JP2001500897A

JP2001500897A - 治療用分子の細胞内送達のための陽イオン性両親媒性組成物

Info

Publication number: JP2001500897A
Application number: JP10515603A
Authority: JP
Inventors: マーシャル，ジョン; ハリス，デビッド，ジェイ．; リー，エドワード，アール．; シーゲル，クレイグ，エス．; イーストマン，サイモン，ジェイ．; チャン，チャウ，ダン; シュール，ロナルド，ケイ．; チェン，セン，エイチ．
Original assignee: ジエンザイムコーポレイション
Priority date: 1997-06-10
Filing date: 1997-06-10
Publication date: 2001-01-23
Also published as: EP1007003A1; CA2268945A1; WO1998013026A1

Abstract

(57)【要約】生物活性（治療用）分子の細胞内への移動を促進する新規陽イオン性両親媒性化合物が提供される。本発明により、このような陽イオン性両親媒性化合物は、追加のプロトンを受容することができる状態、すなわち完全にプロトン化されていない状態で使用される。本発明の目的において、陽イオン性両親媒性化合物は４つの大きな分類を包含すると考えられる：（Ａ）Ｔ−型／ステロイドベースの両親媒性化合物；（Ｂ）Ｔ−型／非ステロイドベースの両親媒性化合物；（Ｃ）非Ｔ−型／ステロイドベースの両親媒性化合物、および（Ｄ）非Ｔ−型／非ステロイドベースの両親媒性化合物。

Description

【発明の詳細な説明】治療用分子の細胞内送達のための陽イオン性両親媒性組成物本出願は、１９９５年１０月２０日に出願された「治療用分子の細胞内送達のためのジアルキルアミン脂肪親和性基を含有する陽イオン性両親媒性化合物」という標題の米国特許出願第０８／５４６，１１０号の一部継続出願であり、この出願は、１９９５年１０月１１日に出願された「治療用分子の細胞内送達のためのステロイド脂肪親和性基を含有する陽イオン性両親媒性化合物」という標題の米国特許出願第０８／５４０，８６７号の一部継続出願であり、この出願は、１９９４年１２月９日に出願された「治療用分子の細胞内送達のための陽イオン性両親媒性化合物」という標題の米国特許出願第０８／３５２，４７９号の一部継続出願である。本出願はまた、（１）１９９５年９月２６日に出願された「陽イオン性脂質／ＤＮＡ複合体の分子モデル」という標題のエクスプレスメイルラベルＴＢ７９８２２３１０７ＵＳとして識別される米国仮特許出願、および（２）１９９５年９月２７日に出願された「遺伝子治療のための治療用組成物の静脈内送達」という標題のエクスプレスメイルラベルＥＦ１０９４３７０５１ＵＳとして識別される米国仮特許出願の優先権を主張する。上記出願のすべての完全な本文、請求の範囲および図面は、その全体が参照することにより本明細書に組み込まれる。発明の背景本発明は、生物活性（治療用）分子の細胞内送達を促進する新規陽イオン性両親媒性化合物に関する。本発明はまた、このような陽イオン性両親媒性化合物を含み、治療上有効量の生物活性分子を患者の細胞内に送達するのに有用な薬剤組成物に関する。本発明の新規陽イオン性両親媒性化合物は、遺伝子治療に関連して特に有用である。多くのタイプの生物活性分子の有効な治療的使用は、これらによる治療が治療的利益を与えるであろう患者の特定の細胞内に、治療上有効量のそのような物質を送達させる方法が利用できないため、達成されていない。細胞へのこのような分子の治療上充分な量の効率的な送達は、例えば細胞膜は選択的透過性バリアーとなるため、不可能ではないにしてもしばしば困難であった。さらに生物活性分子がうまく標的細胞中に入ったとしても、これらは細胞質中で直接分解されるか、または分解プロセスのために特化した細胞内の構造体（例えば、リソソームコンパートメント）へ輸送される。すなわち、細胞内に入ることを許された細胞の性質および細胞内の標的位置に最終的に到達する量（この量で治療的利益を提供する）の両方とも、厳密に限定される。このような選択性は、正しい細胞機能が維持されるために一般に必要であるが、多くの治療上有用な物質（または治療上有効なその量）が排除されることは欠点である。さらに生物活性分子の細胞内送達の標的となる完全な組織により提示される、複雑な構造、挙動および環境は、インビトロで培養される細胞集団に提示される場合と比較して、しばしばこのような送達を実質的に阻害する。患者の組織への有効なターゲティングがしばしば達成されない生物活性分子の例：（１）免疫グロブリンタンパク質を含む多くのタンパク質、（２）ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡのようなポリヌクレオチド、（３）アンチセンスポリヌクレオチド；および（４）ペプチドホルモンや抗生物質のような、合成のまたは天然に存在する多くの低分子量化合物。医療従事者が直面している基本的課題の１つは、多くの遺伝疾患に関連する欠陥遺伝子（または種々の癌を含む危険因子となるもの）が単離され性状解析されているが、そのような遺伝子の正常なコピーを患者に提供することにより病状自体を直す方法（遺伝子治療の技術）が実質的に欠如していることである。従ってこれらの細胞内送達の改良法の開発が、医学的に極めて重要である。遺伝子治療が望まれている疾患の例としては、嚢胞性繊維症、ゴーシェ病、ファブリー病、および筋ジストロフィーのような遺伝疾患がある。治療可能な後天性疾患の代表的なものには：（１）癌については、多発性ミエローマ、白血病、黒色腫、卵巣癌、および小細胞肺癌、（２）心血管疾患については、進行性心不全、再狭窄、および血友病；および（３）神経疾患については、外傷性脳傷害、がある。遺伝子治療では、患者の標的細胞がうまくトランスフェクションされることが必要である。トランスフェクションは一般に、細胞内に発現可能なポリヌクレオチド（例えば、遺伝子、ｃＤＮＡまたはこれを原型とするｍＲＮＡ）を導入するプロセスであると定義される。コードするポリヌクレオチドがうまく発現されると、正常なタンパク質が細胞中で産生され、異常な遺伝子に引き起こされる病状が治療される。このようなタンパク質を直接標的細胞に提供することに基づく治療法（タンパク質置換治療法）は、しばしば前述のような理由のために有効ではない。よく知られている致死性遺伝疾患である嚢胞性繊維症は、遺伝子治療の標的である疾患の具体例である。この疾患は、嚢胞性繊維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーター（「ＣＦＴＲ」）として知られているタンパク質であり、上皮細胞（肺上皮細胞を含む）の細胞膜を通過するイオン（および、従って流体）の移動を制御するタンパク質を、コードする遺伝子中の１つまたはそれ以上の突然変異の存在により引き起こされる。気道細胞中の異常なイオンの移動は、異常な粘液分泌、炎症および感染、組織傷害、そして最終的に死に至る。いくつかの病状について遺伝子治療は永続的かつ予測可能な型の治療法を提供することが期待されており、遺伝子治療は、多くの遺伝疾患にとって唯一の型の治療法である可能性がある。しかし、細胞へ機能性遺伝子が入ることを促進する化合物であって、この意味で、その活性が、細胞内治療作用に充分である濃度で、遺伝子または他のそのような生物活性治療用分子のインビボ送達を提供するのに充分である化合物を、開発する決定的に重要な必要性がある。報告されている進展生物活性分子の細胞内送達を促進するために設計されている化合物は、非極性および極性環境（例えば、原形質膜、組織液、細胞内のコンパートメント、および生物活性分子自身）の両方と相互作用する必要があるため、このような化合物は典型的には、極性および非極性ドメインの両方を含有するように設計される。このような両方のドメインを有する化合物は両親媒性化合物（amphiphiles）と呼ばれ、このような細胞内送達（インビトロでのまたはインビボでの応用の場合も）の促進のための使用が開示されている多くの脂質および合成脂質は、この定義を満足する。このような両親媒性化合物の１つの重要なクラスは、陽イオン性両親媒性化合物である。一般に、陽イオン性両親媒性化合物は、ほぼ生理学的ｐＨで正に荷電することができる極性基を有し、この性質は当該分野で、両親媒性化合物の、多くのタイプの生物活性（治療的）分子（例えば、ＤＮＡのような負に荷電したポリヌクレオチド）との相互作用の仕方を規定するのに重要であると考えられている。また当該分野では、このような両親媒性化合物を多くのプロトン供給源に曝露して、その陽性電荷を増加させてから治療用分子と接触させることが好ましい。極性および非極性ドメインの両方を有し生物活性分子の細胞内送達に関連して有用であるとされている陽イオン性両親媒性化合物の例は、例えば以下の文献中に見いだされ、これらは（１）これらの化合物をこのような応用に適するようにすると当該分野で考えられている該化合物の性質、および（２）そのような両親媒性化合物と細胞内送達のための治療用分子との複合体を形成させることにより形成される、当該分野で理解されている構造体の性質、の有用な考察を含む。（１）フェルグナー（Felgner）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３−７４１７（１９８７）は、トランスフェクションに適した脂質／ＤＮＡ複合体を作成するのに、Ｎ−［１−（（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＭＡ」）を含む正に荷電した合成陽イオン性脂質の使用を開示している。またフェルグナー（Felgner）ら、ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６９（４），２５５０−２５６１（１９９４）も参照されたい。（２）ベア（Behr）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，６９８２−６９８６（１９８９）は、ジオクタデシルアミドログリシルスペルミン（「ＤＯＧＳ」）を含む多くの両親媒性化合物を開示している。（３）エパンド（Epand）らの米国特許第５，２８３，１８５号は、「ＤＣ−Ｃｈｏｌ」と呼ぶ３β［Ｎ−（Ｎ¹，Ｎ¹−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロールを含む、追加のクラスおよび種の両親媒性化合物を記載している。（４）細胞への生物活性分子の移動を促進する追加の化合物は、フェルグナー（ Felgner）らの米国特許第５，２６４，６１８号に開示されている。また「ＤＭＲＩＥ」１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチルーヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（これは後述される）を含むさらなる化合物の開示については、フェルグナー（Felgner）ら、ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６９（４），ｐｐ．２５５０−２５６１（１９９４）も参照されたい。（５）生物活性分子の細胞内送達に適した両親媒性化合物はまた、ゲベエフ（Ge beyehu）らの米国特許第５，３３４，７６１号、およびフェルグナー（Felgner ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），５，６７−７５（１９９３）にも言及されている。前記文献に記載の化合物は、細胞内へ生物活性分子が入ることを促進（多くの場合、インビトロのみであるが）することが証明されているが、これらによる提供される摂取効率は、多くの治療的用途（特に、遺伝子治療）を支持するには不充分であると考えられている。さらに、上記化合物の活性はあまり強くないと考えられているため、多量に使用する必要があり、このためこのような化合物またはその代謝物の毒性が心配される。従って、治療を成功させるのに充分な活性を有する改良された陽イオン性両親媒性化合物を開発する必要性がある。発明の要約本発明は、細胞内への生物活性分子の移動を促進するのに特に有効な陽イオン性両親媒性化合物を提供する。この目的に有用な任意の陽イオン性両親媒性化合物が、本発明に包含される。本発明においてこのような陽イオン性両親媒性化合物は、追加のプロトンを受容することができる（すなわち完全にはプロトン化されていない）状態で使用される。本発明の目的において、陽イオン性両親媒性化合物は４つの大きな分類を包含すると考えられる：（Ａ）Ｔ−型／ステロイドベースの分子：（Ｂ）Ｔ−型／非ステロイドベースの分子；（Ｃ）非Ｔ−型／ステロイドベースの分子、および（Ｄ）非Ｔ−型／非ステロイドベースの分子。分類「Ａ」（Ｔ−型／ステロイドベースの両親媒性化合物）について、これらは本明細書において代表的な例で、（Ｉ）アルキルアミンおよびポリアルキルアミン残基により付与される極性Ｒ基を有する；および（II）アミノ酸および誘導体化アミノ酸により伸長される、アルキルアミンおよびポリアルキルアミン残基により付与される極性Ｒ基を有する、として説明される２つの群に分類される。従って、細胞内への生物活性分子の移動を促進することができる分類Ａ、群Ｉ（図１、パネルＡ、Ｂ、およびＣを参照）の陽イオン性両親媒性化合物が提供され、この両親媒性化合物は、構造（Ｉ）（式中、Ｚは、ステロイドであり；Ｘは、炭素原子または窒素原子であり；Ｙは、短い結合基であるか、またはＹは欠如しており；Ｒ³は、Ｈ、または飽和もしくは不飽和脂肪族基であり；Ｒ¹は、−−ＮＨ−−、アルキルアミン、またはポリアルキルアミンであり；Ｒ⁴は、Ｈ、または飽和もしくは不飽和脂肪族基であり；Ｒ²は、−−ＮＨ−−、アルキルアミン、またはポリアルキルアミンであり；かつ、Ｒ¹は、Ｒ²と同じであるかまたは異なる（ただし、Ｒ¹とＲ²の両方が−− ＮＨ−−であることはない））を有する。１つの好適な実施態様において、ステロイド成分「Ｚ」は、３−ステロール（ステロール分子は、その３−Ｏ−基、またはそのＮ−置換体によりＹ（または、Ｙが欠如している場合は、直接Ｘ）に、結合される）よりなる群から選択される。本発明のこの面において、特に有効な両親媒性化合物には、例えばスペルミジンコレステロールカルバメート（Ｎ⁴−スペルミジンコレステリルカルバメート、両親媒性化合物Ｎｏ．５３）、およびスペルミンコレステロールカルバメート（Ｎ⁴−スペルミンコレステリルカルバメート、両親媒性化合物Ｎｏ．６７）、およびこれらを原型とする両親媒性化合物がある。さらなる好適な実施態様において、ステロイド基は、ステロイド核の環の１７位（図１と２２を参照）から、または多くのステロイドの１７位から伸長しているアーム（図１のコレステロールの構造を参照）から、またはこのアームの任意の短縮型から、Ｙ（または、Ｙが欠如している場合は直接Ｘ）に結合している。他の好適な実施態様において、結合基Ｙには、それ自身がＸとＺの間で共有結合のブリッジを形成する約３つまたは４つ以下の原子が包含される。本発明の具体的な好適な実施態様において、Ｙは、その１つ以下の基がＸとＺの両方と結合を形成する結合基であるか、またはＹは欠如している。群１に従って提供される代表的な両親媒性化合物には、以下が含まれる：さらに、細胞内への生物活性分子の移動を促進することができる分類Ａ、群II の陽イオン性両親媒性化合物（図５を参照）が提供され、この両親媒性化合物は、構造（II）（式中、Ｚは、ステロイドであり；Ｘは、炭素原子または窒素原子であり；Ｙは、結合基であるか、またはＹは欠如しており；Ｒ³は、アミノ酸、誘導体化アミノ酸、Ｈ、またはアルキルであり；Ｒ¹は、−−ＮＨ−−、アルキルアミン、またはポリアルキルアミンであり；Ｒ⁴はアミノ酸、誘導体化アミノ酸、Ｈ、またはアルキルであり；Ｒ²は、−−ＮＨ−−、アルキルアミン、またはポリアルキルアミンであり；かつ、Ｒ¹は、Ｒ²と同じであるかまたは異なる（ただし、Ｒ¹とＲ²の両方が−− ＮＨ−−であることはない））を有する。群IIで提供される代表的な両親媒性化合物には、以下が含まれる：分類Ｂ、Ｔ−型／非ステロイドベースの両親媒性化合物について、これらは、本明細書において代表的な例で、（III）脂肪親和性基は、モノまたはジアルキルアミン残基により付与され、極性基は典型的にはアルキルアミンまたはポリアルキルアミンにより付与され；および（IV）脂肪親和性基は、飽和もしくは不飽和アルキルもしくはアシル基により付与され、極性基は典型的にはアルキルアミンまたはポリアルキルアミンにより付与される、として説明される２つの群に大きく分類される。従って、細胞内への生物活性分子の移動を促進することができる分類Ｂ、群II I（図６を参照）の陽イオン性両親媒性化合物が提供され、この両親媒性化合物は、構造（III）（式中、Ｚは、そのＮ−原子によりＹ（または、Ｙが欠如している場合は直接Ｘ）に結合したアルキルアミンまたはジアルキルアミンであり、ここでＺはジアルキルアミンであり、そのアルキル基は同じであるかまたは異なり；Ｘは、炭素原子または窒素原子であり；Ｙは、短い結合基であるか、またはＹは欠如しており；Ｒ³は、Ｈ、または飽和もしくは不飽和脂肪族基であり；Ｒ¹は、−−ＮＨ−−、アルキルアミン、またはポリアルキルアミンであり；Ｒ⁴は、Ｈ、または飽和もしくは不飽和脂肪族基であり；Ｒ²は、−−ＮＨ−−、アルキルアミン、またはポリアルキルアミンであり；かつ、Ｒ¹は、Ｒ²と同じであるかまたは異なる（ただし、Ｒ¹とＲ²の両方が−− ＮＨ−−であることはない））を有する。構造（III）により提供される両親媒性化合物に関して、結合基Ｙには、それ自身がＸとＺの間で共有結合のブリッジを形成する約３つまたは４つ以下の原子が包含されることが好ましい。本発明の具体的な好適な実施態様において、Ｙは、その１つ以下の基がＸとＺの両方と結合を形成する結合基（例えば、＞Ｃ＝Ｏ）であるか、またはＹは欠如している。群IIIで提供される代表的な両親媒性化合物には、以下が含まれる：追加の群IIIの両親媒性化合物は、公知の両親媒性化合物ジオクタデシルアミドログリシルスペルミン「ＤＯＧＳ」（ベア（Behr）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，６９８２−６９８６（１９８９）を参照）およびＤＰＰＥＳ（べア（Behr J.P.）、ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，５，１９９４．３８２−３８９に記載）に関するものがある。従って、細胞内への生物活性分子の移動を促進することができる分類Ｂ、群IV （図７を参照）の陽イオン性両親媒性化合物が提供され、この両親媒性化合物は、構造（IV）（式中、ＡとＢは、独立にＯ、ＮまたはＳであり；Ｒ⁵とＲ⁶は、独立にアルキルまたはアシル基であり、かつ飽和されているかまたは不飽和の部位を含有し；Ｃは、−−ＣＨ₂−−、＞Ｃ＝Ｏ、および＞Ｃ＝Ｓよりなる群から選択され；Ｅは、炭素原子または窒素原子であり；Ｄは、−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−または−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−のような結合基であるか、またはＤは欠如しており；Ｒ³は、Ｈ、または飽和もしくは不飽和脂肪族基であり；Ｒ¹は、−−ＮＨ−−、アルキルアミン、またはポリアルキルアミンであり；Ｒ⁴は、Ｈ、または飽和もしくは不飽和脂肪族基であり；Ｒ²は、−−ＮＨ−−、アルキルアミン、またはポリアルキルアミンであり；かつ、Ｒ¹は、Ｒ²と同じであるかまたは異なる（ただし、Ｒ¹とＲ²の両方が−− ＮＨ−−であることはない））を有する。群IVの代表的な両親媒性化合物には、以下が含まれる：前記したように、本発明は、非Ｔ−型／ステロイドベースの両親媒性化合物（分類Ｃ）の製剤およびその使用、例えば（Ｎ¹−スペルミジンコレステリルカルバメート）（Ｎ¹−サーモスペルミンコレステリルカルバメート）、および（Ｎ¹−スペルミンコレステリルカルバメート）を提供する。本発明の実施において使用される分類Ｃの追加の両親媒性化合物には、例えばエパンド（Epand）らの米国特許第５，２８３，１８５号に記載のもの、例えば「ＤＣ−ｃｈｏｌ」と呼ぶ３β［Ｎ−（Ｎ¹，Ｎ¹−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロールがある。本発明はまた、非Ｔ−型／非ステロイドベースの両親媒性化合物（分類Ｄ）の多様な製剤およびその使用、例えばＮ−［１−（（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＭＡ」）を原型とするが、さらにプロトン化することができるその非四級変種（フェルグナー（Felgner）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３−７４１７（１９８７））である陽イオン性脂質、および、例えばリポポリリジンを含む後述される多くの追加の分類、および１−［２−（アシルオキシ）エチル］−２−アルキル（アルケニル）−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリウムクロリドを原型とする陽イオン性両親媒性化合物を提供する。本発明はまた、患者の組織における治療上有効量の生物活性分子の細胞内送達を促進する、１つまたはそれ以上の陽イオン性両親媒性化合物、および１つまたはそれ以上の生物活性分子を含む薬剤組成物を提供する。本発明の薬剤組成物は、保存のために組成物を安定化させ、および／または生物活性分子の細胞内送達の成功に寄与する、１つまたはそれ以上の追加の薬剤学的に許容される物質を含有するように製剤化される。さらなる面において本発明は、細胞内への生物活性分子の移動を促進する方法であって：本発明の陽イオン性両親媒性化合物の分散物を調製する工程；該分散物を生物活性分子に接触させて、両親媒性化合物と分子の間で複合体を形成させる工程；および、細胞に複合体を接触させて、こうして細胞内への生物活性分子の移動を促進する工程、を含んでなる上記方法を提供する。薬学的用途のために、本発明の陽イオン性両親媒性化合物は、細胞内への生物活性分子の送達を促進するために、公知のものを含む１つまたはそれ以上の追加の陽イオン性両親媒性化合物、またはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＯＰＥ」）のような中性の補助脂質（co-lipids）とともに製剤化される。さらに本発明の１つまたはそれ以上の陽イオン性両親媒性化合物を含む組成物は、植物細胞（例えば、培養植物細胞）に生物活性分子を導入するために使用することができる。さらに本発明は、適切な治療用トランス遺伝子の高レベルの発現が達成されるように、遺伝子治療により患者を治療するために、本発明の両親媒性化合物と複合体を形成するのに適した新規プラスミドを提供する。その代表的な例には、プラスミドｐＣＭＶＨＩとｐＣＦＩがある。ｐＣＦ１プラスミドは、サイトメガロウイルスの前初期遺伝子（immediate early gene）からのエンハンサー／プロモーター領域を含有する。このプラスミドはまた、プロモーターとトランス遺伝子ｃＤＮＡの間に位置するハイブリッドイントロンを含有する。ウシ成長ホルモン遺伝子のポリアデニル化シグナルが、トランス遺伝子の下流に置くために選択された。これらおよび他の特徴は、このプラスミドで可能な改良されたトランス遺伝子発現に実質的に寄与する。プラスミドの性能のさらなる増強は、複製しているエピソームプラスミドを提供することにより可能になる。さらなる治療的増強は、治療用トランス遺伝子の発現が、標的組織内の炎症関連物質の濃度に感受性である転写プロモーターの制御下に置かれる、プラスミドを提供することにより可能になる。このようなプラスミドは、炎症が主要な合併症である臨床症例の治療にとって特に有用である。本発明のさらなる実施態様において、両親媒性化合物／トランス遺伝子複合体の静脈内投与により、このような複合体中の両親媒性化合物対ＤＮＡの比を調整することにより、およびその見かけの電荷またはゼータ電位を調整することにより、特定の臓器または組織が遺伝子治療の標的になる。本発明のさらに別のかつ代表的な面は、以下の本発明の詳細な説明に従って記載される。図面の簡単な説明図１は、代表的な群Ｉの陽イオン性両親媒性化合物を示す。図２は、代表的なステロイド脂肪親和性基を示す。図３は、代表的なステロイド脂肪親和性基を示す。図４は、トランスアシル化反応を示す。図５は、代表的な群IIの陽イオン性両親媒性化合物を示す。図６は、代表的な群IIIの陽イオン性両親媒性化合物を示す。図７は、代表的な群IVの陽イオン性両親媒性化合物を示す。図８は、スペルミジンコレステロールカルバメートの合成経路を提供する。図９は、スペルミンコレステロールカルバメートの合成経路を提供する。図１０は、特定の条件下でのいくつかの陽イオン性両親媒性化合物についてインビボのトランスフェクション効率の比較を示す。図１１は、特定の陽イオン性両親媒性化合物についてＤＮＡ濃度の関数としてのインビボのトランスフェクション効率を示す。図１２は、特定の陽イオン性両親媒性化合物の濃度の関数としてインビボのトランスフェクション効率を示す。図１３は、群Ｉの両親媒性化合物の相対的トランスフェクション効率を提供する。図１４は、群IIの両親媒性化合物の相対的トランスフェクション効率を提供する。図１５は、群IVの両親媒性化合物の相対的トランスフェクション効率を提供する。図１６は、ｐＣＭＶＨＩ−ＣＡＴプラスミドの地図を提供する。図１７は、ｐＣＭＶＨＩ−ＣＡＴのハイブリッドイントロンを示す。図１８（パネルＡ）は、ｐＣＦＩ／ＣＡＴプラスミドの地図を提供する。図１８（パネルＢ）は、ｐＣＦ２／ＣＡＴプラスミドの地図を提供する。図１９は、嚢胞性繊維症患者の鼻ポリープ上皮細胞中の修正された塩化物イオン移動のプロットを示す。図２０は、ｐＭｙｃ４−ＣＦＴＲの地図を提供する。図２１は、心臓と肺の静脈内ターゲティングを証明する。図２２は、充分にプロトン化されていない形で提供された時の、両親媒性化合物Ｎｏ．３７のインビボの改良された性能を証明する。発明の詳細な説明本発明の陽イオン性両親媒性化合物の構造に関する情報本発明は、細胞内への生物活性分子の移動を促進するのに有用な、陽イオン性両親媒性化合物、およびこれらを含有する組成物を提供する。両親媒性化合物は細胞（特に遺伝子治療を目的とする患者の細胞）内への生物活性分子の移動を促進するのに特に有用である。本発明の実施に関連して、「陽イオン性」とは、本明細書で定義されるＲ基が、生理学的ｐＨまたはそれに近いｐＨの溶液中で１またはそれ以上の正の電荷を有する傾向があることを意味する。本発明により、追加のプロトンを受容することができる陽イオン性両親媒性化合物が記載される。このような陽イオン性両親媒性化合物はｐＨ７で１またはそれ以上の正の電荷を有するが、本明細書で操作されるように充分にプロトン化されておらず、従ってその完全な陽イオン性電位よりは小さい電位を有する。このような陽イオン性は、両親媒性化合物と治療用分子（例えば、負の電荷を有する核酸）との、または細胞構造体（例えば、原形質膜糖タンパク質）との相互作用を増強し、こうして細胞内に治療用分子がうまく入ることに寄与するか、またはそのサブコンパートメント（例えば、核）内のプロセシングに寄与する。例えば、正に荷電した分子（例えば、追加のプロトンを受容することができる陽イオン性両親媒性化合物）は、細胞膜を横断できるように必要な正の電荷を有することができ、および完全にプロトン化されていない場合は、負に荷電した核酸のような生物活性分子から解離することができる。この点で、陽イオン性両親媒性化合物のトランスフェクション増強機能に関する当該分野の多くの理論（これらは、いずれも本発明の実施を限定するものではない）を参照されたい。本発明の実施により細胞内への移動が促進される生理学的分子には、例えばゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡもしくはＤＮＡ、ポリペプチド、および低分子量薬剤またはホルモンがある。これらの代表的な例は、本発明の治療用（薬剤）組成物の説明に関連して以下に言及される。本発明の実施による分類Ａ（Ｔ−型／ステロイドベース）の陽イオン性両親媒性化合物は、いくつかの新規な特徴を有する。これらの特徴は、陽イオン性両親媒性化合物構造体（エパンド（Epand）らの米国特許第５，２８３，１８５号に開示されているようなものであり、その代表的な構造は、一般に「ＤＣ−ｃｈｏｌ」として知られている３β［Ｎ−（Ｎ¹，Ｎ¹−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール、およびベア（Behr）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，６９８２−６９８６（１９８９）に開示されているようなものであり、その代表的な構造は、ジオクタデシルアミドログリシルスペルミン（「ＤＯＧＳ」）である）と比較することにより理解される。本発明の分類Ａの陽イオン性両親媒性化合物は、明確な構造的特徴を有する：（１）それ自身は、アミノ、アルキルアミンまたはポリアルキルアミン基を有する２つの陽イオン性基（後述）に、直接または結合基を介して結合している脂肪親和性基の存在、このため全体的および新規「Ｔ−型」構造になっている；および（２）多くの場合に、および多くの当該分野で認識されている両親媒性化合物と比較して、脂肪親和性領域と両親媒性化合物の陽イオン性領域を密接に近づけるための比較的短い結合基の使用。理論には拘泥されるつもりはないが、これらの特徴は、これらの化合物のトランスフェクション増強能に実質的に寄与すると考えられる。この例として、以下の図１０は、ＤＣ−ｃｈｏｌおよびＤＭＲＩＥ（２つのよく認識されているトランスフェクション体）と比較して、スペルミジンコレステロールカルバメート（本発明の新規両親媒性化合物）の、実質的なインビボでのトランスフェクション増強能を証明する。本発明の重要な実施態様において、生物活性分子は、患者の細胞中に置かれた時発現されて代謝の欠陥の修正につながるコード性ポリヌクレオチドである。特に重要な例において、ポリヌクレオチドは、ヒトの嚢胞性繊維症トランスメンブランレギュレーター（「ＣＦＴＲ」）の配列の充分な複製しているアミノ酸配列を有し、上皮細胞陰イオンチャネル制御の生物学的性質を獲得することを可能にするポリペプチドをコードする。前記したように、本発明の両親媒性化合物の特徴的かつ新規の特徴は、まず、脂肪親和性基に２つの陽イオン性アミン基を結合させる結合基は非常に短いか完全に欠如していること、および第２に、脂肪親和性基への２つの陽イオン性Ｒ基のこうして得られる結合は、例えば構造（Ｉ）、（II）、（III）、およびIV（原子「Ｅ」を参照）に記載のように原子「Ｘ」（炭素または窒素原子）の位置から見ると、Ｔ−型構造を形成する。本発明の分類Ａの陽イオン性両親媒性化合物の例として、スペルミジンコレステロールカルバメート（Ｎ⁴−スペルミジンコレステリルカルバメート）およびスペルミンコレステロールカルバメート（Ｎ⁴−スペルミンコレステリルカルバメート）は、同等の量の陽イオン性アルキルアミン構造体を有する非「Ｔ−型」両親媒性化合物と比較して、インビボで優れたトランスフェクション体であることが決定されている。すなわち、（スペルミジンコレステロールカルバメート）について、例えば（Ｎ¹−スペルミジンコレステリルカルバメート）と比較して優れた性能（また例３も参照）が決定されている：（スペルミンコレステロールカルバメート）について、例えば（Ｎ¹−サーモスペルミンコレステリルカルバメート）、および（Ｎ¹−スペルミンコレステリルカルバメート）と比較して、優れた性能（が決定されている：本出願人は、本発明のＴ−型／ステロイドベースの陽イオン性両親媒性化合物はスペルミンやスペルミジンのような天然に存在するポリアミンと同じような構造的特徴（Ｎ−原子スペースを含む）を有することに注目した。この点で、分類「Ａ」（Ｔ−型／ステロイドベース）の両親媒性化合物５３、６７、７８、９０、および９１が代表的である。図１３、１４、および１５のデータを調べると明らかなように、窒素原子を、３個および４個の炭素原子の１つまたはそれ以上の組合せにより分離されるように両親媒性化合物の極性の頭部の基に置くと、これと複合体を形成したプラスミドトランス遺伝子のインビボの高いトランスフェクション効率が得られる。本出願人はまた、共通の構造的特徴は、両親媒性化合物のＤＮＡとの結合、および細胞表面ポリアミン受容体との相互作用に対して有用な作用を及ぼすことに注目した。癌細胞のＤＮＡ複製要件により細胞ポリアミン受容体が高レベルに発現されるため、細胞ポリアミン受容体との相互作用は、遺伝子治療による癌細胞の治療に関して特に重要である。しかし本発明において、非Ｔ−型／ステロイドベースの陽イオン性両親媒性化合物の性能は、充分にプロトン化されていない型のその使用により大きく改善されることが観察される。すなわち、追加のプロトン供給源を提供しないことにより、トランスフェクションが改良される。分類Ａ／群Ｉの両親媒性化合物本発明の群Ｉの両親媒性化合物の設計に関して、以下の考えが注目される。次にこれらの設計の特徴の多くを、本発明の他の両親媒性化合物（群II、IIおよび IVに分類されるもの）に関して考察する。従って、細胞内への生物活性分子の移動を促進するすることができる群Ｉの陽イオン性両親媒性化合物（図１、パネルＡ、Ｂ、およびＣを参照）であって、構造（Ｉ）（式中、Ｚは、ステロイドであり；Ｘは、炭素原子または窒素原子であり；Ｙは、短い結合基であるか、またはＹは欠如しており；Ｒ³は、Ｈ、または飽和もしくは不飽和脂肪族基であり；Ｒ¹は、−−ＮＨ−−、アルキルアミン、またはポリアルキルアミンであり；Ｒ⁴は、Ｈ、または飽和もしくは不飽和脂肪族基であり：Ｒ²は、−−ＮＨ−−、アルキルアミン、またはポリアルキルアミンであり；かつ、Ｒ¹は、Ｒ²と同じであるかまたは異なる（ただし、Ｒ¹とＲ²の両方が−− ＮＨ−−であることはない））を有する両親媒性化合物が提供される。結合基好ましくは、２つの陽イオン性Ｒ基に脂肪親和性基を連結する結合基は、比較的短い。結合基Ｙには、それ自身がＸとＺの間で共有結合のブリッジを形成する約３つまたは４つ以下の原子が包含されることが好ましい。Ｙ基の例には、−（ＣＨ₂）₂−；−（ＣＨ₂）₃−；−（ＣＨ₂）−（Ｃ＝Ｏ）−；−（ＣＨ₂）ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−（ここで、ｎは好ましくは４またはそれ以下である）がある。本発明の実施に有用な追加の結合基は、小さいアミノ酸（例えば、グリシル、ベータ−アラニル、セリニルなど）を原型とするものである。上記表示に関連して、その左側は原子「Ｘ」に結合すると企図され、その右側は基「Ｚ」（構造Ｉを参照）に結合すると企図される。本発明のいくつかの好適な実施態様において、Ｙは結合基であり、この基の１つ以下の原子は「Ｘ」および「Ｚ」の両方と結合を形成する。好適な結合基の例には、−−ＣＨ₂−−、＞Ｃ＝Ｓ、および＞Ｃ＝Ｏが含まれる。あるいは、結合基「Ｙ」は完全に欠如していてもよい。前記したように（構造Ｉを参照、すぐ前に記載）、「Ｘ」は、２つの陽イオン性Ｒ基に結合している両親媒性化合物で結合点を形成する。そこで見られるように（図１も参照）、「Ｘ」である窒素原子の位置が明らかに、分子にＴ−型を取らせる。ステロイド脂肪親和性基本発明の実施において陽イオン性両親媒性化合物は、脂肪親和性基として種々の構造体を含んでよい。ステロイドは、このような構造体の好適な群である。本発明の実施において脂肪親和性基としてのステロイドの設計と配向に関して、以下の問題に注意すべきである。ステロイドは動物、微生物および植物界に広く分布している。これらは、典型的には、ペルヒドロシクロペンテノ−フェナントレン環系の形で配置された炭素原子を、その基本的な骨格として含む固体アルコールとして定義される。従ってこのような化合物は、胆汁酸、コレステロールおよび関連物質、ビタミンＤ、いくつかの昆虫脱皮ホルモン、いくつかの性ホルモン、コルチコイドホルモン、いくつかの抗生物質、および上記のすべての誘導体（ここで、追加の環は、付加されるかまたは基本構造から除去される）を含む。［当該分野でステロイドとして理解されている広いクラスの分子のさらなる考察については、ＮａｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔｓＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、ナカニシ（K．Nakanishi）ら編、アカデミックプレス社（Academic Press Inc.）、ニューヨーク州（１９７４）、第１巻、第６章を参照されたい］。さらに、本発明の目的において、ステロイドという用語は、ビタミンＥのような複数のイソプレノイド単位から得られる関連分子を包含するために使用される。本発明の実施に有用な物質の代表であるステロイドは、図１、２、３、および５に示す。以下に詳述するように、本発明のいくつかの好適な両親媒性化合物は、３−ステロール（ここで、ステロール分子は、その３−Ｏ−基またはそのＮ−置換体によりＹに結合している（図１を参照））よりなる群から選択されるステロイド成分「Ｚ」を含む。このような構造体には、例えばスペルミジンコレステロールカルバメート、スペルミンコレステロールカルバメート、スペルミジン７−デヒドロコレステリルカルバメート、リジン３−Ｎ−ジヒドロコレステリルカルバメート、スペルミジンコレスタミン尿素、およびＮ−３−アミンプロピル−Ｎ−４− アミノブチルコレスタミンがある。さらなる好適な実施態様において、ステロイド基は、ステロイド核の環１７位（図１と３を参照）から、または多くのステロイドの１７位から伸長するアーム（図１と３を参照）から、またはこのアームの任意の短縮型から、Ｙ（または、Ｙが欠如している場合は直接Ｘ）に結合している。本発明の両親媒性化合物に含めるためのステロイドの選択に関して、その分子は、体により代謝されかつ使用される投与量では非毒性である構造を有することが好ましい。好ましいのは、実質的に非毒性であり、患者の安全な代謝を促進するための生物学的に正常な立体特異性を有するコレステロールやエルゴステロールのようなステロイドである。本発明の実施において有用な追加のステロイドには、例えばエルゴステロールＢ１、エルゴステロールＢ２、エルゴステロールＢ３、アンドロステロン、コール酸、デソキシコール酸、ケノデソキシコール酸、リトコール酸、および例えば、図２や３のパネルに示すその種々の誘導体がある。ステロイド脂肪親和性基の配向、すなわち、両親媒性化合物の陽イオン性（アルキル）アミン基に対しての基の結合の仕方（リンカー有りまたは無し）に関して、以下の情報に注意すべきである。ステロイド上の任意の環位置または置換基は一般に、結合点として使用される。しかし、（１）化学合成の複雑さを最小にする、および（２）ステロイド分子の「末端」例えば環の３位の近く、または環の１７位（または、典型的にはそこから伸長しているアーム）の近くに位置する、結合点を使用することが好ましい。このような位置は、二重層形成、および／またはミセル形成を促進するか、および／または標的細胞内に運搬される生物活性分子との相互作用の安定化する、残りの両親媒性化合物構造をステロイドに提供する。その環の１７位から伸長するアームを介してステロイド脂肪親和性基に陽イオン性（アルキル）アミン基の結合を示す代表的構造を図３（パネルＡ、Ｂ）に示す。この型の構造に関して、環の３位に結合するようなステロイド上の任意の極性基は、二重層またはミセル構造を不安定化させることがないように、除去されるかまたはキャッピング（例えば、ヒドロキシをメトキシとして）されることがさらに好ましい。そのステロイド脂肪親和性基がステロイド環の１７位を介して陽イオン性アルキルアミン基に結合している陽イオン性両親媒性化合物の図３の表示は、本発明の１例である。同様に、そのステロイド脂肪親和性基がステロイド環の３位を介して陽イオン性アルキルアミン基に結合している陽イオン性両親媒性化合物の図１〜４の表示は、本発明の１例である。前記したように、結合点としての任意のステロイド環の位置（またはそこから伸長する残基または分岐）の使用は、本発明の実施範囲内である。本発明の実施に従って基「Ｚ」としての使用に好適なステロイドは、以下を含む：３−ステロール（コレステロールから得られる）３−Ｎステリル基（コレステロールを原型とする）エルゴステロールと誘導体エルゴステロールを原型とし、本発明の陽イオン性両親媒性化合物の構造を定義するのに使用される代表的分子種には：エルゴステロール（記載の２重結合）；エルゴステロールＢ１（Δ８，９；Δ１４，１５；Δ２２，２３）；エルゴステロールＢ１（Δ６，７；Δ８，１４；Δ２２，２３）；エルゴステロールＢ１（Δ７，８；Δ１４，１５：Δ２２，２３）；およびルミステロール（エルゴステロールの９ｂ−Ｈ異性体）、がある。コール酸と誘導体コール酸を原型とし、本発明の陽イオン性両親媒性化合物の構造を定義するのに使用される代表的分子種には：ｒ¹とｒ²＝ＯＨであるコール酸；ｒ¹＝Ｈおよびｒ²＝ＯＨであるデソキシコール酸：ｒ¹＝ＯＨおよびｒ²＝Ｈであるケノデソキシコール酸；ｒ¹とｒ²＝Ｈであるリトコール酸、がある。アンドロステロンとその誘導体Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、およびＲ⁴の選択Ｒ³とＲ⁴について：本発明の実施において、Ｒ³とＲ⁴は、独立にＨ、または飽和もしくは不飽和脂肪族基である。脂肪族基は、分岐していても分岐していなくてもよい。代表的な基には、アルキル、アルケニル、およびシクロアルキルがある。Ｒ¹とＲ²について：Ｒ¹とＲ²は、当該分野においてアミン；アルキルアミン（一級、二級、および三級アミンを含む）、またはその伸長したもの（本明細書において「ポリアルキルアミン」と呼ぶ）として認識されている構造である。本明細書で定義されるアルキルアミンとポリアルキルアミンの両方とも、１つまたはそれ以上の炭素−炭素２重結合を含有し、従ってこのようなアルキルアミンの使用は本発明の実施範囲内である。代表的なアルキルアミンには、以下が含まれる：（ａ）−−ＮＨ−（ＣＨ₂）_Z −−、ここでｚは０以外である；（ｂ）−−［［ＣＨ₃（ＣＨ₂）_y］Ｎ］−（ＣＨ₂）_Z−−、ここでｚは０以外である；および（ｃ）−−［［ＣＨ₃（ＣＨ₂）_x ］［ＣＨ₃（ＣＨ₂）_y］］Ｎ］−（ＣＨ₂）_Z−−、ここでｚは０以外である。Ｒ¹とＲ²の１つまたは両方が三級アミン（例えば前記構造（ｃ）に記載のもの）である状況に関して、Ｒ³またはＲ⁴に対応する水素原子は、そのプロトン化レベルがｐＨに応じて変化する、Ｎ：Ｈ（＋）構造に対応するため、適宜存在してもしなくてもよい。「ポリアルキルアミン」という用語は本明細書において、少なくとも２つのアルキルアミンが結合しているポリマー構造を意味する。こうして結合されたアルキルアミン単位は、一級または二級であり、得られるポリアルキルアミンは、一級、二級、または三級Ｎ−原子を含有してもよい。アルキルアミン（サブ）ユニットは飽和または不飽和でもよく、従って「アルキルアミン」という用語は、本発明の説明においてアルケニルアミンを包含する。得られる代表的なポリアルキルアミンには、以下が含まれる：（ｄ）−−［ＮＨ−（ＣＨ₂）_(Z)］_q−−、ここでｚは０以外であり、ｑは２またはそれ以上である；（ｅ）−−［ＮＨ−（ＣＨ₂）_(y)］_p−−［ＮＨ−（ＣＨ₂）_(Z)］_q−−、ここでｙとｚはそれぞれ０以外であり、ｐとｑはそれぞれ０以外である；（ｆ） −−［ＮＨ−（ＣＨ₂）_(x)］_n−−［ＮＨ−（ＣＨ₂）_(y)］_p−−［ＮＨ−（ＣＨ₂ ）_(Z)］_q−−、ここでｘ、ｙおよびｚはそれぞれ０以外であり、ｎ、ｐおよびｑはそれぞれ０以外である；（ｇ）−−［ＮＨ−（ＣＨ₂）_(w)］_m−−［ＮＨ− （ＣＨ₂）_(x)］_n−−［ＮＨ−（ＣＨ₂）_(y)］_p−−［ＮＨ−（ＣＨ₂）_(Z)］_q− −、ここでｗ、ｘ、ｙおよびｚはそれぞれ０以外であり、ｍ、ｎ、ｐおよびｑはそれぞれ０以外である；（ｈ）−−［ＮＨ−（ＣＨ₂）_(w)］_m−−［ＮＨ−（ＣＨ₂）_(x)］_n−−［ＮＨ−（ＣＨ₂）_(y)］Ｎ］−（ＣＨ₂）_Z、ここでｘ、ｎおよびｚはそれぞれ０以外である；（ｉ）−−［ＮＨ−（ＣＨ₂）₍ _w) ］_p−−［［ＣＨ₃（ＣＨ₂）_x］Ｎ］−（ＣＨ₂）_y−−［ＮＨ−（ＣＨ₂）_(Z)］_q −−、ここでｗ、ｐ、ｙ、ｚおよびｐはそれぞれ０以外である；（ｊ）−−［ＮＨ−（ＣＨ₂）_(v)］_l−−［ＮＨ−（ＣＨ₂）_(w)］_m−−［ＮＨ−（ＣＨ₂）_(x) ］_n−−［ＮＨ−（ＣＨ₂）_(y)］_p−−［ＮＨ−（ＣＨ₂）_(Z)］_q−−、ここでｖ、ｗ、ｘ、ｙおよびｚはそれぞれ０以外であり、ｌ、ｍ、ｎ、ｐおよびｑはそれぞれ０以外である。前述のようにＲ¹とＲ²は独立に、−−ＮＨ−−、アルキルアミン、またはポリアルキルアミンであり、互いに同じかまたは異なってもよいが、（１）得られる化合物の「Ｔ−型」を維持し、および（２）その安定性を提供するために、Ｒ¹ とＲ²の両方が−−ＮＨ−−ではあり得ない。Ｒ³Ｒ¹（またはＲ⁴Ｒ²）の組合わさった長さは、窒素と炭素の約４０原子未満、より好ましくは窒素と炭素の約３０原子未満である。Ｒ³に隣接するＲ¹基（またはＲ⁴に隣接するＲ²）が、三級中心を規定する末端窒素原子を含有する場合は、Ｒ³が脂肪族基なら四級アミンが形成され（Ｒ¹の窒素原子で）、Ｒ³がＨなら三級アミンが形成される（Ｒ¹の窒素原子で）。従ってこのような得られるＲ³Ｒ¹（またはＲ⁴Ｒ²）構造に関して、代表的な式は、（ｋ）Ｈ−（ＣＨ₂）_(W)−−［［ＣＨ₃（ＣＨ₂）_x］［［ＣＨ₃（ＣＨ₂）_y］Ｎ］−（ＣＨ₂）_z−−、ここでｗとｚはそれぞれ０以外である、；および（ｌ）Ｈ−−［［ＣＨ₃（ＣＨ₂）_x］［［ＣＨ₃（ＣＨ₂）_y］Ｎ］−（ＣＨ₂）_z−−、ここでｚは０以外である、である。本明細書に記載の構造式の解釈に関して、原子「ｘ」へのＲ³Ｒ¹−（またはＲ⁴ Ｒ²−）構造の結合は、Ｒ³Ｒ¹−の右側（記載の通り）を介してであり、すなわちＣＨ₂−残基である。本明細書に記載の係数（すなわち、ｖ、ｗ、ｘ、ｙ、およびｚ、ならびにｌ、ｍ、ｎ、ｐ、およびｑ）は、整数であると定義される。本発明の目的において、「整数」とは、特に明記しない場合は０と自然数１、２、３、４、５、６・・・である。式（ａ）〜（ｌ）で示される本発明の両親媒性化合物に関して、前記構造（Ｉ）で示される原子「Ｘ」が窒素原子であるかまたは炭素原子であるかに依存して、そのような基の設計に関していくつかの選択性があることに注意されたい。「Ｘ」が窒素原子であるなら、得られるＸ位を含むＮ−Ｎ結合により、不安定および／または調製が困難である両親媒性化合物が得られるため、Ｎ原子で終わるＲ³−Ｒ¹（またはＲ⁴Ｒ²）基を含有する両親媒性化合物［すなわち、ｚは０でありｑ＝１である式（ｅ）；ｚは０である式（ｈ）］は好ましくない。調製が困難であるかおよび／または不安定である構造の追加の基は、例えばＲ配列（Ｒ¹ であっても、Ｒ¹とＲ³をブリッジしても）−−ＮＨ−ＣＨ₂−ＮＨ−ＣＨ₂−−で示される。従って、本発明の実施において、そのような構造［すなわち、ｚは１である式（ａ）、ｙとｚの１つまたは両方が１である式（ｅ）］は好ましくない。陽イオン性両親媒性化合物に包含させるための構造（例えば前述のもの）の設計に関して、以下の問題に注意すべきである。アミンとアルキル残基の交互の組合せは、本発明の範囲内のＲ構造を作成する。ポリアルキルアミンは例えば、前記式で示されるが、両親媒性化合物構造内のアルキルアミンサブユニットの数、タイプ、または組合せを伸長することにより、さらに多くの構造（そのような構造は本発明の範囲内である）が記載される。さらなるこのような変更が可能であることは、当業者に公知である。非常の長いポリアルキルアミン基（または得られるＲ³Ｒ¹基）は、例えば得られる両親媒性化合物の溶解性を妨害するか、または細胞内送達のために選択された生物活性分子と安定に相互作用する能力を妨害することもある。この点で、約４０の窒素および炭素原子またはそれ以上の骨格の長さを有するポリアルキルアミン（または得られるＲ³Ｒ¹基）は、両親媒性化合物に含めることは好ましくない。しかし、このような各目的の構造について、その性質は実験によって決定されるが、それでもその使用は本発明の実施範囲内である。従って、以下のような具体的なアルキルアミンおよびポリアルキルアミン構造が得られる：分類Ａ／群II両親媒性化合物さらに、細胞内への生物活性分子の移動を促進することができる分類Ａ、群II （図５を参照）の陽イオン性両親媒性化合物が提供され、この両親媒性化合物は、構造（II）（式中、Ｚは、ステロイドであり；Ｘは、炭素原子または窒素原子であり；Ｙは、結合基であるか、またはＹは欠如しており；Ｒ³は、アミノ酸、誘導体化アミノ酸、Ｈ、またはアルキルであり；Ｒ¹は、−−ＮＨ−−、アルキルアミン、またはポリアルキルアミンであり：Ｒ⁴は、アミノ酸、誘導体化アミノ酸、Ｈ、またはアルキルであり；Ｒ²は、−−ＮＨ−−、アルキルアミン、またはポリアルキルアミンであり；かつ、Ｒ₁は、Ｒ₂と同じであるかまたは異なる（ただし、Ｒ₁とＲ₂の両方が−− ＮＨ−−であることはない））を有する。群IIに従って提供される代表的両親媒性化合物には、両親媒性化合物87、９１、９３、９５、９７、９９、１００、および１０３が含まれる。これらの両親媒性化合物、群IIの他の両親媒性化合物の構造的特徴に関して、以下を考慮すべきである。ステロイド基は、分類Ａ／群Ｉ両親媒性化合物について前記で定義した基準に従って選択される。従って好適な両親媒性化合物は、３−ステロール（ここで、ステロール分子は、その３−Ｏ−基、またはそのＮ−置換体により、「Ｙ」に結合される）よりなる群から選択される。群IIの両親媒性化合物の結合基Ｙは、Ｎ−アシルアミノ酸（またはその誘導体）からなるか、またはその基の１つ以下の原子が「Ｘ」および「Ｚ」の両方と結合を形成する基（例えば、＞Ｃ＝Ｏまたは＞Ｃ＝Ｓ）からなる。基Ｙは随時欠如していてもよい。代表的なＮ−アシルアミノ基には、Ｎ−アシルセリン（Ｎｏ．８７）、Ｎ−アシルグリシン（Ｎｏ．９１）、およびＮ−アシルアスパラギン酸（Ｎｏ．１０３）がある、両親媒性化合物Ｎｏ．１０３中のＮ−アシルアスパラギン酸の使用に関して、そのガンマカルボキシルは、提供されるように、追加のアルキルアミン残基にさらに誘導体化される。Ｒ¹とＲ²の選択の基準は、群Ｉの両親媒性化合物について記載したものと同様である。Ｒ³とＲ⁴は、Ｈまたはアルキルであるか、またはこれらのいずれかの誘導体を含む天然のまたは人工アミノ酸でもよい。Ｒ³とＲ⁴アミノ酸基の代表的な例には、トリプトファン（Ｎｏ．９７）およびアルギニン（Ｎｏ．９５）由来のものがある。分類Ｂ／群III両親媒性化合物さらに、細胞内への生物活性分子の移動を促進することができる分類Ｂ／群II I（図６を参照）の陽イオン性両親媒性化合物が提供され、この両親媒性化合物は、構造（III）（式中、Ｚは、そのＮ−原子によりＹ（または、Ｙが欠如している場合は直接Ｘ）に結合したアルキルアミンまたはジアルキルアミンであり、ここでＺがジアルキルアミンなら、そのアルキル基は同じであるかまたは異なり；Ｘは、炭素原子または窒素原子であり；Ｙは、短い結合基であるか、またはＹは欠如しており；Ｒ³は、Ｈ、または飽和もしくは不飽和脂肪族基であり；Ｒ¹は、−−ＮＨ−−、アルキルアミン、またはポリアルキルアミンであり；Ｒ⁴は、Ｈ、または飽和もしくは不飽和脂肪族基であり；Ｒ²は、−−ＮＨ−−、アルキルアミン、またはポリアルキルアミンであり；かつ、Ｒ₁は、Ｒ₂と同じであるかまたは異なる（ただし、Ｒ₁とＲ₂の両方が−− ＮＨ−−であることはない））を有する。脂肪親和性基としてアルキルアミンまたはジアルキルアミンを含有する本発明の実施に従う代表的な陽イオン性両親媒性化合物には、例えばＮ，Ｎ−ジオクタデシルリジンアミド；Ｎ¹，Ｎ¹−ジオクタデシル−１，２，６−トリアミノヘキサン；Ｎ，Ｎ−ジドデシルリジンアミド；Ｎ，Ｎ−ジデシルリジンアミド；スペルミジン−Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル尿素；Ｎ−ミリスチルリジンアミド；およびＮ−（ジオクチルデシルアミノエチル）−リジンアミドがある。代表的な両親媒性化合物は、両親媒性化合物４３、４７、５６、６０、および７３として記載される（図６）。これらの両親媒性化合物および群IIIの他の両親媒性化合物の構造的特徴に関して、以下を考慮すべきである。脂肪親和性アルキルアミンまたはジアルキルアミン基「Ｚ」の選択に関して、下記の表２は代表的構造を提供する。本発明の両親媒性化合物のＺ位に含めるための、適切なアルキルアミンまたはジアルキルアミン基の選択に関連して、この基のアルキル鎖は、両親媒性化合物の溶解性を妨害するほど、またはプラスミドＤＮＡと相互作用する能力を妨害するほど、大きな分子量であってはならない。さらにアルキルアミンまたはジアルキルアミンのアルキル鎖は、１つまたはそれ以上の不飽和点を含有してもよい。Ｒ基、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、およびＲ⁴の選択は、群Ｉの両親媒性化合物について開示されたものに従い、これらのＲ基は、例えば表１から選択される。結合基Ｙは、群Ｉの両親媒性化合物のように選択され、その好適例は、−ＣＨ₂−および＞Ｃ＝Ｏを含む。分類Ｂ／群IV両親媒性化合物さらに、細胞内への生物活性分子の移動を促進することができる群IV（図７を参照）の陽イオン性両親媒性化合物が提供され、この両親媒性化合物は、構造（ IV）（式中、ＡとＢは、Ｏ、ＮまたはＳであり；Ｒ⁵Ｒ⁶、独立にアルキルまたはアシル基であり、飽和されているかまたは不飽和の部位を含有し；Ｃは、−ＣＨ₂−、＞Ｃ＝Ｏ、および＞Ｃ＝Ｓよりなる群から選択され；Ｅ（構造Ｉ、II、III中の「Ｘ」に類似）は、炭素原子または窒素原子であり；Ｄは、−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−または−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−のような結合基であるか、またはＤは欠如しており；Ｒ³は、Ｈ、または飽和もしくは不飽和脂肪族基であり；Ｒ¹は、−−ＮＨ−−、アルキルアミン、またはポリアルキルアミンであり；Ｒ⁴は、Ｈ、または飽和もしくは不飽和脂肪族基であり；Ｒ²は、−−ＮＨ−−、アルキルアミン、またはポリアルキルアミンであり；かつ、Ｒ¹は、Ｒ²と同じであるかまたは異なる（ただし、Ｒ¹とＲ²の両方が−− ＮＨ−−であることはない））を有する。群IVの代表的な両親媒性化合物には、Ｎｏ．６４、７６、８５、８９、９４、９８、１０２、１０５、１１０および１１１がある。これらの両親媒性化合物および群IVの他の両親媒性化合物の構造的特徴に関して、以下を考慮すべきである。Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、およびＲ⁴の選択に関しては、群Ｉ、II、およびIIIの両親媒性化合物について提供された教示が適用される。前述のように、基「Ｅ」は、炭素原子または窒素原子である。Ｒ⁵とＲ⁶は独立にアルキルまたはアシル基であり、好ましくは約８〜約３０炭素原子を含有し、このような基は、１つまたはそれ以上の不飽和点を含有してもよい。群Ｄの選択に関しては、−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−または−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−のようなリンカーが好適であり、その左側が「Ｃ」に結合し、その右側が「Ｅ」に結合するように記載される。群Ｄは、随時欠如していてもよい（両親媒性化合物Ｎｏ．９４）。前記群Ｉ、II、およびIIIに関して提供された教示に基づき、追加のリンカーが選択され、および得られたインビボ試験日（図１５）に基づき、リンカーＤは短いかまたは欠如していることが好適である。分類Ｃ−非Ｔ−型／ステロイドベースの陽イオン性両親媒性化合物前述のように、本発明はまた、例えば：（Ｎ¹−スペルミジンコレステリルカルバメート）（Ｎ¹−サーモスペルミンコレステリルカルバメート）、および（Ｎ¹−スペルミンコレステリルカルバメート）、のような、非Ｔ−型／ステロイドベースの両親媒性化合物（分類Ｃ）の製剤およびその使用を提供する。本発明の実施に従って使用される追加の分類Ｃの両親媒性化合物には、例えば「ＤＣ−ｃｈｏｌ」と呼ぶ３β［Ｎ−（Ｎ¹，Ｎ¹−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロールを含むエバンド（Epand）らの米国特許第５，２８３，１８５号に記載のもの；コレステリル−３β−カルボサミドエチレントリメチルアンモニウムヨウ化物；コレステリル−３β−オキシスクシンアミドエチレントリメチルアンモニウムヨウ化物、およびβ−アラニルコレステロールを含むものなどがある。さらにこのような両親媒性化合物は、ＤＯＴＡＰ、ＣｈｏＴＢ、およびＣｈｏＳＣ（レベンテイス（Leventis）ら、ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ，１０２３，１９９０，ｐｐ．１２４−１３２）を原型とするものを包含するが、四級型で提供されるときは包含しない）。このような両親媒性化合物のさらなるクラスは、ウォーカー（Walker）ら、ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ，９３，１９９６，１５８５−１５９０に記載の、Ｎ¹−（アルキルアミン）結合陽イオン性化粧用両親媒性化合物（例えば、表１に記載の構造体を含む）により提供される。分類Ｄ−非Ｔ−型／非ステロイドベースの陽イオン性両親媒性化合物本発明はまた、以下を用いて製剤化される非Ｔ−型／非ステロイドベースの両親媒性化合物（分類Ｄ）の多様な製剤、その使用を提供する：（１）Ｎ−［１−（（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＭＡ」）を原型とする陽イオン性両親媒性化合物であるが、非四級変種であり、さらにプロトン化することができる（フェルグナー（Felgner）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３−７４１７，１９８７、およびエプスタイン（Eppstein）らの米国特許第４，８９７，３５５号を参照）；（２）ベア（Behr J.P.）、ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，５，１９９４．３８２−３８９に記載の多くの構造を原型とする陽イオン性両親媒性化合物であるが、その非四級変種（その第３章、Ｃ₁₂ＧｌｕＰｈＣ_nＮ＋、およびＣ₁₄ＧｌｕＣ_nＮ＋；第８章、ＴＭＡＧなどを比較されたい）；（３）１−［２−（アシルオキシ）エチル］−２−アルキル（アルケニル）−３ −（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリウムクロリド（ソロジン（Solodin）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９５，３４，１３５３７−１３５４４を参照）を原型とする陽イオン性両親媒性化合物；およびレドレイ（Ledley）ら、ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，６，１９９５，１１２９−１１４４、およびガオ（Gao）ら、ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，２，１９９５，７１０−７２２に記載のような、この分類に一致する追加の分子種。補助脂質１つまたはそれ以上の陽イオン性両親媒性化合物と混合するための本発明の実施において有用な代表的補助脂質には、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＯＰＥ」）、ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン、リソ−ホスファチジルエタノールアミン他のホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、リソ−ホスファチジルコリンおよびコレステロールがある。典型的には、陽イオン性両親媒性化合物対補助脂質の好適なモル比は、約１：１である。しかし、この比（また広範囲にわたって）を変えることは本発明の実施範囲内である（下記の例３を参照）。補助脂質（特に中性補助脂質）との複合体として陽イオン性両親媒性化合物を調製すると、トランスフェクションを促進する両親媒性化合物の能力を増強することは、当該分野で一般的に考えられている。補助脂質で増強された性能は、本発明の多くの両親媒性化合物について観察されているが、本発明の両親媒性化合物は補助脂質無しでもトランスフェクション体として活性である。従って本発明の実施は、細胞内送達機構への補助脂質の参加に関する理論により限定されることなく、また補助脂質の関与を必要としないと考えられる。トランスアシル化反応当該分野でこれまで認識されていないが、いくつかの補助脂質は、同時保存条件下でいくつかのタイプの陽イオン性両親媒性化合物と化学的に反応し、新しい分子種が得られることも測定された。このような新しい分子種の作成は、トランスアシル化のような機構を介して起きると考えられる。この点で、スペルミンコレステロールカルバメート（Ｎｏ．６７）とＤＯＰＥが関与するトランスアシル化反応（これにより、リソＰＥ分子種と特定のアシル陽イオン性両親媒性化合物の複数の型（Ｎｏ．８０と呼ぶ）が得られる）を記載する図４を参照されたい。このような反応について、以下の説明が興味深い。両親媒性化合物Ｎｏ．６７の使用に関して、クロロホルム溶媒中での両親媒性化合物とＤＯＰＥの混合物は、このような反応に参加しないようであることが観察されている。しかし水溶液中で両親媒性化合物と補助脂質を調製すると（ここで、リポソームのような二重層含有構造が生成する）、トランスアシル化が可能になる。さらに、例えばクロロホルムから両親媒性化合物と補助脂質を乾燥して薄膜にすると（こうして、２つの分子種は密接に接触する）、おそらくエントロピー作用の結果としてトランスアシル化も起きる。これらの現象はまた、凍結乾燥した両親媒性化合物／ＤＯＰＥ調製物にも応用できると予測される。従って、両親媒性化合物／ＤＯＰＥ調製物を非常に低温（例えば、−７０℃）で維持することが非常に好ましい。モノ、ジ、またはトリ酢酸塩としての両親媒性化合物Ｎｏ．６７の調製もまた、トランスアシル化を遅らせることが測定されている。本発明の治療上有効な薬剤組成物は、このようなトランスアシル化副産物、または他の副産物を含有してもよく、およびこのような副産物の存在は、それらを含有する組成物の治療的用途を妨害しないことは、理解されるべきである。このような組成物の使用は、本発明の実施範囲内にあり、従ってこのような組成物およびその新規分子種は、具体的に特許請求される。薬剤組成物の調製とその投与本発明は、生物活性分子の治療上有効量の細胞内送達を促進する薬剤組成物を提供する。本発明の薬剤組成物は、生物活性分子が組織および臓器（例えば、胃粘膜、心臓、肺、および固形腫瘍）に入ることを促進する。さらに、本発明の組成物は、インビトロで維持された（例えば、組織培養）細胞に生物活性分子が入ることを促進する。本発明の化合物の両親媒性のために、これらが、細胞膜の脂質、他の細胞表面分子、および組織表面に会合し、およびそこに融合または結合することを可能にする。両親媒性化合物により形成される１つのタイプの構造体は、やや球形の二重層に形成される小胞であるリポソームであり、これは生物学的液体中で安定であり、細胞内送達の標的の生物学的分子を捕捉することができる。細胞膜と融合することにより、このようなリポソーム組成物は、生物活性分子を一緒に運搬して、これらがエンドサイトーシスやピノサイトーシスを含む１つまたはそれ以上の細胞プロセスを介して細胞の内部に入ることを可能にする。しかし治療用組成物への使用が提唱されている多くのクラスの両親媒性化合物または他の脂質様分子と異なり、本発明の両親媒性化合物は、有効であるために高度に組織化された小胞を形成する必要はなく、および実際広範なゆるく組織化された構造（これらが結合する生物活性分子とともに）を取ることができる。このような構造体の任意のものが、本発明の薬剤調製物中に存在し、その有効性に寄与することができる。本発明の両親媒性化合物を使用して治療量で細胞内に提供することができる生物活性分子は、以下を含む：（ａ）ポリヌクレオチド、例えば当該分野で公知の治療上有効なタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、およびｍＲＮＡ、（ｂ）リボゾームＲＮＡ；（ｃ）遺伝子の転写産物を不活性化するのに有用であり、例えば悪性細胞の増殖を制御するための治療法として有用である、アンチセンスポリヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡ）；および（ｄ）リボザイム。一般的におよびそこから内容物が漏出する可能性があるために、多くの陽イオン性両親媒性化合物から形成される小胞または他の構造体は、低分子量の生物活性分子を送達するのに、当業者には好まれない。本発明の好適な実施態様ではないが、このような低分子量分子を細胞内に送達することは本発明の実施の範囲内である。送達することができる低分子量生物活性分子の代表的タイプは、ホルモンおよび抗生物質である。標的細胞および／またはその細胞下コンパートメントへ生物活性分子が入ることを促進するために、２つまたはそれ以上の分子種が組合せて使用されるように、本発明の陽イオン性両親媒性化合物種は混合してもよい。本発明の陽イオン性両親媒性化合物はまた、当該分野で公知の両親媒性化合物とともに使用するために混合してもよい。本発明の薬剤組成物の投与量は、生物活性分子の半減期、生物活性分子の力価、両親媒性化合物の半減期、両親媒性化合物またはその分解産物の副作用の可能性、投与経路、患者の状態などの要因に依存して、変化してもよい。このような要因は、当業者が決定することができる。本発明の薬剤組成物の極めて正確な投与量を提供するために、種々の投与方法が使用できる。このような調製物は、経口的、非経口的、局所的、粘膜から、または患者の体腔への調製物の注入、または生体分解性物質を含む除放性製剤を使用して、または追加のミセル、ゲルおよびリポソームを使用するオンサイト送達により、投与することができる。噴霧装置、粉末吸入器、およびエアゾル溶液は、このような調製物を呼吸器官に投与するために使用される代表的な方法である。さらに、本発明の治療用組成物は一般的に、賦形剤（例えば、炭水化物である乳糖、トレハロース、ショ糖、マンニトール、マルトース、またはガラクトース）とともに製剤化され、使用前にこのような賦形剤の存在下で凍結乾燥（および次に再度水和）してもよい。本発明の各両親媒性化合物の最適化された製剤の条件は、薬学分野の当業者により決定可能である。例えばスペルミジンコレステロールカルバメート（両親媒性化合物Ｎｏ．５３）については、特にＤＮＡの濃度が上昇した時、両親媒性化合物／ＤＮΛ凝集物の生成を防ぐために、マンニトールよりショ糖の使用が好ましいことがわかっている。そのような賦形剤を添加すると、凍結乾燥された薬剤組成物の保存中の粘稠度が維持され、凍結乾燥状態から水和した時に起きる可能性のある凝集、不溶性などの問題を防止することができる。従って本発明の主要な面は、生物活性分子（例えば、ポリヌクレオチド）および１つまたはそれ以上の陽イオン性両親媒性化合物（随時１つまたはそれ以上の補助脂質を含む）を含む組成物を提供し、次に該組成物を、上記の１つまたはそれ以上の賦形剤の存在下で維持し、得られる組成物は液体または固体（好ましくは凍結乾燥）型であり、その結果：（１）生物活性分子の治療活性は実質的に保存され；（２）両親媒性化合物（または両親媒性化合物／ＤＮＡ複合体）のトランスフェクション増強性は維持される、ことを特徴とする。理論には限定されないが、賦形剤は：（１）容器の表面との相互作用を最小にする、（２）複合体の不可逆的凝集を防ぐ、および（３）両親媒性化合物／ＤＮＡ複合体を化学的に安定な状態に維持、すなわち酸４化および／または加水分解を防ぐ、ことを含む１つまたはそれ以上の作用を介して、両親媒性化合物と生物活性分子の相互作用（複合体）を安定化させると考えられる。本発明の薬剤組成物中の賦形剤の存在は、組成物を安定化しその保存と操作を容易にするが、多くの賦形剤の適度な濃度が、それらを含有する薬剤組成物のトランスフェクション増強能力を妨害することもあることがわかっている。この点で、本発明の両親媒性化合物の追加のおよび有用な特徴は、当該分野で公知の両親媒性化合物に比較して本発明の両親媒性化合物のインビボの活性は大幅に増強されているため、そのような副作用の可能性は最小にすることができることである。理論に限定されるつもりはないが、浸透圧ストレス（低い総溶質濃度で）は、インビボでの細胞へのポリヌクレオチドのトランスフェクションの成功に正に寄与することがあると考えられている。このようなストレスは、緩衝化されていない水中で提供された薬剤組成物が、標的細胞に接触すると起きることがある。従って本来なら好適な組成物の使用が、すでにストレスのかかった標的組織（例えば、嚢胞性繊維症患者の傷害された肺組織）の治療と適合性がないことがある。従って、およびショ糖を例として使用して、約１５mM〜約２００mMの範囲のこの賦形剤の濃度の選択は、（１）保存に対する薬剤組成物の安定化、および（２）トランスフェクション性に対して組成物中の高濃度の溶質が及ぼす可能性のある作用の最小化、との間の妥協である。特定の製剤のための特定の賦形剤の最適濃度の選択は、実験により決定されるが、これはこのような製剤の分野の当業者が決定することができる。プロトン化状態本発明のさらなる面は、治療用組成物を形成するためにプラスミドＤＮＡのような生物活性分子に接触する前の、本発明の陽イオン性両親媒性化合物のプロトン化状態に関する。治療用組成物を作成するために、充分にプロトン化、部分的にプロトン化、または遊離塩基の型の両親媒性化合物を利用することは、本発明の実施の範囲内である。しかし本発明の目的においては、部分的にプロトン化された陽イオン性両親媒性化合物または遊離塩基の型が好ましい。塩でない形の陽イオン性両親媒性化合物（すなわち、調製物中にプロトンの供給源がない）の調製が好ましい。両親媒性化合物は調製中に種々のプロトン化を受けるが、中性の補助脂質（例えば、ＤＯＰＥ）または活性の生物学的分子（例えば、ＤＮＡプラスミド）と組合せるときは、完全にプロトン化していない状態が好ましい。さらに補助脂質自身は、陽イオン性両親媒性化合物に対するプロトンの供給源となることに注意されたい。しかし、本明細書で使用される操作条件下で、そのようなプロトンの寄与は、陽イオン性両親媒性化合物を完全にプロトン化すると予測される。さらに平衡の問題に基づき、特定の時期に、陽イオン性両親媒性化合物の集団（補助脂質または治療用分子と接触している場合を含む）は、完全にプロトン化した状態で、ある割合の分子を含有することに注意されたい。しかし、混合物の平均プロトン化が、全体の電荷が両親媒性化合物が完全にプロトンされていないことを示すようなものなら、陽イオン性両親媒性化合物は完全にはプロトン化されておらず、その使用は本発明の実施の範囲内にある。両親媒性化合物Ｎｏ．６７（スペルミンコレステロールカルバメート）に関して、ＤＯＰＥ（これ自身は双性イオン）との組成物をトランスフェクションするためにこの両親媒性化合物を提供する時、トランス遺伝子発現は、遊離塩基について最適であるが、両親媒性化合物を酢酸塩として調製すると低下することが観察された。一および二酢酸により活性は段階的に低下し、三酢酸塩では最小であった。記載した条件下では、両親媒性化合物と接触するために提供されるプラスミドＤＮＡは、水中のナトリウム塩として調製された（緩衝液は無し）。両親媒性化合物Ｎｏ．３７（例１１を参照）について同様の結果が観察され、補助脂質およびプラスミドＤＮＡと接触する前に、遊離塩基型の両親媒性化合物の保存により、レポーター遺伝子発現が約５０倍改善された。合成法以下の方法は、本発明のいくつかの陽イオン性両親媒性化合物の製造を例示する。これらの化合物の製造および本発明の他の化合物の製造のための、他の方法を当業者は認識できるであろう。群Ｉの両親媒性化合物（Ａ）Ｎ⁴−スペルミジンコレステリルカルバメートスペルミジンコレステロールカルバメート（図１、Ｎｏ．５３）は、図８に概説する以下の方法に従って合成した。Ｎ¹，Ｎ⁸−ジＣＢＺ−Ｎ⁴−スペルミジンコレステロールカルバメートの合成Ｎ¹，Ｎ⁸−ジカルボベンゾキシスペルミジン（収率６１％、融点１０４〜１０５℃）を、シャルマ（S.K．Sharma）、ミラー（M.J．Miller）、およびペイン（ S.M．Payne）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９８９，３２，３５７−３６７の方法に従って調製した。Ｎ¹，Ｎ⁸−ジカルボベンゾキシスペルミジン（２５ｇ、６０．５ミリモル）とトリエチルアミン（２５ml、１７８ミリモル）を、６２５mlの無水塩化メチレン中に溶解し、０〜４℃に冷却し、窒素下で攪拌した。クロロギ酸コレステリル（２７．２ｇ、６０．６ミリモル）を、２５０mlの塩化メチレンに溶解し、２０分かけて反応物に加えた。添加により白色の沈殿物が生じた。添加完了後、反応物を０〜４℃で１０分攪拌し、次に室温で１．５時間攪拌した。この時点で、白色の沈殿物が完全に溶解した。反応を、ヘキサン／酢酸エチル６／４の溶出液を用いてＴＬＣで追跡した（生成物のＲｆ＝０．２５）。この反応混合物に、６２５mlの塩化メチレンと６２５mlの水を加えた。次に層を分離させた。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を真空下で濃縮して油状物を得た。次に真空乾燥を一晩行なった。この粗生成物は、のりのような粘稠度を有した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（２kgのシリカゲル、溶出液−ヘキサン／酢酸エチル６／４）により精製して、４６．８ｇの３−β−［Ｎ⁴−（Ｎ¹，Ｎ⁸−ジカルボキシスペルミジン）カルバモイル］コレステロール（ここでは、Ｎ¹，Ｎ⁸−ジＣＢＺ−Ｎ⁴−スペルミジンコレステロールカルバメートとも記載する）を収率９３％で得た。スペルミジンコレステロールカルバメートの最終合成窒素下で１０％白金担持活性炭６．０ｇに、エタノール１リットル中の３０ｇの３−β−［Ｎ⁴−（Ｎ¹，Ｎ⁸−ジカルボベンゾキシスペルミジン）カルバモイル］コレステロール溶液を加えた（図１３を参照）。反応混合物に窒素を吹き付け、水素下で１８時間撹拌した（大気圧下）。混合物に再度窒素を吹き付け、１０ｇベッドのセライトでろ過した。エタノール中の１０％トリエチルアミン２リットルでフィルターケーキを洗浄し、合わせたろ液を真空下で濃縮してゲルを得た。次に生成物を真空下で一晩乾燥して粘性の固体を得た。この粗生成物をカラムクロマトグラフィー（２kgのシリカゲル、溶出液−４リットルのクロロホルム／メタノール９５／５、次に３０リットルのクロロホルム／メタノール／イソプロピルアミン９５／５／５、Ｒｆ＝０．２４）で精製して、１３．１ｇの所望の所望のスペルミジンコレステロールカルバメートを収率６４％で得た。この物質をＨＰＬＣ（Ｃ−１８逆相カラム、線形勾配溶出液プロフィール−メタノール／イソプロパノール／水／トリフルオロ酢酸６０／２０／２０／０．１〜メタノール／イソプロパノール／トリフルオロ酢酸７０／３０／０．１〜メタノール／イソプロパノール／クロロホルム／トリフルオロ酢酸６０／２０／２０／０．１）分析により、純度は９９．２％であり、７−デヒドロコレステロール類似体が０．８％のレベルで存在した。本例および以下の例に関して、すべてのＴＬＣプレートは、リンモリブデン酸で視覚化した。（Ｂ）Ｎ⁴−スペルミンコレステリルカルバメートスペルミンコレステロールカルバメート（図１、Ｎｏ．６７）を、図９に概説する以下の方法に従って調製した。Ｎ¹，Ｎ¹²−ジＣＢＺ−スペルミンクロロギ酸べンジル（１．７６ｇ、１．５ml、１０．３６ミリモル）を塩化メチレン（５ml）に溶解し、窒素雰囲気下で三ツ首フラスコ中に入れた。イミダゾール（１．４ｇ、２０．６ミリモル）を塩化メチレン（２０ml）に溶解し、添加ロートに入れた。三ツ首フラスコを０℃に冷却し、イミダゾール溶液を２０分かけて徐々に加えた。混合物を室温で１時間攪拌し、次に塩化メチレン（２５ml）とクエン酸（１０％，２５ml）を加えた。層を分離し、有機画分をクエン酸（１０％，２５ml）で洗浄した。有機成分を硫酸マグネシウムで乾燥し、真空下で濃縮した。残渣を高真空下で周囲温度で１時間乾燥した。残渣にジメチルアミノピリジン（３５mg）、塩化メチレン（２５ml）を加え、混合物を窒素雰囲気下で０℃に冷却した。添加ロートに、塩化メチレン（２５ml ）中のスペルミン（１ｇ、４．９４ミリモル）を加えた。スペルミン溶液を１５分かけて徐々に加えた。反応混合物を周囲温度で一晩撹拌し、次に真空下で濃縮した。残渣を酢酸エチル（８０ml）に溶解し、水（１５ml）で３回洗浄した。有機物を硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、真空下で濃縮して白色の固体を得た。この物質をフラッシュクロマトグラフィー（６５ｇシリカゲル、１００：１００：１０クロロホルム：メタノール：水酸化アンモニウム、生成物のＲｆ＝０．３３）して、高真空下で乾燥後、１．０１ｇ（２．１４６ミリモル、収率４３％）の生成物を得た。Ｎ¹，Ｎ¹²−ジＣＢＺ−Ｎ⁴−スペルミンコレステリルカルバメートクロロギ酸コレステリル（９６４ｇ、２．１５ミリモル）をクロロホルム（１０ml）に溶解し、クロロホルム（１０ml）中のＮ¹，Ｎ¹²−ジＣＢＺ−スペルミン（１．０１ｇ、２．１５ミリモル）、トリエチルアミン（１ml）の冷却溶液（０℃）に滴下して加えた。反応物を室温まで加熱し、２時間攪拌した。反応溶液に、水（２５ml）とクロロホルム（２５ml）を加えた。層を分離し、有機画分を硫酸マグネシウムで乾燥した。溶液を真空下で濃縮して、粗物質を得て、これをフラッシュクロマトグラフィー（６８ｇシリカゲル、メタノール／クロロホルム１／４、生成物のＲｆ＝０．３６）して、１．２３ｇ（１．３９ミリモル、収率６８％）の生成物を得た。Ｎ⁴−スペルミンコレステリルカルバメートの最終合成Ｎ¹，Ｎ¹²−ジＣＢＺ−Ｎ⁴−スペルミンコレステリルカルバメート（２６２mg ，０．３００ミリモル）を、５mlの酢酸に溶解し、４５mgの１０％白金担持活性炭を加えた。この溶液に窒素を吹き付け、大気圧の水素下で攪拌した。水素分解を７時間進行させた。反応混合物をろ過し、触媒を４０mlの酢酸エチル／酢酸９／１で洗浄し、ろ液を真空下で濃縮して残渣を得た。粗生成物を３５mlの１ＮＮａＯＨに溶解し、４０mlのクロロホルム／メタノール９／１で３回抽出した。合わせた有機画分を、２０mlの水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶液をろ過し、真空下で濃縮し、真空下で乾燥して、１２５mgの所望の生成物を収率６７％で得た。上記方法に関連して、触媒の毒性を最小にするために水素分解は酸性条件下で行うことに注意されたい。尿素類似体（例えば、スペルミンまたはスペルミジンコレスタミン尿素）は、有機合成の当業者に公知の反応順序で調製できる。例えば、アミンは等モルのカルボジイミドで処理して、次に第２のアミンを加えて所望の尿素を得る。（Ｃ）Ｎ，Ｎビス（３−アミノプロピル）−Ｏ−コレステリル−３−カルバメートＮ，Ｎビス（３−アミノプロピル）−Ｏ−コレステリル−３−カルバメート（図１、Ｎｏ．６９）を、以下の方法に従って調製した。Ｎ¹，Ｎ¹²−ジＣＢＺ− Ｎ⁴−スペルミンについて前記した方法を使用して、ビス（３−アミノプロピル）アミンを調製したが、Ｎ−（３−アミノプロピル）１，３−プロパンジアミンを反応物としてスペルミンの代わりに使用した、純粋な生成物を、クロロホルム／メタノール／水酸化アンモニウム８０／２０／０．５を使用してシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより、収率３４％で単離した。こうして調製したビス（３−ＣＢＺアミノプロピル）アミンを次に、Ｎ¹，Ｎ⁸ −ジＣＢＺ−Ｎ⁴−スペルミジンコレステリルカルバメートの合成について記載した方法に従ってクロロギ酸コレステリルと反応させた。純粋な生成物（Ｎ，Ｎビス（３−ＣＢＺアミノプロピル）−Ｏ−コレステリル−３−カルバメート）を、収率７３％で得た。Ｎ⁴−スペルミジンコレステリルカルバメートの合成に関して前記した方法に従って、Ｎ，Ｎビス（３−ＣＢＺアミノプロピル）−Ｏ−コレステリル−３−カルバメートから、ＣＢＺ基の水素分解により、Ｎ，Ｎビス（３−アミノプロピル）−Ｏ−コレステリル−３−カルバメートの合成を完了した。（Ｄ）Ｎ，Ｎビス（６−アミノヘキシル）−Ｏ−コレステリル−３−カルバメートＮ，Ｎビス（６−アミノヘキシル）−Ｏ−コレステリル−３−カルバメート（図１、Ｎｏ．７０）を、以下の方法に従って調製した。まず、反応物としてスペルミンの代わりにビス（ヘキサメチレン）トリアミンを使用した以外は、Ｎ¹，Ｎ¹²−ジＣＢＺ−スペルミンについて記載した方法を使用して、ビス（６−ＣＢＺアミノヘキシル）アミンを調製した。トルエンから再結晶化して、収率２４％で純粋な生成物を単離した。次に、Ｎ¹，Ｎ⁸−ジＣＢＺ−Ｎ⁴−スペルミジンコレステリルカルバメートの合成について前記した方法に従って、ビス（６−ＣＢＺアミノヘキシル）アミンをクロロギ酸コレステリルと反応させた。ヘキサン／酢酸エチル７／３を使用してシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより、生成物Ｎ，Ｎビス（６−ＣＢＺアミノヘキシル）−Ｏ−コレステリル−３−カルバメートを収率４０％で単離した。（Ｅ）リジン３−Ｎ−ジヒドロコレステリルカルバメートリジン３−Ｎ−ジヒドロコレステリルカルバメート（図１、パネルＣ）を、以下の方法に従って調製した。０℃で窒素雰囲気下で攪拌したＴＨＦ（２．０ml、アルドリッチ（Aldrich））中のジヒドロコレステロール（５．０ｇ）１２．９ミリモル、アルドリッチ（Aldrich））、フタルイミド（２．０ｇ）１３．６ミリモル、アルドリッチ（Aldrich））、およびトリフェニルホスフィン（３．８ｇ）１３．６ミリモル、アルドリッチ（Aldrich））の溶液に、ジエチルアゾジカルボキシレート（２．３ml）１４．５ミリモル、アルドリッチ（Aldrich））を滴下して加えた。添加完了後、反応混合物を周囲温度まで加熱し、一晩攪拌した。反応混合物を真空下で濃縮して残渣にした。この残渣を５０mlのヘキサン／酢酸エチル９５／５に溶解して、沈殿物が生成した。混合物をろ過した。ろ液を真空下で濃縮乾固し、２５mlのヘキサン／酢酸エチル９５／５に溶解し、２００ｇのシリカゲルでクロマトグラフィーを行なった（溶出液２リットルのヘキサン／酢酸エチル９５／５、次に１リットルのヘキサン／酢酸エチル９０／１０）。所望の３−フタルイミドコレスタン（５．４３ｇ）を収率７６％で得た。３−フタルイミドコレスタン（５．４０ｇ、９．７５ミリモル）を６０mlのメタノールに溶解し、無水ヒドラジン（３．１ml、９９ミリモル）を加えた。反応混合物を攪拌し、窒素雰囲気下で４時間加熱還流した。次に混合物を室温まで冷却して、３．１mlの濃ＨＣｌを加え、得られる混合物を一晩加熱還流した。周囲温度まで冷却して、１００mlのジエチルエーテルと５０mlの１ＮＮａＯＨを加え（最終ｐＨ１０．１）、層を分離した。水層を５０mlのジエチルエーテルで抽出し、合わせた有機画分をろ過した。ろ液を真空下で濃縮し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール９０／１０）をして、２．２４ｇの３−アミノコレスタンを収率５９％で得た。Ｌ−Ｎａ，Ｎｅ−ジＢＯＣリジンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（２８６ｇ、０．６４４ミリモル、シグマ（Sigma））および３−アミノコレスタン（２５０ｇ、０．６４４ミリモル）を５mlの塩化メチレンに溶解し、０．１mlのトリエチルアミンを加え、得られた溶液を窒素雰囲気下で周囲温度で一晩攪拌した。反応混合物に１０mlの水と２５mlの塩化メチレンを加えて、層を分離した。水層を２５mlの塩化メチレンで抽出し、合わせた有機画分を硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を真空下で濃縮し、残渣を２５ｇのシリカゲルのクロマトグラフィー（溶出液−ヘキサン／酢酸エチル６／４、試料はヘキサン／酢酸エチル９／１で添加した）により精製した。精製した物質に２５mlのクロロホルムとＨＣｌガスを２時間溶液にバブリングし、次に窒素で１０分バブリングした。溶液を真空下で濃縮して、２９９ｇの所望の生成物を収率７９％でジヒドロ塩酸塩として得た。（Ｆ）Ｎ¹，Ｎ⁸−ビス（３−アミノプロピル）−Ｎ⁴−スペルミジンコレステリルカルバメートＮ¹，Ｎ⁸−ビス（３−アミノプロピル）−Ｎ⁴−スペルミジンコレステリルカルバメート（図１、Ｎｏ．７５）を、以下の方法に従って調製した。Ｎ⁴−スペルミジンコレステリルカルバメート（１．１４ｇ、２．０４ミリモル）をメタノール（５ml）に溶解した。新たに蒸留したアクリロニトリル（０．２８ml、４．２９ミリモル）を加え、溶液を室温で１８時間攪拌した。溶媒を真空下で濃縮して油状物を得た。次に真空乾燥を一晩行なった。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（１２５ｇシリカゲル、溶出液−クロロホルム／メタノール１／９）により精製して、１．１５ｇ（８５％）のＮ¹，Ｎ⁸−ビス（シアノエチル）−Ｎ⁴− スペルミジンコレステリルカルバメートを得た。ラネイニッケルの５０％スラリー（１．２ｇ、アルドリッチ（Aldrich））を、９５％エタノール（５０ml）中の１ＭＮａＯＨとともにパーボンベに入れた。Ｎ¹，Ｎ⁸−ビス（シアノエチル）Ｎ⁴−スペルミジンコレステリルカルバメートをエタノール（３５ml）に溶解し、ボンベに加えた。小胞からガスを抜いてアルゴン圧（８０〜１００psi）下に３回置き、次にガスを抜いて水素圧（１００psi）下に３回置いた。反応物を水素圧（１００psi）下で室温で７２時間攪拌した。小胞からガスを抜いてアルゴン圧下に置いた。ろ過して触媒を除去した。ろ液を真空下で濃縮した。得られた油状物を、２：１塩化メチレン：メタノール（１００ｍｌ）に溶解し、水（３５と２５ml）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を真空下で濃縮し、残渣を１００ｇのシリカゲルのクロマトグラフィー（溶出液− クロロホルム／メタノール／濃水酸化アンモニウム４０／２５／１０、試料はクロロホルム／メタノール４０／２５で添加した）で精製した。精製した物質をイソプロパノール（３×５０ml）で真空下で濃縮し、次に真空下で乾燥して９８６ｇ（８５％）のＮ¹，Ｎ⁸−ビス（３−アミノプロピル）Ｎ⁴−スペルミジンコレステリルカルバメートを得た。（Ｇ）Ｎ（Ｎ⁴−３−アミノプロピル−スペルミジン）コレステリルカルバメートＮ（Ｎ⁴−３−アミノプロピル−スペルミジン）コレステリルカルバメート（図１、Ｎｏ．７８）を、以下のように調製した：Ｎ¹，Ｎ⁸−ジカルボベンゾキシスペルミジン（１．０ｇ、２．４ミリモル）をメタノール（１０ml）に溶解した。新たに蒸留したアクリロニトリル（０．３８ ml、４．５ミリモル）を加え、反応物を室温で１８時間攪拌した。溶媒を真空下で濃縮して油状物を得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（１００ｇシリカゲル、溶出液−クロロホルム／メタノール１／１９）により精製して、１．１０ｇ（９７％）のＮ⁴−２−シアノエチル−Ｎ¹，Ｎ⁸−ジカルボベンゾキシスペルミジンを得た。Ｎ⁴−２−シアノエチル−Ｎ¹，Ｎ⁸−ジカルボベンゾキシスペルミジン（０．５ｇ、１．０７ミリモル）をメタノール（５ml）に溶解し、ＣｏＣｌ₂（２８０m g、２．１５ミリモル、アルドリッチ（Aldrich））を加えた。青い溶液を氷浴で冷却し、１５分かけてＮａＢＨ₄（４０５mg、１０．７ミリモル、アルドリッチ（Aldrich））を少しずつ加えた。得られた黒い溶液を室温で１時間攪拌した。この反応物に、塩化メチレン／メタノール２／１（３０ml）を加えた。黒い沈殿物が生じた。ここに水（２０ml）を加え、混合物をろ過した。得られた層を分離し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤をろ過し、ろ液を真空下で濃縮して油状物を得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（５０ｇシリカゲル、溶出液−クロロホルム／メタノール／濃水酸化アンモニウム１００／１００／５）により精製して、３０９mg（６２％）のＮ⁴−３−アミノプロピル−Ｎ¹，Ｎ⁸ −ジカルボベンゾキシスペルミジンを得た。塩化メチレンに溶解したＮ⁴−３−アミノプロピル−Ｎ¹，Ｎ⁸−ジカルボベンゾキシスペルミジン（３００mg、０．６６ミリモル）に、窒素下でトリエチルアミンを加えた。クロロギ酸コレステリル（３２６mg、０．７２６ミリモル、アルドリッチ（Aldrich））を塩化メチレンに溶解し、反応物に滴下して加えた。混合物を室温で２時間攪拌した。塩化メチレン（２５ml）と水（１０ml）を加えた後、層を分離した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を真空下で濃縮して６４０mgの粗生成物を得た。残渣を８０ｇのシリカゲルのクロマトグラフィー（溶出液−クロロホルム／メタノール９０／１０、試料はクロロホルム／メタノール９０／１０中で添加した）で精製した。精製した物質を真空下で濃縮し、次に真空下で乾燥して３２９mg（５７％）のＮ−（Ｎ⁴−３−アミノプロピル−Ｎ¹，Ｎ⁸−ジカルボベンゾキシスペルミジン）コレステリルカルバメートを得た。１０％白金担持活性炭（６５mg、アルドリッチ（Aldrich））に、酢酸（２５m l）中のＮ−（Ｎ⁴−３−アミノプロピル−Ｎ¹，Ｎ⁸−ジカルボベンゾキシスぺルミジン）コレステリルカルバメート（３００mg）の溶液を加えた。反応物を水素下に置き、反応物をろ過した。触媒を酢酸エチル（５０ml）中の１０％酢酸で洗浄した。ろ液を真空下で濃縮して油状物を得た。油状物を２／１塩化メチレン／メタノール（３５ml）に溶解し、１ＭＮａＯＨ（１５ml）で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を真空下で濃縮し、真空下で乾燥して１９６mg（９３％）のＮ−（Ｎ⁴−３−アミノプロピルスペルミジン）コレステリルカルバメートを得た。（Ｈ）Ｎ−［Ｎ¹，Ｎ⁴，Ｎ⁸−トリス（３−アミノプロピル）スペルミジン］コレステリルカルバメートＮ−（Ｎ⁴−３−アミノプロピルスペルミジン）コレステリルカルバメートにアクリロニトリル（収率９０％）を反応させ、次にＮ¹，Ｎ⁸−ビス（３−アミノプロピル）Ｎ⁴−スペルミジンコレステリルカルバメートについて記載したようにラネイニッケル（収率７５％）でジ付加物を還元して、Ｎ−［Ｎ¹，−Ｎ⁴，Ｎ⁸ −トリス（３−アミノプロピル）スペルミジン］コレステリルカルバメート（図１、Ｎｏ．９６）を調製した。（Ｉ）Ｎ，Ｎ−ビス（４−アミノブチル）コレステリルカルバメートＮ，Ｎ−ビス（４−アミノブチル）コレステリルカルバメート（図１、Ｎｏ．８２）を以下のように調製した。ｎ−ブタノール（５０ml）中のベンジルアミン（２．０ｇ、１８．６ミリモル、アルドリッチ（Aldrich））、炭酸ナトリウム（４．４ｇ、４２ミリモル）およびヨウ化カリウム（１．４ｇ、９．５ミリモル）の混合物に、窒素下で４−クロロブチロニトリル（４．０ml、９５ミリモル）を加えた。反応物を窒素下で４８時間攪拌し還流した。室温に冷却後、ジエチルエーテル（５０ml）を加え、沈殿物をろ過して除去した。ろ液を真空下で濃縮して油状物を得た。トルエン（１００ml）を加え、溶液を真空下で濃縮した。クロロホルム（１００ml）を加え、再度溶液を真空下で濃縮し、次に１８時間真空下で乾燥した。得られた油状物をクロロホルム（１００ml）に溶解し、ろ過し、真空下で濃縮した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（２５０ｇシリカゲル、溶出液−ヘキサン／酢酸エチル６０／４０）を行い、３．７５ｇ（９７％）のＮ，Ｎ−ビス（３−シアノプロピル）ベンジルアミンを得た。Ｎ，Ｎ−ビス（３−シアノプロピル）ベンジルアミン（３．７ｇ、１７．８ミリモル）をエタノール（１５０ml）に溶解し、酢酸（４ml）を加えた。この溶液を、窒素下で１０％白金担持活性炭（４００mg）に加えた。混合物を水素下に置き、反応物を室温で１８時間攪拌した。反応物を窒素下でおいた。触媒をろ過して除去し、エタノール（１５０ml）で洗浄した。ろ液を真空下で濃縮し、クロロホルム（５０ml）を加え、再度真空下で濃縮した。得られた油状物を０．５時間真空下で乾燥し、次の反応に直接使用した。この塩化メチレン（１００ml)に溶解したこの油状物に、窒素下でトリエチルアミン（５mL、３５ミリモル）を加え、溶液を氷浴で冷却した。クロロギ酸コレステリル（６．２ｇ、１３．８７ミリモル）を塩化メチレン（１００ml）に溶解し、この溶液を１０分かけて反応物に滴下して加えた。冷却浴を除去し、反応物を窒素下で室温で１８時間攪拌した。塩化メチレン（１００ml）と水（１００ml）を加え、得られた層を分離した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を真空下で濃縮し、１時間真空下で乾燥した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（６００ｇシリカゲル、溶出液−ヘキサン／酢酸エチル６０／４０）を行い、１．０５ｇ（１０％）のＮ，Ｎ−ビス（３−シアノプロピル）コレステリルカルバメートを得た。ラネイニッケルの５０％スラリー（１．２ｇ）を、９５％エタノール（５０ml ）中の１ＭＮａＯＨとともにパーボンベに入れた。Ｎ，Ｎ−ビス（３−シアノプロピル）コレステリルカルバメート（１．０ｇ、１．７７ミリモル）をエタノール（１００ml）に溶解し、ボンベに加えた。小胞からガスを抜いてアルゴン圧（８０〜１００psi）下に３回置き、次にガスを抜いて水素圧（１００psi）下に３回置いた。反応物を水素圧（１００psi）下で室温で４日間攪拌した。小胞からガスを抜いてアルゴン圧下に置いた。ろ過して触媒を取り出した。ろ液を真空下で濃縮した。得られた油状物を、２：１塩化メチレン：メタノール（２５０ｍｌ）に溶解し、水（７５と５０ml）で２回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を真空下で濃縮し、残渣を１１０ｇのシリカゲルのクロマトグラフィー（溶出液−クロロホルム／メタノール／ｉＰｒＮＨ₂９５／５／５、試料はクロロホルム／メタノール９５／５で添加した）で精製した。精製した物質を真空下で濃縮し、次に真空下で乾燥して９００ｇ（８５％）のＮ，Ｎ −ビス（４−アミノプロピル）コレステリルカルバメートを得た。（Ｊ）Ｎ，Ｎ−ビス（Ｎ’−３−アミノプロビル−４−アミノブチル）コレステリルカルバメートＮ，Ｎ−ビス（Ｎ’−３−アミノプロピル−４−アミノブチル）コレステリルカルバメート（図１、Ｎｏ．８３）は、Ｎ¹，Ｎ⁸−ビス（３−アミノプロピル） −Ｎ⁴−スペルミジンコレステリルカルバメートの調製について記載したように、Ｎ，Ｎ−ビス（４−アミノプロピル）コレステリルカルバメートをアクリロニトリル（収率８２％）と反応させ、次にジアクリロニトリル付加物をラネイニッケル（収率８１％）で還元して調製した。（Ｋ）Ｎ⁴スペルミジンコレステリルカルボキサミドＮ⁴スペルミジンコレステリルカルボキサミド（図１、Ｎｏ．９０）を以下のように調製した。ＴＨＦ（（５０ml）中の塩化コレステリル（５．０ｇ）１２．３ミリモル）の溶液を、還流しながら０．５時間かけて、ＴＨＦ（２５ml）中のマグネシウムくず（３９０mg）に滴下して加えた。まず１つまみのヨウ素と３滴のヨードメタンを加えて反応を開始した。３時間還流後、反応物を室温に冷却した。混合物をドライアイス（１０ｇ）に注ぎ、次に１時間攪拌した。溶液を氷浴中で冷却し、氷冷した１Ｍ硫酸（１００ml）に加えた。５分間撹拌後、塩化ナトリウム（１ｇ）とジエチルエーテル（１００ml）を加えた。層を分離し、水層をジエチルエーテル（１００ml）で抽出した。合わせた有機層を、水（３０ml）中のチオ硫酸ナトリウム５水和物（１２０mg）の溶液で洗浄した。有機層を真空下で濃縮し、１８時間真空下で乾燥した。粗固体をヘキサン（２５ml）で粉砕した。ろ過後固体を氷冷ヘキサン（１０ml）で洗浄した。固体を１時間真空下で乾燥した。得られたコレステリルカルボン酸（３．Ｏｇ、５９％）は、純度約９０％であり、さらに精製することなく使用した。コレステリルカルボン酸（５００mg、１．２ミリモル）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１４０mg、１．２ミリモル）を塩化メチレンに溶解した。この溶液に、ジシクロヘキシルカルボジイミド（２７５mg、１．３２ミリモル）を加え、反応物を窒素下で２時間撹拌した。Ｎ¹，Ｎ⁸−ジカルボベンゾキシスペルミジン（４７４mg、１．２ミリモル）とトリエチルアミン（１．２ml、７．１ミリモル）を加え、反応物を窒素下で72時間撹拌した。反応物をろ過し、沈殿物を塩化メチレン（５０ml）で洗浄した。ろ液を水（２５ml）で洗浄した。分離した有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を真空下で濃縮し、残渣を１５０ｇのシリカゲルクロマトグラフィー（溶出液−ヘキサン／酢酸エチル１／１）により精製した。精製した物質を真空下で濃縮し、次に真空下で乾燥して６８０mg （７０％）のＮ¹，Ｎ⁸−ジカルボベンゾキシ−Ｎ⁴−スペルミジンコレステリルカルボキサミドを得た。Ｎ⁴−スペルミジンコレステリルカルバメートについて記載したように、Ｎ¹− Ｎ⁸−ジカルボベンゾキシ−Ｎ⁴−スペルミジンコレステリルカルボキサミドからカルボベンゾキシ基を除去した。精製した生成物（Ｎ⁴−スペルミジンコレステリルカルボキサミド）を収率５３％で得た。群IIの両親媒性化合物（Ａ）Ｎ¹，Ｎ⁸−ビス（アルギニンカルボキサミド）−Ｎ⁴−スペルミジンコレステリルカルバメートＮ¹，Ｎ⁸−ビス（アルギニンカルボキサミド）−Ｎ⁴−スペルミジンコレステリルカルバメート（図５、Ｎｏ．９５）を以下のように調製した。塩化メチレン（２５ml）中のＮ^(a)，Ｎ^(e)，Ｎ^(e)（アルファ、イプシオン、イプシロン）−トリカルボベンゾキシアルギニンに、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１００mg、０．８９ミリモル）とジシクロヘキシルカルボジイミド（２４０mg、０．８９ミリモル）を加えた。混合物を窒素下で室温で２．５時間攪拌した。Ｎ⁴−スペルミジンコレステリルカルバメート（２５０mg、０．４４８ミリモル）とトリエチルアミン（０．２５ml、１．８ミリモル）を加え、反応物を窒素下で７２時間攪拌した。反応物をろ過し、沈殿物を塩化メチレン（２０ml）で洗浄した。ろ液を水（２０ml）で洗浄した。分離した有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を真空下で濃縮し、残渣を７０ｇのシリカゲルクロマトグラフィー（溶出液−クロロホルム／メタノール９５／５）により精製した。精製した物質を真空下で濃縮し、次に真空下で乾燥して５３３mg（７１％）のＮ¹ ，Ｎ⁸−ビス（Ｎ^(a)，Ｎ^(e)，Ｎ^(e)−トリカルボベンゾキシアルギニンカルボキサミド）−Ｎ⁴−スペルミジンコレステリルカルバメートを得た。Ｎ−（Ｎ⁴−３−アミノプロピルスペルミジン）コレステリルカルバメートについて記載したように、Ｎ¹−Ｎ⁸−ビス（Ｎ^(a)，Ｎ^(e)，Ｎ^(e)−トリカルボベンゾキシアルギニンカルボキサミド）−Ｎ⁴−スペルミジンコレステリルカルバメートからカルボベンゾキシ基を除去した。生成物（Ｎ¹−Ｎ⁸−ビス（アルギニンカルボキサミド）−Ｎ４⁴−スペルミジンコレステリルカルバメート）を収率２７％で得た。群IIIの両親媒性化合物（Ａ）Ｎ，Ｎ−ジオクタデシルリジンアミドＮ，Ｎ−ジオクタデシルリジンアミド（図６、Ｎｏ．７３）を、以下の方法に従って調製した。Ｎ，Ｎ−ジオクタデシルアミン（１．３５ｇ、２．５８ミリモル、フルカ（Fluka））とＬ−Ｎａ，Ｎｅ−ジＢＯＣリジンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（１．００ｇ、２．５８ミリモル、シグマ（Sigma））を、１５mlの塩化メチレン中で合わせ、２mlのトリエチルアミンを加えた。反応混合物を短時間加熱して完全に溶解させ、次に周囲温度で一晩攪拌した。水（２０ml ）と塩化メチレン（５０ml）を反応混合物に加え、層を分離した。水性画分を５０mlの塩化メチレンで２回抽出した。合わせた有機画分を硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、真空下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（１５０ｇシリカゲル、溶出液−ヘキサン／酢酸エチル８／２）により精製した。精製した物質（Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎａ，Ｎｅ−ジＢＯＣリジンアミド）（１．５９ｇ）を２５mlのクロロホルムに溶解し、塩酸ガスを溶液にバブリングしながら２時間攪拌した。溶液に窒素ガスを吹き付け、真空下で濃縮した。Ｎ，Ｎ−ジオクタデシルリジンアミド（１．３４ｇ）を、二塩酸塩として収率６８％で得た。（Ｂ）Ｎ¹，Ｎ¹−ジオクタデシル−１，２，６−トリアミノヘキサンＮ¹，Ｎ¹−ジオクタデシル−１，２，６−トリアミノヘキサン（図６、Ｎｏ．４７）を以下のように調製した。３０mlの無水ＴＨＦ中のＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎａ，Ｎｅ−ジＢＯＣリジンアミド（７６０mg、０．８２３ミリモル）に、周囲温度でＬｉＡｌＨ₄（１８５mg、４．８７ミリモル）を少しずつ加えた。反応混合物を窒素下で周囲温度で一晩撹拌した。２mlの水を滴下して加えて反応を停止させ、得られた溶液を真空下で濃縮した。この残渣に、順に１０ｍｌの１ＭＨＣｌ、５０mlの塩化メチレン、および１０mlの１ＭＮａＯＨ（最終ｐＨ１０）を加えた。層を分離し、水性画分を５０mlの塩化メチレンで２回抽出した。合わせた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。フィルターケーキを５０mlの塩化メチレンで洗浄した。合わせたろ液を真空下で濃縮して、７００mgの粗生成物を得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（８Ｏｇシリカゲル、溶出液−ヘキサン／酢酸エチル７／３）により精製した。精製した生成物を含有する画分を合わせ、真空下で濃縮して、ジＢＯＣ誘導体として保護された４９０mg の生成物を得た。このジＢＯＣ誘導体２００mgに、４mlのクロロホルムと１mlのＴＦＡを加えた。反応混合物を周囲温度で２時間攪拌し、真空下で濃縮した。残渣を２５mlの水と２５mlの塩化メチレンに溶解し、約２mlの濃水酸化アンモニウムでｐＨ１０に調整した。層を分離し、水層を２５mlの塩化メチレンで２回抽出した。有機画分を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、真空下で濃縮した。得られた残渣を１０mlのジエチルエーテルに溶解し、溶液にＨＣｌガスを２分間バブリングし、溶液を４℃で一晩冷却した。沈殿した生成物をろ過して集め、冷（４℃ ）ジエチルエーテルで洗浄し、真空下で乾燥して、１６０mgの所望の生成物を収率６７％で得た。群IVの両親媒性化合物（Ａ）１−（Ｎ⁴−スペルミン）−２，３−ジラウリルグリセロールカルバメート１−（Ｎ⁴−スペルミン）−２，３−ジラウリルグリセロールカルバメート（図７、Ｎｏ．８９）を以下のように調製した。ＴＨＦ（２０ml）中の３−ベンジルオキシ−１，２−プロパンジオール（１．００ｇ、５．４９ミリモル）の溶液を、ＴＨＦ（３０ml）中の水素化ナトリウムの懸濁液（油中６０％w/w、５５０m g、１３．７２５ミリモル）に加え、乾燥窒素下で一晩還流させた。ＴＨＦ（２０ml）中のドデシルメタンスルホン酸（３．３９ｇ、１２．０７８ミリモル）の溶液を加え、反応物をさらに２日間還流させた。室温に冷却後、反応物をヤライトのベッドでろ過し、ＴＨＦですすいだ。ろ液を真空下で濃縮して、黄色の油状物を得て、これをジエチルエーテル（１００ml）に溶解した。エーテル溶液を０．１ＮＮａＯＨ（３０ml）とｄＨ₂Ｏ（２×３０ml）で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、真空下で濃縮して赤褐色の油状物とした。粗物質をフラッシュカラムクロマトグラフィー（３００ｇシリカゲル）により３％酢酸エチル／ヘキサンで溶出して精製した。所望の生成物を淡黄色の油状物として単離し、¹ＨＮＭＲにより３−ＯＢｎ−１，２−ジラウリルグリセロール（１．７０ｇ、６０％）として解析された。エタノール（１００ml）中の３−ＯＢｎ−１，２−ジラウリルグリセロール（１．７０ｇ、３．２８ミリモル）を、１０％白金担持活性炭（２５０mg、１５重量％）と水素雰囲気下で２４時間攪拌した。反応物に窒素をフラッシュし、セライトでろ過し、エタノールですすぎ、触媒を取り出した。ろ液を真空下で濃縮して固体を得た。粗物質をフラッシュカラムクロマトグラフィー（１４０ｇシリカゲル）により１０％酢酸エチル／ヘキサンで溶出して精製した。所望の生成物を白色の固体として単離し、¹ＨＮＭＲにより１，２−ジラウリルグリセロール（１．２３ｇ、８８％）として解析された。トルエン（０．７７ml、１．４９ミリモル）中の１．９３Ｍのホスゲン溶液を、塩化メチレン（１０ml）中の１，２−ジラウリルグリセロール（５８０mg）１．３５ミリモル）とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．２６ml、１．４９ミリモル）の溶液に加え、一晩攪拌した。６０：２５：４クロロホルム／メタノール／水（８０ml）中のＮ¹，Ｎ¹²−ジ−ＣＢｚ−スペルミン・２ＨＣｌ（７３４mg、１．３５ミリモル）の溶液を加えた。３時間後、別のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．２６ml、１．４９ミリモル）を加えた。さらに０．５当量のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１３ml、０．７５ミリモル）を３時間後に加え、反応物を窒素下で周囲温度で一晩攪拌させた。反応物を１ＭＮａＯＨ（２０ml）とｄＨ₂Ｏ（１５ml）で洗浄した。有機層を分離し、硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、真空下で濃縮して白色の固体とした。粗物質をフラッシュカラムクロマトグラフィー（１２５ｇシリカゲル）により９０：１０：０．５クロロホルム／メタノール／水酸化アンモニウムで溶出して精製した。所望の生成物を油状物として単離し、¹ＨＮＭＲにより１−（Ｎ⁴−（Ｎ¹，Ｎ¹² −ジ−ＣＢｚ−スペルミン））−２，３−ジラウリルグリセロールカルバメート（１８８mg、１５％）として解析された。１−（Ｎ⁴−（Ｎ¹，Ｎ¹²−ジ−ＣＢｚ−スペルミン））−２，３−ジラウリルグリセロールカルバメート（１８８mg、０．２０３ミリモル）を氷酢酸（１０ml ）に溶解し、水素雰囲気下で１０％白金担持活性炭（４５mg、２４重量％）とともに５時間攪拌した。真空ろ過して触媒を取り出して、１０％酢酸／酢酸エチル（１０ml）ですすいだ。ろ液をロータリーエバポレーターで濃縮して油状物とした。得られた油状物を１０％メタノール／クロロホルム（８５ml）に溶解し、１ＭＮａＯＨ（１５ml）とｄＨ₂Ｏ（１０ml）で洗浄した。有機層を分離し、硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、真空下で濃縮して油状物にした。生成物は¹ ＨＮＭＲにより１−（Ｎ⁴−スペルミン）−２，３−ジラウリルグリセロールカルバメート（１２５mg、９４％）として解析された。本発明の他の両親媒性化合物は、当業者の知識の範囲内の方法に従って調製できるであろう。例以下の例は、本発明の実施を例示するものである。例１−細胞トランスフェクション測定法３．３５μモルのスペルミジンコレステロールカルバメート（両親媒性化合物Ｎｏ．５３）と中性脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＯＰＥ」）の試料をそれぞれ、ストック調製物としてクロロホルムに溶解した。溶液を合わせてから、減圧下（２０mmHg）で溶媒を留去して混合物から薄膜を作成した。膜を真空下（１mmHg）でさらに２４時問乾燥した。前記したように、本発明の両親媒性化合物の一部は、ＤＯＰＥのような補助脂質とともにトランスアシル化反応に参加するか、またはその分解を起こす他の反応を受ける。従って、両親媒性化合物／補助脂質組成物は、使用するまで低温（例えば−７０℃）で保存することが好ましい。分散懸濁液を作成するために、次に脂質膜を無菌脱イオン化水（１ml）で１０分問水和し、次に１分問ボルテックス混合した（浴ソニケーター中で１０〜２０秒間の超音波処理も使用でき、超音波処理はＤＣ−ｃｈｏｌのような他の両親媒性化合物に対して有用であった）。得られた懸濁液を次に、４mlの水で希釈して、陽イオン性両親媒性化合物中６７０μＭおよび中性補助脂質中６７０μＭである溶液を得た。またスペルミンコレステロールカルバメート（両親媒性化合物Ｎｏ．６７）と本発明の他の両親媒性化合物を使用して実験を行なった。スペルミンコレステロールカルバメートに関して、試験した条件下での両親媒性化合物対ＤＯＰＥの最適モル比は、１：２であり、１：１ではなかつた。本発明の多くの両親媒性化合物についての最適比は、図１３、１４、および１５に記載されており、当業者は容易に測定することができる。トランスフェクション溶液の調製のために、β−ガラクトシダーゼをコードするＤＮＡ（ｐＣＭＶβ、クローンテク（ClonTech）、パロアルト、カリホルニア州）を、ＯｐｔｉＭＥＭ培地（ギブコ／ビーアールエル（Gibco/BRL）Ｎｏ．３１８８５−０１３）に溶解した。得られた溶液は、ＤＮＡ濃度９６０μＭであった（コードするＤＮＡ中のヌクレオチドについて、平均分子量は３３０ダルトンであると仮定した）。以下の方法を使用して、陽イオン性両親媒性化合物スペルミジンコレステロールカルバメートとＤＯＰＥの１：１モル混合物を試験した。補助脂質（６７０μ Ｍ）も含有するスペルミジンコレステロールカルバメート（６７０μＭ）の１６５μｌアリコートを、各ウェル中にＯｐｔｉＭＥＭ（１６５μｌ）を含有する９６マイクロタイタープレート中の８つの別々のウェルにピペットで入れた。得られた３３５μＭ溶液を次に、連続７回希釈して、濃度が３３５μＭ〜２．６３ μＭの範囲の８つの異なる両親媒性化合物を含有する溶液を作成した（各１６５ μｌの容量を有する）。すなわち、８つの異なる濃度の両親媒性化合物／ＤＯＰＥのそれぞれについて８つのウェルで、全部で６４の溶液を調製した。別に、ＤＮＡ溶液（１６５μｌ、９６０μＭ）を、ＯｐｔｉＭＥＭ（１６５μ ｌ）を含有する８つのウェルにピペットで取り、次に得られた４８０μＭ溶液を連続７回希釈して、各ウェルから８つの異なる１６５μｌの溶液を作成し、ウェル中のＤＮＡの濃度は４８０μＭ〜３．７５μＭの範囲であった。次に６４の試験溶液（陽イオン性両親媒性化合物：中性脂質）を６４のＤＮＡ溶液と合わせて、６４のウェル中に別の混合物を得た（それぞれが３３０μｌの容量と、１つの軸に沿って２４０μＭ〜１．８７５μＭの濃度範囲と、別の軸に沿って１６７μＭ〜１．３２μＭの濃度範囲の脂質を有する）。すなわち、全部で６４の溶液を調製し、それぞれは、異なる両親媒性化合物：ＤＮＡ比および／または濃度を有する。ＤＮＡと両親媒性化合物の溶液を、１５〜３０分間靜置させて、複合体を形成させた。ジェームズ・ヤンカスカス（James Yankaskas）博士（ノースカロライナ大学（University of North Carolina）、チャペルヒル（Chapel Hill））から提供されたＣＦＴ−１細胞株（パピローマウイルスで不死化したヒト嚢胞性繊維症気管支上皮細胞）を、インビトロ測定法で使用した。細胞は、嚢胞性繊維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーター（「ＣＦＴＲ」）タンパク質をコードする遺伝子の突然変異アレレについてホモ接合性であった（５０８位でのフェニルアラニンの検出、以後ΔＦ５０８）。ＣＦＴＲは、ｃＡＭＰに制御される塩化物（Ｃｌ^-）チャネルタンパク質である。ＣＦＴＲ遺伝子の突然変異は、典型的には例えば患部上皮組織の細胞膜を介するＣｌ^-チャネル活性の完全な喪失（または、少なくとも実質的障害）を引き起こす。 ΔＦ５０８突然変異は、嚢胞性繊維症を引き起こす最も一般的な突然変異である。ΔＦ５０８突然変異の性質と嚢胞性繊維症の遺伝学の考察については、特にチェング（Cheng）ら、Ｃｅｌｌ，６３，８２７−８３４（１９９０）を参照されたい。またリオルダン（Riordan）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４５，１０６６− １０７３（１９８９）；グレゴリー（Gregory）らのヨーロッパ特許出願Ｎｏ．９１３０１８１９．８号、公表番号０４４６０１７Ａ１号；およびグレゴリー（ Gregory）ら，Ｎａｔｕｒｅ，３４７，３８２−３８５（１９９０）も参照されたい。細胞を、２％胎児牛血清（「ＦＢＳ」、アービンサイエンティフィック（Irvi ne Scientific）、Ｎｏ．３０００）と７つの追加の補足物で補足したＨａｍｓＦ１２栄養培地（ギブコ／ビーアールエル（Gibco/BRL）Ｎｏ．３１７６５−０２７）で培養した。次に細胞を、約７，５００細胞／ウェルの密度で組織培養プレートに広げた。測定で使用する前に、細胞をコンフルエントパターンが得られるまで、５〜７日間増殖させた。割り当てられた期間後、ＣＦＴ−１細胞を有する３つの９６ウェルプレートを吸引して、増殖培地を除去した。種々の濃度のＤＮＡ−脂質複合体（１００μｌアリコート中）を、各９６ウェルプレートに移し、ＤＮＡ−脂質複合体を細胞と接触させた。ＤＮＡのみ／細胞および脂質のみ／細胞対照ウェルも、３つのプレートの１つに調製した。１００μｌのＤＮＡ−脂質複合体溶液を、細胞の上で６時問維持し、次に各ウェルに５０μｌの３０％ＦＢＳ（ＯｐｔｉＭＥＭ中）を加えた。さらに２０時間インキュベーション後、さらに１０μｌのＯｐｔｉＭＥＭ中の１０％ＦＢＳを加えた。さらに２４時間インキュベーション後、タンパク質とβ−ガラクトシダーゼの発現について細胞を測定した。測定にのために、得られた培地はプレートから除去し、細胞をリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄した。次に溶解緩衝液（５０μｌ、２５０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ８．０、０．１５％トリトンＸ−１００）を加え、細胞を３０分間溶解した。９６ウェルプレートを１０秒間注意深くボルテックス混合して細胞と細胞破片をはがし、各ウェルから５μｌ容量の溶解物を、クマシーブルー（登録商標）プロテインアッセイ試薬（ピアス社（Pierce Company）、Ｎｏ．２３２３６）１００ μｌを含有するプレートに移した。プロテインアッセイプレートを、各測定法に含まれるタンパク質標準曲線とともに、５９５nmフィルターを有するバイオラッド（Bio-Rad）モデル４５０プレートリーダーで読んだ。各ウェル中のβ−ガラクトシダーゼ活性のレベルは、残りの溶解物にリン酸緩衝化生理食塩水（５０μｌ）を加え次にクロロフェノールレッドガラクトピラノシド（１００μｌ、１mg/ml、カルビオケム（Calbiochem）Ｎｏ．２２０５８）、６０mMのリン酸水素二ナトリウム（ｐＨ８．０）、１mMの硫酸マグネシウム、１０mMの塩化カリウム、および５０mMの２−メルカプトエタノールからなる緩衝化溶液を加えた。クロロフェノールレッドガラクトピラノシドは、酵素的（β− ガラクトシダーゼ）加水分解により赤色になり、これを５７０nmフィルターを有するプレートリーダーにより検出した。β−ガラクトシダーゼ（シグマ（Sigma ）Ｎｏ．Ｇ６５１２）標準曲線を含めて各測定を較正した。バックグランド読み値を引いて、プレートリーダーにより測定された光学データから、β−ガラクトシダーゼ活性とタンパク質含量が測定された。既知のトランスフェクション体により発現されるβ−ガラクトシダーゼの量と比較すると、ＤＭＲＩＥ（１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）（本発明の化合物）は、気道上皮細胞のトランスフェクションおよびそこでのβ−ガラクトシダーゼ発現の誘導に特に有用である。ＤＭＲＩＥ：ＤＯＰＥ（１：１）に比較して、スペルミジンコレステロールカルバメート：ＤＯＰＥ混合物（これも１：１）は、約５倍改善されたトランスフェクション効率を示した（例えば、図１３、１４、および１５を参照）。例２−ヒト嚢胞性繊維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレータ−タンパク質をコードする遺伝子のトランスフェクション細胞をトランスフェクションしその生化学的修正を誘導する本発明の陽イオン性両親媒性化合物の能力を、別のインビトロ測定法で証明した。不死化したヒト嚢胞性繊維症気道細胞（ＣＦＴ−１、前記）を使用した。測定の準備のために、細胞を約６０％コンフルエントになるまでカバーガラス上で増殖させた。次に細胞を、スペルミジンコレステロールカルバメート：ＤＯＰＥ（１：１）と、野生型ヒトＣＦＴＲをコードするｃＤＮΛを含有するプラスミド（ｐＣＭＶ−ＣＦＴＲ）の複合体でトランスフェクシヨンした。ｐＣＭＶ− ＣＦＴＲプラスミドは、ＣＦＴＲのコード配列、次の制御成分、ＣＭＶプロモーターとエンハンサー、およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含有する作製体である。本例の実施に適した追加の作製体には、ｐＭＴ−ＣＦＴＲがある（チェン（Cheng）ら、Ｃｅｌｌ，６３，８２７−８３４（１９９０））。使用した複合体は、１０．５μモルのスペルミジンコレステロールカルバメート（ＤＯＰＥも）とヌクレオチドベースで３０μモルのｐＣＭＶ−ＣＦＴＲである。両親媒性化合物介在トランスフェクションの４８時間後、６−メトキシ−Ｎ− （３スルホプロピル）キノリウム（「ＳＰＱ」）測定法を使用して、ｃＡＭＰ刺激Ｃｌ^-チャネル活性について試験した。測定法の詳細については、チェン（S.C heng）ら、Ｃｅｌｌ，１０２７−１０３６（１９９１）を参照されたい。測定において、ｃＡＭＰ依存性Ｃｌ^-チャネル活性は、「ＳＰＱ」（モレキュラープローブ（Molecular Probes）、ユージーン（Eugene）、オレゴン州）、ハロゲン化物感受性発蛍光団を使用して試験した。ハロゲン化物透過性の増加は、ＳＰＱ蛍光の急速な増加を引き起こし、この変化速度（蛍光の絶対変化より）は、Ｃｌ^- 透過性の評価の重要な変数である。バックグランド情報については、リッチ（Ri ch）ら，Ｎａｔｕｒｅ，３４７，３５８−３６３（１９９０）も参照されたい。各細胞中のＳＰＱ分子の蛍光は、倒立顕微鏡（ニコン（Nikon））、ユニバーサルイメージング（Universal Imaging）のデジタルイメージングシステム、およびＩＣＣＤカメラ（ハママツ（hamamatsu Inc.））を使用して測定した。蛍光特性の予測される変化速度についての前知識無しで、分析のために細胞を選択した。各実験において、９０〜１００個の細胞の最大５顕微鏡視野を特定の日に観察し、各条件での試験を少なくとも３つの異なる日に繰り返した。ＣＦＴＲの発現は不均一（すなわち、細胞は同量のＣＦＴＲを産生しない）なため、示したデータは、最大の応答を示す各視野の２０％の細胞についてのものである。予測されるように、疑似トランスフェクションした細胞は、ｃＡＭＰ刺激ハロゲン化物蛍光の測定可能な増加を示さなかった。これに対して、野生型ＣＦＴＲｃＤＮＡでトランスフェクションした細胞は、ｃＡＭＰアゴニストで刺激するとＳＰＱ蛍光が急速に増加し、陰イオンに対する透過性の増加を示していた。測定した細胞の約６０％は、測定可能なｃＡＭＰ刺激Ｃｌ^-チャネル活性を示した。従ってスペルミジンコレステロールカルバメートおよび試験した本発明の他の陽イオン性両親媒性化合物は、不死化ＣＦ気道細胞に、ＣＦＴＲコードプラスミドをトランスフェクションするのに有効である。例３−ＣＡＴ測定パートＡこの測定法は、生きている試料からインビボで細胞をトランスフェクションする本発明の陽イオン性両親媒性化合物の能力を評価するために使用した。この測定法では、以下の方法で投与前の１５分間に形成させた陽イオン性両親媒性化合物：ＤＮＡ複合体の１００μｌを、Ｂａｌｂ／ｃマウスの肺に鼻内に点滴注入した（経気管支的に行うこともできる）。両親媒性化合物（あらかじめ補助脂質と混合した、下記）を水の中で１０分間（必要な最終濃度の２倍の懸濁液を与えるのに充分な時間）水和した。これを２分間ボルテックス混合し、アリコートして、点滴注入される各マウスに５５μｌ与えた。同様にレポーター（ＣＡＴ）遺伝子をコードするＤＮＡを水で、必要な最終濃度の２倍に希釈し、点滴注入される各マウスに５５μｌ与えた。脂質を静かにＤＮＡと合わせ（ポリスチレン試験管中で）、１５分間複合体を形成させてから、マウスに点滴注入した。使用したプラスミド（ｐＣＭＶＨＩ−ＣＡＴ、例４を参照）は、クロラムフェニコールトランスフェラーゼ酵素のコードＤＮＡを提供する。両親媒性化合物：ＤＮＡ複合体の詳細を以下に示す。トランスフェクションの２日後に、マウスを屠殺し、肺と気管を取り出し、重量を測定し、緩衝液（２５０ｍＭトリス、ｐＨ７．８、５mM ＥＤＴＡ）中でホモジナイズした。ホモジネートを遠心分離により清澄化し、７０℃で１０分間加熱処理してその中のデアセチラーゼを不活性化した。溶解物をアセチル補酵素ＡおよびＣ¹⁴−クロラムフェニコールとともに一晩インキュベートした。酢酸エチル抽出後、ＣＡＴ酵素活性を薄層クロマトグラフィー（「ＴＬＣ」）により視覚化した。酵素活性はＣＡＴ標準曲線と比較して定量した。酵素ＣＡＴの存在は、アセチル補酵素ＡからＣ¹⁴−クロラムフェニコールへのアセチル基の移動を引き起こす。アセチル化／放射能標識クロラムフェニコールは、ＴＬＣプレート上でより速く移動するため、その存在が検出される。次に、アセチル化クロラムフェニコールの測定された量を作成するのに必要であったＣＡＴの量が、標準物質から算定される。スペルミジンコレステロールカルバメート（両親媒性化合物Ｎｏ．５３）の活性は、認識されているトランスフェクション試薬ＤＭＲＩＥとＤＣ−Ｃｈｏｌと比較して、ＣＡＴ測定法で決定した。図１０は、インビボで細胞をトランスフェクションするスペルミジンコレステロールカルバメート（両親媒性化合物Ｎｏ．５３）の能力の増強（この増強は、この測定法では約２０倍またはそれ以上）を劇的に示す（組織１００mgあたりのngＣＡＴ活性として）。この測定法では、活性は、肺組織１００mgあたりのngＣＡＴ酵素として測定した。比較のために、既知のトランスフェクション物質であるＤＭＲＩＥをＤＯＰＥと１：１モル混合物として調製し、次にプラスミドＤＮＡと複合体を形成させる（１．７mM ＤＭＲＩＥ、１．７mM ＤＯＰＥ、ヌクレオチドとして測定された１．２mMプラスミドＤＮＡ）と、この測定法において１００mgの肺組織あたり約１〜２ngの活性を与えることが一般的に観察される。図１０に示す比較に関して、以下の条件に注意すべきである。スペルミジンコレステロールカルバメートのトランスフェクション溶液は、ヌクレオチドの濃度として測定して６mMのＤＮＡと１．５mMの陽イオン性両親媒性化合物を含有した。全体に例１の方法に従い、各両親媒性化合物をあらかじめＤＯＰＥと混合した（この場合、１：１モル比）。ＤＣ−Ｃｈｏｌによるトランスフェクションでは、ＤＣ−Ｃｈｏｌ対ＤＯＰＥのモル比は３：２であり、陽イオン性両親媒性化合物とＤＮＡ（ヌクレオチドとして）の濃度は、それぞれ１．３mMと０．９mMであった。ＤＭＲＩＥによるトランスフェクションでは、ＤＭＲＩＥＪＡＤＯＰＥのモル比は１：１であり、陽イオン性両親媒性化合物とＤＮＡの濃度は、それぞれ１．７mMと１．２mMであった。これらの濃度（および濃度比）の各両親媒性化合物および補助脂質とＤＮＡは、各両親媒性化合物のトランスフェクションについて最適であると測定されており、従って本明細書に示す比較のための基礎として使用した。スペルミジンコレステロールカルバメート（両親媒性化合物Ｎｏ．５３）について、最適化実験も行い、特定の両親媒性化合物濃度（図１１を参照）についてプラスミドの好適な濃度を決定し、および特定のプラスミド濃度と比較した同じ両親媒性化合物の好適な濃度を決定した（図１２を参照）。トランスフェクション効率は、両親媒性化合物濃度１．５mM（ＤＯＰＥも１．５mMで存在する）、およびプラスミド約６mM（ヌクレオチドにより）、すなわち約１：４の比で、最適であった。しかし、約０．７５mMの両親媒性化合物、および３．０mMのプラスミドの濃度は、標的細胞に対してあまり毒性はなかったことに注目した。また、スペルミジンコレステロールカルバメートを陽イオン性両親媒性化合物として使用して、しかし補助脂質としてはコレステロールを使用して、ｐＣＭＶＨＩ−ＣＡＴベクターによる鼻内トランスフェクションも行なった。この実験では、試験したスペルミジンコレステロールカルバメートの濃度は１．０〜１．５ mMであった（この場合、コレステロールは１：１のモル比で存在し、両親媒性化合物と補助脂質の混合は前記したように行なった）。ＤＮＡ濃度（ヌクレオチド濃度として測定した）は、４．０〜６．０mMであった。トランスフェクション効率（ngＣＡＴ／１００mg組織として測定）は、補助脂質としてＤＯＰＥを使用したものより有効ではなかったが、トランスフェクションはＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥを使用したものより実質的に有効であった。パートＢ図１、５および７に記載の陽イオン性両親媒性化合物のインビボのトランスフェクション効率を比較するために、追加の実験を行なった。その結果を、それぞれ図１３、１４および１５に示す。化合物当たり１２および１５匹のマウスを使用して、化合物を鼻内に投与した。前記パートＡと同様に、組織１００mg当たりのngＣＡＴ活性を測定した。しかし、改良されたベクター（ｐＣＦ１／ＣＡＴとその近い相当物ｐＣＦ２／ＣＡＴ）を使用した。一部は改良されたベクターの性質のため、溶解物と、アセチル補酵素ＡおよびＣ¹⁴−クロラムフェニコールとのインキュベーションは、３０分間行なったのみである。ｐＣＦ１／ＣＡＴとｐＣＦ２／ＣＡＴの作製は、以下の例４に示す。図１３、１４および１５に示したインビボのデータは、以下のように編集した。前記したように、図１０と１１は、両親媒性化合物Ｎｏ．５３の完全なインビボ最適化を示す。両親媒性化合物Ｎｏ．６７に、同様の部分的最適化を行なった。報告したすべての他の陽イオン性両親媒性化合物に関して、および多くの構造的類似性を利用して、インビボ試験の最適化組成をインビトロの結果から外挿した。これは多数の両親媒性化合物のスクリーニングを促進し、広く（正確にではないが）比較可能なデータを与えた。Ｎｏ．５３と６７以外のすべての両親媒性化合物について、両親媒性化合物濃度対ＤＯＰＥ濃度のインビボの比率は、両親媒性化合物濃度対ＤＮＡ濃度の最適比のように、インビトロ実験から取った（例１を参照）。従って、このような両親媒性化合物についてはインビボ試験濃度は１ mMで固定し、従って補助脂質濃度も固定した。［おおまかには、両親媒性化合物対補助脂質ＤＯＰＥのモル比は、１：２（例えば、スペルミンコレステロールカルバメート、Ｎｏ．６７）から１：１（例えば、スペルミジンコレステロールカルバメート、Ｎｏ．５３）から２：１（例えば、両親媒性化合物Ｎｏ．７５）まででの範囲であった］。インビトロで決定した最適化両親媒性化合物／ＤＮＡ比をまねるために、プラスミドＤＮＡの濃度は、試験した各両親媒性化合物種について変動した。パートＣ本発明の新規の両親媒性化合物が当該分野において重要な寄与をしているということは、その性能（インビボのトランスフェクションエンハンサーとして）を、新規のＴ−型を欠如する他の密接に関連する陽イオン性両親媒性化合物の性能と比較することにより、直ちに明らかである。スペルミジンコレステロールカルバメートは、Ｎ¹−スペルミジンコレステリルカルバメート（これは、その陽イオン性アルキルアミン成分中に同じ数の炭素原子と窒素原子を含有するが、線状であり、「Ｔ−型」ではない）よりはるかに大きいレベルの増強を提供する。ほぼ例３のパートＢの方法に従い、およびそれぞれ６mM（ヌクレオチドとして）、１．５mM、および１．５mM濃度のＤＮＡ、両親媒性化合物および補助脂質を使用すると、スペルミジンコレステロールカルバメート（両親媒性化合物Ｎｏ．５３）が与えるトランスフェクションの増強は、Ｎ¹−スペルミジンコレステリルカルバメートと比較すると、約３０倍であると測定された。また、ほぼ例３のパートＢの方法に従い、およびそれぞれ４mM（ヌクレオチドとして）、１mM、および２mM濃度のＤＮＡ、両親媒性化合物および補助脂質を使用すると、スペルミンコレステロールカルバメート（両親媒性化合物Ｎｏ．６７）が与えるトランスフェクションの増強は、Ｎ¹−サーモスペルミンコレステリルカルバメートおよびＮ¹−スペルミンコレステリルカルバメート（スペルミンコレステロールカルバメートが同様に関連している）と比較すると、少なくとも約３０倍である。例４−ベクターの作製前記したように、多くのタイプの生物活性分子水、１つまたはそれ以上の本発明の陽イオン性両親媒性化合物を含む治療用組成物中で、細胞に輸送することができる。本発明の重要な実施態様において、生物活性巨大分子はコードＤＮＡである。以下に、標的細胞でのそのようなコードＤＮＡの発現を促進するために好適な新規ベクター（プラスミド）を記載する。パートＡ −ｐＣＭＶＨＩ−ＣＡＴｐＣＭＶＨＩ−ＣＡＴは、本発明の実施において有用なプラスミド作製体の代表的なものである。このプラスミドはレポーター遺伝子を有する形で提供される（例３を参照）が、治療的有用性を有するトランス遺伝子もこの中に含めることができる。ｐＣＭＶＨＩ−ＣＡＴベクターは、市販のｐＣＭＶβ（クロンテク（Clontech ））をベースにしている。ｐＣＭＶβ作製体は、ｐＵＣ１９骨格（ビエイラ（J ．Vieira）ら、Ｇｅｎｅ，１９，２５９−２６８，１９８２）を有し、これは元々のｐＢＲ３２２から得られた原核生物性複製開始点を含む。ｐＣＭＶＨＩ−ＣＡＴプラスミド（ＣＡＴをコードするヌクレオチド配列を含むように作製した）の基本的特徴は以下の通りである。時計回りに進んで、ヒトサイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーターおよびエンハンサー、アデノウイルスとハイブリッドイントロンからの融合３成分リーダー、リンカー配列、ＣＡＴｃＤＮＡ、追加のリンカー配列、後期ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、およびｐＵＣ複製開始点、ならびにアンピシリン耐性の遺伝子を含む骨格。ヒトサイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーターおよびエンハンサーは、ヌクレオチド１〜６３９の領域をカバーする。これは、もともとボスハート（Bo shart）ら、Ｃｅｌｌ４１：５２１−５３０，１９８５により規定されたように、転写開始部位（＋１）に対して−５２２〜＋７２の領域に対応し、−５２４〜−１１８のほとんどすべてのエンハンサー領域を含む。ＣＡＡＴボックスは、ｐＣＭＶＨＩ−ＣＡＴ中のヌクレオチド４８７〜４９１に位置し、ＴＡＴＡボックスはヌクレオチド５２２〜５２６にある。ＣＡＴ転写は、ヌクレオチド５ 49で開始すると考えられており、これはＣＭＶプロモーターの転写開始部位である。３成分リーダー−ハイブリッドイントロンは、５’スプライスドナーシグナルとＩｇＧ遺伝子から得られる３’スプライスアクセプターシグナルを含有する、アデノウイルスからの融合３成分リーダーから構成される。イントロン中の成分は以下の通りである：最初のリーダー、第２のリーダー、第３のリーダーの一部、第１のリーダーからのスプライスドナー配列とイントロン領域、およびマウス免疫グロブリン遺伝子スプライスドナー配列。イントロンの長さは２３０ヌクレオチドである。ＣＡＴコード領域は、ヌクレオチド１２５７〜１９１３を含む。ＳＶ４０ポリＡシグナルは、ヌクレオチド２０２０〜２２４９に伸長する。従って、ｐＣＭＶＨＩ−ＣＡＴプラスミドの作製は以下のように進めた。ベクターｐＣＭＶβ（クロンテク（Clontech）、パロアルト、カリホルニア州）はＮｏｔＩで消化して、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を切断した。β−ガラクトシダーゼ遺伝子を欠如するベクター断片を単離し、連結してｐＣＭＶを作成した。第３のイントロン（図１７）は、プラスミドｐＡＤβ（クロンテク（Clontech ））から得た。ハイブリッドイントロンは、ｐ９１０２３（Ｂ）の６９５塩基対のＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片から単離されていた。ウォング（Wong）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８，８１０−８１５（１９８５）を参照。ハイブリッドイントロンは、アデノウイルスからの融合３成分リーダー、３成分リーダーの第１のセグメントからのドナー部位、およびＩｇＧ遺伝子からのアクセプター部位を含有し、２３０塩基対の長さを有する。ｐＡＤβをＰｍｌＩとＮｏｔＩで消化し、〜５００塩基対（ｂｐ）断片を単離し、次にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（−）（ストラタジーン（Stratagene）、ラホヤ、カリホルニア州）のＮｏｔＩ部位に連結してｐＢｌｕｅII−ＨＩを形成した。ｐＢｌｕｅII−ＨＩをＸｈｏＩとＮｏｔＩで消化して、ハイブリッドイントロン断片を切り出した。この断片をｐＣＭＶのＸｈｏＩとＮｏｔＩ部位に連結し、ＳＶ４０イントロンを置換してｐＣＭＶＨＩを作成した。ＣＡＴ遺伝子は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼジーンブロック（Chloramphenicol Acetyltransferase GenBlock）（ファルマシア（Phar macia）、ピスカタウェイ（Piscataway）、ニュージャージー州）から得た。この７９２塩基対ＨｉｎｄIII断片を、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片で平滑末端にし、ＮｏｔＩリンカー（ニューイングランドバイオラボズ（New Englan d Biolabs））を両端に連結した。ＮｏｔＩで消化して、ＮｏｔＩ粘着末端を露出させた後、断片をｐＣＭＶのＮｏｔＩ部位にサブクローニングしてｐＣＭＶ− ＣＡＴを作成した。ｐＣＭＶ−ＣＡＴをＮｏｔＩで消化し、ＣＡＴ断片を切り出した。ＣＡＴ断片をｐＣＭＶＨＩに連結して、ｐＣＭＶＨＩ−ＣＡＴ（これは図１６に記載される）を作成した。パートＢ −ｐＣＦ１とｐＣＦ２ｐＣＭＶＨＩは治療的トランスフェクションに適しているが、さらなる性能の増強（トランス遺伝子の発現の増加を含む）は、ｐＣＦＩとｐＣＦ２プラスミドにより提供される。ｐＣＦＩ／ＣＡＴの地図は図１８のパネルＡに示し、ｐＣＦ２／ＣＡＴの地図はパネルＢに示す。簡単に説明すると、ｐＣＦＩは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の前初期遺伝子からのエンハンサー／プロモーター領域を含有する。ハイブリッドイントロンは、プロモーターとトランス遺伝子ｃＤＮＡの間に位置する。ウシ成長ホルモン遺伝子のポリアデニル化シグナルは、トランス遺伝子の下流に置くために選択される。このベクターはまた、アミノグリコシダーゼ３’−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（トランスポゾンＴｎ９０３から得られる、オカ（A．Oka）ら、ｊｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，１４７，２１７− ２２６，１９８１を参照）をコードし、こうしてカナマイシンに対する耐性を付与する薬剤耐性マーカーを含有する。ｐＣＦＩ構造のさらなる詳細は、下記に提供するが、嚢胞性繊維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーター（ＣＦＴＲ）タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列のその中の位置の記載を含む。ｐＣＦ１ベクターは、市販のｐＣＭＶβ（クロンテク（Clontech））をベースにしている。ｐＣＭＶβ作製体は、ｐＵＣ１９骨格（ビエイラ（J．Vieira）ら、Ｇｅｎｅ，１９，２５９−２６８，１９８２）を有し、これはもともとｐＢＲ３２２から得られた原核生物性複製開始点を含む。ｐＣＦ１−プラスミド（ＣＡＴをコードするヌクレオチド配列を含むように作製した）の基本的特徴は以下の通りである。時計回りに進んで、ヒトサイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーターおよびエンハンサー、アデノウイルスとハイブリッドイントロンからの融合３成分リーダー、リンカー配列、ＣＦＴＲｃＤＮＡ、追加のリンカー配列、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、およびｐＵＣ複製開始点と骨格、ならびにカナマイシン耐性遺伝子。ｐＣＦＩ−ＣＦＴＲプラスミドは、両方の鎖で完全に配列決定されている。ヒトサイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーターおよびエンハンサーは、ヌクレオチド１〜６３９の領域をカバーする。これは、もともとボスハート（Bo shart）ら、Ｃｅｌｌ４１：５２１−５３０（１９８５）により規定されたように、転写開始部位（＋１）に対して−５２２〜＋７２の領域に対応し、−５２４〜−１１８のほとんどすべてのエンハンサー領域を含む。ＣＡＡＴボックスは、ｐＣＦ１−ＣＡＴ中のヌクレオチド４８６〜４９０に位置し、ＴＡＴΛボックスはヌクレオチド５２２〜５２６にある。ＣＦＴＲ転写は、ヌクレオチド５４８で開始すると考えられており、これはＣＭＶプロモーターの転写開始部位である。ハイブリッドイントロンは、５’スプライスドナーシグナルとＩｇＧ遺伝子から得られる３’スプライスアクセプターシグナルを含有する、アデノウイルスからの融合３成分リーダーから構成される。イントロン中の成分は以下の通りである：最初のリーダー（ヌクレオチド７０５〜７４５）、第２のリーダー（ヌクレオチド７４６〜８１６）、第３のリーダーの（一部、ヌクレオチド８１７〜８７７）、第１のリーダーからのスプライスドナー配列とイントロン領域（ヌクレオチド８７８〜１０４２）、およびマウス免疫グロブリン遺伝子スプライスドナー配列（ヌクレオチド１０４３〜１１３８）。ドナー部位（Ｇ｜ＧＴ）はヌクレオチド８８７〜８８８にあり、アクセプター部位（ＡＧ｜Ｇ）はヌクレオチド１１２８〜１１２９にあり、イントロンの長さは２３０ヌクレオチドである。ＣＦＴＲコード領域は、ヌクレオチド１１８３〜５６２２を含む。ｐＣＦＩ−ＣＦＴＲのＣＦＴＲコードｃＤＮＡ内に、元々の公表された予測されるｃＤＮＡ配列とは２つの差がある（リオルダン（J．Riordan）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４５，１０６６−１０７３（１９８９）；（１）元々の公表された配列中の誤りを修正する、ＣＦＴＲｃＤＮＡの１９９０位のＡからＣへの変化、および（２）９３６位に導入されるＴからＣへの変化。９３６位の変化は部位特異的突然変異誘発により導入され、サイレントであるが、細菌のプラスミド中で増殖するとｃＤＮＡの安定性を大幅に上昇させる（グレゴリー（R.J.Gregory）ら，Ｎａｔｕｒｅ，３４７，３８２−３８５，１９９０）。予測されるＣＦＴＲ転写体の３’非翻訳領域は、ＣＦＴＲｃＤＮＡの３’非翻訳領域の５１ヌクレオチド、リンカー配列の２１ヌクレオチド、およびＢＧＨポリＡシグナルの１１４ヌクレオチドを含有する。ＢＧＨポリＡシグナルは、保存ＡＡＵＡＡＡの５’にフランキング配列の９０ヌクレオチドと、ＡＡＵＡＡＡモチーフの３’にフランキング配列の１２９ヌクレオチドを含有する。一次ＣＦＴＲ転写体は、ヌクレオチド５８０８のＢＧＨポリアデニル化シグナルの下流で切断されると予測される。切断部位に対して＋４６位でｐＣＦ１−ＣＦＴＲの欠失があるが、この欠失は、グッドウィン（E.C.Go odwin）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１６３３０−１６３３４（１９９２）の研究に基づき、ポリアデニル化効率または切断部位の正確性のいずれにも影響を与えないと予測される。ポリＡテイルの付加後、得られる転写体のサイズは約５．１kbである。ｐＣＦ２プラスミド（図１８（Ｂ））は、第２のＣＭＶエンハンサーを第１のものとタンデムで含有する。ｐＣＦＩまたはｐＣＦ２からのトランス遺伝子の発現増強は、強いプロモーター、非常に効率的なポリアデニル化シグナルの存在、翻訳を増強するリーダー配列、およびメッセージ安定性を上昇させるイントロンの組合せから得られる。例５−嚢胞性繊維症患者の鼻ポリープ上皮細胞中の塩化物イオン輸送欠陥の陽イオン性両親媒性化合物介在遺伝子移動による修正成人男性嚢胞性繊維症患者（ΔＦ５０８についてホモ接合性）の一次（非不死化）鼻ポリープ細胞を、コラーゲン被覆透過性フィルター支持体（ミリセルズ（ Millicells））上で増殖させて、極性を持ったコンフルエントな上皮単層を作成した。単層がいったん電気的に密になると（接種の約５〜７日後であり、細胞シートに抵抗が発生することで示される）、とがった表面は陽イオン性両親媒性化合物：ＤＮＡ複合体製剤に曝露される。この場合、両親媒性化合物（スペルミジンコレステロールカルバメート）はＤＯＰＥとの１：１（モル）混合物として提供され、この混合物を次に、ｐＣＭＶ −ＣＦＴＲプラスミドベクター（野生型のヒト嚢胞性繊維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレータータンパク質をコードする作製体、前記）と複合体を形成させた。最終混合物中の濃度は、４２μモルのスペルミジンコレステロールカルバメート（および、ＤＯＰＥ）および６０μモル（ヌクレオチドのモル濃度に基づく）のプラスミド発現ベクターであった。ＣＦＴＲの発現は、修飾ウッシング（Ussing）チェンバー（ザブナー（Zabner ）ら、ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ，６，７５−８３（１９８４））中でｃＡＭＰ刺激経上皮塩素分泌を測定することにより決定された。上皮の粘膜側を、９５％酸素と５％二酸化炭素をバブリングしたリンゲル重炭酸溶液に浸した。粘膜下溶液の組成は粘膜溶液と同じであったが、塩化ナトリウムの代わりにグルコン酸ナトリウムを使用した。経上皮電圧は０mVに固定し、短絡電流を記録した。アミロライド（１０ｐＭ）を浴先端に適用し、ホルスコリンとＩＢＭＸ（各１００μＭ）を粘膜に加えた。ＣＦＴＲ塩化物チャネルのインヒビターである５−ニトロ−２−（３−フェニルプロピルアミノ）安息香酸（「ＮＰＰＢ」）を、１０〜３０μＭで粘膜溶液に加えた。塩化物分泌（すなわち、上皮細胞から粘膜溶液への塩化物の移動）は、上方へのたわみにより示される（図１９を参照）。同じプラスミドベクター（しかし、レポーター遺伝子を含む）を、陰性対照として使用した。野生型ＣＦＴＲ遺伝子でトランスフェクションした単層で、ｃＡＭＰ刺激電流（０，５〜２．５μアンペア/cm²）が観察された。電流はｐＣＭＶ−β−ガラクトシダーゼ対照では検出されなかった。例６−嚢胞性繊維症患者の気道上皮細胞の塩化物イオン輸送欠陥の陽イオン性両親媒性化合物介在遺伝子移動による修正ヒト患者の嚢胞性繊維症を治療するのに本発明の薬剤組成物を製剤化し使用する推奨法は、以下の通りである。一般的に例１に示す方法に従い、スペルミンコレステロールカルバメート（両親媒性化合物Ｎｏ．６７）とＤＯＰＥがモル比１：２で存在する薄膜（クロロホルムから溶媒を留去した）を作成した。両親媒性化合物含有膜を注射用水で静かにボルテックス混合しながら再水和して、約３mMの両親媒性化合物濃度を得た。しかし、均一相としてエアゾルにより安定に送達される（例えば、レニクサメディカルディビジョン（Lenexa Medical Division）、レネクサ（Lenexa）、カンザス州、のプリタンベネットレインドロップ（Puritan Bennett Raindrop）噴霧器、またはパリレスピラトリ−エクイップメント社（PARI Respiratory Equipme nt，Inc.）、リッチモンド、バージニア州、のパリエルシージット（登録商標）（PARI LC Jet）噴霧器を使用して）両親媒性化合物／ＤＮＡ複合体の量を増加させるために、最終の両親媒性化合物／ＤＮＡ組成物を安定化させるように作用する１つまたはそれ以上の追加の成分を含有させるように両親媒性化合物含有膜を調製することが有効なことがある。従って、両親媒性化合物含有膜を両親媒性化合物Ｎｏ．６７、ＤＯＰＥ、およびＰＥＧ₍₅₀₀₀₎−ＤＭＰＥの１：２：０．０５モル混合物として調製することが、本発明において好適である。［ＰＥＧ−ＤＭＰＥ、ＰＥＧ５０００−ジミリストイルホスファチジルエタノールアミンの適切な供給源は、アバンチポーラーリピッズ（Avanti Polar Lipids）、アラバスター（Alabaster）、アラバマ州、のカタログＮｏ．８８０２１０である］。ＰＥＧ−ＰＥの別の脂肪酸種を代わりに使用することもできる。理論には限定されるつもりはないが、ＰＥＧ₍₅₀₀₀₎−ＤＭＰＥは、形成された両親媒性化合物／ＤＮＡ複合体のさらなる凝集を防ぐことにより、治療用組成物を安定化させると考えられている。さらに、ＰＥＧ₍₂₀₀₀₎−ＤＭＰＥは、本発明の実施においてあまり有効でないことが見いだされたことに注意されたい。ｐＣＦ１−ＣＦＴＲプラスミド（ヒト嚢胞性繊維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーターのコード配列を含有する、例４を参照）は、ヌクレオチドとして測定する時４mMの濃度で注射用水として提供される。プラスミドと両親媒性化合物の溶液を、１０分間静かに接触させて、両方物質の複合体形成を進行させる。エアゾル化したＤＮＡを、約２〜約１２mM（ヌクレオチドとして）の濃度で肺に送達することが好ましい。ＣＦＴＲをコードする遺伝子中のΔＦ５０８突然変異がホモ接合性である成人患者の肺への１回のエアゾル投与には、約１０〜約４０mlの試料が一般的に充分である。この方法（両親媒性化合物／ＤＮＡの新たに調製された試料を使用する）は約２週間の間隔で繰り返すことが必要であると予想されるが、これは、患者の応答、トランスフェクションされたＤＮＡからの発現の期間、可能性のある副作用（例えば、炎症）の出現（これらすべては、各患者個人について測定され、患者の担当医により考慮される）に大きく依存する。本発明の陽イオン性両親媒性化合物の１つの重要な利点は、これらは他の現在入手できる両親媒性化合物よりインビボで実質的により有効であり、既知の陽イオン性両親媒性化合物より実質的に低濃度で使用することができることである。このため、遺伝子治療の成功に悪影響を与えるであろう副作用（例えば、両親媒性化合物毒性、炎症応答）を実質的に小さくする機会を与える。本発明の多くの両親媒性化合物の使用に伴うさらなる利点を、再度言及すべきである。本発明の両親媒性化合物の多くは、その代謝が、比較的無害の生物学的に適合性のある成分に急速に向かって進むように設計されている。この点で、高活性の両親媒性化合物５３、６７、および７５に特に注目すべきである。例７−遺伝子治療のためのプラスミド設計のさらなる増強：エピソームプラスミドの複製上記の設計的特徴は、入手できるプラスミドの性能を実質的に増強させるが、そのようなプラスミドおよび陽イオン性両親媒性化合物を含む治療用組成物が遺伝子治療のための最適の性能を有するように、さらなる修飾が好ましい。プラスミドが連続して存在すると長期間にわたって遺伝的欠陥（嚢胞性繊維症の場合は、肺上皮細胞または他の細胞の細胞膜中のＣＦＴＲタンパク質の機能の欠如）の修正を提供するため、遺伝子治療のためのプラスミドは、患者の細胞中で複製できることが好ましい。現状の技術の代表的なプラスミド（すなわち、患者の標的細胞中で複製することができないもの）は、患者の中で比較的短期間維持された後分解され、従って過剰な繰り返し投与が必要になるという心配がある。長期間の修正は、おそらく患者の標的細胞中の染色体に組み込まれるように設計されたベクター（例えば、レトロウイルスを原型とするべクター）を使用することにより達成されるであろう。しかしそのような方策は、（１）ベクターが染色体の必須の領域に組み込まれるか、または（２）ベクターは癌遺伝子の隣に組み込まれてこれを活性化する、という危険性がある。従って、他の手段で遺伝子治療ベクター（プラスミド）の連続的維持を提供することが好ましいであろう。そのような方策の１つは、標的細胞の核中の別の場所で維持することができ、そこで複製することができるプラスミド（すなわち、エピソーム）を作製することである。本発明の面に従って提供されるプラスミドは、以下のように作製される。ヒトｃ−ｍｙｃ遺伝子のエキソン１にすぐ５’に存在する２．４kbのＨｉｎｄIII− ＸｈｏＩ断片は、複製開始点を含有することが、わかってる（マクウィニー（C. McWhinney）ら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１８，１２３３−１２４２，１９９０）。次にこの断片はプラスミド中にクローン化され、Ｈｅｌａ細胞にトランスフェクションされると、薬剤選択下で３００世代以上そこで維持されることが証明された。複製は半保存的であった（マクウィニー（C.McWhinney ）ら）。これらの実験で薬剤選択のない場合、細胞世代毎にプラスミド集団の約５％が失われたが、この結果は、遺伝子治療のための治療用プラスミドの設計に関して、実質的な安定化が有効であることを証明している。従って、複製しているエピソームベクターの１つの例では、２．４kbのＨｉｎｄIII−ＸｈｏＩ断片のコピーがｐＣＦＩ骨格のＣＭＶエンハンサー／プロモーター領域のすぐ５’に位置するｐＣＦＩ−ＣＦＴＲ（またはｐＣＦＩ−ＣＡＴ）の変種が作製できる。あるいは、２．４kb断片のタンデムの２〜約４コピーが同様に存在してもよい。２．４kb（またはその複数のコピー）の挿入から得られるプラスミドサイズの増加は、追加の利点、すなわちプラスミドの巻き戻しを促進、すなわちＤＮＡポリメラーゼの活性を促進するという利点を提供する。この複製開始点、またはその複数のコピーの使用は、得られたプラスミドがヒト細胞中で効率的に複製することを可能にする。他の複製開始点を含有する他のＤＮＡ配列（例えば、ヒトβ−グロビン遺伝子またはマウスＤＨＦＲ遺伝子中に存在するもの）も使用することができる。本発明のこの面に従って作製され、サイトメガロウイルスプロモーターとエンハンサー、イントロン、ＣＦＴＲｃＤＮＡ、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、カナマイシン耐性トランスポゾンＴｎ９０３、およびヒトｃ−ｍｙｃ遺伝子の２．４kbの５’フランキング領域の４つのコピーを有するプラスミドを、図２０に示す。例８−遺伝子治療のためのプラスミド設計のさらなる増強：遺伝子治療におけるトランス遺伝子の発現を調節するためのサイトカインプロモーターの使用慢性の炎症は、遺伝子治療により治療できる多くの病状が関係している。そのような病状の代表的なものは、嚢胞性繊維症（ＣＦＴＲを使用）、気管支炎、成人型呼吸窮迫症候群（アルファ−１アンチトリプシンを使用）、および転移性癌（ｐ５３、ＴＩＭＰ−１、およびＴＩＭＰ−２のアップレギュレーションを介して）である。炎症症状は典型的には、多くの相互に関連するプロセス（例えば、多くのタイプの免疫系細胞および肝タンパク質の関与）があり、このため体は傷害されたかまたは感染した組織を治療しようとする。しかし、未治療の結果として残存する慢性の炎症は、嚢胞性繊維症や関連するそのおよび未治療の肺感染に犯された肺組織の場合のように、永久的な組織傷害を引き起こす。実際、嚢胞性繊維症患者の肺組織への永久的な傷害が、その死亡率の主要な原因である。標的病状に関連する炎症症状を治療するように、遺伝子治療を提供することが好ましいであろう。従って本発明のさらなる面は、治療用トランス遺伝子が、例えばインターロイキン２、インターロイキン８、インターロイキン１、インターロイキン１１、インターロイキン６、エンドセリン−１、単球化学走化性タンパク質−１、ＩＬ− １ｒａ（受容体アゴニスト）、またはＧＭ−ＣＳＦのようなサイトカイン遺伝子（または、別の同様の制御タンパク質をコードする遺伝子）からのＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下に置かれる、遺伝子治療ベクターを作製する。サイトカインは、細胞の増殖、分化、および機能（例えば、造血やリンパ球形成）の制御に関与する、ホルモン様細胞間シグナルタンパク質であるとして定義される。インターロイキンは、本発明の実施において有用なプロモーターを有する特定の群のサイトカインである。インターロイキンはタンパク質であり、典型的には、起源が無関係であり、免疫反応性細胞の間の反応を仲介する細胞間シグナルとして作用する。しかし、多くの「インターロイキン」は、別のタイプの細胞（内皮細胞、上皮細胞、および繊維芽細胞を含む）にも作用すると理解されている。多くのサイトカインの濃度は、存在する炎症のレベルに応答して患部でアップレギュレーションを受けるため、そこから発現される治療トランス遺伝子のレベルが、一部は存在する炎症のレベルにより測定されるような遺伝子治療ベクターを設計することができる。例として主にインターロイキン８遺伝子の性質を使用して、いかにそのようなベクターが設計されるかを、以下に記載する。多くの生物活性分子（例えば、腫瘍壊死因子「ＴＮＦ」、およびＮＦ−ｋＢ、ＡＰ−Ｉ、ＮＦ−ＩＬ６およびオクタマー結合タンパク質のような可能性のある転写因子）は、炎症症状の重傷度とともに増殖する濃度で組織中に存在することがわかっている。またインターロイキン８（分子量８，５００のポリペプチド）は、炎症によりアップレギュレーションされ、それ自身が炎症応答に関与する細胞であるＴリンパ球や好中球の強力な化学走化性物質として作用することがわかっている。インターロイキン８遺伝子は主に転写レベルで制御され、ＴＮＦは、インターロイキン８の転写を気管支上皮細胞中でインビトロで３０倍以上上昇されることが測定されている（ナカムラ（H．Nakamura）ら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６６，１９６１１−１９６１７，１９９１）。従って、これを利用する遺伝子治療ベクターを以下に説明する。ｐＣＦＩに実質的に類似のプラスミド、すなわち、細菌由来の複製開始点とカナマイシン耐性を与える遺伝子を含有するｐＵＣプラスミドから得られる、プラスミドを作製することができる。得られるプラスミドはまた、順にＣＭＶエンハンサー、プロモーター、ハイブリッドイントロン、ＣＦＴＲをコードするＤＮＡ配列、およびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含有する。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとして、インターロイキン８プロモーターの−３３５〜＋５４領域が選択される。この領域は、ＴＮＦが無い場合よりＴＮＦがある場合に最も高いプロモーター活性を与えた（ナカムラ（Nakamura）、１９９１）。このようなプラスミドは、特に有用な性能を有する。嚢胞性繊維症に犯された肺の炎症の増加（従って、遺伝子治療により肺を治療する必要性が増加する）とともに、種々の炎症関連分子（例えばＴＮＦ）の濃度が増加する。ＣＦＴＲをコードする治療用プラスミドのｃＤＮＡを転写プロモーター（例えば、インターロイキン８のもの）（これ自身は、細胞との接触において炎症関連物質の濃度に対して感受性である）の制御下に置くことにより、プロモーターは天然の遺伝子スイッチとして機能し、炎症の量に応じて有効なＣＦＴＲ転写の量が変動する。前記したように、他の前記遺伝子から得られるＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列もまた、本発明の実施において有用である。例９−トランス遺伝子の静脈内送達いくつかの病状（例えば、嚢胞性繊維症）については、トランス遺伝子を肺に送達することが好ましい。この目的を達成するのにエアゾルを使用することが最も直接的なアプローチである。しかし、肺以外の標的臓器（例えば、嚢胞性繊維症の膵臓）に対するニ−ズとともにエアゾルを送達することの本質的な困難さのため、非エアゾル送達フォーマットを使用して肺送達の現実性を評価することが重要である。従って、マウスモデルを使用してレポータートランス遺伝子の静脈内送達を行い、静脈内臓器ターゲティングの実現性を評価した。肺への送達と心臓への送達の実現性を比較した。レポータープラスミドｐＣＦ−１ＣＡＴ（例４）を使用し、エンドトキシン（＜ＩＥＵ/mg ｐＤＮＡ）および染色体ＤＮＡの混入を最小（＜２％）にするために、精製した。両親媒性化合物Ｎｏ．５３（ＤＯＰＥと１：１）／ＤＮＡ複合体を、例３の方法に従って調製した。両親媒性化合物を遊離塩基として提供し、プラスミドは水中のナトリウム塩として、およびＤＯＰＥは双性イオン型で提供した。動物モデルはＢａｌｂ／ｃマウスである。１群５匹のマウスを使用して、６〜８週齢の体重１６〜１８ｇの雌に、尾静脈に静脈内注射した。使用した脂質：ｐＤＮＡ複合体の容量は、すべての実験で１００μｌであった。特に明記しない場合は、複合体の投与後４８時間目にマウスを屠殺した。直ちに臓器をドライアイスで凍結し、以後の分析のために保存した。クロラムフェニコールアヤチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）の発現は、ＣＡＴ酵素活性についての放射化学測定法を使用して定量した。臓器の重さを測り、プロテアーゼインヒビターを含有する溶解緩衝液中で氷上でホモジナイズした。溶解物を３回凍結−融解し、遠心分離し、６５℃に加熱して、デアセチラーゼを不活性化してから、これを¹⁴Ｃ−クロラムフェニコールを含有する反応混合物に加えた。３７℃でインキュベーション後、混合物を酢酸エチルで抽出し、濃縮し、ＴＬＣプレート上にスポットし、クロロホルム／メタノールで溶出した。アシル化した反応生成物に対応するスポットを定量（ベタゲン（Betagen））し、真正のＣＡＴ標準物質を使用してngＣＡＴ活性に変換した。驚くべきことに、治療用組成物中の両親媒性化合物／ＤＮＡのモル比（ヌクレオチドとして測定して、０．９mMの一定のＤＮＡ濃度）を変化させることにより、心臓に対するターゲティングは、実質的に改善されることがわかった。心臓の遺伝子治療（例えば、冠動脈疾患）に関連して、この情報は重要である。しかし肺へのターゲティングは、両親媒性化合物／ＤＮＡ比の範囲（すべて、一定のＤＮＡ濃度で）にわたって比較的一定に維持された（図２１）。約０．５未満のモル比で、臓器分布は肺の方に強く傾いていた。このモル比で、複合体のゼータ電位は陰性（約−３０mV）であり、これは一部は、両親媒性化合物に対してＤＮＡの陰性電荷が過剰なためである。しかし複合体が陽性のゼータ電位（約＋３０mV）を有する両親媒性化合物／ＤＮΛ比が１．２５では、臓器分布は顕著に異なり、実質的な発現は心臓に見いだされた（図２１）。試料のゼータ電位は、マルベルンゼータサイザー（Malvern Zetasizer）（マルベルンインストルメンツ（Malvern Instruments）、サウスボロー（Southboro ugh）、マサチューセッツ州）とゼータセル（ＡＺ−１０４セル、マルベルンインストルメンツ社（Malvern Instruments Co.））を使用して測定することができる（典型的には、１試料について５つの測定）。陽イオン性脂質とＤＯＰＥを含有する乾燥脂質膜を、蒸留水（ｄＨ₂Ｏ）中で水和する。ＤＮＡは典型的には、ｄＨ₂Ｏ中約３００μＭの濃度に希釈すべきである。次にＤＮＡ溶液（１．５ml）を等量の陽イオン性脂質小胞に加え、室温で１０分インキュベートした。充分なＮａＣｌ（例えば、４mMストック）を加えると、最終濃度が１Mm ＮａＣｌになる。必要であれば、１mM ＮａＣｌで試料をさらに希釈することができ（光電子増倍管のシグナルを４０００カウント／秒以下に維持するために）、ＮａＣｌ溶液の代わりに蒸留水を使用することができる。本発明のこの面に従って、両親媒性化合物Ｎｏ．５３とＮｏ．６７は、群Ｉと群IIから選択された他の多くの両親媒性化合物と同様に、心臓の静脈内ターゲティングに使用するのに特に好適なものである。例１０−追加の実験（Ａ）Ｎ⁴−スペルミンコレステリルカルバメート（両親媒性化合物Ｎｏ．６７）の追加の合成法（Ｎ¹，Ｎ¹²−ジＣｂｚ−スペルミンジ−ＨＣｌ塩）クロロギ酸ベンジル（１５ml、１０５ミリモル）を塩化メチレン（３３５ml）に溶解し、窒素雰囲気下で三ツ首フラスコ中に入れた。イミダゾール（１４ｇ、２０６ミリモル）を塩化メチレン（２００ml）に溶解した。氷水浴を使用して三ツ首フラスコを０〜２℃に冷却し、イミダゾール溶液を３０分かけて徐々に加えた。冷却浴を除き、混合物を室温で１時間撹拌した。塩化メチレン（２５０ml）とクエン酸水溶液（１０％、２５０ml）を混合物に加えた。層を分離し、有機層をクエン酸水溶液（１０％、２５０ml）で洗浄した。有機画分を硫酸マグネシウムで乾燥し、真空下で濃縮した。得られた油状物を周囲温度で２時間真空下で乾燥した。油状物にジメチルアミノピリジン（５３０mg、４３ミリモル）と塩化メチレン（２５０ml）を加えた。混合物を０〜２℃に冷却し、窒素雰囲気下で維持した。塩化メチレン（２５０ml）中のスペルミン（１０ｇ、４９ミリモル）の溶液を、１５分かけて徐々に加え、反応温度を０〜２℃に維持した。反応混合物を周囲温度で一晩撹拌し、次に真空下で濃縮した。得られた物質に、１Ｍ塩酸（６７ml）とメタノール（４００ml）を加えた。溶液を４℃で一晩冷却して、白色の沈殿物を得た。この沈殿物をワットマン＃１濾紙を使用して真空ろ過で単離した。こうして得られたＮ¹，Ｎ¹²−ジＣｂｚ−スペルミンジＨＣｌ塩（１３．３８ｇ）２４．７ミリモル、収率５０％）を、周囲温度で１７時間真空下で乾燥した。（Ｎ¹，Ｎ¹²−ジＣｂｚ−Ｎ⁴−スペルミンコレステリルカルバメートの合成）Ｎ¹，Ｎ¹²−ジＣｂｚ−スペルミンジＨＣｌ塩（１３．３８ｇ、２４．７ミリモル）を、６５：２５：４の比のクロロホルム、メタノールおよび水混合物（９４０ml）に溶解した。溶液を室温で攪拌し、クロロギ酸コレステリル（１１ｇ、２４．５ミリモル）を加えた。溶液を周囲温度で１．５時間撹拌し、次に１ＭＮａＯＨ溶液（１６５ml）で希釈した。有機層および水層を分離し、生成物を含有する有機層を水（１１０ml）で洗浄した。有機画分を硫酸ナトリウムで乾燥し、真空下で濃縮し、真空下で乾燥した。粗油状物を、シリカゲル（６０Å、１kg ）を使用してクロマトグラフィーにより精製した。シリカを１０％メタノール／クロロホルムに充填し、カラムを２５％メタノール／クロロホルムで溶出した。９００mlの画分を集め、薄層クロマトグラフィーで解析した。生成物（２０％メタノール／クロロホルム中でＲｆ＝０．５）を含有する画分を合わせ、真空下で濃縮した。得られた油状物を１７時間真空下で乾燥して、８．５ｇ（９．６７ミリモル、収率３９％）の生成物を得た。（Ｎ⁴−スペルミンコレステリルカルバメートの合成）Ｎ¹，Ｎ¹²−ジＣｂｚ−Ｎ⁴−スペルミンコレステリルカルバメート（８．５ｇ、９．６７ミリモル）を、２００mlの酢酸に溶解し、１．６６ｇの１０％白金担持活性炭を加えた。溶液に窒素を吹き付け、大気圧で水素下で攪拌した。水素ガスを満たした風船を使用して、反応フラスコに水素を供給した。水素分解を３時間進行させた。反応混合物をワットマン＃１濾紙でろ過し、触媒を２５０mlの酢酸エチル中の１０％酢酸で洗浄した。ろ液を真空下で濃縮して残渣を得て、クロロホルムと一緒に溶媒を留去すると酢酸の除去が促進される。粗生成物に１ＭＮａＯＨ溶液（４００ml）を加え、溶液を１０％メタノール／クロロホルム（７００ml）で３回洗浄した。合わせた有機画分を水（６００ml）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶液をろ過し、真空下で濃縮し、周囲温度で４８時間真空下で乾燥した。粗物質を、シリカゲル（５００ｇ）のクロマトグラフィーにより精製した。カラムに４０：２５メタノール：クロロホルムを充填し、４０：２５メタノール：クロロホルムで溶出し、次に４０：２５：１０メタノール：クロロホルム：水酸化アンモニウムで溶出した。集めた画分を薄層クロマトグラフィーで分析し、画分を含有する生成物を合わせ、真空下で濃縮した（残存する水を共沸させるためにイソプロパノールを加えて溶媒の蒸発を助けた）。物質を周囲温度で４８時間真空下で乾燥して、Ｎ⁴−スペルミンコレステリルカルバメート（４ｇ、６．５ミリモル、収率６７％）を得た。（Ｂ）Ｎ⁴−（Ｎ’−コレステリルカルバメートグリシンアミド）−スペルミン（両親媒性化合物Ｎｏ．９１）Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−グリシン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．５ｇ、１．８３ミリモル）を、６５／２５／４のクロロホルム／メタノール／水（５０ml）中のジＣｂｚ−スペルミン・２ＨＣｌ（１．０ｇ、１．９４ミリモル）とＮ，Ｎ −ジイソプロピルエチルアミン（０．３ml、１．７２ミリモル）の溶液に加えた。溶液を室温で一晩撹拌した。反応物をＴＬＣ（２０％メタノール／クロロホルム）で分析すると、新しいスポットが存在した。反応物をまず１ＭＮａＯＨ（１０ml）次に水（１０ml）で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥し、真空ろ過し、真空下で濃縮して油状物を得た。粗物質をフラッシュカラムクロマトグラフィー（８５ｇシリカゲル）により２０％メタノール／クロロホルムで溶出して精製した。所望の生成物を単離し、¹ＨＮＭＲによりＮ¹，Ｎ¹²−ジＣｂｚ−Ｎ⁴−（Ｎ’−ｔ−ＢＯＣ−グリシンアミド）スペルミン（４０２mg、０．６５ミリモル、３５％）として解析された。クロロギ酸ベンジル（１００mg、０．５８ミリモル）を、塩化メチレン（２０ ml）中のＮ¹，Ｎ¹²−ジＣｂｚ−Ｎ⁴−（Ｎ’−ｔ−ＢＯＣ−グリシンアミド）スペルミン（２２０mg、０．３５４ミリモル）とトリエチルアミン（４滴）の溶液に加えた。反応物を室温で一晩撹拌した。反応物をＴＬＣ（２０％メタノール／クロロホルム）により分析すると、新しい移動の速いスポットの存在が示された。１ＭＨＣｌ（５ml）を加えて反応を停止させた。有機層を単離し、Ｈ₂Ｏ（５ml）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、真空下で濃縮した。得られた粗物質をクロロホルム（３０ml）に溶解し、無水ＨＣｌガスを２時間溶液にバブリングした。反応物をＴＬＣ（１０％メタノール／クロロホルム）で分析すると、出発物質が完全に消失していることを示した。反応物に乾燥窒素を吹き付け、１ＭＮａＯＨ（２×１０ml）とｄＨ₂Ｏ（１０ml）で洗浄した。有機層を単離し、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、真空下で濃縮して、Ｎ¹，Ｎ⁹ ，Ｎ¹²−トリＣｂｚ−Ｎ⁴−グリシンアミド−スペルミン（２１９mg、０．３３ミリモル、２工程の収率９３％）を得た。クロロギ酸コレステリル（１４８mg、０．３３ミリモル）を、塩化メチレン（３０ml）中のＮ¹，Ｎ⁹，Ｎ¹²−トリＣｂｚ−Ｎ⁴−グリシンアミド−スペルミン（２１９mg、０．３３ミリモル）とトリエチルアミン（０．３ml、２．１５ミリモル）の溶液に加えた。反応物を室温で３時間撹拌した。反応物をＨ₂Ｏ（１０m l）で洗浄した。有機層を単離し、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、真空下で濃縮した。粗物質をフラッシュカラムクロマトグラフィー（３０ｇシリカゲル）により６５％酢酸エチル／ヘキサンで溶出して精製した。所望の生成物を単離し、¹ＨＮＭＲによりＮ¹，Ｎ⁹，Ｎ¹²−トリＣｂｚ−Ｎ⁴−（Ｎ’−コレステリルカルバメートグリシンアミド）−スペルミン（２２１mg、０．２ミリモル、６２％）として解析された。Ｎ¹，Ｎ⁹，Ｎ¹²−トリＣｂｚ−Ｎ⁴−（Ｎ’−コレステリルカルバメートグリシンアミド）−スペルミン（２２１mg、０．２ミリモル）を、氷酢酸（１０ml）中で１０％白金担持活性炭とともに、水素雰囲気下で２．５時間撹拌した。反応物をＴＬＣ（６５％酢酸エチル／ヘキサン）により分析すると、出発物質が完全に消失していることを示した。フラスコに窒素を吹き付け、ろ紙を用いて真空ろ過により触媒を取り出して１０％酢酸／酢酸エチル（２０ml）ですすいだ。ろ液を真空下で濃縮して油状物を得て、これを１０％メタノール／クロロホルム（１００ml）に溶解し、１ＭＮａＯＨ（２０ml）と水（１５ml）で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、真空下で濃縮した。単離した生成物は、¹ＨＮＭＲによりＮ⁴−（Ｎ’−コレステリルカルバメートグリシンアミド）−スペルミン（１２８mg、０．１９ミリモル、収率９５％）として解析された。（Ｃ）Ｎ⁴−スペルミジン−２，３−ジラウリルオキシプロピルアミン、両親媒性化合物Ｎｏ．９４の合成２，３ジミリストイルグリセロール（６００mg、１．４ミリモル）をピリジンに溶解し、この溶液を０℃に冷却した。溶液を窒素雰囲気下で攪拌し、ｐ−トルエンスルホニルクロリド（３００mg、１．５７ミリモル）を加えた。溶液を室温に加熱し、次に周囲温度で一晩撹拌した。この溶液に、塩酸（２．５Ｍ、２０ml ）を加え、溶液を塩化メチレン（２５ml）で３回抽出した。合わせた有機抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、真空下で濃縮して粗油状物を得た。油状物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル５０ｇ、６０Å）により５％酢酸エチル／ヘキサンで溶出して精製した。フラッシュクロマトグラフィーにより得られた油状物を高真空で周囲温度で乾燥して、２，３ジミリストイルグリセロールートシレート（６３０mg、収率７７％）を得た。２，３ジミリストイルグリセロールートシレート（３００mg、０．５１ミリモル）とＮ¹，Ｎ⁸−ジＣｂｚ−スペルミジン（１．５ｇ，３．６ミリモル）をトルエン（１５ml）に溶解した。溶液を窒素雰囲気下で撹拌し、加熱還流した（１１０℃）。反応物を還流温度で５日間加熱した。反応物を室温に冷却し、次にワットマン＃１ろ紙でろ過した。ろ液を真空下で濃縮した。残渣をクロロホルム（５０ml）に溶解し、水酸化ナトリウム溶液（１Ｍ、１０ml）と水（１０ml）で洗浄した。有機画分を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、真空下で濃縮した。粗物質をフラッシュクロマトグラフィー（３０ｇシリカゲル、６０Å）により５％メタノール／クロロホルムで溶出して精製した。画分を含有する生成物を真空下で濃縮した。物質を２回目のフラッシュカラムクロマトグラフィー（２０ｇ、６０Å ）により５０％酢酸エチル／ヘキサンで溶出して精製した。生成物を高真空で周囲温度で乾燥後、クロマトグラフィーによりＮ⁴−（Ｎ¹，Ｎ⁸）−ジＣｂｚ−スペルミジン−２，３−ジラウリルオキシプロピルアミンが油状物として得られた（１４２mg、収率３５％）。氷酢酸（５ml）中のＮ⁴−（Ｎ¹，Ｎ⁸）−ジＣｂｚ−スペルミジン−２，３− ジラウリルオキシプロピルアミン（１４２mg、０．１８ミリモル）を１０％白金担持活性炭とともに、水素雰囲気下で２時間撹拌した。ワットマン＃１ろ紙で真空ろ過して触媒を取り出した。触媒を酢酸エチル／ヘキサン（１０％、１０ml）で洗浄した。ろ液を真空下で濃縮し、高真空で２時間乾燥した。残渣に水酸化ナトリウム溶液（１Ｍ、８ml）を加え、溶液をメタノール／クロロホルム（１０％、２０ml）で３回抽出した。合わせた有機抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、真空下で濃縮して、高真空で乾燥後、Ｎ⁴−スペルミジン−２，３−ジラウリルオキシプロピルアミン（５２mg、収率５２％）を得た。（Ｄ）Ｎ⁴−スペルミン−２，３−ジラウリルオキシプロピルアミン、両親媒性化合物Ｎｏ．１０２の合成Ｎ¹，Ｎ¹²−ジＣｂｚ−スペルミン（０．８７ｇ、１．８５ミリモル）と２，３ジミリストイルグリセロールートシレート（２８０mg、０．４８ミリモル）を、トルエン（２５ml）に溶解し、還流温度（１１０℃）で３日間加熱した。溶液を真空下で濃縮し、得られた物質をフラッシュクロマトグラフィー（３０ｇシリカゲル、６０Å）により１０％メタノール／クロロホルムで溶出して精製した。単離した物質をメタノール／クロロホルム（１０％、８５ml）に溶解し、水酸化ナトリウム溶液（１Ｍ、１５ml）と水（１０ml）で２回洗浄した。有機画分を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、真空下で濃縮した。物質を高真空で周囲温度で一晩乾燥して、Ｎ⁴−（Ｎ¹，Ｎ¹²−ジＣｂｚ−スペルミン）−２，３ジラウリルオキシプロピルアミン（１８０ｍｇ、収率４３％）を得た。氷酢酸（１０ml）中のＮ⁴−（Ｎ¹，Ｎ¹²−ジＣｂｚ−スペルミン）−２，３ジラウリルオキシプロピルアミン（１８０mg）、０．２ミリモル）を１０％白金担持活性炭（５０mg）とともに水素雰囲気下で３時間撹拌した。ワットマン＃１ろ紙で真空ろ過して触媒を取り出した。触媒を酢酸エチル／ヘキサン（１０％、３０ml）で洗浄した。ろ液を真空下で濃縮し、高真空で２時間乾燥した。残渣にメタノール／クロロホルム（１０％、８５ml）を加え、有機層を水酸化ナトリウム溶液(１Ｍ、１５ml）と水（１０ml）で２回洗浄した。有機画分を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、真空下で濃縮して、高真空で乾燥後、Ｎ⁴−スペルミン− ２，３−ジラウリルオキシプロピルアミン（５０mg、収率４０％）を得た。例１１−Ｎ¹−スペルミンコレステリルカルバメート（Ｎｏ．３７）のＣＡＴ測定Ｎ¹−スペルミンコレステリルカルバメート（前記参照、両親媒性化合物Ｎｏ．３７）を、一般的に例３の方法に従って、インビボＣＡＴ測定法で評価した。Ｎ¹−スペルミンコレステリルカルバメートのストック溶液と中性の補助脂質ＤＯＰＥ（ジオレオイル［１８：１］ホスファチジルエタノールアミン）の調製は、例１に記載の通りであるが、いくつかの調製物（下記）では、完全にプロトン化した塩酸塩として両親媒性化合物を提供した（クロロホルムから）。トランスフェクションについては、両親媒性化合物をＤＯＰＥに対して１：１または１：２のモル比で、最終濃度３．６mMレポータープラスミドＤＮＡ（ヌクレオチドとして）、０．６mM陽イオン性両親媒性化合物、および０．６もしくは１．２mMのＤＯＰＥで試験した。図２２に示すように、遊離塩基の型の両親媒性化合物は、完全にプロトン化した塩酸塩に比較してレポーター遺伝子発現が劇的に増加した。本発明の好適な実施態様の上記説明は、本発明を当業者に例示するためのものである。これらは、開示された正確な形で本発明を限定するものと考えてはならない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者リー，エドワード，アール. アメリカ合衆国02169 マサチューセッツ州クインシイ，リンカンハイツ，センターストリート 175―ジェイ (72)発明者シーゲル，クレイグ，エス. アメリカ合衆国01801 マサチューセッツ州ウォバーン，ブラドフォードロード 15 (72)発明者イーストマン，サイモン，ジェイ. アメリカ合衆国01752 マサチューセッツ州マールボロ，ロイヤルクレストドライブナンバー10 13 (72)発明者チャン，チャウ，ダンアメリカ合衆国02173 マサチューセッツ州レキシントン，ミドルバイロード７ (72)発明者シュール，ロナルド，ケイ. アメリカ合衆国01748 マサチューセッツ州ホプキントン，イーストストリート 26 (72)発明者チェン，セン，エイチ. アメリカ合衆国02181 マサチューセッツ州ウェルスリイ，ウォールストリート 50

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）追加のプロトンを受容することができる陽イオン性両親媒性化合物；および（ｂ）生物活性のある核酸分子、の混合物を含む組成物。２．補助脂質をさらに含む、請求の範囲第１項に記載の組成物。３．補助脂質以外のプロトン供給源は存在しない、請求の範囲第２項に記載の組成物。４．陽イオン性両親媒性化合物は約５０％未満プロトン化されている、請求の範囲第１項に記載の組成物。５．陽イオン性両親媒性化合物はＴ−型である、請求の範囲第１項に記載の組成物。６．陽イオン性両親媒性化合物はステロイドベースである、請求の範囲第１項に記載の組成物。７．（ａ）追加のプロトンを受容することができる陽イオン性両親媒性化合物；および（ｂ）補助脂質、の混合物を含む組成物。８．陽イオン性脂質は追加のプロトンを受容することができる、陽イオン性脂質の存在下で生物活性のある核酸分子に細胞を接触させることを含む、細胞のトランスフェクション方法。９．接触はさらに補助脂質の存在下で行われる、請求の範囲第８項に記載の方法。１０．（ａ）追加のプロトンを受容することができる陽イオン性両親媒性化合物と；（ｂ）生物活性のある核酸分子とを、組合せる方法により産生される組成物。１１．補助脂質をさらに含む請求の範囲第１１項に記載の組成物。