JP2003501111A

JP2003501111A - ウイルスベクターと荷電分子の遺伝子治療への利用

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Publication number: JP2003501111A
Application number: JP2001502884A
Authority: JP
Inventors: フランシストゥファロ; ソニアユン; ブライアンホースバーグ
Original assignee: ニューロビールセラピューティクスインコーポレーティッド
Priority date: 1999-06-11
Filing date: 2000-06-12
Publication date: 2003-01-14
Also published as: EP1185306A4; CA2376956A1; DE60024442D1; WO2000076553A1; AU777120B2; US20040166092A1; DE60024442T2; EP1185306B1; EP1185306A1; ATE311205T1; AU5608900A; ES2252017T3

Abstract

(57)【要約】本発明は、遺伝子治療に用いるためのウイルスベクターおよび荷電分子を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の背景本発明は、ウイルスベクターおよび荷電分子の遺伝子治療への利用に関する。

【０００２】骨格筋は、近づくことができる部位が多く、非常に血管に富み、優れた分泌臓
器であることから、原発性ミオパシーまたは循環する蛋白質の産生を必要とする
疾患にとって理想的な治療提供部位である（ブラウ（Blau）ら、New Eng. J. Me
d. 333(23：1554〜1546、1995；ファンドイテコム（van Deutekom）ら、Neuromu
scular Disorders 8(3-4)：135〜148、1998；ホウェル（Howell）ら、Human Gen
e Therapy 9(5)：629〜934、1998；イサカ（Isaka）ら、Nature Med. 2(4)：418
〜423、1996；ポーリー（Pauly）ら、Gene Therapy 5(4)：473〜480、1998；ボ
ール（Bohl）ら、Human Gene Therapy 8(2)：195〜204、1997；タケダ（Takeda
）、Nippon Rinsho-Japanese J. Clin. Med. 55(12)：3114〜3119、1997；ツル
ミ（Tsurumi）ら、Circulation 96(9補足)：II-382〜8、1997）。その上、筋線
維の分裂後特性と筋線維の寿命が長いことから、たとえそれらが染色体DNAに組
み入れられなくとも、移入された遺伝子の安定な発現が可能となる（スベンソン
（Svensson）ら、Mol. Med. Today 2(4)：166〜172、1996；ファンドイテコム（
van Deutekom）ら、Mol. Med. Today 4(5)：214〜220、1998）。同様に、比較的
少数の筋肉線維に高レベルで遺伝子を発現させることは、遺伝的もしくは後天性
代謝障害を治療するために、またはワクチン接種にとって十分な免疫応答を誘導
するために、適切である可能性がある（デービス（Davis）ら、Human Mol. Gen.
2(11)：1847〜1851、1993）。

【０００３】骨格筋に対する遺伝子移入は、現在の世代のベクターが有意な細胞数を感染さ
せることができないために部分的に障害となっている（アクサディ（Acsadi）ら
、Nature 352(6338)：815〜818、1991；カルパチ（Karpati）ら、Muscle ＆ Ner
ve 16(11)：1141〜1153；スミス（Smith）ら、Nature Genetics 5(4)：397〜402
、1993；アクサディ（Acsadi）ら、Human Mol. Gen. 3(4)：579〜584、1994；ヤ
ン（Yang）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(10)：4407〜4411、1994；ダイ
（Dai）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92(5)：1401〜1405、1995；ヒュアー
ド（Huard）ら、Exp. ＆ Mol. Path. 62(2)：131〜143、1995；マリガン（Mulli
gan）、Science 260(5110)：926〜932、1993）。アデノ随伴ウイルス（AAV）は
、筋肉に効率的に感染し、かつ持続的な遺伝子発現を誘発するが、大きい遺伝子
を輸送して調節する能力は限られている。単純ヘルペスウイルス（HSV）および
アデノウイルスのような大きいDNAウイルスの場合、筋線維の感染に対する感受
性は、成熟するにつれて失われる（アクサディ（Acsadi）ら、Human Mol. Gen.
3(4)：579〜584、1994；ヒュアード（Huard）ら、Human Gene Therapy 8(4)：43
9〜452、1997；フェーロ（Feero）ら、Human Gene Therapy 8(4)：371〜380、19
97；ヒュアード（Huard）ら、Neuromuscular Disorders 7(5)：299〜313、1997
；ヒュアード（Huard）ら、J. Virol. 70(11)：8117〜8123、1996；ヒュアード
（Huard）ら、Gene Therapy 2(6)：385〜392、1995；イヌイ（Inui）ら、Brain
& Dev. 18(5)：357〜361、1996；ラゴット（Ragot）ら、Nature 361(6413)：647
〜650、1993；クアンチン（Quantin）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(7)：
2581〜2584、1992；ビンセント（Vincent）ら、Nature Genetics 5(2)：130〜13
4、1993）。齧歯類におけるHSV感染に関するこれまでの研究は、感染性の喪失が
、少なくとも一部、成熟の過程を通じての基底層の発達による可能性があり、こ
れが、HSV感染症における最初の事象を阻害する可能性がある（ヒュアード（Hua
rd）ら、J. Virol. 70(11)：8117〜8123、1996）。

【０００４】癌は、それに対して多くの治療が試験されているもう一つの疾患である。癌の
領域において集中的に研究されている一つの領域は、遺伝子治療である。癌の遺
伝子治療は、上記の筋肉の遺伝子治療と同じ多くの問題を有する。例えば、現行
のベクターは、腫瘍の増殖を減少させ、患者の生存を増加させるために十分な細
胞数に対して正確に輸送することができない。

【０００５】感染を開始させるために、HSVは、ヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸のよう
な細胞表面のグリコサミノグリカンに接着し（スペア（Spear）ら、Adv. Exp. M
ed & Biol. 313：341〜353、1992；シエー（Shieh）ら、116(5)：1273〜1281、1
992；フュラー（Fuller）ら、J. Virol. 66(8)：5002〜5012、1992；グルーエン
ハイド（Gruenheid）ら、J. Virol. 67(1)：93〜100、1993；ヘロルド（Herold
）ら、J. Gen. Virol. 75(6)：1211〜1222、1994；バンフィールド（Banfield）
ら、Virology 208(2)：531〜539、1995；ウィリアムス（Williams）ら、J. Viro
l. 71(2)：1375〜1380、1997）、これは、宿主細胞内に入るために必要な二次蛋
白質受容体と相互作用することができるようにウイルスを安定化させる（テリー
・アリソン（Terry-Allison）ら、J. Virol. 72(7)：5802〜5810、1998；ゲラー
ティ（Geraghty）ら、Science 280(5369)：1618〜1620、1998；モンゴメリー（M
ontgomery）ら、Cell 87(3)：427〜436、1996）。

【０００６】発明の概要本発明は、ベクター（例えばHSVベクターのようなウイルスベクター）を荷電
分子（例えば、グリコサミノグリカンまたはその類似体のような荷電多糖類）と
共に投与することによって、細胞にベクターを導入する方法を提供する。本発明
の方法を用いて、遺伝子治療またはワクチン接種において用いられる細胞に遺伝
子を導入することができる。

【０００７】したがって、本発明は、細胞をベクターに接触させること、およびこの接触の
前、間、または後のいずれかに、その培地中で荷電を有し、非細胞障害性、で細
胞によるベクターの取り込みを促進することができる化合物を含む液体培地に細
胞を接触させることによって、生きている細胞に核酸ベクターを導入する方法を
特徴とする。好ましくは、この方法は、哺乳類、例えば、ヒト患者において実施
される。本発明の方法において用いることができるベクターは、細胞への流入の
ための受容体または共受容体としてグリコサミノグリカンを用いることができる
。例えば、ヘルペスウイルスファミリー（例えば、HSV-1、HSV-2、VZV、CMV、EB
V、HHV6、およびHHV7）のウイルスベクターと共にデング熱ウイルス、アデノ随
伴ウイルス（AAV）、アデノウイルス、乳頭腫ウイルス、およびレトロウイルス
（例えば、HIVのようなレンチウイルス）に基づくベクターを用いることができ
る。同様に、リステリア菌（Listeria monocytogenes）に基づくベクターのよう
な細菌ベクターも用いることができる。好ましくは、ベクターは弱毒化され、本
発明において用いることができる弱毒化ウイルスの例を下記に提供する。

【０００８】本発明において用いることができる陰性または陽性荷電のいずれかを有する分
子には、グリコサミノグリカンおよびその類似体のような多糖類、ポリリジン、
アシクロデキストリン、ならびにジエチルアミノエタン（DEAE）が含まれる。本
発明において用いることができるグリコサミノグリカンおよびグリコサミノグリ
カン類似体の例には、例えば、デキストラン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫
酸、コンドロイチン硫酸、およびケラチン硫酸が含まれる。本発明において用い
ることができるさらなる荷電分子はポリエチレングリコールである。下記により
詳しく説明するように、荷電分子は、本発明の方法においてベクターの前、また
はベクターと共に投与することができる。

【０００９】本発明において用いてもよい細胞には、成熟筋細胞、網膜細胞、および癌細胞
が含まれる。

【００１０】それに対して本発明の方法を用いることができる病態および疾患には、癌、原
発性ミオパシー、ならびに治療産物の循環中への産生によって治療することがで
きる病態および疾患が含まれる。これらの病態および疾患の特定の例と共に、ポ
リペプチド（例えば、増殖因子、酵素、抗血管新生ポリペプチド、および細胞死
を促進するポリペプチド）、ホルモン、ワクチン抗原、アンチセンス分子、なら
びにリボザイムをコードする遺伝子のような、この治療を有効にするためにベク
ターに含めることができる遺伝子を下記にさらに説明する。さらに、ベクターお
よび荷電分子は、被験者に局所的または全身的に輸送してもよい。

【００１１】本発明は多くの長所を提供する。例えば、デキストラン硫酸のようなグリコサ
ミノグリカンおよびグリコサミノグリカン類似体は、非破壊性、非毒性であり、
ウイルスベクターが組織の他の部位に伝幡しないように制限する。このように、
本発明の方法は、直接注入によって所望の細胞または組織においてHSVベクター
中の遺伝子を標的化して発現させるというアプローチを表す。同様に、HSVは、
その大きさが大きいためにいくつかの大きい遺伝子を同時に輸送することができ
ることと、比較的毒性がないことから、遺伝子輸送ベクターとして魅力的である
（ヒュアード（Huard）ら、Neuromuscular Disorders 7(5)：299〜313、1997；
グロリオソ（Glorioso）ら、Annual Rev. Microbiol. 49：675〜710、1995）。
その上、HSVは、高い力価で増殖させることができ、非分裂細胞に効率よく感染
することができ（リム（Lim）ら、Biotechniques 20(3)：460〜469、1996）、お
よびウイルス複製を不活化するアシクロビルのような抗ウイルス剤の作用によっ
て制御することができる（エブラード（Evrard）ら、Cell Biol. & Toxic. 12(4
-6)：345〜350、1996；ブラック（Black）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(
8)：3525〜3529、1996；ハセガワ（Hasegawa）ら、Am. J. Resp. Cell & Mol. B
iol. 8(6)：655〜661、1993）。非複製HSVベクターも同様に、比較的毒性がなく
、このように、組織に外来蛋白質を発現させた場合の免疫原性の緩和に関与しう
る。最後に、上記のように、骨格筋は、近づくことができる多くの部位を有し、
血管に富む優れた分泌臓器であることから、ミオパシーおよび他の障害の治療に
とって理想的な部位である。

【００１２】本発明の他の特徴および長所は以下の詳細な説明および添付の図面から明らか
となるであろう。

【００１３】詳細な説明本発明は、多糖類、例えばグリコサミノグリカンまたはその類似体のような荷
電多糖類とベクター（例えば、HSVベクターのようなウイルスベクター）を同時
投与することによって、ベクターを細胞、例えば、成熟骨格筋細胞または腫瘍細
胞に導入する方法を提供する。本発明の方法は、例えば、遺伝子治療またはワク
チン接種の目的のためにインビボで細胞に遺伝子を導入するために用いることが
できる。

【００１４】本発明において用いることができるベクターは、細胞への流入のための受容体
または同時受容体としてグリコサミノグリカンを利用する。例えば、ヘルペスウ
イルスファミリーのウイルスベクター（例えば、HSV-1、HSV-2、VZV、CMV、EBV
、HHV-6、HHV-7、およびHHV-8）のウイルスベクターと共にデング熱ウイルス、
アデノ随伴ウイルス（AAV）、アデノウイルス、乳頭腫ウイルス、およびレンチ
ウイルス（例えば、HIV）に基づくベクターを用いることができる。同様に、リ
ステリア菌（Listeria monocytogenes）に基づくベクターのような細菌ベクター
も本発明の方法において用いることができる。

【００１５】場合によっては、本発明において用いられるウイルスベクターは、それらが導
入される細胞において複製しないように、または例えば、細胞の溶解もしくはア
ポトーシスを誘導することによって、細胞を殺さないように、弱毒化もしくは変
異させることが望ましい。他の場合、例えば、腫瘍細胞の遺伝子治療では、ベク
ターを細胞中で複製させて細胞を殺すことが有用である。これらの特徴を有する
多数の適当な変異ウイルスが既知であり、当業者は本発明において用いるために
容易に適合させることができる。例えば、HSVの場合、ゲラー（Geller）（米国
特許第5,501,979号；国際公開公報第90/09441号；アメリカンタイプカルチャー
コレクション（ATCC）、メリーランド州ロックビル、ATCCアクセッション番号40
544）、ブレークフィールド（Breakfield）（欧州特許第453,242-A1号）、スペ
ック（Speck）（国際公開公報第96/04395号）、プレストン（Preston）ら（国際
公開公報第96/04394号）、デルカ（DeLuca）（米国特許第5,658,724号）、およ
びマルツザ（Martuza）（米国特許第5,585,096号）のベクターを本発明の方法に
用いるために適合させることができる。本発明において用いることができる弱毒
化HSV変異体の特定の例には、NV1020（下記）、G207（ヤザキ（Yazaki）ら、Can
cer Res. 55(21)：4752〜4756、1995）、HF（ATCC VR-260）、マッキンタイアー
（MacIntyre）（ATCC VR-539）、MP（ATCC VR-735）；HSV-2株G（ATCC VR-724）
およびMS（ATCC VR-540）；と共に以下の遺伝子の一つまたはそれ以上において
変異を有する変異体が含まれうる：前初期遺伝子ICP0、ICP4、ICP22、ICP27、お
よびICP47（米国特許第5,658,724号）；ウイルス複製に必要な遺伝子、UL9、UL5
、UL42、DNA polおよびICP8；γ34.5遺伝子；リボヌクレオチドレダクターゼ遺
伝子；VP16遺伝子（すなわち、Vmw65、国際公開公報第91/02788号；国際公開公
報第96/04395号；国際公開公報第96/04394号）；およびgH、gL、gD、またはgB遺
伝子（国際公開公報第92/05263号、第94/21807号、第94/03207号）。

【００１６】本発明において用いることができる荷電分子には、グリコサミノグリカンおよ
びその類似体のような荷電多糖類、ポリリジン、アシクロデキストリン、ならび
にジエチルアミノエタン（DEAE）が含まれる。本発明において用いることができ
るグリコサミノグリカンおよびグリコサミノグリカン誘導体の例には、例えば、
デキストラン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、およ
びケラチン硫酸が含まれる。本発明において用いることができるさらなる荷電分
子はポリエチレングリコールである。下記に、より詳しく説明するように、荷電
分子は、本発明の方法においてベクターの前、またはベクターと共に投与するこ
とができる。

【００１７】本発明の方法を用いて治療することができる病態には、癌、原発性ミオパシー
と共に、循環する蛋白質の産生によって治療することができる病態が含まれうる
。このように、本発明の方法において用いられるベクターには、その発現によっ
て病態または疾患の症状が緩和または予防される、ポリペプチド、例えば、増殖
因子、酵素、細胞死を促進するポリペプチド、抗血管新生ポリペプチド、または
免疫調節蛋白質、ホルモン、アンチセンスRNA分子、またはリボザイム（下記参
照）のような一つまたはそれ以上の治療的遺伝子産物をコードする一つまたはそ
れ以上の遺伝子を含みうる。または、遺伝子はワクチン抗原をコードすることが
でき、このように本発明の方法は、例えば、望ましくない病原体または癌細胞の
ような細胞タイプに対する予防的または治療的免疫応答を誘導するために用いる
ことができる。

【００１８】本発明の方法を用いて治療することができる病態の特定の例（および、病態を
治療するためのベクターに含まれる対応する遺伝子）は以下の通りである：再狭
窄（β-ARKct（イアッカリノ（Iaccarino）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96
(7)：3945〜3950、1999））；線維芽細胞増殖因子受容体（ユカワ（Yukawa）ら
、Atherosclerosis 141(1)：125〜132、1998）；神経の発芽と筋肉の神経再支配
の増強による喉頭麻痺および筋萎縮（インスリン様増殖因子-1（IGF-1）（シオ
タニ（Shiotani）ら、Archives Otolaryngology 125(5)：555〜560、1999））；
VII型ムコ多糖症（β-グルクロニダーゼ（ダリー（Daly）ら、Human Gene Thera
py 10(1)：85〜94、1999）；肢帯筋ジストロフィー2C-F（δ-サルコグリカン（
グリーリッシュ（Greelish）ら、Nature Medicine 5(4)：439〜443、1999）；糸
球体腎炎および糸球体硬化症のような繊維症疾患（トランスフォーミング増殖因
子-βII型受容体-IgG Fcキメラ（イサカ（Isaka）ら、Kidney Intl. 55(2)：740
〜741、1999））；VI型ムコ多糖症（N-アセチルガラクトサミン-4-スルファター
ゼ（ヨガリンガム（Yogalingam）ら、DNA & Cell Biol. 18(3)：187〜195、1999
））；運動神経疾患（ニューロトロピン-3、およびCNTF、BDNF、およびIGF-1の
ような他の神経栄養因子（ハーセ（Haase）ら、J. Neuro. Sci. 160（補足1）：
S97〜105、1998））；高血圧症（アンジオテンシンII１型受容体アンチセンス（
ゲルバンド（Gelband）ら、Hypertension 33(1)：360〜365、1999）；アテロー
ム性動脈硬化症および高コレステロール血症（アポリポ蛋白質AIおよびレシチン
コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ファン（Fan）ら、Gene Therapy 5(
10)：1434〜1440、1998）；同種異系免疫応答の誘導（ドナーMHCクラスI（ザイ
（Zhai）ら、Transplant Immunology 6(3)：169〜175、1998））；血友病（第VI
II因子、第IX因子（ヘルツォグ（Herzog）ら、Nature Medicine 5(1)：56〜63、
1999；ヘルツォグ（Herzog）ら、Cur. Opin. Hemat. 5(5)：321〜326、1998））
；加齢における骨格筋機能の喪失（IGF-1（バートンデービス（Barton-Davis）
ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(26)：15603〜15607、1998）；肝酵素欠損
症（フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ハーディング（Harding）ら、Gene Th
erapy 5(5)：677〜683、1998）；非インスリン依存性真性糖尿病（GLUT4（ガル
スカ（Galuska）ら、Adv. Exp. Med. & Biol. 441：73〜85、1998）；グリコー
ゲン貯蔵疾患（酸α-グルコシダーゼ（ニコリーノ（Nicolino）ら、Human Mol.
Gen. 7(11)：1695〜1702、1998）；筋ジストロフィー（ジストロフィン（バラノ
フ（Baranov）ら、Genetika 34(7)：876〜882、1998；ウトロフィン（utrophin
）ラファエル（Rafael）ら、Nature Genetics 19(1)：79〜82、1998）；腫瘍お
よび転移抑制、ワクチンアジュバント、および病原体防御（インターロイキン-1
2（リー（Lee）ら、Human Gene Therapy 9(4)：457〜465、1998））；および急
性四肢虚血（血管内皮増殖因子（ツルミ（Tsurumi）ら、Circulation 96（補足9
）：II-382〜8、1997））。本発明の方法を用いて産生することができるさらな
る治療産物には、例えば成長ホルモン、エリスロポエチン、およびインスリン、
免疫調節蛋白質、抗血管新生蛋白質、サイトカイン、および細胞死に関係するポ
リペプチドが含まれうる。

【００１９】上記のように、本発明の方法において用いられるベクターにおける遺伝子によ
ってコードされる治療産物はまた、ハイブリダイゼーション相互作用によって細
胞または病原体mRNAの発現を阻害するために用いることができるアンチセンスRN
A分子のようなRNAにもなりうる。または、RNA分子は、欠損する細胞RNAを修復す
るか、または望ましくない細胞もしくは病原体コードRNAを破壊するようにデザ
インされたリボザイム（例えば、ハンマーヘッドもしくはヘアピン骨格のリボザ
イム）となりうる（例えば、スレンジャー（Sullenger）、Chem. Biol. 2(5)：2
49〜253、1995；クズバイコ（Czubayko）ら、Gene Ther. 4(9)：943〜949、1997
；ロッシ（Rossi）、Ciba Found. Symp. 209：195〜204、1997；ジェームス（Ja
mes）ら、Blood 91(2)：371〜382、1998；スレンジャー（Sullenger）、Cytokin
es Mol. Ther. 2(3)：201〜205、1996；ハンペル（Hampel）、Prog. Nucleic Ac
id Res. Mol. Bio. 58：1〜39、1998；クルシオ（Curcio）ら、Pharmacol. Ther
. 74(3)：317〜332、1997を参照のこと）。

【００２０】遺伝子は、標準的な方法を用いて本発明の方法に用いられるベクターに挿入す
ることができる（例えば、アウスユベール（Ausubel）ら、「分子生物学の現行
プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」、ジョン・ウィリ
ー＆サンズ、ニューヨーク、ニューヨーク州、1998を参照のこと）。遺伝子は、
それらがベクター調節配列の制御下となるように挿入することができる。または
、遺伝子は、プロモーターまたはエンハンサーのような調節エレメントを含む発
現カセットの一部として挿入することができる。適当な調節エレメントは、例え
ば、所望の組織特異性および発現レベルに基づいて当業者によって選択すること
ができる。例えば、組織または細胞タイプ特異的（例えば、筋肉特異的または腫
瘍が起こる組織）プロモーターを用いて、遺伝子産物の発現を特異的組織または
細胞タイプとなるように制限することができる。組織特異的プロモーターを用い
ることに加えて、ベクターおよび／または荷電分子の局所投与を用いて、局所発
現を得ることができる。

【００２１】本発明において用いることができる非組織特異的プロモーターの例には、初期
サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター（米国特許第4,168,062号）およびラ
ウス肉腫ウイルスプロモーター（ノートン（Norton）ら、Molec. Cell Biol. 5
：281、1985）が含まれうる。同様に、HSV-1 IEおよびIE4/5プロモーターのよう
なHSVプロモーターを用いることができる。本発明において用いることができる
組織特異的プロモーターの例は、筋肉細胞に特異的なデスミンプロモーターであ
る（リ（Li）ら、Gene 78：243、1989；リ（Li）ら、J. Biol. Chem. 266：6562
、1991）。他の筋肉特異的プロモーターは当技術分野で既知であり、本発明にお
いて用いるために容易に適合させることができる。

【００２２】ベクターおよび荷電分子は、本発明の方法に従って、例えば組織、例えば筋肉
または腫瘍が存在する組織に直接注入することによって、または外科的技法によ
って、患者（例えば、ヒト患者）に投与することができる。または、これらの物
質の１つまたは双方の投与は、非経口、静脈内、皮下、腹腔内、皮内、または表
皮内経路となりうる、または粘膜表面を経由する、例えば、眼表面、鼻腔内、肺
内、口腔、腸内、直腸内、膣内、もしくは尿路表面となりうる。

【００２３】哺乳類において細胞にベクターを導入する周知の多くの製剤を本発明において
用いることができる（例えば、「レミントンの製薬化学（Remington's Pharmace
utical Science）」（第18版）、ゲナロ（A. Gennaro）編、1990、マックパブリ
ッシング、イーストン、ペンシルバニア州を参照のこと）。例えばベクターは、
裸の形で、パッケージングまたは輸送媒体を含まずに用いることができる。ベク
ター（荷電分子と共に）は、担体と共にまたは担体を伴わずに、滅菌生理食塩液
または滅菌緩衝生理食塩液のような生理学的に許容される溶液に単に希釈するこ
とができる。

【００２４】投与すべきベクターの量は、例えば、達成される特定の目標、ベクターにおい
て用いられるプロモーターの強度、投与を対象とした哺乳類の状態（例えば、哺
乳類の体重、年齢、および全身健康状態）、投与様式、ならびに製剤のタイプに
依存する。一般的に、例えば約１ ng〜約１ mg、好ましくは約10 μg〜約800 μ
gの治療的または予防的有効量をヒト成人に投与する。

【００２５】投与される荷電分子の量は、当業者によって決定することができ、例えば、約
１ ng/ml〜約100 μg/mlとなりうるが、好ましくは10 μg/ml未満である。ベク
ターと荷電分子の双方の投与は、一回投与として、または一定間隔で反復して行
うことができる。同様に、荷電分子は、ベクターと同時に、またはベクターの前
（例えば、３時間前といった、５時間前まで）に投与することができる。

【００２６】本発明の方法は、下記に詳細に説明する、グリコサミノグリカン合成がマウス
の骨格筋成熟のあいだにダウンレギュレートされるという本発明者らの発見に基
づいている。このことは、ヘパラン硫酸がHSVの細胞への接着の共受容体として
作用するために、マウス骨格筋の成熟におけるHSV感染の減少を説明することが
できるであろう（モンゴメリー（Montgomery）ら、Cell 87(3)：427〜436、1996
；ゲラーティ（Geraghty）ら、Science 280）（5369）：1618〜1620、1998；ホ
イットベック（Whitbeck）ら、J. Virol. 71(8)：6083〜6093、1997）。二次HSV
受容体が存在するか否かを調べるために、筋繊維を、IV型コラゲナーゼおよびコ
ンドロイチンABCリアーゼを含む多様な酵素によって処理した。これらの処理は
いずれもHSV感染症を増強し、これは、ウイルス受容体が存在するが、無傷の筋
線維におけるウイルスに容易に近づくことができないことを示唆している。意外
にも本発明者らは同様に、HSV-1の感染性は、グリコサミノグリカン類似体であ
るデキストラン硫酸の低濃度に筋線維を暴露することによって回復することがで
きるが、２型HSV（HSV-2）は回復できないことを発見した。デキストラン硫酸は
、ヘパラン硫酸の非存在下でHSV-1を推進するが、HSV-2感染症は促進しないこと
がすでに知られている。このことは、近づくことができるヘパラン硫酸が存在し
ないことが、HSV-1感染症に対する成熟筋線維の抵抗性の原因であるという仮説
の根拠となる。併せて考慮すると、これらの結果は、基底層が感染症に対する完
全な遮断ではないこと、およびデキストラン硫酸が、成熟骨格筋に対するHSV-1
の非破壊的ターゲティングのための代用補助受容体として用いることができるこ
とを示している。これらの知見は、下記に詳細に説明するが、遺伝および後天性
疾患の治療のための遺伝子治療ベクターとしてHSVの有用性を大きく拡大する。

【００２７】本発明者らはまた、HSVによる腫瘍細胞の感染は、荷電分子、例えばグリコサ
ミノグリカンまたはグリコサミノグリカン類似体の同時投与によって増加するこ
とを発見した。これらの結果は、さらに下記に説明するが、癌または他の細胞の
増殖疾患もしくは病態を治療するために遺伝子治療ベクターとしてHSVを用いる
ことのさらに根拠となる。

【００２８】結果成熟筋線維は感染に対して抵抗性である HSVベクターは新生児筋線維をインビトロで感染させるが、より高齢の動物か
ら単離されたものは感染させないことが示されている（Huardら、Human Gene Th
erapy 8（4）：439〜452、1997；Feeroら、Human Gene Therapy 8（4）：371〜3
80、1997；Huardら、Neuromuscular Disorders 7（5）：299〜313、1997；Huard
ら、J. Virol. 70（11）：8117〜8123、1996）。成熟依存的な感染喪失の背景に
ある基盤を検討するために、単一の筋線維を培養下で樹立し、感染後にβ-ガラ
クトシダーゼを発現する弱毒複製能欠損HSV-1ベクターG207に曝露させた（Yazak
iら、Cancer Res. 55（21）：4752〜4756、1995；Minetaら、Nature Med. 1（9
）：938〜943、1995）。これらのアッセイ法において、新生児筋線維はすべて感
染に対して感受性であったが、この濃度のウイルスに感染した成熟筋線維は6％
に過ぎなかった（表1ならびに図1aおよびb）。すなわち、これらの結果は、HSV
感染に対する感受性の成熟依存的な喪失を示した以前の研究と一致していた（Fe
eroら、Human Gene Therapy 8（4）：371〜380、1997；Huardら、J. Virol. 70
（11）：8117〜8123、1996）。

【００２９】

【表１】成熟マウスEDL筋から単離された、G207接種および提示した処理の後
にlacZを発現する筋線維の数 *0.66mg／ml IV型コラゲナーゼは単離筋線維に対して毒性があった

【００３０】成体骨格筋の感染性を回復させるためのアプローチ以前の研究から、成熟期間中の基底層の形成がHSV感染に対する物理的障壁と
して作用し、それによってウイルスと感染のために必要な受容体との相互作用が
妨げられる可能性が示唆されている。このことを検証するために、コラーゲンか
らペプチドを遊離させてそれによって基底層を分解するIV型コラゲナーゼで処理
した後に単離筋線維をG207に曝露させた（図1）。核内HSV蛋白質ICP4の間接的免
疫蛍光により、この手法による基底層の部分的破壊によってHSV感染が促された
ことが明らかになった（図1d）。この効果は濃度依存的であり、IV型コラゲナー
ゼの増加はHSV感染の増加と相関していた。30分間のプレインキュベーション期
間における筋線維の超収縮（hypercontraction）によって示される毒性は0.66mg
／mlから生じた（表1）。第2のアプローチでは、広範囲のコンドロイチン硫酸部
分を分解するコンドロイチンABCリアーゼがHSV感染への感受性を高める能力を検
討した（図1gおよびh）。この処理によって感染性は著しく高まったが、ヘパリ
チナーゼ処理ではこれは生じなかった（表1）。したがって、特異的酵素による
基底層の部分的破壊によってHIVの付着および成熟筋線維への進入が可能となっ
ており、このことからウイルス二次受容体は存在するものの、成熟筋線維の状況
下では到達可能でない可能性が示唆される。

【００３１】細胞表面グリコサミノグリカンの分析 HSVは、細胞表面のヘパラン硫酸様部分に付着した後に二次蛋白質受容体と相
互作用することによって細胞に感染する（Spearら、Adv. Exp. Med. & Biol. 31
3：341〜353、1992；Gruenheidら、J. Virol. 67（1）：93〜l00、1993；Geragh
tyら、Science 280（5369）：1618〜1620、1998；Montgomeryら、Cell 87（3）
：427〜436、1996）。細胞表面ヘパラン硫酸は厳密に必要ではないものの、検討
された細胞の大部分でHSV感染効率を2倍に高める（Banfieldら、J. Virol. 69（
9）：3290〜3298、1995）。グリコサミノグリカンの発現が成体および新生児の
筋線維で変化しているか否かを調べるために、放射性グリコサミノグリカンを筋
線維培養物から単離し、陰イオン交換HPLCによって分析した（図2）。新生児筋
線維は著しい量のヘパラン硫酸およびコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカン
を発現した。これに対して、成体筋線維では定常的標識時のグリコサミノグリカ
ンの合成が著しく低下しており、合成された残りのヘパラン硫酸の硫酸化の程度
も新生児筋線維と比べて低かった（図2）。

【００３２】デキストラン硫酸は成熟筋線維におけるHSV感染を回復させるこれまでのデータは、成熟筋線維に存在する基底層の1つまたは複数の成分がH
SV感染を妨げることを示している。さらに、ヘパラン硫酸の生合成は未熟な筋線
維と比べて低下しており、これはHSV感染に対する感受性が喪失する原因のすべ
てまたは一部である可能性がある。ヘパラン硫酸の生合成が行われない細胞は、
低濃度のデキストラン硫酸を感染前または感染時に細胞に添加すると、HSV-1に
は感染しうるがHSV-2には感染しないことが以前に示されている（Dyerら、J. Vi
rol. 71（1）：191〜198、1997）。これとは対照的に、デキストラン硫酸は、標
的細胞が著しい量のヘパラン硫酸を発現する場合にはHSV感染の強力な阻害因子
である。デキストラン硫酸を培養下にある成熟筋線維に添加すると、HSV-1感染
性は著しく高まった（図1eおよびfならびに表1）。さらに、この作用はHSV-1に
特異的であり、これは成熟筋線維の感染性の喪失の原因が少なくとも一部には細
胞表面上に到達可能なヘパラン硫酸部分がないことによるという仮説に一致する
（表2）。

【００３３】

【表２】成熟筋線維のデキストラン硫酸刺激、G207（HSV-1）とLIBR1（HSV-2
）との対比

【００３４】 HSVと細胞膜との付着後融合にさらに遮断があるか否かを検証するために、単
離した成熟筋線維を、G207を感染させる前に、融合誘導因子であるポリエチレン
グリコール（PEG）に曝露した。PEG誘導性の融合は成体筋線維の感染性を変化さ
せず、このことからHSV感染の遮断はウイルス付着のレベルで生じていることが
示唆された（表1）。

【００３５】骨格筋の感染未熟筋線維がインビボでG207感染に対する感受性をもつことを確認するために
、8日齢balb／cマウスの前脛骨（TA）筋に10^６プラーク形成単位（pfu）を直接
注射した。注射した筋肉を注射3日後に採取して切片化し、β-ガラクトシダーゼ
の発現に関して組織化学的に分析した（図3）。注射した領域には導入遺伝子の
高レベルの発現が検出された。HSVに感染した筋線維は注射部位から離れたとこ
ろにも認められ、ベクターのかなりの拡がりが示唆された。

【００３６】インビトロでの感染性を高めた3種類の処理が成体動物で作用するか否かを検
証するために、マウスの前脛骨（TA）筋に、コンドロイチンABCリアーゼ、IV型
コラゲナーゼ、またはデキストラン硫酸とともに1×10^６pfuのG207を注射した。
いずれの場合にも、インビボの結果はインビトロでの観察所見と一致していた（
図4、表3）。興味深いことに、デキストラン硫酸をウイルスよりも1時間前に投
与しても機能喪失はみられず、この観察所見はインビトロでも認められた（Dyer
ら、J. Virol. 71（1）：191〜198、1997）。さらに、感染は、中心部に核が位
置することによって同定される再生中の筋線維に限定されなかった。以上を総合
すると、これらの結果は、成体骨格筋におけるHSV感染に対する障壁は、少なく
とも一部には、効率的な感染のために必要なHSV受容体が比較的少ないことに起
因することを示している。

【００３７】

【表３】各処理とG207との筋肉内同時注射による遺伝子導入後の成熟マウスTA
筋におけるlacZ発現性線維の数

【００３８】全身性送達後のHSV毒性 NV1020を全身性に送達したマウスにおけるHSVの毒性をまず評価した。マウス
に脾臓内経路、門脈、または尾静脈を介してさまざまな用量のNV1020を投与した
。罹病率および死亡率を28日間にわたって毎日評価した（表4）。これらの試験
から、1×10^７pfuであれば、観測しうる毒性を伴わずにマウスにさまざまな経路
から送達しうることが示された。この無作用量はヒトでは約3.5×10^１０pfuに相
当する。

【００３９】

【表４】血管内送達後のHSVの毒性 †死亡率％はウイルス精製過程に依存する *マウスが12週齡を超える場合は認められない

【００４０】HSVの全身性送達は腫瘍組織の感染を引き起こす HSVを抗腫瘍薬として腫瘍組織に送達することもできる。例えば、尾静脈を介
して（ICP47が欠失し、細菌人工染色体（BAC）因子をチミジンキナーゼ座位に挿
入されたG207の派生物であるG47Δ-BAC）または門脈を介して局所領域的に（G20
7）HSVをマウスに投与し、それぞれ遠位側腹腫瘍または肝腫瘍へと到達させた。
ウイルスはそれぞれのモデルにおいて腫瘍細胞を首尾良く感染させた（図5）。
ウイルスによって誘導される腫瘍細胞の破壊の後には、腫瘍壊死が起こり、腫瘍
増殖の遅延および寛解をもたらす可能性がある。

【００４１】全身投与の後の種々の組織へのウイルス粒子の送達全身投与後に腫瘍に到達したウイルス粒子の推定数も評価した。側腹腫瘍のあ
るマウスに尾静脈から1×10^７pfuの^３５Sメチオニン標識NV1020を注射した。NV1
020はγ34.5を1コピーのみ含み、ゲノムセグメントの再配列が破壊されるように
末端反復部に欠失がある複製可能な組換えベクターである。2時間後にマウスを
屠殺してその組織を回収し、ウイルス粒子の存在に関して測定した（放射性標識
の測定による）。これらの試験の結果から、約10^３〜10^４個のウイルス粒子が肝
臓内に見いだされ、約10^４〜10^５個の粒子が腫瘍組織中に見いだされることが示
された（図6）。

【００４２】NV1020の全身性送達はCT-26転移性肝癌モデルの生存性を有意に高める NV1020を、転移性癌モデルのマウスに対するこのウイルスベクターの投与の効
果を検討する目的にも用いた。このモデルでは、マウスへのCT-26癌細胞の脾臓
内注射後に肝腫瘍小結節が形成された。細胞注入から24時間後にマウスに尾静脈
から1×10⁷個のNV1020を注射した。マウスを注意深く観察し、生存率を経時的に
評価した（図7）。瀕死状態のマウスは適切な形で屠殺した。NV1020の投与によ
り、生存率は対照動物と比較して25％から75％に上昇した。

【００４３】NV1020の腫瘍内または全身性送達はCT-26側腹腫瘍モデルにおいて抗腫瘍効果を
もたらす腫瘍増殖に対するHSVの全身性送達の効果を明らかにするために、さまざまな
送達様式も検討した。CT-26癌細胞の皮下注射によってマウスに側腹腫瘍を作成
した。続いてこのマウスに1×10^７pfuのNV1020を腫瘍内に、または尾静脈を介し
て全身性に投与した。続いて腫瘍体積を週2回測定することによって腫瘍増殖速
度を評価した（図8）。

【００４４】この試験の結果から、NV1020の腫瘍内投与が尾静脈を介した全身性送達と同程
度に有効である（統計学的な差がない）ことが示された。いずれの投与経路も腫
瘍増殖速度を有意に低下させ、腫瘍体積は約50％減少した。これらの結果は、ウ
イルスは腫瘍モデルに腫瘍内注射によって投与されることが典型的ではあるもの
の（ウイルスの全身性送達では、有効性が十分に得られるpfuが腫瘍に到達しな
いと考えられているため）、他の投与経路も有効であることを示している。

【００４５】腫瘍治療のためのウイルスベクター療法へのグリコサミノグリカン類似体の追
加についても検討した。デキストラン硫酸は、ウイルスと細胞との付着を妨げる
ことによって標的細胞のウイルス感染を阻止するために研究環境で用いられるグ
リコサミノグリカン類似体である。臨床的環境では、これは手術後の治療薬の局
所的灌流のために用いられる。デキストラン硫酸は増量剤としても報告されてい
る。ごく最近では、デキストラン硫酸はHIVに対する抗ウイルス薬としても検討
されている。

【００４６】腫瘍増殖に対するHSVおよびデキストラン硫酸類似体の併用の効果を明らかに
するために、CT-26側腹腫瘍モデルを再び用いた。1×10^７pfuのNV1020およびデ
キストラン硫酸（100μg／ml）の組み合わせを側腹腫瘍のあるマウスに尾静脈か
ら併用投与し、腫瘍体積を経時的に評価した。NV1020単独の場合と同じく、NV10
20＋デキストランによっても腫瘍体積は減少した（図8）。

【００４７】投与するデキストラン硫酸の用量とともに抗腫瘍効果は高まる HSVとともに投与する荷電分子の濃度が腫瘍増殖に及ぼす影響も評価した。側
腹腫瘍のあるマウスに1×10^７pfuのNV1020、1×10^７pfuのNV1020＋10μg／mlの
デキストラン硫酸、1×10 pfuのNV1020＋100μg／mlのデキストラン硫酸（100μ
g／ml）、1×10^７pfuのNV1020＋500μg／mlのデキストラン硫酸、またはPBS＋10
0μg／mlのデキストラン硫酸（対照）の単回投与を、第0日、第2日および第4日
に行った。続いて腫瘍増殖速度を評価した（図9）。これらの試験により、デキ
ストラン硫酸がウイルス療法を用量依存的な様式で強化し、NV1020と同時投与す
るデキストラン硫酸の濃度が高いほど低濃度よりも有効であることが明らかにな
った。

【００４８】多回投与はCT-26側腹腫瘍モデルにおける抗腫瘍効果を高める腫瘍増殖に対するHSV＋デキストラン硫酸の多回投与の効果も評価した。側腹
腫瘍のあるマウスに対して、1×10^７pfuのNV1020の3回投与、3×10^７pfuのNV102
0の単回投与、1×10^７pfuのNV1020＋100μg／mlのデキストラン硫酸（F1）の３
回投与、またはPBS（対照）の投与を行った。続いて腫瘍増殖速度を評価した（
図10）。

【００４９】この試験の結果から、腫瘍の増殖性は100μg／mlのデキストラン硫酸をNV1020
と同時注射した場合に相対的に低いことが示された。さらに、抗腫瘍効果は1×1
0^７pfuのNV1020の3回投与を行った場合の方が3×10^７pfuのNV1020の単回投与を
行った場合と比べて高かった。

【００５０】NV1020とデキストラン硫酸との多回投与はCT-26側腹腫瘍モデルにおける生存性
を高める抗腫瘍効果に関する多くの報告では、対象の生存性がそれに対応する形では高
まっていない。HSVまたはHSV＋デキストラン硫酸を投与した動物における生存性
が抗腫瘍効果と対応するかどうかを明らかにするために、側腹腫瘍のあるマウス
に対して、3×10^７pfuのNV1020の単回投与、3×10^７pfuのNV1020＋100μg／mlの
デキストラン硫酸の単回投与、1×10^７pfuのNV1020＋100μg／mlのデキストラン
硫酸の3回投与、またはPBS（対照）の投与を行った。続いてマウスの生存率を経
時的に計測した（図11）。これらの試験により、デキストラン硫酸とともにNV10
20が多回投与によって送達された場合にマウスの生存率が高まることが示された
。これらの結果は、上記のNV1020＋デキストラン硫酸の抗腫瘍効果と対応してい
る。このような治療によって、治癒が得られる可能性がある。

【００５１】デキストラン硫酸はCT-26転移性肝癌モデルにおける効果を高めるマウスCT-26転移性肝癌モデルにおける処方の変化の影響も評価した。転移性
腫瘍のあるマウスに対して、1×10^７pfuのNV1020、1×10^７pfuのNV1020＋デキス
トラン硫酸（100μg／ml）、PBSのみ（対照）、またはPBS＋デキストラン硫酸（
100μg／ml）（対照）を投与した。続いて処理後13日目に腫瘍小結節の数を評価
した（図12）。3種類の処方のそれぞれの投与により、対照と比較して小結節の
数は減少した。これらの結果は、この投与プロトコールが、単一の大きな確立さ
れた側腹腫瘍の場合だけでなく、微細病巣の場合にも有効であることを立証する
ものである。

【００５２】デキストランおよびアシクロビルもCT-26側腹腫瘍モデルにおける抗腫瘍効果を
高める HSV＋デキストラン硫酸処方の抗腫瘍効果におけるデキストラン硫酸の硫酸化
およびHSVの複製の役割を検討するために、デキストランまたはアシクロビルを
処方に追加した。デキストラン分子は医療において増量剤として、および手術後
の組織の局所的灌流のために用いられている。また、日本ではデキストランを心
血管疾患の治療にルーチン的に用いているという報告もある。アシクロビルは臨
床的に承認された医薬品であり、HSVの複製を防止し、それによってその拡がり
を抑制するために用いられている。これはウイルスチミジンキナーゼによって活
性化される絶対的連鎖終結因子である。

【００５３】側腹腫瘍のあるマウスに対して、1×10^７pfuのNV1020、1×10^７のpfu NV1020
＋デキストラン硫酸（100μg／ml）、1×10^７pfuのNV1020＋デキストランのみ、
1×10^７pfuのNV1020＋デキストラン硫酸（100μg／ml）およびアシクロビル（2m
g／ml）、またはPBS＋デキストラン硫酸（100μg／ml）を投与した。続いて腫瘍
増殖速度を週2回評価した（図13）。HSVとデキストランのみの同時注射によって
も同等な抗腫瘍効果が得られたため、デキストラン硫酸の硫酸成分は、抗腫瘍効
果を高めるその作用に影響を及ぼさないと思われた。同じく、HSV、デキストラ
ン硫酸およびアシクロビルの併用によって腫瘍の増殖性が低下したことから、ウ
イルスの複製は抗腫瘍効果またはマウスの生存性に必要ではないと思われた。

【００５４】G207の抗腫瘍効果はデキストラン硫酸によって高まる NV1020とは別の系統であり、γ34.5の双方のコピーが欠失し、β-ガラクトシ
ダーゼ遺伝子の挿入によってリボヌクレオチドレダクターゼが不活性化されてい
るもう1つの組換えHSVベクターであるG207の抗腫瘍効果の試験も行った。側腹腫
瘍のあるマウスに対して、1×10^７pfuのNV1020、1×10^７pfuのG207、1×10^７pfu
のG207＋デキストラン硫酸（100μg／ml）またはPBS＋デキストラン硫酸（100μ
g／ml）（対照）を、第0日、第2日、および第4日に投与した。続いて腫瘍増殖速
度を測定した（図14）。デキストラン硫酸はG207の抗腫瘍効果を高め、このこと
から他の系統のHSVベクターも治療的価値があること、およびHSV-1の抗腫瘍効果
はγ34.5には依存しないことが示された。これらの所見は、現在の世代の他のベ
クターも治療的に用いうる可能性を示唆する。

【００５５】デキストラン硫酸はCT-26の形態をインビトロで変化させるが、細胞増殖は変化
させない HSVと併用した際のデキストラン硫酸またはデキストランのインビボ効果をさ
らに解明するために、細胞形態および細胞増殖に対するデキストラン硫酸の影響
を細胞培養モデルで評価した。CT-26細胞を100μg／mlのデキストラン硫酸で処
理するか、処理を行わずに放置した。48時間後に細胞の数および形態を調べた（
図15）。インビトロでデキストラン硫酸を細胞培養液に添加してもCT-26細胞の
増殖は遅延しなかった。しかし、細胞をデキストラン硫酸で処理すると細胞の形
態が変化した。デキストラン硫酸の非存在下でCT-26細胞は「塊状」の外観を呈
したのに対して（図面A）、デキストラン硫酸の存在下ではCT-26細胞は組織培養
皿の全体に均等に拡がっているように認められた（図面B）。これらの結果は、
インビボで認められた著明な抗腫瘍効果の原因が遺伝子発現の変化にある可能性
を示唆する。

【００５６】デキストラン硫酸およびアシクロビルは培養下でCT-26の増殖に影響を及ぼさな
いインビトロでの細胞増殖に対するデキストラン硫酸、アシクロビルまたはデキ
ストランとアシクロビルとの併用の効果も検討した。培養CT-26細胞に対して、
デキストラン硫酸（100μg／ml）、アシクロビル（2mg／ml）、デキストラン硫
酸とアシクロビルの両方を投与するか、または処理を行わずに放置した（対照）
。各処方を添加した後のさまざまな時点でCT-26細胞を計数した。処方に72時間
曝露させた後、デキストラン硫酸、アシクロビルまたは両処方の組み合わせに曝
露させた場合の細胞の増殖（細胞数／ml）には非処理細胞と比べて有意差はなか
った（図16）。このような結果は、これらの処方がインビトロで細胞増殖を変化
させないことを示している。

【００５７】デキストラン硫酸は腫瘍の周辺変性（peripheral degeneration）を増大させる次に、HSVとデキストラン硫酸の同時投与が腫瘍変性に及ぼす結果を検討した
。側腹腫瘍のあるマウスに対してNV1020またはNV1020＋デキストラン硫酸（F1）
を尾静脈から投与した。続いて腫瘍を摘出して凍結し、組織化学的分析のために
切片化した（図17）。腫瘍の周辺変性はデキストラン硫酸をNV1020とともに投与
した場合（図面B；薄紫色で示されている領域）の方が、NV1020を単独で投与し
た場合よりもはるかに強かった（図面A）。このことは、腫瘍壊死が腫瘍の中心
部の無酸素細胞に限定されず、腫瘍に栄養分を運ぶ血管が位置する辺縁部に位置
する増殖性および分裂性の腫瘍細胞にも及んでいることを示している。

【００５８】デキストラン硫酸はウイルスのインビボでの生物学的利用能を高めるウイルスは、免疫系の成分（補体、抗体）を含む、血液中に存在する成分によ
って急速に不活性化されることが知られているため、ウイルスのインビボでの生
物学的利用能に対するデキストラン硫酸の影響を検討した。1×10^７pfuのNV1020
または1×10^７pfuのNV1020＋デキストラン硫酸（100μg／ml）をマウスに尾静脈
から投与した。その後のさまざまな時点でマウスの群を屠殺した。心臓穿刺によ
って血液試料を採取し、ウイルスがインビボで感染性を有する期間を決定するた
めに血清を分析した（図18）。デキストラン硫酸をNV1020とともに投与すると、
感染性ウイルスの循環時間は3倍に延長した。このような時間であれば、ウイル
スが抗腫瘍効果を媒介するために腫瘍に十分に到達することができる。すなわち
、感染性ウイルスの循環時間の延長により、送達される正味の治療ベクターは増
加する。

【００５９】デキストラン硫酸はより多くのウイルスが腫瘍組織に到達するようにNV1020のインビボ分布を変化させるさらに、NV1020のインビボ組織分布に対するデキストラン硫酸の影響を評価し
た。1×10^７pfuの放射性標識（^３５S）NV1020または1×10^７pfuの放射性標識（
^３５S）NV1020＋デキストラン硫酸（100μg／ml）を側腹腫瘍のあるマウスに尾
静脈から投与した。2時間または12時間後の時点で、肝臓、脾臓、腎臓、肺、お
よび心臓を含む種々の臓器、ならびに腫瘍を回収してホモジナイズし、シンチレ
ーション計数によってウイルス量に関して評価した（図19）。時間の経過ととも
に、デキストラン硫酸は腫瘍内に認められるウイルスの量を増加させ、肝臓内に
認められるウイルスの量を減少させた。

【００６０】デキストラン硫酸は血管新生因子の遺伝子発現を低下させるデキストラン硫酸で処理したCT-26細胞における遺伝子発現試験も実施した。
培養CT-26細胞をデキストラン硫酸で1時間処理するか、または処理せずに放置し
た。続いてRNAを細胞から抽出した。続いて数多くの異なる遺伝子の発現を測定
し、デキストラン硫酸で処理した細胞と非処理細胞との間で発現レベルを比較し
た。これらの試験の結果を表5にまとめている。注目されるのは、血管新生に関
与する蛋白質をコードする多数の遺伝子の発現が低下していたことである。

【００６１】

【表５】遺伝子アレイ分析

【００６２】材料および方法材料分子量500,000のデキストラン硫酸はファルマシア（Pharmacia）社から購入し
た（カタログ番号17-0340-01）。コンドロイチンABCリアーゼは生化学工業株式
会社（Seikagaku Corporation）から購入した（カタログ番号100330）。ヘパリ
チナーゼは生化学工業株式会社（Seikagaku Corporation）から購入した（カタ
ログ番号100703）。IV型コラゲナーゼはシグマ（Sigma）社から購入した（カタ
ログ番号C 1889）。すべての組織培養用試薬（Gibco）および培養皿（Nunc）は
カナディアンライフテクノロジーズ（Canadian Life Technologies）社（Burlin
gton、Ontario、Canada）から購入した。

【００６３】ウイルス株組換えNV1020、HSV-1、G207（NeuroVir Inc.）およびHSV-2、LIBR1（Asanoら
、J. Gen. Virol. 80（1）：51〜56、1999；Nishiyamaら、Virology 190（1）：
256〜268、1992）はベロ細胞にて調製した。複製可能なベクターである組換えHS
VベクターNV1020は、γ34.5を1コピーのみ含み、ゲノムセグメントの再配列が破
壊されるように末端反復部に欠失がある。G207はリボヌクレオチドレダクターゼ
遺伝子中にインフレーム形式で挿入されたβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を含んで
いる。このため、この組換えウイルスは非分裂細胞（例えば筋肉細胞）では複製
不能である。LIBR1はUS3蛋白質キナーゼ遺伝子に挿入された形でβ-ガラクトシ
ダーゼ遺伝子を含む。ウイルスは、標準的な方法を用いて、30％スクロースパッ
ドを通した遠心処理によって濃縮し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中に懸濁さ
せ、0.45μmフィルター（Sartorius）によって濾過した。すべての実験に用いた
感染性ウイルスの最終的な力価は1×10^８pfu／mlであった。

【００６４】初代筋線維培養 Balb／cマウスはブリティッシュコロンビア大学（University of British Col
umbia）の施設内の動物飼育室で飼育した。2つの異なる年齢群を「新生児」およ
び「成体」と命名した。「新生児」マウスは7〜10日齢とした。「成体」マウス
は6〜12週齡とした。

【００６５】切り出した長趾伸（EDL）筋から単一の単離筋線維を調製した。0.2％1型コラ
ゲナーゼ（Sigma）中での酵素的脱凝集の後に軽く摩砕を加えることによって筋
線維を解離させた。続いて単離筋線維を、1mg／mlのマトリゲル（Matrigel）（C
ollaborative Biomedical Products）をコーティングした複数の24穴培養皿に平
板培養した。10％ウマ血清および10％FBSを含むDMEMからなる培地をウェルに加
えた。続いてこれらのプレートを37℃で18時間インキュベートし、その時点で生
存している筋線維にG207を感染させた。

【００６６】筋線維の感染 G207（10^６pfu）を含む培地（10％FBS、DMEM中）をウェルに直接添加すること
によって筋線維を感染させた。インキュベーション期間は一晩（約18時間）とし
たが、DMEM中で1時間感染させれば再現性のある感染を得るのに十分であった。
インキュベーションの後に、筋線維を1.25％グルタルアルデヒド中で15分間固定
し、2％X-gal基質（PBS中、1mM MgCl_２、5mM K_４Fe(CN)_６／K_３Fe(CN)_６）（Can
adian Life Technologies）により37℃で4時間染色した。

【００６７】間接免疫蛍光法単離筋線維をカバーグラス上に平板培養し、上記の通りにG207に感染させた。
続いてそれらを1.25％グルタルアルデヒド（PBS中）で15分間固定し、PBSで2回
すすぎ洗いをした後に、ブロッキング溶液（1％ウシ血清アルブミン（Boehringe
r Manuheim）を含むPBS）中で15分間インキュベートした。ブロッキングの後に
、0.1％Triton-X100／PBSで筋線維の透過化処理を5分間行い、1：2000の希釈度
でマウス抗ICP4抗体とともに1時間インキュベートした。PBSを3回交換して筋線
維を洗った後、PBS-1％BSAで1：200に希釈したテキサスレッド結合ヤギ抗マウス
IgG（Jackson Immunochemicals）とともに30分間インキュベートした。続いて筋
線維をPBSですすぎ洗いし、スライドグラスに載せた。免疫蛍光染色をバイオラ
ッド（BioRad）MRC 600共焦点表面蛍光（epifluorescence）顕微鏡を用いて観察
した。共焦点画像をNIHイメージ（NIH Image）バージョン1.60を用いてレンダリ
ングし、アドビフォトショップ（Adobe Photoshop）バージョン4.0（Adobe Syst
ems Inc.）で着色した。二次抗体のみとの、および偽感染細胞とのインキュベー
ションを含む標準対照実験を行った。固定および抗体インキュベーションはすべ
て室温で行った。

【００６８】インビトロ処理アッセイ法デキストラン硫酸による刺激、IV型コラゲナーゼ、コンドロイチンABCリアー
ゼおよびヘパリチナーゼに関するアッセイ法は、24穴培養皿に平板培養した成体
筋線維に対して行った。感染させる前に、筋線維をさまざまな濃度のデキストラ
ン硫酸、IV型コラゲナーゼ、コンドロイチンABCリアーゼまたはヘパリチナーゼ
を含むDMEM中で30分間前処理した。37℃で一晩の吸着期間（約18時間）をおいた
後に接種物を回収した。続いて筋線維を1.25％グルタルアルデヒド中で15分間固
定し、2％X-gal基質により37℃で4時間染色した。別に特記しない限り、すべて
のインビトロ試験に関して、1つの処理群につき少なくとも40個の筋線維を検討
した。PEG誘発性の融合は、以前に記載された通りに行った（Meyerら、J. Gen.
Virol. 79（8）：1983〜1987、1998）。

【００６９】グリコサミノグリカンの分析グリコサミノグリカンの生化学的標識は、以前に記載された手順の変法によっ
て行った（Bameら、J. Biol. Chem. 264：8059〜8065、1989）。簡潔に述べると
、10μM硫酸塩を含むように改変したDMEM／10％FBS／10％ウマ血清中で、細胞を
［^３５S］硫酸塩（無担体、約43Ci／mg、ICN）とともに24時間インキュベートす
ることによってグリコサミノグリカンの放射性標識を行った。細胞を冷PBSで3回
洗い、室温の0.1N NaOH 1ml中に15分間おいて溶解させた。試料を蛋白質測定の
ために回収した。濃酢酸の添加によって抽出物をpH 5.5に調整し、サケ軟骨コン
ドロイチン硫酸（2mg／ml）を担体として含む0.32M NaCl、40mM酢酸ナトリウム
、pH 5.5中でプロテアーゼ（Sigma；2mg／ml）により40℃で12時間処理した。い
くつかの実験については、放射性物質の一部を、10mUのコンドロイチンABCリア
ーゼ（Sigma）または0.5Uのヘパリチナーゼ（Sigma）とともに40℃で12時間処理
した。50mM NaCl中で結合させた後に1M NaClで溶出させるDEAE-セファセル（Sep
hacel）（Pharmacia）上でのクロマトグラフィーによって放射性産物を定量した
。高速液体クロマトグラフィー（HPLC）分析に関しては、エタノール沈殿によっ
てグリコサミノグリカン試料を脱塩した。遠心処理後にエタノール沈殿物を20mM
Tris（pH 7.4）中に懸濁させ、TSK DEAE-35Wカラム（15×75mm；Beckman instr
uments）を用いる陰イオン交換HPLCで分離した。プロテオグリカンは10mM KH_２P
O_４（pH 6.0）中に形成させた直線的な50〜700mM NaCl勾配を用いてカラムから
溶出させた。緩衝液にはすべて0.2％ツヴィッタージェント（Zwittergent）3〜1
2（Calbiochem）を含めた。ピーク中のグリコサミノグリカンは試料を関連する
酵素で消化した後にクロマトグラフィーを行うことによって同定した。

【００７０】側腹腫瘍モデルマウスにケタミン（70mg／kg）およびキシラジン（10mg／kg）で麻酔を施した
。26ゲージ針を用いて、CT-26細胞（5×10^４個の細胞を100μlのPBS中に再懸濁
した）を各マウスの右側腹に皮下注射した。細胞に腫瘍を形成させ、約100〜150
mm^３の大きさに増殖させた。続いて所定の治療による注射を開始した。腫瘍体積
は通常、週2回測定した。マウスは腫瘍体積が1500mm^３に到達した時点で屠殺し
た。

【００７１】転移性癌モデル転移性癌モデルはラフレニーレ（Lafreniere）およびローゼンバーグ（Rosenb
erg）（J. Natl. Cancer Inst. 76（2）：309〜22、1986）に記載されている。

【００７２】組換えHSVベクターの筋肉内投与麻酔下（ケタミン／ロンプン（Rhompun）腹腔内投与）にある成体および新生
児マウスの前脛骨筋（TA）に、ハミルトンシリンジを用いて約2.0mmの深さに皮
下注射を行った。処理溶液とウイルス接種物の同時投与を行うインビボアッセイ
法に関しては、デキストラン硫酸、IV型コラゲナーゼまたはコンドロイチンABC
リアーゼをG207とともに適切な濃度（インビトロ試験によって同定されたとおり
）に希釈し、注射容量を50μl（成体マウスの場合）または25μl（新生マウスの
場合）とした。対照筋肉にはG207のみを注射した。感染3日後に筋肉を切片化お
よび組織分析のために採取し、筋線維の感染を評価した。いずれの手順について
も、最低4匹のマウスに同一の処理を行い、これを1つの実験群とした。

【００７３】組換えHSVベクターの尾静脈投与所定の治療法による尾静脈投与は当技術分野で一般に知られた手法を用いて行
った。

【００７４】組織切片の作製注射した筋肉および対照筋肉、または腫瘍組織を急速凍結した。筋肉または腫
瘍組織を切片化し、組織全体にわたる連続的な横断切片を得た。横断切片（10μ
m）をクリオスタットで切り出し、X-galならびに／またはヘマトキシリンおよび
エオジンで染色した。切片を一定間隔（約120μm毎）に保時した。組織分析のた
めに、凍結切片をゼラチンコーティングがなされたスライドグラス上に集めた。

【００７５】組織分析凍結切片におけるβ-ガラクトシダーゼ発現細胞組織学的検出はX-galを用いて
行った。β-ガラクトシダーゼを高レベルに発現している細胞ではこの化合物か
ら青色の反応産物が生じる。スライドグラスを4％パラホルムアルデヒド、100mM
NaP、pH7.2中に5分間浸漬することによって切片をまず固定した。スライドをPB
Sで5分間ずつすすぎ洗いした。続いて切片を、5mM K_３Fe(CN)_６、5mM K_４Fe(CN) _６、2mM MgCl_２、PBS中にある1mg／mlの濃度のX-gal（Sigma）で12時間染色した
。水性マウント用溶媒（Promount）を用いてスライドグラスをマウントし、β-
ガラクトシダーゼで標識された（「青色」）筋線維の存在を顕微鏡下で観察した
。青色繊維の数が最大であり、注入部位で一定であった切片から筋肉内のlacZ発
現線維の総数を決定した。

【００７６】または、標準免疫組織化学的な手順およびHSV抗原を認識する抗体を用いて、H
SVに感染した細胞を検出した。

【００７７】ウイルスのインビボでの生物学的利用能の決定 NV1020に感染させたマウスから採取した血液からの血清を培養細胞に加えた。
ウイルスが細胞を感染させることができる期間を上記の通りに決定した。

【００７８】本明細書で言及した刊行物はすべて、その全体が参照として本明細書に組み入
れられる。

【図面の簡単な説明】

【図１】成熟筋線維の感染核を示すHSV ICP4免疫蛍光の写真である。G207
に感染した単離筋線維を、マウス抗ICP4抗体を用いて間接的免疫蛍光のために処
理した。（a）G207のみ、成熟筋線維；（b）G207のみ、未成熟筋線維；（c）G20
7のみ；（d）G207＋0.33 mg/ml IV型コラゲナーゼ；（e）G207＋３μg/mlデキス
トラン硫酸；（f）G207＋10 μg/mlデキストラン硫酸；（g）G207＋２ U/mlコン
ドロイチンABCリアーゼ；（h）G207＋４ U/mlコンドロイチンABCリアーゼ。倍率
は：a、b、c、e〜gは20倍；hは40倍；dは60倍であった。画像は、共焦点顕微鏡
によって得た：c-g。

【図２】異なる年齢群に属する筋線維に由来する細胞会合グリコサミノグ
リカンの陰イオン交換HPLCを示すグラフである。筋線維を[³⁵S]硫酸塩で24時間
標識した。培地を除去して、単層を十分に洗浄して、いかなる微量の培地も細胞
から除去した。グリコサミノグリカンを単離して、HPLCによって分画した。HS、
ヘパラン硫酸の溶出位置；CS、コンドロイチン硫酸の溶出位置。白い菱形、８週
令マウスから単離した筋線維；黒い菱形、２ヶ月令のマウスから単離した筋線維
。破線は、溶出に用いた塩勾配を表す。

【図３】 G207を未成熟骨格筋にインビボ注入した結果を示す写真である。
HSVの注入３日後に採取して、β-ガラクトシダーゼに関して組織化学的に染色し
た未成熟マウスTA筋肉の凍結切片。遺伝子移入は、G207（１×10⁶プラーク形成
単位（pfu））の容量50 μlの筋肉内注射によって実施した。（a）＆（b）G207
のみ。倍率：1は10倍、bは40倍。

【図４】成熟骨格筋のG207感染を示す写真である。成体マウスの骨格筋へ
のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子移入。G207（１×10⁶ pfu）および提案された治療
を２ヶ月令のbalb/cマウスの前脛骨に総注射量50 μlで同時注射した。凍結切片
を切断してβ-ガラクトシダーゼ活性に関して染色した。（a）＆（b）G207のみ
；（c）＆（d）G207＋0.33 mg/ml IV型コラゲナーゼ；（e）＆（f）G207＋10 （
g/mlデキストラン硫酸；（g）＆（h）G207＋２U/mlコンドロイチンABCリアーゼ
。倍率：a、b、e、gは20倍；b、d、f、hは40倍。

【図５】全身輸送後にHSVが腫瘍組織に達したことを示す一組の写真であ
る。HSVは尾静脈からマウスに投与して、遠位側腹腫瘍に達し（左側のパネル）
、または門脈から限局的に投与して肝腫瘍に達した（右側のパネル）。HSVに感
染した細胞を検出するために腫瘍組織をβ-ガラクトシダーゼに関して染色した
。

【図６】マウスにおける標識HSVの注射を示す略図（右のパネル）と、側
腹の腫瘍を有するマウスの様々な組織にウイルス粒子を輸送したグラフ。マウス
に³⁵S-メチオニン標識NV1020１×10⁷ pfuを注射した。２時間後、動物を屠殺し
て、その組織をウイルス粒子の有無に関して測定した。

【図７】 CT-26肝転移癌モデルにおけるマウスの生存に及ぼすNV1020（HSV
）の全身輸送の影響を示すグラフである。肝腫瘍小結節を有するマウスに、NV10
20またはPBS（対照）１×10⁷ pfuを全身輸送した。生存マウスの割合を経時的に
測定した。

【図８】 CT-26側腹腫瘍モデルにおける抗腫瘍効果に及ぼすNV1020またはN
V1020プラスF1（デキストラン硫酸）の腫瘍内または全身輸送の影響を示すグラ
フである。側腹の腫瘍を有するマウスにNV1020を腫瘍内（IT）または尾静脈から
全身（IV；F1（デキストラン硫酸）と共に、もしくはF1を含まない）投与した。
腫瘍の増殖速度を評価した。

【図９】抗腫瘍効果に及ぼすデキストラン硫酸（DexS）用量の影響を示す
グラフである。側腹の腫瘍を有するマウスにNV1020を１×10⁷ pfu、NV1020１×1
0⁷ pfu＋デキストラン硫酸10 μg/ml、NV1020１×10⁷ pfu＋デキストラン硫酸10
0 μg/ml、NV1020１×10⁷ pfu＋デキストラン硫酸500 μg/ml、またはPBS＋デキ
ストラン硫酸100 μg/ml（対照）を、０日目、２日目、および４日目に投与した
。次に腫瘍の増殖速度を評価した。

【図１０】 CT-26側腹腫瘍モデルにおける抗腫瘍効果に及ぼす複数回HSV＋
デキストラン硫酸（DexS）投与の影響を示すグラフである。側腹腫瘍を有するマ
ウスに、NV1020 ３×10⁷ pfu１用量、NV1020３×10⁷ pfu１用量＋デキストラン
硫酸100 μg/ml、NV1020１×10⁷ pfu３用量＋デキストラン硫酸100 μg/ml、ま
たはPBS（対照）を投与した。腫瘍の増殖速度を評価した。

【図１１】 CT-26側腹腫瘍モデルにおけるマウスの生存に及ぼす複数回NV1
020＋デキストラン硫酸（DexS）投与の影響を示すグラフである。側腹腫瘍を有
するマウスにNV1020 ３×10⁷ pfu１用量、NV1020３×10⁷ pfu１用量＋デキスト
ラン硫酸100 μg/ml、NV1020１×10⁷ pfu３用量＋デキストラン硫酸100 μg/ml
、またはPBS（対照）を投与した。マウスの生存を経時的に測定した。

【図１２】 CT-26肝転移モデルにおける抗腫瘍効果に及ぼすデキストラン
硫酸（DexS）の影響を示すグラフである。転移腫瘍を有するマウスに、NV1020１
×10⁷ pfu、NV1020１×10⁷ pfu＋デキストラン硫酸（100 μg/ml）、PBSのみ（
対照）、またはPBS＋デキストラン硫酸（100 μg/ml）（対照）を投与した。腫
瘍の小結節数を13日後に評価した。

【図１３】 CT-26側腹腫瘍モデルにおける抗腫瘍効果に及ぼすデキストラ
ンとアシクロビルの影響を示すグラフである。側腹腫瘍を有するマウスにNV1020
１×10⁷ pfu１用量、NV1020１×10⁷ pfu＋デキストラン硫酸（F1；100 μg/ml）
、NV1020＋デキストランのみ（F2）、NV1020１×10⁷ pfu＋デキストラン硫酸お
よびアシクロビル（F3；２ mg/ml）、またはPBS＋デキストラン硫酸（100 μg/m
l）（対照）を０日目、２日目、および４日目に投与した。腫瘍の増殖速度を評
価した。

【図１４】抗腫瘍効果に及ぼすG207＋デキストラン硫酸（DexS）の影響を
示すグラフである。側腹腫瘍を有するマウスにNV1020１×10⁷ pfu１用量、G207
１×10⁷ pfu、G207１×10⁷ pfu＋デキストラン硫酸（100 μg/ml）、またはPBS
（対照）を、０日目、２日目、および４日目に投与した。腫瘍の増殖速度を測定
した。

【図１５】 CT-26形態およびインビトロ細胞増殖に及ぼすデキストラン硫
酸（DexS）の影響を示す一組の写真である。化合物なし（パネルA）、またはデ
キストラン硫酸（100 μg/ml；パネルB）を培養CT-26細胞に加えた。48時間後、
細胞数および形態学を調べた。

【図１６】培養CT-26の増殖に及ぼすデキストラン硫酸（DexS）およびア
シクロビル（ACV）の影響を示すグラフである。インビトロで培養CT-26細胞にデ
キストラン硫酸（100 μg/ml）、アシクロビル（２ mg/ml）、デキストラン硫酸
およびアシクロビルの双方を投与したか、または無処置のままとした。細胞の増
殖を経時的に測定した。

【図１７】側腹腫瘍の末梢での退縮に及ぼすデキストラン硫酸の影響を示
す一組の写真である。マウスにNV1020１×10⁷ pfu（パネルA）またはNV1020１×
10⁷ pfu＋デキストラン硫酸（F1）（パネルB）を投与した。次に、腫瘍を摘出し
て、組織化学分析用に調製して、腫瘍の壊死を評価した。

【図１８】インビボでのウイルスの生物学的利用率に及ぼすデキストラン
硫酸（DexS）の影響を示すグラフである。NV1020１×10⁷ pfuまたはNV1020１×1
0⁷ pfu＋デキストラン硫酸をマウスの尾静脈から投与した。次に、マウスの群を
様々な時点で屠殺した。血液試料を採取して、感染ウイルスに関して血清を分析
した。

【図１９】様々な組織におけるNV1020のインビボ分布に及ぼすデキストラ
ン硫酸（DexS）の影響を示すグラフである。放射活性標識（³⁵S）NV1020１×10⁷ pfuまたは放射活性標識（³⁵S）NV1020１×10⁷ pfu＋デキストラン硫酸（100 μ
g/ml）を、側腹腫瘍を有するマウスの尾静脈から投与した。２または12時間後、
動物を屠殺して、様々な臓器を摘出してホモジナイズし、（³⁵S）NV1020の分布
を評価した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 38/22 Ａ６１Ｐ 21/00 ４Ｃ０８７ 38/43 35/00 39/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 48/00 Ａ６１Ｋ 37/02 Ａ６１Ｐ 21/00 37/24 35/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/48 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ユンソニアカナダ国ブリティッシュコロンビアバンクーバーウエスト第40 アベニュー 1537 (72)発明者ホースバーグブライアンカナダ国ブリティッシュコロンビアバンクーバーマナトバストリート 2620 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 BA01 BA07 BA21 BA31 BA80 CA02 CA20 DA02 DA03 EA02 EA04 FA01 GA11 GA30 HA17 4B065 AA91X AA93X AA93Y AB01 AC14 BA02 BA14 BA30 BD50 CA24 CA27 CA44 4C084 AA02 AA13 AA14 BA23 BA35 BA44 DB01 DB52 DC01 DC50 MA02 NA10 NA13 NA14 ZA942 ZB262 4C085 AA03 BA07 BA51 BA65 BA69 BA77 BA78 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB26 4C087 AA01 AA02 BC76 BC83 CA09 MA02 MA66 NA01 NA13 NA14 ZA94 ZB26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】細胞をベクターに接触させる段階、ならびに該細胞を該ベク
ターに接触させる前、間、または後に、培地中で荷電を有し、非細胞障害性で、
細胞によるベクターの取り込みを促進することができる化合物を含む液体培地に
該細胞を接触させる段階を含む、生きている細胞に核酸ベクターを導入する方法
。
【請求項２】細胞が哺乳類である、請求項１記載の方法。
【請求項３】哺乳類がヒト患者である、請求項３記載の方法。
【請求項４】ベクターがポリペプチド、ホルモン、ワクチン抗原、アンチ
センス分子、またはリボザイムをコードする遺伝子を含む、請求項１記載の方法
。
【請求項５】ポリペプチドが増殖因子、酵素、抗血管新生ポリペプチド、
および細胞死を促進するポリペプチドからなる群より選択される、請求項４記載
の方法。
【請求項６】ベクターがウイルスに基づくベクターである、請求項１記載
の方法。
【請求項７】ベクターがヘルペスウイルス、デング熱ウイルス、アデノ随
伴ウイルス、アデノウイルス、乳頭腫ウイルス、およびレトロウイルスに基づく
ベクターからなる群より選択される、請求項６記載の方法。
【請求項８】ベクターが、HSV-1、HSV-2、VZV、CMV、EBV、HHV-6、HHV-7
、およびHHV-8からなる群より選択される、請求項７記載の方法。
【請求項９】ベクターがレンチウイルスに基づくベクターである、請求項
７記載の方法。
【請求項１０】ベクターがHIVに基づくベクターである、請求項９記載の
方法。
【請求項１１】ベクターが細菌ベクターである、請求項１記載の方法。
【請求項１２】ベクターがリステリア菌（Listeria monocytogenes）に基
づくベクターである、請求項11記載の方法。
【請求項１３】ベクターが弱毒化されている、請求項１記載の方法。
【請求項１４】荷電分子が、荷電多糖類、ポリリジン、アシクロデキスト
リン、ジエチルアミノエタン、およびポリエチレングリコールからなる群より選
択される、請求項１記載の方法。
【請求項１５】荷電多糖類がグリコサミノグリカンである、請求項14記載
の方法。
【請求項１６】荷電多糖類がグリコサミノグリカン類似体である、請求項
14記載の方法。
【請求項１７】グリコサミノグリカンがデルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、
コンドロイチン硫酸、およびケラチン硫酸からなる群より選択される、請求項15
記載の方法。
【請求項１８】グリコサミノグリカン類似体がデキストラン硫酸である、
請求項16記載の方法。
【請求項１９】荷電分子が、ベクターを細胞に投与する前に該細胞に投与
される、請求項１記載の方法。
【請求項２０】荷電分子が、ベクターの細胞への投与と同時に該細胞に投
与される、請求項１記載の方法。
【請求項２１】細胞が成熟筋細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項２２】細胞が癌細胞である、請求項３記載の方法。
【請求項２３】患者が癌を有する、請求項22記載の方法。
【請求項２４】筋肉細胞が原発性ミオパシー患者に存在する、請求項21記
載の方法。
【請求項２５】患者が被験者の循環中に分泌される治療産物の産生によっ
て治療されうる病態を有する、請求項３記載の方法。
【請求項２６】ベクターおよび荷電分子が局所輸送される、請求項３記載
の方法。
【請求項２７】ベクターおよび荷電分子が全身輸送される、請求項３記載
の方法。