JP2002112794A - ｉｎｖｉｖｏ遺伝子治療のための方法及び組成物 - Google Patents

ｉｎｖｉｖｏ遺伝子治療のための方法及び組成物

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 全身性投与後に２以上の組織へ遺伝子型及
び表現型を改変することが可能な遺伝子の導入のため
に、新規な方法及び組成物を提供する。 【解決手段】 本発明は、裸のＤＮＡとして又は、脂質
キャリア特に陽イオン性脂質キャリアと会合した発現ベ
クターの方法で、上記遺伝子を哺乳類宿主へ導入する。
多重の別個な組織を、裸のＤＮＡでトランスフェクトす
ることができる。ＤＮＡ：脂質キャリア複合体を用い
て、多重組織及び細胞型をトランスフェクトすることが
できる。この技術及び組成物は、種々の遺伝子関連疾患
全ての緩和又は治療に使用される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、in vivo で哺乳
類、特にヒトの細胞への外因性遺伝物質の全身性導入の
ための方法及び組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】異常な発現が生命を脅かすヒトの疾患に
関連する遺伝子のかなり長い配列がクローン化され同定
されている。このようなクローン化遺伝子のヒトにおけ
る発現能は、多くの重要なヒトの疾患の予防及び／又は
治療を最終的には可能にするであろう。このような疾患
は、今、現在有効な治療法によってごくわずかに治療さ
れるか又は治療不可能にある。例えば、ヒトの患者にお
けるコレステロール調節遺伝子、ＨＩＶの複製を選択的
に遮断する遺伝子又は腫瘍抑制遺伝子のin vivo発現
は、各々心臓疾患、ＨＩＶ及び癌の治療を劇的に改良す
る。しかし、現在有効な遺伝子送達(delivery)戦略は、
哺乳宿主への全身性投与の後で、広範囲の組織における
in vivo での高レベルの又は広汎性の注入遺伝子(trans
gene) 発現をもたらことはできていない。この不可能性
は、殆どのヒトの疾患のための有効な遺伝子治療の開発
を妨げている。
【０００３】遺伝子治療の手法には、異なる到達点とこ
れらの到達点に達するための異なる方法が共に含まれ
る。この到達点には、一般的に、遺伝子置換、遺伝子修
正及び遺伝子増大が含まれる。遺伝子置換では、変異遺
伝子配列が、特異的にゲノムから取り出され、正常な機
能的遺伝子と置換される。遺伝子修正では、変異遺伝子
配列が、標的ゲノムにおいて更に変化することなく修正
される。遺伝子増大では、欠陥細胞中の変異遺伝子の発
現が、外来正常遺伝子配列を導入することによって改変
される。
【０００４】他のよって用いられる上記到達点に達する
ための方法には、標的細胞の “体外性(ex vivo)"トラ
ンスフェクションと、その後の宿主哺乳類における好適
器官へのトランスフォームされた細胞の導入が含まれ
る。Ex vivo 技術には、裸のＤＮＡ又はＤＮＡリポソー
ム結合体による in vitro での細胞のトランスフェクシ
ョンと、その後の宿主器官への導入（“ex vivo”遺伝
子治療）が含まれる。好適標的器官又は組織の基準に
は、容易にアクセス可能であり、 in vitro で操作する
ことができ、遺伝的改変方法が行いやすい標的器官及び
組織であること並びに、理想的には、非複製細胞又はサ
イクリング（細胞周期をまわっている）幹細胞を含み遺
伝子修正を永続化できることが含まれる。更に、遺伝的
に改変された細胞を、機能的及び安定な形態で生物へ再
移植可能なことも必要である。この基準に適合する標的
器官の例は、哺乳類の骨髄細胞である。 ex vivo遺伝子
治療の更なる基準には、レトロウィルスベクターを用い
る場合、細胞が有糸分裂前であることである；有糸分裂
後の細胞は、レトロウィルスベクターによる感染に無反
応性である。これは報告されていないが、例えば、修正
遺伝子産物が所望の効果で／標的細胞に、血液又は他の
体液において循環して分泌され影響を及ぼすならば、ex
vivo遺伝子治療を用いて標的器官又は組織以外からの
細胞をトランスフェクト可能となり得る。
【０００５】ex vivo 治療には幾つかの欠点がある。例
えば、分化し、複製中の細胞のみが感染すると、新たに
導入された遺伝子機能は、その細胞が成熟して死滅すれ
ば失われてしまう。ex vivo 的手段は、また限られた数
の細胞のトランスフェクションにしか利用できず、生体
から最初に取り出されたものでない細胞をトランスフェ
クトするためには利用できない。上記の方法は、一般的
に細胞ゲノムへ新たな遺伝物質を組み込むことに関連し
ており、従って、永久的な変化を達成する。
【０００６】リポソームは、特に薬物、放射性治療剤、
酵素、ウィルス、転写因子及び他の細胞性エフェクター
を種々の培養細胞株及び動物へ導入することに、効率的
に用いられている。導入させるための試薬は、普通、リ
ポソーム、または脂質小胞中に捕獲されているか、該試
薬を該小胞の外側に結合させ得る。リポソーム仲介薬物
送達の効率を試験するための首尾よい臨床実験が完成し
ている。いくつかの戦略が、特定の組織及び特定の細胞
型にリポソームを向けることによって、リポソーム仲介
薬物送達の効率を上げることを提案している。しかし、
リポソーム仲介ベクターの使用のための基本的な方法論
が十分に開発されている一方で、この技術がin vivo 遺
伝子治療におけるリポソーム主体トランスフェクション
ベクターについては完成していない。
【０００７】注入遺伝子の ex vivo発現は、他によって
報告されているように、注入遺伝子の特定組織への直接
的な注入、例えば裸のＤＮＡ又はＤＮＡ−陽イオン性リ
ポソーム複合体の直接的な気管内、筋肉内若しくは動脈
内注入に、又は宿主細胞のexvivo トランスフェクショ
ン及びその後の再注入に拘束されていた。該発現は低
く、一般に、ひとつの組織に制限され、普通は注入され
た組織（例えば筋肉）か；静脈注入が用いられた場合の
肝臓若しくは肺か；気管内注入が用いられた場合の肺か
に限定され、これらの組織内の全細胞の１％未満がトラ
ンスフェクトされた。ある場合には、細胞のトランスフ
ェクションは、静脈投与の部位に輸入性の組織において
もたらされる。
【０００８】現在有効な遺伝子送達の戦略は、in vivo
での高レベル及び／又は広汎性の注入遺伝子発現をもた
らすことに、一様に失敗している。従って、多くのヒト
疾患のin vivo 治療、予防又は軽減のために、注入遺伝
子の高レベルの転写及び／又は種々の細胞及び組織タイ
プでの発現のためのin vivo 遺伝子治療の組成物及び送
達方法を開発することが興味の対象となっている。遺伝
子治療の他の方法としての遺伝子改変の使用もまた、興
味の対象となっている。遺伝子改変では、既に発現され
た遺伝子の発現を、外因性正常遺伝子配列を導入するこ
とによって増大させ、アンチセンス遺伝子若しくは遺伝
子断片（フラグメント）を導入することによって、又は
特定ｍＲＮＡを開裂できるリボザイムをもたらすことが
できるベクターを導入することによって減少させる。遺
伝子改変は、遺伝子発現を範囲を改変し、又は遺伝子産
物のプロセッシング、構築若しくは分泌に影響するタン
パク質をコードする外因性正常遺伝子配列を導入するこ
とによって達成することもできる。
【０００９】多数の刊行物が哺乳類のin vivo 及び ex
vivoトランスフェクションに関連している。あるもの
は、注入遺伝子の転写が達成できたことのみであり、他
のものは、低レベルの発現及び／又は限定数の組織若し
くは細胞タイプでの発現のみを示したデータを提示して
いる。以下のものは、この領域の刊行物の例である。
【００１０】機能的な新規遺伝物質の細胞への導入のた
めの種々の手段が、 in vitro 及びin vivo の両方で試
みられた (フリードマン(Friedmann),(1989) Science,2
44:1275-1280)。これらの手段には、改変レトロウィル
スへの発現すべき遺伝子の組み込み（フリードマン,(19
89) 前出）；ローゼンバーグ(Rosenberg)(1991) Cancer
Research 51(18)、追補：5074S-5079S)；非レトロウィ
ルスベクターへの組み込み (ローゼンフェルド(Rosenfe
ld)ら、(1992) Cell,68:143-155；ローゼンフェルド
ら、(1991) Science,252: 431-434)；又は、リポソーム
を介した異種プロモーター−エンハンサー要素に連結さ
れた注入遺伝子の送達（フリードマン、(1989)、前出；
ブリガムら、(1989) Am.J.Med.Sci.,298:278-281；ナー
ベル(Nabel)ら、(1990) Science,249:1285-1288；ハジ
ンスキ(Hazinski)ら、(1991) Am.J.Resp.Cell Molec.Bi
ol.,4:206-209；ワンとホァン(Huang)、(1987)、Proc.N
atl.Acad.Sci.,USA.,84:7815-7855)；リガンド特異性、
陽イオン主体輸送システムとの結合（ウー(Wu)及びウ
ー、(1988) J.Biol.Chem.,263:14621-14624)又は裸のＤ
ＮＡ発現ベクターの使用（ナーベルら、(1990)、前
出)；ウォルフ(Wolff)ら、(1990) Science,247:1465-14
68)が含まれる。注入遺伝子の組織への直接的な注入
は、局所的な発現のみをもたらす（ローゼンフェルド、
(1992)前出) ；ローゼンフェルドら、(1991), 前出；ブ
リガムら(1989)、前出；ナーベル、(1990)、前出；及び
ハジンスキら、(1991)、前出) 。ブリガムらのグループ
(Am.J.Med.Sci.(1989)298:278-281及びClinical Resear
ch (1991)39（抄録))は、ＤＮＡリポソーム複合物の静
脈内又は気管内投与後でのマウスの肺のin vivo トラン
スフェクションのみを報告している。ヒト遺伝子治療手
法の総説記事の例には：アンダーソン(Anderson)、Scie
nce (1992) 256:808-813がある。
【００１１】ＰＣＴ／ＵＳ90／01515(フェルナー(Felgn
er)ら) は、in vivo での脊椎動物の細胞の内部への医
薬的又は免疫原的ポリペプチドをコードする遺伝子の送
達方法に向けられている。注入遺伝子の発現は、注入組
織に限定されている。ＰＣＴ／ＵＳ90／05993(ブリガ
ム) は、発現コンストラクト（構築物）の静脈内又は気
管内注入の後の哺乳類の肺細胞における注入遺伝子の発
現を得る方法に向けられている。ＰＣＴ89／02469 及び
ＰＣＴ90／06997 は、ex vivo 遺伝子治療に向けられ、
これは、体内から取り出すことができる細胞例えばリン
パ球における注入遺伝子の発現に限定されている。ＰＣ
Ｔ89／12109 は、同様にex vivo 遺伝子治療に向けられ
ている。ＰＣＴ90／12878 は、トランスフォームされた
細胞株と、ex vivo トランスフェクションを用いたトラ
ンスジェニックマウスとの両方における高レベルな発現
を提供する。ＰＣＴ／ＵＳ92／08806 は、哺乳類の非接
触細胞の粒子仲介トランスフォーメーションに向けられ
ている。ＥＰ出願91301819.8は、組み換え技術を用いて
嚢胞性繊維症膜貫通型コンダクタンス調節物質（ＣＦＴ
Ｒ）を生成することに向けられている。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＤＮＡ発現
カセット（発現ベクター）で哺乳類中の細胞をトランス
フォームする方法と哺乳類細胞をトランスフォーメーシ
ョンするリポソームを提供することを目的とする。この
方法では、哺乳類へ発現カセットを導入することを含
む。この方法において、ＤＮＡ発現カセットは、プロモ
ータ及びポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含み、
前記ＤＮＡ発現カセットは、陽イオン脂質対非陽イオン
脂質を含む脂質キャリアと複合化しており、ここで、陽
イオン脂質対非陽イオン脂質のモル比は５％と１００％
の間であり、これにより約１００ｎｍと約１０μｍの間
の平均直径を有するＤＮＡ発現カセット−脂質キャリア
複合体となる。また、in vivo で哺乳類中の細胞の最適
なトランスフォーメーションを提供するＤＮＡ対脂質キ
ャリアの比を決定する方法の提供を目的とする。この方
法では、第１のＤＮＡ：脂質キャリアを有する第１のＤ
ＮＡ：脂質キャリア複合体と、第２のＤＮＡ：脂質キャ
リアを有する第２のＤＮＡ：脂質キャリア複合体とを各
々、第１の哺乳類及び第２の哺乳類に対して全身的に導
入する工程、ＤＮＡでトランスフォームされた細胞型の
パーセンテージを各々測定する工程、測定されたパーセ
ンテージを比較する工程を含む。更に本発明は、ＤＮＡ
を用いて哺乳類中の細胞をトランスフォームする方法の
提供を目的とする。この方法では、水溶液中のＤＮＡを
哺乳類へ全身的に投与することを含む。
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明によって、調製方法及び用
途と共に核酸コンストラクトがもたらされ、これは、該
核酸によって接触された組織及び細胞のトランスフェク
ションが起きるために十分な投与量で哺乳類宿主へコン
ストラクトを導入した後、該宿主の複数の組織において
細胞の表現型のin vivo 変化及び／又は改変をもたら
す。トランスフェクションベクターの成分は、一般に、
転写の方向で連結された操作可能な成分として、転写開
始領域、対象となるＤＮＡ配列及び転写集結領域を含
み、転写調節領域は、トランスフェクションの標的とさ
れる宿主の哺乳類中で機能する。任意には、イントロン
を、該コンストラクトに好ましくはコード化配列の５’
末端に含み得る。一般に、該コンストラクトは、宿主細
胞ゲノム中へ組み込まれるようにならず、主として染色
体外に又はエピソーム形態で維持される非組み込みプラ
スミドの一部として該宿主へ導入される。該コンストラ
クトは、裸の核酸にも脂質キャリアと会合した核酸にも
することができる。十分な投与量とは、所望の効果、例
えば動物又はヒトの疾患の予防、緩和及び／又は治療、
又は対象となる薬物の内因性レベルの改変をもたらし得
ることを意味する (“in vivo"遺伝子治療）。この改変
は広汎性であり得、即ち、多数の細胞型若しくは組織に
おいて得られ、又は、この改変は選択的に、例えば選択
された細胞若しくは組織型にのみにおいて及び／又はそ
こに誘導可能にし得る。
【００１４】宿主への該核酸コンストラクトの導入部位
にのみ又はこれに対して輸入性部分以外の複数の組織及
び細胞のトランスフェクションが得られ、発現が高レベ
ルで多数の細胞及び細胞型において起こる。トランスフ
ォームされ得る組織には、正常な動物の肺、心臓、肝
臓、骨髄、脾臓、リンパ節、腎臓、胸腺、骨格筋、卵
巣、子宮、胃、小腸、大腸、膵臓及び脳と、腫瘍発生哺
乳類の転移性腫瘍及び脈管内腫瘍塞栓とが含まれる。ト
ランスフェクトされる特定細胞には、マクロファージ、
肺胞Ｉ型及びII型細胞、肝細胞、気道上皮細胞、血管内
皮細胞、心臓筋細胞、骨髄芽球、赤芽球、Ｂリンパ球及
びＴリンパ球が含まれる。投与の経路は、普通は、循環
性体液例えば血液、脳脊髄液中であるが、投与の他の経
路も用いることができる。該コンストラクトは、裸の核
酸にも脂質キャリアと会合している核酸にもすることが
できる。任意には、脂質キャリア分子及び／又はコンス
トラクトは、特定細胞型の標的化及び／又はそこに発現
をもたらし得る。
【００１５】核酸コンストラクトを、合成、天然的に誘
導又はこれらの組み合わせである核酸配列から調製する
ことができる。この配列を、意図されているレシピエン
ト宿主と相同なドナー宿主から得ることができ、又は該
核酸配列の性質に基づいて、宿主の好ましいコドンを有
する配列を合成することもできる。宿主の好ましいコド
ンは、対象となる特定宿主に大量に発現されているタン
パク質に高頻度なコドンから決定され得る。クローニン
グが細菌宿主系において成されている場合には、コドン
選択を変えてこの細菌性宿主系における安定性を促進す
ることが有益である。意図される用途が、感染生物によ
る疾患を治療することである場合には、配列の適当な供
給源は、ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかのウィルス性の核
酸とし得る。
【００１６】遺伝子は高分子量であり、ポリカチオンで
あるので、キャリア仲介送達は、通常、培養においても
in vivo においても、細胞のＤＮＡトランスフェクショ
ンに必ずしも必要でない。陽イオン性脂質キャリア例え
ばリポソームを用いて、転写調節タンパク質を送達する
ことができる。更に、リポソームそれ自身は、（ウィル
スベクターと異なり）in vivo で非免疫原のようであ
る。リポソーム配合物には、陽イオン性脂質を有するも
のが包含され、ヒト患者において安全であり、よく寛容
化されることが示されている（トリート(Treat) ら、(1
990) J.Natl.Cancer Instit. 82:1706-1710)。多様なト
ランスフェクション技術が、培養細胞における注入遺伝
子の高レベルの発現をもたらすことができるが、このよ
うな方法のごく僅かには、リポソームを用いたものも含
まれるが、これらはin vivo 遺伝子送達にも適用でき
る。陽イオン性リポソーム又は裸のＤＮＡのいずれかを
用いたin vivo トランスフェクションを得る既存の試み
は、１つの組織のトランスフェクション及び／又は外因
性ＤＮＡを導入した組織のみのトランスフェクションを
もたらしている。トランスフェクションのこのパターン
は、正常細胞性機構により取り込まれるＤＮＡ及び／又
はリポソームよりもむしろ、導入の組織中の細胞が、導
入方法によって傷つけられ、その後に導入される外因性
ＤＮＡのいくつかを取り込むことができる。
【００１７】出願人は、驚くべきことに、広範囲の組織
及び細胞型のトランスフェクションと、哺乳類宿主への
全身性投与後の高レベルの注入遺伝子の発現とを共にも
たらす変更を発見した。これらの変化には、ＤＮＡ：陽
イオン性脂質キャリア複合体の使用であって、ＤＮＡ対
脂質キャリアの陽イオン性脂質の比はin vivo 発現の獲
得にかなり作用できる；以前用いられているよりも多く
の量の複合体の使用；適当なプロモータ成分の使用例え
ば、強く且つ継続的な活性のもの例えばＨＣＭＶ−ＩＥ
１成分であり、これはin vivo で多くの細胞型において
増進された発現をもたらすために望ましい；並びに、注
入遺伝子のコード化領域の５’側の１００ｂｐ以上のイ
ントロンの置換又は、所望遺伝子産物の生成に利用され
る全てのイントロンの除去が含まれる。更に、驚くべき
ことに、肺、肝臓、脾臓、腎臓、リンパ節及び心臓を含
む多数の組織を、高投与量の裸のＤＮＡを循環性体液例
えば、血液又は脳脊髄液へ直接投与した後にトランスフ
ォームすることができることを発見した。或いは、選択
的な発現を、特定細胞及び組織型において所望に時期に
（即ち、発現は誘導性である）、成分特に用いたコンス
トラクトのプロモータ及び／又はエンハンサーを変更す
ることによって、又は、リポソームの標的部分を使用す
ることによって、得ることができる。
【００１８】殆どの遺伝子治療戦略は、レトロウィルス
性又はＤＮＡウィルスベクターへの注入遺伝子挿入に依
存している。レトロウィルスの潜在的欠点には、裸のＤ
ＮＡ又は陽イオン性脂質キャリアの使用に対して、レト
ロウィルスのin vivo (ex vivoとは逆に）注入遺伝子発
現の制限された仲介能；レトロウィルスベクターの非分
裂細胞に対するトランスフェクト無能性；感染性レトロ
ウィルスをもたらす複製欠陥レトロウィルスベクターに
おける組み換え現象の可能性；注入遺伝子の宿主細胞ゲ
ノムＤＮＡへのランダム挿入による癌遺伝子（オンコジ
ン）の活性化又は腫瘍抑制遺伝子の阻害可能性；サイズ
の制限、即ち、普通１５ｋｂ未満のＤＮＡをレトロウィ
ルスベクターにパッケージすることができる；並びに、
ベクターに対する宿主の免疫応答を誘発する潜在的な免
疫原性が含まれる。更に、すべての ex vivo手段は、ト
ランスフェクトされる細胞を体外へ取り出し、一定期間
培養系に維持することを必要とする。培養中では、細胞
は有害又は潜在的に危険な表現型的及び／又は遺伝子型
的変更を実行するかしれない。アデノウィルス及び他の
ＤＮＡウィルスベクターは、上記の潜在的制限の幾つか
を共有する。従って、アデノウィルス若しくは他のＤＮ
Ａウィルスベクターを使用しない本発明は、既存の技術
を越える幾つかの利点を有する。更に、本発明は、投与
の容易さと他の方法によって達成できない結果とを約束
する。
【００１９】本発明の用いられるコンストラクトには、
当該コンストラクトの用途に応じて幾つかの形がある。
従って、該コンストラクトには、ベクター、転写カセッ
ト、発現カセット及びプラスミドが含まれる。転写及び
翻訳開始領域（時として “プロモータ”とも呼ばれ
る）は、転写開始調節領域と翻訳されない５’側配列の
翻訳開始調節領域、リボソームへのｍＲＮＡの結合及び
翻訳開始に寄与する “リボソーム結合部位”が入って
いることが望ましい。開始制御領域の転写及び翻訳機能
要素は、同一の遺伝子から由来又はこれから入手可能で
あることが望ましい。ある具体例では、プロモーターは
エンハンサーなどの配列の追加、又は必須でない及び／
又は望ましくない配列の削除によって改変される。
“入手可能”とは、対象ＤＮＡの転写の所望な特異性を
提供するために、本来のプロモーターと十分類似してい
るＤＮＡ配列を有するプロモーターを意図している。こ
れには、天然配列と合成配列、更には合成配列と天然配
列の組合せによる配列が含まれる。
【００２０】転写開始領域、即ちプロモーター要素につ
いては、対象ＤＮＡ配列の所望のレベルの転写を与える
ことを条件に、どの領域を使われ得る。転写開始領域
は、宿主細胞に及び／又は転写されるべきＤＮＡ配列
に、本来のもの若しくは相同なもの、又は宿主細胞に固
有でない及び／又は転写されるべきＤＮＡ配列にとって
外来の若しくは異種のものとし得る。宿主細胞にとって
固有でないとは、転写開始領域を含むコンストラクトが
挿入されるべき宿主に、転写開始領域が正常では見つか
らないということを意味する。ＤＮＡ配列にとって外来
とは、対象ＤＮＡ配列に正常では伴わない転写開始領域
のことを意味する。転写開始のための効率のよいプロモ
ーター要素には、ＳＶ４０（シミアンウィルス４０）初
期プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウィルス）プロモ
ーター、アデノウィルスメジャー後期プロモーター、及
びヒトＣＭＶ（サイトメガロウィルス）前初期１プロモ
ーターが含まれる。
【００２１】誘導プロモーターも、転写のタイミングを
制御するのが望ましい本発明で有用である。このプロモ
ーターの例には、β−インターフェロン遺伝子、熱ショ
ック遺伝子、メタロチオネイン遺伝子由来或いはエクジ
ソンリセプターをコードするものなど昆虫の遺伝子を含
むステロイドホルモン反応性遺伝子由来のもの等が含ま
れる。このような誘導プロモーターは、インターフェロ
ン又はグルココルチコイドなど外部刺激を利用した注入
遺伝子の転写を調節するために用いることができる。真
核プロモーター要素の編成はかなり柔軟性があるので、
構成的要素と誘導要素との組合せを使用することもでき
る。２つ以上の誘導プロモーター要素の縦列配置では、
単一の誘導要素で達成できるベースライン上の誘導レベ
ルと比べた場合に、達せられる転写ベースライン上の誘
導レベルを上げ得る。
【００２２】一般に、転写調節配列は遺伝子の転写開始
の５’側に約１．５kbまでのＤＮＡを含むが、これより
はるかに小さくすることもできる。必要があれば、この
調節配列は、部位特異的突然変異誘発により（クンケル
(Kunkel)ＴＡ、1985、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.82,488
-492）、又は適当な制限部位がＮ末端コドン近くで見つ
かれば、連結反応（ライゲーション）によって都合のよ
いリンカーオリゴヌクレオチドを導入することにより、
希望するタンパク質の最初のコドンに対応する位置で修
飾され得る。理想的な具体例では、互換性のある制限部
位を持つコーディング配列が、遺伝子のコドン＃１に対
応する位置で連結され得る。この置換物は、元のコーデ
ィング配列に完全に置き換えるようにして挿入され得、
従って置換された配列は、その３’未端で遺伝子ターミ
ネーター及びポリアデニル化シグナルと隣接する。
【００２３】転写エンハンサー要素は、任意的には転写
又は発現カセットに含まれ得る。“転写エンハンサー要
素”とは、転写活性の基本的な調節因子であり、プロモ
ーター要素によって転写を増大するように作用でき、し
かも一般に転写活性を増強するためにプロモーターに対
して５’方向にしなくてもよいＤＮＡ配列を意図してい
る。特定のカセット中に使用されるプロモーター及びエ
ンハンサー要素の組合せは、特定作用を最大限発揮させ
る技術に精通している者によって選択することができ
る。様々なエンハンサー要素を、多様な組織や細胞型に
おける所望レベルの注入遺伝子の転写及び／又は発現を
実現するために用いることができる。例えば、ヒトＣＭ
Ｖ前初期プロモーター−エンハンサー要素を、in vivo
で様々な組織において高レベルの注入遺伝子の転写及び
発現をもたらすために用いることができる。
【００２４】多くの種からの多様な細胞型中で、連結さ
れた遺伝子に高レベルの転写をもたらす他のエンハンサ
ー要素の例には、ＳＶ４０及びＲＳＶ−ＬＴＲからのエ
ンハンサーが含まれる。ＳＶ４０及びＲＳＶ−ＬＴＲ
は、必須な構成成分である。これらは特異的作用を有す
る他のエンハンサーと組み合わせることもでき、特異的
エンハンサーを単独で使用することもできる。従って、
転写の特異的制御が所望されるときは、組織、発達段階
又は細胞特異性様式でのみ活性な有効エンハンサー要素
には、例えば免疫グロブリン、インターロイキン−２
（ＩＬ−２）及びβ−グロビンエンハンサーが含まれ
る。組織、発達段階又は細胞に特異的なエンハンサーを
使って、例えばＢリンパ球やＴリンパ球などの特定の細
胞型、或いはミエロイド若しくは赤血球前駆細胞中で注
入遺伝子の転写及び／又は発現をもたらすことができ
る。或いは、高レベルの転写と組織特異性注入遺伝子転
写との両方を得るために、ヒト嚢胞性線維症膜貫通型コ
ンダクタンス調節物質（ＣＦＴＲ）遺伝子に由来のもの
など組織特異性プロモーターを、きわめて活性が高く異
種のエンハンサー要素、例えばＳＶ４０エンハンサーに
融合することができる。更に、ＬＣＫのような組織特異
性プロモーターの利用は、注入遺伝子転写をＴリンパ球
に向けることを可能にする。注入遺伝子の組織特異性転
写は、標的組織以外の組織で注入遺伝子の転写が生じる
と有害な場合に、特に重要である。
【００２５】２つ以上のエンハンサー要素又はエンハン
サー要素の組合せの縦列（タンデム）反復は、単一のコ
ピーのエンハンサー要素の使用と比べて注入遺伝子の発
現を有意に増大し得る；それ故、エンハンサー要素は発
現カセットにおいて有用である。単一プロモーターに隣
接する若しくはその内部にある、同一又は異なる供給源
からの２つのエンハンサー要素の使用は、ある場合で
は、個々のエンハンサーが単独で効果を有する各組織中
での注入遺伝子発現をもたらすことができ、それによっ
て転写が達成される組織の数が増加する。他の場合で
は、２つの異なるエンハンサー要素の存在が、エンハン
サー効果の沈黙化（サイレンシング）を起こす。特別に
希望する発現の効果又は組織について、エンハンサー要
素の特定の組合せ方を評価することは、当該技術分野の
レベル内である。
【００２６】一般には転写及び／又は発現カセットにイ
ントロンを含める必要はないが、静脈内又は腹腔内投与
された注入遺伝子の高レベルで且つ広範囲のin vivo 転
写及び／又は発現を得るために十分な介在配列によって
離間された５’スプライス部位（供与接合部）及び３’
スプライス部位（受容接合部）を含むイントロンを、任
意的に含めることもできる。概して、約１００bpの介在
配列は、希望する発現パターン及び／又はレベルをもた
らすが、希望する結果を得るために、必要に応じて配列
の大きさを変えることができる。任意的なイントロンを
コーディング配列の５’側に置くと、注入遺伝子の高レ
ベルで且つ広範囲なin vivo 発現がもたらされるが、発
現を得るためには一般に必要ない。最適なのは、ｍＲＮ
Ａ配列が誤ってスプライスされる結果をもたらす潜在ス
プライス部位を５’イントロンが特異的に欠損している
ことである。
【００２７】これが用いられた場合、それぞれ５’から
３’に編成されたイントロン・スプライス供与部位とス
プライス受容部位が、転写開始部位と翻訳開始コドンの
間に配置される。或いは、介在配列は翻訳終結コドン及
び転写ターミネーターの３’側又はコーディング領域の
内に配置し得る。イントロンは、介在配列との混成イン
トロン又はゲノムコーディング配列から取ったイントロ
ンとすることができる。コーディング領域の３’側のイ
ントロン、１００bp未満のもの或いは潜在スプライス部
位を含む全てのイントロンは、一定の条件下でin vivo
でもたらされる注入遺伝子発現のレベルを実質的に低下
し得る。しかし、イントロンを欠くベクターを用いる
と、予期せずして、注入遺伝子の高レベルのin vivo 発
現を達成することができる。従って、in vivo トランス
フェクションでは、このようなベクターは特に関心がも
たれる。
【００２８】転写及び／又は翻訳開始調節領域の下流で
且つその制御下には、対象の核酸配列を挿入するための
多重クローニング部位があり、対象の核酸配列は、宿主
の表現型の１以上の変更をもたらし、例えば、後天性免
疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、嚢胞性繊維症、癌、心臓疾
患、自己免疫疾患及び多くの生命危機の感染に要求され
る治療を劇的に改良する。便宜上、多重クローニング部
位は、有効な方法で核酸配列の多様性のために使用でき
る。クローニング部位に挿入される核酸配列は、リボザ
イム配列をコードすることができ、又はポリペプチド例
えば、酵素活性を有するタンパク質をコードすることが
できるが、但し、コード化配列がペプチドをコードする
場合に、適当なｍＲＮＡ分子の生成を遮断し、及び／又
は異常なスプライス若しくは異常なｍＲＮＡ分子をもた
らしてしまう潜在スプライス部位を欠くべきである。ポ
リペプチドは、細胞内的に活性があるもの、膜通過型タ
ンパク質とすることができ、また分泌タンパク質とし得
る。変異タンパク質例えば、正常に分泌されるが、細胞
内的に作用するように変更されているものにもすること
ができる。核酸配列はＤＮＡにすることができる；ゲノ
ム配列に相補的な配列（ “アンチセンス配列”）とす
ることもでき、ここで、該ゲノム配列は１以上のオープ
ンリーディングフレーム、イントロン、非コード化リー
ダー配列又は相補的配列が転写、伝令ＲＮＡプロセッシ
ング例えばスプライシング若しくは翻訳を阻害し得る他
の配列とすることもできる。
【００２９】ＡＩＤＳの治療のために、抗ＴＡＴ、ＲＥ
Ｖ、ＴＡＲ又は他の重要な抗ＨＩＶ配列を、特に、Ｔリ
ンパ球、マクロファージ及び単球において適当なコード
配列の発現のために用いることができ、これを、適当な
コード配列のｉｖ投与後に達成することができる。従っ
て、ｍＲＮＡ（ＨＩＶ−ＲＥＶ若しくはＢＣＲ−ＡＢＬ
配列に対するもののようなアンチセンス又はリボザイム
配列）をコードするＤＮＡ配列又はヒト細胞において、
ＨＩＶ遺伝子の宿主細胞ゲノムＤＮＡへの組み込み、Ｈ
ＩＶ配列の複製、ＨＩＶタンパク質の翻訳、ＨＩＶｍＲ
ＮＡのプロセッシング又はウィルスパッケージングを特
異的に妨害するトランスドミナント負方向変異体(trans
dominant negative mutant) のようなタンパク質をコー
ドするＤＮＡ配列を用いることができる。
【００３０】野性型のコンダクタンス調節物質（ＣＦＴ
Ｒ）遺伝子の嚢胞性繊維症患者の肺における発現は、嚢
胞性繊維症の治療に用いることができる（コリンズ(Col
lins)、(1992) Science 256:774-783を参照のこと）。
ＣＦＴＲのｃＤＮＡは、ミシガン大学のコリンス博士と
トロント病気小児病院(Tronto Sick Children's Hospit
al)から得ることができる。
【００３１】野性型ｐ５３の遺伝子がない又は異常に発
現している癌患者の腫瘍における野性型ｐ５３の発現
は、これらの患者の治療の方法として用いられることが
できる。ｐ５３は、ジョン・ホプキンス大学のフォーゲ
ルシュタイン(Vogelstain)博士から入手可能である。癌
治療の他の方法には、過剰発現しトランスフォームして
いる癌遺伝子例えば、腫瘍中のｍｙｃ又はｒａｓに対す
るアンチセンス配列の転写が含まれる。
【００３２】ウィルス性肺炎は、かなりの若年及び老年
層の死及び障害の主な原因となっている。タンパク質例
えば顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ
ＳＦ）は、免疫無防備状態の患者の骨髄からの白血球の
生成を刺激するものであり、これは、ウィルス感染の進
行を調節することに有用となり得る。特に、遺伝子移入
により誘導されるＧＭ−ＣＳＦは、ウィルス性肺炎の発
生の危険性に対する予防条件及びこの感染の治療のため
の治療的条件として作用するであろう。ＧＭ−ＣＳＦは
また顕著な抗腫瘍活性も有する。対象となる核酸配列の
他の例には、ＬＤＬ（低密度リポタンパク質）リセプタ
ーをコードするもの、これは特に血清コレステロールを
下げ、血清コレステロールレベルの上昇に伴う患者の心
臓発作の危険性を減らすことができる；肺血症、慢性間
接リウマチ及び喘息を含む感染に関する状態の治療とし
てのＩＬ−１リセプターをダウンレギュレートするアン
チセンスＩＬ−１リセプターのような配列；循環レベル
が冠状動脈疾患（ＣＡＤ）の危険に関連するアポ（ａ）
をコードしている遺伝子のダウンレギュレーション；並
びに、多発性硬化症におけるミエリン又は自己免疫疾患
における他の標的を攻撃する活性化Ｔ細胞クローンの活
性を遮断する遺伝子が含まれる。ミエリンを認識して攻
撃するように活性化されるＴ細胞リンパ球クローンは、
アンチセンス配列、リボザイム配列又は、ミエリン鞘細
胞の認識及び／又は攻撃を仲介するＴ細胞リセプター成
分のＴ細胞上での表面発現を特異的に遮断するトランス
ドミナント負方向変異体コードする注入遺伝子を用いる
ことによって、標的化することができる。他の有効な治
療用核酸配列は、本発明を用いてin vivo で適当な細胞
において発現することができ、これには、スーパーオキ
サイドジスムターゼ活性又はカタラーゼ活性を有し、酸
化剤障害から肺を保護する分子をコードする核酸配列；
プロスタサイクリン及びプロスタグランジンＥ２を生成
する内皮性プロスタグランジンシンターゼ；並びに、ア
ンチプロテアーゼα−１アンチトリプシン、及びエリス
ロポイエチンが含まれる。
【００３３】用いられる終結領域は、終結領域が比較的
交換可能のようであるため、都合のよいものとする。終
結領域は、意図された対象核酸配列本来のものでも、他
の供給源から誘導したものでもよい。都合のよい終結領
域が利用でき、遺伝子ターミネーターの3'末端及び、5'
側の調節領域を得た同一遺伝子からのポリアデニル化シ
グナルを或いは、異なる遺伝子からのターミネーター及
びポリアデニル化シグナルを利用しても同じ様な結果が
得られ得る。転写後ｍＲＮＡの安定性を調節する特定配
列を任意的に含み得る。例えば、特定のポリＡ配列（ヴ
ォロック及びホウスマン、Cell (1981) 23:509-514）及
びβ−グロビンｍＲＮＡ要素はｍＲＮＡの安定性を高め
ることができ、一方、ｍＲＮＡ中の特定のＡＵ富裕配列
は、ｍＲＮＡの安定性を下げることができる（シュー
ら、Genes and Devel. (1989) 3:60-72)。更に、特定の
用途においてｍＲＮＡの半減期が短いほうが好ましい場
合には、３’非コード化領域のＡＵ領域を使ってｍＲＮ
Ａを不安定にしてもよい。
【００３４】該コンストラクトには、選別のための配列
として、例えばネオマイシン耐性遺伝子若しくはジヒド
ロ葉酸レダクターゼ遺伝子及び／又は、異なる細胞性成
分を標的とし若しくは野性型の配列がない場合には分泌
する組換えタンパク質を発生するためのシグナル配列を
含み得る。様々なシグナル配列が全て用いられ、これは
当業者によく知られている。シグナル配列は、新たなワ
クチン戦略の形成を可能にし、又はトランスフォームし
た癌遺伝子のような特異的再表面リセプターに向かう可
溶性拮抗剤を製造し得る。選別のための配列は、別のプ
ラスミドに置くことができ、治療性核酸を運ぶプラスミ
ドと共に同時トランスフェクトすることもできる。キャ
リアを使用する場合には、選別プラスミドを異なるキャ
リアと又は治療性プラスミドと同一のキャリアと複合体
し得る。
【００３５】ある場合には、高レベルで宿主細胞ゲノム
ＤＮＡへ注入遺伝子の組み込みによって又は安定なエピ
ソーム形態でin vivo で細胞の核での注入遺伝子の永続
化によって、in vivo で長期にわたる注入遺伝子効果を
もたらすコンストラクトを使用することが望ましい。所
望する場合、in vivo で宿主細胞のゲノムＤＮＡへの注
入遺伝子の組み込みは、直鎖形態で注入遺伝子（コード
領域のみでも、５’及び３’調節配列を伴うコード領域
でもよいが、プラスミド配列の存在は伴わない）を投与
することによって利用され得る。精製レトロウィルス酵
素例えば、ＨＩＶ−１インテグラーゼ酵素を脂質キャリ
ア−ＤＮＡ複合体へ取り込むことによって、ゲノムＤＮ
Ａへの注入遺伝子組み込みの発生率を更に増加し得る。
適当な隣接（フランキング）配列が、注入遺伝子ＤＮＡ
の５’及び３’末端に置かれる。これらのフランキング
配列が、ＨＩＶ−１インテグラーゼの存在下で宿主細胞
ゲノムＤＮＡへＨＩＶ−１のＤＮＡの組み込みを仲介す
ることが示されている。或いは、ウィルス例えばエスプ
タイン−バールウィルスの非トランスフォーミング配列
並びに、哺乳動物細胞において異種ＤＮＡをプラスミド
として複製させるために十分と思われるｏｒｉＰ及びＥ
ＢＮＡ−１のような配列を含むコンストラクトを使用す
ることで、in vivo における外来核酸の発現の持続期間
を延長することができる（ブハンス(Buhans)ら、Cell
(1986) 52:955)。
【００３６】宿主への導入後に宿主細胞への直接的なＤ
ＮＡ取り込みでの使用のために、５’末端でプロモータ
及び調節配列と３’末端でターミネータ及び調節配列と
に隣接している組換えコード配列は、好適なクローニン
グプラスミド（例えば、ｐＵＣ１８、ｐＳＰ７２）へ導
入され得る。宿主へ導入されるときに裸の核酸が、血液
中の脂質キャリア例えばカイロミクロンと会合すること
によって、ヌクレアーゼによる分解（消化）から保護さ
れるということが、本発明の理論である。従って、より
効率的なトランスフェクションは、血中の脂質が食物の
消化後で上昇したレベルにあるときに達成される。
【００３７】核酸コンストラクトは、キャリア例えば脂
質キャリア特に、陽イオン性脂質キャリアと複合化（錯
体化）して、複合体を形成し得る。複合体とは、発現カ
セット又は転写カセットを含むプラスミドのような核酸
コンストラクトと脂質混合物との間での会合を意図す
る。複合体の物理的形態は、リポソームの外側に複合化
するか若しくはリポソームの内部に取り込まれた核酸を
有するリポソーム、又は間に挿入さらた脂質及び核酸の
形態とし得、或いは、上記物理形態の幾つかの若しくは
全ての混合物とし得る。静脈投与のために、一般には、
該混合物を、使用される脂質混合物を音波処理し、その
後、音波処理済混合物と該核酸とを適当なＤＮＡ：脂質
比で生理的に許容可能な希釈剤中で、使用の直前に混合
して調製する。該脂質キャリアは、種々の陽イオン性脂
質から製造されることができ、これには、ＤＯＴＡＰ、
ＤＯＴＭＡ、ＤＤＡＢ、Ｌ−ＰＥ等が含まれる。陽イオ
ン性脂質例えば、 “リポフェクチン”として知られる
Ｎ［１−（２，３−ジオレイロキシ）プロピル］−Ｎ，
Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭ
Ａ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド
（ＤＤＡＢ）、１，２−ジオレオイロキシ−３−（トリ
メチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）又はリシニ
ルホスファチジルエタノールアミン（Ｌ−ＰＥ）と、第
２脂質例えばジオレオイルホスファチジルエタノールア
ミン（ＤＯＰＥ）又はコレステロール（Ｃｈｏｌ）とを
含有する脂質キャリアは、特に対象となる。ＤＯＴＭＡ
合成はフェルナー(Felgner)らProc.Natl.Acad.Sci.,US
A.,(1987) 84:7413-7417に記載されている。ＤＯＴＡＰ
合成はスタマタトス(Stamatatos)ら、Biochemistry (19
88)27:3917 に記載されている。ＤＯＴＭＡ：ＤＯＰＥ
脂質キャリアは例えばＢＲＬ社から購入できる。ＤＯＴ
ＡＰ：ＤＯＰＥ脂質キャリアはベーリンガー・マンハイ
ム社から購入できる。コレステロール及びＤＤＡＢはシ
グマ社から市販されている。ＤＯＰＥはアバンチ・ポー
ラー・リピド(Avanti Polar Lipids)社から市販されて
いる。ＤＤＡＢ：ＤＯＰＥはプロメガ社から購入でき
る。生分解性陽イオン性両親媒物もまた、使用すること
ができる（例えば、同時係属ＰＣＴ出願、代理人整理番
号ＭＥＢＩ−００２／００ＷＯ、１９９２年１２月１７
日出願を参照のこと）。
【００３８】脂質キャリア例えば陽イオン性リポソーム
は、核酸を培養系で広範囲の細胞へ送達することによっ
て、注入遺伝子又はｍＲＮＡの高レベルでの細胞性発現
を仲介することができる。特定の陽イオン性脂質の使用
は、in vivo 送達のための特殊な利点を確立できる。例
えば、ＤＯＴＡＰ含有リポソーム若しくはエチルホスフ
ァチジルコリン（Ｅ−ＰＣ）脂質キャリアに複合化した
核酸の静脈注入は、主として肺に注入遺伝子の発現を向
けることができる。その上、ＤＯＴＡＰと、Ｌ−ＰＥ及
びコレステロールエステルβ−アラニン（ＣＥＢＡ）と
は、細胞によって十分に代謝されるが、ＤＯＴＭＡは細
胞によって十分に代謝されない。従って、ＤＯＴＡＰ、
Ｅ−ＰＣ及びＬ−ＰＥは、ＤＯＴＭＡと異なり、哺乳宿
主への反復注入に適している。更に、陽イオン性脂質と
第２脂質とを含む脂質キャリアを用いる場合、特にコレ
ステロール又はＤＯＰＥがin vivo での注入遺伝子の発
現を最大にすることができる。また、ステロイド例えば
コレステロールをＤＯＰＥの代わりにＤＯＴＡＰ、ＤＯ
ＴＭＡ若しくはＤＤＡＢと混合することは、実質的にin
vivo における注入遺伝子の発現を増加する。
【００３９】投与の経路及び投与の部位に依存して、特
定の細胞及び組織が標的にされ得る。例えば、血流の方
向で注入部位に最も近い組織のトランスフェクション
は、如何なる特殊な標的化もなくトランスフェクトされ
得る。更に、所望するならば、脂質キャリアは部位指向
性分子(site-directing molecules)を用いて特定の型の
細胞へ該複合体を指向するように改変され得る。従っ
て、特定のリセプター又は他の細胞表面タンパク質に対
する抗体又はリガンドが、特定の表面タンパク質と会合
された標的細胞と共に用いられ得る。例えばＡＩＤＳウ
ィルスは主としてＣＤ４表面タンパク質を有する細胞に
向かう。脂質キャリアの表面に結合した抗ＣＤ４抗体を
担持することによって、核酸脂質キャリア複合体はＴヘ
ルパー細胞に主として向くことができる。
【００４０】特定リガンド又は抗体は、部位指向性分子
を脂質に結合することによって、又は部位指向性成分の
機能性部位(functionality)を連結するために該二重膜
に存在する脂質上の連結基を提供することによって、慣
用の方法により脂質に結合されることができる。このよ
うな技術は当業者にはよく知られている。リガンド指向
性ＤＮＡ−多価陽イオン複合体が、静脈注入後に肝臓の
肝細胞へトランスフェクトすることが示されている；こ
の手段によって他の細胞型又は組織型をトランスフェク
トする能力は、証明されていない。
【００４１】非陽イオン性脂質キャリア、特にｐＨ感受
性リポソームは、in vivo 遺伝子治療のための他の魅力
的な手段の可能性を提供する。しかし、陽イオン性リポ
ソームに比べて、ｐＨ感受性リポソームは、ＤＮＡの被
包化及び細胞内でのＤＮＡの送達において効率が劣り、
血清の存在下で不活化し得るので、静脈内における使用
が制限される。
【００４２】多数の因子は、トランスフェクトされた組
織における発現量に作用することができ、従って、特定
の目的に合うように発現のレベルを変更するために用い
られ得る。高レベルの発現が望ましい箇所では、全ての
因子を最適化することができ、わずかな発現が望ましい
箇所では、１以上のパラメータを変更して所望のレベル
の発現を得ることができる。例えば、高い発現が治療範
囲(therapeutic window)を越える場合には、最適よりも
少ない条件を採用することができる。変更することがで
きる因子は以下のものがある：注入される複合体の脂質
組成又は脂質キャリアの平均直径（粒子形状例えばリポ
ソームの場合）は、in vivo でもたらされる注入遺伝子
発現のレベルに劇的に作用することができる。従って、
リポソーム脂質組成物は、一般に、非陽イオン性脂質に
対して５０％モル比の組成の陽イオン性脂質を有する
が、５％から１００％の範囲もとることができる。脂質
キャリアの直径は、一般に、１００ｎｍから１０μｍの
範囲内にするべきである。脂質キャリア範囲が１００ｎ
ｍから数μｍの直径の陽イオン性脂質キャリア−ＤＮＡ
複合体は、哺乳類宿主への全身性投与後に、かなりのレ
ベルの注入遺伝子発現をもたらすことができる。
【００４３】５００ｎｍを越える脂質キャリアの使用
（言い換えれば多重ラメラ小胞（ＭＬＶ）又は大単ラメ
ラ小胞（ＬＵＶ))は、小単ラメラ小胞（ＳＵＶ）と比較
した場合、ある場合には、哺乳宿主において達成される
注入遺伝子の発現のレベルを有意に増加することができ
る。ＭＬＶ及びＬＵＶは乾燥脂質フィルムに水性物質を
添加した後に、音波粉砕よりもむしろボルテックス処理
によって製造される。粒子を使用しようとするならば、
得られた脂質キャリアを、決まったサイズのポリカーボ
ネート膜を通して高圧下で押し出して、特定の用途のた
めにより均一なサイズ分布に達することができる。
【００４４】特定の核酸対脂質キャリア比の使用は、ま
た、トランスフェクションの量及び／又は対象となる核
酸配列の転写及び／又は発現のレベルを増加することも
できる。用いられる比が、注入遺伝子がin vivo で発現
するか否か及びそのレベルを規定し、従ってこれを最適
化することができ、これはコンストラクトの性質、脂質
キャリアのサイズ及び脂質組成物並びに、ＭＬＶかＳＵ
Ｖか、投与の経路及び宿主哺乳動物を含む種々の因子に
依存する。例えば、リポーター遺伝子であるＣＡＴ（ク
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）を用
いれば、約１：１（０.５：１から２：１の範囲）のＤ
ＮＡ対脂質キャリア比（μｇＤＮＡ対nmolの陽イオン性
脂質）は、腹腔投与後の全ての器官において、マウスで
最も高い遺伝子発現をもたらし、約１：４比（２：１か
ら１：７の範囲）は、静脈投与後の全ての器官において
最も高いレベルの遺伝子発現をもたらす。最適条件を用
いた広範囲の組織での高いレベルの注入遺伝子発現の達
成に加えて、肺、脾臓、リンパ節及び骨髄に存在する全
ての細胞の大部分は、心臓に存在する全ての内皮細胞の
大部分と同様に、in vivo でトランスフェクトされる。
【００４５】ＤＮＡ：脂質キャリア比は、注入遺伝子が
該複合体の全身性投与後の哺乳宿主における発現レベル
を決定する。いくつかの因子が、所望の特定発現レベル
のためのＤＮＡ：脂質キャリア比を最適化するので重要
である。従って、特定のＤＮＡ：脂質キャリア比が、用
いられた個々の脂質キャリアサイズ毎と、用いられた陽
イオン性脂質のタイプ毎に必要である。用いられた脂質
キャリア組成物毎に、最大発現を最適化するため、ＤＮ
Ａは、ＤＮＡ：脂質キャリア複合体の凝集をもたらす比
を最初に決定するために、６：１から１：１０（μｇの
ＤＮＡ対nmolの陽イオン性脂質）の範囲となる、複数の
異なる率で脂質キャリアと共に混合される。凝集をもた
らす比は、in vivo では用いることができない。凝集を
もたらさない比は、in vivo での所望の注入遺伝子の発
現レベルを確保するＤＮＡ：脂質キャリア比を決定する
ために、動物モデルにおいて試験される。例えば、ＤＯ
ＴＭＡ：ＤＯＰＥ、ＤＤＡＢ：ＤＯＰＥ、ＤＯＴＡＰ：
ＤＯＰＥ、ＤＯＴＡＰ：コレステロール、Ｌ−ＰＥ：Ｃ
ＥＢＡ、ＤＤＡＢ：コレステロール及びＬ−ＰＥ：ＤＯ
ＰＥにおけるＳＵＶの最適ＤＮＡ：脂質キャリア比は、
各々、１：４、１：３、（全ての比でかなり低い活
性）、１：６、１：１、１：５及び２：１である。ＤＮ
Ａ：脂質キャリア複合体は適当な生理学的溶液中で作製
されなければならない。ＤＮＡ：脂質キャリア複合体
は、それ自身ＤＮＡ：脂質キャリア複合体の凝集を誘導
しない生理溶液（約２９０ミリ浸透圧モル）に混合され
る。この溶液は、水又は通常の生理塩水中に５％のデキ
ストロースを含む。陽イオン性脂質キャリアの対する細
胞表面リセプターは、哺乳類宿主における注入遺伝子発
現の標的細胞特異性を調節及び提供を共にするために用
いられ得る。陽イオン性脂質キャリア：ＤＮＡ複合体
は、陽イオン分子に対して特異的な結合部位を含み且つ
これを吸収することができる細胞表面リセプターを用い
て、伝統的なリセプター仲介エンドサイトシスによって
細胞に取り込まれる（図７参照）。従って、薬剤例えば
サイトカイン、成長因子、他の可溶性タンパク質及び特
定の薬物を用いると、選択的にこれらの陽イオン結合リ
セプターをアップ又はダウンレギュレートすることが可
能になる。適当な薬剤によるこれらリセプターのアップ
又はダウンレギュレーションの速度は、特定細胞のin v
ivo におけるトランスフェクションのレベルの上げ下げ
の選択を可能にする。裸のＤＮＡに対する細胞表面リセ
プターは、哺乳動物宿主内の遺伝子導入発現における標
的細胞特異性を、調節及び確保を共にするために用いら
れることができる。
【００４６】プラスミドＤＮＡに複合化された、単及び
多重ラメラ脂質キャリアのいずれかであるＤＯＴＭＡ脂
質キャリアと、種々の細胞型（例えばＣＶ−１サル腎臓
細胞、Ｕ９３７ヒト骨髄単球白血病細胞、Ｋ５６２、Ｍ
ＥＬ（マウス赤芽球白血病細胞)、ラット肺胞マクロフ
ァージ及び肺胞II型細胞）との間の最もよく起こる相互
作用は、脂質キャリア付着及び吸収によるものである。
この相互作用は、リセプター仲介エンドサイトシスのよ
く研究されている例に共通している。陽イオン性脂質キ
ャリア：ＤＮＡ複合体に接触するような全ての細胞が、
形質膜への該複合体の結合後に、複合体を摂取する。こ
れらの細胞型の全てが、同一の伝統的リセプター仲介エ
ンドサイトシス的な吸収経路を証明している。
【００４７】哺乳動物宿主は、全ての動物、特に遺伝子
関連疾患又は、遺伝子関連治療を受けることが可能な感
染疾患の症状を有する動物であり得る。従って、適用対
象は、家畜、飼育動物例えばウシ、ヒツジ、ブタでも、
霊長類特にヒトでも使用される。哺乳動物宿主は妊娠さ
れ得、遺伝子関連治療の意図されたレシピエントは、妊
娠したメス及び胎児のいずれか又は両方とし得る。 本
発明の方法では、in vivoトランスフェクションは、治
療用転写又は発現ベクターを哺乳動物宿主へ、裸のＤＮ
Ａと脂質キャリア特に陽イオン性脂質キャリアと複合さ
れたＤＮＡとのいずれかを導入することによって得られ
る。コンストラクトは、注入遺伝子の安定な維持又は注
入遺伝子のエピソーム発現のために、宿主細胞ゲノムへ
組み込むために提供され得る。哺乳動物宿主への導入は
いくつかの経路のいずれかによってされ得、これには、
静脈模試は腹腔注入、気管内的、鞘内的、腸管外的、動
脈内的、鼻腔内的、筋肉内的、局所的、経皮的、全ての
粘膜表面からの投入、角膜点滴等が含まれる。治療用発
現ベクターの循環体液又は体口若しくは体腔例えば肺、
大腸、膣等への導入が特に対象となる。従って、静脈投
与及び気管内投与は、ベクターがこのような投与経路の
後に広く拡散し得るので特に対象となり、また、エアロ
ゾル投与は体口又は体腔への導入に用いられる。全て生
理学的に許容可能な媒体がＤＮＡ又は脂質キャリアの投
与のために用いられ得、これには、例えば脱イオン水、
生理塩水、リン酸緩衝液、５％デキストロース水溶液等
が含まれ、これらは投与経路に依存する。他の成分がこ
の配合に含まれ得、例えば緩衝液、安定剤、殺生物剤等
である。これらの成分は、文献において広く例示が認め
られ、特にここでの説明の必要はない。該複合体の凝集
の原因となる全ての希釈剤又は希釈剤成分は、避けるべ
きであり、これには、高濃度塩類、キレート剤等が含ま
れる。
【００４８】用いられる裸のＤＮＡ又は複合体の量は、
ＤＮＡ又は複合体が血流へ侵入した後、種々の組織への
適当な散布がもたらされるために、及びトランスフェク
トされた組織における治療的なレベルの発現をもたらす
ために、十分なものとする。治療レベルの発現は、宿主
哺乳類の疾患又は感染を予防、処置又は緩和するために
十分な量の発現である。更に、用いられる核酸ベクター
の量は、in vivo において対象の組織での所望のレベル
での注入遺伝子発現をもたらすために十分なものとしな
ければならず、例えば≧１ｍｇの発現プラスミドのみ
を、マウスへ注入すると、多数の組織においてＣＡＴ遺
伝子の高レベル発現がもたらされる。他のＤＮＡ配列例
えばアデノウィルスＶＡ遺伝子は、投与媒体に含有され
ることができ、対象遺伝子と共にトランスフェクトされ
ることができる。アデノウィルスＶＡ遺伝子をコードす
る遺伝子の存在は、これが所望されれば、プラスミドか
ら転写されたｍＲＮＡの翻訳を有意に促進し得る。
【００４９】組み換え遺伝子の発現のレベル及び組織
は、ｍＲＮＡレベルで及び／又はポリペプチド若しくは
タンパク質のレベルで測定され得る。遺伝子産物は、組
織における生物活性を測定することによって定量され得
る。例えば、酵素活性は、生物学的アッセイ又は、免疫
染色技術例えば該遺伝子産物若しくは発現カセットに存
在するリポーター遺伝子産物を特異的に認識する抗体を
用いたプロービング（釣り上げ）によってトランスフェ
クトされた細胞中の遺伝子産物を同定することによっ
て、測定されることができる。或いは、該遺伝子産物の
潜在的治療効果は、例えば対象ＤＮＡ配列がＧＭ−ＣＳ
Ｆをコードする場合には、ＧＭ−ＣＳＦ注入遺伝子を発
現する致死量被爆動物の生き残りにおける遺伝子発現の
効果を測定することによって、測定することができる。
注入遺伝子産物の有意量の生成は、これらのマウスの生
き残りを実質的に延長する。
【００５０】ポリペプチド／タンパク質の発現又はｍＲ
ＮＡ自身さえも、宿主における変化した生化学的表現型
を確保する場合、新しい表現型の存在又は古い表現型の
欠失は評価され得る；例えば宿主細胞のトランフェクシ
ョンの結果として、以前に不十分な量で生成されていた
既存の所望産物の生成が増進され得、又は、アンチセン
ス、リボザイム又は共同抑制技術を用いて望ましくない
遺伝子産物の減少又は更なる抑制が起こり得る；抑制の
場合では、遺伝子産物の減少が測定され得る。普通、治
療カセットは、宿主細胞ゲノムへ組み込まれない。必要
であれば、治療は、達成される結果に依存した目的に応
じて、繰り返されることができる。治療が繰り返される
場合、哺乳動物宿主は治療に対する不利な免疫応答又は
他の応答がないことを確保するためにモニターされる。
【００５１】例えば、特定の疾患状態を治療することが
望まれている臨床環境では、治療様式の生物学的効能と
臨床的効能とが、可能であれば共に評価されることが必
要である。例えば、嚢胞性繊維症の治療では、広汎性上
皮性機能不全があり、これは、気道、汗腺、腸及び生殖
路並びに膵臓の管腔液又は “分泌物”の電解質及び水
分含量における異常としてそれ自身が示される。従っ
て、遺伝子治療の生物学的効能は、例えば治療前及び相
互作用後に、上皮間の電位の差を測定することによっ
て、評価することができる。評価は、鼻細胞のトランス
フェクション後に及び肺細胞のトランスフェクション後
に実行され得る。呼吸上皮と嚢胞性繊維を横切って生物
電位の差を測定するために用いることができる技術の例
には、ノウレス(Knowles) ら、(1981) New England Gen
eral of Medicine 305:1489-1495；ノウレスら、(1983)
General of Clinical Invastigation 71:1410-1417 ；
ノウレスら、(1983) Science 221:1067-1070に記載され
ているものがある。臨床的効能は、注目される欠陥の治
療が疾患の進路を変えることに有効であるかどうかであ
り、これを測定することは更に困難になり得る。生物学
的効能の評価が臨床的効能のための代わりの終点として
実行されているが、最終的なものではない。従って、例
えば６ヵ月の肺機能の指標となるいわゆる “肺活量測
定”因子のような臨床的な終点を測定することは、治療
レジメンの臨床的効能の指標となり得る。典型的な測定
には、肺の努力肺活量（ＦＶＣ）及び１秒間の最大努力
吸気肺活量（ＦＥＶ）が含まれる。嚢胞性繊維症のため
の遺伝子治療の効能を評価するために実行できる臨床研
究のタイプの１例は、肺疾患及び嚢胞性繊維症の治療の
ためにアミロライドについて使用されているものであ
る；ノウレスら、(1990) Ner England General of Medi
cine 322:1189-1194。同様に、当業者は、特定遺伝子治
療のプロトコールの生物学的及び臨床的効能を評価する
ことができる。
【００５２】本組成物は、１以上の手順の使用に提供さ
れることができる。キットには通常、ＤＮＡが裸のＤＮ
Ａ又は脂質キャリアと複合化されて含まれる。更に、脂
質キャリアは、提供されたＤＮＡと複合化させるため
に、別容器で提供され得る。直接投与及び脂質キャリア
との複合化のいずれかのためのＤＮＡ又は脂質キャリア
／ＤＮＡ複合体は、使用前に更に希釈され得る濃縮物と
して存在し得、又は使用濃度で提供され得るが、この場
合にはバイアルは、１回以上の投与分を含み得る。都合
上、医師又は獣医師がシリンジを直接用い得るように、
単一投与量がシリンジで提供され得、これは滅菌容器中
に含まれている。ここで、該シリンジは所望の量及び濃
度の試薬を有する。従ってキットには、適正な比率の量
のＤＮＡ又はＤＮＡ／脂質キャリア複合体を含む複数の
シリンジが入っている。該シリンジが直接使用のための
配合を含む場合、通常、本方法による使用の際に他の使
用試薬を必要としない。
【００５３】本発明は、多くの疾患のin vivo 予防、治
療及び／又は緩和に使用される。遺伝子のin vivo 置換
は、例えば相同組み換え又は異常な遺伝子の初期ノック
アウト及び次の所望注入遺伝子との置換の技術によって
達成されることができる。本発明を用いたin vivo で適
当な細胞における核酸の発現による更なる利益は、コー
ド化されたタンパク質が、正しい方法でプロセッシング
されて転写後の改変に付されることである。
【００５４】下記の例は、説明を意図したものであり、
これに限定されるものではない。
【００５５】
【実施例】（材料の一覧）実施例１では、in vivo 遺伝
子治療のためのプラスミドの調製について述べる。
【００５６】ｐＲＳＶＣＡＴ ｐ５’ＰＲＬ３−ＣＡＴ ｐＳＩＳ−ＣＡＴ ｐＺＮ２０（図１１〜１４参照） ｐＺＮ２７（図５２、５３参照） ｐＺＮ４６（図５４〜５７参照） ｐＺＮ３２（図５８参照） ｐＺＮ５１（図６４、６５参照） ｐＺＮ６０、ｐＺＮ６１、ｐＺＮ６２、ｐＺＮ６３（図
６６〜７０参照） ｐＣＩＳ−ＣＡＴ 実施例２では、脂質キャリア及び脂質キャリアと複合化
したＤＮＡの調製における、脂質キャリアの調製、プラ
スミド調製、脂質キャリア−プラスミドの調製、及び複
合化について述べる。
【００５７】実施例３では、ｐＺＮ２７−ＤＤＡＢ：コ
レステロール脂質キャリア複合体（図１参照）の静脈
（ｉｖ）注入後の肺におけるＣＡＴ遺伝子の発現の免疫
組織化学による証明について述べる。
【００５８】実施例４では、ｐＣＩＳ−ＣＡＴの腹腔投
与後の発現について説明する。
【００５９】実施例５では、ｐ５’ＰＲＬ３−ＣＡＴ：
Ｌ−ＰＥ：ＣＥＢＡ複合体の静脈（ｉｖ）注入後の脾臓
におけるＣＡＴ遺伝子発現の証明について述べる。
【００６０】実施例６では、ＤＯＴＭＡ：ＤＯＰＥ＋ｐ
ＳＩＳ−ＣＡＴプラスミドの注入が、明らかにin vivo
で検出可能なＣＡＴ遺伝子発現をもたらさないことにつ
いて述べる。
【００６１】実施例７では、ＤＮＡ：脂質キャリア複合
体と細胞表面リセプターとの相互作用（図４３〜４８参
照）について述べる。
【００６２】実施例８では、マウスＴリンパ球がin viv
o でトランスフェクトされることを証明する（図３、４
参照）。
【００６３】実施例９では、マウス造血系骨髄由来細胞
がin vivo でトランスフェクトされることを証明する。
【００６４】実施例１０では、正常ドナーから新たに単
離したヒトＣＤ４+ リンパ球がトランスフェクトされる
ことを証明する（図９、１０参照）。
【００６５】実施例１１では、ＤＮＡの陽イオン性リポ
ソーム仲介送達を用いた種々のヒト肺癌細胞株の効率的
なトランスフェクションについて述べる（図８９参
照）。
【００６６】実施例１２では、陽イオン性脂質キャリ
ア：ＤＮＡ複合体の静脈注入によるマウスにおける肺癌
細胞のトランスフェクション（図４９、５０参照）につ
いて述べる。
【００６７】実施例１３では、ｐＺＳＮ２７のみ又はｐ
ＺＮ２７：ＤＤＡＢ：コレステロールＳＵＶ複合体の静
脈（ｉｖ）注入後の、多重組織における高レベルＣＡＴ
遺伝子の発現を証明する。
【００６８】実施例１４では、ＣＭＶ−インターロイキ
ン−２遺伝子と複合化した陽イオン性脂質キャリアの静
脈注入によるマウスの脾臓及びリンパ節における高レベ
ルのヒトインターロイキン−２の誘導について述べる。
【００６９】実施例１５では、ｐＺＮ３２：陽イオン性
脂質キャリア複合体のｉｖ投与によって処置されたマウ
スにおけるヒトＣＦＴＲ遺伝子の高レベル発現の誘導に
ついて述べる（図６３参照）。
【００７０】実施例１６では、異なるＣＡＴ遺伝子含有
プラスミドの静脈注入後の肺及び腎臓におけるＣＡＴ遺
伝子の発現を証明する（図７１参照）。
【００７１】実施例１７では、ＣＭＶ−ＣＡＴ−リポソ
ーム又はＣＦＴＲ−ＣＡＴ−リポソーム複合体の各ｉｖ
注入によってもたらされる、広汎性ＣＡＴ遺伝子と組織
及び細胞型特異性ＣＡＴ遺伝子の各発現について述べる
（図７２〜８２参照）。
【００７２】実施例１８では、プラスミドのみのｉｖ注
入と、脂質キャリアと複合化されたプラスミドのｉｖ注
入に注目したトランスフェクションを比較する（図８
６、８７参照）。
【００７３】実施例１９では、ＧＭ−ＣＳＦ発現プラス
ミド−陽イオン性リポソーム複合体のＩＶ注入が、顕著
な抗腫瘍効果をもたらすことについて述べる。ｐＺＮ８
４（図８３、８４参照）実施例２０では、ＤＤＡＢ：コ
レステロール（１：１）リポソームに複合化されたｐＺ
Ｎ８４のヤギへの静脈（ｉｖ）注入後のin vivo での延
長された高レベルのマウスＧＭ−ＣＳＦ遺伝子発現（図
９０、９１参照）について述べる。
【００７４】実施例２１では、マウスにおける実験的な
ウィルス性肺炎の進行におけるリポソーム−ＧＭ−ＣＳ
Ｆプラスミド複合体の影響について述べる。
【００７５】実施例２２では、中枢神経系への直接的な
ＤＮＡのみ又はＤＮＡ−陽イオン性リポソーム複合体の
注入によってもたらされるマウス脳におけるＣＡＴ遺伝
子の高レベルの発現について述べる（図８８参照）。
【００７６】実施例２３では、ｐＲＳＶ−ＣＡＴ：Ｌ−
ＰＥ：ＣＥＢＡ複合体の静脈（ｉｖ）注入後の肺におけ
るＣＡＴ遺伝子の発現を証明する。
【００７７】実施例２４では、ｐＺＮ２０−ＣＡＴ：Ｄ
ＤＡＢ：ＤＯＰＥ複合体の静脈（ｉｖ）注入後の多重組
織におけるＣＡＴ遺伝子発現を証明する。 （実施例１） in vivo 遺伝子治療のためのプラスミドの調製 哺乳類細胞のトランスフェクションに用いたプラスミド
の詳細は以下の通りである。
【００７８】ｐＲＳＶＣＡＴ：このプラスミドの構築
は、ゴルマン(Gorman)ら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,
(1982),79:6777-6781に記載されている。このｐＲＳＶ
ＣＡＴプラスミドには、３′−ＲＳＶＬＴＲが、ＣＡＴ
コーディング配列の上流にプロモータとして並置されて
いる。ＬＴＲ転写開始部位とＣＡＴ開始コドン（開始部
位の下流の最初のＡＵＧ）との距離は約７０ｂｐであ
る。
【００７９】ｐ５′ＰＲＬ３−ＣＡＴ：このプラスミド
の構築は、サカイら、Genes and Development (1988)
2:1144-1154に記載されている。
【００８０】ｐＳＩＳ−ＣＡＴ：このプラスミドの構築
は、ホァン及びゴルマン、NucleicAcids Research (199
0) 18:937-948に記載されている。
【００８１】ｐＺＮ２０：このプラスミドの構築は、図
１１〜１４に説明されている。このプラスミドは下記の
ようにして調製した。ｐＣＡＴｗｔ７６０（スティンス
キ(Stinski)とロウアー(Roehr)、(1985) J.Virol.,55:4
31-441)を HindIIIで処理し、ＨＣＭＶ ＩＥ１エンハ
ンサー及びプロモーター要素を含むフラグメントを精製
した。その後、単離フラグメントを、ｐＳＰ７２（プロ
メガ）の HindIII部位へクローン化してｐＺＮ９を作製
した。エンハンサー及びプロモーター要素が図１１〜１
４に示されているクローンをスクリーン（選抜）した。
ｐＺＮ９の部分的 HindIII消化の後、平滑末端にＤＮＡ
ポリメラーゼＩクレノウフラグメントを添加した。得ら
れたクローンｐＺＮ１２は、エンハンサー及びプロモー
ター要素の５′の HindIII部位を失っていた。その後ｐ
ＺＮ１２を NcoＩ及び HindIIIで処理し、大きい NcoＩ
− HindIIIフラグメントを精製し、ｐＢＣ１２／ＣＭＶ
／ＩＬ−２（クーレン(Cullen)、Cell (1986) 46:973-9
82) 由来の精製された小さい NcoＩ− HindIIIフラグメ
ントに連結した（ライゲーション）。ｐＢＣ１２／ＣＭ
Ｖ／ＩＬ−２はＡＤ１６９株由来のＨＣＭＶプロモータ
ーを含む。得られたクローンをｐＺＮ１３とした。ｐＺ
Ｎ１３を BamＨＩで部分消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩ
クレノウフラグメントを添加し、得られたクローンをエ
ンハンサー及びプロモーター要素の５′末端で BamＨＩ
部位を失っているクローンをスクリーンした。得られた
クローンをｐＺＮ１７と呼んだ。ｐＺＮ１７を HindIII
及び BamＨＩで処理し、得られた HindIII− BamＨＩ大
フラグメントを精製し、ｐＳＶ２−ＣＡＴ（ゴルマン
ら、(1982) Molecular Cell Biology,2:1044-1051)から
得られた精製小HindIII−BamＨＩフラグメントと連結し
た。得られたクローンをｐＺＮ２０とした。ＨＣＭＶ
（Ｔｏｗｎｅ）の完全制限地図は図１５〜２３に示され
ている。ＨＣＭＶ（ＡＤ１６９）は図３１〜４２に示さ
れている。２つのプロモーターの比較は図２４〜３０に
示されている。Ｔｏｗｎｅ株由来のものに炊いてＡＤ株
由来のプロモータを用いた場合に、実質的により高い発
現が得られる。ｐＺＮ２０は NcoＩ部位の５′側にＴｏ
ｗｎｅの配列と NcoＩ部位の３′側にＡＤ１６９の配列
とを有する複合プロモーターを含む。 NcoＩ部位は、図
２４〜３０でアスタリスクによって表示されている。ｐ
ＺＮ２０はこの複合ＨＣＭＶプロモーターと、その後に
ＣＡＴ遺伝子、ＳＶ４０のｔ−イントロン及びＳＶ４０
のポリＡ付加部位とを有する。
【００８２】ｐＺＮ２７：このプラスミドのコンストラ
クトは図５１、５２に説明されている。ｐＺＮ２７は複
合ＨＣＭＶプロモーターとその後にＳＶ４０のｔ−イン
トロン、ＣＡＴコーディング配列及びＳＶ４０のポリＡ
付加部位を、この順で有する。
【００８３】ｐＺＮ４６：このプラスミドのコンストラ
クトは図５４〜５７に説明されている。ｐＺＮ４６は、
複合ＨＣＭＶプロモーターとその後にヒトＩＬ−２遺伝
子、ラットのプレプロインシュリン２イントロン及びラ
ットプレプロインシュリン２遺伝子由来のポリＡ付加部
位を含む。これらの最後の３つの成分は、クーレン（Ce
ll 46:973-982 (1986)) のｐＢＣ１２／ＣＭＶ／ＩＬ−
２プラスミド由来であった。ラットプレプロインシュリ
ン２イントロンは、内部の１６２ｂｐの NdeＩフラグメ
ントを欠損することによって改変された。
【００８４】ｐＺＮ３２：このプラスミドのコンストラ
クトは図５８に説明されている。ｐＺＮ３２は、複合Ｈ
ＣＭＶプロモーターと、その後にｐＺＮ４６で説明され
たラットの改変プレプロインシュリン２イントロン、Ｃ
ＦＴＲのヒトｃＤＮＡ及びｐＺＮ４６で説明されたプレ
プロインシュリン２遺伝子ポリＡ付加部位を含む。ＣＦ
ＴＲのｃＤＮＡは、Ｆ.コリンズ(Collins)(ミシガン大
学) から供与されたｐＢＱ４.７から得られた。
【００８５】ｐＺＮ５１：このプラスミドのコンストラ
クトは図６４、６５に説明されている。ｐＺＮ５１は、
複合ＨＣＭＶプロモーターとその後にＣＡＴコーディン
グ配列及びＳＶ４０ポリＡ部位を含む。
【００８６】ｐＺＮ６０、ｐＺＮ６１、ｐＺＮ６２、ｐ
ＺＮ６３：これらのプラスミドは図６６〜７０に示され
ている。ｐＺＮ６０はＨＣＭＶ複合プロモーターと、そ
の後に改変ラットプレプロインシュリン２イントロン、
ＣＡＴコーディング配列及びＳＶ４０ポリＡ付加部位を
含む。ｐＺＮ６１はｐＺＮ６０と同一であるが、イント
ロンの５′側に１６６ｂｐの付加を含む。この付加ＤＮ
ＡはｐＢＣ１２／ＣＭＶ／ＩＬ−２プラスミド中のイン
トロンのすぐ５′側の１６６ｂｐであり、ラットプレプ
ロインシュリン２遺伝子コーディング配列を含み得る。
ｐＺＮ６２は、イントロンがｐＺＮ６０における５′よ
りはむしろＣＡＴコーディング配列の３′側のものであ
る以外はｐＺＮ６０と類似している。ｐＺＮ６３はイン
トロンの５′側の１６６ｂｐの付加を除いてｐＺＮ６２
と同一である。これはｐＺＮ６１で記述されたものと同
一の付加配列である。
【００８７】ｐＣＩＳ−ＣＡＴ： このプラスミドは、
ＣＭＶプロモータ及び混成イントロン配列を、プラスミ
ドｐＭＬ．Ｉ．ＣＡＴ、ゴルマンら、(1990) DNA Prote
in Eng.Tech.,2:3-10 中のＳＶ４０プロモータに代えて
使用した以外は、ファン(Huang),Ｍ．Ｔ．Ｆ．及びゴル
マン，Ｃ．Ｍ.,(1990) Nucl.Acids Res.18:937-947に記
載されているように作製した。
【００８８】（実施例２） ・脂質キャリア及び脂質キャリアと複合化したＤＮＡの
調製 陽イオン性脂質例えばＮ［１−２−３−ジオレイロキ
シ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム
クロライド（ＤＯＴＭＡ）、ジメチルジオクタデシルア
ンモニウムブロマイド（ＤＤＡＢ）又は１，２−ジオレ
オイロキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン
（ＤＯＴＡＰ）又はリシニル−ホスファチジルエタノー
ルアミン（Ｌ−ＰＥ）と、第２脂質例えばジオイルホス
ファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）又はコレステ
ロールとを含む脂質キャリアが下記のように調製され
た。 ・脂質キャリアの調製 脂質例えば、ＤＤＡＢ、Ｌ−ＰＥ、コレステロール−エ
ステル−β−アラニン（ＣＥＢＡ）、ＤＯＴＡＰと、コ
レステロール（Ｃｈｏｌ）とを、クロロホルムに溶解し
た。各脂質の好適な量（最終脂質キャリア配合物におけ
る各脂質の所望のモル比によって規定され、通常１対１
モルの陽イオン性脂質対非陽イオン性脂質であるが、５
〜１対１〜５の範囲を採る）を共に混合して、回転式蒸
発器によって乾燥するまで蒸発させた。その後、該脂質
フィルムを、水又は脂質キャリア緩衝液（２５ｍＭのト
リス−ＨＣｌ、ｐＨ７.４、１００μＭのＺｎＣｌ2 、
ＮａＣｌに等張）中５％のデキストロースを付加した後
にボルテックス処理によって再懸濁した。最終脂質濃度
２０ｍＭの多重ラメラ小胞（ＭＬＶ）を作製するために
である。小さい単ラメラ小胞（ＳＵＶ）の調製には、そ
の後、この混合物を音波粉砕槽中で１５分間、音波粉砕
し、脂質キャリアを使用まで４℃アルゴン下で保存し
た。 ・プラスミド調製 プラスミドを運ぶＥ.ｃｏｌｉ株ＨＢ１０１を３７℃で
ＴＢにおいて成育させた。プラスミド精製方法は、サム
ブロックら（Molecular Cloning,第２版、1989、コール
ド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社)
によって記述されている “アルカリ溶解”及び “ポリ
エチレングリコールを用いた沈殿によるプラスミドＤＮ
Ａの精製”の改変手法とする。この改変はＰＥＧによる
ＤＮＡの沈殿を省いていることである。最終ＤＮＡ調製
物は、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８.０に溶解し
た。 ・脂質キャリア−プラスミド複合体の調製 プラスミドを所望の濃度（通常、１μｇ／μｌ）に５％
デキストロース水溶液に別途希釈した。脂質キャリアも
プラスミドと同一の容量に５％デキストロース水に希釈
した。
【００８９】使用される脂質キャリアの量は、脂質nmol
対添加プラスミドμｇの比に基づいて規定され、例えば
脂質キャリア：プラスミド＝１：１であり、１ナノモル
の陽イオン性脂質を１μｇのプラスミドＤＮＡと混合し
た。その後、プラスミドと脂質キャリアとを共に混合し
てＤＮＡ：脂質キャリア複合体を形成した。 ・投与量注入 少なくとも５０μｇであり、規則的には陽イオン性脂質
キャリアに複合化されたプラスミドＤＮＡ１００μｇを
マウス当たりに注入した。プラスミドのみの注入には、
少なくとも５００μｇ及び規則的には２ｍｇのプラスミ
ドＤＮＡをマウス当たりに尾静脈によって注入した。 （実施例３） ｐＺＮ２７−ＤＤＡＢ：コレステロール脂質キャリア複
合体の静脈（ｉｖ）注入後の肺におけるＣＡＴ遺伝子発
現の免疫組織化学による証明 脂質キャリア： ＤＤＡＢ：コレステロール＝１：１、
脂質キャリア緩衝液中２０ｍＭで保存。 プラスミド： ｐＺＮ２７ ＤＮＡ：脂質キャリア比： 脂質キャリア：プラスミド
＝５nmol陽イオン性脂質：１μｇＤＮＡ ＤＮＡ投与量： ５％デキストロース水溶液２００μｌ
中１００μｇプラスミドＤＮＡをマウス当たり尾静脈か
らｉｖで注入した。 マウス： ＩＣＲ、メス、２５ｇ。 in vivo で処理したマウスの肺切片におけるＣＡＴタン
パク質を検出するための免疫組織化学染色 （方法） ｐＺＮ２７−ＤＤＡＢ：コレステロール複合体の注入後
４８時間で、肺を取り出し、３３％のＯＣＴ包埋媒体
（ミルス社）で還流し、ＯＣＴ中で包埋してスナップ凍
結した。凍結組織は６μｍに切り、ガラススライド上へ
回収して４℃アセトンで１０分間固定して、その後０.
２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中に配置して膜を透過性
にした。その後、切片を１２〜４８時間、適当な希釈率
でモノクローナル抗ＣＡＴ抗体（アリゾナ大学のパーカ
ー・アンティン(Parker Antin)博士から供与された）又
はネガティブ対照用アイソタイプ抗体と共にインキュベ
ートした。洗浄後、一次抗体に直接対するビオチン化抗
体（ザイメッド社、Ｓ．サンフランシスコ）を６０分間
作用させ、その後、ストレプトアビジン−アルカリホス
ファターゼ複合物（ザイメッド社）を６０分間添加し
た。その後、製造社の取扱書によって酵素標識に好適な
基質色素源を添加した。スライドを検査のために水溶性
マウント用媒体へオーバースライドさせた。 （結果）結果は図１に示され、これは肺の拡散染色を証
明している。染色は肺胞壁に局在し、このことは、肺胞
管壁細胞と共に、Ｉ型及びII型細胞並びに肺胞マクロフ
ァージを含めて７０％を越える肺血管上皮細胞がＤＮＡ
脂質キャリア複合体の単回ｉｖ注入によってトランスフ
ェクトされることを示す。更に、有意な数の細気管支気
道管壁細胞が、ＣＡＴタンパク質に対してポジティブに
染色し、従って、脂質キャリア：ＤＮＡ複合体のｉｖ注
入によってin vivo でトランスフェクトされる。従っ
て、肺の全細胞の大多数がｐＺＮ２７−ＤＤＡＢ：Ｃｈ
ｏｌ複合体のｉｖ注入によってトランスフェクトした。
【００９０】（実施例４） 腹腔投与後のｐＣＩＳ−ＣＡＴの発現 in vivo ＣＡＴ遺伝子発現のレベルにおけるｉｐ注入さ
れたｐＣＩＳ−ＣＡＴ−陽イオン性脂質キャリア複合体
の量の効果 メスＩＣＲマウスを、０.０１、０.１若しくは１μmol
のＤＤＡＢ：ＤＯＰＥ脂質キャリアに複合された各々
０.０１、０.１、１ｍｇのｐＣＩＳ−ＣＡＴ発現プラス
ミドを含む５％デキストロース水溶液１ｍｌで腹腔注入
した。マウスを４８時間後に犠牲死させ、器官を摘出し
てハンドヘルドのホモジナイザを用いて組織を０.２５
Ｍのトリス−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７.８中でホモジナイズ
した。細胞質抽出物を作製しタンパク質含量で基準化し
て、その後、ＣＡＴタンパク質のレベルを測定した。実
験は３匹を１群とし、結果はアセチル化クロラムフェニ
コールの平均ｄｐｍ±ＳＥＭで表す。 （方法）ＤＤＡＢを含む脂質キャリアをＤＯＰＥに対し
て１：１モル比で下記のようにして調製した：クロロホ
ルム溶解ＤＯＰＥ１０μmol とエタノール溶解陽イオン
性脂質１０μmol とを回転式蒸発器で乾燥状態まで蒸発
させた。滅菌水１ｍｌを添加して、混合物を音波粉砕槽
（ラボラトリー・サプライ社、ヒックスビル、ニューヨ
ーク州）中で２０分間音波粉砕した。脂質キャリアは約
１００±２５ｎｍの平均径を有していた。ＣＡＴアッセ
イのために細胞抽出物を作製し、そのタンパク質含量
を、クマジーブルーアッセイ（バイオラド社、リッチモ
ンド、カリフォルニア州）によって測定した。肺、脾
臓、肝臓及び心臓抽出物からの１００μｇのタンパク質
及びリンパ節抽出物からの５０μｇのタンパク質を、既
述（ゴルマン、前出）のように、14Ｃ標識化クロラムフ
ェニコールと反応させて、クロマトグラフィーにかけ
た。ｄｐｍの算出のため、アセチル化物と非アセチル化
物とを共にＴＬＣプレートから切出し、シンチレーショ
ンカウンタで放射物活性を計測した。 （結果）in vivo での潜在的投与量反応性相関を評価す
るために、１群につき３匹の動物に、０.０１μmol 、
０.１μmol 又は１μmol のＤＤＡＢ：ＤＯＰＥ脂質キ
ャリアに複合された各々０.０１ｍｇ、０.１ｍｇ又は１
ｍｇのｐＣＩＳ−ＣＡＴプラスミドを注入した。０.１
ｍｇ及び１ｍｇＤＮＡ投与量は共に、アッセイされた全
ての器官において高い有意なレベル（ｐ＜０.００５）
のＣＡＴタンパク質を生成した。各器官におけるＣＡＴ
遺伝子発現の最高レベルは１ｍｇのＤＮＡ投与量でもた
らされ、ＤＮＡ−脂質キャリア量の１０倍増加は、リン
パ節ＣＡＴレベルを約２倍増加させ、脾臓では３倍増加
させた。 （実施例５） ｐ５′ＰＲＬ３−ＣＡＴ：Ｌ−ＰＥ：ＣＥＢＡ複合体の
静脈（ｉｖ）注入後の脾臓におけるＣＡＴ遺伝子発現の
証明 脂質キャリア： Ｌ−ＰＥ：ＣＥＢＡ＝１：１、脂質キ
ャリア緩衝液に２０ｍＭで保存。 プラスミド： ｐ５′ＰＲＬ３−ＣＡＴ（サカキら、(1
988) Genes and Development 2:1144-1154) ＤＮＡ：脂質キャリア比： 脂質キャリア：プラスミド
＝１nmol陽イオン性脂質：１μｇプラスミドＤＮＡ ＤＮＡ投与量： ５％デキストロース水溶液２００μｌ
中２００μｇのプラスミドＤＮＡをマウス当たり尾静脈
から注入した。 マウス：Ｂａｌｂ／ｃ、メス、２５ｇ （組織摘出手順）尾静脈注入後４８時間で、マウスを犠
牲死させ、全脾臓を１ｍｌの０.２５Ｍのトリス−ＨＣ
ｌ、ｐＨ７.８、５ｍＭのＥＤＴＡ、８０μｇ／ｍｌの
ＰＭＳＦ中にホモジナイズして、得られた抽出物を遠心
分離し、その後上清を３サイクルの凍結−溶解操作に付
し、その後２０分間６５℃に加熱した。
【００９１】（ＣＡＴアッセイ手順）１００μｌの抽出
物＋１０μｌの２０ｍＭアセチルＣｏＡ＋４μｌの14Ｃ
−クロラムフェニコール（２５μＣｉ／ｍｌ、５５ｍＣ
ｉ／mmol、アマシャム社）を共に、３７℃６時間でイン
キュベートした。３時間で、更に１０μｌのアセチルＣ
ｏＡを添加した。
【００９２】（結果）この実験は、有意なレベルのＣＡ
Ｔ活性が処理動物の脾臓抽出物にあったが、脂質キャリ
アのみで注入された動物から得られた対照脾臓の抽出物
にはなかったことを示した。 （実施例６） ＤＯＴＭＡ：ＤＯＰＥ＋ｐＳＩＳ−ＣＡＴプラスミドの
注入は、明らかに検出可能なin vivo におけるＣＡＴ遺
伝子の発現をもたらさない 脂質キャリア： ＤＯＴＭＡ：ＤＯＰＥ＝１：１、５％
デキストロース水溶液中 プラスミド： ｐＳＩＳ−ＣＡＴ（ホァン、Ｍ.Ｔ.Ｆ.
及びＣ.Ｍ.ゴルマン、1990、Nucleic Acids Research 1
8:937-947) 比： 陽イオン性脂質：プラスミド＝４nmol：１μｇ、
投与量：２００μｌの５％デキストロース水溶液中１０
０μｇＤＮＡ マウス： ＩＣＲ、メス、２５ｇ 注入： 尾静脈 （組織採取及び加工処理）マウスを２日目及び６日目で
犠牲死させて、肺、脾臓、肝臓及び心臓を採取した。器
官全体を、肝臓以外は０.５ｍｌの、肝臓は２.０ｍｌ
の、０.２５Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.８、５ｍＭの
ＥＤＴＡ、２μｇ／ｍｌのアプロチニン、１μｇ／ｍｌ
のＥ−６４及び０.５μｇ／ｍｌのロイペプチン（全て
のプロテアーゼ阻害剤はベーリンガーマンハイム社から
購入）中にホモジナイズした。抽出物を３サイクルの凍
結−溶解操作に付し、その後１０分間６５℃に加熱し
た。 （ＣＡＴアッセイ手順）アッセイのための抽出物１００
μｌと０.３μＣｉの14Ｃ−クロラムフェニコール及び
１０μｌの２０ｍＭアセチルＣｏＡとを３７℃で５時間
か２４.５時間かでインキュベートし、その後、該物質
をエチルアセテートを用いて抽出し、ＴＬＣプレート上
で解析した。 （結果）処理動物からの抽出物を、対照動物からのもの
とを比較することによって測定したときに、アセチル化
クロラムフェニコール種は認められなかった。従って、
高レベルのｐＺＮ２７の発現がもたらされるものと同様
の実験上の条件下でｐＳＩＳ−ＣＡＴ発現ベクターの使
用は、in vivo でアッセイされた全ての組織における検
出可能な連結ＣＡＴ遺伝子の如何なる発現も生じない。
in vivo でのｐＳＩＳ−ＣＡＴの発現の欠落は、高レベ
ルのin vivo 発現を発揮するｐＺＮ２７ベクターと比較
すると、異なるプロモーター−エンハンサー要素（ＳＶ
４０）のためか、異なるイントロン配列のためかであろ
う。 （実施例７） ＤＮＡ：脂質キャリア複合体と細胞表面リセプターとの
相互作用 （細胞及び細胞培養）ＣＶ−１（アフリカミドリ猿、肝
臓）、Ｕ９３７（ヒト、骨髄性白血病）、マウス赤白血
病（ＭＥＬ）細胞、及びＫ５６２細胞（ヒト、赤白血病
細胞）をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ン（ロックヴィル、メリーランド州）から得た。ＣＶ−
１及びＭＥＬ細胞を、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）添加
ダルベッコ最少必須培地ＤＭＥ−Ｈ２１中に、３７℃及
び７％ＣＯ2 で維持した。ラット肺胞II型細胞及びラッ
ト肺胞マクロファージを既述のように単離して精製した
（デブス(Debs)ら、Amer.Rev.Respiratory Disease (19
87) 135:731-737 ；ドッブス(Dobbs)、Amer.Rev.Respir
atory Disease (1986) 134:141-145) 。II型細胞を５％
ＦＢＳ添加ＤＭＥ−Ｈ１６中に、３７℃及び７％ＣＯ2
で維持した。２０nmolのＤＯＴＭＡ：ＤＯＰＥ脂質キャ
リアと２０μｇのｐＲＳＶ−ＣＡＴプラスミドＤＮＡと
の複合体を、６０ｍｍファルコンプラスチックディッシ
ュ中で成長している２×106 細胞に添加して（ＳＵＶ及
びＭＬＶのいずれか）、その後１５分から２時間の時点
でのＥＭのために固定した。 （電子顕微鏡のための固定及び処理）ＤＯＴＭＡ脂質キ
ャリアと組織培養中の又は血液若しくは肺胞から新たに
単離した細胞とを、１％シュークロースを含有する０.
１モルのカコジル酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７.４、中
の１.５％グルタルアルデヒドに、１時間室温で固定し
た。タンニン酸及びウラニルアセテート増加の後、組織
をアルコールの段階シリーズ中で脱水し、エポキシ８１
２樹脂（アーネスト Ｆ.フラム(Ernest F.Fullam) イ
ンク社、ラザム、ニューヨーク州）に包埋し、ダイアモ
ンドナイフを用いてＭＴ２ミクロトームにおいて切片を
作製し、８０ｋＶで操作したジョエル１００ＣＸ透過型
電子顕微鏡で試験した。ＣＶ−１サル腎臓細胞中の脂質
複合体の取り込みの電子顕微鏡写真は、図４３〜４８に
示されている。パネル（ａ）中の矢印は、クラスリン被
覆小胞に結合している粒子を示し；パネル（ｂ）中の矢
印は、エンドソーム中に取り込まれ存在している粒子の
場所を示している。
【００９３】プラスミドＤＮＡに複合した単一又は多重
ラメラ脂質キャリアのＤＯＴＭＡ脂質キャリアと種々の
細胞型（ＣＶ−１サル腎臓細胞、Ｕ９３７ヒト骨髄単球
白血病細胞、Ｋ５６２、ＭＥＬ赤芽球白血病細胞、ラッ
ト肺胞マクロファージ及びII型肺胞細胞）との高頻度相
互作用は、脂質キャリア付着と典型的な被覆小胞経路に
おけるインターナライゼーションのものである（図４３
〜４８）。この相互作用は、リセプター仲介エンドサイ
トシスのよく研究された例に共通しているものである。
陽イオン性脂質キャリア：ＤＮＡ複合物と接触するよう
に見える全ての細胞は、形質膜への結合後に該複合物を
取り込む。これらの全ての細胞型（げっ歯類、サル及び
ヒト細胞由来）は、同一のインターナライゼーションの
伝統的なリセプター仲介エンドサイトシス経路を証明す
る。ＤＮＡ−陽イオン性リポソーム複合体は、一般に、
非ヒト及び同様の系統にある特定のげっ歯類細胞と同じ
位又はそれ以上に、ヒト細胞によって取り込まれる。 （実施例８） マウスＴリンパ球がin vivo でトランスフェクトされる
ことの証明 メスＩＣＲマウスに、１μmol のＤＤＡＢ：ＤＯＰＥ
（１：１モル、ＳＵＶ）脂質キャリアに複合化されたｐ
ＺＮ２７プラスミド１mgを含む５％デキストロース水溶
液１ｍｌをｉｐ注入した。マウスを４８時間後に犠牲死
させ、脾臓及びリンパ節を摘出し、血清含有培養液中で
ホモジナイズすることによって単細胞懸濁液にした。そ
の後、細胞をＦＩＴＣ結合抗Ｔｈｙ−１.２抗体（Ｊ．
ベック博士、サンフランシスコ退役軍人局医学センター
から入手）と共にインキュベートしてＦＡＣＳでソート
（選択分離）した。Ｔｈｙ−１.２+ Ｔリンパ球分画を
顕微鏡スライド上にサイトスパンして固定し、０.２５
％のトライトンＸ−１００を用いて細胞を透過性にした
後に内在化ＣＡＴタンパク質の存在について釣り上げ
た。細胞を抗ＣＡＴモノクローナル抗体（Ｐ．アンティ
ン(Antin) 博士、アリゾナ大学からの贈与）と共に、２
０℃でインキュベートして、その後、テキサスレッド結
合ヤギ抗マウスＩｇＧで１時間、２０℃で染色した。図
３は、位相差顕微鏡によるＴリンパ球の視野を示し、図
４は、蛍光顕微鏡による同一視野が示されている。これ
らの結果は、７０％以上のＴｈｙ−１.２+ Ｔリンパ球
が、ｐＺＮ２７：ＤＤＡＢ：ＤＯＰＥ複合体の１回のｉ
ｐ注入によって、in vivo でトランスフェクトされる
（赤い蛍光によって示されるように）ことを証明してい
る。未処理マウスからのＴｈｙ−１.２+ リンパ球は、
図６に示されているように免疫蛍光染色を示さない；同
一視野の位相差顕微鏡写真は２Ｃに示されている。 （実施例９） マウス造血系骨髄由来細胞がin vivo でトランスフェク
トされることの証明 メスＩＣＲマウスに、１μmol のＤＤＡＢ：ＤＯＰＥ
ＳＵＶ脂質キャリアに複合化されたｐＺＮ２７プラスミ
ド１mgを含む５％デキストロース水溶液１ｍｌをｉｐで
注入した。マウスを４８時間後に犠牲死させ、それか
ら、ＲＰＭＩ−１６４０培地で大腿腔を洗い流すことに
よって骨髄由来造血細胞を得て、その後、小塊をホモジ
ナイズして単細胞懸濁液を得た。その後、骨髄細胞をガ
ラススライド上に向けて遠心し、実施例８で記述したよ
うに蛍光染色した。この実験では、約２０％のマウス骨
髄造血細胞（形態に基づいた初期の骨髄芽球及び赤芽球
前駆体細胞である細胞を含む）が、ｐＺＮ２７：ＤＤＡ
Ｂ：ＤＯＰＥ複合体の１回のｉｐ投与によって、in viv
o でトランスフェクトされたことを証明した。 （実施例１０） 正常ドナーから新たに単離されたヒトＣＤ４+ Ｔ細胞が
in vitro でトランスフェクトされることの証明 バフィコート調製物を、密度勾配遠心分離によって正常
ヒトドナーから新たに単離した。その後、細胞を抗ＣＤ
３（ベクトン−ディッキンソン社、マウンテンデュー、
カリフォルニア州）モノクローナル抗体を用いてパニン
グしてＣＤ３+Ｔリンパ球分画を単離した。その後、こ
れらの細胞を下記のプロトコールを用いてトランスフェ
クトした；即ち、１０×106 の細胞を１００mmのディッ
シュ上に置き、その後、５０nmolのＤＤＡＢ：ＤＯＰＥ
（１：１）ＳＵＶ脂質キャリアに複合化された２５μｇ
のｐＺＮ２７を４８時間添加した。対照群の細胞は、ト
ランスフェクトされなかった。その後、この細胞を、Ｆ
ＩＴＣ結合モノクローナル抗ＣＤ４抗体（ベクトン−デ
ィッキンソン社）とインキュベートしてＦＡＣＳにより
ソートした。得られたＣＤ４+ Ｔリンパ球を、顕微鏡ス
ライド上にサイトスパンして固定し、０.２５％のトラ
イトンＸ−１００を用いて細胞を透過性化した後、細胞
内ＣＡＴタンパク質の存在について釣り上げた。細胞
を、抗ＣＡＴモノクローナル抗体で１時間２０℃でイン
キュベートして、テキサスレッド結合ヤギ抗マウスＩｇ
Ｇを用いて１時間２０℃で染色した。
【００９４】結果は図９、１０に示されており、これ
は、少なくとも７０％の新たに単離されたヒトＣＤ４+
Ｔリンパ球が、図４Ｂで細胞の赤い蛍光によって示され
るように、培養系でｐＺＮ２７：ＤＤＡＢ：ＤＯＰＥ複
合体に晒された後トランスフェクトされたことを証明し
ている。対照群の未処理細胞は蛍光を示さなかった。こ
れらの結果は、この手段が、ＡＩＤＳ及び癌を含む疾患
の治療を劇的に改良し得ることを示唆している。
【００９５】上記の結果が示すように、高レベルの注入
遺伝子発現が、全身性（ｉｖ又はｉｐ）の注入遺伝子投
与後に、心臓、腎臓、リンパ節、骨髄細胞、肝臓、肺及
び脾臓において達成された。成人への全身性（ｉｖ又は
ｉｐ）注入遺伝子投与後の独立した心臓、腎臓、リンパ
節又は骨髄細胞のトランスフェクションは、以前には達
成されていない。ＤＮＡの全身性投与によるＴリンパ
球、肺気道若しくは肺胞細胞型、冠状内皮管壁細胞及び
冠状筋肉細胞、並びに、骨髄造血系前駆体細胞のin viv
o でのトランスフェクションは、以前に示されていな
い。特に、５０％を越えるＴリンパ球、肺気道上皮、肺
胞及び血管内皮細胞型、冠状内皮管壁細胞及び骨髄造血
前駆体細胞（約７０％の芽細胞を含む）は、ＣＡＴ発現
プラスミド−陽イオン性脂質キャリア複合体の１回のｉ
ｖ若しくはｉｐ注入の後に、in vivoでトランスフェク
トされる。全ての単一組織中に存在する高パーセントの
全細胞のトランスフェクションは、以前には報告されて
いなかった。 （実施例１１） ＤＮＡの陽イオン性リポソーム仲介送達を用いた種々の
ヒト肺癌細胞株の効率的なトランスフェクション （方法） 細胞培養： ＮＣＩ−Ｈ６９、ＮＣＩ−Ｈ８２及びＮＣ
Ｉ−Ｈ５２０細胞を用いた。Ｈ６９及びＨ５２０細胞
を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＲＰＭＩ−１
６４０中で成育させ、Ｈ８２細胞を、１０％ＦＢＳ含有
のダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥ）−Ｈ２１中で成育
させた。 リポソーム調製： リポソームは下記のようにして調製
した。即ち、クロロホルム（又はエタノール（ＤＤＴＭ
Ａ））に懸濁された総量４μmol の脂質を、回転式エバ
ポレータで乾燥状態まで蒸発させた。５０ｍＭのトリ
ス、０.５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０
０μＭのＺｎＣｌ2 緩衝液１ｍｌを２０mmolの脂質毎に
添加し、混合物を音波処理槽（ラボラトリー・サプライ
社、ヒックスビル、ニューヨーク州）中で２０分間音波
処理した。得られたリポソームは、約１００±２５ｎｍ
の平均直径である。下記のリポソーム調製物を用いた。
即ち、精製ＤＯＴＭＡ、２〜１モル比のＤＯＴＭＡ：コ
レステロール、精製Ｌ−ＰＥ又は６〜４モル比のＬ−Ｐ
Ｅ：ＣＥＢＡであった。 細胞性トランスフェクション： 細胞のトランスフェク
ションのために、４ｍｌの無血清培地中の２×106 の細
胞を１００mmのプラスチックディッシュ（ファルコン
社、オックスナード、カリフォルニア州）に置いた。プ
ラスミドＤＮＡ−リポソーム複合体を、まず、１）ＤＮ
Ａに、その後、２）リポソームに添加して、ゆっくりと
混合することによって調製した。その後、該混合物を１
ｍｌの無血清培地に懸濁して、細胞へ添加した。４時間
後に、細胞を２回洗浄し、１０ｍｌの血清含有培地に再
懸濁し、続いて４４時間後に採取した。採取の直前に、
細胞を２回洗浄し、その後、このプレートをラバーポリ
スマンで掻き取った。細胞を１０００×ｇで５分間遠心
分離して、０.１３５ｍｌの０.２５Ｍのトリス緩衝液、
ｐＨ７.５、５ｍｌのＥＤＴＡを各沈殿物に添加した。
細胞を３回、凍結溶解して、６５℃で１０分間加熱し、
１２５００×ｇで１０分間回転させた。上清をタンパク
質についてアッセイし、試料当たり２０μｇの上清タン
パク質を用いて、実施例４で記述したようにＣＡＴ活性
を測定した。 （結果）結果は、２つの異なるヒト小細胞肺癌細胞（Ｈ
６９及びＨ８２）並びに偏平上皮細胞肺癌株（Ｈ５２
０）の高レベルのトランスフェクションに対する陽イオ
ン性リポソームの仲介能を証明している。３つの株の全
ては、３つの異なる陽イオン性リポソーム配合物に対し
て複合化した場合に、ＲＳＶ−ＣＡＴによってかなり効
率的にトランスフェクトされた（図８９）。これらヒト
細胞株は、比較条件下でトランスフェクトされたげっ歯
類の腫瘍細胞株と同等又はそれよりも効率的にトランス
フェクトされた。 （実施例１２） 陽イオン性脂質キャリア：ＤＮＡ複合体の静脈注入によ
るマウスにおける肺癌細胞のトランスフェクション マウス： Ｃ５７／ｂｌａｃｋ ６、メス、２５ｇ 癌： Ｂ１６、肺に対してかなり転移性であるマウスメ
ラノーマ株である。該細胞株を、５％ウシ胎児血清を添
加したＰＲＭＩ １６４０中で成育させた。 脂質キャリア： ＤＯＴＡＰ：コレステロール＝１：
１、５％デキストロース水溶液中１０ｍＭ プラスミド： ｐＺＮ２０ 比： 陽イオン性脂質：ＤＮＡ＝６nmol：１μｇ、２０
０μｌの５％デキストロース水溶液中に１００μｇを、
マウス毎に尾静脈から注入した。 マウスへの癌細胞株の接種及びＣＡＴ発現プラスミド−
陽イオン性脂質キャリア複合体の投与：Ｂ１６細胞をト
リプシン処理してプレートから剥がし、マウス当たり５
００００細胞を尾静脈へ静脈注入で各マウスに接種し
た。接種後２週間で、陽イオン性脂質キャリア−ＤＮＡ
複合体を尾静脈から注入した。肺を注入後４８時間で採
取してドライアイス−エタノール槽中の凍らせた３３％
のＯＣＴで浸潤させ、凍結切片にして、細胞内ＣＡＴタ
ンパク質を検出するために免疫組織化学的解析のために
処理した。 免疫組織学的解析 （手順）器官を取り出し、適当に整えて、ＯＣＴ中に包
埋し、スナップ凍結した。凍結組織を６μｍで切片にし
て、ガラススライド上に集めて４℃アセトン中で１０分
間固定して、その後、０.２％トライトンＸ−１００に
置いて透過性化した。その後、切片を１２−４８時間、
モノクローナル抗ＣＡＴ抗体と又はアイソタイプ陰性対
照抗体と共に、適当な希釈率でインキュベートした。洗
浄後、一次抗体に対するビオチン化抗体（ザイメッド
社、Ｓ．サンフランシスコ）を最低６０分間添加し、ス
トレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体（ザイメッ
ド社）を６０分間加えて、その後、用いた酵素標識に適
当な基質−色素源を適用した。その後、スライドを希釈
ヘマトキシリン中で対応染色して、又は未染色のまま
で、検査のために水溶性マウント媒体中でカバーガラス
を載せた。 （結果）免疫組織化学的解析は図４９〜５１に示されて
おり、これはＢ−１６メラノーマ肺腫瘍（図４９、矢印
で表示）と管内腫瘍塞栓（図５０、矢印で表示）とは、
ＤＮＡ−脂質キャリア複合体のｉｖ注入後に効率的にト
ランスフェクトされることを証明している。肺腫瘍と管
内腫瘍塞栓とは共に強く染色されており、in vivo で効
率よい広汎性トランスフェクションを示している。腫瘍
発生マウスは、ＤＮＡ−脂質キャリア複合体の注入を受
けてないが、肺又は全ての肺腫瘍細胞にＣＡＴ活性が示
されていない（図５１）。クローン化した遺伝子の全身
性投与による哺乳宿主内に存在する腫瘍のトランスフェ
クト能は、以前には証明されていなかった。 （実施例１３） ｐＺＳＮ２７のみ又はｐＺＮ２７：ＤＤＡＢ：コレステ
ロールＳＵＶ複合体の静脈（ｉｖ）注入後の、多重組織
における高レベルＣＡＴ遺伝子発現の証明 脂質キャリア： ＤＤＡＢ：コレステロール＝１：１、
５％デキストロース水溶液中１０ｍＭで保存。５％デキ
ストロースを乾燥脂質形態に添加後、ＳＵＶを２０分間
音波処理槽中で音波処理して調製した。 プラスミド： ｐＺＮ２７ ＤＮＡ：脂質キャリア比： 陽イオン性脂質：プラスミ
ドＤＮＡ＝５nmol：１μｇＤＮＡ ＤＮＡ投与量： ｐＺＮ２７のみ： 個々のマウスは、尾静脈注入により
５％デキストロース水溶液２００μｌ中のｐＺＮ２７
を、５００μｇ、１ｍｇ、２ｍｇ又は５００μｇ、４時
間後に２回目の５００μｇ投与量で受けた。
【００９６】脂質キャリアに複合化したｐＺＮ２７：
２００μｌの５％デキストロース水溶液中の５００nmol
のＤＤＡＢ：コレステロールＳＵＶ脂質キャリアに複合
化された１００μｇのプラスミドＤＮＡを、マウス当た
り尾静脈により注入した。 マウス： ＩＣＲ、メス、２５ｇ。 （組織抽出方法）各器官を０.３ｍｌの０.２５Ｍ トリ
ス−ＨＣｌ、ｐＨ７.８、５ｍＭ ＥＤＴＡ中にホモジナ
イズして、得られた抽出物を遠心分離し、その後、上清
を３回、凍結−溶解操作にかけ、その後、６５℃で２０
分間加熱した。 ＣＡＴアッセイ方法： 各組織抽出物のタンパク質濃度
を、クマジーブルー主体タンパク質アッセイ（バイオ・
ラド社、リッチモンド）を用いて定量し、各組織抽出物
からの等量の総タンパク質を、３７℃１３時間、１０μ
ｌの２０ｍＭアセチルＣｏＡ＋１２μｌの14Ｃ−クロラ
ムフェニコール（２５μＣｉ／ｍｌ、５５ｍＣｉ／mmo
l、アマシャム社）と共に、ＣＡＴアッセイに添加し
た。 （結果）かなりのレベルのＣＡＴ遺伝子発現が、ｐＺＮ
２７のみ、又はＤＤＡＢ：コレステロール脂質キャリア
に複合化されたｐＺＮ２７の注入後に、アッセイされた
６つの異なる組織（肺、心臓、肝臓、腎臓、脾臓及びリ
ンパ節）の各々で示された。裸の発現プラスミドの全身
性投与後に、in vivo での多重組織における注入遺伝子
の発現は以前に証明されていなかった。 （実施例１４） ＣＭＶ−インターロイキン−２遺伝子と複合化した陽イ
オン性脂質キャリアの静脈注入によるマウスの脾臓及び
リンパ節での高レベルのヒトインターロイキン−２の誘
導 マウス： Ｃ５７／Ｂｌａｃｋ ６、メス、２５ｇ 癌： Ｂ１６、肺に対してかなり転移性であるマウスメ
ラノーマ株である。該細胞株を、５％ウシ胎児血清を添
加したＰＲＭＩ １６４０中で成育させた。 脂質キャリア： ＤＤＡＢ：コレステロール＝１：１、
５％デキストロース水溶液中１０ｍＭで保存。 プラスミド： ｐＺＮ４６（ヒトインターロイキン−２
をコード化する配列に融合されたＨＣＭＶプロモータエ
ンハンサー） 比： 陽イオン性脂質：ＤＮＡ＝注入当たりに投与され
た２００μｌの５％デキストロース水溶液中、５nmol：
１μｇＤＮＡ （腫瘍細胞株のマウスへの接種とヒトインターロイキン
−２発現プラスミド−陽イオン性脂質キャリア複合体の
投与）Ｂ１６細胞をトリプシン処理してプレートから剥
がし、５×104 細胞を尾静脈へ静脈注入によって各マウ
スに接種した。腫瘍細胞注入後２日目に開始して、陽イ
オン性脂質キャリア−ＤＮＡ複合体を週に２回で合計２
週間、尾静脈から注入した。動物を腫瘍細胞注入の２週
間後に犠牲死させ、脾臓及びリンパ節を摘出し、組織粉
砕器を用いて単細胞懸濁液にして、その後、３７℃の培
養器中で１００ｍｍのプラスチックディッシュにＲＰＭ
Ｉ−１６４０、１０％ウシ胎児血清中で２４時間培養し
た。２４時間後に、上清を回収して、上清中のヒトイン
ターロイキン−２の濃度をヒトＩＬ−２ ＥＬＩＳＡを
用いて測定した。 （結果）ｐＺＮ４６−ＤＤＡＢ：コレステロール脂質キ
ャリア複合体を注入したマウスからの脾臓細胞懸濁液中
には、１００ｐｇ／ｍｌのヒトＩＬ−２／ｍｌが、リン
パ節細胞懸濁液には９１ｐｇ／ｍｌのＩＬ−２が存在し
ていた。ヒトＩＬ−２は、Ｂ−１６メラノーマ細胞の同
一の注入を受けたが、ｐＺＮ４６−ＤＤＡＢ：コレステ
ロール脂質キャリア複合体の注入を受けなかったマウス
由来の脾臓細胞又はリンパ節細胞懸濁液には検出されな
かった。従って、ＨＣＭＶ発現プラスミドにおけるＣＡ
Ｔ遺伝子コード領域に対するヒトＩＬ−２遺伝子コード
領域の置換は、マウスにおけるin vivo でのＩＬ−２遺
伝子の高レベルでの発現と産生型ヒトＩＬ−２タンパク
質の大量の生成とをもたらした。 （実施例１５） ｐＺＮ３２：陽イオン性脂質キャリア複合体のｉｖ投与
によって処置されたマウスにおけるヒトＣＦＴＲ遺伝子
の高レベル発現の誘導 マウス： ＩＣＲ メス、２５ｇ 脂質キャリア： ＤＤＡＢ：コレステロール＝１：１
ＳＵＶ、５％デキストロース水溶液中１０ｍＭ。 プラスミド： ｐＺＮ３２（ヒトＣＦＴＲコード配列に
融合されたＨＣＭＶプロモータエンハンサー） 比： 陽イオン性脂質：ＤＮＡ＝５nmol：１μｇプラス
ミドＤＮＡ 投与量： ｉｖ尾静脈注入当たり投与された２００μｌ
の５％デキストロース水溶液中、総量１００μｇのプラ
スミドＤＮＡ （方法）注入後４８時間で、マウスを犠牲死させ、肺を
摘出して整え、ＯＣＴに包埋して、スナップ凍結した。
凍結組織を６μｍの切片にして、ガラススライド上に集
め、４％アセトン中で１０分間固定した。その後、ＣＦ
ＴＲの免疫局在をアフィニティ精製ウサギモノクローナ
ル抗ＣＦＴＲ抗体、α−1468、コーン(Cohn)ら、(1991)
Biochem.Biophs.Res.Comm. 181:36-43)を用いて行っ
た。この方法は、下記の変更を有するが、マリノ(Marin
o)ら、(1991) J.Clin.Invest.88:712に記載されている
ものと同一であった。洗浄後、ウサギポリクローナル抗
体に対するビオチン化抗体（ザイメッド）を、６０分間
添加し、その後、ストレプトアビジンホスファターゼ複
合体（ザイメッド）を６０分間添加して、その後、基質
−色素源を添加した。それから、スライドに、検査のた
めに水溶性マウント媒体中でカバーガラスを載せた。 （結果）ｐＺＮ３２−ＤＤＡＢ：コレステロール（１：
１）リポソーム複合体についてｉｖ注入した後４８時間
のマウス肺と未処理対照群の肺との凍結切片の顕微鏡写
真（違う倍率の視野）を図５９〜６３に示す。ポリクロ
ーナル抗ＣＦＴＲ抗体、α1468による強い染色によって
示されるように、圧倒的多数の気道が、ヒトＣＦＴＲ遺
伝子によってトランスフェクトされた。図５９、６１及
び６３を参照のこと。視覚的検査により、トランスフェ
クトされた気道中の本質的に全ての細胞が陽性に染ま
り、これは、気道細胞の圧倒的多数が、処理されたＤＤ
ＡＢ：コレステロール（１：１）リポソームに複合化さ
れたｐＺＮ３２の１回の投与で、in vivo でヒトＣＦＴ
Ｒ遺伝子によりトランスフェクトされ、対照動物は組織
学的に区別できないことを証明している。ヒトＣＦＴＲ
遺伝子の顕著な発現は、ＤＤＡＢ−コレステロール
（１：１）リポソームに複合化されたｐＺＮ３２の１回
のｉｖ投与後少なくとも６０日で、マウス肺において、
少なくとも５０％の全ての気道及び、少なくとも５０％
の全ての気道管壁細胞（視覚的検査）に存在する対照動
物からのマウス肺の凍結切片（図６０及び６２）は、Ｃ
ＦＴＲについて如何なる検出可能な染色も示さず、これ
は、図５９、６１及び６３に示されているＣＦＴＲ発現
全てが、ヒトＣＦＴＲ遺伝子による肺細胞のトランスフ
ェクションのためであることを証明している。
【００９７】上記の結果に示されるように、１回のｉｖ
投与の発現コンストラクトは、対象となる遺伝子を含む
と共に、陽イオン性リポソームに複合化されたものであ
り、これは、肺の誘導気道に沿った細胞の殆どをトラン
スフェクトし、該遺伝子産物は、少なくとも６０日間肺
に存在し、この発現は、気道細胞に特異的のようであ
り、暴露後に損傷の組織的な証拠は認められない。これ
は、リポソームが十分に寛容化されて、非免疫原性であ
るので重要である。更に、複合化されたｐＺＮ３２：Ｄ
ＤＡＢ−コレステロール（１：１）の静脈注入で処理さ
れたマウスの外見、挙動及び寿命は、正常のようであ
り、未処理の正常対照マウスと何ら区別することができ
ない。これらの動物からの広範囲の組織の外見、挙動、
寿命及び詳細な組織学的解析の解析により証明されるよ
うに、この毒性の欠如は、ｐＺＮ３２−ＤＤＡＢ：コレ
ステロール複合体のin vivo 送達によりもたられる毒性
の欠如を証明している。更に、ＤＮＡ／リポソーム複合
体の反復ｉｖ投与の影響は、効果的且つ非毒性である。
ｉｖ注入による陽イオン性リポソーム仲介ＤＮＡ送達
は、in vivo で高レベルで肺特異性注入遺伝子発現をも
たらす。 （実施例１６） 異なるＣＡＴ遺伝子含有プラスミドの静脈注入後の肺及
び肝臓におけるＣＡＴ遺伝子発現の証明 脂質キャリア： ＤＤＡＢ：コレステロール＝１：１
５％デキストロース水溶液中５ｍＭで保存。 プラスミド： プラスミドは以下に示す。 ＤＮＡ−脂質キャリア比： 陽イオン性脂質：プラスミ
ドＤＮＡ＝１nmol：１μｇ 投与量： ｉｖ尾静脈注入により静脈注入された２００
μｌ容量中、１００μｌ のＤＮＡ マウス： ＩＣＲ メス、２５ｇ （方法）動物を注入後２４時間で犠牲死させた。組織抽
出方法及びＣＡＴアッセイは、ＣＡＴアッセイを３時間
３７℃でインキュベートして、２.０ｍＭのパラオキソ
ン（ライ(Lai) ら、(1988) Carcinogenesis 9:1295-130
2)を肝臓試料に添加した以外は、実施例４で記述したよ
うにした。結果を図７１に示す。レーン１−１２は肺試
料であり、レーン１３−２４は肝臓試料である。レーン
１、２、１３、１４はｐＺＮ５１；レーン３、４、１
５、１６はｐＺＮ６０；レーン５、６、１７、１８はｐ
ＺＮ６１；レーン７、８、１９、２０はｐＺＮ６２；レ
ーン９、１０、２１、２２はｐＺＮ６３；レーン１１、
１２、２３、２４はｐＺＮ２７である。 （結果）ｐＺＮ５１はイントロンを含まないものであ
り、これはコード配列の３’又は５’側のいずれかのイ
ントロンを含むプラスミドと同様に又はそれ以上に発現
する。 （実施例１７） ＣＭＶ−ＣＡＴ−リポソーム又はＣＦＴＲ−ＣＡＴ−リ
ポソーム複合体の各ｉｖ注入によってもたらされる広汎
性ＣＡＴ遺伝子と組織及び細胞型特異性ＣＡＴ遺伝子の
各発現 マウス： ＩＣＲ メス、２５ｇ リポソーム： ＤＤＡＢ：コレステロール＝１：１ Ｓ
ＵＶ、５％デキストロース水溶液中１０ｍＭ。 プラスミド： １）ｐＺＮ２７又は、２）ｐＢＥ３.８
ＣＡＴ（構築は、チュウ(Chou)ら、(1991) J.Biol.Che
m. 266:24471-24476 を参照のこと) （実験条件）１群につき３匹のマウスに、（ａ）未処
理、又は（ｂ）ＣＡＴ遺伝子に融合されたヒトＣＦＴＲ
遺伝子の５’上流側領域の３.８ｋｂ配列１００μｇに
複合化されたＤＤＡＢ：コレステロールリポソームの１
回のｉｖ尾静脈注入、又は（ｃ）ｐＺＮ２７を与えた。
マウスを２４時間後に犠牲死させ、実施例４で記述した
ように、肺、肝臓、脾臓、リンパ節、腎臓及び心臓にお
いてＣＡＴ活性をアッセイした。各群のマウス各々のか
らの肺切片の免疫組織化学的解析を、実施例３で記述し
たように実施した。 （結果）これらのマウスからの凍結肺切片の免疫組織化
学染色は、ＣＭＶ−ＣＡＴリポソーム複合体のｉｖ注入
が高レベルの赤い染色をもたらすことを示し、これは、
肺内部の内皮、肺胞及び気道細胞におけるＣＡＴ遺伝子
発現を示している（図７２）。これに対して、ＣＦＴＲ
−ＣＡＴ−リポソーム複合体は、気道上皮細胞に主とし
て局在化したＣＡＴ遺伝子発現をもたらした（図７
３）。これは、in situ ハイブリダイゼーション研究に
よって検出されたように（トレザイズ(Trezise)とブッ
チワルド(Buchwaod)、(1991) Nature 353:434-437)、ラ
ット肺における内因性ＣＦＴＲ遺伝子発現のパターンに
近似している。未注入マウスからの肺切片は、赤い染色
を示さず、これは，ＣＡＴ遺伝子発現がトランスフェク
トされた細胞にのみ存在することを示している（図７
４）。図７５は、ＣＭＶ−ＣＡＴ処理マウスからの肺胞
の高倍率の顕微鏡写真であり、これは肺胞細胞と肺内皮
細胞との両方で高レベルのＣＡＴ遺伝子発現を示してい
る。ＣＦＴＲ−ＣＡＴ処理マウスからの肺胞の高倍率の
顕微鏡写真（図７６）は、肺胞でも内皮細胞でも顕著な
ＣＡＴ遺伝子発現が認められないことを示し、これは、
ＣＦＴＲプロモータが注入遺伝子発現の標的を気道上皮
細胞にしていることを示している。これは、ｉｖ注入後
に、広汎性と用いられた調節要素に依存した細胞型特異
的様式とのいずれかで、マウス肺内部において注入遺伝
子を発現することができることの、最初の証明である。
【００９８】ＣＡＴアッセイは、ＣＭＶ−ＣＡＴが、
肺、肝臓、心臓、脾臓、リンパ節及び腎臓において顕著
なＣＡＴ遺伝子発現をもたらし、一方、ＣＦＴＲ−ＣＡ
Ｔが肺特異的遺伝子発現をもたらすことを証明した。各
組織のオートラジオグラフ解析の写真は、図７７〜８２
に示されている。従って、ＣＭＶプロモータは広範囲の
組織における連結遺伝子の発現を誘導し、一方、ヒトＣ
ＦＴＲ遺伝子の５’フランキング領域は、ｉｖリポソー
ム主体投与後に、組織特異性注入遺伝子発現に指向す
る。 （実施例１８） プラスミドのみのｉｖ注入と、脂質キャリアと複合化さ
れたプラスミドのｉｖ注入に注目したトランスフェクシ
ョンの比較 ｐＺＮ２７のみの静脈（ｉｖ）注入後のin vivo での広
範囲、高レベルのＣＡＴ遺伝子発現の証明 プラスミド： ｐＺＮ２７ ＤＮＡ：脂質キャリア比： リポソームを用いないでプ
ラスミドＤＮＡのみを注入した。 ＤＮＡ投与量：５％デキストロース水溶液２００μｌ中
１ｍｇのプラスミドＤＮＡを、マウス当たり尾静脈から
４時間にわたって２回注入した。マウスを２４時間後に
犠牲死させ、１７の異なる組織をＣＡＴ遺伝子活性につ
いてアッセイした。 マウス： ＩＣＲ、メス、２５ｇ （組織抽出方法）各器官を０.３ｍｌの０.２５Ｍ トリ
ス−ＨＣｌ、ｐＨ７.８、５ｍＭ ＥＤＴＡ中にホモジナ
イズして、得られた抽出物を遠心分離し、その後、上清
を３回、凍結−溶解操作にかけ、その後、６５℃で２０
分間加熱した。 （ＣＡＴアッセイ方法）各組織抽出物のタンパク質濃度
を、ニンヒドリン主体タンパク質アッセイ（バイオ・ラ
ド社、リッチモンド）を用いて定量し、各組織抽出物か
らの等量の総タンパク質を、３７℃１３時間、１０μｌ
の２０ｍＭアセチルＣｏＡ＋１２μｌの 14Ｃ−クロラム
フェニコール（２５μＣｉ／ｍｌ、５５ｍＣｉ／mmol、
アマシャム社）と共に、ＣＡＴアッセイに添加した。 （結果）この実験のオートラジオグラフは、図８６に示
されている。対照レベル（レーン１）と比較して、ｐＺ
Ｎ２７のみのｉｖ注入は、下記の組織において、かなり
高レベルのＣＡＴ遺伝子発現をもたらした：肺、胸腺、
食道、心臓、肝臓、脾臓、胃、小腸、盲腸、卵巣、膣、
骨格筋、膵臓及びリンパ節。従って、ｐＺＮ２７発現プ
ラスミドのみのｉｖ注入は、体内のかなり多種多様な組
織を効率的にトランスフェクトすることができる。 ＤＤＡＢ：コレステロール（１：１）リポソームに複合
化されたｐＺＮ２７の静脈（ｉｖ）注入後のin vivo に
おける広範囲、高レベルのＣＡＴ遺伝子発現の証明 プラスミド： ｐＺＮ２７ リポソーム： ＤＤＡＢ：コレステロール＝１：１、５
％デキストロース水溶液中１０ｍＭで保存 ＤＮＡ：脂質キャリア比： リポソーム：プラスミド、
５nmol：１μｇ ＤＮＡ投与量：５％デキストロース水溶液２００μｌ中
１００μｇのプラスミドＤＮＡを、マウス当たり尾静脈
から注入した。マウスを２４時間後に犠牲死させ、１７
の異なる組織をＣＡＴ遺伝子活性についてアッセイし
た。 マウス： ＩＣＲ、メス、２５ｇ （組織抽出方法）各器官を０.３ｍｌの０.２５Ｍ トリ
ス−ＨＣｌ、ｐＨ７.８、５ｍＭ ＥＤＴＡ中にホモジナ
イズして、得られた抽出物を遠心分離し、その後、上清
を３回、凍結−溶解操作にかけ、その後、６５℃で２０
分間加熱した。 （ＣＡＴアッセイ方法）各組織抽出物のタンパク質濃度
を、ニンヒドリン主体タンパク質アッセイ（バイオ・ラ
ド社、リッチモンド）を用いて定量し、各組織抽出物か
らの等量の総タンパク質を、３７℃１３時間、１０μｌ
の２０ｍＭアセチルＣｏＡ＋１２μｌの 14Ｃ−クロラム
フェニコール（２５μＣｉ／ｍｌ、５５ｍＣｉ／mmol、
アマシャム社）と共に、ＣＡＴアッセイに添加した。 （結果）この実験のオートラジオグラフは、図８７に示
されている。対照レベル（レーン１）と比較して、ｐＺ
Ｎ２７：ＤＤＡＢ：コレステロール複合体のｉｖ注入
は、下記の組織において高レベルのＣＡＴ遺伝子発現を
もたらした：肺、胸腺、食道、心臓、肝臓、脾臓、胃、
小腸、大腸、盲腸、子宮、卵巣、膣、骨格筋、膵臓及び
リンパ節。従って、ｐＺＮ２７：ＤＤＡＢ：コレステロ
ール複合体のｉｖ注入は、体内のかなり多種多様な組織
を効率的にトランスフェクトすることができる。 （実施例１９） ＧＭ−ＣＳＦ発現プラスミド−陽イオン性リポソーム複
合体のｉｖ注入は、顕著な抗腫瘍効果をもたらす マウス： Ｃ５７／ｂｌａｃｋ ６、メス、２５ｇ 癌： Ｂ１６、肺に対してかなり転移性であるマウスメ
ラノーマ株である。該細胞株を、５％ウシ胎児血清を添
加したＰＲＭＩ １６４０中で成育させた。
【００９９】リポソーム： ＤＤＡＢ：コレステロール
＝１：１、５％デキストロース水溶液中１０ｍＭで保
存。２５０００のＢ−１６細胞を尾静脈からｉｖ注入し
た。
【０１００】プラスミド： ｐＺＮ８４（図８３、８４
に示されるように、マウスＧＭ−ＣＳＦコード配列に融
合されたＨＣＭＶプロモータエンハンサー） 比： 陽イオン性脂質：ＤＮＡ＝５nmol：１μｇ。５％
デキストロース水溶液２００μｌ中、合計１００μｇの
プラスミドＤＮＡを注入毎に投与した。 （実験概略）１群につき８匹のマウスは、２.５×104
のＢ−１６ミラノーマ細胞のｉｖ尾静脈注入を１回受け
た。グループ１は未処理であり、グループ２はＤＤＡ
Ｂ：コレステロールリポソームに複合化されたｐＺＮ８
４１００μｇを週２回受け、実験は腫瘍細胞注入の４日
前に始めて、腫瘍注入後２週間まで続けた。全てのマウ
スを腫瘍注入後３週間で犠牲死させ、表面肺腫瘍節は黒
色であり、解剖顕微鏡を用いて顕微鏡上でカウントし
た。 （結果）対照マウスは肺当たり６４.５±１９.７（Ｓ.
Ｅ.Ｍ.)の小節を有していた。これに対して、ＧＭ−Ｃ
ＳＦ−リポソーム処理動物は、肺当たり１１.９±３.６
（ステューデントのｔ試験による評価で対照群に対して
ｐ＜０.０１）の腫瘍小節を有していた。従って、サイ
トカイン遺伝子のｉｖ注入は、かなり顕著な抗腫瘍効果
をもたらした。これは、遺伝子のｉｖ注入が抗腫瘍活性
をin vivo でもたらすことができることの最初の証明で
ある。 （実施例２０） ＤＤＡＢ：コレステロール（１：１）リポソームに複合
化されたｐＺＮ８４のヤギへの静脈（ｉｖ）注入後のin
vivo での延長された高レベルのマウスＧＭ−ＣＳＦ遺
伝子発現 動物： ヤギ：メス、１１０ポンド プラスミド： ｐＺＮ８４ リポソーム： ＤＤＡＢ：コレステロール＝１：１、５
％デキストロース水溶液中１０ｍＭで保存 ＤＮＡ：脂質キャリア比： リポソーム：プラスミド＝
５：１ ＤＮＡ投与量： ５％デキストロース水溶液５ｍｌ中
１.０ｍｇのプラスミドＤＮＡを、ヤギ当たり頸静脈か
ら注入した。 （血液採取）血液をｐＺＮ８４リポソーム複合体の注入
の直前と、注入後１２、２４、４８、７２、１６８及び
８４０時間で抜き出した。 （マウスＧＭ−ＣＳＦ ＥＬＩＳＡアッセイ手順）マウ
スＧＭ−ＣＳＦを、エンドン(Endogen) から入手した市
販マウスＧＭ−ＣＳＦ ＥＬＩＳＡキットを用いて、こ
れらの血清試料中で測定した。ＥＬＩＳＡによるヤギと
マウスのＧＭ−ＣＳＦ間に相互反応はない。 （結果）図９０及び９１（ヤギＡ、Ｂ及びＣ）に示され
るように、対照レベルと比較して、ｐＺＮ８４：ＤＤＡ
Ｂ：コレステロール複合体のｉｖ注入は、少なくとも注
入後１６８時間、高く継続された循環レベルのマウスＧ
Ｍ−ＣＳＦタンパク質をもたらした。しかし、８４０時
間（３５日）では、ＧＭ−ＣＳＦレベルは、かなり減少
した（図２７、ヤギＡ）。マウスＧＭ−ＣＳＦタンパク
質は、ＤＤＡＢ：コレステロールリポソームに複合化さ
れた１ｍｇのＣＡＴ遺伝子（ｐＺＮ５１）を同一のｉｖ
注入方法によって受けたヤギの循環系中には検出されな
かった。ＣＡＴ遺伝子を受けたヤギは、ＣＡＴ抗原の免
疫染色によって測定した場合、注入後２４時間で大部分
の循環性白血細胞にＣＡＴ抗原を発現した。ＣＡＴ抗原
は、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子リポソーム複合体で注入された
ヤギの白血細胞に検出されなかった。従って、ｐＺＮ８
４：ＤＤＡＢ：コレステロール複合体のｉｖ注入は、ヤ
ギにおいてマウスＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の高レベルの発現
を延長した期間でもたらすことができる。ｐＺＮ５１：
ＤＤＡＢ：コレステロール複合体のｉｖ注入は、ヤギに
おいて全ての循環性白血細胞の大分部で高レベルのＣＡ
Ｔ遺伝子産物をもたらすことができる。 （実施例２１） マウスにおける実験的なウィルス性肺炎の進行における
リポソーム−ＧＭ−ＣＳＦプラスミド複合体の影響 内因性サイトカインは、ウィルス感染に対する宿主応答
に包含されると考えられている。従って、単一のサイト
カインＧＭ−ＣＳＦの増大された発現が、ウィルス性肺
炎の時間的進行に影響するかを測定することは興味があ
るところである。センダイウィルス試行に対する宿主応
答において、マウスＧＭ−ＣＳＦプラスミド−リポソー
ム複合体の２つの異なる経路を経た送達の影響を試験し
た。プラスミド−リポソーム複合体を、マウスのある群
にはｉｖで、次の群には鼻腔内（ｉｎ）で送達した。投
与量、送達時間、ウィルス試行投与量及び終了点は、両
群共に同一する。プラスミド−リポソーム複合体の投与
量は、１００μｇ／マウス／投与とする。両方の方法の
投与は、下記のスケジュールで行う。 グループ 最初のＰＬ*投与 ２回目のＰＬ投与ウィルス 試行 終了点 ｉｖ経路 ３日目 ０日目 ０日目 ３、７、10日目 ｉｎ経路 ３日目 ０日目 ０日目 ３、７、10日目 ＰＬ*−プラスミド−リポソーム 各実験群は、下記のように構成されている： マウスＧＭ−ＣＳＦプラスミド−リポソーム＋ウィル
ス：３匹 ＣＡＴプラスミド−リポソーム＋ウィルス：３匹 未処理＋ウィルス：３匹 これは、各時点当たり９匹のマウス（各実験につき合計
２７匹、全部で５４匹のマウス）となった。全ての動物
実験は、適当な無痛法の使用を含むＮＩＨ及びＡＡＡ
Ｉ.ＡＣガイドラインに従って実施される。
【０１０１】ウィルス試行は、センダイウィルス株７７
１０７６による鼻腔的投与であり、この菌株は、マウス
において病原性であることが知られている。終了点で
は、下記のことが含まれる（これらは、センダイ肺炎の
終了点として有用であると示されている）： １．肺重量対体重及び脳重量 ２．肺組織病理 ３．ウィルス回収量 ４．センダイ特異的抗体反応 ５．肺ＧＭ−ＣＳＦ ６．肺ＴＮＦ （実施例２２） 中枢神経系に直接的なＤＮＡのみ又はＤＮＡ−陽イオン
性リポソーム複合体の注入によってもたらされるマウス
脳におけるＣＡＴ遺伝子の高レベルの発現 マウス： ＩＣＲ、メス、２５ｇ プラスミド： ｐＣＩＳ−ＣＡＴ リポソーム： ＤＤＡＢ：ＤＯＰＥ（１：１） 注入されたマウス毎に、２.５μｇＤＮＡを５％デキス
トロースに希釈し、その後、５％デキストロースに同容
量に希釈されたリポソームと混合した。５μｌを、各マ
ウスの右脳室へ定位的に注入した。 比： プラスミド：リポソーム＝１：０（１ｍｇＤＮ
Ａ：０μmol ＤＯＴＭＡ） プラスミド：リポソーム＝１：１（１ｍｇＤＮＡ：１μ
mol ＤＯＴＭＡ） プラスミド：リポソーム＝１：３（１ｍｇＤＮＡ：３μ
mol ＤＯＴＭＡ） プラスミド：リポソーム＝１：４（１ｍｇＤＮＡ：４μ
mol ＤＯＴＭＡ） プラスミド：リポソーム＝１：６（１ｍｇＤＮＡ：６μ
mol ＤＯＴＭＡ） マウスを注入後４８時間で犠牲死させた。脳を取り出
し、左と右の脳室に分けた。各脳室を、２５０μｌの
０.２５ＭトリスｐＨ７.８、５ｍＭ ＥＤＴＡ中にホモ
ジナイズして、その後、凍結−溶解操作を３回繰り返
し、１０分間６５℃に付した。
【０１０２】ＣＡＴアッセイに用いた抽出物の量をタン
パク質レベルで標準化した。０.３ｍｌの14Ｃ−クロラ
ムフェニコールを各アッセイに用いた。アッセイを３７
℃で一晩実行した。反応生成物を、実施例４で記述した
ように、ＴＬＣプレート上で分離させ、フィルムに露光
した。 （結果）これらの結果は、異種遺伝子の高レベルの発現
を、中枢神経系へ直接ＤＮＡ−リポソーム複合体（適当
な割合で）の注入によって、脳全体にもたらすことがで
きることを証明している。これらはまた、発現プラスミ
ドのみの注入が、脳において顕著な注入遺伝子発現をも
たらすことができることを証明している。結果は図８８
に示されている。 （実施例２３） ｐＲＳＶ−ＣＡＴ：Ｌ−ＰＥ：ＣＥＢＡ複合体の静脈
（ｉｖ）注入後の肺におけるＣＡＴ遺伝子発現の証明 脂質キャリア： Ｌ−ＰＥ：ＣＥＢＡ＝１：１、脂質キ
ャリア緩衝液中２０ｍＭで保存 プラスミド： ｐＲＳＶ−ＣＡＴ ＤＮＡ：脂質キャリア比： 脂質キャリア：プラスミド
＝１nmol陽イオン性脂質：１μｇプラスミドＤＮＡ ＤＮＡ投与量：５％デキストロース水溶液２００μｌ中
１００μｇのプラスミドＤＮＡを、マウス当たり尾静脈
から注入した。 マウス： Ｂａｌｂ／ｃ、メス、２５ｇ （組織抽出方法）尾静脈注入後４８時間で、動物を犠牲
死させ、全肺を１ｍｌの０.２５Ｍ トリス−ＨＣｌ、ｐ
Ｈ７.８、５ｍＭ ＥＤＴＡ、８０μｇ／ｍｌ ＰＭＳＦ
中にホモジナイズして、得られた抽出物を遠心分離し、
その後、上清を３回、凍結−溶解操作にかけ、その後、
６５℃で２０分間加熱した。ＣＡＴアッセイ方法： １
００μｌの抽出物＋１０μｌの２０ｍＭアセチルＣｏＡ
＋４μｌの14Ｃ−クロラムフェニコール（２５μＣｉ／
ｍｌ、５５ｍＣｉ／mmol、アマシャム社）とを共に、３
７℃６時間、インキュベートした。３時間で、更に１０
μｌのアセチルＣｏＡを添加した。 （結果）この実験は、顕著なレベルのＣＡＴ活性（注入
遺伝子の発現として表示）が、脂質キャリア：ＤＮＡ複
合体を用いて注入した動物の肺に存在したが、対照動物
からの肺には存在しなかったことを示した。 （実施例２４） ｐＺＮ２０−ＣＡＴ：ＤＤＡＢ：ＤＯＰＥ複合体の静脈
（ｉｖ）注入後の多重組織におけるＣＡＴ遺伝子発現の
証明 脂質キャリア： ＤＤＡＢ：ＤＯＰＥ＝１：１、５％デ
キストロース中１０ｍＭで保存 プラスミド： ｐＺＮ２０ ＤＮＡ：脂質キャリア比： 脂質キャリア：プラスミド
＝（Ａ）３nmol陽イオン性脂質：１μｇプラスミドＤＮ
Ａ（ＳＵＶ）。（Ｂ）６nmol陽イオン性脂質：１μｇプ
ラスミドＤＮＡ（ＭＬＶ） ＤＮＡ投与量： ５％デキストロース水溶液２００μｌ
中１００μｇのプラスミドＤＮＡを、マウス当たり尾静
脈から注入した。３匹のマウス各々は、この量のＭＬ
Ｖ：ｐＺＮ２０を、３匹のマウスの各々は、この量のＳ
ＵＶ：ｐＺＮ２０を受けた。 （組織抽出方法）各器官を０.３ｍｌの０.２５Ｍ トリ
ス−ＨＣｌ、ｐＨ７.８、５ｍＭ ＥＤＴＡ中にホモジナ
イズして、得られた抽出物を遠心分離し、その後、上清
を３回、凍結−溶解操作にかけ、その後、６５℃で２０
分間加熱した。 （ＣＡＴアッセイ方法）各組織抽出物のタンパク質濃度
をクマジーブルー主体タンパク質アッセイ（バイオ・ラ
ド社、リッチモンド、カリフォルニア州）を用いて定量
し、各組織抽出物からの同量の総タンパク質を、１０μ
ｌの２０ｍＭアセチルＣｏＡ＋１２μｌの14Ｃ−クロラ
ムフェニコール（２５μＣｉ／ｍｌ、５５ｍＣｉ／mmo
l、アマシャム社）と共に、３７℃１３時間、ＣＡＴア
ッセイに添加した。 （結果）この実験は、ｐＺＮ２０：ＤＤＡＢ：ＤＯＰＥ
複合体のｉｖ注入が、肺、心臓、肝臓、脾臓、腎臓及び
リンパ節を含む６つの異なる組織の各々で顕著なレベル
のＣＡＴ遺伝子発現をもたらすことを証明した。更に、
ＭＬＶ脂質キャリアは、同一脂質から構成されるＳＵＶ
脂質キャリアよりも、同等か又はより高いレベルのin v
ivo 注入遺伝子発現を仲介した。 （実施例２５） ワクチンの製造 本発明は、種々の疾患のための、in vivo でのワクチン
の製造において一般的に使用され得る。顆粒球−マクロ
ファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）に連結され
たキメラな、遺伝的に設計されたタンパク質(genetical
ly-engineeredproteins) の抗原フラグメント、増強抗
原提示及びin vivo で注入されたときに抗原に対する増
加免疫応答は示されている（タオ(Tao) 及びレヴィ(Lev
y)、(1993)、Nature 362:755-758) 。従って、特定抗原
をコードする核酸配列を、ＧＭ−ＣＳＦをコードする核
酸に融合して、本発明を用いてin vivo で適当な細胞に
発現し得る。この手段は、癌治療における悪性腫瘍の増
殖の調節を劇的に改良することができる。他の用途に
は、種々のウィルス性及び他の感染性疾患に対するinvi
vo ワクチン製造が含まれ、特に、これらの疾患には、
免疫応答が慣用のワクチン戦略ではうまくいかない又は
弱いような疾患が含まれる。特に、ＨＩＶのような超可
変域によってタンパク質が特徴付けられているような疾
患に興味が引かれる。種々の潜在的超可変域配列をコー
ドする核酸配列は、ＧＭ−ＣＳＦに融合してin vivo で
同時に発現させ、多くの異なる株のウィルスに対する免
疫応答を引き出すことができる。 （実施例２６） 腫瘍増殖の治療 タンパク質５３をコードするような核酸配列は、腫瘍増
殖を治療することに有用となり得る。腫瘍抑制タンパク
質ｐ５３をコードする配列を、適当な発現ベクター−脂
質複合体を用いてin vivo で細胞内に発現することがで
きる。このような複合体は、便宜上、この脂質複合体に
結合された適当な抗体又はリガンドによって、腫瘍細胞
を標的とすることができる。細胞のトランスフェクショ
ンを伴う初期感染は、培養細胞例えば腫瘍細胞株Ｋ５６
２を用いて発生する。ｐ５３遺伝子発現がＫ５６２にお
いて一度確認され、最適なベクターが同定されると、in
vivo 抗腫瘍実験が実施される。ＳＣＩＤマウスにマウ
ス当たり約２５×106 のＫ５６２細胞が腹腔注入によっ
て与えられる。注入後約３週間で、１０匹の腫瘍発生マ
ウスは、下記のものを与えられる：未処理／対照群；静
脈注入によるｐ５３ベクターリポソーム複合体；腹腔注
入によるｐ５３ベクターリポソーム複合体；報告済みの
遺伝子ベクターリポソーム複合体。ｐ５３の発現の抗腫
瘍効果は、その後、マウスの生き残りに基づいてアッセ
イされる。 （実施例２７）赤血球生成は、赤血球の生成であり、細
胞崩壊に至るまでの連続的な全体の生涯を生じさせるこ
とができる。赤血球生成は、かなり正確に調節された生
理機構であり、適当な組織酸素付与のために血液中に十
分に利用できる量の赤血球を有するが、細胞が循環を妨
げられる位多い量ではない。赤血球の形成は骨髄で起こ
り、ホルモン、エリスロポイエチンの調節下にある。エ
リスロポイエチンは赤血球形成の過程に必須であるの
で、このホルモンは、低い又は不完全な赤血球の生成に
よって特徴付けられる血液障害の両方の治療の診断のた
めの適用に使用することが可能である。エリスロポイエ
チンのコード配列を使用した遺伝子治療は、種々の疾患
状態、障害及び、貧血を含む血液異常の状態特に、慢性
腎不全等に関連するタイプの貧血の修復において使用さ
れる。ＥＰＯ活性を有するポリペプチドをコードする核
酸配列は、適当な転写又は発現カセットへ挿入され、裸
のＤＮＡ又は適当な脂質キャリアと複合化されて宿主哺
乳類へ導入される。活性ＥＰＯポリペプチドの生成のモ
ニターを、米国特許4,703,008号の実施例で記述された
ように実施することができる。
【０１０３】
【発明の効果】上記の結果に示されるように、複数の組
織が、脂質キャリアと複合化しても、裸の核酸として
も、注入遺伝子の全身性投与の後にトランスフォームさ
れることができる。陽イオン性脂質キャリア／外因性Ｄ
ＮＡ複合体の哺乳類宿主への静脈注入後の外因性ＤＮＡ
の発現は、Ｔリンパ球、転移性腫瘍及び管内腫瘍塞栓を
含む多重の組織において示された。網内系のものを含む
これら多重の異なる組織における外因性ＤＮＡの発現
は、裸のＤＮＡとして発現プラスミドを静脈注入した後
に得られた。in vivo でのＴリンパ球のトランスフェク
ト能は、ＡＩＤＳ、癌、多発性硬化症及び関節炎の治療
に劇的な影響力を有する。心臓内皮細胞のin vivoトラ
ンスフェクションは、心臓疾患及び心臓発作の治療に劇
的な影響力を有する。肺細胞のin vivo トランスフェク
ションは、嚢胞性繊維症、喘息、気腫及び肺癌の治療に
劇的な影響力を有する。骨髄細胞のin vivo トランスフ
ェクションは、癌、血液疾患及び感染に劇的な影響力を
有する。
【０１０４】上述したようなin vivo 遺伝子治療送達技
術は、動物において非毒性であり、注入遺伝子発現は１
回の投与後、少なくとも６０日間持続することが示され
た。注入遺伝子はサザン解析による測定でin vivo にお
いて検出可能なレベルで宿主細胞ＤＮＡへ組み込まれる
ようであり、これは、遺伝子治療のためのこの技術が、
癌発生オンコジンを活性化する正常細胞性遺伝子の発現
の変更、又は癌を予防する腫瘍抑制遺伝子をオフにする
ことによる宿主哺乳類に対する問題を引き起こさないで
あろうということを示唆している。更に、ＤＮＡ発現ベ
クターのみの全身性投与後の注入遺伝子の発現が示さ
れ；注入遺伝子発現は、キャリアシステムを伴うことな
く、ＤＮＡ発現ベクターの１回の投与後少なくとも３週
間、肺にもたらされた。
【０１０５】異種遺伝子の成体動物への全身性投与は、
広範囲の組織においてかなり高レベルの発現をもたら
し、上述したように、これらの組織の多くに存在する全
ての細胞の大部分（＞７０％）をトランスフェクトでき
る。これに対して、既存の研究は、成体動物への異種遺
伝子の直接的な転移を試みているものであり、１又はわ
ずかな組織に限られたトランスフェクション、これらの
組織における低いレベルの注入遺伝子発現及び（組織化
学解析が含まれる場合全て）トランスフェクトされた組
織において存在する細胞の１％未満の細胞に限定された
トランスフェクションを報告していた。
【０１０６】肺に存在する全ての細胞の大部分とトラン
スフェクトすることに加えて、上記の方法及びコンスト
ラクトを用いて、高レベルの注入遺伝子発現は広範囲の
他の組織及び細胞型にもたらされた。これらには、以下
のことが含まれる： ・脾臓及びリンパ節に存在する全ての細胞の大部分のト
ランスフェクションであり、これには全てのＴリンパ球
の７０％以上のトランスフェクションが含まれる。in v
ivo でのＴリンパ球の効率的なトランスフェクト能は、
抗ＨＩＶ治療及び免疫応答の選択的改変の両方に対する
最初の特異性分子手段を可能にする。
【０１０７】・腫瘍発生宿主へのＤＮＡのｉｖ注入後の
内臓腫瘍及び管内腫瘍塞栓の効果的な治療。以前は、癌
に関する遺伝子転移研究は、 ex vivo手段にのみ拘束さ
れていた。ここで我々の仕事は、腫瘍発生宿主におい
て、腫瘍抑制物、抗オンコジン及び／又は腫瘍内部の抗
転移活性をもたらす注入遺伝子を用いた直接的トランス
フェクションを可能にする。
【０１０８】・異種遺伝子の全身性送達による、心臓血
管内皮細胞の大分部と骨髄に存在する芽球細胞のかなり
大部分を含む骨髄由来造血細胞との大部分のトランスフ
ェクション。これらにより、分子レベルでの虚血性心疾
患及び造血を調節する劇的な及び新たな方法を創りだ
す。 ・ヒトＣＦＴＲ、ＩＬ−２及びＧＭ−ＣＳＦに例示され
るような、種々の生物学的に重要な注入遺伝子の高レベ
ルのin vivo 発現の発生能の証明 多くの刊行物及び特許出願は、個々の刊行物又は特許出
願各々が援用されて本文の記載の一部となることを特別
に及び個別的に指示している場合には、同一範囲で、こ
こに援用されて本明細書の一部とする。
【０１０９】本発明はここで十分に説明されたので、当
業者にとって、多くの変更及び改変が添付のクレームの
精神又は範囲を逸脱することなく、行うことができると
いうことは明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】 トランスフェクションカセットで注入された
マウスからのマウス肺の切片の顕微鏡写真。
【図２】 対照群のマウスからの、マウス肺の切片の顕
微鏡写真。ｐＺＮ２７：ＤＤＡＢ：コレステロール発現
ベクター−陽イオン性脂質キャリア複合体の静脈注入後
４８時間のマウス肺の切片を示している。プラスミド
は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼ）の発現のための配列を含む。脂質キャリア組
成物は、１対１のＤＤＡＢ：コレステロールであった。
キャリア：プラスミド比は、５nmol陽イオン性脂質対１
μｇＤＮＡであった。１００μｇの投与量のＤＮＡを、
マウス毎に注入した。この視野では、肺胞及び肺胞管壁
細胞が示されており、この殆ど（５０〜７０％）が、抗
ＣＡＴ抗体でつり上げ、アルカリホスファターゼを用い
て視覚化をした場合に、ＣＡＴタンパク質の存在につい
て、赤く陽性に染まる（矢印で表示）。処理された動物
の肺は、肺胞及び血管内皮細胞に拡散して不均一に染ま
る。気道上皮の染色は、また、気道細胞もトランスフェ
クトされていることを示しているように見える。ＣＡＴ
タンパク質は、通常、哺乳細胞には存在せず、従って、
これらの細胞でのＣＡＴタンパク質の存在は、in vivo
でトランスフェクトされたものであることを示してい
る。図２での顕微鏡写真は、静脈注入された脂質キャリ
アのみで処理され、抗ＣＡＴ抗体でつり上げられた対照
群マウスからのマウス肺切片を示している。細胞は、顕
著には染色されないが、低レベルのバックグラウンドの
染色が幾つかの肺胞マクロファージで検出され（矢印で
表示）、この細胞は、内因性のアルカリホスファターゼ
活性を有している。
【図３】 ＤＮＡ−陽イオン性脂質キャリア複合体の腹
腔内（ｉｐ）注入の４８時間後に単離されたマウスＴリ
ンパ球の位相差顕微鏡写真。脂質キャリアは、ＤＤＡ
Ｂ：ＤＯＰＥ、１対１モル比であった。ＤＮＡ−陽イオ
ン性脂質キャリア複合体は１mgのｐＣＩＳ−ＣＡＴと１
μmol の陽イオン性脂質であった。１mgのＤＮＡをｉｐ
で注入した。細胞を抗ＣＡＴマウスモノクローナル抗体
と、その後にテキサスレッド結合ヤギ抗マウスＩｇＧと
共にインキュベートした。
【図４】 図３と同一視野の蛍光顕微鏡写真。これは、
処理動物から取り出され、存在する本質的に全てのＴ細
胞は、ＤＮＡ／陽イオン性脂質キャリア複合体のｉｐ注
入後でのトランスフェクトされたＣＡＴ遺伝子の発現を
証明する免疫蛍光によって、赤く染色された。
【図５】 未注入の対照マウスから単離されたＴリンパ
球の位相差顕微鏡写真。
【図６】 図４と同一視野の蛍光顕微鏡写真。これは、
対照動物群からのこれらのリンパ球ではＣＡＴ遺伝子発
現がないことを示している。
【図７】 ４８時間前にＤＮＡ：脂質キャリア複合体Ｄ
ＤＡＢ：コレステロール：ｐＺＮ５１で処理したマウス
からの造血系骨髄由来細胞を示している。細胞を、図１
のようにＣＡＴタンパク質について染めた。顕微鏡写真
は、始原細胞又は芽球細胞を含む約７０％の骨髄由来細
胞が赤く染まり（矢印は芽球細胞を示している）、in v
ivo でトランスフェクトされることを示している。脂質
キャリアは１：１のＤＤＡＢ：コレステロールであっ
た。ＤＮＡ：陽イオン性脂質の比は、１μｇのＤＮＡ対
５nmolの陽イオン性脂質であった。１００μｇのＤＮＡ
を各マウスへｉｖで注入した。
【図８】 未処理の対照マウスからの単離骨髄細胞。顕
微鏡写真は赤く染まらず、これは、未処理動物において
ＣＡＴ遺伝子発現がないことを示している。
【図９】 培養でのＣＡＴ発現プラスミド−ＤＮＡ複合
体によるヒトＴ細胞（ＣＤ４+ ) のトランスフェクショ
ンを示す。
【図１０】 培養でのＣＡＴ発現プラスミド−ＤＮＡ複
合体によるヒトＴ細胞（ＣＤ４+ ) のトランスフェクシ
ョンを示す。脂質キャリア組成物は、１：１モル比のＤ
ＤＡＢ：ＤＯＰＥの小単ラメラ小胞（ＳＵＶ）であっ
た。５０nmolの陽イオン性脂質と複合化された２５μｇ
のｐＺＮ２７は、培養中の１０００万の細胞へ添加され
た。細胞を、抗ＣＡＴマウスモノクローナル抗体と、そ
の後に、テキサスレッド結合ヤギ抗マウスＩｇＧと共に
インキュベートした。図９は、トランスフェクション後
４８時間の新鮮な単離ヒトＣＤ４+ Ｔリンパ球の位相差
顕微鏡写真を示している。図１０は、同一視野の蛍光顕
微鏡写真を示し、これは、本質的に１００％のＴリンパ
球がＣＡＴタンパク質のついて陽性に染め、即ち、これ
らはトランスフェクトされたことを証明している。
【図１１】 プラスミドｐＺＮ２０のコンストラクショ
ンを示している。
【図１２】 プラスミドｐＺＮ２０のコンストラクショ
ンを示している。
【図１３】 プラスミドｐＺＮ２０のコンストラクショ
ンを示している。
【図１４】 プラスミドｐＺＮ２０のコンストラクショ
ンを示している。
【図１５】 ＨＣＭＶ（Ｔｏｗｎｅ）の前初期エンハン
サー及びプロモーター領域の制限地図。
【図１６】 ＨＣＭＶ（Ｔｏｗｎｅ）の前初期エンハン
サー及びプロモーター領域の制限地図。
【図１７】 ＨＣＭＶ（Ｔｏｗｎｅ）の前初期エンハン
サー及びプロモーター領域の制限地図。
【図１８】 ＨＣＭＶ（Ｔｏｗｎｅ）の前初期エンハン
サー及びプロモーター領域の制限地図。
【図１９】 ＨＣＭＶ（Ｔｏｗｎｅ）の前初期エンハン
サー及びプロモーター領域の制限地図。
【図２０】 ＨＣＭＶ（Ｔｏｗｎｅ）の前初期エンハン
サー及びプロモーター領域の制限地図。
【図２１】 ＨＣＭＶ（Ｔｏｗｎｅ）の前初期エンハン
サー及びプロモーター領域の制限地図。
【図２２】 ＨＣＭＶ（Ｔｏｗｎｅ）の前初期エンハン
サー及びプロモーター領域の制限地図。
【図２３】 ＨＣＭＶ（Ｔｏｗｎｅ）の前初期エンハン
サー及びプロモーター領域の制限地図。
【図２４】 ２つのＨＣＭＶプロモータの配列比較。 N
coＩ部位の位置は、アスタリスクで示してある。
【図２５】 ２つのＨＣＭＶプロモータの配列比較。 N
coＩ部位の位置は、アスタリスクで示してある。
【図２６】 ２つのＨＣＭＶプロモータの配列比較。 N
coＩ部位の位置は、アスタリスクで示してある。
【図２７】 ２つのＨＣＭＶプロモータの配列比較。 N
coＩ部位の位置は、アスタリスクで示してある。
【図２８】 ２つのＨＣＭＶプロモータの配列比較。 N
coＩ部位の位置は、アスタリスクで示してある。
【図２９】 ２つのＨＣＭＶプロモータの配列比較。 N
coＩ部位の位置は、アスタリスクで示してある。
【図３０】 ２つのＨＣＭＶプロモータの配列比較。 N
coＩ部位の位置は、アスタリスクで示してある。
【図３１】 ＨＣＭＶ（ＡＤ１６９）の前初期エンハン
サー及びプロモーター領域の制限地図を示す。
【図３２】 ＨＣＭＶ（ＡＤ１６９）の前初期エンハン
サー及びプロモーター領域の制限地図を示す。
【図３３】 ＨＣＭＶ（ＡＤ１６９）の前初期エンハン
サー及びプロモーター領域の制限地図を示す。
【図３４】 ＨＣＭＶ（ＡＤ１６９）の前初期エンハン
サー及びプロモーター領域の制限地図を示す。
【図３５】 ＨＣＭＶ（ＡＤ１６９）の前初期エンハン
サー及びプロモーター領域の制限地図を示す。
【図３６】 ＨＣＭＶ（ＡＤ１６９）の前初期エンハン
サー及びプロモーター領域の制限地図を示す。
【図３７】 ＨＣＭＶ（ＡＤ１６９）の前初期エンハン
サー及びプロモーター領域の制限地図を示す。
【図３８】 ＨＣＭＶ（ＡＤ１６９）の前初期エンハン
サー及びプロモーター領域の制限地図を示す。
【図３９】 ＨＣＭＶ（ＡＤ１６９）の前初期エンハン
サー及びプロモーター領域の制限地図を示す。
【図４０】 ＨＣＭＶ（ＡＤ１６９）の前初期エンハン
サー及びプロモーター領域の制限地図を示す。
【図４１】 ＨＣＭＶ（ＡＤ１６９）の前初期エンハン
サー及びプロモーター領域の制限地図を示す。
【図４２】 ＨＣＭＶ（ＡＤ１６９）の前初期エンハン
サー及びプロモーター領域の制限地図を示す。
【図４３】 図４３〜４８は、陽イオン性脂質キャリ
ア：ＤＮＡ複合体（ＤＯＴＭＡ：ＤＯＰＥ：ｐＲＳＶ−
ＣＡＴ）が、細胞表面リセプターに結合した後、伝統的
なリセプター仲介エンドサイトシスを介してＣＶ−１
（アフリカミドリザルの肝臓）細胞によって内在化され
ることを証明する電子顕微鏡写真である。ｐＲＳＶＣＡ
Ｔのコンストラクションは、ゴルマン(Gorman)ら、(198
2) Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,79:6777-6781を参照のこ
と。脂質キャリアは１：１のＤＯＴＭＡ：ＤＯＰＥであ
った。２０μｇのＤＮＡを２０nmolの陽イオン性脂質と
複合化して、２×106 の細胞に添加した。図４３中の矢
印はクラスリン被覆小胞に結合している粒子を示す。
【図４４】 図４３説明を参照のこと。図４４の矢印
は、取り込まれてエンドソーム内に存在している粒子を
示している。
【図４５】 図４３説明を参照。
【図４６】 図４３説明を参照。
【図４７】 図４３説明を参照。
【図４８】 図４３説明を参照。
【図４９】 図４９〜５１は、ＣＭＶ−ＣＡＴ陽イオン
性脂質キャリア：ＤＮＡ複合体の静脈注入を受けたＢ−
１６メラノーマ発生動物からの肺の組織学的解析の顕微
鏡写真。脂質キャリアは１：１モル比のＤＯＴＡＰ：コ
レステロールであった。陽イオン性脂質：ＤＮＡ比は、
６nmol：１μｇＤＮＡであった。用いたプラスミドはｐ
ＺＮ２０（図５参照）であった。マウス当たり１００μ
ｇＤＮＡを注入した。ＣＡＴタンパク質の免疫組織化学
的解析は、多くの集中した実質の腫瘍の強い赤の染色
（図４９では矢印で表示）と、血管内の腫瘍塞栓（図５
０では矢印で表示）とを示し、これは、肺における多く
のＢ１６メラノーマ腫瘍細胞が血管経由転移(blood-bor
ne metastases)と同様に、静脈注入後にトランスフェク
トされることを示している。図５１は、ＤＮＡ−脂質キ
ャリア複合体の注入を受けなかったＢ１６メラノーマ発
生マウスからの組織において、ＣＡＴタンパク質が、周
囲の正常肺又は肺腫瘍細胞のいずれにも存在しないこと
を示している。
【図５０】 図４９説明を参照。
【図５１】 図４９説明を参照。
【図５２】 ＣＡＴをコードしているプラスミドｐＺＮ
２７の構築を示す。
【図５３】 ＣＡＴをコードしているプラスミドｐＺＮ
２７の構築を示す。
【図５４】 ヒトＩＬ−２をコードしているプラスミド
ｐＺＮ４６の構築を示す。
【図５５】 ヒトＩＬ−２をコードしているプラスミド
ｐＺＮ４６の構築を示す。
【図５６】 ヒトＩＬ−２をコードしているプラスミド
ｐＺＮ４６の構築を示す。
【図５７】 ヒトＩＬ−２をコードしているプラスミド
ｐＺＮ４６の構築を示す。
【図５８】 ヒトＣＦＴＲをコードしているプラスミド
ｐＺＮ３２の構築を示す。
【図５９】 図５９〜６３は、ｐＺＮ３２：陽イオン性
脂質キャリア複合体又は脂質キャリアのみ（対照群マウ
ス）の静脈投与で処理されたマウスからの肺組織の免疫
組織的に（ＣＦＴＲタンパク質の対して）染色された凍
結切片の顕微鏡写真を示す。図５９は、５０×の倍率に
よるＤＮＡ脂質キャリア複合体で処理されたマウスから
の肺切片。
【図６０】 図５９の説明を参照。５０×の倍率による
対照マウスからの肺切片。
【図６１】 図５９の説明を参照。１００×の倍率によ
るＤＮＡ脂質キャリア複合体で処理されたマウスからの
肺切片。
【図６２】 図５９の説明を参照。１００×の倍率によ
る対照マウスからの肺切片。
【図６３】 図５９の説明を参照。２５０×の倍率によ
るＤＮＡ脂質キャリア複合体で処理されたマウスからの
肺切片。これらは、対照マウスの肺には検出可能なＣＦ
ＴＲ発現がないことを示す。脂質キャリアは１：１モル
のＤＤＡＢ：コレステロール（ＳＵＶ）であった。脂質
キャリア−ＤＮＡ複合体は、５nmolの陽イオン性脂質体
１μｇのＤＮＡであった。マウスに対して１００μｇの
ＤＮＡを注入した。動物を、注入後２４時間で犠牲死さ
せた。これらの図は、気道及び気道管壁細胞の両方の＞
７０％が強く赤く染まることを示し、これはこれらの細
胞が、ＣＦＴＲ遺伝子を発現していることを示してい
る。
【図６４】 ＣＡＴをコードしているプラスミドｐＺＮ
５１の構築を示す。
【図６５】 ＣＡＴをコードしているプラスミドｐＺＮ
５１の構築を示す。
【図６６】 図６６〜７０は、全てＣＡＴをコードして
いるプラスミドｐＺＮ６０、ｐＺＮ６１、ｐＺＮ６２及
びｐＺＮ６３の構築を示す。図６６〜６８は、中間体プ
ラスミドｐＺＮ５２、ｐＺＮ５４、ｐＺＮ５６及びｐＺ
Ｎ５８の構築を示す。図６９〜７０は、中間体からの最
終プラスミドｐＺＮ６０からｐＺＮ６３の構築を示す。
【図６７】 図６６の説明を参照。
【図６８】 図６６の説明を参照。
【図６９】 図６６の説明を参照。
【図７０】 図６６の説明を参照。
【図７１】 マウスに静脈注入された６つの異なるプラ
スミドについてのＣＡＴアッセイの薄層クロマトグラフ
ィのオートラジオグラフを示す。レーン１−１２は、肺
組織のＣＡＴ活性を示し、レーン１３−２４は、肝組織
のＣＡＴ活性を示し、レーン１、２、１３、１４はｐＺ
Ｎ５１であり、レーン３、４、１５、１６はｐＺＮ６０
であり、レーン５、６、１７、１８はｐＺＮ６１であ
り、レーン７、８、１９、２０はｐＺＮ６２であり、レ
ーン９、１０、２１、２２はｐＺＮ６３であり、レーン
１１、１２、２３、２４はｐＺＮ２７である。脂質キャ
リアはＤＤＡＢ：コレステロール（１：１）であった。
脂質キャリア−ＤＮＡ複合体は５nmolの陽イオン性脂質
対１μｇのＤＮＡであった。マウス当たり１００μｇの
ＤＮＡを注入した。動物を４８時間後に犠牲死させた。
各レーンは１匹マウスを表す。クロマトグラフィを、示
されているように図の下部から上部に向けて流してい
る。図１５の中カッコに示されるように、未反応の14Ｃ
クロラムフェニコールは、ＴＬＣプレートの原点から短
い距離だけ移動している。14Ｃアセチル化クロラムフェ
ニコール種は、中カッコによって示されるようにプレー
トの更に上にＣＡＴ酵素活性によって移動する。
【図７２】 図７２〜７６は、ＣＡＴタンパク質につい
て免疫組織化学的に染色された凍結肺切片の顕微鏡写真
を示す。マウスには、尾静脈からｐＺＮ２７（図７２）
が注入され、これは、ＣＡＴについての赤い陽性染色が
肺内部の内皮細胞、肺胞、気道細胞であることを示して
いる。これに対して、天然ＣＦＴＲプロモータに連結さ
れたＣＡＴ遺伝子（ｐＢＥ３.８ＣＡＴ）のリポソーム
複合体は、主として気道上皮細胞にＣＡＴ発現を示した
（図７３）。未注入の対照動物からの肺切片は、赤い染
色を示さず、これは、未トランスフェクト細胞でのＣＡ
Ｔ発現がないことを示している（図７４）。図７５は、
ｐＺＮ２７処理マウスからの肺胞の高倍率の顕微鏡写真
を示し、これは、肺胞及び上皮細胞の両方におけるＣＡ
Ｔ遺伝子産物についての高レベルの陽性赤染色を示して
いる。図７６は、ｐＢＥ３.８ＣＡＴ注入マウスからの
肺胞の高倍率の顕微鏡写真を示し、これは、肺胞又は内
皮細胞には、いずれも顕著なＣＡＴ遺伝子発現がないこ
とを示している。１００μｇのプラスミドを、ＳＵＶと
してのＤＤＡＢ：コレステロールと複合化して静脈注入
した。動物を２４時間後に犠牲死させた。
【図７３】 図７２の説明を参照。
【図７４】 図７２の説明を参照。
【図７５】 図７２の説明を参照。
【図７６】 図７２の説明を参照。
【図７７】 図７７〜８２は、未処理のマウス（レーン
１−３）、ｐＢＥ３.８ＣＡＴ（チュウ(Chou)ら、(199
1) J.Biol.Chem.,266:24471-24476)をｉｖ注入されたマ
ウス（レーン４−６）又はｐＣＩＳ−ＣＡＴを注入した
マウス（レーン７−９）からの組織であって、心臓（図
７７）、リンパ節（図８０）、脾臓（図７８）、腎臓
（図８１）、肺（図７９）及び肝臓（図８２）中のＣＡ
Ｔ活性の薄層クロマトグラフィのオートラジオグラフを
示す。脂質キャリアは、ＤＤＡＢ：コレステロール、
１：１ＳＵＶ（１μｇＤＮＡ対５nmol陽イオン性脂質）
であって、マウス当たり１００μｇを注入した。
【図７８】 図７７の説明を参照。
【図７９】 図７７の説明を参照。
【図８０】 図７７の説明を参照。
【図８１】 図７７の説明を参照。
【図８２】 図７７の説明を参照。
【図８３】 マウスＧＭ−ＣＳＦをコードしているプラ
スミドｐＺＮ８４の構築を示す。
【図８４】 マウスＧＭ−ＣＳＦをコードしているプラ
スミドｐＺＮ８４の構築を示す。
【図８５】 ヒトＣＦＴＲをコードしているプラスミド
ｐＺＮ１０２の構築を示す。
【図８６】 ＴＬＣプレートのオートラジオグラフであ
り、これは、全ての脂質キャリアを伴わないｐＺＮ２７
の注入後の動物におけるＣＡＴ活性を示す。１mgを４時
間にわたって２回ｉｖで注入した。マウスを２４時間後
に犠牲死させた。試験された種々の組織を各レーンの下
に示す。
【図８７】 ＴＬＣプレートのオートラジオグラフであ
り、これは、脂質キャリアと複合化されたｐＺＮ２７を
注入された動物におけるＣＡＴ活性を示す。脂質キャリ
アは、ＤＤＡＢ：コレステロール１対１モルであり、５
μｇのプラスミドを１nmolの脂質と複合化した。１００
μｇをｉｖで注入し、動物を２４時間後に犠牲死させ
た。試験された種々の組織を各レーンの下に示す。
【図８８】 提示されている比のプラスミド：脂質にお
いてＤＯＴＭＡ：ＤＯＰＥ（１：１）脂質キャリアと複
合化されたｐＣＩＳ−ＣＡＴの右脳室への注入のＰＬＣ
プレートのオートラジオグラフを示ず。動物を２．５μ
ｇの定位的な注入の４８時間後の犠牲死させた。１組の
レーンは１匹のマウスを示している。左（Ｌ）脳室は注
入ていないので、左脳室のトランスフェクションが、脳
全体がトランスフェクトされていることを証明する。
【図８９】 ヒト肺癌細胞株のトランスフェクションを
示す。ＴＬＣプレートのオートラジオグラフは、種々の
陽イオン性リポソームを用いてトランスフェクトされた
３種の異なるヒト肺癌細胞株からの抽出物におけるＣＡ
Ｔ活性を示している。肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ６９、ＮＣ
Ｉ−Ｈ８２及びＮＣＩ−Ｈ５２０を、プレート当たり２
×106 細胞で配置させ、懸濁液でトランスフェクトさせ
た。細胞の個々のプレートを、５μｇのＲＳＶ−ＣＡＴ
（ＲＣ）のみ又は、合計で１０若しくは２０nmolの精製
ＤＯＴＭＡ（Ｄ）、精製Ｌ−ＰＥ（Ｌ）、若しくはＬ−
ＰＥ／ＣＥＢＡ（Ｌ／ＣＡ）リポソームと複合化したＲ
ＳＶ−ＣＡＴ５μｇでトランスフェクトした。細胞をト
ランスフェクション後４８時間で採取して、ＣＡＴ活性
についてアッセイした。
【図９０】 ＤＤＡＢ：コレステロールリポソームと複
合化した１mgのＧＭ−ＣＳＦプラスミド（ｐＺＮ８４）
（１μｇプラスミド対１nmol脂質）をｉｖで注入された
１匹のヤギにおける血清マウスＧＭ−ＣＳＦレベルを示
す。血清試料を、注入後０、１２、２４，４８、７２、
１６８及び８４０時間で採取した。マウスＧＭ−ＣＳＦ
レベルを市販のキット（エンドゲン）を用いてＥＬＩＳ
Ａによって測定した。
【図９１】 ヤギＡと同様にｐＺＮ８４を注入した更に
２匹のヤギ（Ｂ及びＣ）における血清マウスＧＭ−ＣＳ
Ｆレベルを示す。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年８月９日（２００１．８．９）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 47/28 Ａ６１Ｋ 48/00 48/00 Ａ６１Ｐ 31/12 Ａ６１Ｐ 31/12 35/00 35/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 ツー、 ニン アメリカ合衆国 94116 カリフォルニア 州 サンフランシスコ セブンティーンス アベニュ 2137 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 DA02 EA04 GA13 HA17 4C076 AA19 BB11 CC27 CC35 DD50F DD70F FF16 4C084 AA13 MA01 MA24 MA66 NA05 NA10 ZB262 ZB332 4C085 AA03 BB23 EE01 GG01 4C086 AA01 AA02 EA16 MA02 MA05 MA10 MA24 MA66 NA05 NA10 ZB26 ZB33

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 哺乳類中の細胞をin vivoでトランスフ
    ォームするDNA発現ベクター脂質キャリア複合体であっ
    て、ここで前記DNAベクターは、プロモータ及びポリペ
    プチドをコードするDNA配列を含み、前記脂質キャリア
    は陽イオン及び非陽イオン脂質を含み、ここで、陽イオ
    ン脂質対非陽イオン脂質のモル比は５％〜１００％の間
    であって、これにより前記脂質キャリアが約１００ｎｍ
    〜約１０μｍの平均直径を有することを特徴とする、DN
    A発現ベクター脂質キャリア複合体。
  2. 【請求項２】 前記DNA発現ベクター及び脂質キャリア
    比が、DNA（マイクログラム単位）対陽イオン脂質（ナ
    ノモル単位）＝６：１〜１：１０である請求の範囲第１
    項記載のDNA発現ベクター脂質キャリア複合体。
  3. 【請求項３】 前記脂質キャリアが非陽イオン脂質とし
    て更にステロイドまたはコレステロールを含む請求の範
    囲第１項記載のDNA発現ベクター脂質キャリア複合体。
  4. 【請求項４】 前記プロモータがHCMVプロモータである
    請求の範囲第１項記載のDNA発現ベクター脂質キャリア
    複合体。
  5. 【請求項５】 前記DNA発現ベクターを全身的に前記哺
    乳類へ導入し、１以上の細胞型の細胞をトランスフォー
    ム可能であり、ここでトランスフォームされる細胞が任
    意的には哺乳類T細胞である請求の範囲第１項記載のDNA
    発現ベクター脂質キャリア複合体。
  6. 【請求項６】 前記脂質キャリアが、 DNA：脂質キャリア比が約１：４であって脂質キャリア
    がDOTMA：DOPEを含む； DNA：脂質キャリア比が約１：３であって脂質キャリア
    がDDAB：DOPEを含む； DNA：脂質キャリア比が約１：６であって脂質キャリア
    がDOTMA及びコレステロールを含む； DNA：脂質キャリア比が約１：１であって脂質キャリア
    がLPE及びCEBAを含む； DNA：脂質キャリア比が約１：５であって脂質キャリア
    がDDAB及びコレステロールを含む；並びに、 DNA：脂質キャリア比が約２：１であって脂質キャリア
    がLPE及びDOPEを含む、から選択されるいずれか１つの
    条件を満たす請求の範囲第１項記載のDNA発現ベクター
    脂質キャリア複合体。
  7. 【請求項７】 in vivoで使用する哺乳動物細胞トラン
    スフォーメーションリポソームであって、陽イオン脂質
    並びに非陽イオン脂質、及びDNA（マイクログラム単
    位）対陽イオン脂質（ナノモル単位）の比が６：１〜
    １：１０となるDNAを含み、ここで前記非陽イオン脂質
    がコレステロールを含み、前記リポソームの直径が１０
    ０ｎｍ〜１０μｍであり、前記リポソームがin vitroで
    凝集しない前記哺乳動物細胞トランスフォーメーション
    リポソーム。
  8. 【請求項８】 前記陽イオン脂質が、DOTMA若しくは対
    コレステロールのモル比が約６：４であるL‐PEであ
    る、又は、陽イオン対比陽イオン脂質比が約１：１であ
    る請求の範囲第７項記載の哺乳動物細胞トランスフォー
    メーションリポソーム。
  9. 【請求項９】 in vivoで哺乳動物細胞をトランスフォ
    ーメーションするための陽イオン脂質及び非陽イオン脂
    質の使用における、陽イオン脂質、非陽イオン脂質、コ
    レステロール、容器及び取扱説明書を含むキット。
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