DE69735498T2

DE69735498T2 - Transgenes modell für herzversagen

Info

Publication number: DE69735498T2
Application number: DE69735498T
Authority: DE
Inventors: L. Karen Boulder VIKSTROM
Original assignee: University of Colorado
Current assignee: University of Colorado
Priority date: 1996-09-26
Filing date: 1997-09-26
Publication date: 2006-11-09
Anticipated expiration: 2017-09-27
Also published as: EP1007628A4; DE69735498D1; WO1998013476A1; US6353151B1; EP1007628A1; EP1007628B1; AU4503497A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein transgenes, nicht-menschliches Tiermodell zur Untersuchung von Herzinsuffizienz. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Untersuchung molekularer/zellulärer Ereignisse, die mit kongestiver Herzinsuffizienz assoziiert sind, Verfahren zum Testen von Kandidatenwirkstoffen zur Prävention oder Behandlung kongestiver Herzinsuffizienz, Verfahren zur Untersuchung der Effekte von Faktoren wie Diät oder Leibesübung auf kongestive Herzinsuffizienz und Verfahren zur Untersuchung spezifischer Zustände oder Erkrankungen, die mit kongestiver Herzinsuffizienz assoziiert sind.
Eine Vielzahl menschlicher Erkrankungen und Zustände, die sich in Herzanomalien oder HerzDysfunktion manifestieren, können zur Herzinsuffizienz führen. Herzinsuffizienz ist ein physiologischer Zustand, bei dem das Herz nicht mehr genug Blut pumpen kann, um die Kreislaufanforderungen des Körpers zu erfüllen. Die Untersuchung eines solchen Zustands in genetisch unterschiedlichen Menschen ist schwierig und unvorhersagbar. Daher besteht ein Bedarf an einem Modellsystem, das die Untersuchung der Mechanismen und Ursachen von Herzinsuffizienz, als auch die Identifikation potentieller therapeutischer Ziele erleichtert. Die Entwicklung der Technologie der transgenen Tiere stellte signifikante Fortschritte beim Erhalten vollständigerer Informationen aus komplexen Systemen in vivo zur Verfügung. Durch Manipulation der Expression von Genen (eines Gens) in vivo ist es möglich Einblick in die Rolle solcher Gene in besonderen Systemen zu erlangen oder die Aspekte dieses Systems in einem genetisch kontrollierten Umfeld zu untersuchen. Obwohl sich eine Herzerkrankung in einem kleinen Säugetier inhärent von dem unterscheidet, was man in Menschen sieht, erlauben Säugetiere wie die Maus die Analyse der Erkrankung auf molekularer und zellulärer Ebene, was in Menschen oft unmöglich ist. Dementsprechend ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein transgenes Modell-System für die Untersuchung der Herzinsuffizienz und Verfahren zur dessen Anwendung zur Verfügung zu stellen.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine transgene Maus, die ein Modell zur Untersuchung kongestiver Herzinsuffizienz ist. Solch eine transgene Maus hat in ihr Genom ein Transgen eingebaut, das folgendes einschließt: (a) einen Herzgewebe-spezifischen Promoter; und, (b) eine Nukleinsäuresequenz, die eine Aminosäuresequenz eines α-Myosin schwere Kette-Proteins kodiert, wobei die Nukleinsäuresequenz eine erste Mutation besitzt, die eine Punktmutation umfasst, die in einer Arg403Gln-Mutation in der Aminosäuresequenz resultiert, und wobei die Nukleinsäuresequenz eine zweite Mutation besitzt die eine interstitielle Deletion in einem Teil der Nukleinsäuresequenz umfasst, die eine Aktin-Bindedomäne kodiert, und wobei die Nukleinsäuresequenz operativ mit dem Herzgewebe-spezifischen Promoter verbunden ist; wobei das Transgen in den Herzgeweben der transgenen Maus exprimiert wird.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein transgenes, nicht-menschliches Säugetier, das ein Modell für kongestive Herzinsuffizienz ist. Solch ein transgenes, nicht-menschliches Säugetier hat im Wesentlichen das gleiche Transgen, wie oben für eine transgene Maus der vorliegenden Erfindung beschrieben, in seinem Genom eingebaut.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleinsäuresequenz, die eine Aminosäuresequenz eines α-Myosin schwere Kette-Proteins kodiert, einschließt, wobei die Nukleinsäuresequenz operativ mit einer oder mehreren Expressionskontrollsequenzen verbunden ist, wobei die Nukleinsäuresequenz eine erste Mutation besitzt, die eine Punktmutation umfasst, die in einer Arg403Gln-Mutation in der Aminosäuresequenz resultiert, und wobei die Nukleinsäuresequenz eine zweite Mutation besitzt, die eine interstitielle Deletion in einem Teil der Nukleinsäuresequenz umfasst, die eine Aktin-Bindedomäne kodiert.
Noch eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung der molekularen und zellulären Ereignisse, die mit kongestiver Herzinsuffizienz assoziiert sind, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Abernten von Zellen und Geweben von einer transgenen Maus der vorliegenden Erfindung wie oben beschrieben; und, (b) Vergleichen von Zellen und Geweben von der transgenen Maus mit Zellen und Geweben von einer Maus, die nicht das Transgen trägt, in einem Assay. Solch ein Assay ist ausgewählt aus morphologischer Untersuchung von Herzzellen; histologischer Untersuchung koronarer Gefäße; histologische Untersuchung von Herzschnitten; histologische Untersuchung von Myozyten; histologische Untersuchung von Myofibrillen; Auswertung der DNA-Replikation und – Expression in Herzmyozyten; Auswertung von Herz-bezogener Enzymaktivität; und Auswertung von Apoptose von Herzzellen.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen zur Behandlung kongestiver Herzinsuffizienz. Solch ein Verfahren schließt folgende Schritte ein: (a) Verabreichen einer auszuwertenden Verbindung an eine transgene Maus der vorliegenden Erfindung wie oben beschrieben; und Auswerten der physiologischen und pathologischen Veränderungen in der transgenen Maus im Vergleich zu einer Maus, die diese Verbindung nicht erhalten hat, um die Wirksamkeit der Verbindung zur Behandlung kongestiver Herzinsuffizienz zu bestimmen.
Noch eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Auswertung der Effekte von externen Faktoren, die ausgewählt sind aus Diät und Leibesübung, auf die kongestive Herzinsuffizienz. Solch ein Verfahren schließt die folgenden Schritte ein: (a) Etablierung eines normalen Kontroll-Verabreichungsschemas für einen externen Faktor in einer ersten transgenen Maus der vorliegenden Erfindung wie oben beschrieben; (b) Modulierung des Verabreichungsschemas für den externen Faktor in einer zweiten transgenen Maus der vorliegenden Erfindung wie oben beschrieben; und (c) Überwachung der zweiten transgenen Maus hinsichtlich einer Veränderung in einem Charakteristikum, das mit der kongestiven Herzinsuffizienz assoziiert ist im Vergleich mit der ersten transgenen Maus.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung der molekularen und zellulären Ereignisse, die mit einem Zustand verbunden sind, der mit kongestiver Herzinsuffizienz assoziiert ist. Solch ein Verfahren schließt die Schritte wie sie oben für das Verfahren zur Untersuchung der molekularen und zellulären Ereignisse, die mit kongestiver Herzinsuffizienz verbunden sind, mit ein. Solch ein Zustand oder solch eine Erkrankung schließt dilatierte Kardiomyopathie, hypertrophe Kardiomyopathie, akute aortische Regurgitation, Trikuspidstenose, konstriktive Perikarditis, akute infektiöse Endokarditis, ischämische Herzerkrankung, Bluthochdruck, eine primäre myokardiale Erkrankung, Klappenerkrankung, perikardiale Erkrankung, Hyperthyroidismus, Anämie, arteriovenöse Fistel, Beriberi und die Paget-Krankheit mit ein, ist aber nicht darauf beschränkt.
Noch eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung einer transgenen Maus, die ein Modell zur Untersuchung kongestiver Herzinsuffizienz ist. Solch ein Verfahren schließt die folgenden Schritte ein: (a) Einführen eines Transgens in eine embryonale Zelle einer Maus wie zuvor hierin beschrieben; und (b) Erhalten von Nachwuchs, der das Transgen stabil im Genom inkorporiert besitzt, wobei das Transgen in den Herzgeweben der Nachkommen exprimiert wird. Solch ein Verfahren kann weiter den Schritt (c) des Auswählens des männlichen, transgenen Nachwuchses einschließen, und ferner den Schritt des Auswählens des männlichen, transgenen Nachwuchses, der wenigstens 5 Monate alt ist, einschließen.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft eine transgene Maus, die ein Modell für hypertrophe Kardiomyopathie ist. Solch eine Maus hat in ihrem Genom ein Transgen eingebaut, wobei das Transgen folgendes umfasst (a) einen Herzgewebe-spezifischen Promoter; und, (b) eine Nukleinsäuresequenz, die eine Aminosäuresequenz eines α-Myosin schwere Kette-Proteins kodiert, wobei die Nukleinsäuresequenz eine erste Mutation besitzt, die eine Punktmutation umfasst, die in einer Arg403Gln-Mutation in der Aminosäuresequenz resultiert, und wobei die Nukleinsäuresequenz eine zweite Mutation besitzt, die eine interstitielle Deletion in einem Teil der Nukleinsäuresequenz umfasst, die eine Aktin-Bindedomäne kodiert, und wobei die Nukleinsäuresequenz operativ mit dem Herzgewebe-spezifischen Promoter verbunden ist; wobei das Transgen in den Herzgeweben der transgenen Maus auf einem Niveau exprimiert wird, das ausreichend ist, um hypertrophe Kardiomyopathie in der Maus zu fördern. In dieser Ausführungsform ist eine solche transgene Maus vorzugsweise eine weibliche transgene Maus, oder eine männliche transgene Maus, die weniger als ungefähr 8 Monate alt ist.
1 ist eine schematische Zeichnung des mutierten α-Myosin schwere Kette-Transgens der vorliegenden Erfindung.
2 ist ein Graph, der die Gewichte für den linken Ventrikel gleichaltriger transgener männlicher und weiblicher Mäuse und ihrer negativen Geschwister illustriert.
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein ein transgenes Modell für Herzinsuffizienz und Verfahren solch ein Modell zur Untersuchung von Herzinsuffizienz zu verwenden. Transgene Mäuse der vorliegenden Erfindung wurden von den Erfindern als ein Modell zur Untersuchung hypertropher Kardiomyopathie konstruiert. Dementsprechend ist eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein transgenes Mausmodell für hypertrophe Kardiomyopathie zur Verfügung zu stellen. Man fand unerwarteterweise heraus, dass ältere Männchen dieser Mäuse einheitlich besondere phänotypische Charakteristika aufweisen, wlche mit kongestiver Herzinsuffizienz assoziiert sind. Die vorliegende Erfindung ist im Allgemeinen gerichtet auf die Verwendung solcher transgenen Mäuse als ein Modell zur Untersuchung verschiedener Aspekte der kongestiven Herzinsuffizienz.
Vor der vorliegenden Erfindung war ein Mausmodell der hypertrophen Kardiomyopathie (HCM) beschrieben worden, das mehrere Aspekte der HCM in Menschen nachahmt, nämlich das Auftreten myozellulärer Unordnung, Fibrose, unter Herz-Dysfunktion (Geisterfer-Lowrance et al., 1996, Science, 272:731 – 734). Während dieses Mausmodell für HCM genetisch am meisten der menschlichen Erkrankung ähnelt, zeigt es phänotypisch jedoch mindestens einen substanziellen Unterschied, nämlich eine deutliche Vergrößerung des linken Atriums in Abwesenheit ventrikulärer Hypertrophie, Merkmale, die man beim menschlichen Erkrankungszustand normalerweise nicht sieht. Folglich sind diese Tiere nicht geeignet zur Untersuchung vieler Aspekte der HCM-Pathogenese. Darüber hinaus sind die zuvor beschriebenen transgenen Mausmodelle der HCM nicht auch noch Modelle für kongestive Herzinsuffizienz.
Die vorliegenden Erfinder haben die ersten transgenen Mauslinien geschaffen, die phänotypisch praktisch identisch mit menschlicher HCM sind und die es erlauben, den Einfluss von Mutationen in kontraktilen Proteinen auf das Herz zu analysieren und Faktoren zu bestimmen, die zur natürlichen Geschichte der Erkrankung beitragen. Zusätzlich haben die vorliegenden Erfinder die ersten transgenen Mauslinien geschaffen, die ein Modell für kongestive Herzinsuffizienz sind.
Die transgenen Mäuse der vorliegenden Erfindung und Verfahren der Verwendung dieser Mäuse stellen einen Einblick in die grundlegenden Mechanismen, die der kongestiven Herzinsuffizienz und Herzhypertrophie zu Grunde liegen, zur Verfügung. Zusätzlich wird das Wissen, das von der Untersuchung der Herzpathogenese in den transgenen Mäusen der vorliegenden Erfindung erhalten wird, Einfluss auf das Wissen über die menschliche kongestive Herzinsuffizienz und über die menschliche HCM haben. Die Möglichkeit, eine kombinierte molekulare und morphologische Analyse der transgenen Mäuse der vorliegenden Erfindung zu verwenden und die Fähigkeit, diese mit anderen genetisch veränderten Mauslinien zu kreuzen, wird die Suche nach Elementen, die in die Pathogenese der kongestiven Herzinsuffizienz und HCM involviert sind, und die Identifikation potentieller therapeutischer Ziele erleichtern.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine transgene Maus, die ein Modell zur Untersuchung kongestiver Herzinsuffizienz ist. Solch eine transgene Maus hat in ihr Genom ein Transgen eingebaut, wobei das Transgen folgendes umfasst (a) einen Herzgewebe-spezifischen Promoter; und, (b) eine Nukleinsäuresequenz, die eine Aminosäuresequenz eines α-Myosin schwere Kette-Proteins kodiert, wobei die Nukleinsäuresequenz eine erste Mutation besitzt, die eine Punktmutation umfasst, die in einer Arg403Gln-Mutation in der Aminosäuresequenz resultiert, und wobei die Nukleinsäuresequenz eine zweite Mutation besitzt, die eine interstitielle Deletion in einem Teil der Nukleinsäuresequenz umfasst, die eine Aktin-Bindedomäne kodiert, und wobei die Nukleinsäuresequenz operativ mit dem Herzgewebe-spezifischen Promoter verbunden ist; wobei das Transgen in den Herzgeweben der transgenen Maus exprimiert wird. Wie im Detail unten diskutiert werden wird, sind ältere, männliche transgene Mäuse der vorliegenden Erfindung geeignete Modelle für kongestive Herzinsuffizienz, wohingegen weibliche transgene Mäuse keine geeigneten Modelle für kongestive Herzinsuffizienz sind. Man muss jedoch verstehen, dass weibliche transgene Mäuse der vorliegenden Erfindung in dieser Ausführungsform der Erfindung eingeschlossen sind, weil weibliche transgene Mäuse nützliche Modelle zur Untersuchung kongestiver Herzinsuffizienz sein können (d. h. zur Untersuchung von Faktoren, die assoziiert sind mit einer Resistenz gegenüber der Entwicklung von Herzinsuffizienz, beispielsweise der Effekt von Hormonen). Zusätzlich können weibliche transgene Mäuse der vorliegenden Erfindung nützlich sein als Kontrolltiere, mit denen männliche transgene Mäuse, die Modelle für kongestive Herzinsuffizienz sind, verglichen werden können. Natürlich sind die weiblichen transgenen Mäuse der vorliegenden Erfindung auch wichtig als Zuchtmittel zur Propagierung der transgenen Linie.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine transgene Maus eine Maus, die ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül (d. h. Transgen), beinhaltet, das in das Genom der Maus im Embryonalstadium der Entwicklung der Maus eingeführt wurde. Als solches wird das Transgen in allen Keimzellen und allen somatischen Zellen der Maus vorliegen (d. h. eingebaut sein). Verfahren zur Einführung eines Transgens in ein Mausembryo sind im Stand der Technik bekannt und sind im Detail in Hogan et al., „Manipulating the Mouse Embryo. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor press, Cold Sping Harbor, NY, 1986, beschrieben. Viele U.S.-Patente beschreiben auch die Herstellung eines transgenen Tiers (siehe z. B., Leder et al., U.S.-Patent Nr. 4, 736,866, 1988; Cordell, U.S.-Patent Nr. 5,387,742, 1995; Lonberg et al., U.S.-Patent Nr. 5,545,806, 1996; Capecchi et al., U.S.-Patent Nr. 5,487,992, 1996; Hammer et al., U.S.-Patent Nr. 5,489,742, 1996; Bleck et al., U.S.-Patent Nr. 5,530,177, 1996; Wheeler, U.S.-Patent Nr. 5,523,226, 1996; Robinson et al., U.S.-Patent Nr. 5,489,743, 1996; Krimpenfort et al., U.S.-Patent Nr. 5,434,340, 1995; und Terhorst et al., U.S.-Patent Nr. 5,530,179, 1996. Beispielsweise kann ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül (d. h. Transgen), in den männlichen Pronukleus eines fertlisierten Mauseies injiziert werden, um zu verursachen, das eine oder mehrere Kopien des rekombinanten Nukleinsäuremoleküls in den Zellen der sich entwickelnden Maus zurückgehalten werden. Eine Maus, die das Transgen zurückbehält, auch als Gründer- („Founder"-) Maus bezeichnet, überträgt normalerweise das Transgen über die Keimbahn an die nächste Generation von Mäusen, wodurch transgene Linien etabliert werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung schließen transgene Mäuse auch alle Nachkommen einer transgenen Maus ein, die das Transgen erben.
Ein Transgen-negatives Geschwister, wie hierin verwendet, ist eine Maus, die im selben Wurf wie eine hierin beschriebene transgene Maus geboren ist (d.h. ein Geschwister), das aber nicht das Transgen vererbt bekommen hat (d. h. Transgen-negativ ist, oder das Transgen nicht im Genom eingebaut hat). Solch eine Maus ist im Wesentlichen eine normale oder wildtypische Maus und ist nützlich als gleichaltrige Kontrolle für die hierin beschriebenen Verfahren.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann jedes nicht-menschliche Säugetier, das geeignet ist zur Untersuchung von Herzinsuffizienz, verwendet werden, als Ausgangsorganismus für die Ableitung eines transgenen Tieres der vorliegenden Erfindung. Vorzugsweise ist ein transgenes Modell der vorliegenden Erfindung ein nicht-menschliches Säugetier einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Kaninchen, Primaten und Nagetiere. Ein transgenes Modell der vorliegenden Erfindung ist besonders bevorzugt ein Nagetier, und sogar noch mehr bevorzugt eine Maus. Es ist eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, dass das Transgen, die Verfahren und die Anwendungen zur Verwendung einer transgenen Maus der vorliegenden Erfindung, wie unten im Detail beschrieben, modifiziert werden können und auf jedes geeignete transgene, nicht-menschliche Säugetier der vorliegenden Erfindung zur Untersuchung von Herzinsuffizienz angewendet werden können.
Wie hierin verwendet ist der Zustand, der als kongestive Herzinsuffizienz bezeichnet wird, ein pathophysiologischer Status, in dem eine abnormale Herzfunktion dafür verantwortlich ist, das das Herz dabei versagt ausreichende Mengen von Blut zu pumpen, um die Anforderungen des Kreislaufs des Körpers zu erfüllen. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann kongestive Herzinsuffizienz mindestens durch eines der folgenden phänotypischen Charakteristika gekennzeichnet werden; Dilation (Dilatation), systolische Dysfunktion, und Verdünnung der Herzwand.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann kongestive Herzinsuffizienz das Endstadiumsereignis sein, oder eine sekundärer Zustand, von einer Vielzahl von Herzerkrankungen und Zuständen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf dilatierte Kardiomyopathie, hypertrophe Kardiomyopathie, akute aortische Regurgitation, Trikuspidstenose, konstriktive Perikarditis, akute infektiöse Endokarditis, ischämische Herzerkrankung, Bluthochdruck, eine primäre myokardiale Erkrankung, Klappenerkrankung, perikardiale Erkrankung, Hyperthyroidismus, Anämie, arteriovenöse Fistel, Beriberi und die Paget-erkrankung. Jede dieser Erkrankungen und jeder dieser Zustände kann mit verschiedenen oder den gleichen wie oben für die kongestive Herzinsuffizienz beschrieben phänotypischen Charakteristika assoziiert sein.
Wie hierin verwendet, ist der Zustand, der als hypertrophe Kardiomyopathie (HCM) bezeichnet wird, eine klinisch heterogene Erkrankung des Herzens mit dominanter Vererbung, wobei die Erkrankung gekennzeichnet ist durch ein Verdicken der muskulären Wände im ventrikulären Septum und im linken Ventrikel (Herzhypertrophie), was zu einer Verengung des Ausflusstrakts des linken Ventrikel führt. Speziellere Charakteristika hypertropher Kardiomyopathie schließen Myozyten-Hypertrophie, myozelluläre Unordnung, interstitielle Fibrose, Koronarerkrankung kleiner Gefäße, und in einigen Fällen Verstopfung des linksventrikulären Ausflusstrakts, mit ein. Das Potential die Pathogenese menschlicher HCM zu verstehen hat sich mit der Identifikation von Mutationen im β-Myosin schwere Kette (Myh)-Gen in zwei verwandten Personen mit HCM erhöht. Von 40 β-Myosin schwere Kette-Mutationen, vor allem in der „Motor"-Domäne des Moleküls sind berichtet worden. Die Identifizierung von Mutationen in zusätzlichen Muskelstrukturproteinen (Herztroponin T, α-Tropomyosin und Herzmyosinbindeprotein C) zeigte, dass HCM auch genetisch heterogen ist und führte zu der Hypothese, das HCM eine Erkrankung der Sarkomere ist. Obwohl der genetische Beweis für defekte kontraktile Proteine bei HCM eindeutig ist, bleibt die Verbindung zwischen diesen Mutationen und dem klinischen Phänotyp unklar. Die dominante Vererbung kann implizieren, dass das mutante Protein als dominant-negatives wirkt, das die Funktion des Wildtypproteins stört. Mehrere Beweisanzeichen unterstützen diese Hypothese. Gereinigtes Myosin von HCM-Patienten (das eine Mischung von Wildtyp und mutantem Protein ist) weist eine reduzierte Beweglichkeit in in vitro Beweglichkeitsassays auf. Die biochemische Analyse eines mutanten Allels(Arg403Gln) zeigt einen Defekt in der aktin-aktivierten ATPase-Aktivität und reduzierte Beweglichkeit in einem in vitro Assay. Zusätzlich weist die mutante Myosin schwere Kette einen dominanten Effekt auf, wenn sie mit Wildtypprotein gemischt wird, wobei die Geschwindigkeit der Mischung unproportional verlangsamt wird.
Hypertrophe Kardiomyopathie wird von kongestiver Herzinsuffizienz dadurch unterschieden, dass obwohl hypertrophe Kardiomyopathie zu sekundären Zuständen kongestiver Herzinsuffizienz führen kann, hypertrophe Kardiomyopathie nicht die einzige Ursache kongestiver Herzinsuffizienz ist. Insbesondere ist kongestive Herzinsuffizienz durch phänotypische Merkmale gekennzeichnet, die normalerweise nicht mit hypertropher Kardiomyopathie assoziiert sind, beispielsweise Dilation, Wandverdünnung, und systolische Dysfunktion. Ältere, erwachsene männliche transgene Mäuse der vorliegenden Erfindung, die geeignete Modelle für kongestive Herzinsuffizienz sind, weisen alle solch phänotypische Merkmale auf.
In einer Ausführungsform sind die transgenen Mäuse der vorliegenden Erfindung nützlich als Modell für hypertrophe Kardiomyopathie. In einer weiteren Ausführungsform ist eine Untergruppe solcher Mäuse nützlich als Modell für kongestive Herzinsuffizienz. Die vorliegende Erfindung ist vor allem gerichtet auf solch eine Untergruppe von transgenen Mäusen, die Modelle für kongestive Herzinsuffizienz sind. Insbesondere können transgene Mäuse der vorliegenden Erfindung, die geeignete Modelle für kongestive Herzinsuffizienz sind, identifiziert werden anhand von Kriterien, welche Geschlecht, Alter und Grad der Expression des Transgens einschließen. Solche Mäuse entwickeln phänotypische Charakteristika von Herzinsuffizienz, einschließlich Dilation, systolische Dysfunktion, und Wandverdünnung, von denen jedes im Detail unten beschrieben wird.
Eine transgene Maus der vorliegenden Erfindung hat in seinem Genom ein Transgen eingebaut. Wie hierin verwendet, ist ein Transgen ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül, das in das Genom der Maus im Embryonalstadium währen der Entwicklung der Maus eingeführt worden ist. Ein Transgen, das in das Genom eines Tiers eingebaut worden ist, ist ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül, das stabil in die DNA aller Keimzellen und somatischen Zellen eines Tieres integriert hat. Ein Transgen schließt also normalerweise regulatorische Sequenzen, beispielsweise Expressionskontrollsequenzen (z. B. Promotoren), die die Expression des Transgens in den Zellen des Tieres kontrollieren, mit ein. Solche Sequenzen werden unten im Detail beschrieben.
In der hierin beschriebenen transgenen Maus schließt das Transgen folgendes ein: (a) einen Herzgewebe-spezifischen Promoter; und (b) eine Nukleinsäuresequenz, die eine Aminosäuresequenz eines α-Myosin schwere Kette-Proteins kodiert, wobei die Nukleinsäuresequenz zwei Mutationen enthält: (1) eine Punktmutation, wobei eine Guaninbase an Position 1445 durch eine Adeninbase substituiert wird, wobei einen solche Substitution zur einer Aminosäuresubstitution eines Arginins gegen ein Glutamin an Aminosäureposition 403 (Arg403Gln) führt; und (2) eine interstitielle Deletion in dem Teil der DNA, der für die Aminosäuren innerhalb der Aktin-Bindedomäne kodiert. Eine α-Myosin schwere Kette-cDNA mit den oben beschriebenen Mutationen wird hierin auch als mutante α-Myosin schwere Kette (Myh), oder als mutantes α Myh bezeichnet.
Ein α-Myosin schwere Kette-Gen, das wie hierin beschrieben mutiert wurde, wird vorzugsweise als Transgen bei der Herstellung einer transgenen Maus der vorliegender Erfindung verwendet. Im Gegensatz zum Menschen, wo die β-Myosin schwere Kette die vorherrschende Myosinisoform im Herzen ist, ist die α-Myosin schwere Kette die vorherrschende Isoform im adulten Mausventrikel. Daher wurde von den vorliegenden Erfindern eine mutierte α-Myosin schwere Ketten-cDNA der Ratte ausgewählt, um den transgenen kodierenden Bereich der transgenen Mäuse wie hierin offenbart zu konstruieren. Es ist jedoch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, jedes α-Myosin schwere Kette-Gen der Säuger zur Herstellung eines transgenen, nicht-menschlichen Säugetiers der vorliegenden Erfindung zu verwenden. Die α-Myosin schwere Kette ist zwischen den Säugetierarten stark konserviert. Die α-Myosin schwere Kette der Ratte und der Maus sind auf Aminosäurenebene zu 98,9% identisch (22 Unterschiede auf 1938 Aminosäuren), wobei die Unterschiede ähnlich sind zu den neutralen Polymorphismen?, die man zwischen verschiedenen mit sich selbst gekreuzten Mausstämmen findet. Zusätzlich ist die α-Myosin schwere Kette-Aminosäuresequenz zwischen Ratte, Maus und Mensch zu ungefähr 96,9% bis ungefähr 98,7% identisch. Darüber hinaus ist das Arginin an Position 403 der Aminosäuresequenz des Wildtyp α-Myosin schwere Kette-Proteins zwischen Ratte, Maus und Mensch konserviert, was nahe legt, dass dieser Aminosäurerest innerhalb vieler Säugetierarten konserviert ist. Wenn ein anderes transgenes, nicht-menschliches Säugetier als die Ratte oder die Maus hergestellt wird (z.B. ein Schwein oder ein Primat), wird vorzugsweise ein α-Myosin schwere Kette-Gen der gewünschten Art verwendet.
Das Wissen um die Nukleinsäuresequenz des α-Myosin schwere Kette-Nukleinsäuremoleküls der Ratte und der Maus der vorliegenden Erfindung erlaubt dem Fachmann zum Beispiel, (a) Kopien jener Nukleinsäuremoleküle zu machen, (b) Nukleinsäuremoleküle zu erhalten, die wenigstens einen Teil eines solchen Nukleinsäuremoleküls einschließen (z. B. Nukleinsäuremoleküle die folgendes einschließen: Gene mit der vollen Länge, kodierende Bereiche mit der vollen Länge, regulatorische Kontrollsequenzen, verkürzte kodierende Bereiche), und (c) α-Myosin schwere Kette-Nukleinsäuremoleküle für andere Säugetiere zu erhalten. Solche Nukleinsäuremoleküle können auf einer Vielzahl von Wegen erhalten werden einschließlich der folgenden: Durchmusterung geeigneter Expressionbibliotheken mit Antikörpern, die gegen die α-Myosin schwere Kette gerichtet sind; traditionelle Klonierungstechniken unter Verwendung von Oligonukleotidsonden von konservierten Bereichen der α-Myosin schweren Kette, um geeignete Bibliotheken oder DNA zu durchmustern; und PCR-Amplifikation von geeigneten Bibliotheken oder DNA unter Verwendung von Oligonukleotidprimern. Verfahren zur Herstellung einer mutierten α-Myosin schwere Kette-Nukleinsäuresequenz werden unten im Detail diskutiert.
Wie oben diskutiert ist eine der Mutationen in einem mutierten α-Myosin schwere Kette-Transgen der vorliegenden Erfindung eine interstitielle Deletion, die in einer Deletion von Aminosäuren innerhalb der Aktin-Bindedomäne der α-Myosin schweren Kette resultiert. Solch eine interstitielle Deletion resultiert in einer Deletion von wenigstens 15 Aminosäuren, noch bevorzugter in einer Deletion von wenigstens ungefähr 30 Aminosäuren, und noch bevorzugter in einer Deletion von wenigstens ungefähr 45 Aminosäuren, und noch bevorzugter in einer Deletion von wenigstens ungefähr 60 Aminosäuren innerhalb der Aktin-Bindedomäne einer α-Myosin schweren Kette. Solch eine interstitielle Deletion in Verbindung mit der oben beschriebenen Punktmutation, Arg403Gln, inhibiert vorzugsweise die Bindung von Aktin an die Aktin-Bindedomäne der α-Myosin schweren Kette. Insbesondere kodiert solch eine Deletion, in Verbindung mit der oben beschriebenen Punktmutation, eine mutierte α-Myosin schwere Kette, die, wenn sie in männlichen transgenen Mäusen in einem bestimmten Altersbereich exprimiert wird und ein Transgenexpressionsniveau wie hierin beschrieben hat, darin resultiert, dass eine solche Maus die phänotypischen Charakteristika kongestiver Herzinsuffizienz, wie unten im Detail beschrieben, hat.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst eine Deletion in einer Aktin-Bindedomäne die Deletion von Aminosäuren von ungefähr Position 468 bis ungefähr Position 527 des α-Myosin schwere Kette-Proteins der Ratte. Es ist eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, dass solch eine Deletion von Aminosäuren die Deletion eines Teils der vermutlichen Aktin-Bindedomäne einschließt, die kleiner oder größer ist als der Bereich, der durch die Aminosäuren von 468 bis 527 definiert wird, wenn die Charakteristika der transgenen Maus mit den phänotypischen Charakteristika kongestiver Herzinsuffizienz der vorliegenden Erfindung, wie hierin beschrieben, aufrecht erhalten oder verstärkt werden.
Solche eine interstitielle Deletion in der Aktin-Bindedomäne wird vorzugsweise überbrückt durch Zusatz einer Nukleinsäuresequenz, die einen Zusatz von Aminosäureresten kodiert, die keinen Teil der Aktin-Bindedomäne kodieren. Mit anderen Worten, die Aminosäuresequenz des Zusatzes von Aminosäureresten wird nicht aus der Sequenz von Aminosäureresten, die natürlich innerhalb der Aktin-Bindedomäne der α-Myosin schweren Ketten gefunden werden, ausgewählt. Vorzugsweise umfasst solch ein Zusatz von Aminosäureresten eine Aminosäuresequenz von ungefähr 8 Aminosäuren. In einer Ausführungsform ist solch ein Zusatz von Resten die Sequenz SerSerLeuProHisLeuLysLeu, die hierin repräsentiert ist als SEQ ID Nr. 1.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat ein Transgen, das verwendet wird, um eine transgene Maus der vorliegenden Erfindung herzustellen, eine Nukleinsäuresequenz, die eine mutierte α-Myosin schwere Kette kodiert, wobei die Nukleinsäuresequenz hierin repräsentiert ist durch SEQ ID Nr. 2. Solch eine Nukleinsäuresequenz kodiert für eine Aminosäuresequenz, die hierin repräsentiert ist als SEQ ID Nr. 3.
Das Transgen, das verwendet wird, um eine transgene Maus der vorliegenden Erfindung herzustellen, hat auch einen Herzgewebe-spezifischen Promotor. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Herzgewebe-spezifischer Promotor ein Promotor, der die Expression des Transgens ausschließlich oder im Wesentlichen ausschließlich im Herzen bewirkt. Beispiele für solch einen Promotor schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, α-Myosin schwere Kette-Promotor und Myosin leichte Kette 2V (ventrikulär)-Promotor. Vorzugsweise ist der Promotor ein α-Myosin schwere Kette-Promotor, der operativ mit der mutierten α-Myosin schwere Kette-Nukleinsäuresequenz verbunden ist. In einer Ausführungsform ist ein Promotor zur Verwendung in einem rekombinanten Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung ein α-Myosin schwere Kette-Promotor. Wenn das rekombinante Nukleinsäuremolekül bei der Herstellung einer transgenen Maus oder Ratte verwendet werden soll, ist es vorzuziehen, einen α-Myosin schwere Kette-Promotor der Maus oder der Ratte zu verwenden.
Der Ausdruck „operativ verbunden" bezieht sich auf das Einsetzen von Nukleinsäuresequenzen, einschließlich der Expressionskontrollsequenzen, auf eine Art und Weise, so dass das Molekül in der Lage ist, in Herzzellen exprimiert zu werden, wenn es in ein Wirtsgenom integriert wird.
Expressionskontrollsequenzen sind regulatorische Sequenzen, die kompatibel mit den Zellen des transgenen Wirts sind und die die Expression des Nukleinsäuremoleküls der vorliegenden Erfindung kontrollieren. Insbesondere kontrollieren die Expressionskontrollsequenzen die Initiation, Elongation und Termination der Transkription. Besonders wichtige Expressionskontrollsequenzen sind jene, welche die Transkriptionsinitiation kontrollieren, beispielsweise Promoter- und Enhancersequenzen. Geeignete Expressionskontrollsequenzen schließen jede Expressionskontrollsequenz ein, die in wenigstens einem der transgenen, nichtmenschlichen Säugetiere der vorliegenden Erfindung wirken kann. Eine Vielzahl solcher Expressionskontrollsequenzen sind dem Fachmann bekannt. Expressionskontrollsequenzen der vorliegenden Erfindung können auch natürlich auftretende Expressionskontrollsequenzen einschließen, die natürlich mit einer α-Myosin schwere Kette-Nukleinsäuresequenz assoziiert sind. Geeignete Expressionskontrollsequenzen schließen jede Expressionskontrollsequenz ein, die in dem Transgenexpressionssystem der vorliegenden Erfindung wirken kann.
Das mutierte α-Myosin schwere Kette-Transgen wird mittels Standardverfahren aus dem Stand der Technik konstruiert und kloniert. Ein mutiertes α-Myosin schwere Kette-Transgen der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise mittels rekombinanter DNA-Technologie (z. B. Polymerase Kettenreaktion (PCR)-Amplifikation, Klonierung) oder chemischer Synthese konstruiert werden. Wie hierin verwendet, kann eine Nukleinsäuresequenz den Sense-Strang als auch den Nonsense-Strang, oder komplementäre Gegenstücke zu solch einer Nukleinsäuresequenz einschließen. Nukleinsäuresequenzen können unter Verwendung einer Vielzahl von Techniken modifiziert werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, klassische Mutagenese-Techniken und rekombinante DNA-Techniken, beispielsweise ortsspezifische Mutagenese, chemische Behandlung von Nukleinsäuremolekülen zur Einführung von Mutationen, Restriktionsenzymspaltung eines Nukleinsäurefragments, Ligation von Nukleinsäurefragmenten, PCR-Amplifikation und/oder Mutagenese ausgewählter Bereiche einer Nukleinsäuresequenz, Synthese von Oligonukleotidgemischen und Ligation von Gemischgruppen, um ein Gemisch von Nukleinsäuremolekülen und Kombinationen davon zu „bilden". Solche Standardverfahren werden beispielsweise in Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Labaratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press offenbart.
Insbesondere wird das α-Myosin schwere Kette-Transgen, das die oben offenbarten Mutationen eingebaut hat, in einen prokaryotischen Klonierungsvektor ligiert. Prokaryotische Klonierungsvektoren und Verfahren zur Verwendung solcher Vektoren, um DNA zu klonieren, sind im Stand der Technik bekannt. Das Transgen wird so konstruiert, dass es sowohl das oben beschriebene mutierte α-Myosin schwere Kette-Gen als auch einen Herzgewebe-spezifischen Promotor enthält. Das Transgen kann ferner 5' und 3' flankierende Introns und Polyadenylierungssequenzen einschließen.
Transgensequenzen werden mittels eines prokaryotischen Standardklonierungssystems kloniert und die Transgen-Produkte werden aus dem prokaryotischen Vektor ausgeschnitten, gereinigt, und in den Pronukleos befruchteter Mäuseeier injiziert. Die stabile Integration des Transgens in das Genom des transgenen Embryos erlaubt es, permanente transgene Mauslinien zu etablieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform schließt ein Transgen der vorliegenden Erfindung folgendes ein: eine mutierte α-Myosin schwere Kette-cDNA wie hierin beschrieben; ungefähr 2936 Basenpaare des α-Myosin schwere Kette-5'-flankierenden Bereichs der Ratte als Promotor; ein Hybridintron am 5'-Ende der mutierten cDNA, umfassend das von HindIII und EcoRI Restriktionsendonukleasestellen flankierte 113 Basenpaarfragment, das vom Säugetierexpressionskonstrukt pMT21 (Genetics Institute, Cambrigde, MA) abgeleitet ist; das SV40 kleines-t-Intron am 3'-Ende der mutierten cDNA; und SV40 kleines-t-Polyadenylierungssequenzen.
Mausstämme, die geeignet sind für die Ableitung von transgenen Mäusen wie hierin beschrieben, sind alle gebräuchlichen Labor-Mausstämme. Ein bevorzugter Mausstamm zur Verwendung bei der Ableitung transgener Gründermäuse der vorliegenden Erfindung sind (CBA X C57BL6)F1-Kreuzungen. Vorzugsweise werden Gründermäuse dieser Kreuzung mit C57BL/6-Mäusen gekreuzt, um transgene Mauslinien zu schaffen.
Transgene Mäuse der vorliegenden Erfindung, die geeignete Modelle für kongestive Herzinsuffizienz sind, sind erwachsene männliche Mäuse. Männliche und weibliche transgene Mäuse der vorliegenden Erfindung sind geeignete Modelle für hypertrophe Kardiomyopathie, aber weibliche transgene Mäuse sind keine geeigneten Modelle für kongestive Herzinsuffizienz, weil weibliche transgene Mäuse nicht die phänotypischen Charakteristika kongestiver Herzinsuffizienz, wie sie unten beschrieben sind, entwickeln. Man muss jedoch verstehen, dass weibliche transgene Mäuse der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit den männlichen transgenen Mäusen der vorliegenden Erfindung geeignete Modelle zur Untersuchung von Herzinsuffizienz sind, weil die weiblichen Mäuse nützlich sind bei der Untersuchung der Resistenz gegenüber Herzinsuffizienz und der Untersuchung der Umwelt /geschlechtsabhängigen Faktoren, die zur Resistenz gegenüber oder zur Anfälligkeit gegenüber kongestiver Herzinsuffizienz beitragen.
Transgene Mäuse der vorliegenden Erfindung, die geeignete Modelle für kongestive Herzinsuffizienz sind, schließen männliche transgene Mäuse mit ein, die wenigstens ungefähr 5 Monate alt sind. Vorzugsweise sind solche Mäuse wenigstens ungefähr 6 Monate alt, und noch bevorzugter wenigstens ungefähr 7 Monate alt, und am bevorzugtesten wenigstens ungefähr 8 Monate alt.
Das oben beschriebene Transgen wird in den Herzgeweben der transgenen Mäuse der vorliegenden Erfindung exprimiert. Insbesondere wird das Transgen in den Herzgeweben transgener Mäuse auf einem Niveau exprimiert, das ausreichend ist, um kongestive Herzinsuffizienz zu fördern, wenn die transgene Maus ein wenigstens ungefähr 5 Monate altes Männchen ist. In einer transgenen Maus der vorliegenden Erfindung, die ein geeignetes Modell für kongestive Herzinsuffizienz ist, liegt das Niveau der mutierten α-Myosin schwere KettemRNA vorzugsweise bei wenigstens 25% des endogenen α-Myosin schwere Kette-mRNA-Niveaus. Noch bevorzugter liegt das Niveau der mutierten α-Myosin schwere Kette-mRNA bei wenigstens ungefähr 35%, und noch bevorzugter bei wenigstens ungefähr 45%, und sogar noch bevorzugter bei wenigstens ungefähr 55% des endogenen α-Myosin schwere Kette-mRNA-Niveaus. Es sei angeführt, dass es keinen signifikanten Unterschied im Expressionsniveau der Transgene zwischen männlichen und weiblichen transgenen Mäusen der vorliegenden Erfindung gab (das heißt, Männchen exprimieren nicht signifikant mehr oder weniger Transgen als Weibchen). Das Niveau der mutierten α-Myosin schwere Kette-mRNA kann mittels jedes Mittels zum Messen von mRNA-Niveaus, die im Stand der Technik bekannt sind, gemessen werden. Solche Verfahren schließen beispielsweise Northern Blots und RNAse-Schutzassays mit ein. Die interstitielle Deletionsmutation im Transgen erlaubt es, die transgene mRNA elektrophoretisch von der endogenen α-Myosin schwere Kette-mRNA zu unterscheiden.
In einer transgenen Maus der vorliegenden Erfindung, die ein geeignetes Modell für kongestive Herzinsuffizienz ist, umfasst das mutierte α-Myosin schwere Kette-Protein wenigstens ungefähr 1 Massenprozent des gesamten Myosin-Proteins im Herz. Vorzugsweise umfasst das mutierte α-Myosin schwere Kette-Protein wenigstens ungefähr 3 Massenprozent, und noch bevorzugter wenigstens ungefähr 9 Massenprozent, und noch bevorzugter wenigstens ungefähr 12 Massenprozent vom gesamten Myosin-Protein im Herz. Die Menge an mutiertem α-Myosin schwere Kette-Protein in einer transgenen Maus oder einem transgenen, nicht-menschlichen Säugetier der vorliegenden Erfindung kann mittels jedes Mittels zum Quantifizieren von Proteinmengen bestimmt werden. Solche Verfahren schließen beispielsweise Immunoblot-Assays ein. Die Quantifizierung kann zum Beispiel über eine densitometrische Messung erfolgen. Wie unten in Beispiel 1 diskutiert, erlaubt die interstitielle Deletion das Transgen-Protein elektrophoretisch von der endogenen α-Myosin schwere Kette zu unterscheiden.
Transgene Mäuse der vorliegenden Erfindung, die geeignete Modelle für kongestive Herzinsuffizienz sind, zeigen besondere phänotypische Charakteristika, die mit Herzinsuffizienz assoziiert sind. Wie hierin verwendet, ist ein phänotypisches Charakteristikum ein messbares oder beobachtbares Charakteristikum, das aus der Wechselwirkung der genetischen Konstitution der Maus mit ihrer Umwelt resultiert. Beispiele für phänotypische Charakteristika, die mit Herzinsuffizienz assoziiert sind, sind unten beschrieben.
Ein phänotypisches Charakteristikum transgener Mäuse dieser Erfindung, die geeignete Modelle für kongestive Herzinsuffizienz sind, ist Dilation der Herzkammern. Wie hierin verwendet, ist Dilation, auch als Dilatation bezeichnet, eine Vergrößerung oder Ausweitung der Herzkammer. Insbesondere weisen solche Mäuse Dilation des linken Ventrikels auf, obwohl Dilation anderer Kammern des Herzens auftreten kann. Dilation kann mittels direkter Messung eines Herzen eines toten Tiers, oder am schlagenden Herzen im Organismus mittels Echoradiographie beurteilt werden. Solch eine Messung mittels Echoradiographie wird linksventrikuläre enddiastolische Ausdehnung oder LVEDD genannt. Gemäß der vorliegenden Erfindung hat eine erwachsene Transgen-negative Maus eine LVEDD von zwischen ungefähr 1,8 mm und ungefähr 2,7 mm. Eine transgene Maus der vorliegenden Erfindung, die ein geeignetes Modell für kongestive Herzinsuffizienz ist, hat eine LVEDD von zwischen ungefähr 2,7 mm und ungefähr 4,0 mm.
Ein weiteres phänotypisches Charakteristikum transgener Mäuse der vorliegenden Erfindung, die geeignete Modelle für kongestive Herzinsuffizienz sind ist, dass solche Mäuse eine Verdünnung der Herzwände aufweisen, auch hierin als Wandverdünnung bezeichnet. Gemäß der vorliegenden Erfindung sind die Herzwände einer transgenen Maus, welche ein geeignetes Modell für kongestive Herzinsuffizienz ist, wenigstens ungefähr 10% dünner, und noch bevorzugter wenigstens ungefähr 30% dünner, und noch bevorzugter wenigstens ungefähr 50% dünner, und am bevorzugtesten wenigstens ungefähr 70% dünner als die Herzwände der Transgen-negativen Maus. Als solches zeigen transgene Mäuse der vorliegenden Erfindung, die geeignete Modelle für kongestive Herzinsuffizienz sind, keine Herzhypertrophie, oder zeigen keine Herzhypertrophie mehr. Wie hierin verwendet, verweist Herzhypertrophie auf die Ausdehnung oder Vergrößerung der Wände des Herzens infolge der Verstärkung der Zellen, aus denen sie sich zusammensetzen, aber nicht infolge eines quantitativen Zuwachs an Zellen oder neuen Wachstums. Transgene Mäuse der vorliegenden Erfindung, die geeignete Modelle für kongestive Herzinsuffizienz sind, haben das Charakteristikum der Hypertrophie, falls sie solch ein Charakteristikum in einem jüngeren Alter aufwiesen, verloren. Die Gesamtdimensionen des Herzens dieser Mäuse können größer sein als jene von Transgen-negativen Geschwistern, solch eine Vergrößerung wäre jedoch infolge von Dilation, wie oben beschrieben.
Noch ein weiteres phänotypisches Charakteristikum transgener Mäuse der vorliegenden Erfindung, die geeignete Modelle für kongestive Herzinsuffizienz sind, ist systolische Dysfunktion. Wie hierin verwendet ist systolische Dysfunktion eine Dysfunktion im kontraktilen Prozess des Herzens, die durch eine Unfähigkeit, ausreichend Blut auszustoßen, gekennzeichnet ist. Die systolische Funktion kann in Mäusen mittels Messen des Prozentsatzes fraktionaler Verkürzung (%FS) beurteilt werden, der ein Messwert der Verkürzung der linksventrikulären kleineren Achse während der Systole ist. Transgen-negative Mäuse der vorliegenden Erfindung haben typischerweise eine systolische Funktion von zwischen ungefähr %FS = 50 und ungefähr %FS = 60, wohingegen transgene Mäuse der vorliegenden Erfindung, die geeignete Modelle für Herzinsuffizienz sind, eine signifikant reduzierte systolische Funktion von zwischen ungefähr %FS = 18 und ungefähr %FS = 30 haben.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein transgenes, nicht-menschliches Säugetier, das ein Modell zur Untersuchung kongestiver Herzinsuffizienz ist. Solch ein transgenes, nicht-menschliches Säugetier hat in seinem Genom ein Transgen eingebaut, wobei das Transgen folgendes umfasst: (a) einen Herzgewebe-spezifischen Promotor; und (b) eine Nukleinsäuresequenz, die eine Aminosäuresequenz eines α-Myosin schwere Kette-Proteins kodiert, wobei die Nukleinsäuresequenz eine erste und zweite Mutation wie oben beschrieben für eine transgene Maus der vorliegenden Erfindung hat, wobei das Transgen in den Herzgeweben des transgenen Säugetiers exprimiert wird. In bevorzugten Ausführungsformen schließen geeignete Säugetiere zur Verwendung bei der Herstellung eines transgenen, nicht-menschlichen Säugetiers der vorliegenden Erfindung Mäuse, Ratten, Kaninchen, Schafe, Schweine, Rind, und Primaten ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die eine Aminosäuresequenz eines α-Myosin schwere Kette-Proteins kodiert, wobei die Nukleinsäuresequenz operativ mit einer oder mehreren Expressionskontrollsequenzen verbunden ist, wobei die Nukleinsäuresequenz eine erste Mutation hat umfassend eine Punktmutation, die in einer Arg403Gln-Mutation in der Aminosäuresequenz resultiert; und eine zweite Mutation hat umfassend eine interstitielle Deletion in einem Teil der Nukleinsäuresequenz, die eine Aktin-Bindedomäne kodiert. Solch eine Nukleinsäuresequenz ist hierin im Detail beschrieben worden. Eine bevorzugte Expressionskontrollsequenz zur Verwendung in einem rekombinanten Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung ist ein Herzgewebe-spezifischer Promotor. Solche Promotoren sind hierin im Detail beschrieben worden. Gemäß der vorliegenden Erfindung können, wenn ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül in das Genom eines Tieres im Embryonalstadium eingebaut wird, die Ausdrücke „rekombinantes Nukleinsäuremolekül" und „Transgen" wechselseitig austauschbar verwendet werden. Bevorzugte und alternative Ausführungsformen solch eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls sind jene wie oben für ein Transgen einer transgenen Maus der vorliegenden Erfindung beschrieben.
Es wird vom Fachmann geschätzt werden, dass die Verwendung der rekombinanten DNA-Technologien die Expression der hierin offenbarten Transgene verbessern kann, durch Manipulation zum Beispiel der Anzahl der Kopien der Nukleinsäuremoleküle, die in einer Wirtszelle integriert sind, der Effizienz, mit der jene Nukleinsäuremoleküle transkribiert werden, der Effizienz, mit der die resultierenden Transkripte translatiert werden, und der Effizienz von posttranslationalen Modifikationen. Rekombinante Techniken, die nützlich zum Steigern der Expression von Nukleinsäuremolekülen der vorliegenden Erfindung sind, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Substitutionen oder Modifikationen von Expressionskontrollsignalen (z. B. Promotoren, Operatoren, Enhancer), Substitutionen oder Modifikationen translationaler Kontrollsignale (z. B. Ribosomen-Bindestellen, Shine-Dalgarno-Sequenzen) und Deletion von Sequenzen, die Transkripte destabilisieren.
Es muss angeführt werden, dass der Ausdruck „ein" oder „eine" sich auf eine oder mehrere davon bezieht; zum Beispiel bezieht sich ein Charakteristikum auf ein oder mehrere Charakteristika oder auf wenigstens ein Charakteristikum. Als solches können die Ausdrücke „ein" (oder „eine"), „ein oder mehrere" und „wenigstens ein" hierin wechselseitig austauschbar verwendet werden. Es muss auch angeführt werden, dass die Ausdrücke „umfassend", „einschließend" und „mit" wechselseitig austauschbar verwendet werden können.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Untersuchung der molekularen und zellulären Ereignisse, die mit kongestiver Herzinsuffizienz assoziiert sind. Solch ein Verfahren umfasst die Verwendung einer transgenen Maus mit phänotypischen Charakteristika der kongestiven Herzinsuffizienz der vorliegenden Erfindung. Im Speziellen wird eine transgene Maus der vorliegenden Erfindung, die ein geeignetes Modell für Herzinsuffizienz, wie durch die hierin zuvor beschriebenen Kriterien definiert, ist, getötet. Die Zellen und/oder Gewebe der Maus werden dann auf zellulärem Niveau und/oder auf dem molekularen Niveau untersucht und mit Zellen und/oder Geweben von Transgen-negativen Geschwistern untersucht. Alternativ werden die Zellen und/oder Gewebe von einer transgenen Maus der vorliegenden Erfindung, die ein geeignetes Modell für Herzinsuffizienz ist, mit Zellen und/oder Geweben von einer transgenen Maus der vorliegenden Erfindung, die kein geeignetes Modell für kongestive Herzinsuffizienz ist (z. B. eine weibliche transgene Maus) verglichen. Beispiele von Experimenten, die durchgeführt werden können, um die Zellen und/oder Gewebe der Mäuse zu vergleichen, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, morphologische Untersuchung von Herzzellen; histologischer Untersuchung koronarer Gefäße, von Herzschnitten, von Myozyten und/oder Myofibrillen; Auswertung der DNA-Replikation und/oder -expression in Herz-Myozyten; Assays zur Auswertung der Enzymaktivität; und Assays zur Untersuchung des programmierten Zelltods oder der Apoptose. Die Verfahren, um solche Experimente durchzuführen, sind Standard und im Stand der Technik bekannt. Viele dieser Experimente sind hierin im Beispielabschnitt im Detail beschrieben.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein System, in dem Kandidatenwirkstoffe für die Prävention oder Behandlung kongestiver Herzinsuffizienz getestet werden sollen. In dieser Ausführungsform dient eine transgene Maus, die ein Modell für kongestive Herzinsuffizienz ist, als ein in vivo-System, um die Wirkung von Kandidatenwirkstoffen für die Prävention oder Behandlung kongestiver Herzinsuffizienz zu bewerten. Im Speziellen wird einer transgenen Maus der vorliegenden Erfindung, die die Kriterien für ein Modell der kongestiven Herzinsuffizienz wie hierin beschrieben erfüllt, eine zu bewertende Kandidatenverbindung verabreicht. Die Maus wird dann auf physiologische und pathologische Veränderungen, die die Wirksamkeit der Verbindung bei der Prävention oder Behandlung kongestiver Herzinsuffizienz anzeigen, bewertet. Die Maus wird mit einer transgenen Maus, die die Kriterien für kongestive Herzinsuffizienz erfüllt und die die Verbindung nicht erhalten hat, verglichen. Wie für das Verfahren oben kann ein Transgennegatives Geschwister oder eine weibliche transgene Maus auch als Kontrolle oder Vergleichspunkt dienen. Ein zu bewertender Wirkstoff oder zu bewertende Verbindung bezieht sich auf jede chemische Verbindung, die einem Tier als Hilfe bei der Diagnose, Behandlung oder Prävention von Erkrankung oder eines anormalen Zustands verabreicht werden kann.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung schließen akzeptable Protokolle, um einen Kandidatenwirkstoff oder eine Verbindung zu verabreichen die Art und Weise der Verabreichung und die effektive Menge des einem Tier verabreichten Kandidatenwirkstoffs oder der Verbindung, ein, einschließlich individueller Dosisgröße, Anzahl der Dosen und Frequenz der Dosenverabreichung. Die Bestimmung solcher Protokolle kann erreicht werden durch den Fachmann. Geeignete Art und Weisen der Verabreichung können einschließen, sind aber nicht beschränkt auf, orale, nasale, topische, transdermale, rektale und parenterale Wege. Bevorzugte parenterale Wege können einschließen, sind aber nicht beschränkt auf, subkutane, intradermale, intravenöse, intramuskuläre und intraperitoneale Wege. Bevorzugte topische Wege schließen Inhalation über Aerosole (das heißt Sprays) oder topische Oberflächenverabreichung auf die Haut eines Tieres ein.
Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst eine an ein Tier zu verabreichende wirksame Menge eines Kandidatenwirkstoffs oder einer Verbindung eine Menge, die in der Lage ist, kongestive Herzinsuffizienz zu verhindern oder zu behandeln, ohne toxisch für das Tier zu sein. Eine Menge, die toxisch für das Tier ist, umfasst jede Menge, die Schaden an Struktur und Funktion eines Tieres verursacht (das heißt giftig ist). Die Prävention oder Behandlung kongestiver Herzinsuffizienz kann als Veränderung (das heißt Zunahme oder Reduktion) eines phänotypischen Charakteristikums, das mit kongestiver Herzinsuffizienz assoziiert ist, abgeschätzt werden, wobei solch eine Veränderung wirksam ist, um kongestive Herzinsuffizienz zu verhindern oder zu behandeln.
Noch eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung einer transgenen Maus mit phänotypischen Charakteristika kongestiver Herzinsuffizienz, um die Effekte externer Faktoren auf kongestive Herzinsuffizienz zu untersuchen. Solche Faktoren schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Diät und Leibesübungen. In dieser Ausführungsform wird einer ersten transgenen Maus, die die Kriterien eines Modell für kongestive Herzinsuffizienz wie hierin beschrieben erfüllt, eine besondere Diät gefüttert oder wird einem besonderen Leibesübungsverabreichungsschema unterworfen, das als normales oder Kontroll-Verabreichungsschema etabliert werden muss. Beispielsweise kann eine normale oder eine Kontrolldiät die Diät sein, die an eine Wildtypmaus des besonderen transgenen Hintergrunds (z. B. C57B1/6) gefüttert wird????, wie etabliert für normale Tierställe. Nichttransgene Geschwister und/oder weibliche transgene Mäuse können als zusätzliche Kontrolle verwendet werden. Dieses Verabreichungsschema wird dann moduliert, um den Effekt solch eines modulierten externen Faktors auf Herzinsuffizienz zu untersuchen. Wieder können dieselben Kontrollen verwendet werden. Die zweite transgene Maus wird dann dahingehend überwacht, ob eine Veränderung in einem oder mehreren Charakteristika der kongestiven Herzinsuffizienz im Vergleich zu der ersten transgenen Maus (mit normalem Verabreichungsschema) und im Vergleich zu den Transgen-negativen Geschwistern oder weiblichen transgenen Mäusen auftritt. Beispielsweise können die Effekte einer Niedrigfettdiät oder einer moderaten Leibesübung auf die Entwicklung von Charakteristika, die mit kongestiver Herzinsuffizienz assoziiert sind, unter Verwendung des transgenen Mausmodells für kongestive Herzinsuffizienz der vorliegenden Erfindung bewertet werden.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung einer transgenen Maus, die die Kriterien für ein Modell für kongestive Herzinsuffizienz der vorliegenden Erfindung erfüllt, zur Untersuchung spezifischer Zustände oder Erkrankungen, die mit kongestiver Herzinsuffizienz assoziiert sind. Solch ein Verfahren schließt die Schritte ein des (a) Aberntens von Zellen und Geweben von einer transgenen Maus der vorliegenden Erfindung und des Vergleichens der Zellen und der Gewebe mit einem Transgen-negativen Geschwister, um ein biochemisches, physiologisches, und/oder molekulares Ereignis zu bewerten, das in Beziehung zu einer Erkrankung oder einem Zustand steht, der mit kongestiver Herzinsuffizienz assoziiert ist. Alternativ kann einer transgenen Maus der vorliegenden Erfindung eine Verbindung verabreicht werden, um deren Effekt auf eine Erkrankung oder einen Zustand, der mit kongestiver Herzinsuffizienz assoziiert ist, zu testen, wobei solch eine Maus mit einer transgenen Maus verglichen wird, die die Verbindung nicht erhalten hat. Solche spezifischen Zustände oder Erkrankungen, die mit kongestiver Herzinsuffizienz assoziiert sind, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf dilatierte Kardiomyopathie, hypertrophe Kardiomyopathie, akute aortische Regurgitation, Trikuspidstenose, konstriktive Perikarditis, akute infektiöse Endokarditis, ischämische Herzerkrankung, Bluthochdruck, eine primäre myokardiale Erkrankung, Klappenerkrankung, perikardiale Erkrankung, Hyperthyroidismus, Anämie, arteriovenöse Fistel, Beriberi und die Paget-Krankheit.
Alternativ kann eine transgene Maus der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, die eine oder mehrere zusätzliche Transgene zusätzlich zum mutierten α-Myosin schwere Kette-Transgen der vorliegenden Erfindung trägt.
Diese Ausführungsform kann auch verwendet werden, um einen Zustand oder eine Erkrankung zu untersuchen, die mit kongestiver Herzinsuffizienz assoziiert ist. Eine Maus, die genetisch so modifiziert worden ist, dass sie ein Modell ist für einen besonderen Zustand oder eine Erkrankung, die mit kongestiver Herzinsuffizienz assoziiert sind, kann beispielsweise mit einer transgenen Maus der vorliegenden Erfindung verpaart werden, um eine Maus herzustellen, die nützlich bei der Untersuchung der Korrelation zwischen dem besonderen Zustand oder der Erkrankung und kongestiver Herzinsuffizienz ist. Solche spezifischen Zustände oder Erkrankungen, die mit kongestiver Herzinsuffizienz assoziiert sind, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf dilatierte Kardiomyopathie, hypertrophe Kardiomyopathie, akute aortische Regurgitation, Trikuspidstenose, konstriktive Perikarditis, akute infektiöse Endokarditis, ischämische Herzerkrankung, Bluthochdruck, eine primäre myokardiale Erkrankung, Klappenerkrankung, perikardiale Erkrankung, Hyperthyroidismus, Anämie, arteriovenöse Fistel, Beriberi und die Paget-Krankheit.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Maus, die ein Modell für die Untersuchung von Herzinsuffizienz ist. Solch ein Verfahren schließt die folgenden Schritte ein: (a) Einführen eines Transgens in eine embryonale Zelle einer Maus, wobei das Transgen folgendes umfasst: (1) einen Herzgewebe-spezifischen Promotor; und, (2) eine Nukleinsäuresequenz, die eine Aminosäuresequenz eines α-Myosin schwere Kette-Proteins kodiert, wobei die Nukleinsäuresequenz eine erste Mutation besitzt, die eine Punktmutation umfasst, die in einer Arg403Gln Mutation in der Aminosäuresequenz resultiert und wobei die Nukleinsäuresequenz eine zweite Mutation besitzt, die eine interstitielle Deletion in einem Teil der Nukleinsäuresequenz umfasst, die eine Aktin-Bindedomäne kodiert; und (b) Erhalten von Nachwuchs, der das rekombinante Nukleinsäuremolekül stabil im Genom inkorporiert besitzt. Das Transgen wird in den Herzgeweben des Nachwuchses exprimiert. In einer Ausführungsform schließt das Verfahren den weiteren Schritt (c) des Auswählens der Männchen aus dem Nachwuchs, der das Transgen stabil im Genom inkorporiert, ein. Das Verfahren kann ferner das Auswählen des männlichen Nachwuchses einschließen, der wenigstens ungefähr 5 Monate alt ist. Wie oben diskutiert worden ist können auch weibliche transgene Mäuse als Modell zur Untersuchung von Herzinsuffizienz ausgewählt werden, weil mittels der weiblichen transgenen Mäuse Beiträge zur Erkrankung, die von der Umwelt oder dem Geschlecht beeinflusst werden, untersucht werden können.
Noch eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft eine transgene Maus, die ein Modell für hypertrophe Kardiomyopathie ist. Solch eine transgene Maus hat in ihrem Genom ein Transgen inkorporiert, wobei das Transgen umfasst: (a) einen Herzgewebespezifischen Promotor; und (b) eine Nukleinsäuresequenz, die eine Aminosäuresequenz eines α-Myosin schwere Kette-Proteins kodiert. Die Nukleinsäuresequenz hat eine erste Mutation umfassend eine Punktmutation, die in einer Arg403Gln-Mutation in der Aminosäuresequenz resultiert, und wobei die Nukleinsäuresequenz eine zweite Mutation besitzt, die eine interstitielle Deletion in einem Teil der Nukleinsäuresequenz umfasst, die eine Aktin-Bindedomäne kodiert. Das Transgen wird in den Herzgeweben der transgenen Maus auf einem ausreichenden Niveau exprimiert, um hypertrophe Kardiomyopathie in der Maus zu fördern. Solch eine Maus ist im Detail zuvor hierin beschrieben worden. Insbesondere schließt eine Maus der vorliegenden Erfindung, die ein geeignetes Modell für hypertrophe Kardiomyopathie ist, jede weibliche transgene Maus der vorliegenden Erfindung und junge, männliche transgene Mäuse der vorliegenden Erfindung ein. Vorzugsweise sind männliche transgene Mäuse der vorliegenden Erfindung, die geeignete Modelle für hypertrophe Kardiomyopathie sind, weniger als ungefähr 8 Monate alt, vorzugsweise weniger als ungefähr 7 Monate alt, noch bevorzugter weniger als ungefähr 6 Monate alt, und am bevorzugtesten, weniger als ungefähr 5 Monate alt. Vorzugsweise wird das Transgen wenigstens auf dem minimalen Niveau exprimiert, wie es hierin für Mäuse offenbart ist, die ein Modell für kongestive Herzinsuffizienz sein können.
Die folgenden Beispiele werden zu Zwecken der Illustration zur Verfügung gestellt und sind nicht dazu gedacht, den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu beschränken.
Beispiele
Beispiel 1
Das folgende Beispiel illustriert die Herstellung einer transgenen Maus der vorliegenden Erfindung.
5 transgene Mauslinien mit Herz-spezifischer Expression einer mutierten α-Myosin schwere Kette wurden erzeugt. Im Gegensatz zum Menschen, wo die β-Myosin schwere Kette die vorherrschende Isoform des Herzmyosins ist, ist die α-Myosin schwere Kette die vorherrschende Isoform im Ventrikel der adulten Maus. Daher wurde eine mutierte α-Myosin schwere KettecDNA der Ratte verwendet, um den kodierenden Bereich des Transgens herzustellen. Auf Ebene der Aminosäuren sind die α-Myosin schwere Ketten der Ratte und der Maus zu 98,9% identisch (22 Unterschiede auf 1938 Aminosäuren), wobei die Unterschiede ähnlich zu den neutralen Polymorphismen sind, die man zwischen verschiedenen mit sich selbst gekreuzten Mausstämmen findet. Keiner der 7 nicht konservativen Unterschiede zwischen der α-Myosin schweren Kette von Ratte und Maus findet sich im Kopf oder Subfragment 1 (S1)-Bereich der Myosin-schweren Kette, der Stelle mit den meisten HCM-Mutationen. Die Unterschiede findet man nur im Subfragment 2-(S2; 2 Aminosäuren) oder im leichten Meromyosin (LMM; 5 Aminosäuren)-Bereich. Zusätzlich konnten keine HCM-Mutationen in Aminosäuren gefunden werden, die sich in der α-Myosin schweren Kette von Ratte und Maus unterscheiden.
Das Transgen, das schematisch in 1 illustriert ist, wurde mittels Standardklonierungstechniken hergestellt. Der kodierende Bereich des Transgens besteht aus einer α-Myosin schwere Kette-cDNA der Ratte, die 2 Mutationen enthält: (a) eine Punktmutation an Position 1445 von G nach A (G1445A), die in einer Aminosäuresubstitution an Aminosäureposition 403 von Arginin nach Glutamin (Arg403Gln) resultiert; und (b) eine Deletion der Aminosäuren 468-527 in der vermutenten Aktin-Bindedomäne, die durch den Zusatz von 8 nicht-Myosin-Aminosäuren (SerSerLeuProHisLeuLysLeu) überbrückt wird. Für die Kombination dieser 2 Mutationen haben die vorliegenden Erfinder vorhergesagt, dass sie ein sehr stark dominant-negativen Effekt durch Veränderung der Wechselwirkung von Myosin mit Aktin bewirkt. Zusätzlich erlaubt die Deletionsmutation, das Transgenprotein von der endogenen Myosin schwere Kette der Maus elektrophoretisch zu unterscheiden. Der kodierende Bereich des Transgens wurde am 5'-Ende (Genetics Institute, Cambridge, MA, USA) von einem Hydrid-Intron, das vom Säugetier-Expressionskonstrukt pMT21 abgeleitet worden ist, und am 3'-Ende vom kleinen-T-Intron des SV40 flankiert. Die Transgenexpression wurde von ungefähr 3,3 kb der 5'-flankierenden DNA der α-Myosin schweren Kette der Ratte (die von B. Markham, Medical College of Wisconsin, USA, erhalten wurde) gesteuert, und Polyadenylierungssequenzen wurden von der kleinen-t-DNA des SV40 zur Verfügung gestellt.
Die Transgensequenzen wurden aus den prokaryotischen Vektorsequenzen ausgeschnitten, in Agarosegelen gereinigt, und in den Pronukleus fertilisierter Mäuseeier von CBA X C57B1/6 (F1-Kreuzung) Mäusen gemäß Standardtechniken injiziert. Gründertiere wurden mittels Southern Blot identifiziert und mit C57B1/6-Mäusen verpaart.
5 unabhängige transgene Linien wurden etabliert (Linien 131, 136, 138, 140 und 143) und die Herz-spezifische Expression der Transgen-mRNA wurde mittels Ribonuklease (RNase)-Schutzanalyse wie folgt bestätigt (Daten nicht gezeigt). Die RNA wurde mittels des Guanidinium-Säure Phenol-Verfahrens gereinigt. Vom 5'-Ende des Transgens wurde eine Antisense-Ribosonde mittels des Promega Riboprobe Kits (Promega, Madison, WI, USA) erzeugt und über die Guanidinium-Säure Phenol-Extraktion gefolgt von einer Isopropanol-Präzipitation gereinigt. Die Sonde hybridisiert mit ungefähr 300 und 200 bp geschützten Fragmenten des Transgens beziehungsweise der endogenen Myosin schwere Kette-mRNAs der Maus. Eine Sonde mit 500 000 gezählten Ereignissen pro Minute wurde mit 3 μg RNA kombiniert und über Nacht bei 55°C in 86% Formamid, 2 mM EDTA; 0,433 M NaCl, 43 mM Pipes, pH 6,9 hybridisiert. Die Proben wurden bei 37°C für 1,5 Stunden mit 40 Einheiten TI-RNAase (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, USA) und 0,5 μg RNAase A (Boehringer Mannheim) in 0,5 ml 0,3 M NaCl, 30 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 μg/ml Hefe tRNA verdaut. Der Verdau wurde durch den sequenziellen Zusatz von 10 μl 20% SDS und 50 μl Stop-Puffer (4 M Ammoniumacetat, 100 mM EDTA, 1 mg/ml Hefe tRNA) abgestoppt. Die Proben wurden Phenol/Chloroform-extrahiert, Ethanol-präzipitiert, und dann elektrophoretisch auf einem 5% Acrylamidgel unter denaturierenden Bedingungen aufgetrennt. Langzeitexpositionen zeigten sehr geringe Mengen der endogenen α-Myosin schwere Kette der Maus in der Lunge, die Transgenexpression wurde jedoch nur im Herzen nachgewiesen. Die Transgen-mRNA war in den Herzen dieser Mäuse abundant und war auf einem Niveau von 26-50% des endogenen Myosin schwere Kette (der Maus)-Niveaus (nicht gezeigt).
Beispiel 2
Das folgende Beispiel zeigt, dass die transgenen Mäuse der vorliegenden Erfindung ein Modell für familiäre, hypertrophe Kardiomyopathie (HCM) sind.
Wenn die transgenen Mäuse der vorliegenden Erfindung als Modell für HCM wirken sollen, sollten sie verschiedene phänotypische Merkmale aufweisen, die man in den meisten Individuen mit der Krankheit findet. Diese schließen Myozyten-Hypertrophie, myozelluäre Unordnung, interstitielle Fibrose, und die koronare Erkrankung kleiner Gefäße ein. Im Alter von 12-14 Wochen wurden Herzen von jeder transgenen Linie auf Beweise für diese Merkmale untersucht. Kurz zusammengefasst, es wurden Paraffinschnitte von Herzen von Kontroll- und transgenen Mäusen mit Masson's Trichrome oder Hämotoxilin/Eosin angefärbt. In allen Fällen waren die Atria normal, aber im linken Ventrikel zeigte sich eine deutliche kardiäre Histopathologie. In einigen wenigen Tieren wurden im rechten Ventrikel anormale Myozyten gesehen, aber der übermäßige Großteil der hypertrophierten Zellen wurde im linken Ventrikel gefunden. Foci myozellulärer Unordnung wurden im gesamten linken Ventrikel gefunden, begleitet von Beweisen erhöhter Matrixakkumulation. Herzen 5 Monate alter transgener Mäuse der Linie 140 wurden in Plastikharz eingebettet und anormale Bereiche innerhalb des linken Ventrikels in dicken Schnitten des in Plastik eingebetteten Gewebes identifiziert. Von diesen Bereichen wurden dünne Schnitte geschnitten, mit Uranyl-Acetat und Bleizitrat angefärbt und unter dem Elektronenmikroskop untersucht. Myofibrilläre Unordnung als auch Degeneration war offensichtlich. Wenn Gebiete mit myozellulärer Unordnung identifiziert und dann auf Stufe des Elektronenmikroskops untersucht wurden, wurden mehrere Anormalitäten beobachtet. Degenerierende Myofibrillen, auffällige Kolagenablagerungen und Z-Linie-Strömung waren klar erkennbar. Es ist interessant, festzuhalten, dass schwer geschädigte Myozyten oft benachbart zu augenscheinlich normalen Zellen waren. In diesen Fällen fehlten intakte Myofibrillen nahe den interkalierten Scheiben, was eine fehlende Kraftübertragung zwischen den benachbarten Myozyten nahe legt. Die Elektronenmikrographien der myozellulären Unordnung (hierin nicht gezeigt) sind nahezu nicht von veröffentlichten Mikrographien skelettaler Muskelbiopsien von menschlichen HCM-Patienten zu unterscheiden.
Die koronare Erkrankung kleiner Gefäße, die sich histopathologisch als Verdickung der medialen und intimalen Schichten der kleinen Koronargefäße zeigt, findet man in vielen Patienten mit HCM und liegt auch bei feliner und porziner HCM vor.
Anormale Koronargefäße wurden in den Herzen aller transgenen Mauslinien gefunden. Nicht alle Gefäße waren hypertrophiert, was sich in der Anwesenheit normaler und anormaler Gefäße innerhalb desselben Tiers zeigte. Solche Heterogenität von Gefäß zu Gefäß sieht man auch im Menschen. Die Expression der mutierten α-Myosin schwere Kette wurde nicht in Geweben reich an glattem Muskel beispielsweise Uterus nachgewiesen, was nahe legt, dass sie auch nicht in der glatten Muskelschicht der koronaren Arterien exprimiert wird. Die Hypertrophie des glatten Muskels, die man in kleinen Koronararterien sieht, ist am wahrscheinlichsten das Ergebnis einer kompensatorischen Antwort des Gefäßsystems auf Herzmyozyten mit Dysfunktion. Während alle fünf Mauslinien histopathologische Charakteristika der HCM aufwiesen, hatten auf mikroskopischen Niveau zwei einen relativ milden und drei einen recht starken Phänotyp. Zwei transgene Linien (Linien 131 und 140) wurden als Beispiele für milde bzw. starke Phänotypen ausgewählt und für die weitere Untersuchung zurückgehalten.
Aktin und Myosin findet man normalerweise in einem exakten Verhältnis im Muskel und Veränderungen dieser Stöchiometrie können tiefgreifende Wirkungen haben. Um zu bestimmen, ob die Expression der mutanten Myosin schwere Kette die Stöchiometrie der kontraktilen Proteine in diesen transgenen Mäusen beeinträchtigte, wurden Herzmyofibrillen von transgenen Mäusen zubereitet (Linien 131 und 140). Das Verhältnis von Myosin zu Aktin wurde in diesen Zubereitungen mittel Densitometrie bestimmt und mit den Herzmyofibrillen von Kontrollmäusen verglichen (nicht gezeigt). Die Myosin/Aktin-Verhältnisse stellten sich als identisch heraus, obwohl sehr geringe Veränderungen, die durch die vorliegende Analyse nicht nachweisbar sind, nicht ausgeschlossen werden können.
Die Menge an transgenem Protein in Herzhomogenaten von Kontrollmäusen, Mäusen der Linie 131 und 140 wurde mittels SDS-Acrylamid-Gelelektrophorese gefolgt von Immunblottens und Densitometrie wie im Folgenden beschrieben bestimmt. Herzhomogenate oder Myofibrillen wurden auf 6%-igen SDS-Polyacrylamidgelen nach Laemmli elektrophoretisch aufgetrennt. Die Elektrophorese wurde so lange fortgesetzt bis die schweren Ketten von Myosin ungefähr 8 cm durch ein 11 cm langes Trenngel gewandert waren. Der Immunblot wurde mittels eines Anti-α-Myosin schwere Kette-monoklonalen Antikörpers, BAG5 (erhalten von Dr. S. Schiaffino, Padua, Italien) durchgeführt und chemilumineszierende Bilder wurden mittels eines Molecular Dynamics Laser-Densitometers quantifiziert.
Acrylamidgele wurden gefahren, die die Größenunterschiede zwischen den mutierten und endogenen Wildtypspezies optimal darstellen. Die Ergebnisse zeigten, dass das mutante Protein 10 bis 12% des Gesamtmyosins in Linie 140 und 0,6-2,5% in Linie 12 umfasst. Egal ob Herzhomogenate oder gereinigte Myofibrillen untersucht wurden, es wurden identische Ergebnisse erhalten. Die niedrigen Konzentrationen an mutantem Protein in Verbindung mit der offensichtlich normalen Aktin/Myosin-Stöchiometrie legen nahe, dass der schwere Phänotyp aufgrund des dominanten Effekts der Mutante auftritt, so dass eine relativ kleine Anzahl an mutanten Polypeptiden einen „Zug" auf die Sarkomerfunktion ausübt. Mit dieser Schlussfolgerung stimmen Befunde überein, das ein Gemisch von mutanten (Arg403Gln) und Wildtypmyosinproteinen die Eigenschaften der Mutante aufweist, so lange Wildtyp nicht mehr als 60% des Gemischs ausmacht.
Die Gewichte der Vorhöfe, des linken Ventrikels und des rechten Ventrikels wurden in gleichaltrigen transgenen Mäusen (12 Wochen alt und 8 Monate alt) bestimmt, wobei negative Geschwister als Kontrollen dienten (Tabelle 1 und 2). Tabelle 1 zeigt, dass in einem Alter von 12 Wochen Linie 140 im Vergleich zu Kontrollen signifikante Zuwächse in der Masse des linken und des rechten Ventrikels aufwies (Weibchen: linker Ventrikel (LV) 12%-iger Zuwachs, und rechter Ventrikel (RV) 14%-iger Zuwachs; Männchen: LV 7%-iger Zuwachs und RV 9%iger Zuwachs), während kein Unterschied im Körpergewicht oder in der Länge der Tibia beobachtet werden konnte. Die Daten in Tabelle 1 wurden unter Verwendung eines ungepaarten Student't-Test analysiert. p-Werte sind in der Tabelle angezeigt. Die Herzhypertrophie in diesen Tieren wird begleitet von erhöhten Boten-Konzentrationen des atriellen natriuretischen Faktors (ANF) und α-Skelett-Aktin, zwei molekulare Marker von Herzhypertrophie. Tiere der Linie 131 wiesen keine signifikante Herzhypertrophie in diesem Alter auf. Obwohl keine große Anzahl an Tieren von den anderen drei Mauslinien für die Herzmassenmessungen untersucht wurde, war jedes transgene Herz von jenen drei Linien in einem Alter von 12 Wochen hypertroph. Obwohl die Linie 131 keine erhöhten Konzentrationen an ANF und α-Skelett-Aktin mRNAs aufwies, waren die Konzentrationen dieser molekularen Marker der Hypertrophie signifikant weniger als in der Linie 140.
Tabelle 1. Herzhypertrophie in transgenen Mäusen
Die molekulare genetische Analyse hat gezeigt, dass hypertrophe Kardiomyopathie oft mit Mutationen in Genen assoziiert ist, die für kontraktile Proteine kodieren. Das führte zu der Hypothese, dass HCM eine Erkrankung der Sarkomere ist. Der exakte Zusammenhang zwischen mutanten kontraktilen Proteinen und dem Phänotyp bleibt jedoch unklar. Die Charakterisierung der HCM-Pathogenese auf zellulärem und molekularem Niveau wird Informationen bereitstellen, die hilfreich sind, um dieser Frage nachzugehen. Die vorliegenden Erfinder haben fünf unabhängige transgene Mauslinien mit Herz-spezifischer Expression einer mutanten Myosin schweren Kette hergestellt. Wie bei humaner HCM, zeigen diese Tiermodelle linksventrikuläre Hypertrophie, Myozyten-Hypertrophie, myozelluläre Unordnung, Fibrose, und Koronarerkrankungen kleiner Gefäße. Ausgehend von diesen Befunden sind die transgenen Mäuse der vorliegenden Erfindung ein gutes Modell für HCM und ihre Analyse sorgt für einen Einblick in die an der Entwicklung des Krankheits-Phänotyps beteiligten Mechanismen.
Es ist klar, dass mutante kontraktile Proteine das anfängliche Ergebnis der Entwicklung von HCM sind, aber Patienten sterben nicht einfach als Ergebnis von Dysfunktion der Sarkomere. Ohne auf die Theorie festgelegt zu sein, glauben die vorliegenden Erfinder, dass Mutationen in der schweren Kette von β-Myosin, Herztroponin T, α-Tropomyosin, und Herzmyosin-Bindeprotein C einen pathogenen Weg auslösen, der in einem gemeinsamen Phänotyp, der hypertrophen Kardiomyopathie, resultiert. Die vorliegende Analyse von HCM der Maus legt nahe, dass das Auftreten von histologischen Anormalitäten eines der „auslösenden" Ereignisse bei der Entwicklung von HCM sein kann. Mäuse sowohl der Linie 131 als auch der Linie 140 wiesen eine Herzhistopathologie auf, während eine erhöhte Herzmasse nur in Linie 140 gesehen wird, was nahe legt, dass das Auftreten von histologischen Anormalitäten der Entwicklung von Hypertrophie vorausgeht. Ähnliche Beispiele für HCM ohne Kammerhypertrophie sind für die Patientenpopulation berichtet worden. Die ultrastrukturellen Anormalitäten, die in diesen transgenen Mäusen beobachtet werden, legen einen möglichen Mechanismus für das „auslösende" Ereignis nahe. Die Degenerierung von Myofibrillen an der Stelle ihrer Anlagerung an die interkalierende Scheibe würde in einer Myozyte resultieren, die nicht in der Lage ist, eine Kraft auf ihren Nachbarn zu übertragen. Diese „Lücke" in der Kraft-herstellenden Maschinerie könnte dann kompensatorische Reaktionen in dem Gewebe auslösen, beispielsweise Umorientierung der umgebenden Myozyten (Unordnung) und Hypertrophie. Daher könnten geringe Expressionsniveaus eines stark dominant negativen mutanten Proteins (beispielsweise wie in den vorliegenden transgenen Mäusen beobachtet) tiefgreifende Effekte im Herz auslösen.
Ohne durch die Theorie gebunden zu sein, glauben die vorliegenden Erfinder, dass es einen Schwellenwert der Dysfunktion für Sarkomere gibt, der, wenn er überschritten wird, eine stärkere hypertrophe Reaktion auslöst. Die Natur des mutanten Proteins, die auf den Muskel anfallende Arbeitsbelastung sowie die Menge an mutantem Protein könnten alle bestimmen, wann dieser Schwellenwert erreicht wird. Daher würde man für Individuen mit zwei Kopien einer relativ gutartigen Mutation vorhersagen, dass sie einen schwereren Phänotyp aufweisen, als Familienmitglieder mit nur einer Kopie des mutanten Gens, wie berichtet worden ist. Zusätzlich würde man für Mauslinien mit höherer (Linie 140) oder geringerer (Linie 131) Expression einer mutanten Myosin schwere Kette vorhersagen, dass sie stärkere oder mildere Phänotypen aufweisen, wie durch die Daten hierin gezeigt wurde.
Beispiel 3
Das folgende Beispiel zeigt, dass ältere männliche transgene Mäuse der vorliegenden Erfindung Modell für kongestive Herzinsuffizienz sind.
Wie oben in Beispiel 2 beschrieben, wurden die Gewichte für die linken Ventrikel für gleichaltrige transgene Mäuse und ihre negativen Geschwistern des gleichen Wurfes bestimmt und auf die Länge ihrer Tibia normalisiert. Im Alter von 8 Monaten war der Grad an linksventrikulärer Hypertrophie, den man in Weibchen der Linie 140 sieht, mehr als verdoppelt auf 32%. Diese Veränderungen waren für das absolute Gewicht der linken Ventrikel (12-32%) oder bei den Ventrikelgewichten offensichtlich, wenn sie gegen die Länge der Tibia normalisiert wurden (12-28%). Im Gegensatz dazu fehlte im Alter von 8 Monaten dem durchschnittlichen Herzgewicht von Männchen der Linie 140, obwohl es immer noch leicht höher lag als das von Kontrollen, jegliche statistische Signifikanz (p > 0,1). Es gibt eine extreme Variabilität für Herz- und Körpergrößen, die man in älteren männlichen Mäusen sieht (sowohl Kontrolle als auch Transgen). Eine grobe Untersuchung von Formaldehyd-fixierter Herzen zeigte jedoch, dass die Herzen der Linie 140 insgesamt Ausmaße hatten, die viel größer waren als die der Kontrollen (Daten nicht gezeigt).
Mit Formaldehyd fixierte Herzen, sowohl der Kontrolle als auch der transgenen Linie 140, wurden axial mittels eines Einschnitts durch die vordere Fläche des linken Ventrikels halbiert. Die zwei Hälften des Herzens wurden aufgespreizt, um die linksventrikuläre Höhle zu öffnen. In dieser Position sind die Vorhöfe hinter den zwei Hälften des Herzens verborgen, die linksventrikuläre freie Wand liegt distal und die rechtsventrikuläre freie Wand liegt medial zur Ventrikelachse. Diese Gruppe (d. h. ältere männliche Mäuse der Linie 140) wiesen eine signifikante Kammerdilation auf Im Kontrollherzen hatte die linksventrikuläre Höhle eine normale halbmondförmige Gestalt (7 von 7 untersuchten Herzen), während in allen 8 Monaten alten Männchen der Linie 140 (5 untersuchte Herzen) die linksventrikuläre Höhle dilatiert und mandelförmig war.
Insgesamt wiesen in der Linie 140 ältere männliche und weibliche Mäuse unterschiedliche Phänotypen auf. Während die Herzhypertrophie in älteren weiblichen Tieren verstärkt war, wiesen männliche Mäuse der Linie 140 signifikante Dilatation des linken Ventrikels auf. Obwohl geschlechtsspezifische Unterschiede im HCM-Phänotyp nicht für Menschen berichtet worden sind, ist eine klinische Heterogenität ein Merkmal dieser Erkrankung. Zusätzlich weisen HCM-Patienten oft eine fortschreitende Wandverdünnung oder eine relative ventrikuläre Dilation mit zunehmendem Alter auf, was kongestive Herzinsuffizienz anzeigt. Die Entwicklung ventrikulärer Dilation, die zur Herzinsuffizienz im Endstadium führt (d. h. kongestive Herzinsuffizienz), ist auch für Familien berichtet worden, wo das primäre Endergebnis der Erkrankung plötzlicher Herztod ist. Die Entwicklung geschlechtsspezifischer Phänotypen in Tieren der Linie 140 stellt ein zufälliges Werkzeug zur Verfügung, um die Faktoren, die zum klinischen Verlauf kongestiver Herzinsuffizienz beitragen sowie die molekularen Mechanismen, die zu dilatierter Kardiomyopathie führen, zu entschlüsseln.
Beispiel 4
Das folgende Beispiel zeigt, dass die transgene Maus der vorliegenden Erfindung ein Modell für hypertrophe Kardiomyopathie ist, und dass ältere, männliche transgene Mäuse der vorliegenden Erfindung Modelle für kongestive Herzinsuffizienz sind, die Dilatation, Wandverdünnung und systolische Dysfunktion aufweisen.
Transgene Mäuse der vorliegenden Erfindung, die Merkmale humaner HCM aufweisen, einschließlich Myozytenhypertrophie, myozelluläre Unordnung, anormal kleine intramurale Koronararterien und signifikante LVH, wurden mit der Zeit unter Verwendung von Echokardiographie getestet. Im Alter von 3 Monaten hatten sowohl männliche als auch weibliche transgene Mäuse signifikante septale Hypertrophie (IVS = 1,19 mm gegenüber 0,85 mm in Kontrollen) mit erhaltener systolischer Funktion (%FS = 54 gegenüber 53) und Kammerausmaßen (LVEDD = 2,48 mm gegenüber 2,66 mm). Im Alter von 10 – 12 Monaten zeigten Weibchen progressive Hypertrophie und normale %FS. 10 bis 12 Monate alte Männchen hatten jedoch Kammerdilation (LVEDD = 3,48 mm), Hypertrophieverlust (NS = 0,92 mm) und reduzierte systolische Funktion (%FS = 36) entwickelt. Insgesamt weist ein genetisches Mausmodell, das entwickelt wurde, um hypertrophe Kardiomyopathie zu untersuchen, einen unerwarteten geschlechtsspezifischen Unterschied in der phänotypischen Expression von Symptomen kongestiver Herzinsuffizienz mit dem Alter auf. Dieser Verlauf spiegelt den Verlauf von Hypertrophie, die zu kongestiver Herzinsuffizienz in älteren Menschen mit Aortastenose führt, wie mittels serieller Echokardiographie dokumentiert wurde.
Sequenzprotokoll
Während verschiedene Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung im Detail beschrieben worden sind, ist offensichtlich, dass Modifikationen und Anpassungen jener Ausführungsformen dem Fachmann einfallen werden. Es versteht sich jedoch von selbst, dass solche Modifikationen und Anpassungen innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung liegen, wie sie in den folgenden Ansprüchen dargelegt sind.

Claims

Transgene Maus, die ein Modell für die Untersuchung der kongestiven Herzinsuffizienz ist, wobei die transgene Maus in ihrem Genom ein Transgen eingebaut hat, wobei das Transgen Folgendes umfasst: (a) einen Herzgewebe-spezifischen Promotor; und (b) eine Nukleinsäuresequenz, die eine Aminosäuresequenz eines α-Myosin schwere Kette-Proteins kodiert, wobei die Nukleinsäuresequenz eine erste Mutation besitzt, die eine Punktmutation umfasst, die in einer Arg403Gln-Mutation in der Aminosäuresequenz resultiert, und wobei die Nukleinsäuresequenz eine zweite Mutation besitzt. die eine interstitielle Deletion in einem Teil der Nukleinsäuresequenz umfasst, der eine Aktin-Bindedomäne kodiert, und wobei die Nukleinsäuresequenz operativ mit dem Herzgewebe-spezifischen Promotor verbunden ist; wobei das Transgen in den Herzgeweben der transgenen Maus exprimiert wird.
Transgene Maus gemäß Anspruch 1, wobei die interstitielle Deletion eine Deletion der Nukleinsäuresequenz umfasst, die wenigstens 15 Aminosäuren der Aktin-Bindedomäne kodiert.
Transgene Maus gemäß Anspruch 1, wobei die interstitielle Deletion eine Deletion der Nukleinsäuresequenz umfasst, die wenigstens 30 Aminosäuren der Aktin-Bindedomäne kodiert.
Transgene Maus gemäß Anspruch 1, wobei die interstitielle Deletion eine Deletion der Nukleinsäuresequenz umfasst, die wenigstens 45 Aminosäuren der Aktin-Bindedomäne kodiert.
Transgene Maus gemäß Anspruch 1, wobei die interstitielle Deletion eine Deletion der Nukleinsäuresequenz umfasst, die wenigstens 60 Aminosäuren der Aktin-Bindedomäne kodiert.
Transgene Maus gemäß Anspruch 1, wobei die interstitielle Deletion eine Deletion der Nukleinsäuresequenz umfasst, welche die Aminosäurereste von Position 468 bis Position 527 des α-Myosin schwere Kette-Proteins der Ratte kodiert.
Transgene Maus gemäß Anspruch 1, wobei die interstitielle Deletion von einer Nukleinsäuresequenz überbrückt wird, die einen Zusatz von Aminosäureresten kodiert, die keinen Teil der Aktin-Bindedomäne kodieren.
Transgene Maus gemäß Anspruch 7, wobei der Zusatz von Aminosäureresten eine Aminosäuresequenz von etwa 8 Aminosäureresten umfasst.
Transgene Maus gemäß Anspruch 8, wobei der Zusatz von Aminosäureresten von der Aminosäuresequenz SEQ 1D NO: 1 dargestellt wird.
Transgene Maus gemäß Anspruch 1, wobei die Nukleinsäuresequenz SEQ 1D NO: 2 ist.
Transgene Maus gemäß Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 3 ist.
Transgene Maus gemäß Anspruch 1, wobei der Herzgewebe-spezifische Promotor ein α-Myosin schwere Kette-Promotor ist.
Transgene Maus gemäß Anspruch 1, wobei die Nukleinsäuresequenz weiter 5'- und 3'-flankierende Introns und Polyadenylierungssequenzen umfasst.
Transgene Maus gemäß Anspruch 1, wobei das α-Myosin schwere Kette-Protein von einer α-Myosin schweren Kette eines Nagers stammt, der aus Ratte und Maus ausgewählt wird.
Transgene Maus gemäß Anspruch 1, wobei die Maus männlich ist.
Transgene Maus gemäß Anspruch 1, wobei die Maus wenigstens 5 Monate alt ist.
Transgene Maus gemäß Anspruch 1, wobei die Maus wenigstens 6 Monate alt ist.
Transgene Maus gemäß Anspruch 1, wobei die Maus wenigstens 7 Monate alt ist.
Transgene Maus gemäß Anspruch 1, wobei die Maus wenigstens 8 Monate alt ist.
Transgene Maus gemäß Anspruch 1, wobei das Niveau der mRNA-Expression des Transgens im Herzen der Maus wenigstens 25% des Expressionsniveaus endogener α-Myosin schwere Kette-mRNA in der Maus ist.
Transgene Maus gemäß Anspruch 1, wobei das Niveau der mRNA-Expression des Transgens im Herzen der Maus wenigstens 35% des Expressionsniveaus endogener α-Myosin schwere Kette-mRNA in der Maus ist.
Transgene Maus gemäß Anspruch 1, wobei das Niveau der mRNA-Expression des Transgens im Herzen der Maus wenigstens 45% des Expressionsniveaus endogener α-Myosin schwere Kette-mRNA in der Maus ist.
Transgene Maus gemäß Anspruch 1, wobei das Niveau der mRNA-Expression des Transgens im Herzen der Maus wenigstens 55% des Expressionsniveaus endogener α-Myosin schwere Kette-mRNA in der Maus ist.
Transgene Maus gemäß Anspruch 1, wobei das durch das Transgen kodierte Protein wenigstens 1% der Gesamtmenge von Myosinprotein nach Masse im Herzen der Maus beträgt.
Transgene Maus gemäß Anspruch 1, wobei das durch das Transgen kodierte Protein wenigstens 3% der Gesamtmenge von Myosinprotein nach Masse im Herzen der Maus beträgt.
Transgene Maus gemäß Anspruch 1, wobei das durch das Transgen kodierte Protein wenigstens 9% der Gesamtmenge von Myosinprotein nach Masse im Herzen der Maus beträgt.
Transgene Maus gemäß Anspruch 1, wobei das durch das Transgen kodierte Protein wenigstens 12% der Gesamtmenge von Myosinprotein nach Masse im Herzen der Maus beträgt.
Transgene Maus gemäß Anspruch 1, wobei die Maus eine Dilatation von wenigstens einer Herzkammer aufweist.
Transgene Maus gemäß Anspruch 28, wobei die Herzkammer der linke Ventrikel ist.
Transgene Maus gemäß Anspruch 1, wobei die Maus eine linksventrikuläre Enddiastolische Ausdehnung (LVEDD) von zwischen 2,7 mm und 4,0 mm besitzt.
Transgene Maus gemäß Anspruch 1, wobei die Maus Herzwände besitzt, die wenigstens 10% dünner sind als die Herzwände einer Maus, die das Transgen nicht trägt.
Transgene Maus gemäß Anspruch 1, wobei die Maus Herzwände besitzt, die wenigstens 30% dünner sind als die Herzwände einer Maus, die das Transgen nicht trägt.
Transgene Maus gemäß Anspruch 1, wobei die Maus Herzwände besitzt, die wenigstens 50% dünner sind als die Herzwände einer Maus, die das Transgen nicht trägt.
Transgene Maus gemäß Anspruch 1, wobei die Maus Herzwände besitzt, die wenigstens 70% dünner sind als die Herzwände einer Maus, die das Transgen nicht trägt.
Transgene Maus gemäß Anspruch 1, wobei die Maus eine systolische Dysfunktion aufweist, die durch einen Prozentsatz der fraktionalen Verkürzung (%FS) von zwischen %FS = 18 und %FS = 30 angezeigt wird.
Transgenes nicht-humanes Säugetier, das ein Modell für die Untersuchung der kongestiven Herzinsuffizienz ist, wobei das transgene nicht-humane Säugetier in seinem Genom ein Transgen eingebaut hat, wobei das Transgen Folgendes umfasst: (a) einen Herzgewebe-spezifischen Promotor; und (b) eine Nukleinsäuresequenz, die eine Aminosäuresequenz eines α-Myosin schwere Kette-Proteins kodiert, wobei die Nukleinsäuresequenz eine erste Mutation besitzt, die eine Punktmutation umfasst, die in einer Arg403Gln-Mutation in der Aminosäuresequenz resultiert, und wobei die Nukleinsäuresequenz eine zweite Mutation besitzt. die eine interstitielle Deletion in einem Teil der Nukleinsäuresequenz umfasst, der eine Aktin-Bindedomäne kodiert, und wobei die Nukleinsäuresequenz operativ mit dem Herzgewebe-spezifischen Promotor verbunden ist; wobei das Transgen in den Herzgeweben des transgenen nicht-humanen Säugetiers exprimiert wird.
Rekombinantes Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die eine Aminosäuresequenz eines α-Myosin schwere Kette-Proteins kodiert, wobei die Nukleinsäuresequenz eine erste Mutation besitzt, die eine, Punktmutation umfasst, die in einer Arg403Gln-Mutation in der Aminosäuresequenz resultiert, und wobei die Nukleinsäuresequenz eine zweite Mutation besitzt, die eine interstitielle Deletion in einen Teil der Nukleinsäuresequenz umfasst, welche eine Aktin-Bindedomäne kodiert; wobei die Nukleinsäuresequenz operativ mit einer oder mehreren Expressionskontrollsequenzen verbunden ist.
Rekombinantes Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 37, wobei eine der Expressionskontrollsequenzen ein Herzgewebe-spezifischer Promotor ist.
Rekombinantes Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 38, wobei der Herzgewebespezifische Promotor ein α-Myosin schwere Kette-Promotor ist.
Rekombinantes Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 37, wobei die interstitielle Deletion eine Deletion der Nukleinsäuresequenz umfasst, die wenigstens 15 Aminosäuren der Aktin-Bindedomäne kodiert.
Rekombinantes Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 37, wobei die interstitielle Deletion eine Deletion der Nukleinsäuresequenz umfasst, welche die Aminosäurereste von Position 468 bis Position 527 des α-Myosin schwere Kette-Proteins der Ratte kodiert.
Rekombinantes Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 37, wobei die interstitielle Deletion von einer Nukleinsäuresequenz überbrückt wird, die einen Zusatz von Aminosäureresten kodiert, die keinen Teil der Aktin-Bindedomäne des α-Myosin-Proteins kodieren.
Rekombinantes Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 37, wobei die Nukleinsäuresequenz SEQ 1D NO: 2 ist.
Rekombinantes Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 37, wobei die Aminosäuresequenz SEQ 1D NO: 3 ist.
Ex vivo-Verfahren zur Untersuchung der molekularen und zellulären Ereignisse, die mit der kongestiven Herzinsuffizienz assoziiert sind, wobei das Verfahren den folgenden Schritt umfasst: Vergleichen von Zellen und Geweben, die zuvor von einer transgenen Maus gemäß Anspruch 1 abgeerntet wurden, mit Zellen und Geweben, die zuvor von einer Maus, die ausgewählt ist aus (i) einer Maus, die das Transgen nicht trägt und (ii) einer weiblicher transgenen Maus, in einem Assay, der ausgewählt ist aus morphologischer Untersuchung von Herzzellen; histologischer Untersuchung koronarer Gefäße; histologischer Untersuchung von Herzschnitten; histologischer Untersuchung von Myozyten; histologischer Untersuchung von Myofibrillen; Auswertung der DNA-Replikation und -Expression in Herz-Myozyten; Auswertung von Herz-bezogener Enzymaktivität; und Auswertung von Apoptose von Herzzellen.
Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die zur Behandlung kongestiver Herzinsuffizienz nützlich sind, wobei das Verfahren den folgenden Schritt umfasst: Vergleichen physiologischer und pathologischer Veränderungen von (i) einer transgenen Maus gemäß Anspruch 1, die eine Verbindung, die ausgewertet werden soll, erhalten hat, mit (ii) einer transgenen Maus gemäß Anspruch 1, die die Verbindung nicht erhalten hat.
Verfahren zur Auswertung der Effekte externer Faktoren, die ausgewählt sind aus Diät und Leibesübung, auf die kongestive Herzinsuffizienz, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Etablierung eines normalen Kontroll-Verabreichungsschemas für einer externen Faktor, der aus Diät und Leibesübung ausgewählt ist, in einer ersten transgenen Maus gemäß Anspruch 1; (b) Modulierung des Verabreichungsschemas für den externen Faktor in einer zweiten transgenen Maus gemäß Anspruch 1; und (c) Überwachung der zweiten transgenen Maus hinsichtlich einer Veränderung in einem Charaktertstikum, das mit der kongestiven Herzinsuffizienz assoziiert ist, im Vergleich mit der ersten transgenen Maus.
Ex vivo-Verfahren zur Untersuchung der molekularen und zellulären Ereignisse eines Erkrankungszustands, der mit kongestiver Herzinsuffizienz assoziiert ist, wobei das Verfahren den folgenden Schritt umfasst: Vergleichen von Zellen und Geweben, die zuvor von einer transgenen Maus gemäß Anspruch 1 abgeerntet wurden, mit Zellen und Geweben, die zuvor von einer Maus abgeerntet wurden, die ausgewählt wurde aus (i) einer Maus, welche das Transgen nicht trägt, und (ii) einer weiblichen transgenen Maus, um einen Erkrankungszustand zu bewerten, der mit kongestiver Herzinsuffizienz assoziiert ist, wobei der Erkrankungszustand ausgewählt wird aus dilatierter Kardiomyopathie, hypertropher Kardiomyopathie, akuter aortischer Regurgitation, Trikuspidstenose, konstriktiver Perikarditis, akuter infektiöser Endokarditis, ischämischer Herzerkrankung, Bluthochdruck, einer primären myokardialen Erkrankung, Klappenerkrankung, perikardialer Erkrankung, Hyperthyroidismus, Anämie, arteriovenöser Fistel, Beriberi und der Paget-Krankheit.
Verfahren, um eine transgene Maus gemäß Anspruch 1 zu erzeugen, die ein Modell für die Untersuchung von Herzversagen ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Einführen eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls gemäß Anspruch 38 in eine embryonale Zelle einer Maus; und (b) Erhalten von Nachwuchs, der das rekombinante Nukleinsätiremolekül stabil im Genom inkorporiert besitzt, wobei das rekombinante Nukleinsäuremolekül in den Herzgeweben der Nachkommen exprimiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 49, wobei das Verfahren weiter den folgenden Schritt umfasst: (c) Auswählen des männlichen Nachwuchses aus dem Nachwuchs, der das Transgen stabil im Genom inkorporiert besitzt.
Verfahren gemäß Anspruch 50, wobei der Schritt (c) der Auswahl weiter die Auswahl männlicher Nachkommenschaft, die wenigstens 5 Monate alt ist, umfasst.
Transgene Maus, die ein Modell für hypertrophe Kardiomyopathie ist, wobei die transgene Maus in ihrem Genom ein Transgen inkorporiert besitzt, wobei das Transgen Folgendes umfasst: (a) einen Herzgewebe-spezifischen Promotor; und (b) eine Nukleinsäuresequenz, die eine Aminosäuresequenz eines α-Myosin schwere Kette-Proteins kodiert, wobei die Nukleinsäuresequenz eine erste Mutation besitzt, die eine Punktmutation umfasst, die in einer Arg403Gln-Mutation in der Aminosäuresequenz resultiert, und wobei die Nukleinsäuresequenz eine zweite Mutation besitzt, die eine interstitielle Deletion in einem Teil der Nukleinsäuresequenz umfasst, der eine Aktin-Bindedomäne kodiert, und wobei die Nukleinsäuresequenz operativ mit dem Herzgewebe-spezifischen Promotor verbunden ist; wobei das Transgen in den Herzgeweben der transgenen Maus in einer Konzentration exprimiert wird, die ausreicht, um hypertrophe Kardiomyopathie in der Maus zu fördern.