DE69830737T2

DE69830737T2 - Transgene tiermodelle für herz-hypertrophie und deren verwendungen

Info

Publication number: DE69830737T2
Application number: DE69830737T
Authority: DE
Inventors: R. Stephen GRANT; N. Eric Olson; D. Jeffrey MOLKENTIN
Original assignee: University of North Texas; University of Texas System; University of North Texas Health Science Center
Current assignee: University of North Texas; University of Texas System; University of North Texas Health Science Center
Priority date: 1997-10-16
Filing date: 1998-10-16
Publication date: 2006-06-01
Anticipated expiration: 2018-10-17
Also published as: DE69830737D1; AU9805898A; WO1999019473A1; AU755428B2; CA2306448A1; EP1025216A1; EP1025216B1; JP2001520010A; US6201165B1; JP2008253274A; US6673768B1; AU748334B2; AU1099299A; EP1645634A2; US6657104B1; WO1999019471A1; ES2241173T3; JP2001520170A; EP1645634A3; ATE298793T1

Description

FACHGEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von transgenen Tiermodellen für Herzhypertrophie. Sie betrifft weiter die Verwendung von solchen transgenen Tieren zum Nachweis von Substanzen mit therapeutischer Aktivität gegen Herzhypertrophie. Sie betrifft weiter die Verwendung einer Zusammensetzung für die Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von Herzhypertrophie.
HINTERGRUND
Herzhypertrophie
Herzhypertrophie ist eine adaptierte Reaktion des Herzens auf praktisch alle Herzerkrankungsformen, einschließlich solcher, die durch Hypertonie, mechanische Belastung, Myocardinfarkt, Herzarrhythmie, endokrine Störungen und genetische Mutationen in das Herz betreffenden Genen für kontraktile Proteine hervorgerufen werden. Während die hypertrophe Reaktion anfänglich ein kompensatorischer Mechanismus ist, der das Herzzeitvolumen erhöht, kann anhaltende Hypertrophie zu dilatierter Kardiomyopathie, Herzinsuffizienz und plötzlichem Tod führen. In den Vereinigten Staaten wird jährlich bei etwa einer halben Millionen Menschen Herzinsuffizienz diagnostiziert, wobei sich die Sterberate etwa 50% nähert.
Trotz der verschiedenen Stimuli, die zu Herzhypertrophie führen, gibt es eine prototypische molekulare Endreaktion von Cardiomyocyten auf hypertrophe Signale, die eine Steigerung der Zellgröße und Proteinsynthese, erhöhte Sarkomerorganisation, Hochregulierung der fötalen das Herz betreffender Gene und Induktion von Immediate-Early-Genen, wie beispielsweise c-fos und c-myc einbezieht. Siehe Chien et al. (1993) Ann. Rev. Physiol. 55: 77–95; und Sadoshima und Izumo (1997) Ann. Rev. Physiol. 59: 551–571. Die Ursachen und Wirkungen von Herzhypertrophie wurden ausführlich dargelegt, aber die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen, die die an der Zellmembran initiierten hypertrophen Signale mit der Reprogrammierung der Cardiomyocyten-Genexpression koppeln, verbleiben dürftig verstanden. Die Aufklärung dieser Mechanismen spielt eine zentrale Rolle in der kardiovaskulären Biologie und ist für den Entwurf neuer Strategien zur Prävention oder Behandlung von Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz entscheidend.
Zahlreiche Studien bringen intrazelluläres Ca²⁺ als ein Signal für Herzhypertrophie in Verbindung. Als Reaktion auf Myocytenstreckung oder erhöhte Belastungen auf Working-Heart-Präparationen steigen die intrazellulären Ca²⁺-Konzentrationen an (Marban et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 6005–6009; Bustamante et al. (1991) J. Cardiovasc. Pharmacol. 17: S110–S113; Hongo et al. (1995) Am. J. Physol. 269: C690–C697), welches mit einer Rolle von Ca²⁺ in der Koordination von physiologischen Reaktionen mit verstärktem Herzzeitvolumen übereinstimmt. Eine Vielzahl von humoralen Faktoren, einschließlich Angiotensin II (AngII), Phenylephrin (PE) und Endothelin-1 (ET-1), die die hypertrophe Reaktion in Cardiomyocyten induzieren, teilen ebenfalls die Fähigkeit intrazelluläre Ca²⁺-Konzentrationen zu erhöhen. Karliner et al. (1990) Experientia 46: 81–84; Sadoshima und Izumo (1993) Circ. Res. 73: 424–438; Sadoshima et al. (1993) Cell 75: 977–984; und Leite et al. (1994) Am. J. Physiol. 267: H2193–H2203.
Hypertrophe Stimuli haben die Reprogrammierung der Genexpression im adulten Myocard zur Folge, so dass die Gene, die die fötalen Proteinisoformen, wie die schwere Kette des β-Myosins (MHC) und Skelett-α-Aktin kodieren, hochreguliert werden, während die entsprechenden adulten Isoformen, α-MHC und das Herz betreffendes α-Aktin herunterreguliert werden. Die natriuretischen Peptide, atrialer nutriuretischer Faktor (ANF) und b-Typ natriuretisches Peptid (BNP), die den Blutdruck durch Vasodilatation und Natriurese senken, werden im Herzen ebenfalls als Reaktion auf hypertrophe Signale schnell hochreguliert. Komuro und Yazaki (1993) Ann. Rev. Physiol. 55: 55–75. Die bei der koordinierten Regulierung dieser das Herz betreffenden Gene während Hypertrophie beteiligten Mechanismen sind nicht bekannt, obwohl die Bindungsstellen für mehrere Transkriptionsfaktoren, einschließlich Serum-Response-Faktor (SRF), TEF-1, AP-1 und SP1 für die Aktivierung von fötalen das Herz betreffenden Genen als Reaktion auf Hypertrophie wichtig sind. Sadoshima und Izumo (1993); Sadoshima et al. (1993); Kariya et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 3775–3782; Karns et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 410–417; und Kovacic-Milivojevic et al. (1996) Endocrinol. 137: 1108–1117. Kürzlich wurde gezeigt, dass der Herz-restringierte Zinkfinger-Transkriptionsfaktor GATA4 ebenfalls zur Transkriptionsaktivierung der Gene für Ang II Typ 1a Rezeptor und β- MHC während Hypertrophie erforderlich ist. Herzig et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 7543–7548; Hasegawa et al. (1997) Circulation 96: 3943–3953; und Molkentin und Olson (1997) Circulation 96: 3833–3835.
Eine Reihe intrazellulärer Signalwege sind bei der Transduktion von hypertrophen Stimuli beteiligt. Zum Beispiel führt die Besetzung der Zelloberflächenrezeptoren für AngII, PE und ET-1 zur Aktivierung von Phospholipase C, wodurch die Herstellung von Diacylglycerol und Inositoltriphosphatat folgt, welches wiederum die Mobilisierung von intrazellulärem Ca²⁺ und Aktivierung von Proteinkinase C (PKC) zur Folge hat. Sadoshima und Izumo (1993); Yamazaki et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 3221–3228; und Zou et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 33592–33597. Es gibt ebenfalls Hinweise, dass die Pfade der Ras- und Mitogen-aktivierten Protein (MAP) Kinase hypertrophe Signale transduzieren. Thorburn et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 2244–2249; und Force et al. (1996) Circ. Res. 78: 947–953. Das Ausmaß, in dem diese Signalwege während Herzhypertrophie koordiniert werden, ist nicht bekannt. Dennoch sind all diese Wege mit einer Zunahme von intrazellulärem Ca²⁺ assoziiert, welches mit der zentralen regulatorischen Rolle von Ca²⁺ in der Koordinierung der Aktivitäten von multiplen hypertrophen Signalwegen übereinstimmt.
Es wurde gezeigt, dass in B- und T-Zellen die Ca²⁺-, Calmodulin-abhängige Phosphatase Calcineurin intrazelluäre Signalwege verbindet, die eine Erhöhung von intrazellulärem Ca²⁺ mit einer Aktivierung der Immunantwort zur Folge haben. Calcineurin reguliert Immunantwort-Genen durch Dephosphorylierung einer als NF-Ats (nucleare Faktoren aktivierter T-Zellen) bekannten Transkriptionsfaktorenfamilie. Rao et al. (1997) Ann. Rev. Immunol. 15: 707–747. Sind die NF-AT Transkriptonsfaktoren erst durch Calcineurin dephosphoryliert, verlagern sich die NF-AT Transkriptionsfaktoren zum Kern und aktivieren direkt Immunantwort-Gene. Flanagan et al. (1991) Nature 352: 803–807; Loh et al. (1996) Mol. Cell. Biol. 16: 3945–3954; und Loh et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 10884–10891. Die immunsuppressiven Stoffe Cyclosporin A (CsA) und FK506 unterdrücken die Immunantwort durch Inhibierung der Fähigkeit des Calcineurins, NF-AT Transkriptionsfaktoren zu aktivieren. Shaw et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 11205–11209; Loh et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 10884–10891.
Es gibt keine spontanen Mutationen der Maus, die ausreichende Ähnlichkeiten zu Herzhypertrophie haben, um als experimentelle Modelle nützlich zu sein. Eine transgene Nagetier-Linie, die Calmodulin unter der Kontrolle des Gens für humanen atrialen natriuretischen Faktor überexprimiert, wurde hergestellt. Gruver et al. (1993) Endocrinology 133: 376–388. In diesen Mäusen bewirkte eine entwickelte CaM-Überexpression in Cardiomyocyten der Maus eine deutlich übertriebene Herzwachstumsreaktion, die durch das Vorhandensein von Cardiomyocyten-Hypertrophie in Bereichen, von denen gezeigt wurde, dass diese CaM überexprimieren, und durch Cardiomyocyten-Hyperplasie, die in frühen Entwicklungsstadien sichtbar wird, gekennzeichnet ist. Dennoch ist die Expression von Calmodulin in diesen Tieren konstitutiv und spiegelt somit nicht physiologische Bedingungen in Menschen wider. Transgene Mäuse wurden geschaffen, in denen ein Reportergen von einem Tetracyclin-kontrollierten Transaktivator (tTA) reguliert wird, der wiederum unter Transkriptionskontrolle von 2,9 kb der 5' flankierenden Sequenz der schweren Kette des α-Myosins der Ratte ist. Yu et al. (1996) Circ. Res. 79.79: 691–697.
Der gegenwärtige medizinische Umgang mit Herzhypertrophie schließt die Verwendung von drei Stoffarten ein: Calciumkanalblocker, β-adrenerge Blocker und Diisopyramid. Kikura und Levy (1995) Int. Anesthesiol. Clin. 33: 21–37. Therapeutika für Herzinsuffizienz schließen Angiotensin II konvertierendes Enzym (ACE)-Inhibitoren und Diuretika ein. Andere Pharmazeutika, die für die Behandlung von Herzhypertrophie offenbart wurden, schließen Angiotension II Rezeptorantagonisten (U.S. Patentnr. 5,604,251); und Newopeptid Y-Antagonisten (internationale Patentveröffentlichungsnr. WO 98/33791) ein. Trotz gegenwärtig erhältlicher pharmazeutischer Verbindungen stellen Prävention und Behandlung von Herzhypertrophie und nachfolgender Herzinsuffizienz bis heute eine therapeutische Herausforderung dar.
Somit gibt es einen Bedarf für die Entwicklung neuer pharmakologischer Strategien für die Prophylaxe und Behandlung von Herzhypertrophie in Menschen. Um solche Strategien zu entwickeln, gibt es einen Bedarf an Tiermodellen, die das pathologische Profil der Erkrankung genau widerspiegeln, um die Identifizierung von neuen Zielen für eine therapeutische Intervention zu ermöglichen. Zusätzlich gibt es einen Bedarf an neuen Tests, um die Identifizierung von potentiellen neuen Therapeutika zur Behandlung von Herzhypertrophie zu erlauben.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung verwendet nicht-humane Tiere als Modelle. Solche Modelle sind für die Identifizierung zusätzlicher Ziele für die Behandlung von Herzhypertrophie und für das Testen von Substanzen hinsichtlich Wirksamkeit für die Behandlung von Herzhypertrophie nützlich. In einem Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung eines transgenen, nicht-humanen Tieres bereit, das als ein Transgen ein Polynucleotid umfasst, das, wenn es in einem frühen Stadium in ein befruchtetes Ei oder Embryo eines zu den Säugetieren gehörigen, nicht-humanen Tieres eingeführt wird, in das Genom davon funktional integriert werden kann, wobei ein transgenes Tier hergestellt wird, das dadurch gekennzeichnet ist, dass das Polynucleotid eine Nucleotidsequenz, die Calcineurin kodiert, das Transkription von wenigstens einem Gen moduliert, das in Cardiomyocyten als Reaktion auf ein das Herz betreffendes hypertrophes Signal exprimiert wird, in Kombination mit Kontrollsequenzen, einschließlich, zum Beispiel, einen Promotor, der Expression des Gens in somatischen Zellen des transgenen Tieres, insbesondere in Cardiomyocyten, steuert und reguliert, umfasst.
Solch transgene Tiere sind für die Identifizierung neuer Ziele für die Prophylaxe und Therapie von Herzhypertrophie und von durch Herzhypertrophieinduzierten Funktionsstörungen nützlich. Diese Tiere sind ebenfalls für Forschungszwecke nützlich, zur Untersuchung von Signaltransduktionswegen, die an der Reaktion auf hypertrophe Signale beteiligt sind. Diese Tiere sind weiter für die Suche nach potentiellen therapeutischen Mitteln für die Behandlung und/oder Prophylaxe von Herzhypertrophie nützlich.
Vorzugsweise ist das zum Erzeugen eines transgenen Tieres verwendete Polynucleotid ein rekombinantes DNA Konstrukt, in dem der Promotor und wenigsten einige Kontrollsequenzen die Expression einer funktional verbundenen kodierenden Sequenz steuern. In einigen Ausführungsformen werden der Promotor und die Kontrollsequenzen auf eine Cardiomyocyten-spezifische Weise exprimiert. Die kodierende Sequenz wird an ein stromabwärts gelegenes Segment fusioniert, das wenigsten ein Fragment einer eukaryotischen Gensequenz umfasst, das Signale zur Transkriptionsterminierung oder zur Kontrolle des Prozessierens von transkribierter RNA während der Expression des kodierten Genproduktes wirksam bereitstellt. In einer Ausführungsform stammt der Promotor von einem Gen für die schweren Kette des α-Myosins (α-MHC) ab. In anderen Ausführungsformen umfassen die Transkriptionskontrollsequenzen Elemente, die die induzierbare Expression der funktional verbundenen kodierenden Sequenz übertragen. In einigen Ausführungsformen umfasst das transgene Tier ein Transgen, das ein Polypeptid kodiert, das Transkription von wenigsten einem Herzhypertrophie-sensitiven Gen moduliert. In diesen Ausführungsformen kann das Polypeptid eine Wildtyp-Aminosäuresequenz oder eine mutierte Aminosäuresequenz umfassen, so dass das Polypeptid eine veränderte Funktion hat, wie beispielsweise eine veränderte enzymatische Funktion, oder veränderte regulatorische Eigenschaften hat, einschließlich, zum Beispiel, eine dominante negative Mutante. In anderen Ausführungsformen ist das Transgen-kodierte Genprodukt ein Antisense-Polynucleotid. In noch anderen Ausführungsformen ist das Transgen-kodierte Genprodukt Ribozym.
Die Konstrukte werden in Tierembryonen unter Verwendung von Standardtechniken, wie beispielsweise Mikroinjektion oder embryonale Stammzellen eingeführt. Zellkulturmodelle können ebenfalls durch verschiedene Verfahren präpariert werden. Zum Beispiel können Zellen aus den transgenen Tieren isoliert werden oder aus etablierten Zellkulturen unter Verwendung der gleichen Konstrukte mit Standardzelltransfektionstechniken präpariert werden.
Konstrukte für die Verwendung zum Erzeugen von transgenen Tieren können so konstruiert werden, dass die Expression des Transgens konstitutiv oder induzierbar ist. Ein Polynucleotid für die Verwendung zum Erzeugen eines trangenen Tieres umfasst eine Nucleotidsequenz, die ein Genprodukt kodiert, das Transkription von wenigsten einem Gen moduliert, das in Cardiomyocyten als Reaktion auf ein hypertrophes Signal exprimiert wird. In einem Aspekt wird die Nucleotidsequenz, die ein Genprodukt kodiert, das Transkription von wenigsten einem Gen moduliert, in Cardiomoycyten als Reaktion auf ein hypertrophes Signal konstitutiv exprimiert. In einem anderen Aspekt wird das Gen, das ein Genprodukt kodiert, das Transkription von wenigsten einem Gen moduliert, das in Cardiomyocyten als Reaktion auf ein hypertrophes Signal exprimiert wird, auf eine regulierbare Weise exprimiert. In einem anderen Aspekt umfasst das Gen, das ein Genprodukt kodiert, das Transkription von wenigstens einem Gen moduliert, das in Cardiomyocyten als Reaktion auf ein hypertrophes Signal exprimiert wird, einen Teil, der eine dominante negative Mutante eines Polypeptids kodiert.
Ein transgenes Tier kann, als ein Transgen, ein Gen umfassen, das ein Genprodukt kodiert, das die Transkription von wenigstens einem Gen, das in Cardiomyocyten als Reaktion auf ein hypertrophes Signal exprimiert wird, unterdrückt. Das Transgen-kodierte Genprodukt ist Calcineurin, das im Allgemeinen die Transkription von Genen induziert, die auf Herzhypertrophie reagieren.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung von Cardiomyocyten, die aus den oben-beschriebenen transgenen Tieren isoliert werden. Aus transgenen Tieren isolierte Cardiomyocyten können zum Testen der cardiotherapeutischen Eigenschaften von Substanzen verwendet werden, denen die Zellen in vitro ausgesetzt sind. Somit sind die Zellen für die Suche nach potentiellen Therapeutika für die Behandlung und/oder Prophylaxe von Herzhypertrophie nützlich. Solche Zellen können ebenfalls verwendet werden, um neuartige Ziele für die Prophylaxe und Therapie von Herzhypertrophie und von durch Herzhypertrophie induzierten Funktionsstörungen zu identifizieren. Diese Zellen sind ebenfalls für Forschungszwecke, für die Untersuchung von Signaltransduktionswegen, die an der Reaktion auf hypertrophe Signale beteiligt sind, nützlich.
Die Erfindung stellt somit die Verwendung solcher Zellen für die Suche nach Substanzen für die Verwendung zur Behandlung eines durch Herzhypertrophie induzierten Erkrankungszustandes (Funktionsstörung) bereit.
In einigen Ausführungsformen werden Suchtests, die auf Enzymen basieren, bereitgestellt, worin die verwendeten Enzyme an der Modulierung von Gehalten des aktiven Produktes von wenigstens einem Gen, das in Cardiomyocyten als Reaktion auf ein hypertrophes Signal exprimiert wird, beteiligt sind. Die Verfahren beziehen im Allgemeinen das In-Kontakt-Bringen des Enzyms mit einer zu testenden Substanz und das Messen einer Aktivität des Enzyms, verglichen mit einer Kontrollprobe, die das Enzym bei Nichtvorhandensein der zu testenden Substanz umfasst, ein.
In anderen Ausführungsformen werden auf Zellen basierende Suchtests bereitgestellt, worin im Wesentlichen isolierte Cardiomyocyten mit einer zu testenden Substanz in Kontakt gebracht werden, gefolgt von dem Messen einer Cardiomyocyten-Funktion oder Parameters. Eine Veränderung der gemessenen Cardiomyocytenfunktion im Vergleich mit einer Kontrollzellprobe, zu der keine Substanz hinzugefügt wird, ist ein Hinweis, dass die Substanz für die Verwendung bei der Behandlung einer Herzhypertrophie-induzierten Funktionsstörung geeignet ist. In einigen dieser Ausführungsformen stammen die Cardiomyocyten von einem transgenen Tier, wie oben beschrieben, ab. In anderen Ausführungsformen stammen die Cardiomyocyten von einem nichtransgenen Tier ab.
In noch anderen Ausführungsformen werden Suchtests bereitgestellt, die auf Ganztiermodellen basieren. Diese Ausführungsformen umfassen die Verwendung von transgenen Tieren oder von den daraus isolierten Herzen für das Testen von cardiotherapeutischen Eigenschaften von Substanzen, die an besagte Tiere verabreicht werden, oder für das Testen der Aktivität von solchen Substanzen, die Entwicklung von hypertropher Cardiomyopathie zu kontrollieren oder zu inhibieren. Das Verfahren zur Suche und Identifizieren oder Testen eines Stoffes oder anderer Substanzen hinsichtlich Aktivität entgegen der Entwicklung von oder bei der Behandlung von hypertropher Cardiomyopathie umfasst Behandeln eines transgenen Tieres oder des aus dem Tier isolierten Herzens mit besagtem Stoff oder anderer betreffender Substanz und Nachweisen oder Bemerken einer verringerten Häufigkeit, hypertrophe Cardiomyopathie zu entwickeln und Verringerung der Morbidität im Vergleich mit entsprechenden Tieren, die nicht mit dem Stoff oder der Substanz behandelt werden, oder Nachweisen oder Bemerken einer Wirksamkeit, die Herzfunktion beizubehalten, wiederherzustellen oder zu verbessern.
Die Erfindung stellt weiter die Verwendung einer Zusammensetzung für die Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz bereit. Solche Zusammensetzungen schließen Substanzen ein, die die aktiven Gehalte eines oder mehrerer Genprodukte steigern, die normalerweise die Transkription von wenigstens einem Gen unterdrücken, das in Cardiomyocyten als Reaktion auf ein hypertrophes Signal exprimiert wird, wodurch die Expression von wenigstens einem Gen, das in Cardiomyocyten als Reaktion auf ein hypertrophes Signal exprimiert wird, verringert wird. Solche Zusammensetzungen schließen ebenfalls Substanzen ein, die die aktiven Gehalte eines oder mehrerer Genprodukte verringern, die normalerweise die Transkription von wenigsten einem Gen, das in Cardiomyocyten als Reaktion auf ein hypertrophes Signal exprimiert wird, steigern, wodurch die Expression von wenigstens einem Gen verringert wird, das in Cardiomyocyten als Reaktion auf ein hypertrophes Signal exprimiert wird. Weiter eingeschlossen sind Substanzen, die bekannte Modulatoren von Genprodukten sind, die die Transkription von wenigstens einem Gen modulieren, das in Cardiomyocyten als Reaktion auf ein hypertrophes Signal exprimiert wird, für die Verwendung zur Behandlung einer durch Hypertrophie induzierten Funktionsstörung. Eingeschlossen sind bekannte Calcineurin-Inhibitoren und Derivate dieser Inhibitoren, die eine Phosphataseaktivität von Calcineurin inhibieren.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 stellt ein Modell der nuclearen Signale und der Transkriptionskontrolle der Hypertrophie-induzierten embryonalen Genexpression dar. Die verwendetet Abkürzungen sind wie folgt: VDCC, Spannungsabhängiger Calciumkanal; PLC, Phospholipase C; AngII, Angiotensin II; Et-1, Endothelin-1; DAG, Diacylglycerol; PKC, Proteinkinase C; IP3, Inositol-3-Phosphat; CAM, Calmodulin.
2 zeigt die Inhibierung von Angiotensin II- und Phenylephrin-induzierter Hypertrophie von primären Cardiomyocyten durch CsA und FK506. A–F, Primäre Cardiocyten der Ratte wurden mit AngII (10 nM) oder PE (10 μm) in Serum-freiem Medium 72 Stunden stimuliert. Die Zellen wurden dann fixiert und zur Darstellung der Sarkomere mit anti-α-Aktinin Antikörper und zur Darstellung der Zellkerne mit Höchst-Farbstoff gefärbt. Zu einem Kulturansatz wurde gleichzeitig AngII CsA (500 ng/ml) zugegeben. G, Gesamt-RNA wurde aus primären Cardiocyten-Kulturen, die mit AngII bei Vorhandensein oder Nichtvorhandensein von CsA wie in A behandelt wurden, isoliert, und hinsichtlich Expression von GAPDH und ANF Transkripten mittels Dot-Blot untersucht. H, Primäre Cardiomyocyten der Ratte wurden mit einem Luciferase-Reportergen transient transfiziert, das an 3 Tandemkopien der NF-AT Konsensus-Bindestelle verbunden war. Die Zellen wurden dann mit AngII oder PE bei Vorhandensein oder Nichtvorhandensein von CsA, wie oben beschrieben, behandelt. Achtundvierzig Stunden später wurden die Zellen geerntet und die Luciferaseaktivität wurde bestimmt.
3 zeigt Photographien von Herzen von α-MHC Calcineurin-transgenen Mäusen. A, Kontrolle und α-MHC Calcineurin-transgene Wurfgeschwister wurden im Alter von 18 Tagen getötet, und die Herzen wurden entfernt und photographiert. B, C, Von den in A gezeigten Herzen wurden Längsschnitte angefertig, um die Ventrikelkammern und Ventrikelseptum anzuzeigen. D, E, Stark vergrößerte Ansicht der linken Ventrikelwände der in B und beziehungsweise C gezeigten Herzen. F, G, Querschnitte durch Herzen von Kontroll- und Calcineurin-transgenen Tieren im Alter von 9 Wochen, die mit H&E gefärbt wurden. H, Die in G dargestellten Schnitte aus dem Calcineurin-transgenen Herzen wurden mit Masson-Trichrom gefärbt, um Kollagen aufzuzeigen. ca, Koronararterie; la, linker Vorhof; lv, linker Ventrikel; ra, rechter Vorhof; rv, rechter Ventrikel. Balken in B, C, F, G, H = 1 mm. Balken in D, E = 50 μm.
4 veranschaulicht die Ergebnisse der Behandlung von α-MHC-Calcineurin Mäusen mit CsA. A) Die Vorgehensweise für eine CsA-Behandlung wird dargestellt. B) α-MHC Calcineurin-transgene und nicht-transgene Mäuse wurden mit oder ohne CsA (25 mg/kg) behandelt, wie angezeigt. Herz-Körper Gewichtsverhältnisse werden ± Standardabweichungen ausgedrückt. Transgene Wurfgeschwister, die von dem männlichen Calcineurin-trangenen Tier #37 erhalten wurden, wurden im Alter von 9 Tagen beginnend mit CsA oder Vehikel alleine, wie in Beispiel 2 beschrieben, behandelt. Im Alter von 25 Tagen wurden die Tiere getötet und die Herzen wurden entfernt und Längsschnitte angefertigt. C) Hämatoxylin und Eosin-gefärbte Schnitte des Herzens aus nichtransgenen (Kontrolle) und transgenen Mäusen, die mit Vehikel (mittlere Spalte) oder CsA (rechte Spalte) behandelt wurden. la, linker Vorhof; lv, linker Ventrikel; ra, rechter Vorhof; rv, rechter Ventrikel. Der rechte Vorhof wurde aus der Kontrolle und beide Vorhöfe wurden aus den mit CsA behandelten transgenen Tieren entfernt. Balken = 2 mm.
5 zeigt Photographien von Herzen von α-MHC CaMKIV transgenen Mäusen. Kontroll- und α-MHC-CaMKIV transgene Wurfgeschwister wurden im Alter von 3 Wochen getötet, und die Herzen wurden entfernt und Längsschnitte angefertigt und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. la, linker Vorhof; lv, linker Ventrikel; ra, rechter Vorhof; rv, rechter Ventrikel.
6 ist ein Balkendiagramm, das die Wirkungen von mutiertem CaMKII und CaN auf Promotor-Reporterkonstrukte, die ANF, Skelett-α-Aktin und das Herz betreffende α-Aktin Promotoren umfassen, die Luciferaseexpression antreiben, zeigt. Die Schalen mit ventrikulären myocardialen Zellen wurden in doppelten Ansätzen mit Reporterplasmiden und CaMKII(I-290) oder CaN_mut, den konstitutiv aktiven Formen von CaMKII und beziehungsweise CaN, cotransfiziert. "Kontrolle" stellt Zellen, die mit Expressionsvektoren ohne cDNA-Inserts und Promotor-Reporter-Plasmiden cotransfiziert wurden, dar. Die Werte werden hinsichtlich Transfektionseffizienz korrigiert und als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) aus wenigstens drei Experimenten dargestellt.
7 ist ein Balkendiagramm, das die Wirkungen der exogenen CaM-Kinase Isoenzyme auf die ANF-Promotor-Aktvität veranschaulicht. Schalen mit ventrikulären Cardiomyocyten wurden in doppelten Ansätzen mit einem ANF- Promotor-Reporter-Konstrukt und Expressionskonstrukten, die verschiedene CaMK-Isofomen kodieren, transfiziert. "Kontrolle" stellt Zellen dar, die mit Expressionsvektor ohne ein cDNA-Insert und Promotor-Reporter-Plasmid cotransfiziert wurden. Die Werte werden hinsichtlich Transfektionseffizienz korrigiert und als Mittelwert ± SD aus wenigstens drei Experimenten dargestellt.
8 ist ein Balkendiagramm, das Wirkungen von PE, exogenenem CaMKII oder CaN auf ANF-nested-Deletion-Promotor-Reporter-Konstrukte veranschaulicht. Die Werte werden hinsichtlich Transfektionseffizienz korrigiert und als Mittelwert ± SD aus wenigstens drei Experimenten dargestellt.
9 ist ein Balkendiagramm, das die Stimulierung von CaMKII-Aktivität durch den b1-adrenergen Rezeptor in neonatalen Herzgewebe der Ratte veranschaulicht. Neonatale (1–4 Tage alte) Herzgewebestreifen wurden isoliert und mit Isoproterenol (ISO, 100 μM), Dolbutamin (DOB, 10 μM) oder Vehikel alleine (Kontrolle) behandelt. Propanolol (PROP, 20 μM) wurde 2 Minuten vor Zugabe von Agonisten hinzugefügt. Nach 30 Sekunden Behandlung wurde die autonome CaMKII-Aktivität untersucht. Die Daten werden als Prozentsatz des Verhältnisses der Calcium-unabhängigen Aktivität geteilt durch die Gesamtaktivität und als Mittelwert ± SD aus wenigstens drei Experimenten dargestellt.
10 stellt Daten dar, die die Wirkungen von Adrenorezeptor-Agonisten auf Promotor-Reporter Aktivitäten für ANF, Skelett-α-Aktin und das Herz betreffendes α-Aktin und den zeitlichen Wirkungsverlauf von DOB auf ANF message-Gehalte zeigen. 10A, B und C sind Balkendiagramme, die die Luciferase-Reporter Gehalte nach Transfektion von ANF, Skelett-α-Aktin und beziehungsweise das Herz betreffenden α-Aktin in ventrikulären myocardialen Zellen, und Behandlung, 24 Stunden nach Transfektion, mit PE (100 μM), DOB (10 μM) oder TGF-β1 (1 ng/ml) zeigen. Die Werte werden hinsichtlich Transfektionseffizienz korrigiert und als Mittelwert ±SD aus wenigstens drei Experimenten dargestellt. 10D. Ventrikuläre myocardiale Zellen wurden in Serum-freies Medium überführt. An verschiedenen Zeitpunkten wurde dem Medium DOB zugegeben. "Kontrolle" stellt mit dem DOB Vehikel behandelte Zellen dar. 24 Stunden nach Inkubation wurde die Gesamt-RNA extrahiert und durch Northern-Blot analysiert. Die Ergebnisse sind für n = 3 oder mehr für jeden Zeitpunkt repräsentativ.
11 zeigt die Regulierung von tTA-abhängiger Zielgenexpression in primären Cardiomyocyten der Ratte. Die Cardiomyocyten wurden mit tTa Expressionsplasmid pUHD15-1 und entweder einem tTA-abhängigen Luciferase-Konstrukt pUHC13-3 oder leerem Vektor als Kontrolle cotransfiziert. 16 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen in entweder Medium ohne Doxcyclin (DOX) oder Medium mit Doxcyclin inkubiert. 11A zeigt den Zeitverlauf der Zielgentranskription. Leere Kreise, leerer Vektor, kein DOX; gefüllte Kreise, leerer Vektor, plus DOX; leere Dreiecke, pUHC13-3, kein DOX; ausgefüllte Dreiecke, pUHC13-3, plus DOX. 11B ist ein Balkendiagramm, das die Fähigkeit von tTa die Transkription des Zielgens zu stimulieren, und die inhibitorische Wirkung von Doxcyclin 12 Stunden nach Transfektion veranschaulicht.
12 ist ein Graph, der die Dosisabhängigkeit der Transkription von Herzhypertrophie-sensitiven Genen in myocardialen Zellen zeigt. 0,25 μg tTA Expressionskonstrukt pUHD15-1, 0,25 μg das Herz betreffendes α-Aktin Promotor-Reporter Plasmid CardA-Luc und verschiedene Mengen des tTA-abhängigen CaN Expressionskonstruktes p10-3CaN wurde in Zellen cotransfiziert. Die Daten sind für sechs unabhängige Experimente repräsentativ. Die Werte werden als Mittelwert ±SE; n = 3 Kulturen ausgedrückt.
13 stellt Graphen dar, die den zeitlichen Verlauf der Transkription von Herzhypertrophie-sensitiven Genen zeigt, die durch exogenes aktives CaN in myocardialen Zellen induziert werden. Die Daten werden genormt und als Prozentsatz der maximalen Reaktion ausgedrückt. Die Daten sind für drei unabhängige Experimente repräsentativ. Die Werte sind als Mittelwert ± SE; n = 3 Kulturen dargestellt.
14 stellt Balkendiagramme dar, die die Wirkungen von aktiviertem CaN auf Transkription von Hypertrophie-sensitiven Genen in myocardialen Zellen veranschaulichen. Die Daten sind für drei unabhängige Experimente repräsentativ. Die Werte sind als Mittelwert ± SE; n = 3 Kulturen dargestellt.
15 ist ein Graph, der die Inhibierung der CaN Induktion der Gentranskription als Reaktion auf Herzhypertrophie durch CsA veranschaulicht. Myocardiale Zellen wurden entweder mit pUHD15-1, Card-A-Luc und p10-3CaN oder leerem Vektor cotransfiziert. Im Anschluss an Transfektion wurden die Zellen mit 50 nM, 100 nM oder 150 nM CsA behandelt. 24, 48 und 72 Stunden nach Behandlung wurde die Luciferaseaktivität gemessen.
16 ist ein Graph, der den zeitlichen Verlauf der CsA-Inhibierung der CaN-Induktion der Transkription eines Herzhypertrophie-sensitiven Gens zeigt. Die Werte sind als Mittelwert ± SE; n = 3 Kulturen dargestellt.
17 ist ein Balkendiagramm, das die Wirkungen von CsA-Behandlung auf Transkriptionsaktivierung von Herzhypertrophie-sensitiven Genen durch CaN in myocardialen Zellen veranschaulicht. Die Werte sind als Mittelwert ± SE; n = 3 Kulturen dargestellt.
18 ist ein Graph, der die reversible Regulierung der Transkriptionsrepression der Genexpression als Reaktion auf Herzhypertrophie durch CsA zeigt. Die Werte sind als Mittelwert ± SE; n = 3 Kulturen dargestellt.
ARTEN ZUR DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG
Die transgenen, nicht-humanen Tiere, die zur Suche nach Substanzen, die für die Behandlung von Herzhypertrophie geeignet sind, verwendet werden, umfassen als Transgene rekombinante Polynucleotide, die eine kodierende Sequenz umfassen, die Calineurin kodiert, das Transkription von wenigstens einem Gen moduliert, das in Cardiomyocyten als Reaktion auf ein hypertrophes Signal exprimiert wird. Solch ein transgenes Tier hat eine wesentlich gesteigerte oder wesentlich verringerte Wahrscheinlichkeit Herzhypertrophie spontan zu entwickeln.
Die Konstruktion von transgenen Tiermodellen unter Verwendung der rekombinanten Polynucleotide zum Testen von potentiellen Behandlungen von Herzhypertrophie ist beschrieben. Die Genkonstrukte werden in Tierembryonen unter Verwendung von Standardtechniken, wie beispielsweise Mikroinjektion oder embryonale Stammzellen eingeführt.
Bei der Suche nach Substanzen, die Herzhypertrophie verringern können, werden verschiedene Parameter gemessen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Masse des linken Ventrikels/Körpergewicht, Veränderungen der Cardiomyocytengröße und -organisation, Veränderungen der das Herz betreffenden Genexpression und Veränderungen der Herzfunktion.
Allgemeine Techniken
Zur praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung werden, wenn nicht anders angezeigt, herkömmliche Techniken der Molekularbiologie (einschließlich rekombinanter Techniken), Zellbiologie, Biochemie und Immunologie angewandt, die innerhalb des Fachgebietes sind. Solche Techniken sind in der Literatur ausführlich erklärt, wie beispielsweise in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Ausgabe (Sambrook et al., 1989); Oligonucleotid Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir & C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds., 1987); The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); und Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991).
Mit der Herstellung von transgenen Tieren verwandte Techniken siehe, inter alia, Hogan et al., (1986) Manipulation the Mouse Embryo – A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1986.
Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck "ein Genprodukt, das Transkription von wenigstens einem Gen, das in Cardiomyocyten als Reaktion auf ein hypertrophes Signal exprimiert wird, moduliert", ein beliebiges Genprodukt, entweder ein Protein oder eine RNA, welches die Transkription von wenigstens einem Gen moduliert, das in Cardiomyocyten als Reaktion auf ein hypertrophes Signal exprimiert wird. Es ist ebenfalls eines, das die Aktivität von wenigstens einem Gen verringert oder moduliert, das in Cardiomyocyten als Reaktion auf ein hypertrophes Signal exprimiert wird, durch Verringerung von Transkriptions- und/oder Translationsgehalten oder Verringerung von Proteinaktivität z.B. durch kompetitive oder nicht-kompetitive Inhibierung oder durch Verringerung von Proteinkonzentration und Ähnliches. Die "Modulation" kann entweder eine Herunterregulierung oder Hochregulierung des Gens sein, das in Cardiomyocyten als Reaktion auf ein hypertrophes Signal exprimiert wird.
Ein in Cardiomyocyten als Reaktion auf ein hypertrophes Signal exprimiertes Gen wird hierin ebenfalls als ein "Herzhypertrophie-sensitives Gen" oder ein "auf Herzhypertrophie reagierendes Gen" bezeichnet. Beispiele von Genen, die als Reaktion auf hypertrophe Signale exprimiert werden, schließen ein, beschränken sich jedoch nicht auf, atrialer natriuretischer Faktor (ANF), Skelett-α-Aktin, b-Typ natriuretisches Peptid (BNP), das Herz betreffendes Aktin, und schwere Kette des β-Myosins (β-MHC), wie in 1 schematisch dargestellt.
Der Ausdruck "transgenes Tier" bezeichnet ein nicht-humanes Tier, vorzugsweise ein nicht-humanes Säugetier, das in seine Keimbahn-DNA eine oder mehrere DNA-Sequenzen, die in das Tier eingeführt wurden, integriert enthält.
Wie hierin verwendet, weist der Ausdruck "hypertrophes Signal" auf einen Stimulus hin, mechanisch oder chemisch, der messbare Symptome von Herzhypertrophie zur Folge hat. Hypertrophe Signale schließen ein, beschränken sich jedoch nicht auf, mechanische Dehnung, β-adrenerge Agonisten, α1-adrenerge Rezeptoragonisten und Angiotensin II. Symptome von Herzhypertrophie können durch verschiedene Parameter gemessen werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Verhältnis der Masse des linken Ventrikels:Körpergewicht, Veränderungen der Cardiomyocytengröße und -organisation, Veränderungen der das Herz betreffenden Genexpression und Veränderungen der Herzfunktion; faserartige Ablagerung; Veränderungen von dP/dT, d.h. Veränderungsrate des Ventrikeldruckes bezüglich Zeit; Calciumioenfluss; Schlaglänge; und Ventrikelvolumen.
Die Ausdrücke "transkriptonsregulierendes Element" (TRE) und "transkriptionskontrollierender Bereich", "Transkription-Response-Element" und "transkriptionskontrollierendes Element", die austauschbar hierin verwendet werden, bezeichnen eine Polynucleotid-Sequenz, vorzugsweise eine DNA-Sequenz, die die Transkription einer funktional verbundenen Polynucleotid-Sequenz in einer Wirtszelle selektiv aktiviert. Ein TRE schließt gewöhnlich einen Promotorbereich ein, und kann gegebenenfalls zusätzlich zu einem Promotor andere Kontrollsequenzen, wie beispielsweise Enhancer oder Silencer einschließen.
Ein "heterologes/heterologer" TRE, Promotor oder Enhancer ist eines/einer, das/der in einer Zelle mit der 5'-flankierenden Sequenz eines Gens normalerweise nicht assoziiert ist oder nicht davon abstammt. Im Zusammenhang mit einem Gen, das ein Produkt kodiert, das Gehalte von wenigstens einem Genprodukt eines Hypertrophie-sensitiven Gens aktiv moduliert, schließen Beispiele eines heterologen Promotors oder Enhancers einen 5'-flankierenden Bereich des Gens für die schwere Kette des α-Myosins ein.
Der Ausdruck "funktional verbunden" bezieht sich auf die Orientierung von Polynucleotidelementen in einer funktionellen Beziehung. Ein TRE ist mit einem kodierenden Abschnitt funktional verbunden, wenn das TRE Transkription der kodierenden Sequenz fördert. Funktional verbunden bedeutet, dass die zu verbindenden DNA-Sequenzen im Allgemeinen benachbart sind, und wo es notwendig ist, zwei proteinkodierende Bereiche zu verbinden, benachbart und im gleichen Leseraster sind. Dennoch können einige Polynucleotidelemente, da Enhancer im Allgemeinen funktionieren, wenn sie von dem Promotor mehrere Kilobasen entfernt sind, funktional verbunden, aber nicht benachbart sein.
Die Ausdrücke "Polynucleotid" und "Nucleinsäure", die hierin austauschbar verwendet werden, bezeichnen Nucleotidpolymere mit beliebiger Länge, entweder Ribonucleotide oder Desoxyribonucleotide. Somit schließt dieser Ausdruck doppel- und einzelsträngige DNA und RNA ein. Ein Fachmann weiß, dass an den in der vorliegenden Erfindung verwendeten Promotorsequenzen und Sequenzen des kodierenden Bereiches Punktmutationen und Deletionen vorgenommen werden können, ohne die Fähigkeit der Sequenzen, ihre Funktion auszuüben, zu verändern, unabhängig davon, ob diese Funktion ist, die Transkription zu aktivieren oder ein funktionelles Protein zu kodieren. Vorzugsweise ist das Polynucleotid DNA. Wie hierin verwendet schließt "DNA" nicht nur die Basen A, T, C und G, sondern auch ein beliebiges Analogon davon oder modifizierte Formen dieser Basen, wie beispielsweise methylierte Nucleotide, Internucleotidmodifikationen, wie beispielsweise ungeladene Verknüpfungen und Thioate, Verwendung von Zuckeranaloga und modifizierte und/oder alternative Rückgratstrukturen, wie beispielsweise Polyamide ein.
Ein "im Wesentlichen isoliertes" oder "gereinigtes" Polynucleotid ist eines, das im Wesentlichen frei von Materialien ist, mit denen es natürlich assoziiert ist. Mit im Wesentlichen frei ist wenigstens zu 50%, vorzugsweise wenigstens zu 70%, bevorzugter zu wenigstens 80% und noch bevorzugter wenigstens zu 90% frei von Materialien, mit denen es natürlich assoziiert ist, gemeint. Wie hierin verwendet, bezeichnet ein "im Wesentlich isoliertes" Polynucleotid ebenfalls rekombinante Polynucleotide, die aufgrund ihres Ursprunges oder Manipulation: (1) vollständig oder mit einem Teil eines Polynucleotids nicht assoziiert sind, mit dem sie natürlich assoziiert sind, (2) mit einem anderen Polynucleotid verbunden sind, als sie natürlich verbunden sind, oder (3) natürlich nicht vorkommen.
Wie hierin verwendet bezeichnet der Ausdruck "Antikörper" ein Immunglobulinmolekül oder ein Fragment eines Immunglobulinmoleküls mit der Fähigkeit, an ein bestimmtes Antigen spezifisch zu binden. Antikörper sind einem Immunologen bekannt. Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck "Antikörper" nicht nur intakte Antikörpermoleküle, sondern auch Antikörpermolekülfragmente, die ihre Antigenbindungsfähigkeit beibehalten. Solche Fragmente sind im Fachgebiet ebenfalls wohl bekannt und werden regelmäßig sowohl in vitro als auch in vivo verwendet. Insbesondere bezeichnet, wie hierin verwendet", der Ausdruck "Antikörper" nicht nur intakte Immunglobulinmoleküle mit einem beliebigen Isotyp (IgA, IgG, IgE, IgD, IgM), sondern auch die bekannten aktiven Fragmente F(ab')₂, Fab, Fv, scFv, Fd, V_H und V_L. Bezüglich Antikörperfragmente siehe zum Beispiel "Immunochemistry in Practice" (Johnstone und Thorpe, eds., 1996; Blackwell Science), p. 69.
Wie hierin verwendet ist eine "Herzhypertrophie-induzierte Funktionsstörung" ein Zustand oder eine Erkrankung, die mit Herzhypertrophie in Beziehung steht, und schließt Herzhypertrophie, kombinierte Herzhypertrophie, dilatierte Herzhypertrophie, dekompensierte Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz ein. Eine Herzhypertrophie-induzierte Funktionsstörung ist durch ein oder mehrere der folgenden Symptome oder Ereignisse gekennzeichnet: konzentrisch vergrößerte Ventrikelmasse; exzentrisch vergrößerte Ventrikelmasse; Progression zu dilatierter Herzmyopathie; ausgiebige faserartige Ablagerung; Veränderung von dP/dT; Cardiomyocytenumordnung; Calciumionenfreisetzung und -aufnahme (d.h. Ca²⁺-Fluss); Schlagverkürzung; vermindertes Ventrikelzeitvolumen; Arrhythmie; Tachykardie; Veränderungen der zentralen Anforderungen; und Herzinsuffizienz.
Transgene Tiere
Gemäß der vorliegenden Erfindung nützliche transgene Tiere schließen solche ein, die eine im Wesentlichen verringerte Wahrscheinlichkeit, spontan Herzhypertrophie zu entwickeln und solche, die eine im Wesentlichen gesteigerte Wahrscheinlichkeit, spontan Herzhypertrophie zu entwickeln, verglichen mit nicht-transgenen Wurfgeschwistern aufweisen. Eine "im Wesentlichen gesteigerte" oder eine "im Wesentlichen verringerte" Wahrscheinlichkeit spontan Herzhypertrophie zu entwickeln, bedeutet, dass eine statistisch signifikante Steigerung oder beziehungsweise Verringerung von messbaren Symptomen der Herzhypertrophie im Vergleich der transgenen Tiere mit nicht-transgenen Wurfgeschwister(n) beobachtet wird.
Die transgenen Tiere werden mit Transgenen hergestellt, die einen kodierenden Bereich, der Calcineurin kodiert, umfassen. Der kodierende Bereich kann das gesamte Polypeptid oder ein Fragment davon kodieren, solange die gewünschte Funktion des Polypeptids beibehalten wird, d.h. das Polypeptid kann Transkription von wenigstens einem Gen modulieren, das in Cardiomyocyten als Reaktion auf ein hypertrophes Signal exprimiert wird. Der zur Konstruktion der Transgene verwendete kodierende Bereich schließt weiter solche ein, die Mutationen enthalten, einschließlich stiller Mutationen, Mutationen, die zu einer Veränderung der Aminosäuresequenz führen, jedoch nicht funktionelle Veränderungen zur Folge haben, Mutationen, die ein aktiveres Protein zur Folge haben, Mutationen, die ein konstitutiv aktives Protein zur Folge haben, Mutationen, die ein Protein mit verringerter Aktivität zur Folge haben und dominante negative Mutanten. Kodierende Bereiche können von Mensch-, Ratte-, oder Maus-Sequenzen abstammen, wovon mehrere offenbart wurden. Nucleotidsequenzen wurden für die mRNA der katalytische Untereinheit von CaN der Maus offenbart (Genbank Hinterlegungsnr. M81475 und J05479). Als Beispiele für konstitutiv aktive Mutanten wurden konstitutiv aktive CaN-Formen beschrieben. Sun et al. (1994) Genes Dev. 8: 2527–2539; Cruzalegui und Means (1993) J. Biol. Chem. 268: 26171–26178; und O'Keefe et al. (1992) Nature 357: 692–694.
Zur Konstruktion von transgenen Tieren verwendete Transgene schließen solche ein, in denen das Calcineurin-Gen 1) unter der Kontrolle eines Cardiomyocyten-spezifischen Promotor ist; 2) in Cardiomyocyten unter der Kontrolle eines Cardiomyocyten-spezifischen Promotors konstitutiv exprimiert wird; 3) unter der Kontrolle eines Cardiomyocyten-spezifischen Promotor ist, aber auf induzierbare Weise exprimiert wird.
Transkriptionsregulierende Elemente
Die Transkription des kodierenden Bereiches wird von einem transkriptionsregulierenden Element (TRE) kontrolliert. Zur Verwendung geeignete TREs schließen solche ein, die die Transkription eines kodierenden Bereiches, mit dem sie funktional verbunden sind, bevorzugt in Cardiomyocyten steuern. Mit "bevorzugt" ist gemeint, dass die Expression des Transgens in Cardiomyocyten wenigstens etwa 10-fach, bevorzugter wenigstens etwa 10-fach bis etwa 50-fach, noch bevorzugter wenigstens etwa 50-fach bis 100-fach, noch bevorzugter mehr als 100-fach erhöht ist als in Nicht-Cardiomyocyten. Vorzugsweise ist die Expression des Transgens in anderen Zellen als Cardiomyocyten unterhalb der Nachweisgrenze, worauf die in den Beispielen beschriebenen Reportergentests hinweisen.
Eine Vielzahl von Cardiomyocyten-spezifischen TREs wurde in der Literatur beschrieben und können verwendet werden. Sie schließen ein, beschränken sich jedoch nicht auf TREs, die von den folgenden Genen abstammen: leichte Kette-2 des Myosins, schwere Kette des α-Myosins, AE3, das Herz betreffendes Troponin C und das Herz betreffendes α-Aktin. Franz et al. (1997) Cardiovasc. Res. 35: 560–566; Robbins et al. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 752: 492–505; Linn et al. (1995) Circ. Res. 76: 584–591; Parmacek et al. (1994) Mol. Cell. Biol. 14: 1870–1885; Hunter et al. (1993) Hypertension 22: 608–617; und Sartorelli et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4047–4051.
In einer Ausführungsform umfasst das TRE einen Promotorbereich aus dem 5'flankierenden Bereich eines α-MHC Gens. Eine 5443 Basen lange 5'-flankierende Sequenz des α-MHC Gens der Maus wird in GenBank unter der Hinterlegungsnr. U71441 bereitgestellt. Obwohl die gesamte 5,4 kb Sequenz in den Transgenen der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, können ebenfalls Teile davon, die die Transkription eines funktional verbundenen kodierenden Bereiches bevorzugt in Cardiomyocyten steuern, verwendet werden. Der in Beispiel * beschriebene α-MHC Expressionsvektor kann zum Einfügen eines gewünschten kodierenden Bereiches verwendet werden, so dass der kodierende Bereich mit dem α-MHC Promotor funktional verbunden sein wird. Jones et al. (1994) Dev. Dyn. 22: 117–128.
In einer anderen Ausführungsform umfasst TRE einen Promotorbereich aus dem 5'-flankierenden Bereich eines Gens für b-Typ natriuretisches Peptid (BNP). Thuerauf und Glembotski (1997) J. Biol. Chem. 272: 7464–7472; und LaPointe et al. (1996) Hypertension 27: 715–722. Eine Nucleotidsequenz eines 5'-flankierenden Bereiches von humanem BNP wurde offenbart (GenBank Hinterlegungsnr. D16641).
In anderen Ausführungsformen ist der kodierende Bereich mit (einem) induzierbaren regulierenden Elementen) funktional verbunden. In der Literatur sind eine Vielzahl von induzierbaren Promotorsystemen beschrieben und können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Diese schließen ein, beschränken sich jedoch nicht auf, Tetracyclin-regulierbare Systeme (WO 94/29442; WO 96/01313); hormonsensitive Systeme, Interferon-induzierbare Systeme, Metall-induzierbare Systeme und Hitze-induzierbare Systeme (WO 93/20218); und Ecdyson-induzierbare Systeme. Einige dieser Systeme, einschließlich der Ecdyson-induzierbaren und Tetracyclin-induzierbaren Systeme sind von Invitrogen (Carlsbad, CA) und beziehungsweise Clontech (Palo alto, CA) kommerziell erhältlich.
In einigen Ausführungsformen umfasst das induzierbare (regulierbare) Promotorsystem einen Tetracyclin-bindenden Operator, tetO, der durch Tetracyclinzugabe (oder einem Analogon davon) zum Wasser oder zur Nahrung des Tieres reguliert wird, der mit einem kodierenden Bereich, dessen Produkt die Transkription von wenigstens einem Gen moduliert, das in Cardiomyocyten als Reaktion auf ein hypertrophes Signal exprimiert wird, funktional verbunden ist. Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignete Systeme sind wohl bekannt. Yu et al. (1996) Circ. Res. 79: 691–697; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547–5551; und Hillen und Wissmann, in Protein-Nucleic Acid Interaction, Topics in Molecular and Structural Biology, Saenger und Heinemann, eds. Macmillan, London (1989), pp. 143–162. Im Allgemeinen macht dieses System Gebrauch von einem Hybridfusionsprotein, dem Tetracyclin-Transaktivator (tTA), der eine DNA-Bindedomäne umfasst, die fähig ist, tetO zu binden, die von einem Polypeptid abstammt, wie beispielsweise das tet Repressor (tetR) Protein von E.coli, das an eine Transkriptionsaktivierungsdomäne, wie beispielsweise aus dem viralen Protein VP16 gekoppelt ist, so dass, wenn tTa an einen minimalen Promotor, der tetO Sequenzen enthält, bindet, die Transkription des Zielgens aktiviert wird. Tetracyclin-Bindung an tTA verhindert vermutlich die Aktivierung, indem eine Konformationsänderung im tetR Teil von tTA verursacht wird, wobei die Bindung von tTA an tetO blockiert wird. Die Genaktivierung erfolgt durch Entfernen des Tetracyclins.
Zusätzlich können Zelltyp-spezifische TREs verwendet werden. Zelltyp-spezifische TREs schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf solche, die von den folgenden beispielhaften Genen abstammen (Zelltyp, in dem die TREs spezifisch funktionell sind, stehen in Klammern):vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktorrezeptor (Endothel), Albumin (Leber), Faktor VII (Leber), Fettsäuresynthase (Leber), von Willebrand-Faktor (Hirnendothel), alpha-Aktin und schwere Kette des Myosins (beide im glatten Muskel), Synthetase I (Dünndarm), Na-K-Cl Transporter (Niere), Prostata-spezifisches Antigen (Prostata) und glanduläres Kallikrein-1 Gen (Prostata).
Eine andere TRE-Klasse sind solche, die die Transkription eines funktional verbundenen Polynucleotides als Reaktion auf sauerstoffarme Bedingungen aktivieren. Diese schließen TREs ein, die wenigstens teilweise durch Hypoxiainduzierbaren Faktor-1 reguliert werden. Bunn und Poyton (1996) Physiol. Rev. 76: 839–885; Dachs und Stratford (1996) Br. J. Cancer 74: 5126–5132; Guillemin und Krasnow (1997) Cell 89: 9–12; Firth et al (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 6496–6500; und Jiang et al. (1997) Cancer Res. 57: 5328–5335.
Eine weitreichend Vielzahl viraler Promotoren sind im Fachgebiet bekannt und können verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, einen Cytomegalovirus (CMV) Promotor, einen Rous-Sarkoma-Virus (RSV) Promotor, einen SV40 Promotor und einen MMTV LTR Promotor. In Abhängigkeit ihrer Regulationsart können Promotoren konstitutiv oder durch experimentelle Bedingungen regulierbar sein.
Andere Regulationssequenzen, die in einem Transgen eingeschlossen sein können, schließen Polyadenylierungssignale und Terminierungssignale ein, wobei Letztere dazu dienen, die message-Gehalte zu erhöhen und ein Hineinlesen in andere Sequenzen minimieren. Diese Regulationssequenzen sind im Fachgebiet bekannt.
Polynucleotide für die Verwendung in der Herstellung von transgenen Tieren
Im Wesentlichen isolierte Polynucleotide für die Verwendung in der Herstellung eines transgenen Tieres schließen Polynucleotide ein, die einen kodierenden Bereich umfassen, der ein Calcineurin kodiert.
Mehrere für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung zur Schaffung von transgenen Tieren geeignete cDNA-Klone wurden beschrieben: katalytische Untereinheit von Calcineurin, Muramatsu und Kincaid (1992) Biochem. Biophys Res. Comm. 188: 265–271 (humane Sequenz der katalytischen Untereinheit, GenBank Hinterlegungsnr. 546622), Kincaid et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 11312–11319 (Sequenzen der katalytischen Untereinheit aus der Maus, GenBank Hinterlegungsnr. J05479 und M81475).
Expressionsklone zur Herstellung von transgenen Mäusen können ebenfalls so konstruiert werden, dass der kodierende Bereich eine oder mehrere Mutationen trägt, die die Aktivität des kodierten Proteins beeinflussen. Zum Beispiel bindet eine CaM-Mutante, der die Aminosäuren 75–82 fehlt, Ca²⁺ mit kinetischen Eigenschaften, die denen von Wildtyp CaM ähnlich sind, ist aber nicht fähig, mehrere CaM-abhängige Zielenzyme in vitro zu aktivieren. Van Berkum et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 3750–3756.
Nützliche Mutationen schließen solche ein, die konstitutiv aktive Formen des kodierten Proteins zur Folge haben. Zum Beispiel können Gene, die konstitutiv aktive mutierte Formen von CaN kodieren zur Erzeugung von transgenen Tieren verwendet werden.
Polynucleotid-Genprodukte, die nützlich sind, schließen Antisense-Polynucleotide, Ribozyme und Triplehelix-Polynucleotide ein, die die Expression eines Produktes von wenigstens einem Gen, das in Cardiomyocyten als Reaktion auf ein hypertrophes Signal exprimiert wird, modulieren. Antisense-Polynucleotide und Ribozyme wurden ausführlich beschrieben. S. T. Crooke und B. Lebleu, eds. Antisense Research and Applications (1993) CRC Press; und Antisense RNA und DNA (1998) D. A. Melton, ed. Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor, NY. Antisense-RNA und DNA-Moleküle wirken, in dem sie die Translation von mRNA durch Binden an gezielte mRNA direkt blockieren und Proteintranslation verhindern. Ein Beispiel eines Antisense-Polynucleotids ist ein Oligodeoxyribonucleotid, das von der Translationsinitiationsstelle, d.h. zwischen der –10 und +10 Region der relevanten Nucleotidsequenz stammt.
Ribozyme sind enzymatische RNA-Moleküle, die fähig sind, die spezifische Spaltung von RNA zu katalysieren. Der Mechanismus der Ribozymwirkung bezieht die Sequenz-spezifische Interaktion des Ribozymmoleküls an komplementäre Ziel-RNA, gefolgt von einer endonucleolytischen Spaltung ein. Innerhalb des Rahmens der Erfindung sind konstruiertes Hammerhead-Ribozym oder andere Motiv-Ribozymmoleküle, die die endonucleolytische Spaltung von RNA-Sequenzen, die Proteinkomplexkomponenten kodieren, spezifisch und wirksam katalysieren.
Spezifische Ribozymschnittstellen innerhalb eines beliebigen RNA-Ziels werden anfänglich durch Durchsuchen der Zielmoleküle nach Ribozymschnittstellen, die die folgenden Sequenzen GUA, GUU und GUC einschließen, identifiziert. Nach Identifizierung können kurze RNA-Sequenzen mit zwischen 15 und 20 Ribonucleotiden, die dem Bereich des Zielgens, das die Schnittstelle enthält, entsprechen, bezüglich vorhergesagter Strukturmerkmale, wie beispielsweise Sekundärstruktur, die die Oligonucleotidsequenz ungeeignet machen könnte, bewertet werden. Die Eignung von zu prüfenden Zielen kann ebenfalls durch Testen ihrer Zugänglichkeit für Hybridisierung mit komplementären Oligonucleotiden unter Verwendung von Ribonuclease-Schutztests bewertet werden. Siehe Draper PCT WO 93/23569; und U.S. Pat. Nr. 5,093,246.
Die in Triplehelixformation zur Transkriptionsinhibierung verwendeten Nucleinsäuremoleküle sind im Allgemeinen einzelsträngig und bestehen aus Deoxyribonucleotiden. Die Basenzusammensetzung muss zur Förderung der Triplehelixformation über Basenpaarungsgesetze nach Hoogsteen, die im Allgemeinen das Vorhandensein von beträchtlichen Abschnitten von entweder Purinen oder Pyrimidinen in einem Strang der Duplex erforderlich machen, entworfen werden. Nucleotidsequenzen können auf Pyrimidinen basieren, welche TAT und CGC⁺ Triplets über die drei assoziierten Stränge der resultierenden Triplehelix zur Folge haben. Die Pyrimidin-reichen Moleküle stellen Basenkomplementarität zu einer Purin-reichen Region eines Einzelstrangs der Duplex in einer parallelen Orientierung zu diesem Strang bereit. Zusätzlich können Nucleinsäure-Moleküle ausgewählt werden, die Purin-reich sind, zum Beispiel, die einen Abschnitt an G-Resten enthalten. Diese Moleküle werden eine Triplehelix mit einer DNA-Duplex bilden, die reich an GC Paaren, ist, wobei die Mehrzahl der Purinreste auf einem einzelnen Strang der Ziel-Duplex vorliegt, wodurch GGC Triplets über die drei Stränge in der Triplex folgen.
Wahlweise können die potentiellen Sequenzen, die für die Triplehelixbildung anvisiert werden können, durch Schaffung eines sogenannten "Switchback" Nucleinsäuremoleküls gesteigert werden. Switchback-Moleküle werden in einer alternierenden 5'-3', 3'-5'Weise synthetisiert, so dass sie Basenpaarungen mit erst einem Strang einer Duplex und dann mit dem anderen bilden, was die Notwendigkeit des Vorhandenseins einer beträchtlichen Strecke von entweder Purinen oder Pyrimidenen auf einem Strang einer Duplex eliminiert.
Antisense RNA- oder DNA-Moleküle, Ribozyme und Triplehelixmoleküle können durch ein beliebiges, im Fachgebiet bekanntes Verfahren für die Synthese von DNA- oder RNA-Molekülen hergestellt werden. Siehe Draper, id. Diese schließen im Fachgebiet wohlbekannte Techniken für die chemische Synthese von Oligodeoxyribonucleotiden ein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, chemische Synthese durch Festphasenphosphoramidit. Wahlweise können RNA-Moleküle durch in vitro und in vivo Transkription von DNA-Sequenzen, die das Antisense-RNA-Molekül kodieren, erzeugt werden. Solche DNA-Sequenzen können in eine weitreichende Vielzahl von Vektoren aufgenommen werden, die geeignete Promotoren der RNA-Polymerase, wie beispielsweise T7 oder SP6 Polymerase Promotoren enthalten. Wahlweise können Antisense cDNA-Konstrukte, die Antisense-RNA in Abhängigkeit von dem verwendeten Promotor, konstitutiv oder induzierbar synthetisieren, stabil oder transient in Zellen eingeführt werden.
Verschiedene wohlbekannte Modifikationen an den DNA-Molekülen können als ein Mittel zur Steigerung der intrazellulären Stabilität und Halbwertszeit eingeführt werden. Mögliche Modifikationen schließen ein, beschränken sich jedoch nicht auf eher die Addition von flankierenden Sequenzen von Ribonucleotiden oder Deoxyribonucleotiden an die 5'- und/oder 3'-Enden des Moleküls oder die Verwendung von Phosphorthioat oder 2'-O-Methyl, statt Phosphodiesterase-Verknüpfungen innerhalb des Oligodeoxyribonucleotid-Rückgrates.
Genprodukte, die die Transkription von wenigstens einem Gen modulieren, das in Cardiomyocyten als Reaktion auf ein hypertrophes Signal exprimiert wird, können durch ein beliebiges, im Fachgebiet bekanntes Mittel identifiziert werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, ein Zwei-Hybrid-System der Hefe, von denen eine Vielzahl im Fachgebiet bekannt sind, und unten detaillierter beschrieben werden. Ein Transkriptionsaktivationstest, wie beispielsweise das Zwei-Hybrid-System der Hefe erlaubt die Identifizierung und Manipulierung von Protein-Protein-Interaktionen. Fields und Song (1989) Nature 340: 245–246. Die konzeptionelle Grundlage für einen Transkriptionaktivationstest beruht auf der modularen Natur von Transkriptionsfaktoren, die aus funktional trennbaren DNA-Binde- und Transaktivierungsdomänen bestehen. Werden sie als getrennte Proteine exprimiert, sind diese zwei Domänen nicht fähig, Gentranskription zu vermitteln. Dennoch kann die Fähigkeit, Transkription zu aktivieren, wiederhergestellt werden, wenn die DNA-Bindedomäne und die Transaktivierungsdomäne durch eine Protein-Protein-Interaktion überbrückt werden. Diese Domänen können zum Beispiel durch Expression der DNA-Bindedomäne und Transaktivierungsdomäne als Fusionsproteine (Hybride) zusammengebracht werden, wo die Proteine, die an diese Domänen anhaften, miteinander interagieren können. Diese Protein-Protein-Interaktion der Hybride kann die DNA-Binde- und Transaktivierungsdomänen zusammenbringen, um einen transkriptionskompeteten Komplex zu schaffen. Eine bekannte Komponente eines Signaltransduktionswegs, wie beispielsweise GATA4 kann als "Köder" wirken und kann an ein DNA-Bindeprotein fusioniert werden. Expressions-cDNA Bibliotheken können hergestellt werden, die die Expression von Fusionsproteinen erlauben, die ein Protein umfassen, das an einen Transkriptionsaktivator fusioniert ist. Proteine, die an GATA4 funktionell binden, erlauben dann, dass die Transkription des lacZ Gens stattfindet. Das Produkt des lacZ Gens kann dann durch Zugabe eines chromogenen Substrates zum Wachstumssubstrat nachgewiesen werden. Kits zur Durchführung solcher Tests sind kommerziell erhältlich.
Zur Herstellung von transgenen Tieren verwendete Nucleinsäure Konstrukte
Konstrukte zur Verwendung bei der Erzeugung von transgenen Tieren umfassen ein TRE zur Expression des Konstruktes in einer Tierzelle und einen Bereich, der ein Genprodukt kodiert, das Transkription von wenigstens einem Gen, das in Cardiomyocyten als Reaktion auf ein hypertrophes Signal exprimiert wird, moduliert.
In einigen Ausführungsformen umfasst ein Konstrukt zur Verwendung bei der Erzeugung eines transgenen Tieres einen Bereich, der ein Genprodukt kodiert, das Transkription von wenigstens einem Hypertrophie-sensitiven Gen in Cardiomyocyten moduliert, worin der das Genprodukt kodierende Bereich mit einem heterologen Promotor funktional verbunden ist, so dass das Genprodukt in Cardiomyocyten überexprimiert wird. "Überexprimiert" zeigt an, dass das Genprodukt wenigstens etwa 2-fach bis etwa 5-fach, vorzugsweise wenigstens etwa 5-fach bis etwa 50-fach, bevorzugter wenigstens etwa 50-fach bis etwa 100-fach, noch bevorzugter wenigstens etwa 100-fach verglichen mit der Expression des Gens in Wildtyp-Zellen oder verglichen mit der Expression des Gens, das mit seinem homologen Promotor funktional verbunden ist, exprimiert wird.
In anderen Ausführungsformen umfasst das Konstrukt zur Verwendung bei der Erzeugung eines transgenen Tieres einen Bereich, der ein Genprodukt kodiert, das Transkription von wenigstens einem Hypertrophie-sensitiven Gen in Cardiomyocyten moduliert, worin der Bereich, der das Genprodukt kodiert, mit einem heterologen TRE funktional verbunden ist, und der Bereich, der das Genprodukt kodiert, mutiert ist, so dass das kodierte Genprodukt in Cardiomyocyten konstitutiv aktiv ist.
In anderen Ausführungsformen umfasst das Konstrukt zur Verwendung bei der Erzeugung eines transgenen Tieres einen Bereich, der ein Genprodukt kodiert, das die Transkription von wenigstens einem Hypertrophie-sensitiven Gen in Cardiomyocyten moduliert, worin der Bereich, der das Genprodukt kodiert, mit einem heterologen TRE funktional verbunden ist und worin die Transkription des Bereiches, der das Genprodukt kodiert, induzierbar ist. Induzierbare Systeme sind im Fachgebiet bekannt und werden hierin beschrieben.
In anderen Ausführungsformen umfasst das Konstrukt zur Verwendung bei der Erzeugung eines transgenen Tieres einen Bereich, der ein Genprodukt kodiert, das Transkription von wenigstens einem Hypertrophie-sensitiven Gen in Cardiomyocyten moduliert, worin das Genprodukt eine dominante negative Mutante ist.
DNA-Klone für die Mikroinjektion können durch beliebige im Fachgebiet bekannte Mittel präpariert werden. Zum Beispiel können DNA-Klone für die Mikroinjektion mit Enzymen gespalten werden, die zum Entfernen der bakteriellen Plasmidsequenzen geeignet sind, und die DNA-Fragmente können unter Verwendung von Standardtechniken einer Elektrophorese unterzogen werden. Die DNA-Banden werden durch Färben mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht, und die Bande, die die Expressionssequenzen enthält, wird ausgeschnitten. Die ausgeschnittene Bande wird dann in Dialyseschläuche, die 0,3 M Natriumacetet, pH 7,0 enthalten, überführt. Die DNA wird in die Dialyseschläuche elektroeluiert, mit einer 1:1 Phenol/Chloroform-Lösung extrahiert und mit zwei Volumen Ethanol präzipitiert. Die DNA wird in 1 ml Low-Salt-Puffer (0,2 M NaCl, 20 mM Tris, pH 7,4 und 1 mM EDTA) wiedergelöst und auf einer Elute-D^TM Säule gereinigt. Die Säule wird zunächst mit 3 ml High-Salt-Puffer (1 M NaCl, 20 mM Tris, pH 7,4 und 1 mM EDTA) beladen und anschließend mit 5 ml Low-Salt-Puffer gewaschen. Die DNA-Lösungen werden dreimal durch die Säule passiert, um die DNA an die Säulenmatrix zu binden. Nach einem Waschvorgang mit 3 ml Low-Salt-Puffer wird die DNA mit 0,4 ml High-Salt-Puffer eluiert und mit zwei Volumen Ethanol präzipitiert. Die DNA-Konzentrationen werden durch Absorption bei 260 nm in einem UV-Spektrophotometer gemessen. Für die Mikroinjektion werden die DNA-Konzentrationen auf 3 μg/ml in 5 mM Tris, pH 7,4 und 0,1 mM EDTA eingestellt.
Andere Verfahren zur Reinigung von DNA für die Mikroinjektion sind beschrieben in Hogan et al. Manipulating the Mouse Embryo (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1986), in Palmiter et al. Nature 300: 611 (1982); in The Qiagenologist, Application Protocols, 3. Ausgabe, veröffentlicht von Qiagen, Inc., Chatsworth, CA.; und in Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
Untersuchen der Trangenkonstrukte in Zellkultur
Die Transgenkonstrukte können, wenn erwünscht, bezüglich ihrer Aktivität in einer in vitro Kultur, wie in den Beispielen beschrieben, untersucht werden. TRE-Aktivität kann zum Beispiel durch Einführen eines Polynucleotidkonstruktes, das ein TRE umfasst, das mit einem Gen funktional verbunden ist, dessen Fähigkeit die Transkription von wenigstens einem Gen, das in Cardiomyocyten als Reaktion auf ein hypertrophes Signal exprimiert wird, zu modulieren, untersucht werden soll, in kultivierte Cardiomyocyten und Überwachen der Expression des/der Hypertrophiesensitiven Gens oder Gene untersucht werden. Wahlweise kann die Aktivität eines TRE durch Einführen eines Polynucleotidkonstruktes, das ein TRE umfasst, das mit einem Reportergen funktional verbunden ist, das ein nachweisbares, wünschenswert quantifizierbares Signal bereitstellt, in kultivierte Cardiomyocyten untersucht werden.
Die zu untersuchende(n) Sequenz(en) kann/können in einen Vektor eingefügt werden, so dass sie mit einem geeigneten Reportergen funktional verbunden ist/sind, das ein Reporterprotein kodiert, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Chloramphenicolacetyltransferase (CAT), β-Galaktosidase (von dem lacZ Gen kodiert), alkalische Phosphatase, grünfluoreszierendes Protein and Meerrettich-Peroxidase. Solche Vektoren und Tests sind, inter alia, von kommerziellen Quellen leicht erhältlich. So konstruierte Plasmide werden in eine geeignete Wirtszelle zur Untersuchung hinsichtlich der Expression des Reportergens, das von dem THE kontrolliert wird, unter Verwendung von im Fachgebiet bekannten Transfektionsverfahren, wie beispielsweise Calciumphosphat-Präzipitation, Elektroporation, Liposomen (Lipofektion) und DEAE-Dextran transfiziert.
Das Konstrukt kann auf herkömmliche Weise präpariert werden, wobei die Bestandteile des Konstruktes in ein Plasmid durch Anwendung passender Restriktionsschnittstellen eingeführt werden, an den Enden mittels PCR spezifische Sequenzen eingeführt werden, die Restriktionsschnittstellen enthalten können, und Ähnliches. Nachdem das Expressionskonstrukt präpariert wurde, kann es in die Zellen auf herkömmliche Weisen eingeführt werden.
Verfahren zur Einführung des Expressionskonstruktes in Zellen schließen Transfektion, Komplexbildung mit kationischen Verbindungen, Lipofektion, Elektroporation und Ähnliche ein. Ein Expressionskonstrukt kann in eine Zelle in Assoziation mit einem der beliebigen Liefervehikel, einschließlich viraler und nichtviraler Liefervehikel, wie unten beschrieben, eingeführt werden. Im Anschluss an die Einführung des Expressionskonstruktes in die Zellen kann die Expression des Reportergens durch herkömmliche Mittel bestimmt werden. Jeder Test, der ein Produkt des Reportergens entweder durch direkten Nachweis des von dem Reportergen kodierten Proteins oder durch Nachweis eines enzymatischen Produktes eines Reportergen-kodierten Enzyms nachweist, ist zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet. Tests schießen kolorimetrische, fluorimetrische oder lumineszente Tests oder sogar im Fall von Protein-Anhängseln Radioimmuntests oder andere immunologische Tests ein. Die Transfektionseffizienz kann durch Cotransfektion eines Expressionskonstruktes, das einen konstitutiv aktiven Promotor, der mit einem Reportergen funktional verbunden ist, umfasst, überwacht werden.
Die Aktivität eines TRE in einem TRE-Reportergen-Konstrukt kann nach transienter Expression bewertet werden, oder es können stabile Zelllinien erzeugt werden. Soll eine stabile Zelllinie erzeugt werden, dann enthält das Konstrukt ebenfalls ein Selektionsgen, das ebenfalls als selektierbarer Marker bezeichnet wird. Dieses Gen kodiert ein Protein, das für das Überleben oder Wachstum von transformierten Wirtszellen, die in einem selektiven Kulturmedium wachsen, notwendig ist. Wirtszellen, die nicht mit dem Vektor, der das Selektionsgen enthält, transformiert sind, werden in dem Kulturmedium nicht überleben. Typische Selektionsgene kodieren Proteine, die Resistenz gegen Antibiotika und andere Toxine, z. B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin übertragen, auxotrophe Mängel komplementieren oder aus den komplexen Medien nicht vorhandene kritische Nährstoffe bereitstellen. Wahlweise kann der selektierbare Marker auf einem von dem Konstrukt, das das TRE-Reportergen enthält, getrennten Konstrukt enthalten sein, und die zwei Konstrukte werden gleichzeitig in Wirtszellen eingeführt.
Zur Bewertung der Fähigkeit eines oder mehrerer Genprodukte, die Aktivität eines TRE zu modulieren, kann ein Expressionskonstrukt, das ein Gen umfasst, das ein zu untersuchendes Produkt kodiert, in Cardiomyocyten zusammen mit dem TRE-Reportergen-Konstrukt cotransfiziert werden. Die Wirkung des Genproduktes auf die Expression des Reportergens kann dann, wie oben beschrieben, bewertet werden.
Zur Bewertung der Fähigkeit eines oder mehrerer Genprodukten, die Transkription eines oder mehrerer Hypertrophie-sensitiver Gene zu modulieren, kann ein Expressionskonstrukt, das ein TRE eines Hypertrophie-sensitiven Gen umfasst, mit einem Reportergen, wie oben beschrieben, funktional verbunden werden, und in Zellen, wie oben beschrieben, eingeführt werden. Expressionskonstrukte, die ein Gen umfassen, das ein Produkt kodiert, dessen Fähigkeit die Transkription eines oder mehrerer Hypertrophie-sensitiver Genen zu modulieren, untersucht werden soll, können in Zellen cotransfiziert werden. Die Wirkung des Genproduktes auf die Expression des Reportergens kann, wie oben beschrieben, bewertet werden.
Gegebenenfalls können zusätzliche Agenzien dem Kulturmedium zugefügt werden, wie beispielsweise Rezeptoragonisten und -antagonisten, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, adrenerge Rezeptoragonisten oder -antagonisten. Die Wirkung, falls vorhanden, auf die Transkription eines Hypertrophie-sensitiven Gens kann, wie oben beschrieben, gemessen werden.
Agonisten und Antagonisten, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen ein, beschränken sich jedoch nicht auf, β1-spezifische Agonisten, wie beispielsweise Albuterol (ALB) und Dobutamin (DOB); β1-spezifische Antagonisten, wie beispielsweise Metroprolol (MET); α1-spezifische Agonisten, wie beispielsweise Phenylephrin (PE); α1-spezifische Antagonisten, wie beispielsweise Prazosin; gemischte β-Agonisten, wie beispielsweise Isoproterenol (ISO); gemischte β-Antagonisten, wie beispielsweise Propanolol(PROP); und Angiotensin II.
Liefern von Polynucleotidkonstrukten in Zellen
Ein Polynucleotidkonstrukt kann in eine Zelle auf eine Vielzahl von Weisen eingeführt werden. Liefervehikel, die zum Liefern eines Polynucleotids in eine Zelle (entweder in vivo, ex vivo oder in vitro) geeignet sind, schließen virale und nicht-virale Liefervehikel ein. Im Allgemeinen wird eine Polynucleotidsequenz mit einem transkriptionsregulierenden Element (TRE) funktional verbunden und ein heterologes Polypeptid sein. Ein Polynucleotid, das einen kodierenden Bereich umfasst, der ein Genprodukt kodiert, das Transkription von wenigstens einem Gen moduliert, das in Cardiomyocyten als Reaktion auf ein hypertrophes Signal exprimiert wird, oder ein Polynucleotid, das ein Hypertrophie-sensitives Gen umfasst, kann innerhalb eines Klonierungs- oder Expressionsvektors unter Verwendung von im Fachgebiet wohlbekannten Verfahren enthalten sein. Diese Vektoren (insbesondere Expressionsvektoren) können wiederum manipuliert werden, um eine beliebige Form einer Reihe von Formen anzunehmen, die zum Beispiel das Liefern zu und/oder Eintritt in eine Zelle vereinfachen kann. Das Liefern des Polynucleotidkonstruktes der Erfindung an eukaryotische Zellen, besonders an Säugerzellen, insbesondere an Cardiomyocyten, kann durch ein beliebiges, geeignetes, im Fachgebiet bekanntes Verfahren erfolgen. Liefern kann in vivo, ex vivo oder in vitro erfolgen.
Zur Inkorporation eines Polynucleotides zur Einführung in eine Wirtszelle geeignete Liefervehikel schließen nicht-virale und virale Vektoren ein. Verma und Somia (1997) Nature 389: 239–242.
Eine weitreichende Vielzahl an nicht-viralen Vehikeln zum Liefern eines Polynucleotides sind im Fachgebiet bekannt und liegen im Rahmen der vorliegenden Erfindung. Ein Polynucleotid kann an eine Zelle als nackte DNA (U.S. Patentnr. 5,692,622; WO 97/40163) geliefert werden. Wahlweise kann ein Polynucleotid an eine Zelle, auf eine Vielzahl von Weisen mit einer Vielzahl von Substanzen assoziiert geliefert werden (Lieferformen), einschließlich, aber nicht beschränkt auf, kationische Lipide; biokompatible Polymere, einschließlich natürlicher Polymere und synthetischer Polymere; Lipoproteine; Polypeptide; Polysaccharide; Lipopolysaccharide; künstliche virale Hüllen; Metallpartikel; und Bakterien. Ein Liefervehikel kann ein Mikropartikel sein. Mischungen oder Konjugate dieser verschiedenen Substanzen können ebenfalls als Liefervehikel verwendet werden. Ein Polynucleotid kann nichtkovalent oder kovalent mit diesen verschiedenen Lieferformen assoziiert sein. Liposomen können auf einen bestimmten Zelltyp zielen, z.B. auf einen Cardiomyocyten.
Virale Vektoren schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, virale DNA-Vektoren, wie beispielsweise solche, die auf Adenoviren, Herpes-Simplex-Virus, Poxviren, wie beispielsweise Vacciniavirus, und Parvoviren, einschließlich Adenoassoziiertes Virus basieren; und virale RNA-Vektoren, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, die retroviralen Vektoren. Retrovirale Vektoren schließen murines Leukemievirus und Lentiviren, wie beispielsweise humanes Immundefizienzvirus ein. Naldini et al. (1996) Science 272: 263–267.
Nicht-virale Liefervehikel, die ein Polynucleotid umfassen, können in Wirtszellen und/oder Zielzellen durch ein im Fachgebiet bekanntes Verfahren, wie beispielsweise Transfektion durch die Calciumphosphat-Copräzipitationstechnik; Elektorporation; Elektorpermeabilisierung; Liposom-vermittelte Transfektion; ballistische Transfektion; biolistische Vorgänge einschließlich Mikropartikel-Beschuss, Jetinjektion und Nadel- und Spritzeninjektion; oder durch Mikroinjektion eingeführt werden. Zahlreiche Transfektionsverfahren sind dem Fachmann bekannt.
Virale Liefervehikel können in Zellen durch Infektion eingeführt werden. Wahlweise können virale Vehikel in einen beliebigen der oben, zum Liefern in die Zellen beschriebenen nicht-viralen Liefervehikel inkorporiert werden. Zum Beispiel können virale Vektoren mit kationischen Lipiden (Hodgson und Solaiman (1996) Nature Biotechnol. 14: 339–342); oder lamellaren Liposomen (Wilson et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 3471; und Faller et al. (1984) J. Virol. 49: 269) vermischt werden.
Für die Lieferung in vivo können die Liefervehikel in ein Individuum durch eine Reihe von Verfahren eingeführt werden, die im Fachgebiet bekannt sind.
Herkunft der Tiere
Tiere, die zur Erzeugung von trangenen Tieren geeignet sind, sind nicht-humane Tiere, bevorzugt Säugetiere, und schließen ein, beschränken sich aber nicht auf, Mäuse, Ratten, Kaninchen, Schweine, Kühe und Schafe.
Für transgene Experimente geeignete Tiere können von herkömmlichen kommerziellen Quellen erhalten werden, wie beispielsweise Charles River (Wilmington, MA), Taconic (Germantown, NY) und Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, IN). Ist zum Beispiel das transgene Tier eine Maus, sind viele Mäusestämme geeignet, aber weibliche C57BL/6 Mäuse werden für Embryonengewinnung und -transfer bevorzugt. Männliche C57BL/6 Mäuse können zur Paarung verwendet werden und vasektomierte männliche C57BL/6 Zuchttiere, können zur Stimulierung einer Scheinträchtigkeit verwendet werden. Vasektomierte Mäuse und Ratten können vom Lieferanten erhalten werden.
Transgene Tiere
Transgene Tiere können durch ein beliebiges bekanntes Verfahren, einschließlich Mikroinjektionsverfahren und Verfahren mit embryonalen Stammzellen hergestellt werden. Die Vorgehensweisen zur Manipulation des Nagetier-Embryos und zur Mikroinjektion von DNA sind im Detail beschrieben in Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1986), die Inhalte sind im Allgemeinen bekannt und sind hierin eingefügt.
Als ein Beispiel einer Mikroinjektion wird bei weiblichen Mäusen im Alter von sechs Wochen durch eine 5 IU Injektion (0,1 cc, ip) Stutenserumgonadotropin (PMSG, Sigma), 48 Stunden später gefolgt von einer 5 IU Injektion (0,1 cc, IP) humanes Chorion-Gonadotropin (hCG, Sigma) Superovulation induziert. Die weiblichen Tiere werden unmittelbar nach hCG-Injektion mit männlichen Tieren zusammengebracht. Einundzwanzig Stunden nach hCG-Injektion werden die gepaarten Weibchen durch Erstickung mit CO₂ oder Genickbruch getötet, und die Embryonen werden aus den herausgeschnittenen Ovidukten gewonnen und in Dulbecco Phosphat-gepufferter Saline mit 0,5% Rinderserumalbumin (BSA; Sigma) überführt. Umgrenzende Zellhaufen werden mit Hyaluronidase (1 mg/ml) entfernt. Pronucleare Embryonen werden dann gewaschen und bis zum Injektionszeitpunkt in Earles-balancierter Salzlösung, die 0,5% BSA enthält (EBSS), in einen 37,5°C Inkubator unter befeuchteter Atmosphäre mit 5% CO₂, 95% Luft überführt. Die Embryonen können im Zweizellstadium implantiert werden.
Adulte weibliche Mäuse mit zufälligem Zyklus werden mit vasektomierten männlichen Mäusen gepaart. C57BL/6 oder Swiss-Mäuse oder andere vergleichbare Stämme können für diesen Zweck verwendet werden. Empfänger-Weibchen werden zur gleichen Zeit wie Donor-Weibchen gepaart. Zum Zeitpunkt des Embryonentransfers werden die Empfänger-Weibchen mit einer intraperitonealen Injektion von 0,015 ml 2,5% Avertin pro Gramm Körpergewicht anästhesiert. Die Ovidukte werden durch eine einzige mediane dorsale Inzision freigelegt. Eine Inzision erfolgt dann durch die Körperwand direkt über dem Ovidukt. Die ovariale Bursa wird mit einer Uhrmacherpinzette zerrissen. Die zu übertragenden Embryonen werden in DPBS (Dulbecco Phosphat-gepufferte Saline) in die Spitze einer Transferpipette überführt (etwa 10 bis 12 Embryonen). Die Pipettenspitze wird dann in das Infundibulum eingeführt und die Embryonen übertragen. Nach dem Transfer wird die Inzision mit zwei Nähten verschlossen.
Identifizierung und Charakterisierung von transgenen Tieren
Transgene Tiere können durch Analyse ihrer DNA identifiziert werden. Zu diesem Zweck können, wenn das transgene Tier ein Nagetier ist, Schwanzproben (1 bis 2 cm) aus drei Wochen alten Tieren entnommen werden. DNA aus diesen oder anderen Proben kann dann präpariert und durch Southern-Blot, PCR oder Slot-Blot analysiert werden, um transgene Foundertiere (F₀) und ihre Nachkommenschaft (F₁ und F₂) nachzuweisen.
1. Pathologische Studien
Die verschiedenen F0, F1 und F2 Tiere, die ein Transgen tragen, können durch eine Vielzahl von Techniken, einschließlich Immunhistologie, Elektronenmikroskopie, Elektrocardiographie und durch Bestimmen des Gesamtherzgewichts und des Gewichtes von Herzteilen, Messen der Cardiomyocytenquerschnittsbereiche und Bestimmen der Cardiomyocytenanzahl analysiert werden. Eine immunhistologische Analyse der Expression eines Transgens unter Verwendung eines Antikörpers mit geeigneter Spezifität kann unter Verwendung von bekannten Verfahren durchgeführt werden.
Morphometrische Analysen zur Bestimmung von Teilgewichten, Cardiomyocytenquerschnittsbereichen und Anzahl an Cardiomyocytenkernen kann unter Verwendung bekannter Verfahren durchgeführt werden. Die Herzen können hinsichtlich Funktion, Histologie und Expression von fötalen das Herz betreffenden Genen analysiert werden.
2. Analyse der Transgen-Expression durch Messen der mRNA-Gehalte
Messenger-RNA kann durch ein beliebiges, im Fachgebiet bekanntes Verfahren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Säure-Guanidinium-Thiocyanat-Phenol:Chloroform Extraktionsverfahren (Chomozynski und Sacchi (1987) Anal. Biochem. 162: 156–159), aus Zelllinien und Geweben von transgenen Tieren zur Bestimmung der Expressionsgehalte durch Northern-Blots, RNAse, quantitative PCR und Nuclease-Schutz-Tests isoliert werden.
3. Analyse der Transgen-Expression durch Messen der Proteingehalte
Die Proteingehalte können durch beliebige, im Fachgebiet bekannte Mittel gemessen werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Western-Blot-Analyse, ELISA und Radioimmuntests unter Verwendung eines oder mehrerer Antikörper, die für das Proteine spezifisch sind, das von dem Transgen kodiert wird.
Für die Western-Blot-Analyse können Proteinfraktionen aus Gewebehomogenaten und Zelllysaten isoliert werden und einer Western-Blot-Analyse, wie zum Beispiel beschrieben von Harlow et al. Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, NY, 1988) unterworfen werden.
Zum Beispiel können Proteinfraktionen in Laemmli-Probenpuffer denaturiert werden und auf SDS-Polyacrylamidgelen elektrophoretisch aufgetrennt werden. Die Proteine werden dann auf Nitrozellulose durch Elektroblotten übertragen. Die Filter werden blockiert, mit Primärantikörpern inkubiert und schließlich mit Enzymkonjugierten Sekundärantikörpern inkubiert. Die nachfolgende Inkubation mit dem geeigneten chromogenen Substrat zeigt die Position der Transgen-kodierten Proteine an.
Kreuzen der transgenen Tiere
Transgene nicht-humane Tiere, die die Nachkommenschaft von Kreuzungen zwischen einem transgenen Tier und einem zweiten Tier sind, können zur Identifizierung anderer Faktoren, die die hypertrophe Reaktion beeinflussen und die ebenfalls als ein Ziel für Arzneien dienen könnten, nützlich sein. Transgene Tiere können mit anderen transgenen Tieren gezüchtete werden, wobei die zwei transgenen Tiere unter Verwendung von unterschiedlichen Transgenen erzeugt wurden, um die Wirkung eines Genproduktes auf ein anderes Genprodukt zu untersuchen oder um die kombinierten Wirkungen der zwei Genprodukte zu untersuchen.
In einigen Ausführungsformen wird das Transgen in einem ersten transgenen Tier, das als ein Transgen ein Polynucleotid umfasst, das Calcineurin codiert, das mit einem heterologen, Cardiomyocyten-spezifischen THE funktionell verbunden ist, worin die Expression des Transgens embryonal letal oder anderweitig schädlich ist, so dass die Tiere für eine Analyse nicht lang genug überleben, unter die Transkriptionskontrolle eines induzierbaren Promotors gestellt, wie beispielsweise das tet induzierbare System, das oben beschrieben wird, so dass das Transgen im Wesentlichen nicht exprimiert wird, bis es erwünscht ist. Solche Tiere können dann mit tTA konstitutiven transgenen "Founder"-Tieren gekreuzt werden, die als ein Transgen ein Polynucleotid umfassen, das tTA unter Tetracyclin-Kontrolle umfasst.
In anderen Ausführungsformen wird ein erstes transgenes Tier, das als ein Transgen ein Calcineurin umfasst, das mit einem heterologen, Cardiomyocytenspezifischenen TRE funktional verbunden ist, so dass das erste Tiere ein oder mehrere Symptome der Herzhypertrophie aufzeigt, mit einem zweiten transgenen Tier gekreuzt, das als ein Transgen eine dominante negative Mutante von Calcineurin umfasst. Die Nachkommenschaft einer solchen Kreuzung würde eine Verringerung von einem oder mehrerer Symptome, die mit Herzhypertrophie assoziiert sind, aufzeigen.
Suchen nach Substanzen für die Behandlung von Herzhypertrophie
Die transgenen Tiere, aus transgenen Tieren isolierte Tierzellen, oder isolierte Enzyme können zum Suchen nach Substanzen hinsichtlich einer potentiellen Wirkung bei der Behandlung von Herzhypertrophie verwendet werden.
Auf Enzyme basierende Suchtests
In auf Enzymen basierenden Suchtests werden im Wesentlichen isolierte Enzyme, die an der Reaktion auf ein hypertrophes Signal in Cardiomyocyten beteiligt sind, mit einer zu untersuchenden Substanz in Kontakt gebracht. Die Aktivität des Enzyms wird bei Vorhandensein der Substanz nach einem geeigneten Zeitraum gemessen. Die Bedingungen und die für die Interaktion eines zu prüfenden Enzymagonisten oder -antagonisten mit dem Enzym ausreichende Zeitdauer wird mit dem Enzym variieren, dennoch bewegen sich die für die Bindung geeignete Bedingungen im Allgemeinen zwischen etwa 4°C und etwa 40°C, bevorzugt zwischen etwa 4°C und etwa 37°C, in einer gepufferten Lösung, die geeignete Ionen in einem geeigneten Konzentrationsbereich enthält, der für ein gegebenes Enzym variieren kann; und innerhalb eines pH-Bereiches zwischen 5 und 9. Ein ausreichender Zeitraum für die Bindung und Reaktion wird im Allgemeinen zwischen etwa 1 Millisekunde und etwa 24 Stunden nach Exposition liegen.
Die Enzymaktivität bei Vorhandensein der zu untersuchenden Substanz wird mit der Aktivität bei Nichtvorhandensein der zu untersuchenden Substanz verglichen. Eine Zu- oder Abnahme der gemessenen Aktivität ist ein Hinweis, dass die Substanz für die Verwendung, eine Herzhypertrophie-induzierte Funktionsstörung zu verringern, geeignet ist. Einer Substanz wird zugeschrieben, eine Wirkung auf Enzymaktivität zu haben, wenn die gemessene Aktivität wenigstens etwa 2-fach, bevorzugter wenigstens etwa 5-fach, bevorzugter wenigstens etwa 10-fach oder mehr, verglichen mit der Enzymaktivität, die bei Nichtvorhandensein der untersuchten Substanz gemessen wird, gesteigert oder verringert wird. Die Substanz kann weiter im Zellmodell und/oder Ganztiermodell, wie unten beschrieben, untersucht werden.
Enzyme, die an der Reaktion auf ein hypertrophes Signal in Cardiomyocyten beteiligt sind, sind Formen von Calcineurin. Enzyme können die native Form; eine mutierte Form mit veränderten enzymatischen Aktivitäten und/oder in vitro Stabilität oder Löslichkeit; eine mutierte Form, in der eine regulatorische oder andere Komponente von Calcineurin fehlt, aber das Enzym eine mit der Reaktion auf ein hypertrophes Signal in Verbindung stehende enzymatische Aktivität beibehält; mit einem anderen Molekül kovalent oder nichtkovalent assoziiert, um in vitro Stabilität zu übertragen, um Anlagerung an einen festen Träger zu vereinfachen, um eine antigene Determinante bereitzustellen, und Ähnliches sein. Die Enzyme können an einen Marker, der fähig ist, ein nachweisbares Signal herzustellen oder an andere funktionelle Teile konjugiert sein. Geeignete Marker schließen ein, beschränken sich aber nicht auf, Radionuclide, andere Enzyme, Substrate, Cofaktoren, Inhibitoren, fluoreszierende Farbstoffe, chemilumineszente Farbstoffe, biolumineszente Verbindungen und magnetische Partikel.
Vorzugsweise ist ein Enzym für die Verwendung in einem Suchtest im Wesentlichen gereinigt. Ein "im Wesentlichen isoliertes" oder "gereinigtes" Enzym ist eines, das im Wesentlichen frei von den Materialien ist, mit denen es natürlich assoziiert ist, insbesondere von anderem proteinartigen Material oder Substanzen, die eine enzymatische Aktivität, die mit einer Reaktion auf ein hypertrophes Signal in Verbindung steht, inhibieren können. Mit im Wesentlichen frei ist wenigstens zu 90% frei von den Materialien, mit denen es natürlich assoziiert ist, gemeint. Wie hierin verwendet, bezeichnet ein "im Wesentlichen isoliertes" Enzym rekombinante Enzyme, die, aufgrund der Herkunft oder Manipulation: (1) nicht mit dem gesamten oder einem Teil eines Enzyms assoziiert sind, mit dem sie natürlich assoziiert sind, (2) mit einem anderen Polypeptid verbunden sind, als an das sie natürlich verbunden sind, oder (3) natürlich nicht vorkommen.
Enzyme für die Verwendung in diesen Tests sind durch ein beliebiges, im Fachgebiet bekanntes Verfahren erhältlich, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, natürliche Quellen, chemische Synthese oder rekombinante Techniken. Ein Enzym für die Verwendung in den hierin beschriebenen Suchtests kann durch ein beliebiges bekanntes Verfahren gereinigt werden. Eine weitreichende Vielzahl von Verfahren sind im Fachgebiet bekannt. Siehe, zum Beispiel, Protein Purification: Principles and Practice, R. Scopes, ed. (1987) Springer Verlag.
Enzymaktivität kann mittels einem beliebigen bekannten Verfahren bestimmt werden.
Auf Zellen basierende Suchtests
In auf Zellen basierenden Suchtests wird die zu untersuchende Verbindung in die Kulturmedien von Zellen innerhalb eines Zeitraumes und in verschiedenen Dosierungen eingeführt, dann werden die Zellen hinsichtlich einer oder mehrerer Funktionen untersucht, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Veränderungen der Expressionsgehalte eines Hypertrophie sensitiven Gens, Veränderungen der Gehalte eines Polypeptidproduktes eines Hypertrophie-sensitiven Gens und Veränderungen der Zellgröße und/oder -morphologie.
Suchtests zur Bestimmung des therapeutischen Potentials von Verbindungen können unter Verwendung von Tierzellen, die von transgenen Tierzellen für die offenbarten Transgenkonstrukte in Zellkulturen abstammen oder mit dem offenbarten Konstrukten transient transfiziert wurden, durchgeführt werden. Auf Zellen basierende Suchtests können ebenfalls unter Verwendung von Primärzellen, wie beispielsweise Cardiomyocyten, die von einem nicht-transgenen Tier abstammen, durchgeführt werden, wobei die Zellen mit den Polynucleotidkonstrukten stabil oder transient transfiziert werden, oder mit hypertrophen Signalen, wie beispielsweise Angiotensin II oder α-adrenergen Agonisten stimuliert werden.
Zum Nachweis einer Veränderung der Polypeptidproduktgehalte eines Hypertrophie-sensitiven Gens können eine Vielzahl von Testverfahren verwendet werden, die alle im Fachgebiet bekannt sind. Zum Beispiel kann ein immunologischer Test, wie beispielsweise ELISA unter Verwendung eines oder mehrerer Antikörpern, die für ein oder mehrere Polypeptidprodukte eines Hypertrophie-sensitiven Gens spezifisch sind, verwendet werden.
Zum Nachweis einer Veränderung von Expressionsgehalten eines Hypertrophie-sensitiven Gens kann ein beliebiges, bekanntes Verfahren verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Hybridisierung mit einer Polynucleotid-Sonde, die zu einem RNA-Produkt des Gens komplementär ist; und eine Polymerasekettenreaktion unter Verwendung von Oligonucleotidprimern, die eine Verlängerung einer cDNA-Kopie eines RNA-Produktes des Gens initiieren. Die Nucleotidsequenzen einiger Hypertrophie-sensitiver Gene wurden offenbart, und diese Information kann zum Entwurf von Oligonucleotidprimern verwendet werden.
Wahlweise können die Zellen mit einem Reportergen-Konstrukt transfiziert werden, das ein Reportergen umfasst, das mit einem TRE funktional verbunden ist, insbesondere eines, das von einem Hypertrophie-sensitiven Gen abstammt. In diesen Tests ist das ablesbare Ergebnis der Gehalt des aktiven Reportergenprodukts. Die Nucleotidsequenzen von 5'-flankierenden Bereichen einiger Hypertrophie-sensitiver Gene wurden offenbart und können zum Erzeugen von Konstrukten verwendet werden, die ein THE eines Herzhypertrophie-sensitiven Gens, das mit einem Reportergen funktional verbunden ist, umfassen. Solche Nucleotidsequenzen schließen, zum Beispiel, ANF 5'-flankierende Sequenzen der Ratte (GenBank Hinterlegungsnr. J03267); und β-MHC 5'-flankierende Sequenzen der Maus (GenBank Hinterlegungsnr. U86076) ein.
Auf Zellen basierende Suchtests, die hierin beschrieben sind, können zur Primärsuche, oder wahlweise, für sekundäre Suchvorgänge, um weiter Verbindungen zu untersuchen, die in der oben beschriebenen, auf Enzymen basierenden Suche aktiv sind, verwendet werden.
Für diese Tests geeignete Zellen schließen ein, beschränken sich aber nicht auf, primäre Cardiomyocyten, die entweder aus transgenen oder nicht-transgenen Tieren isoliert werden. Andere Zellen, die zur Verwendung in auf Zellen basierenden Suchtests geeignet sind, schließen Nicht-Cardiomyocyten-Zelltypen, wie beispielsweise Fibroblasten ein.
In einigen Ausführungsformen werden Zellen mit einen Konstrukt transfiziert, das ein TRE aus einem Hypertrophie-sensitiven Gen, das mit einem Reportergen funktional verbunden ist, umfasst. Reportergene sind im Fachgebiet bekannt und werden oben beschrieben. Ein Beispiel ist ein grünfluoreszierendes Protein (GFP) und Varianten davon. Siehe, zum Beispiel, Heim und Tsien (1996) Curr. Biol. 6: 178–182; Mitra et al. (1996) Gene 173: 13–17; und Yang et al. (1996) Nucl. Acids. Res. 24: 4592–4593. Die transfizierten Zellen werden dann in Kulturplatten mit 96 Vertiefungen mit 1,5 bis 2,5 × 10⁴ Zellen pro Vertiefung in einem geeigneten Kulturmedium, wie beispielsweise Dulbecco Minimal-Essential-Medium plus 10% fötales Rinderserum überführt. Im Anschluss an Inkubation über Nacht bei 37°C in einem mit 5% Kohlendioxid äquilibrierten Inkubator werden die Medien entfernt und durch Medien, die eine zu untersuchende Verbindung enthalten, ersetzt, und eine geeignete Zeitdauer inkubiert. Eine geeignete Zeitdauer zur Inkubation mit einer zu untersuchenden Substanz kann von etwa 0,5 Stunden bis etwa 24 Stunden reichen. Zusätzlich zur Testverbindung wird eine Hypertrophie induzierende Substanz zum Kulturmedium zugefügt. Die Hypertrophie-induzierende Substanz kann gleichzeitig mit, vor, oder nach Zugabe der Testsubstanz zugegeben werden. Hypertrophie-induzierende Substanzen schließen ein, beschränken sich aber nicht auf Angiotensin II und PE. Die Stämme, die die zu untersuchende Verbindung enthalten, werden erst in einem geeigneten Lösemittel präpariert. Mehrere Verdünnungen der Testverbindung werden untersucht. Passende Kontrollen schließen Zellen, zu denen Lösemittel, das keine Testsubstanz enthält, zugegeben wird und Zellen, zu denen Testsubstanz zugegeben wird, aber zu denen keine Hypertrophie-induzierende Substanz gegeben wird, ein.
Nach Behandlung wird eine Wirkung der Testverbindung unter Verwendung eines geeigneten Tests für das Reportergenprodukt gemessen.
Reportergene, die verwendet werden können, sind wohl bekannt und schließen ein, beschränken sich aber nicht auf, Luciferase, ein grünfluoreszierendes Protein (GFP), zum Beispiel, ein GFP aus Aequorea victoris, oder ein beliebiges einer GFP-Vielzahl, die im Fachgebiet bekannt sind; β-Galaktosidase, Chloramphenicolacetyltransferase; immunologisch nachweisbare Protein-"Anhängsel", wie beispielsweise humanes Wachstumshormon; und Ähnliche. Siehe, zum Beispiel, Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. eds., 198 und regelmäßige Aktualisierungen.
Ein Test, der ein Produkt des Reportergens entweder durch direkten Nachweis des Proteins, das von dem Reportergen kodiert wird oder durch Nachweis eines enzymatischen Produktes eines von einem Reportergen kodierten Enzyms nachweist, ist für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet. Tests schließen kolorimetrische, fluorimetrische, oder lumineszente Tests oder sogar, im Fall von Protein-Anhängseln, Radioimmuntests oder andere immunologische Tests ein.
Einer Substanz wird eine Wirkung zugeschrieben, wenn die Transkription des funktional verbundenen Reportergens in Zellen wenigstens etwa 2-fach, bevorzugter wenigstens etwa 5-fach, bevorzugter wenigstens etwa 10-fach oder mehr im Vergleich zu Kontrollzellen, die nicht der Substanz ausgesetzt waren, erhöht oder verringert ist.
Cytotoxische Wirkungen der Substanzen können durch im Fachgebiet bekannte Mittel gemessen werden. Zum Beispiel können cytotoxische Wirkungen der Substanzen durch eine Modifikation des Verfahrens nach Hansen et al. (1989) J. Immunol. Method. 119: 203–210 gemessen werden. Zu den in der Gewebekulturschale verbleibenden Zellen wird 25 μL einer 3,(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) Stammlösung (5 mg/mL) in einer Endkonzentration von 1 mg/mL zugegeben. Die Zellen werden bei 37°C eine Stunde inkubiert, und die zelluläre Aktivität wird durch die Zugabe eines gleichen Volumens MTT Lysepuffer (20% w/v Natriumdodecylformamid, pH 4,7) gestoppt. Eine vollständige Extraktion wird durch Rütteln über Nacht bei Raumtemperatur erzielt. Der Unterschied der OD_562nm und der OD_650nm wird in einem Molecular Device UV_max Mikroplattenlesegerät oder mittels Entsprechendem, als ein Indikator der zellulären Lebensfähigkeit gemessen. Andere Tests der Lebensfähigkeit von Zellen schließen die Trypanblau-Ausschluß-Methode ein.
Ganztiermodelle als Suchtests
In den Ganztiermodellen als Suchtests, die hierin beschrieben sind, wird die Verbindung an ein transgenes Tier über eine Zeitdauer und in verschiedenen Dosierungen verabreicht, dann werden die Tiere hinsichtlich Herzfunktion untersucht, die durch verschiedene Parameter gemessen wird, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Verhältnis der linken Ventrikelmasse:Körpergewicht; Cardiomyocytengröße und -organisation; Herzhypertrophie-sensitive Genexpression; Herzfunktion; dP/dT; faserartige Ablagerung; Calciumionenfluss, Schlaglänge; und Ventrikelzeitvolumen. Ein Ganztiermodell kann als Erstsuche verwendet werden, oder kann als eine Zweitsuche verwendet werden, um Substanzen weiter zu bewerten, die in einer auf Enzymen und/oder auf Zellen basierenden Suche identifiziert wurden. In anderen Ausführungsformen kann ein Teil eines transgenen Tieres in einem in vitro Suchtest verwendet werden. Zum Beispiel kann ein aus einem transgenen Tier isoliertes Herz in einem in vitro Suchtest verwendet werden. Die Parameter, die gemessen werden können, entsprechen denen eines Ganztiermodells.
Tests zum Nachweis von Proteinen, die mit Enzymen interagieren, die an der Reaktion auf ein hypertrophes Signal beteiligt sind
Die Enzymziele, die in den auf Enzymen basierenden Suchtests, die oben beschrieben sind, verwendet werden, sind ebenfalls zur Identifizierung anderer Faktoren, die Polypeptide sein können, die mit dem Enzymziel interagieren, nützlich. Solche Faktoren können dann hinsichtlich ihrer Nützlichkeit als therapeutische Ziele bei der Behandlung einer Hypertrophie-induzierten Funktionsstörung bewertet werden. Solche Faktoren können ebenfalls hinsichtlich einer potentiellen Rolle beim Modulieren einer biologischen Funktion des Zielgenproduktes analysiert werden.
Jedes bekannte Verfahren kann zur Identifizierung von Polypeptiden, die mit einem Enzymziel interagieren, verwendet werden. Geeignete Tests schließen in vitro und in vivo Tests ein. In vitro Tests schließen ein, beschränken sich aber nicht auf Copräzipitation, Proteininteraktions-Trapping und ELISA. Tests können zur Identifizierung von Verbindungen entworfen werden, die an Zielgenprodukte binden, an andere zelluläre oder extrazelluläre Proteine binden, die mit einem Zielgenprodukt interagieren und die die Interaktion eines Zielgenproduktes mit anderen zellulären Proteinen stören.
Als ein Beispiel von Proteininteraktions-Trapping kann eine Suche unter Verwendung des Zwei-Hybrid-Systems der Hefe unter Verwendung von GATA4 der Maus als Köder zur Identifizierung von potentiellen interagierenden Faktoren in dem adulten Mycardium durchgeführt werden, wie beschrieben. Molkentin et al. (1998) Cell 93: 215–228. In diesem Beispiel enthält der GATA4-Köder die Aminosäuren 130–409 mit der GAL4 DNA-Bindedomäne im Leseraster fusioniert. Dieser Bereich von GATA4 umfasst zwei Zinkfingerdomänen und ist innerhalb eines PstI–NsiI Fragmentes kodiert, das in eine Pst I Stelle im pAS Expressionsvektor der Hefe kloniert wurde. pAS-GATA4 wurde in Hefe mit einer Bibliothek des adulten Herzens der Maus, die die GAL4 Aktivierungsdomäne an Random-cDNAs fusioniert enthielt, cotransformiert, und über 5 Millionen erste Kolonien wurde hinsichtlich positiver Interaktionen durchsucht. Annährend 100 positive Hefekolonien wurden anfänglich identifiziert. Für jeden einzelnen Kolonie wurde das aktivierende Plasmid gewonnen und das cDNA-Insert wurde sequenziert. Klone, die die cDNA-Inserts in der Antisense-Orientierung enthielten oder die nicht im Leseraster waren, wurden verworfen. Die verbleibenden Klone (etwa 21) wurden zur Untersuchung ihrer Spezifität zurück in die Hefe retransformiert.
Bindungsspezifität kann unter Verwendung folgender Kriterien bestimmt werden: 1) die isolierten Klone sollten die Interaktion mit dem ursprünglichen Köder wiederholen; 2) die isolierten Klone sollten nicht mit einem unspezifischen Köder, in diesem Fall eine GAL4-E12 Fusion, interagieren. Als weiterer Spezifitätstest kann man die Interaktion mit verwandten Proteinen, die ein hohes Maß an Aminosäuresequenzhomologie aufweisen, weiter untersuchen.
Verwendung von transgenen Tieren oder davon abstammenden Zellen
Die hier beschriebenen transgenen Tiere sind zur Suche und Identifizierung oder zum Testen von Substanzen oder potentiellen Stoffen zum Behandeln von hypertrophen Cardiomyopathien und/oder zur Forschung im Zusammenhang mit hypertrophen Cardiomyopathien mit dem Ziel verbesserte therapeutische Behandlungen oder diagnostische Verfahren zu entwickeln, die in der Humanmedizin anwendbar sind, besonders nützlich.
Zu untersuchende Substanzen schließen natürlich vorkommende und synthetische Substanzen ein. Diese Substanzen schließen nicht nur natürliche und synthetische anorganische und organische Verbindungen, basierend auf verschiedenen Kernstrukturen, sondern auch Oligomere, wie beispielsweise Oligopeptide und Oligonucleotide ein. Verschiedene natürliche Quellen können nach Wirkstoffen durchsucht werden, einschließlich solcher, die im Dschungel, den Ozeanen und Ähnlichen gefunden werden. Zusätzlich können kombinatorische Bibliotheken von Verbindungen erzeugt und untersucht werden. Auch zur Untersuchung inbegriffen sind Antikörper gegen ein Genprodukt, insbesondere ein Polypeptid eines Gens, das an der Modulierung von Transkription eines Herzhypertrophie-sensitiven Gens beteiligt ist.
Zusammensetzungen, die zur Behandlung von Herzhypertrophie oder Herzinsuffizienz nützliche Substanzen umfassen
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Zusammensetzungen bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung einer Herzhypertrophieinduzierten Funktionsstörung. Zum Zweck dieser Erfindung ist eine Substanz zur Verwendung bei der Behandlung einer Herzhypertrophie-induzierten Funktionsstörung eine Substanz, die Gehalte eines aktiven Produktes von wenigstens einem Gen, das in Cardiomyocyten als Reaktion auf ein hypertrophes Signal exprimiert wird, moduliert. Substanzen, die geeignet sind, schließen natürliche oder synthetische organische oder anorganische Verbindungen ein, die 1) die Expression eines Hypertrophie-sensitiven Gens modulieren; 2) die Expression eines Gens modulieren, dessen Produkt die Expression eines Hypertrophie-sensitiven Gens moduliert, und/oder 3) eine Aktivität eines Genproduktes modulieren, das die Expression eins Hypertrophie-sensitiven Gens moduliert. Eine "Substanz" schließt ebenfalls ein Polynucleotid ein, das 1) die Expression eines Hypertrophie-sensitiven Gens moduliert; 2) die Expression eines Gens moduliert, dessen Produkt die Expression eines Hypertrophie-sensitiven Gens moduliert; 3) die Gehalte an aktivem Produkt von wenigstens einem Gen moduliert, das in Cardiomyocyten als Reaktion auf ein hypertrophes Signal exprimiert wird.
Substanzen zum Behandeln von Herzhypertrophie schließen ein, beschränken sich aber nicht auf, die Calcineurin-Inhibitoren FK506 und Cyclosporin und verwandte Stoffe. Diese Stoffe werden routinemäßig als Immunsuppressiva in Transplantationspatienten verwendet, sind bisher jedoch nicht zur Behandlung von Herzhypertrophie oder Herzinsuffizienz verwendet worden. "Cyclosporine" sind zyklische Undekapeptide. Eine Vielzahl von Cyclosporinen, die die Phosphataseaktivität von CaN inhibieren, wurden beschrieben und sind im Ausdruck "Cyclosporin" inbegriffen. Diese schließen ein, beschränken sich jedoch nicht auf, Cyclosporin A; Derivate von Cyclosporin A, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, (O-(2-Hydroxyethyl)-D-ser)8 und (3'-Deshydroxy-3'-keto-McBmt)1-(Val)2 Derivate (U.S. Patentnr. 5,284,826 und 5,525,590); und Cyclosporin G. Pharmazeutische Formulierungen von Cyclosporin, die geeignet sein können, schließen ein, beschränken sich jedoch nicht auf solche, die in UK Patentveröffentlichungsnr. GB 2,257,359; PCT Veröffentlichungsnr. WO 95/34285 und WO 97/07787; und U.S. Patentnr. 5,739,105 und 5,641,745 beschrieben sind. FK596 ist ein makrozyklisches Lakton. Der Ausdruck "FK506", wie hierin verwendet, schließt FK506 und Derivate ein, die eine Phosphataseaktivität von CaN inhibieren, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Derivate, die in U.S. Patentnr. 5,530,120 und 5,493,019 offenbart werden. Ebenfalls sind Substanzen eingeschlossen, die CaMKIV- Inhibitoren sind, einschließlich KN62, KN93 und verwandte Stoffe, die Kinaseaktivität von CaMKIV inhibieren. Weiterhin sind Inhibitoren der p38 Kinase, die in PCT Veröffentlichungsnr. WO98/27098 beschrieben sind, eingeschlossen.
Substanzen, die ein Potential zur Behandlung von Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz aufweisen, schließen Substanzen ein, die die Expression eines oder mehrerer Genprodukte verstärken, die normalerweise die Transkription von wenigstens einem Gen, das in Cardiomyocyten als Reaktion auf ein hypertrophes Signal exprimiert wird, unterdrücken, wobei die Expression von wenigstens einem Gen, das in Cardiomyocyten als Reaktion auf ein hypertrophes Signal exprimiert wird, verringert wird. Zum Beispiel wurde entdeckt, dass der Transkriptionsfaktor YY1 ein umfassender Repressor von Genen, die auf Herzhypertrophie reagieren, ist. Eine Überexpression von YY1 in kultivierten Cardiomyocyten verhindert Herzhypertrophie und dämpft die gesamte Hypertrophie-sensitive Genexpression. Substanzen, die Regulatoren von YY1 sind, können dann potentiell verwendet werden, um Herzhypertrophie, Cardiomyocytenwachstum und Herzfunktion zu regulieren. Als ein weiteres Beispiel dämpft konstitutiv aktives CaMKIIα alle Hypertrophie-sensitiven Gene in Cardiomyocyten-Kulturen. Substanzen, die CaMKIIα aktivieren, haben das Potential, Herzhypertrophie zu regulieren.
Substanzen, die ein Potential zur Behandlung von Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz haben, schließen ebenfalls Substanzen ein, die die Expression eines oder mehrerer Genprodukte verringern, die normalerweise Transkription von wenigstens einem Gen steigern, das in Cardiomyocyten als Reaktion auf ein hypertrophes Signal exprimiert wird, wobei die Expression von wenigstens einem Gen, das in Cardiomyocyten als Reaktion auf ein hypertrophes Signal exprimiert wird, verringert wird.
Eine Substanz kann alleine oder zusammen mit anderen Arzneistoffen, einschließlich β-adrenergen Rezeptor-Antagonisten, Endothelinrezeptor-Anagonisten, ACE-Inhibitoren und Ähnliche verabreicht werden. ACE-Inhibitoren schließen Stoffe ein, die von den Warenzeichen Accupril^®, Altace^®, Capoten^®, Lotensin^®, Monopril^®, Prinivil^®, Vasotec^® und Zestril^® entworfen wurden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen werden unter Verwendung einer Substanz oder durch Verbinden einer Substanz mit einem passenden Träger, der selbst ein immunologisches Adjuvanz sein kann, präpariert. Diese Zusammensetzungen können durch beliebige Mittel, die den beabsichtigten Zweck erfüllen, verabreicht werden. Zum Beispiel kann eine Verabreichung subkutan, kutan, intravenös, intradermal, intramuskulär oder intraperitoneal erfolgen.
Sowohl die Menge der verabreichten Substanz als auch die Verabreichungshäufigkeit hängt von Alter, Geschlecht, Gesundheitszustand und Gewicht des Empfängers, als auch von der Natur der erwünschten Wirkung ab.
Zusätzlich zu den durch oben beschriebene Suchverfahren identifizierten Substanzen können diese pharmazeutischen Zusammensetzungen geeignete pharmazeutisch verträgliche Träger enthalten, die Arzneimittelträger und Hilfsstoffe umfassen, die eine Verarbeitung der Wirkstoffe zu Präparationen, die pharmazeutisch genutzt werden können, vereinfachen. Vorzugsweise enthalten die Präparationen, insbesondere solche, die oral verabreicht werden können und die für die bevorzugte Verabreichungsform verwendet werden können, wie beispielsweise Tabletten, Dragees und Kapseln, und auch Präparationen, die rektal verabreicht werden können, wie beispielsweise Suppositorien, als auch zur Verabreichung durch Injektion oder oral geeignete Lösungen, von etwa 0,1 bis 99 Gewichtsprozent, und vorzugsweise von etwa 25 bis 85 Gewichtsprozent Wirkstoff zusammen mit dem Arzneimittelträger.
Die pharmazeutischen Präparationen werden auf eine Weise hergestellt, die bekannt ist, zum Beispiel mittels herkömmliche Misch-, Granulier-, Drageeherstellungs-, Lösungs- oder Lyophilisierungsvorgänge. Somit können pharmazeutische Präparationen erhalten werden durch Vereinen der Wirkstoffe mit festen Arzneimittelträgern, gegebenenfalls durch Mahlen einer resultierenden Mischung und Verarbeiten der Granulatmischung, nach der Zugabe geeigneter Hilfsstoffe, wenn erwünscht oder notwendig, um Tabletten oder Drageekerne zu erhalten.
Geeignete Arzneimittelträger sind insbesondere Füllstoffe, wie beispielsweise Zucker, zum Beispiel Lactose, Sucrose, Mannitol oder Sorbitol, Cellulosepräparationen und/oder Calciumphosphat, wie beispielsweise Tricalciumphosphat oder Calciumhydrogenphosphat, als auch Bindemittel, wie beispielsweise Stärkepaste unter Verwendung von, zum Beispiel, Maisstärke, Weizenstärke, Reisstärke, Kartoffelstärke, Gelatine, Gummitragant, Methylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon. Wenn erwünscht, können Aufschlussmittel zugegeben werden, wie beispielsweise die oben genannten Stärken und Derivate davon, vernetztes Polyvinylpyrrolidon, Agar, oder Alginsäure oder Salze davon, wie beispielsweise Natriumalginat. Hilfsstoffe schließen fließregulierende Mittel und Schmiermittel, wie beispielsweise Silica, Talk, Stearinsäure oder Salze davon, wie beispielsweise Magnesium oder Calciumstearat und/oder Polyethylenglycol ein. Drageekerne können mit geeigneten Beschichtungen, die, falls erwünscht, gegen Magensäure resistent sind, bereitgestellt werden. Zu diesem Zweck können konzentrierte Zuckerlösungen verwendet werden, die gegebenenfalls Gummiarabikum, Talk, Polyvinylpyrrolidon, Polyethylenglycol und/oder Titaniumdioxid, Lacquer-Lösungen und geeignete organische Lösemittel oder Lösemittelmischungen enthalten können. Um Beschichtungen herzustellen, die gegen Magensäfte resistent sind, werden Lösungen geeigneter Cellulosepräparationen, wie beispielsweise Acetylcellulosephthalat oder Hydroxypropylmethylcellulosephthalat verwendet. Farbstoffe oder Pigmente können zu den Tabletten- oder Drageebeschichtungen zugefügt werden, zum Beispiel zur Identifizierung oder zur Kennzeichnung von verschiedenen Kombinationen von Wirkstoffdosierungen.
Andere pharmazeutische Präparationen, die oral verwendet werden können, schließen sowohl Steckkapseln, die aus Gelatine hergestellt sind, als auch versiegelte Weichkapseln, die aus Gelatine und einem Weichmacher, wie beispielsweise Glycerol oder Sorbitol hergestellt sind, ein. Die Steckkapseln können die Wirkstoffe in Form von Granula, die mit Füllstoffen, wie beispielsweise Lactose, Bindemittel, wie beispielsweise Stärken, und/oder Schmiermitteln, wie beispielsweise Talk oder Magnesiumstearat und gegebenenfalls Stabilisatoren vermischt sein können, enthalten. In Weichkapseln werden die Wirkstoffe vorzugsweise in geeigneten Flüssigkeiten, wie beispielsweise Fettöle, Flüssigparaffin oder Polyethylenglycole gelöst oder suspendiert. Zusätzlich können Stabilisatoren zugegeben werden.
Pharmazeutische Präparationen, die rektal verabreicht werden können, schließen Suppositorien ein, die aus einer Kombination aus Wirkstoffen mit einer Suppositorienbasis bestehen. Geeignete Suppositorienbasen sind, zum Beispiel, natürliche oder synthetische Triglyceride, Paraffinkohlenwasserstoffe, Polyethylenglycole und höhere Alkohole. Zusätzlich ist es ebenfalls möglich, Gelatine-Rektalkapseln zu verwenden, die aus einer Kombination der Wirkstoffe mit einer geeigneten Basis bestehen. Geeignete Basismaterialien schließen, zum Beispiel, flüssige Triglyceride, Polyethylenglycole und Paraffinkohlenwasserstoffe ein.
Eine Vielzahl an Vorrichtungen sind bekannt, die eine kontrollierte Zuführung einer Substanz an ein Gewebe erlauben. Geeignete Beispiele von Depotpräparationen schließen semipermeable Matrizen aus festen hydrophoben Polymeren ein, die das Protein enthalten, wobei die Matrizen in der Form von Formstücken sind, z.B. Filme oder Mikrokapseln.
Geeignete Formulierungen zur parenteralen Verabreichung schließen wässrige Lösungen der Wirkstoffe in wasserlöslicher Form ein. Zusätzlich können Suspensionen der Wirkstoffe als geeignete ölige Suspensionen verabreicht werden. Geeignete lipophile Lösemittel oder Vehikel schließen Fettöle, wie beispielsweise Sesamöl oder synthetische Fettsäureester, wie beispielsweise Ethyloleat oder Triglyceride ein. Wässrige Injektionssuspensionen können Substanzen enthalten, die die Viskosität der Suspension erhöhen, wie beispielsweise Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbitol und/oder Dextran. Gegebenenfalls kann die Suspension Stabilisatoren enthalten.
Pharmazeutische Arzneimittelträger sind im Fachgebiet wohlbekannt und müssen hierin nicht im Detail beschrieben werden. Siehe, zum Beispiel, Remington, The Science and Practice of Pharmacy (19. Ausgabe, 1995), Gennaro, ed.
Verfahren zur Behandlung von Herzhypertrophie-induzierter Funktionsstörung
Wie hierin verwendet, ist "Behandlung" ein Ansatz heilsame oder erwünschte klinische Resultate zu erhalten. Für Zwecke der Erfindung heilsame oder erwünschte klinische Resultate schließen ein, beschränken sich jedoch nicht auf, Symptomlinderung, Verringerung des Erkrankungsausmaßes, Stabilisierung (d.h. nicht Verschlechterung) des Erkrankungszustandes, Verzögerung oder Verlangsamung der Erkrankungsprogression, Verbesserung oder Linderung des Erkrankungszustandes, und Remission (entweder teilweise oder ganz), entweder nachweisbar oder nicht nachweisbar. "Behandlung" kann ebenfalls Überlebensverlängerung im Vergleich zur erwarteten Überlebensdauer, wenn keine Behandlung erfolgt, bedeuten. Wie hierin verwendet, schließt der Ausdruck "Behandlung" Prophylaxe ein.
"Linderung" einer Erkrankung bedeutet, das Ausmaß und/oder nicht erwünschte klinische Manifestationen eines Erkrankungszustandes zu verringern und/oder den Zeitverlauf der Progression zu verlangsamen oder zu verlängern.
Die Verfahren umfassen Verabreichen an ein Individuum (ein "Subjekt") mit einem Bedarf einer Substanzmenge, die die Progression der Funktionsstörung wirksam verringern oder umkehrt. Im Zusammenhang mit Prophylaxe schließt ein "Subjekt mit einem Bedarf" Individuen in der Allgemeinbevölkerung, die 55 Jahr oder alter sind; Individuen, die eine genetische Prädisposition haben, Herzhypertrophie zu entwickeln; Patienten mit dilatierter Herzmyopathie; hypertensive Patienten; Patienten mit Niereninsuffizienz und vaskulärer Hypertonie; Individuen mit vaskulärer Hypertonie aufgrund von Drucküberlastung, Volumenüberlastung, oder gesteigerter Resistenz des peripheren Gefäßbetts; Individuen mit respiratorischen Erkrankungen, wie beispielsweise Emphysema oder Fibrose cystica; chronische Asthmatiker; Individuen mit Tuberkulose; und Organtransplantationspatienten ein, wird jedoch nicht darauf beschränkt.
In einigen Ausführungsformen beziehen die Verfahren ein Blockieren der Aktivität des das Herz betreffenden Calcineurins (CaN), insbesondere hinsichtlich dessen Dephosphorylierungswirkung auf das Herz betreffende Transkriptionsfaktoren, wie beispielsweise NFAT-3 oder andere Mitglieder der NFAT-3 Familie, ein. In einigen Ausführungsformen beziehen die Verfahren die Verwendung von CaN-Inhibitoren zum Blockieren der Transkriptionsaktivierung von NFAT oder anderen nuclearen Transkriptionsfaktoren, die durch CaN-vermittelte Dephosphorylierung aktiviert werden, ein. In anderen Ausführungsformen beziehen die Verfahren eine Inhibierung von CaN durch klinisch getestete spezifische Inhibitorstoffe, einschließlich Mitglieder der immunsuppressiven Familie von Cyclosporin A-Derivaten ein, um die Dephosphorylierungsaktivität von CaN im Cytosol und/oder Kern des Cardiomyocyten zu verringern. Ein Blockieren der Dephosphorylierung von NFAT-Transkriptionsfaktoren durch immunsuppressive Stoffe, die spezifische CaN inhibieren, verringert oder beugt im Wesentlichen die Translokation dieser Transkriptionsfaktoren zum nuclearen Kompartiment des Cardiomyocyten vor, wobei diese unfähig werden, eine aktive Heteroduplex mit GATA4 zu bilden. Die Unfähigkeit die NFAT-3/GATA-4 Heteroduplex oder ähnliche Komplexe zwischen aktivierten NFAT-Mitgliedern und GATA-Transkriptionsfaktoren zu bilden, hält solche Komplexe davon ab, an ihre spezifische Enhancerstelle auf einer Reihe von Hypertrophie-sensitiven, das Herz betreffenden Promotoren zu binden. Da eine Reihe von Herzhypertrophie-sensitiven Promotoren solche Bindestellen enthalten und auf NFAT-3/GATA-4 oder ähnliche Komplexe ansprechen, können ihre Genprodukte durch CaN-Aktivität hochreguliert werden und deshalb durch CaN-spezifische immunsuppressive Inhibitoren inhibiert werden.
CaN-spezifische immunsuppressive Inhibitoren blockieren die Mehrzahl der nuclearen Signale, die bei CaN infolge von Herzhypertrophie, die durch cardiovaskuläre Drucküberlastung induziert ist, konvergieren, und blockieren die Transkriptionsinduktion, welches zu chronischer Hypertrophie führt, die wiederum zu dilatierter Herzmyopahie im chronischen unbehandelten Tier führt. In anderen Ausführungsformen blockiert die Verwendung von CaN-Inhibitoren alle nuclearen Signale, die durch Drucküberlastung der Membranrezeptoren vermittelt werden, für die Transkriptionsinduktion von Herzhypertrophie. Rezeptorvermittelte Transkriptionsinduktion von Herzhypertrophie durch blutdruckerhöhende Mittel, Angiotensin II (AngII), Endothelin-1 (ET-1), Thrombin (Thrb) und alpha-adrenerge Signale durch den alpha-1-adrenergen Rezeptor konvergieren als ein nucleares Transkriptionsaktivierungssignal bei CaN. Da diese Pfade bei CaN konvergieren können blutdruckerhöhendes Mittel- und alpha-1-adrenerge Rezeptor-vermittelte Transkriptionsinduktion von Hypertrophie-sensitiven das Herz betreffenden Genen durch CaN-Inhibitoren blockiert werden.
In anderen Ausführungsformen inhibieren die Verfahren die Expression von Genprodukten, die als Reaktion auf CaN-Dephosphorylierung von NFAT-Transkriptionsfaktoren exprimiert werden, d.h. Genprodukte von Hypertrophiesensitiven Genen. In einigen dieser Ausführungsformen ist das Agens, das die Expression eines oder mehrerer Hypertrophie-sensitiver Gene inhibiert, ein Antisense-Polynucleotid, das auf ein Hypertrophie-sensitives Gen zielt.
In Ausführungsformen, die Verabreichung von/eines Agenzien/Agens, die/das CaN inhibieren/inhibiert, umfassen, wobei die Dephosphorylierung von NFAT-3 und/oder einem oder mehreren verwandten Familienmitgliedern blockiert wird, ist ein Agens, das CaN blockiert, ein Mitglied der Cyclosporinfamilie von immunsuppressiven Stoffen, wie beispielsweise Cyclosporin A (CsA) oder FK506. Ein beliebiges Agens, das das Herz betreffende CaN Aktivität inhibiert, um die Dephosphorylierung eines oder mehrerer Mitglieder der NFAT-Transkriptionsfaktorenfamilie zu blockieren, kann sich als nützlich erweisen.
In einigen Ausführungsformen wird ein Agens verabreicht, das die Expression von das Herz betreffendem CaN verringert. Solche Agenzien schließen ein, beschränken sich jedoch nicht auf, eine dominante negative CaN-Form (z.B. eine negativ-verkürzte Form des kodierenden Bereiches der alpha-Untereinheit von CaN); ein Antisense-Konstrukt, das auf ein CaN-Gen zielt; oder eine verkürzte, inaktive Form der beta-Untereinheit von CaN. Eine verkürzte, inaktive Form der β-Untereinheit von CaN kann die aktive alpha-Untereinheit von CaN absondern und diese zur Aktivierung unfähig machen. In anderen Ausführungsformen umfassen die Verfahren Verabreichen eines für CaN, oder der alpha- oder beta-Untereinheit davon, spezifischen Antikörpers. In einigen dieser Ausführungsformen ist der Antikörper ein einkettiger Antikörper. In anderen Ausführungsformen ist der Antikörper ein Antikörper, der CaN-Aktivität blockiert oder vorbeugt, dass NFAT-3 und/oder NFAT Familienmitglieder durch das Herz betreffendes CaN dephosphoryliert werden.
Die Toxizität und therapeutische Wirksamkeit von solchen Verbindungen kann durch pharmazeutische Standardverfahren in Zellkulturen oder in Tiermodellen bestimmt werden, z.B. zur Bestimmung des LD₅₀ (die für 50% der Population letale Dosis) und des ED₅₀ (die für 50% der Population therapeutisch wirksame Dosis). Das Dosierungsverhältnis zwischen toxischen und therapeutischen Wirkungen ist der therapeutische Index und kann als das Verhältnis LD₅₀/ED₅₀ ausgedrückt werden. Verbindungen, die große therapeutische Indices aufzeigen, werden bevorzugt. Während Verbindungen, die toxische Nebenwirkungen aufzeigen, verwendet werden können, kann ein Liefersystem entworfen werden, dass solche Verbindungen zum Ort des betroffenen Gewebes zielt, um eine potentielle Schädigung von nichtgezielten Zellen zu minimieren und somit Nebenwirkungen zu verringern.
Die aus diesen Zellkulturtests und Tierstudien erhaltenen Daten können zur Formulierung eines Dosierungsbereiches zur Verwendung bei Menschen verwendet werden. Die Dosierung von solchen Verbindungen liegt vorzugsweise innerhalb eines Kreislaufkonzentrationsbereiches, der den ED₅₀ mit geringer oder keiner Toxizität einschließt. Die Dosierung kann innerhalb dieses Bereiches in Abhängigkeit von der angewandten Dosierungsform und dem verwendeten Verabreichungsweg variieren. Für eine beliebige zu verwendende Verbindung kann die therapeutisch wirksame Dosis anfänglich aus Zellkulturtests geschätzt werden. Eine Dosis kann in Tiermodellen formuliert werden, um ein Kreislaufplasmakonzentrationsbereich zu erzielen, der den IC₅₀ (d.h. die Konzentration der Testverbindung, die eine halbmaximale Symptominhibierung erzielt) einschließt, der in Zellkultur und/oder im Ganztiermodell bestimmt wurde. Eine solche Information kann verwendet werden, um nützliche Dosen in Menschen genauer festzulegen.
Die therapeutische Wirksamkeit einer Substanz bei der Behandlung von Herzhypertrophie kann durch einen Fachmann unter Verwendung von bekannten Diagnose- und Behandlungsprinzipien erfolgen.
Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung, jedoch nicht zur Einschränkung der vorliegenden Erfindung bereitgestellt.
BEISPIEL I
Inhibierung der hypertrophen Wirkungen von AngII und PE durch CsA und FK506 in primären Cardiomyocyten
Experimentelles Protokoll
Um primäre Cardiomyocyten und ihre Sarkomerorganisation sichtbar zu machen, wurden anti-α-Aktinin monoklonale Antikörper der Maus verwendet (Sigma). Dieser Antikörper ist für α-Aktin Proteine des Herzens und Skeletts spezifisch. Die Zellen wurden in 1 × phosphatgepufferter Saline (PBS) gewaschen, in 3,7% Paraformaldehyd 5 Minuten fixiert, dreimal mit 1 × PBS gewaschen und dann in 1 × PBS; das 2% Pferdeserum, 2% BSA und 0,1% nichtionisches Detergenz NP40 enthielt, 30 Minuten präblockiert. Anti-α-Aktinin Antikörper wurde mit einer Verdünnung von 1:800 in die frische Präblockierungslösung gegeben und weitere 30 Minuten inkubiert. Anschließend wurden die Zellen dreimal mit 1 × PBS mit 0,1% NP40 gewaschen. Anti-Maus TRITC-konjugierte Sekundärantikörper wurden dann mit einer Verdünnung von 1:400 in Präblockierungslösung 30 Minuten zugegeben, und die Zellen wurden wieder dreimal in 0,1% NP40 enthaltendes 1 × PBS gewaschen. Die Kernfärbung hinsichtlich DNA wurde 15 Minuten mit 0,5 μg/ml Bisbenzimid in PBS durchgeführt, gefolgt von dreimaligem Waschen mit PBS.
Ergebnisse
Werden primäre Cardiomyocyten AngII und PE ausgesetzt, erfolgt eine ausgesprochene hypertrophe Reaktion, die durch eine Zunahme der Zellgröße und Sarkomeranordnung, durch Hochregulierung mehrerer fötalen Genen für kontraktiles Protein und verstärkter Kontraktilität gekennzeichnet ist. Diesen Ereignissen geht ein intrazellulärer Calciumanstieg voraus. Zur Bestimmung, ob die hypertrophe Reaktion von Cardiomyocyten auf diese Agonisten durch Calcineurin vermittelt wurde, wurden neonatale Cardiomyocyten der Ratte AngII (10 nM) oder PE (10 μM) bei Vorhandensein oder Nichtvorhandensein von CsA oder FK506 ausgesetzt. Die Cardiomyocyten zeigten eine drastische Zunahme der Größe und Sarkomeranordnung, nachdem sie 72 h AngII oder PE ausgesetzt waren (2B und 2E). Bei Vorhandensein von CsA (2C und 2F) oder FK506 wurde die Reaktion auf AngII vollständig aufgehoben und die Reaktion auf PE wurde drastisch verringert.
Zur Bestimmung, ob die Veränderungen der Genexpression in Cardiomyocyten als Reaktion auf AngII ebenfalls durch einen Calcineurin-abhängigen Signalweg kontrolliert wurden, wurde die Expression von AFN mRNA in mit AngII behandelten Cardiomyocyten bei Vorhandensein und Nichtvorhandensein von CsA durch einen Dot-Blot-Test untersucht. Wurden die Cardiomyocyten AngII ausgesetzt, folgte ein 15-facher Anstieg der mRNA des atrialen natriuretischen Faktors (AFN), der durch CsA vollständig blockiert wurde (23G). GAPDH mRNA wurde als Kontrolle gemessen. Zusammen demonstrieren diese morphologischen und molekularen Daten, dass die AngII und PE Signalwege CsA-/FK506-sensitiv sind. Da Calcineurin das einzig bekannte Ziel zur Inhibierung von sowohl CsA als auch FK506 ist, lassen diese Ergebnisse vermuten, dass die Calcineurin-Aktivierung ein notwendiger Schritt im Signalweg für AngII- und PE-abhängige Induktion von Herzhypertrophie ist.
BEISPIEL 2
Induktion von Herzhypertophie in vivo Experimentelle Protokolle
Transgene Mäuse. Transgene Mäuse, die Calcineurin im Herzen exprimieren, wurde wie folgt geschaffen. Eine cDNA, die eine konstitutiv aktive Form der katalytischen Untereinheit von Calcineurin A (O'Keefe et al. (1992) Nature 357: 692–694) kodiert, wurde durch PCR mit einem '5-SalI-Linker und 3'-Hind-Linker in einen Expressionsvektor kloniert, der den α-MHC Promotor enthält. Die Expressionsmuster und Kennzeichen dieses Expressionsvektors sind kürzlich beschrieben worden (Jones et al. (1994) Dev. Dyn. 22: 117–128). Der Calcineurin-α-MHC Vektor wurde mit NotI verdaut, um das pBluescript Grundgerüst zu befreien, und um die Reinigung des α-MHC-Fusion cDNA Fragmentes zu erlauben. Dieses Fragment wurde auf einem Agarosegel unter Verwendung des Qiaex II Gelextraktionskits (Qiagen) gereinigt und in Oocyteninjektionspuffer (5 mM Tris – HCl pH 7,4 und 0,2 mM EDTA) eluiert. Das gereinigte Fragment wurde in kürzlich befruchtete Oozyten, die aus FVB Mäusen stammten, injiziert, und in die Ovidukte scheinträchtiger ICR Mäuse überführt.
RNA Analyse. Gesamt-RNA wurde gesammelt und mit Triazol-Reagenz (Gibco BRL), wie empfohlen gereinigt. RNA sowohl aus Wildtyp- und transgenen Herzen, als auch aus kultivierten Cardiomyocyten wurde einer Dot-Blot-Hybridisierung gegen eine Reihe von Oligonucleotidsonden unterzogen, wie kürzlich beschrieben (Jones et al. (1996) J. Clin. Invest. 98, 1906–1917).
Histologie. Herzen aus Wildtyp und transgenen Mäusen wurden einer histologischen Analyse unterzogen. Kurz zusammengefasst, wurden die Herzen entnommen, über Nacht in mit PBS gepufferten 10% Formalin fixiert, in Ethanol dehydriert, in Xylen und dann in Paraffin überführt. In Paraffin eingebettete Herzen wurden in 4 um sektioniert und nachfolgend mit Hämatoxylin und Eosin für die routinemäßigen histologischen Untersuchungen oder mit Masson-Trichrom für Kollagen gefärbt (Woods und Ellis In, Laboratory Histopathology: A Complete Reference (1994) Churchill Livingstone Publischers pp. 7. 1–13).
Ergebnisse
Induktion von Herhypertrophie in vivo durch aktiviertes Calcineurin. Die obigen Ergebnisse sind ein Hinweis, dass Calcineurin ein potenter Regulator von Herzhypertrophie in kultivierten primären Cardiomyocyten war. Zur Bestimmung, ob dieser Signaltransduktionsweg ebenfalls im Myocardium in vivo wirksam sein könnte, wurden transgene Mäuse erzeugt, die die konstitutiv aktive Form der katalytischen Untereinheit von Calcineurin im Herzen unter Verwendung des α-MHC Promotors zum Antrieb der Expression exprimierten. Aktuelle Studien haben gezeigt, dass dieser Herz-spezifische Promotor in den Ventrikelkammern hauptsächlich nach der Geburt aktiv ist (Jones et al. (1994) Dev. Dyn. 22: 117–128). Eine Gesamtzahl von 10 unabhängigen transgenen Foundermäusen wurde erzeugt, die zwischen 2 und 68 Kopien des α-MHC-Calcineurin Transgens enthielten (Tabelle 1).
Tabelle 1: Zusammenfassung von α-MHC Calcineurin-transgenen Linien
Herz:Körper Gewichtsverhältnisse (Herz:Körper wt) wurde durch Wiegen der Herzen und Körper von nicht-transgenen und transgenen Wurfgeschwistern berechnet. Die Werte sind als das relative Gewicht des transgenen Herzens verglichen mit nicht-transgenen Wurfgeschwistern ausgedrückt. Das Alter der Mäuse, die am 18. Februar 1998 noch am Leben waren, ist in Klammern dargestellt. 37 und 39 waren transgene Foundermäuse, und die mit 37- und 39- bezeichneten Mäuse waren ihre Nachkommenschaft. Der Ausdruck "N.D." weist darauf hin, dass dieser Wert nicht bestimmt wurde.
Jede untersuchte Calcineurin-transgene Maus wies eine drastische Zunahme der Herzgröße verglichen mit nicht-transgenen Wurfgeschwistern auf. Das Herz-Körper Gewichtsverhältnis war in den Calcineurin-transgenen Tieren im Vergleich mit den Kontrollwurfgeschwistern sogar bereits 18 Tage postnatal durchschnittlich 2 bis 3 fach erhöht (3; Tabelle 1). Es konnte kein Unterschied des Herzphänotyps in männlichen und weiblichen Tieren beobachtet werden. Die histologische Analyse zeigte eine konzentrische Hypertrophie, worin die Querschnittsbereiche der Ventrikelwände und Ventrikelseptum drastisch vergrößert waren (3C). Der linke Ventrikel war am stärksten betroffen, aber der rechte Ventrikel und die Vorhofkammern waren ebenfalls vergrößert. Im Gegensatz zu der gutorganisierten, gestreiften Muskulatur der normalen Ventrikelwand waren die Cardiomyocyten aus den Herzen von Calcineurin-transgenen Tieren desorganisiert und offensichtlich hypertroph (3D und 3E). Die hypertrophen Cardiomyocyten hatten oftmals drastische Karyomegalie. Die Messungen von Querschnittsbereichen von Myocyten innerhalb der linken Ventrikelwand zeigten eine mehr als 2-fache Zunahme bei Calcineurin-trangenen Tieren verglichen mit den Kontrollen.
Bei Menschen schreitet Herzhypertrophie häufig zu ventrikulärer Dilatation, Herzinsuffizienz und plötzlichen Tod fort. Auf ähnliche Weise wurde in Calcineurintransgenen Mäusen mit zunehmendem Alter Dilatation der Ventrikelkammern beobachtet (3F und 3G). Calcineurin-transgene Mäuse waren ebenfalls stark anfällig für plötzlichen Tod. Dieser geschah sowohl spontan als auch während der Handhabung oder Anästhesie. Die Mäuse, die durch plötzlichen Tod starben wiesen Dilatation des rechten und linken Ventrikels auf, welches ein Hinweis auf Herzinsuffizienz ist. Die Histologie der Lungen zeigte ebenfalls ein ausgiebiges perivaskuläres Ödem und intraalveoläre Makrophagen, die rote Blutzellen enthielten„ welches mit Befunden bei Herzinsuffizienz übereinstimmt. Eines der Merkmale von Herzinsuffizienz ist Ventrikelwandfibrose. Die Herzen von Calcineurin-transgenen Tieren enthielt ausgiebige, meist interstitielle Kollagenablagerungen, die durch Trichromfärbung offengelegt wurden (3H). Bei deutlicher Fibrose war Myofaserabbau ersichtlich.
Aktivierung der molekularen Reaktion auf Hypertrophie durch Calcineurin in vivo. Zur Bestimmung, ob aktiviertes Calcineurin Veränderungen der Kennzeichen der das Herz betreffenden Genexpression von Hypertrophie und Herzinsuffizienz induziert, wurde ein quantitativer Dot-Blot-Test verwendet, um RNA aus Herzen von Calcineurin-transgenen und nicht-transgenen Wurfgeschwistern zu untersuchen. In Übereinstimmung mit der Reaktivierung des fötalen Genexpressionsprogrammes wurden MHC, Skelett-α-Aktin und BNP-Transkripte in transgenen Herzen drastisch hochreguliert, während α-MHC herunterreguliert wurde. Kürzlich wurde gezeigt, dass die Transkripte für Ca⁺⁺-ATPase des sarkoplasmatisches Retikulum (SERCA) und Phospholamban (PLB) während Herzinsuffizienz herunterreguliert werden, da das nachlassende Myocardium eine unzulängliche Umgehensweise mit Ca⁺⁺ aufzeigt (Mercadier et al. (1995) J. Clin. Invest. 85: 305–309; Schwinger et al. (1995) Circulation 92: 3220–3228); waren beide Transkripte in Calcineurin-transgenen Tieren verringert. Es gab eine signifikante Veränderung der Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) Expression.
Prävention von Herzhypertrophie mit CsA. Zur Bestimmung, ob Calcineurin-Aktivität in vivo ein wirksames Mittel sein könnte, Herzhypertrophie vorzubeugen, untersuchten wir, ob eine subkutane Injektion von CsA Herzfunktionsstörungen in Calcineurin-transgenen Mäusen vorbeugen könnte. Für diese Experimente wurden 8 transgene Wurfgeschwister aus einem Wurf der transgenen Maus #37 verwendet (Tabelle 1).
Vier Transgen-positive Nachkommen wurde zweimal täglich 25 mg/ml CsA und vier wurde Vehikel alleine injiziert. Vier transgene Wurfgeschwister wurden ebenfalls mit CsA behandelt, um potentielle toxische Wirkungen oder beliebige Herzabnormalitäten zu kontrollieren, die durch CsA induziert werden. Die CsA-Behandlung wurde im Alter von 9 Tagen begonnen und die Tiere wurden 16 Tage später getötet. Wie in 4C dargestellt, waren die Herzen der Vehikelbehandelten Tiere am Tag 25 stark hypertroph und dilatiert, während die der CsA-behandelten Wurfgeschwister sich nicht in der Größe von den nicht-transgenen Kontrollen unterschieden. Die mittleren Herz:Körper Gewichtsverhältnisse von Calcineurin-transgenen Tieren war annährend 3-fach höher als die von CsA-behandelten transgenen und nicht-transgenen Tieren, wie in 4B dargestellt. Eine CsA-Behandlung beugte ebenfalls eine Fibrose des Herzens von Calcineurintransgenen Tieren vor.
Auf der zellulären Ebene wurde die hypertrophe Reaktion von Cardiomyocyten in den Calcineurin-transgenen Tieren durch CsA größtenteils inhibiert, obwohl es isolierte Bereiche mit Myofaserveränderungen und verstreuten Zellen mit auffallend hyperchromatischen Kernen gab. Eine CsA-Behandlung beugte insgesamt Herzhypertrohie und die assoziierte Pathologie als Reaktion auf aktiviertes Calcineurin in vivo vor.
BEISPIEL 3
Charakterisierung der Wirkungen von CαMKII und CaN auf die Expression von Hypertrophie-sensitiven Genen in einem Cardiomyocyten-Zellkultulmodell
Protokolle
Primäre myocardiale Zellkulturen. Primäre Kulturen neonataler Cardiomyocyten der Ratte wurden unter Verwendung von 1–4 Tage alten Spraque- Dawley Ratten präpariert. Rattenjunge (durchschnittlich 15 Junge pro Präparation) wurden geköpft, und die Herzen wurden aus der Brusthöhle steril entfernt und zum Entfernen von Restblut mit Medium 199 (Life Technologies, Gaithersburg) gewaschen. Die Vorhöfe wurden entfernt und die Ventrikel wurden feingehackt und drei aufeinanderfolgenden Viokase (A. H. Robbins, Company, Richmond, VA) Verdauungsreaktionen von jeweils 18 Minuten unterzogen. Lipase, Protease und Amylase als auch andere Pankreaseenzyme enthaltende Viokase wurde mit 1 mg/ml in PBS-Puffer hergestellt und mit einer Rate von 120 ml pro 15 Herzen verwendet. Die vereinten Überstände aus diesen drei Verdauungsreaktionen wurden zum Löschen der Verdauungsreaktion in ein Eisbad placiert. Die Überstände wurden dann bei 2000 rpm 8 min bei Raumtemperatur in einem Beckman TJ-6 Rotor zentrifugiert. Die Zellpellets wurden in Medium 199, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum und 50 μg/ml Gentamicin resuspendiert. Die Zellen werden dann in 100-mm Gewebekulturschalen ausplattiert und in einem Zellkulturinkubator bei 37°C inkubiert. Dieser Vorgang, der "Präausplattierung" genannt wird, entfernt selektiv schnellhaftende Nicht-Cardiomyocyten, wie beispielsweise Fibroblasten, aus der Zellpopulation, wodurch die Zellpopulation hinsichtlich Cardiomyocyten angereichert wird. Fünfundvierzig bis fünfzig Minuten später wurden die nichthaftenden Zellen in frische 60-mm Schalen mit einer Dichte von etwa 150 Zellen/mm² zur Initiierung der Langzeitkultur überführt. Nach 20–24 Stunden werden die myocardialen Zellkulturen gewaschen und in frischem Medium, ergänzt mit 10% fötalen Rinderserum, wie oben bei den 60-mm Schalen beschrieben, kultiviert. Die Cardiomyocytenkulturen konnten bis zu 7 Tage kultiviert werden.
Transiente Transfektion. Es war notwendig, die isolierten Cardiomyocyten in Serum-freien Medium zu kultivieren, um die durch Serum-Response-Elemente vermittelten Wirkungen auf die Genexpression zu eliminieren. Primäre myocardiale Kulturen wurden zunächst mit Serum-freiem Wachstumsmedium gewaschen und dann in Serum-freiem Medium 199, ergänzt mit Nutridoma HU (Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis, IN), das humanes Serumalbumin, Rinderinsulin und humanes Transferrin enthielt, gehalten. Die Transfektion wurde unter Verwendung eines auf Liposomen-basierenden Transfektionsmittels Lipofectamin (Life Technologies, Grand Island, NI) durchgeführt. Die zur transienten Transfektion verwendeten Verfahrensweisen erfolgten gemäß den Anleitungen der Hersteller. Die optimalen Werte einschließlich DNA-Konzentration, Lipofectamin-Konzentration und Transfektionszeitdauer wurden vor Durchführung der Experimente dieser Studie bestimmt. Kurz zusammengefasst wurden für jede Transfektion 2 μg DNA und 20 μg Lipofectamin in getrennte Reaktionsgefäße verdünnt, die 300 μl Serum-freies Medium mit Nutridoma ergänzt, enthielten. Die zwei Lösungen wurden dann vereint und 15–45 Minuten bei Raumtempertur inkubiert, um die Bildung von DNA-Liposam Komplexen zu erlauben. Für jede Transfektion wurde 2,4 ml Serum-freies Medium mit Nutridoma ergänzt, zum Röhrchen zugegeben, das die DNA-Liposom-Komplexe enthielt, und die verdünnte Mischung wurde dann auf die adhärenten Cardiomyocyten, die einmal mit 2 ml Serum-freien Medium in einer 60-mm Gewebekulturschale gespült wurden, geschichtet. Die Zellkulturen wurden bei 37°C in einem CO₂-Inkubator, der 5% CO₂ enthielt, 24 Stunden inkubiert, und nun wurden verschiedene Testverbindungen zugegeben. Die Promotoraktivitäten aus Zellextrakten wurden innerhalb 48 Stunden nach Transfektionsbeginn untersucht.
Zur α₁-adrenergen Stimulation wurde 100 μM PE (Sigma, St. Louis, MO) zu den Zellen zugegeben. DOB (Gensia Laboratories, Ltd., Irving, CA), ein selektiver β₁-adrenerger Agonist, wurde mit einer Konzentration von 10 μM zugegeben. Um Variationen der Transfektionswirksamkeiten zu korrigieren, wurde eine pβGal-Kontrolle als eine interne Kontrolle verwendet. Die chemilumineszente β-Galaktosidase-Aktivität wurde unter Verwendung eines Aliquots der gleichen Zelllysate untersucht, die für den Luciferasetest gesammelt wurden, und in dem gleichen Luminometer, wie unten beschrieben, gemessen.
Firefly-Luciferasetest. Der Firefly-Luciferasetest basiert auf einem kommerziellen Biolumineszenztest (Promega, Madison, WI), der durch langanhaltendes "Glühen" gekennzeichnet ist. Kurz zusammengefasst, hat eine Aktivierung von Lucerferin die Bildung eines Enzym-gebundenen Luciferyl-Adenylats (Luciferyl-AMP) zur Folge. Das Enzynzwischenprodukt, Luciferyl-AMP wird bei Vorhandensein von Coenzym A (CoA) oxidiert und führt zur Bildung eines Enzym-gebundenen angeregten Produktes, das nachfolgend zerfällt, um Licht und ein engenzymgebundenes Produkt zu emittieren. Bei Vorhandensein von CoA findet die Oxidation stattdessen mit Luciferyl-CoA mit einer vorteilhafteren Gesamtkinetik statt. Die hinsichtlich Luciferaseaktivität zu untersuchenden Zellen wurden zweimal mit PBS-Puffer gespült und in Reporter Lysis IX Puffer (Promega) lysiert und dann durch Abschaben geerntet. Große Zellbruchstücke wurden durch kurze Zentrifugation pelletiert, und der Überstand wurde in frische Röhrchen überführt. Für den Luciferasetest wurden 20 μl Zellextrakt mit 100 μl Luciferasetest-Reagenz (Promega) vermischt, das 20 mM Tricin, 1,07 mM (MgCO₃)₄Mg(OH)₂5H₂O, 2,67 mM MgSO₄, 0,1 mM EDTA, 33,3 mM DTT, 270 μM Coenzym A, 470 μM Luciferin und 530 μM ATP enthielt. Die integrierte Lichtemission wurde zwischen 10 Sekunden und 5 Minuten in einem Turner Designs Luminometer Model 20 (Promega) bestimmt. Alle Tests wurden bei Raumtemperatur innerhalb einer Stunde hinsichtlich Zelllyse durchgeführt.
Northern Analyse. Für die ANF-message-Analyse wurde Gesamt-RNA aus 1 bis 3 Tage alten neonatalen Cardiomyocytenkulturen der Ratte gemäß dem Verfahren nach Chomczynski und Sacchi unter Verwendung des kommerziell erhältlichen TRIzol Reagenz (Life Technologies, Grant Island, NY) extrahiert. Primäre Zellkulturen der Ratte wurden in TRIzol homogenisiert, und die RNA wurde durch die Zugabe von Chloroform extrahiert und bei Vorhandensein von Isopropanol präzipitiert. Die isolierte Gesamt-RNA wurde auf einem 1% Agarose/Formaldehyd Gel fraktioniert und auf eine Nylonmembran durch Kapillarblotting übertragen. Die Blots wurden in einer 50% Formamid-Lösung (Life Technologies, Grand Island, Nn 3–4 Stunden bei 42°C prähybridisiert und dann über Nacht mit einer Randomprimer, Biotin-markierten ANF-cDNA Sonde hybridisiert. Nach Waschen mit hoher Stringenz (0,1 × SSPE, 0,1% SDS, 65°C) wurde hybridisierte, biotinylierte cDNA unter Verwendung eines Chemiluminescenz-Detektion-Systems (TROPIX, Inc., Bedford, MA) nachgewiesen und dann einem Röntgenfilm ausgesetzt. Die ANF-Banden wurden mit einem Howteck-Gel-Scanner (PDI, Huntingtion Station, NY) quantifiziert und bezüglich des Signals der 28 5 rRNA genormt, um Lade- und/oder Übertragungseffizienz zu korrigieren.
Bestimmung der autonomen CaM Kinase II Aktivität. Die autonome Aktivität der CaM Kinase II wurde in Herzgewebe-Homogenaten der Ratte unter Verwendung des synthetischen Peptidsubstrates, Autocamtid-2 (KKALRRQETVDAL) (Mar et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10: 4271–4283; und Farrance et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 17234–17240) als exogenes Substrat bestimmt. Dieses Peptid wurde der Autophosphorylierungskernsequenz der Hirn α-CaM Kinase II der Ratte nachgebildet und ist hinsichtlich CaM Kinase II hochselektiv. Die autonome CaM Kinase II Aktivität wurde durch die Phosphorylierung von Autocamtid-2 bei Nichtvorhandensein von Ca²⁺/Calmodulin untersucht und als ein Anteil der bei Vorhandensein dieser Cofaktoren erhaltenen Aktivität ausgedrückt. Gewebestreifen wurden bei Vorhandensein oder Nichtvorhandensein verschiedener Stoffverbindungen eine erforderliche Zeitdauer inkubiert. Am Ende der Inkubation wurden die Gewebestreifen in eiskaltem Puffer (20 mM Tris-HCl, PH 7,5, 0,5 mM EGTA, 1,0 mM EDTA 2,0 mM Dithiothreitol, 10 mM Natriumpyrophosphat, 0,4 mM Amoniummolybdat, 100 mg/ml Leupeptin) durch Beschallung homogenisiert. Der Überstand wurde durch Zentrifugation (12.000 × g, 2 Minuten) geklärt und dann in einer Reaktionsmischung, die 50 mM PIPES (pH 7,0), 10 mM MgCl₂ 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin, 10 mM Autocamtid-2, 20 mM [γ-³²P] ATP und entweder 0,5 mM CaCl₂, 5 mg/ml Calmodulin für Ca²⁺-stimulierte Aktivität oder 1 mM EGTA für autonome Aktivität, enthielt, untersucht. Der Test wurde bei 30°C 30 Sekunden durchgeführt und durch die Zugabe von Trichloressigsäure in einer Endkonzentration von 5% beendet. Endogenes Protein wurde durch Zentrifugation sedimentiert und die Autocamtid-2 enthaltenden Überstände wurden auf p81 Phosphocellulosestreifen aufgetragen, 5-mal gewaschen, getrocknet, und der ³²P-PO₄ Gehalt wurde mittels Cerenkov-Strahlung quantifiziert.
Plasmid-Konstrukte. Eine Reihe von nested-Deletion-Mutanten, die verschiedene das Herz betreffende ANF Promotorfragmente der Ratte und ANF cDNA der Ratte enthielten, wurde verwendet. Diese Reihe von Promotor-Reporter-Konstrukten wurde in auf Luciferase-basierenden pxp2 Vektoren subkloniert. Die 5'-Deletionen wurden unter Verwendung von passenden Restriktionsenzymschnittstellen oder durch PCR-Amplifikation erzeugt. Ein Diagramm der Schlüsselenhancerelemente, von denen angenommen wird, dass sie ANF-Transkription regulieren, ist in 8A dargestellt. Der Skelett-α-Aktin Reporter, der etwa 400 bp der proximal stromaufwärtsgelegenen Promotordomäne (-394 bp bis 24 bp im Verhältnis zur Transkriptionsstartstelle) des aviären das Herz betreffenden Skelett-α-Aktin Gens enthält, (das die Mehrzahl der Enhancerdomänen erhält, die auf Wachstumssignale reagieren, die mit dem Strukturteil des Firefly-Luciferase-Gens verbunden sind), wurde verwendet. Ein anderes auf Luciferasebasierendes Promotor-Reporter-Konstrukt, das 400 bp der proximal stromaufwärtsgelegenen Promotordomäne des aviären das Herz betreffenden Skelett-α-Aktin Gens enthält, wurde ebenfalls verwendet. Zwei Isoformen der δ-CaM Kinase (δ_A & δ_B), die im pSRα Expressionvektor enthalten sind, wurden verwendet.
Expressionsplasmide für CaM Kinase IV, die sowohl eine Form vollständiger Länge (CaMKIVwt) und eine mutierte Form (CaMKIV313) enthielten, wurden verwendet. Die konstitutiv-aktive Calcineurinform, neuralen Ursprungs, wurde durch Polymerasekettenreaktion-Mutageneseverfahren erzeugt, welches die Deletion der autoinhibitorischen Domäne von Calcineurin zur Folge hatte. Das mutierte Fragment wurde dann in pSRα Expressionsvektor subkloniert. Das Expressionsplasmid für mutierte Hirn α-CaM Kinase II wurde durch Subklonieren einer cDNA konstruiert, die eine verkürzte Version (Aminosäuren 1–290) des Wildtyp CaM Kinase II Enzyms kodiert, das in der EcoR1 Schnittstelle von pCMV5, ein Expressionsplasmid von Säugern, das eine multiple Klonierungssequenz unmittelbar stromabwärts von dem starken viralen Promotor des Cytomegalovirus enthält, konstitutiv aktiv ist. Dieses Konstrukt stellt, wenn es in Cardiomyocytenkulturen transfiziert wird, konstitutiv CaM Kinase II Enzym her, das Ca²⁺ oder Calmodulin nicht bindet.
Ergebnisse
Wirkungen von exogener CaM Kinase II und Calcineurin auf Promotor-Reporter Aktivitäten für ANF Skelett-α-Aktiv und das Herz betreffende α-Aktin Gene
In dieser Studie untersuchten wir die potentiell funktionale Rolle einer Calcium-abhängigen Proteinkinase, CaM Kinase Π (CaMKII) und einer Calcium-sensitiven Phosphatase, Calcineurin (CaN), ANF, Skelett α-Aktin und das Herz betreffende α-Aktin Genexpression zu regulieren. Drei auf Luciferase basierende Promotor-Reporter-Konstrukte, die ANF, Skelett-α-Aktin oder das Herz betreffende α-Aktin Promotorbereiche in annähernd vollständiger Länge, wie oben beschrieben, enthielten, wurden in dieser Studie verwendet. Ein Cotransfektionsprotokoll unter Verwendung von Konstrukten, die eine mutierte, konstitutiv-aktive CaMKII α-Isoform oder eine konstitutiv-aktive mutierte Form von CaN mit der ANF/Luciferase, Skelett-α-Aktin/Luciferase oder das Herz betreffende α-Aktin/Luciferase Fusiongene enthalten, wurde mit neonatalen Cardiomyocytenkulturen, die aus 1–4 Tage alten Rattenjungen präpariert wurden, durchgeführt. Luciferase-Reporter-Aktivitäten wurden bewertet. Wie in 6 gezeigt, dämpfte eine Überexpression der exogenen CaMKII α-Isoform die Promotor-Reporter-Aktivitäten für ANF, Skelett-α-Aktin und das Herz betreffendes α-Aktin im Vergleich zu Kontrollkulturen (mit leerem Vektor cotransfiziert) um 50%. Im Gegensatz dazu steigerte eine Überexpression des exogenen konstitutiv aktiven CaN die Promotoraktivitäten von ANF, Skelett-α-Aktin und das Herz betreffendem α-Aktin zu 300%–600% gegenüber Kontrollzellen. Die Ergebnisse in diesem Experiment ließen vermuten, dass eine Überexpression einer heterologen CaMKII α-Isoform zur Dämpfung von Promotoraktivitäten von sowohl das Herz betreffenden embryonalen Genen, ANF & Skelett-α-Aktin als auch des konstitutiven Gens des kontraktilen Proteins, das Herz betreffendes α-Aktin führt. Im Gegensatz dazu hat eine Aktivierung eines exogenen CaN eine Superinduktion der Promotoraktivitäten dieser drei Gene zur Folge.
Wirkungen von CaM Kinase-Isoenzymen auf ANF-Promotor-Reporter Aktivität
Die CaM Kinasefamilie hat wenigsten zehn Mitglieder, die sich in Struktur, Verteilung, Regulierung und enzymatischer Aktivität unterscheiden. Die Ergebnisse, die in 6 dargestellt sind, lassen vermuten, dass mutiertes α-CaMKII eine Herunterregulierung von Hypertrophie-sensitiven Genen induzierte. Es war von Interesse zu bestimmen, welche Wirkungen von anderen CaM Kinase-Familienmitgliedern auf das prototypische Hypertrophie-sensitive Gen ANF wirken. Ausgewählte Mitglieder der CaM Kinasefamilie, einschließlich Wildtyp CaMKII (CaMKII_wt), δ-CaMKII (δ_A & δ_B) und CaMKIV (Wildtyp und mutierte Form) wurden zur Cotransfektion mit dem ANF Promotor-Reporter-Konstrukt, wie oben beschrieben, verwendet. Die PE-Induktion von ANF wurden ebenfalls bei Vorhandensein der einzelnen exogenen CaM Kinase-Mitglieder bewertet. Wie in 7 gezeigt, verringerte CaMKII_wt ANF Promotoraktivität um ~400%. Im Gegensatz dazu steigerte CaMKIV_wtAFN Promotoraktivität um 270%, während CaMKIV_mut ANF Promotoraktivität um ~400% steigerte. Die CaMKII δ Isoformen, einschließlich sowohl δ_A als auch δ_B, veränderten die Promotoraktivitäten von ANF praktisch nicht. Ähnliche Ergebnisse wurden bei Vorhandensein von PE-Stimulierung in transfizierten Cardiomyocyten erzielt, wie in 7B dargestellt. Zusammengefasst sind diese Daten ein Hinweis, dass unterschiedliche CaM Kinase-Familienmitglieder unterschiedliche Wirkungen auf die Expression von ANF zeigen.
Wirkung von exogenem CaMKII oder CaN auf ANF Promotor-Reporternested-Deletion-Konstrukte
In diesen Studien wurde eine Reihe von nested-Deletion-Konstrukten, die aus der 5'-Promotor/Enhancer Domäne des das Herz betreffenden ANF Gens der Ratte erzeugt wurden, verwendet. Drei verschiedene Längen der nativen ANF- Promotorfragmente wurden in den strukturellen Teil des Firefly-Luciferase-Gens, wie oben beschrieben, ligiert. Ein Diagramm aller identifizierter funktionaler Enhancerelemente für das ANF-Gen ist in 8A gezeigt. Die Reporteraktivität für jedes der nested-Deletion-Konstrukte in Cardiomyocytenkulturen, die PE ausgesetzt waren, ist in 8B gezeigt. Promotor-Reporter-Konstrukte, die ausreichend stromaufwärtsgelegene Sequenzen enthalten, um das PERE (PE Response-Element) Motiv einzuschließen, ANF700 (NP337) und ANF135 (NP325), aber keine Promotorsequenzen, die dieses Motiv verloren haben, ANF50 (NP338), enthalten, wurden, wenn sie PE ausgesetzt waren, aktiviert. Es wurde bewertet, ob Dämpfung/Induktion der ANF Promotor-Reporter-Aktivität durch Expression des exogenen CaMKII/CaN auf einem Bereich der ANF Promotordomäne lokalisiert werden konnte. Die oben beschriebenen ANF Promotor-Reporter nested-Deletion-Konstrukte wurden mit konstitutiv aktivem CaMKII oder beziehungsweise CaN transfiziert. Wie in 8C gezeigt, hatte eine Überexpression des exogenen CaMKII eine Dämpfung von 50% aller drei ANF 5'-Deletionspromotor-Konstrukte verglichen mit Kontrollkulturen zur Folge, während eine Überexpression des exogenen CaN jede der drei ANF Promotorkonstrukte in einem Bereich von 200–600% gegenüber Kontrollkulturen steigerte. Diese Daten sind ein Hinweis, dass Inhibierung/Induktion der ANF Promotor-Reporter-Aktivität durch CaMKII/CaN nicht auf einen definierten Bereich oder Domäne für den ANF-Promotor beschränkt werden konnte.
Beta-adrenerge Rezeptorsignale und das Herz betreffende CaN Kinase II Aktivierung
Diese Experimente bestimmten, ob ein Signal durch den β₁-adrenergen Rezeptor-Subtyp das Herz betreffendes CaMKII aktivieren konnte. Herzgewebestreifen aus 1–4 Tage alten neonatalen Ratten wurden frisch isoliert und mit entweder dem β1-selektiven Agonisten, Dolbutamin (DOB) oder gemischten β1 (β1 & β2) Agonisten, Isoproterentol (ISO) behandelt. In parallelen Studien wurde β1 Antagonist, Propanol (PROP) 15 sec vor Zugabe der Agonisten zugegeben. Später wurde die autonome Aktivität (% der Calcium-abhängigen Aktivität) von CaMKII untersucht. Die Ergebnisse eines solchen Experimentes sind in 9 dargestellt. CaMKII autonome Aktivierung wurde 30 Sekunden im Anschluss an eine Behandlung mit DOB oder ISO ~170% gegenüber der in nichtstimulierten Herzgeweben beobachteten Aktivität gesteigert. Zusätzlich blockierte der β1- Antagonist, PROP, wenn dieser vor der DOB- oder ISO Zugabe zugegeben wurde, eine Aktivierung der autonomen Aktivität von CaMKII. Diese Ergebnisse zeigen, dass, waren die Gewebestreifen einem β1-adrenergen Agonisten ausgesetzt, führte dies zu das Herz betreffender endogener CaMKII Aktivierung. Diese Aktivierung von CaMKII Aktivität ist eine β₁-Rezeptor vermittelte Reaktion.
Wirkung von Adrenoceptor-Agonisten auf Promotor-Reporter Aktivitäten für die Gene von ANF, Skelett-α-Aktiv und das Herz betreffendes α-Aktin
Die Ergebnisse der oben gezeigten Experimente ließen vermuten, dass CaN zur Induktion dieser drei Gene in neonatalen Cardiomyocyten der Ratte führt. Es war von Interesse die Wirkung von α- und β-adrenergen Stimuli auf die Expression von ANF, Skelett-α-Aktin und das Herz betreffendem α-Aktin zu bestimmen. Auf Luciferase-basierende Promotor-Reporter-Konstrukte, die ANF, Skelett-α-Aktin und das Herz betreffende α-Aktin Promotordomänen, wie oben beschrieben, enthalten, wurden in primäre neonatale Cardiomyocytenkulten der Ratte transfiziert. Die transfizierten Cardiomyocyten wurden dann dem α₁-adrenergen Agonisten, Phenylephrin (PE), β₁-adrenergen Agonisten, DOB oder Typ β-transformierenden Wachstumsfaktor (TGF-β1) ausgesetzt. Wie in 10 Tafel A, B und C gezeigt, waren diese Promotor-Reporter-Aktivitäten durch Behandlung mit DOB jeweils um etwa 50% verringert. Die Reporter-Aktivitäten für ANF und Skelett-α-Aktin wurden um 200% gegenüber Kontrollzellen transaktiviert, wenn die Cardiomyocyten PE ausgesetzt waren, wie in 10, Tafel A und B gezeigt. Die Promotor-Aktivität des das Herz betreffenden α-Aktins wurde in PE-behandelten Cardiomyocyten nicht signifikant stimuliert, während eine Behandlung mit TGF-β1 in Übereinstimmung mit früheren Studien das Herz betreffende α-Aktin Promotor-Reporter-Aktivität um 700% gegenüber Kontrollzellen induzierte. Diese Daten zeigen, dass sowohl α-adrenerge und β-adrenerge Stimulierung die Expression von Herzhypertrophie-sensitiven Genen, wie beispielsweise von ANF, Skelett-α-Aktin und das Herz betreffendes α-Aktin moduliert. Eine β₁-adrenerge Stimulierung ist fähig, die Promotor-Aktivitäten von beiden embryonalen Genen, wie ANF, Skelett-α-Aktin und das Gen konstitutiv kontraktiler Proteine, wie das Herz betreffendes α-Aktin zu inhibieren. Deshalb war es von Interesse, zu bewerten, ob die in den obigen Experimenten beobachteten Veränderungen der ANF-Reporter-Aktivität eine Reaktion auf die Veränderungen von ANF-message Pools war.
Primärkulturen neonataler Cardiocyten wurden in Serum-freiem Medium kultiviert und β1 Agonist, DOB, wurde an verschiedenen Zeitpunkten auf die Zellen angewandt. ANF-message-RNA wurde zum Schluß durch Northern-Blot-Analyse-Protokolle, wie oben beschrieben, bewertet. Wie in 10D gezeigt, begann sich der Überfluss an ANF-message zu verringern, als die Zellkulturen DOB ausgesetzt waren, so dass innerhalb von 16 Stunden nur noch die Hälfte verglichen mit der in Kontrollkulturen (keine Stoffzugabe) beobachteten Menge vorhanden war. Dieser Trend setzte sich fort, so dass 24 Stunden nach dem Ausgesetzt sein mit DOB ANF mRNA um 75% verglichen mit Kontrollwerten abgenommen hatte. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass ein Teil, wenn nicht alle Veränderungen der Reporter-Aktvitäten auf der Ebene der Gentranskription stattfinden.
BEISPIEL 4
Transkriptionsregulierung von Hypertrophie-sensitiven Genen durch ein induzierbares Calcineurin Expressionssystem
Plasmidkonstrukte
Tetracyclin-kontrollierter Transaktivator (tTA) Expressionsplasmid pUHD15-1 kodiert chimäres Protein tTa unter der Kontrolle des humanen Cytomegalovirus (CMV) Promotor und Enhancer. tTa besteht aus den Aminosäureresten 1–207 des tetR Proteins und den Resten 363–490 von VP16 (Gossen und Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547–5551).
Das Plasmid pUHD10-3 enthält einen chimären tet Operon/CMV Minimalpromotor stromaufwärts von multiplen Klonierungsstellen (Bujard, 1996). pUHC13-3 ist ein Firefly-Luciferase-Reporter-Genexpressionsplasmid, das von dem chimären tet Operon/CMV Minimalpromotor angetrieben wird (Gossen und Bujard (1992)).
Eine konstitutiv aktive Genform von Calcineurin (ΔCaM-AI) wurde ursprünglich aus dem Plasmid pCN(α)ΔCaM-AI gewonnen, das durch Subklonieren der autoinhibitorischen Domäne-deletierten Calcineurin Gen-Mutante in pSRα Expressionsvektor (Parson et al., 1994) erzeugt wurde. Um das tTa induzierbare Calcineurin-Konstrukt p10-3CaN zu erzeugen, wurde ein 1,2 Kbp EcoRI Fragment von pCN(α)ΔCaM-AI, das das konstitutiv aktive Calcineurin kodiert, in die einzige EcoRI Schnittstelle des Plasmides pUHD10-3 subkloniert, das einen tTA-abhängigen Cytomegalovirus (CMV) Minimalpromotor vor der EcoRI Klonierungsstelle enthält (Bujard, 1996).
Das ANF-Luciferase Promotor-Reporter -Konstrukt NP337 wurde durch Klonieren von etwa 700 bp Nucleotiden des ANF proximalen Promotorfragmentes in den auf Luciferase-basierenden pXP-2 Vektor hergestellt, wie kürzlich anderswo beschrieben (McBride et al., 1993).
Der Skelett-α-Aktin Reporter, SkA-Luc, wurde durch Subklonieren von etwa 420 bp des proximal stromaufwärtsgelegenen Promotors (–394 bp bis +24 bp) des aviären Skelett-α-Aktin Gens in den Firefly-Luciferase-Expressionsvektor pXP1 konstruiert (MacLellan et al., 1994). Ein anderes Reporterkonstrukt, das Herz betreffendes α-Aktin-Promotor-Luciferase (CardA-Luc) wurde durch Subklonieren eines 330 bp Fragmentes des das Herz betreffenden α-Aktin Promotors und unmittelbar stromaufwärtsgelegenen Bereiches des Huhns (von –315 bis +15, im Verhältnis zur Transkriptionsstartstelle) in die HindIII Klonierungsstelle des pGL2-Basic-Luciferase-Vektors erzeugt (Chen und Schwanz, 1996).
Zellkulturen
Primäre myocardiale Zellkulturen. Primäre ventrikuläre Myocyten wurden aus 1–4 Tage alten Sprague-Dawley Ratten, wie in Beispiel 3 beschrieben, präpariert.
Ergebnisse
Regulierung einer exogenen Zielgentranskription durch das Tetracylin-abhängige Transaktivator (tTA) Expressionssystem an primären neonatalen Cardiomyocyten der Ratte
Das Firefly-Luciferase-Gen als ein Reportergen war unter der Kontrolle des chimären tet Operon/CMV Minimalpromotors in pUHC13-3. Transiente Transkriptionen wurden wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt. wurden dieses Konstrukt und tTA Expressionsplasmid pUHD15-1 in Zellen bei Vorhandensein oder Nichtvorhandensein der Wirksubstanz Doxcyclin cotransfiziert, wiesen Veränderungen der Luciferaseaktivität auf die Fähigkeit des tTA-Systems hin, die Zielgentranskription zu regulieren. Zur Untersuchung, ob ein Tetracyclin-reguliertes Genexpressionssystem in primären Cardiomyocyten der Ratte funktioniert, wurden Zellkulturen mit tTA Expressionsplasmid pUHD15-1 (0,25 μg) und tTA-stimuliertes Luciferase-Genexpressionskonstrukt pUHC 13-3 (0,25 μg) cotransfiziert. Als eine Kontrolle wurden die gleichen Mengen an Reporterplasmid pUHC 13-3 plus ein leerer Vektor pUHD10-3 in Cardiomyocyten aus der gleichen Zellpräparation transfiziert. Nach Transfektion wurden die Luciferaseaktivitäten in Zellextrakten an verschiedenen Zeitpunkten unter Verwendung des Luciferasetests, wie in Beispiel 3 beschrieben, untersucht. Bei Nichtvorhandensein von tTA wurden während 48 Stunden post-Transfektion nur sehr geringe Gehalte an Reportergen-Aktivität nachgewiesen. tTA Expression hatte eine drastische Zunahme der Reporteraktivität während dieser Zeitdauer zur Folge, und die Zielgenaktivitäten erreichten ein Maximum 12 Stunden nach Transfektion, wie in 11 A gezeigt. 12 Stunden post-Transfektion waren die Luciferaseaktivitäten in den tTA-transfizierten Zellen mehr als 30-fach höher als solche in der Zelle ohne tTA Transfektion (11A und 11B). Wurden die Zellen mit 1 μg/ml Doxcyclin (Fluka Chemical Corp.) nach Transfektion behandelt, wurde die Transaktivierung des Zielgens deutlich unterdrückt. Dennoch bewirkte die Doxcyclin-Behandlung selbst eine transiente niedrige Expression des Zielgens (etwa eine 4-fache Steigerung 12 Stunden post-Transfektion)(11A und 11B), was vermuten lässt, dass Doxcyclin-Repression in primären Cardiomyocyten nicht vollständig ist. Es ist möglich, das die exogene Genexpression bei transienter Tranfektion nicht unter strenger Kontrolle der nativen Genregulationsmaschinerie in diesen Zellen ist. Eine Doxcyclin-Behandlung kann ein schwaches Signal bewirken, um die niedrige Expression von diesem Zielgen zu stimulieren. Deshalb erscheint Doxcyclin nicht der beste Effektor zur Regulierung der das Herz betreffenden Gentranskription in diesem System zu sein.
Eine Transkription der Hypertrophie sensitiven Gene, die durch das tTA-regulierte Calcineurin Expressionssystem induziert werden, hängt von der Calcineurin-Gendosis ab
Konstitutiv exprimiertes aktives Calcineurin aktiviert die Transkription von ANF-Reportergen in primären Cardiomyocyten der Ratte. Desweiteren wird die Transkription des das Herz betreffenden α-Aktin Reportergens durch tTA-stimulierte aktive Calcineurin Expression in Pac-1 glatten Muskelzellen induziert. Zum Nachweis der Wirkungen von aktivem Calcineurin auf die das Herz betreffende Gentranskription in primären Cardiomyocyten und zur Bestimmung der optimalen Konzentration eines Calcineurin-Konstruktes in der Transfektion, um das Herz betreffende Genexpression zu induzieren, wurden verschiedene Mengen des tTA-abhängigen aktiviertes Calcineurin-Expressionskonstruktes p10-3CaN, 0,25 μg tTA Expressionsplasmid pUHD 15-1 und 0,25 μg das Herz betreffendes α-Aktin Promotor-Reporter-Plasmid CardA-Luc in primäre Cardiomyocyten der Ratte transfiziert. Die Ergebnisse sind in 12 dargestellt. Der leere Vektor, pUHD10-3, wurde als eine Kontrolle verwendet, um p10-3CaN zu ersetzen oder um Gesamt-DNA auf 0,75 μg/pro Vertiefung zu vervollständigen. 24 Stunden nach Transfektion wurden die Expressionsgehalte des das Herz betreffenden α-Aktin Reportergens mittels Luciferasetest untersucht, wie in Beispiel 3 beschrieben. Wie in 12 gezeigt, war bei Nichtvorhandensein von exogenem aktiven Calcineurin der Reportergenexpressionsgehalt recht gering, während die Transkription des das Herz betreffenden α-Aktin Reportergens mit steigenden Dosen von transfizierten p 10-3CaN nach und nach verstärkt wurde. Als der Calcineurin DNA-Gehalt auf 0,25 μg anstieg, war die Expression des Reportergens nahezu auf maximales Niveau gesteigert. Es wird klar, dass die Expression des das Herz betreffenden α-Aktin Gens von der Dosis des aktives-Calcineurin Gens abhängig ist. 0,25 μg p10-3CaN wurde in nachfolgenden Experimenten als die optimale Dosis verwendet.
Die induzierte Expression einer aktiven Form von Calcineurin aktiviert schnell die Transkription von drei Hypertrophie-sensitiven Genen in myocardialen Zellen
Um die Fähigkeit von Calcineurin, die das Herz betreffende Genexpression von myocardialen Zellen zu regulieren, weiter zu bewerten, beobachteten wir die Zeitverläufe der Expression von drei Genen, die auf Hypertrophie reagieren, unter Induktion der Expression von aktivem Calcineurin. Das Herz betreffendes α-Aktin, Skelett-α-Aktin und ANF Promotor-Luc Plasmide wurde als Reporter verwendet. Primäre neonatale Cardiomyocyten der Ratte wurden mit entweder Reporter, pUHD15-1, und p10-3CaN, oder leerem Vektor pUHD10-3 anstelle von p10-3CaN, zusammen mit pUHD15-1 und Reporterplasmiden cotransfiziert. Die Menge eines jeden Plasmides betrug 0,25 μg. Die Transfektionen wurden, wie in Beispiel 3 beschrieben, durchgeführt. An verschiedenen Zeitpunkten nach Transfektion wurden die Luciferaseaktivitäten der Zellextrakte, wie in Beispiel 3 beschrieben, gemessen. In jedem Experiment wurde das höchste Luciferaseaktivitätsniveau als die maximale Reaktion des Reporter-Gens verwendet, und alle Daten wurden als Prozent der maximalen Reaktion genormt. Bei Nichtvorhandensein der Expression des exogenen aktiven Calcineurins waren die Transkriptionsgehalte der drei das Herz betreffenden Gene sehr niedrig. Dennoch induzierte eine Expression des aktiven Calcineurins die Transkription der drei das Herz betreffenden Gene deutlich, wie in 13 dargestellt ist. Die Expression der Gene für das Herz betreffendes α-Aktin, Skelett- α-Aktin und ANF war überall signifikant auf annähernd maximale Gehalte 48 Stunden nach Transfektion gesteigert, was vermuten lässt, dass das aktive Calcineurin die Transkription dieser Hypertrophie-Response-Gene in primären Cardiomyocyten schnell aktiviert.
Die gleichen das Herz betreffenden Zellpräparationen wurden mit den gleichen Reportermengen, tTA und Calcineurin Plasmid-DNA cotransfiziert, wie in 14 angezeigt, und die Expressionsgehalte der drei das Herz betreffenden Gene wurden 48 Stunden nach Transfektion nachgewiesen. Verglichen mit den Kontrollen, in denen nur leerer Vektor pUHD10-3 anstelle der Calcineurin-Plasmide, zusammen mit Reporter und tTA Plasmid in die Cardiomyocyten transfiziert wurde, aktivierte Calcineurin die Transkription des das Herz betreffenden α-Aktins mit etwa 8 bis 10-fach stark und aktivierte ANF und Skelett-α-Aktin Expression mit etwa 6-fach und 3-fach schwach, wie in den 14B und 14C gezeigt.
Diese Ergebnisse waren nicht nur ein Hinweis auf die stimulatorische Wirkung von Calcineurin auf die Transkription von Hypertrophie-sensitiven Genen, sondern zeigten ebenfalls die Nützlichkeit des induzierbaren Genexpressionsystems auf. Die Fähigkeit des aktivierten Calcineurins, die Transkription eines auf Hypertrophiereagierenden Gens in den Cardiomyocyten zu induzieren, stimmt mit dem Ergebnis aus transgegen Mäusen überein, die die konstitutiv aktive Form von Calcineurin überexprimieren (Molkentin et al. 1998). Zum Beispiel war der mRNA Gehalt des Skelett-α-Aktin Gens im Herzen von Calcineurin-transgenen Mäusen etwa 5-fach höher als im Herzen von normalen Mäusen. Die mehrfache Steigerung der ANF Genexpression, die durch Calcineurin in unserem induzierbaren Expressionsystem induziert wurde, ähnelt der BNP-Genaktivierung in Calcineurin-transgenen Mäusen. Dennoch ist die mehrfache Steigerung des Transkriptionsgehaltes des Gens für das Herz betreffendes α-Aktin in unserem System höher als in Mäusen, die Calcineurin überexprimieren.
Repression der Calcineurin Indukttion der Expression von auf Hypertrophiereagierenden Genen durch Cyclosporin A
Zur Bewertung, ob die Transkriptionsaktivierung von Hypertrophie-sensitiven Genen durch aktiviertes Calcineurin durch CsA, einem spezifischen Calcineurin-Inhibitor, inhibiert werden konnte, wurden beide myocardialen Zellkulturen, die entweder mit p10-3CaN Konstrukt oder leerem Vektor pUND10-3, zusammen mit tTA und cardA-Luc Reporterplasmiden, wie in Beispiel 3 beschrieben, transfiziert wurden, mit unterschiedlichen CsA-Konzentrationen (Sandoz Pharmaceuticals Corp., East Hanover, NJ) oder ohne CsA-Behandlung ab 0 Stunden nach Transfektion behandelt. An verschiedenen Zeitpunkten wurden die Luciferaseaktivitäten in solchen Zellen untersucht und verglichen. In der Kontrollgruppe, in denen keine Calcineurin-Transfektion erfolgte, hatte eine CsA-Behandlung nur eine geringere Abnahme des Transkriptionsgehaltes des das Herz betreffenden α-Aktin Gens verglichen mit keiner Behandlung zur Folge, wie in 15 gezeigt. Dennoch war die durch aktiviertes Calcineurin stimulierte Expression des das Herz betreffenden α-Aktin Gens bei allen unterschiedlichen CsA-Konzentrationen signifikant unterdrückt, wie in 15 gezeigt, welches weiterhin die Folgerung unterstützt, dass die Expression dieses das Herz betreffenden, auf Hypertrophie reagierenden Gens durch einen Calcineurin-abhängigen Signaltransduktionsweg aktiviert wird. 72 Stunden nach Transfektion wurde eine durch Calcineurin induzierte Aktivität des Gens des das Herz betreffenden α-Aktins zu mehr als 80% durch 100 nM oder 150 nM CsA-Behandlung, wie in 15 gezeigt, inhibiert, was darauf hinweise, das die sehr geringen CsA-Konzentrationen eine Transkriptionsaktivierung des durch Calcineurin induzierten Gens des das Herz betreffenden α-Aktins inhibiert. Deshalb wurde 100 nM als die optimale CsA-Konzentration in nachfolgenden Experimente gewählt.
Um die Wirkung von CsA auf die Transkription von Hypertrophie-sensitiven Genen, die durch Calcineurin induziert werden, weiter zu demonstrieren, analysierten wir, wie die Expression des das Herz betreffenden α-Aktin-Promotor-Gens bei aktiver Calcineurin-Stimulierung auf CsA reagiert. Primäre Cardiomyocyten wurden entweder mit tTA, das Herz betreffenden α-Aktin-Reporterkonstrukten, und Calcineurin, oder tTa, das Herz betreffendem α-Aktin Reportergen und leerem Vektor als Kontrolle cotransfiziert. Die CsA-Behandlung (100 nM) wurde 0 Stunden nach Transfektion initiiert. Die Genaktivität des das Herz betreffenden α-Aktins in das Herz betreffenden Zellkulturen wurde durch Luciferasetest untersucht und die Ergebnisse wurden als prozentualer Anteil der maximalen Reaktion genormt. In den mit dem leeren Vektor transfizierten Zellen war die Expression des das Herz betreffenden α-Aktin Gens gering und es gab keinen merklichen Unterschied der Genaktivität zwischen den mit CsA-behandelten und unbehandelten Zellen, wie in 16 gezeigt. Dennoch führte die CsA-Behandlung zu einer drastischen Verringerung der das Herz betreffenden Gentranskription in mit aktivem Calcineurin transfizierten Zellen. 48 Stunden nach CsA-Behandlung nahm die Expression des durch Calcineurin aktivierten das Herz betreffenden α-Aktin Gens auf annähernd Grundniveau ab, wie in 16 gezeigt.
Basierend auf den obigen Ergebnissen untersuchten wir die Wirkungen von CsA auf die Calcineurin-vermittelte Transkriptionsaktivierung der Gene für ANF, das Herz betreffendes α-Aktin und Skelett-α-Aktin. Gleiche Menge von jedem Reporterkonstrukt, zusammen mit tTa und p10-3CaN DNA wurde in Zellen, die von der gleichen Primärkulturpräparation abstammten, cotransfiziert. Der leere Vektor, pUHD10-3, anstelle von p10-3CaN wurde als Kontrolle verwendet. Nach Transfektion wurden die mit aktivem Calcineurin transfizierten Zellen 48 Stunden in entweder Kulturmedium, das 100 nM CsA enthielt, oder in Kulturmedium ohne CsA gewechselt. Die mit leerem Vektor transfizierten Zellen wurden in Medium ohne CsA für die gleiche Zeitdauer kultiviert. Dann wurden diese Cardiomyocyten lysiert, um die Aktivitäten dieser auf Herzhypertrophie reagierenden Gene zu untersuchen. Die Ergebnisse werden in 17 gezeigt. Die Transkriptionsaktivierung der Gene von AFN und Skelett-α-Aktin, die durch aktives Calcineurin vermittelt wurde, wurde fast vollständig durch CsA in primären Cardiomyocyten der Ratte blockiert: etwa 80% der Transktiptionsaktvität des das Herz betreffenden α-Aktin Gens, die durch die Wirkung des Calcineurins hochreguliert wurde, wurde durch CsA inhibiert.
Die Repression der Transkription von Hypertrophie-sensitiven Genen durch CsA-Behandlung ist reversibel
Aufgrund der praktischen Erfordernisse in komplexen Studien hätte die Fähigkeit die Expression eines exogenen Gens bidirektional zu regulieren, sowohl in den Genfunktionsstudien als auch in Gentherapien eine große Signifikanz. Zur Bewertung, ob die unterdrückte Expression der exogenen Gene, die auf Hypertrophie reagieren in unserem System durch diskontinuierliche CsA-Behandlung reversibel kontrolliert werden könnte, wurden primäre Cardiomyocyten aus der gleichen Präparation mit tTA, Calcineurin-Konstrukt und das Herz betreffenden-α-Aktin Reporterplasmiden transfiziert. Nach Transfektion wurden alle Zellen mit 100 nM CsA behandelt. 24 Stunden später wurde ein Teil der Zellen in CsA-haltigem Medium weiter kultiviert, während ein anderer Teil der Zellen in Medium ohne CsA wechselte. An verschiedenen Zeitpunkten wurde die Reportergenexpression in diesen Cardiomyocyten mittels Luciferasetest untersucht. Wie in 18 gezeigt, war während einer 72-stündigen Zeitdauer die Reportergenaktivitäten in CsA-behandelten Zellen gering. Dennoch war die Expression des das Herz betreffenden Gens nach Unterbrechung der CsA-Behandlung schnell erhöht. 48 Stunden nach Entfernen von CsA aus den Medien (Zeitpunkt 72 Stunden) war die Reportergenaktivität für das Herz betreffendes α-Aktin etwa 2,5-fach im Vergleich mit den Zellen, die mit CsA behandelt wurden, erhöht. Die Daten zeigten, dass die unterdrückte Transkription des das Herz betreffenden Gens durch CsA schnell umgekehrt werden konnte. Deshalb konnte, basierend auf diesen oben dargestellten Ergebnissen, die Expression von exogenen Hypertrophie-sensitiven Genen in primären Cardiomyocyten unter den verwendeten experimentellen Bedingungen, auf eine positive oder negative Weise schnell reguliert werden.

Claims

Verwendung einer Zusammensetzung, welche die Aktivität von Calcineurin inhibiert und die Aktivität von wenigstens einem Gen oder Genprodukt, das in Cardiomyocyten als Reaktion auf ein hypertrophes Signal exprimiert wird, moduliert, für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer Herzhypertrophie, dekompensierter Herzhypertrophie, kombinierter Herzhypertrophie, dilatierter Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Genprodukt ein atrialer natriuretischer Faktor, ein b-Typ natriuretischer Faktor, eine schwere Kette des β-Myosins oder ein Skelett-α-Aktin ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung eine Substanz umfasst, die aus Cyclosporin, FK506 und Derivaten davon ausgewählt wird.
Verwendung eines transgenen, nicht-humanen Säugetiers, das ein Transgen umfasst, wobei das Transgen einen kodierenden Bereich, der Calcineurin kodiert, und ein Cardiomyocyten-spezifisches transkriptionsregulierendes Element (TRE) umfasst, oder des aus dem Säugetier isolierten Herzens, um nach Substanzen zu suchen, die für die Behandlung von Herzhypertrophie, dekompensierter Herzhypertrophie, kombinierter Herzhypertrophie, dilatierter Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz nützlich sind, wobei ein das Herz betreffender Parameter des Säugetiers oder des Herzens nach der Verabreichung der zu testenden Substanz an das Säugetier oder das Herz gemessen wird und als Kontrolle die Messung dieses Parameters bei einem entsprechenden Säugetier oder bei dem aus einem entsprechenden Säugetier isolierten Herzen, dem die Substanz nicht verabreicht wurde, bereitgestellt wird, wobei die Modulation des das Herz betreffenden Parameters durch die Substanz im Vergleich zur Kontrolle anzeigt, dass die Substanz für die Verwendung bei der Behandlung der oben definierten Erkrankungen nützlich ist.
Verwendung gemäß Anspruch 4, wobei es das transgene, nicht-humane Säugetier ist, das für die Suche verwendet wird.
Verwendung von in Medium kultivierten Zellen, um nach Substanzen zu suchen, die für die Behandlung von Herzhypertrophie, dekompensierter Herzhypertrophie, kombinierter Herzhypertrophie, dilatierter Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz nützlich sind, wobei die zu testende Substanz dem Kulturmedium der Zellen hinzugefügt, eine Funktion der Zellen untersucht und als Kontrolle die Messung dieser Funktion in entsprechenden Zellen bereitgestellt wird, die der Substanz nicht ausgesetzt wurden, und wobei die Zellen Cardiomyocyten sind, die von einem Tier stammen, das für ein Konstrukt transgen ist, wobei das Konstrukt einen kodierenden Bereich, der Calcineurin kodiert, und ein TRE umfasst, das funktional mit dem kodierenden Bereich verbunden ist, wobei das TRE einen Cardiomyocyten-spezifischen Pomotor umfasst, oder wobei die Zellen primäre Cardiomyocyten sind, die von einem nicht-transgenen Tier stammen, wobei die Zellen stabil oder transient mit einem kodierenden Bereich, der Calcineurin kodiert, und einem TRE transfiziert sind, das funktional mit dem kodierenden Bereich verbunden ist, wobei das TRE einen Cardiomyocyten-spezifischen Pomotor umfasst.