JP2008253274A - 心臓肥大のトランスジェニック動物モデルおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
【課題】ヒトの心臓肥大を予防および処置するための新たな薬理学的ストラテジーを提供すること。
【解決手段】心臓肥大が誘導する疾患状態を処置することにおける使用のために適切な物質をスクリーニングする方法であって、該方法は、
a)実質的に単離された酵素と、該物質とを接触させる工程であって、該酵素は、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の活性産物のレベルの調節に関与する、工程;
b)該物質の存在下での該酵素の活性を測定する工程;および
c)該物質の非存在下での該酵素の活性を測定することによってコントロールを提供する工程、
を包含し、
ここで、該コントロールと比較して、該物質による該酵素の活性の調節は、該物質が該心臓肥大が誘導する心臓疾患状態を処置することにおける使用のために適切であることを示す、
方法。
【選択図】なし
【解決手段】心臓肥大が誘導する疾患状態を処置することにおける使用のために適切な物質をスクリーニングする方法であって、該方法は、
a)実質的に単離された酵素と、該物質とを接触させる工程であって、該酵素は、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の活性産物のレベルの調節に関与する、工程;
b)該物質の存在下での該酵素の活性を測定する工程;および
c)該物質の非存在下での該酵素の活性を測定することによってコントロールを提供する工程、
を包含し、
ここで、該コントロールと比較して、該物質による該酵素の活性の調節は、該物質が該心臓肥大が誘導する心臓疾患状態を処置することにおける使用のために適切であることを示す、
方法。
【選択図】なし
Description
(関連出願の相互参照)
本出願は、1997年10月16日に出願された米国仮特許出願第60/062,864号、1997年11月10日に出願された米国仮特許出願第60/065,178号、1998年4月15日に出願された米国仮特許出願第60/081,853号、および1998年4月16日に出願された米国特許出願第09/061,417号の優先権を主張する。
本出願は、1997年10月16日に出願された米国仮特許出願第60/062,864号、1997年11月10日に出願された米国仮特許出願第60/065,178号、1998年4月15日に出願された米国仮特許出願第60/081,853号、および1998年4月16日に出願された米国特許出願第09/061,417号の優先権を主張する。
(資金援助された研究の下でなされた発明に対する権利の記載)
本発明についての資金援助は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金番号第805−3351号の下で、米国政府によって一部提供された。従って、米国政府は、本願発明に一定の権利を有し得る。
本発明についての資金援助は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金番号第805−3351号の下で、米国政府によって一部提供された。従って、米国政府は、本願発明に一定の権利を有し得る。
(技術分野)
本発明は、心臓肥大についてのトランスジェニック動物モデルに関する。本発明はさらに、心臓肥大に対する治療活性を有する物質を検出するためのこのようなトランスジェニック動物の使用に関する。本発明はさらに、心臓肥大の処置に使用する物質を検出するアッセイに関する。本発明はさらに、心臓肥大を処置するための方法に関する。
本発明は、心臓肥大についてのトランスジェニック動物モデルに関する。本発明はさらに、心臓肥大に対する治療活性を有する物質を検出するためのこのようなトランスジェニック動物の使用に関する。本発明はさらに、心臓肥大の処置に使用する物質を検出するアッセイに関する。本発明はさらに、心臓肥大を処置するための方法に関する。
(背景技術)
(心臓肥大)
心臓肥大は、心臓疾患の実質的に全ての形態に対する心臓の適応応答であり、これらの心臓疾患には、高血圧、機械的負荷、心筋梗塞、不整脈、内分泌障害、および心筋収縮タンパク質遺伝子の遺伝的変異が挙げられる。肥大応答は、心臓拍出を増大する、最初の補償的機構であるが、継続した肥大は、拡張型心筋症、心不全、および突然死を導き得る。米国では、ほぼ50万人が毎年心不全と診断されており、死亡率は、50%に達する。
(心臓肥大)
心臓肥大は、心臓疾患の実質的に全ての形態に対する心臓の適応応答であり、これらの心臓疾患には、高血圧、機械的負荷、心筋梗塞、不整脈、内分泌障害、および心筋収縮タンパク質遺伝子の遺伝的変異が挙げられる。肥大応答は、心臓拍出を増大する、最初の補償的機構であるが、継続した肥大は、拡張型心筋症、心不全、および突然死を導き得る。米国では、ほぼ50万人が毎年心不全と診断されており、死亡率は、50%に達する。
心臓肥大を導く多様な刺激にもかかわらず、細胞サイズおよびタンパク質合成の増加、増強された筋節組織化、胎児性心臓遺伝子のアップレギュレーション、および前初期遺伝子の誘導(例えば、c−fosおよびc−myc)に関与する肥大シグナルに対する心筋細胞の基本的な最終分子応答が存在する。Chienら(1993)Ann.Rev.Physiol.55:77−95;およびSadoshimaおよびIzumo(1997)Ann.Rev.Physiol.59:551−571を参照のこと。心臓肥大の因果は、広範に述べられているが、心筋細胞遺伝子発現の再プログラミングに対する細胞膜で開始される肥大シグナルを結びつける、根底にある分子的機構は、依然としてほとんど理解されていないままである。これらの機構の解明は、心臓血管生物学における中心的な論点であり、そして心臓肥大および心不全の予防または処置についての新たなストラテジーを設計するために重要である。
多くの研究は、心臓肥大についてのシグナルとして細胞内Ca2+を関連付けた。心臓製剤を働かせている状態での筋細胞伸展または増加した負荷に対する応答において、細胞内Ca2+濃度は、生理的応答と増強した心臓拍出とを協同させることにおいてCa2+の役割と一致して上昇する(Marbanら(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:6005−6009;Bustamanteら(1991)J.Cardiovasc.Pharmacol.17:S110−S113;およびHongoら(1995)Am.J.Physiol.269:C690−C697)。アンジオテンシンII(AngII)、フェニレフリン(PE)、およびエンドセリン−1(ET−1)を含む種々の体液性因子(これは、心筋細胞の肥大応答を誘導する)はまた、細胞内Ca2+濃度を上昇させる能力を有する。Karlinerら(1990)Experientia 46:81−84;SadoshimaおよびIzumo(1993)Circ.Res.73:424−438;Sadoshimaら(1993)Cell 75:977−984;およびLeiteら(1994)Am.J.Physiol.267:H2193−H2203。
肥大刺激は、β−ミオシン重鎖(MHC)およびα−骨格筋アクチン様の胎児性タンパク質イソ形態をコードする遺伝子がアップレギュレートされるように、成体心筋層での遺伝子発現の再プログラミングを生じる。その一方で、対応する成体イソ形態(α−MHCおよびα−心筋アクチン)は、ダウンレギュレートされる。血管拡張およびナトリウム排泄増加によって血圧を低下させるナトリウム利尿ペプチド、心房性ナトリウム利尿因子(ANF)、およびb型ナトリウム利尿ペプチド(BNP)はまた、肥大シグナルに対する応答において、心臓で迅速にアップレギュレートされる。KomuroおよびYazaki(1993)Ann.Rev.Physiol.55:55−75.肥大の間にこれらの心臓遺伝子を協同して調節することに関与するこの機構は未知であるが、いくつかの転写調節因子(血清応答因子(SRF)、TEF−1、AP−1、およびSp−1を含む)結合部位は、肥大に応答性の胎児性心臓遺伝子の活性化のために重要である。SadoshimaおよびIzumo(1993);Sadoshimaら(1993);Kariyaら(1994)J.Biol.Chem.269:3775−3782;Karnsら(1995)J.Biol.Chem.270:410−417;およびKovacic−Milivojevicら(1996)Endocrinol.137:1108−1117。最も最近では、心臓制限ジンクフィンガー(cardiac−restricted zinc
finger)転写因子、GATA4は、肥大の間にAngII 1a型レセプターおよびβ−MHCについての遺伝子の転写活性化を必要とすることもまた示されている。Herzigら(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:7543−7548;Hasegawaら(1997)Circulation 96:3943−3953;およびMolkentinおよびOlson(1997)Circulation 96:3833−3835。
finger)転写因子、GATA4は、肥大の間にAngII 1a型レセプターおよびβ−MHCについての遺伝子の転写活性化を必要とすることもまた示されている。Herzigら(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:7543−7548;Hasegawaら(1997)Circulation 96:3943−3953;およびMolkentinおよびOlson(1997)Circulation 96:3833−3835。
多くの細胞内シグナル伝達経路は、肥大刺激の伝達に関与している。例えば、細胞表面レセプターの、AngII、PE、およびET−1についての占有は、ホスホリパーゼCの活性化を誘導し、ジアシルグリセロールおよびイノシトール三リン酸の生成を生じる。これは、次いで、細胞内Ca2+の移動およびプロテインキナーゼC(PKC)の活性化を生じる。SadoshimaおよびIzumo(1993);Yamazakiら(1996)J.Biol.Chem.271:3221−3228;およびZouら(1996)J.Biol.Chem.271:33592−33597。Rasおよびマイトジェン活性化プロテイン(MAP)キナーゼ経路が肥大シグナルのトランスデューサーであるという証拠もまた存在する。Thorburnら(1993)J.Biol.Chem.268:2244−2249;およびForceら(1996)Circ.Res.78:947−953。これらのシグナル伝達経路が心臓肥大の間に協調される程度は、未知である。しかし、これらの経路の全ては、複数の肥大シグナル伝達経路の活性化を協調することにおけるCa2+の中心的な調節役割と一致して、細胞内Ca2+の増加と関連する。
BおよびT細胞において、Ca2+、カルモジュリン依存性ホスファターゼ、カルシニューリンは、細胞内シグナル伝達経路を関連することを示している。これは、免疫応答の活性化に伴って、細胞内Ca2+の上昇を生じる。カルシニューリンは、NF−AT(活性化T細胞の核因子)として知られる転写因子のファミリーの脱リン酸化によって免疫応答遺伝子を調節する。Raoら(1997)Ann.Rev.Immunol.15:707−747。一旦、カルシニューリンによって脱リン酸化されると、NF−AT転写因子は核へ移行し、そして免疫応答遺伝子を直接活性化する。Flanaganら(1991)Nature 352:803−807;Lohら(1996)Mol.Cell.Biol.16:3945−3954;およびLohら(1996)J.Biol.Chem.271:10884−10891。免疫抑制薬物であるシクロスポリンA(CsA)およびFK506は、NF−AT転写因子を活性化するカルシニューリンの能力を阻害することによって免疫応答を抑制する。Shawら(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:11205−11209;Lohら(1996)J.Biol.Chem.271:10884−10891。
心臓肥大に十分に類似する、実験モデルとして有用な自然発症変異マウスは存在しない。ヒト心房性ナトリウム利尿因子遺伝子の制御下でカルモジュリンを過剰発現するトランスジェニック齧歯類系統が生産された。Gruverら(1993)Endocrinology 133:376−388。これらのマウスにおいて、マウス心筋のCaMの発生的過剰発現は顕著に誇張された心臓成長応答を生成し、CaMを過剰発現することが実証された領域において心筋肥大の存在および初期の発生段階で明らかである心筋過形成によって特徴付けられる。しかし、これらの動物においてカルモジュリンの発現は構成性であるため、ヒトにおける生理学的条件の反映ではない。トランスジェニックマウスが作製され、ここで、レポーター遺伝子は、テトラサイクリンで制御されたトランスアクチベーター(tTA)によって調節され、次いで、ラットα−ミオシン重鎖遺伝子からの配列に隣接する5’の2.9kbの転写制御下である。Yuら(1996)Circ.Res.79:691−697。
心臓肥大の現在の医学的対応としては、3つの型の薬物の使用が挙げられる:カルシウムチャネル遮断剤、β−アドレナリン遮断剤、およびジソピラミド。KikuraおよびLevy(1995)Int.Anesthesiol.Clin.33:21−37。心不全のための治療剤としては、アンジオテンシンII変換酵素(ACE)インヒビターおよび利尿薬が挙げられる。心臓肥大の処置が開示されている他の薬剤としては、アンジオテンシンIIレセプターアンタゴニスト(米国特許第5,604,251号);および神経ペプチドYアンタゴニスト(国際特許出願WO98/33791)が挙げられる。現在、薬学的化合物が利用可能であるにもかかわらず、心臓肥大およびこれに引き続く心不全の予防および処置は治療的な挑戦でありつづけている。
従って、ヒトの心臓肥大を予防および処置するために新たな薬理学的ストラテジーの開発が必要である。このようなストラテジーを開発するために、この疾患の病理学的プロファイルを正確に反映する動物モデルが必要であり、この動物モデルによって、治療的介入の新規な標的の同定が可能になる。さらに、心臓肥大を処置するために、新たな強力な治療剤の同定を可能にする新規なアッセイが必要である。
(発明の要旨)
本発明は、心臓肥大の非ヒト動物モデルを提供する。このようなモデルは、心臓肥大の処置のためのさらなる標的を同定するため、および心臓肥大の処置において有効な物質を試験するために有用である。1つの局面において、本発明は、トランスジーンとしてポリヌクレオチドを含むトランスジェニック非ヒト動物を提供する。このポリヌクレオチドは、哺乳動物非ヒト動物の受精卵または胚へ初期段階において導入した場合、それらのゲノムへ機能的に組み込まれ、それによってトランスジェニック動物を生産し得る。このトランスジェニック動物は、このポリヌクレオチドが制御配列(例えば、プロモーターを含む)と組み合わせて、心臓肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むという点で特徴付けられる。そしてこの制御配列は、トランスジェニック動物の体細胞、特に心筋細胞内の遺伝子の発現に指向し、かつ調節する。
本発明は、心臓肥大の非ヒト動物モデルを提供する。このようなモデルは、心臓肥大の処置のためのさらなる標的を同定するため、および心臓肥大の処置において有効な物質を試験するために有用である。1つの局面において、本発明は、トランスジーンとしてポリヌクレオチドを含むトランスジェニック非ヒト動物を提供する。このポリヌクレオチドは、哺乳動物非ヒト動物の受精卵または胚へ初期段階において導入した場合、それらのゲノムへ機能的に組み込まれ、それによってトランスジェニック動物を生産し得る。このトランスジェニック動物は、このポリヌクレオチドが制御配列(例えば、プロモーターを含む)と組み合わせて、心臓肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むという点で特徴付けられる。そしてこの制御配列は、トランスジェニック動物の体細胞、特に心筋細胞内の遺伝子の発現に指向し、かつ調節する。
本発明は、トランスジーンとして心臓肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを含むトランスジェニック動物を含む。ここで、この動物は、肥大型心筋症または類似の心臓機能不全の症状を自発的に発症する可能性が実質的に増加されている。
本発明はさらに、トランスジーンとして心臓肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを含むトランスジェニック動物を含む。ここで、この動物は、肥大型心筋症または類似の心臓機能不全の症状を自発的に発症する可能性が実質的に減少されている。
本発明のトランスジェニック動物は、心臓肥大および心臓肥大が誘導する機能不全の予防または処置するための新たな標的を同定することにおいて有用である。これらの動物はまた、調査目的のため、肥大シグナルに対する応答に関与するシグナル伝達経路を調べるために有用である。これらの動物はさらに、心臓肥大の処置および/または予防のための強力な治療剤をスクリーニングするために有用である。
好ましくは、本発明のトランスジェニック動物を生産するために使用されるポリヌクレオチドは、組換えDNA構築物である。ここで、プロモーターおよび少なくともいくつかの制御配列が作動可能に連結したコード配列の発現を指向する。いくつかの実施態様において、プロモーターおよび制御配列は、心筋細胞特異的様式で発現される。このコード配列は、転写を終結するため、およびコードされた遺伝子産物の発現の間に転写されたRNAのプロセシングを制御するためのシグナルを提供するに効果的な真核生物遺伝子配列の少なくともフラグメントを含む下流セグメントに融合される。1つの実施態様において、プロモーターは、α−ミオシン重鎖遺伝子(α−MHC)に由来する。他の実施態様において、転写制御配列は、作動可能に連結されたコード配列に対する誘導性の発現を付与するエレメントを含む。いくつかの実施態様において、トランスジェニック動物は、少なくとも1つの心臓肥大感受性遺伝子の転写を調節するポリペプチドをコードするトランスジーンを含む。これらの実施態様において、このポリペプチドは、改変された機能(例えば、改変された酵素機能)を有するか、または改変された調節特性(例えば、優性のネガティブ変異体)を有するように、野生型アミノ酸配列または変異アミノ酸配列を含み得る。他の実施態様において、トランスジーンがコードした遺伝子産物は、アンチセンスポリヌクレオチドである。なお他の実施態様において、このトランスジーンがコードした遺伝子産物はリボザイムである。
この構築物は、マイクロインジェクションのような標準的技術を使用して動物胚または胚幹細胞へ導入される。細胞培養ベースのモデルもまた、種々の方法によって調製され得る。例えば、細胞をトランスジェニック動物から単離し得るか、または標準的な細胞トランスフェクション技術で同じ構築物を使用して樹立された細胞培養物から調製し得る。
本発明はさらに、肥大型心筋症または類似の心臓機能不全を自発的に発症する可能性が実質的に増加されたか、または肥大型心筋症または類似の心臓機能不全を自発的に発症する可能性が実質的に減少されたかのいずれかのトランスジェニック動物(例えば、マウスまたは他の齧歯類)を生産するための方法を提供する。この方法は、上記の特定化されたポリヌクレオチドが機能的にゲノムに組み込まれるように非ヒト動物のゲノムへ取り込む工程を包含する。少なくとも好ましい実施態様において、核酸は、組換えDNAであり、これは、受精卵または動物の胚へ、それらのゲノムに機能的に組み込まれるように導入される。この組換えDNAは、遺伝子産物をコードする遺伝子配列を含むセグメントを含むという点で特徴付けられ、この遺伝子産物は、肥大シグナルに応答して、またはこのような遺伝子産物の誘導体のために心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の転写を調節する。このセグメントは、上記コード配列の発現を指向かつ調節するために有効なプロモーターおよび少なくともいくつかの制御配列を含む上流セグメントに融合される。そしてまた、好ましくは、このセグメントは、転写の終結および転写されたRNAのプロセシングを制御するためのシグナルを提供するために効果的な真核生物遺伝子配列またはフラグメントを含む下流セグメントに融合される。
トランスジェニック動物を生産することにおいて使用するための構築物は、トランスジーンの発現が構成性または誘導性であり得るように構築され得る。トランスジェニック動物を生産することにおいて使用するためのポリヌクレオチドは、遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含み、この遺伝子産物は、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の転写を調節する。1つの局面において、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードするこのヌクレオチド配列は、構成的に発現される。別の局面において、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードする遺伝子は、調節可能な様式で発現される。別の局面において、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードする遺伝子は、ポリペプチドの優性なネガティブ変異体をコードする部分を含む。
本発明の1つの局面において、トランスジェニック動物は、トランスジーンとして少なくとも1つの遺伝子の転写を抑制する遺伝子産物をコードする遺伝子を含む。この少なくとも1つの遺伝子は、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される。本発明の別の局面において、トランスジーンがコードした遺伝子産物は、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の転写を誘導する。例えば、転写因子YY1は、心臓肥大応答性遺伝子の全体的なリプレッサであるが、カルシニューリンは、一般的に、心臓肥大応答性遺伝子の転写を誘導する。
本発明の別の局面は、上記のトランスジェニック動物から単離された細胞に関する。好ましくは、このような細胞は、心臓組織に由来し、そして心筋細胞である。本発明のトランスジェニック動物から単離された心筋細胞は、細胞がインビトロで曝露された物質の心臓治療的特徴を試験するために使用され得る。従って、この細胞は、心臓肥大の処置および/または予防のための強力な治療剤をスクリーニングするために有用である。このような細胞はまた、心臓肥大または心臓肥大が誘導する機能不全の予防および治療のための新規な標的を同定するために使用され得る。これらの細胞はまた、調査目的で、肥大シグナルに対する応答に関与するシグナル伝達経路を調査するために有用である。
本発明はさらに、心臓肥大が誘導する疾患状態(機能不全)を処置することにおいて使用するための物質をスクリーニングするための方法を提供する。
いくつかの実施態様において、酵素ベースのスクリーニングアッセイが提供され、ここで、この使用される酵素は、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の活性な産物のレベルを調節することに関与する。この方法は、一般的に、この酵素と試験される物質とを接触させる工程、および試験される物質の非存在下でこの酵素を含むコントロールサンプルと比較して、この酵素活性を測定する工程を包含する。
別の実施態様において、細胞ベースのスクリーニングアッセイが提供され、ここで、実質的に単離された心筋細胞を、試験される物質と接触させて、次いで、心筋細胞機能またはパラメーターを測定する。測定される心筋細胞機能における変化は、物質が添加されないコントロール細胞サンプルと比較した場合、物質が心臓肥大が誘導した機能不全の処置において使用されるために適切であることを示す。これらの実施態様のいくつかにおいて、心筋細胞は本発明のトランスジェニック動物に由来する。他の実施態様において、心筋細胞は非トランスジェニック動物に由来する。
なお他の実施態様において、動物そのものがベースのスクリーニングアッセイが提供される。これらの実施態様において、本発明は、上記の動物に投与した物質の心臓治療的特徴を試験するため、または肥大型心筋症の発症を制御もしくは阻害することにおいてこのような物質の活性を試験するための、本発明のトランスジェニック動物、およびその一部の使用を含む。従って、本発明の別の局面に従って、肥大型心筋症の発症に対してまたはこれの処置において活性な薬物もしくは他の物質をスクリーニングおよび同定または試験するための方法は、本発明のトランスジェニック動物、またはその一部を、上記の薬物または他の関係のある物質で処置する工程、ならびに肥大型心筋症の発症の発生数の任意の減少および死亡率の減少を、この薬物または物質で処置していない対応する動物と比較して、検出または記載する工程、あるいは心臓機能を維持、修復、または改善することにおける有効性を検出または記載する工程を包含する。
本発明はさらに、本発明の方法によって同定された物質、ならびに公知の物質を含む組成物の、心臓肥大および心不全を処置するための使用を提供する。このような組成物は、1つ以上の遺伝子産物の活性レベルを増加させる物質を含み、この遺伝子産物は、通常、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の転写を抑制する。このことによって、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の発現を減少させる。このような組成物はまた、1つ以上の遺伝子産物の活性レベルを減少させる物質を含み、この遺伝子産物は、通常、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の転写を増加させる。これにより肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の発現を減少させる。さらに、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される、少なくとも1つの遺伝子の転写を調節する遺伝子産物の公知のモジュレータである物質が、心臓肥大が誘導する機能不全を処置することにおける使用のために含まれる。カルシニューリンのホスファターゼ活性を阻害する、公知のカルシニューリンのインヒビター、およびこれらのインヒビターの誘導体が含まれる。
本発明はさらに、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の転写を調節する遺伝子産物のモジュレーターを使用して心臓肥大を処置する方法を提供する。本発明の1つの局面において、カルシニューリンインヒビターを使用して、心臓肥大および心不全を制御する。本発明はさらに、心臓肥大または心臓肥大が誘導する機能不全を処置する方法を提供し、この方法は、機能不全を減退させるかまたは進行を逆転させる物質をその必要がある個体に投与する工程を包含する。いくつかの実施態様において、この物質は、遺伝子産物が肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の転写を調節する遺伝子の発現を阻害する。他の実施態様において、この物質は、このような遺伝子産物の活性を阻害する。いくつかの実施態様において、この方法は、カルシニューリンのホスファターゼ活性を阻害する、カルシニューリンの公知のインヒビター、およびこれらのインヒビターの誘導体を含む組成物を投与する工程を包含する。
・本発明はさらに、以下を提供し得る:
・(項目1) 心臓肥大が誘導する機能不全を処置する方法であって、
上記機能不全の進行を減退または逆転させるために有効な量の組成物を、心臓肥大が誘導する機能不全を処置する必要がある被験体に投与する工程
を包含し、上記組成物は、カルシニューリン、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼIV(CaMKIV)、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼIIα(AおよびB)(CaMKIIα)、YY1、p38およびMKK6、またはそれらの誘導体からなる群より選択されるタンパク質の活性を阻害する、方法。
・(項目2) 上記組成物が、上記タンパク質またはそれらの誘導体の活性を阻害する、シクロスポリン、FK506、およびそれらの誘導体からなる群より選択される物質を含む、項目1に記載の方法。
・(項目3) 上記組成物が、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子または遺伝子産物の活性を調節する、項目1に記載の方法。
・(項目4) 肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される上記少なくとも1つの遺伝子が、β−ミオシン重鎖、α−骨格筋アクチン、心筋アクチン、心房性ナトリウム利尿因子、およびb型ナトリウム利尿因子からなる群より選択される、項目3に記載の方法。
・(項目5) 上記組成物が、カルシニューリンの活性を低減させる、項目1に記載の方法。
・(項目6) 上記組成物が、カルシニューリンホスファターゼ活性のインヒビターを含む、項目5に記載の方法。
・(項目7) 上記物質がカルシウムカルモジュリン依存性キナーゼIV(CaMKIV)の活性を低減させる、項目1に記載の方法。
・(項目8) 上記物質がCaMKIVキナーゼ活性のインヒビターである、項目7に記載の方法。
・(項目9) 上記物質が、CaMKIVをコードする遺伝子の発現レベルを低減させる、項目7に記載の方法。
・(項目10) 上記物質が、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼIIα(CaMKIIα)の活性を増加させる、項目1に記載の方法。
・(項目11) 上記物質が、CaMKIIαキナーゼ活性のアクチベータである、項目10に記載の方法。
・(項目12) 上記物質が、CaMKIIαをコードする遺伝子の発現レベルを増加させる、項目11に記載の方法。
・(項目13) 上記物質が、YY1の活性を増加させる、項目1に記載の方法。
・(項目14) 上記物質がp38の活性を低減させる、項目13に記載の方法。
・(項目15) 上記物質が、p38キナーゼ活性を阻害する、項目1に記載の方法。
・(項目16) 上記物質が、p38をコードする遺伝子の発現レベルを低減させる、項目15に記載の方法。
・(項目17) 上記物質が、MKK6の活性を低減させる、項目1に記載の方法。
・(項目18) 上記物質が、MKK6キナーゼ活性を阻害する、項目17に記載の方法。
・(項目19) 上記物質が、MKK6をコードする遺伝子の発現レベルを低減させる、項目18に記載の方法。
・(項目20) 上記組成物が、心臓肥大に対する治療的活性を有する、項目1に記載の方法。
・(項目21) 上記組成物が、薬学的に受容可能な賦形剤をさらに含む、項目1に記載の方法。
・(項目22) 心臓肥大が誘導する疾患状態を処置することにおける使用のために適切な物質をスクリーニングする方法であって、上記方法は、
a)実質的に単離された酵素と、上記物質とを接触させる工程であって、上記酵素は、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の活性産物のレベルの調節に関与する、工程;
b)上記物質の存在下での上記酵素の活性を測定する工程;および
c)上記物質の非存在下での上記酵素の活性を測定することによってコントロールを提供する工程、
を包含し、
ここで、上記コントロールと比較して、上記物質による上記酵素の活性の調節は、上記物質が上記心臓肥大が誘導する心臓疾患状態を処置することにおける使用のために適切であることを示す、
方法。
・(項目23) 上記実質的に単離された酵素が、カルシニューリン、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼIV(CaMKIV)、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼIIα(AおよびB)(CaMKIIα)、YY1、p38およびMKK6、またはそれらの誘導体である、項目22に記載の方法。
・(項目24) 肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される上記少なくとも1つの遺伝子が、β−ミオシン重鎖、α−骨格筋アクチン、心房性ナトリウム利尿因子、心筋アクチン、およびb型ナトリウム利尿因子からなる群より選択される、項目22に記載の方法。
・(項目25) 心臓肥大が誘導する疾患状態を処置することにおいて使用するための物質をスクリーニングする方法であって、上記方法は、
a)第1の実質的に単離された心筋細胞と、物質とを接触させる工程;
b)上記物質の存在下での第1の心筋細胞の肥大に関連する心筋細胞パラメーターを測定する工程;および
c)上記物質が接触していない第2の実質的に単離された心筋細胞における肥大に関連する上記心筋細胞パラメーターを測定することによってコントロールを提供する工程、
を包含し、
ここで、上記コントロールと比較して、上記物質による上記心筋細胞パラメーターの調節は、上記物質が、上記心臓肥大が誘導する心臓疾患状態を処置することにおける使用のために適切であることを示す、
方法。
・(項目26) 上記第1および第2の心筋細胞が、初代心筋細胞である、項目25に記載の方法。
・(項目27) 上記第1および第2の心筋細胞がトランスジェニック非ヒト動物から実質的に単離され、かつ上記トランスジェニック動物が、心筋細胞において発現されるトランスジーンを含み、かつ上記トランスジーンの発現産物が、心筋シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の活性産物のレベルを調節する、項目26に記載の方法。
・(項目28) 上記トランスジーンの発現産物が、カルシニューリン、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼIV(CaMKIV)、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼIIα(AおよびB)(CaMKIIα)、YY1、p38およびMKK6、またはそれらの誘導体である、項目26に記載の方法。
・(項目29) 測定される上記心筋細胞パラメーターが、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の発現レベルである、項目26に記載の方法。
・(項目30) 肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される上記少なくとも1つの遺伝子が、β−ミオシン重鎖、α−骨格筋アクチン、心房性ナトリウム利尿因子、心筋アクチン、およびb型ナトリウム利尿因子からなる群より選択されるタンパク質をコードする、項目29に記載の方法。
・(項目31) 測定される上記心筋細胞パラメーターが細胞直径である、項目25に記載の方法。
・(項目32) 測定される上記心筋細胞パラメーターが細胞質量である、項目25に記載の方法。
・(項目33) 測定される上記心筋細胞パラメーターが、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の活性産物のレベルである、項目25に記載の方法。
・(項目34) 肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される上記少なくとも1つの遺伝子が、β−ミオシン重鎖、α−骨格筋アクチン、心房性ナトリウム利尿因子、心筋アクチン、およびb型ナトリウム利尿因子からなる群より選択されるタンパク質をコードする、項目33に記載の方法。
・(項目35) 心臓肥大が誘導する疾患状態を処置することにおける使用のための物質をスクリーニングする方法であって、上記方法は、
a)非ヒトトランスジェニック動物またはそのインビトロ部分に物質を投与する工程であって、上記非ヒトトランスジェニック動物またはそのインビトロ部分は、カルシニューリン、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼIV(CaMKIV)、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼIIα(AおよびB)(CaMKIIα)、YY1、p38およびMKK6、またはそれらの誘導体をコードするコード領域と、心筋特異的転写調節エレメントとを含むトランスジーンを含むゲノムを有する、工程;
b)上記動物またはその一部の心臓パラメーターを、上記物質の存在下で測定する工程;および
c)上記物質を投与しない対応する動物またはその一部における上記心臓パラメーターを測定することによってコントロールを提供する工程、
を包含し、
ここで、上記コントロールと比較して、上記物質による心臓パラメーターの調節は、上記物質が、心臓肥大が誘導する心臓疾患状態を処置することにおける使用のために適切であることを示す、
方法。
・(項目36) 測定される上記心臓パラメーターが、心室質量、拡張型心筋症、類線維沈着、心筋細胞組織化、カルシウムイオンフラックス、拍動の長さ、および心室拍出量、およびdP/dTからなる群より選択される、項目35に記載の方法。
・(項目37) トランスジーンを含むトランスジェニック非ヒト動物であって、上記動物は、
a)少なくとも1つの心臓肥大感受性遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードするコード領域;および
b)上記コード領域に作動可能に連結された転写調節エレメント(TRE)であって、上記TREは、心筋細胞特異的プロモーターを含み、
ここで、上記トランスジェニック動物は、非トランスジェニック同腹仔と比較した場合、心臓肥大を自発的に発症する可能性が実質的に増加しているという点において、特徴付けられる、
トランスジェニック非ヒト動物。
・(項目38) 上記少なくとも1つの心臓肥大感受性遺伝子が、心房性ナトリウム利尿因子遺伝子、b型ナトリウム利尿ペプチド遺伝子、β−ミオシン重鎖遺伝子、およびα−骨格筋アクチン遺伝子からなる群より選択される、項目37に記載のトランスジェニック動物。
・(項目39) 上記心筋細胞特異的プロモーターが、α−ミオシン重鎖プロモーターである、項目37に記載のトランスジェニック動物。
・(項目40) 上記TREが誘導性プロモーターエレメントをさらに含む、項目37に記載のトランスジェニック動物。
・(項目41) 上記誘導性プロモーターエレメントが、テトラサイクリントランスアクチベーターによって調節される、項目40に記載のトランスジェニック動物。
・(項目42) 上記コード領域が、カルシニューリン、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼIV(CaMKIV)、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼIIα(AおよびB)(CaMKIIα)、YY1、p38およびMKK6、またはそれらの誘導体をコードする、項目37に記載のトランスジェニック動物。
・(項目43) 上記カルシニューリンのホスファターゼ活性が、構成的に活性である、項目42に記載のトランスジェニック動物。
・(項目44) トランスジーンを含むトランスジェニック非ヒト動物であって、上記動物は、
a)少なくとも1つの心臓肥大感受性遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードするコード領域;および
b)上記コード領域に作動可能に連結された転写調節エレメント(TRE)であって、上記TREは、心筋細胞特異的プロモーターを含み、
ここで、上記トランスジェニック動物は、非トランスジェニック同腹仔と比較した場合、心臓肥大を自発的に発症する可能性が実質的に減少しているという点において、特徴付けられる、
トランスジェニック非ヒト動物。
・(項目45) 上記コード領域が、カルシニューリンのドミナントネガティブ変異体をコードする、項目44に記載のトランスジェニック動物。
・(項目46) 上記変異体が、ホスファターゼ活性を実質的に欠失しており、ここで、上記変異体がカルモジュリン結合を保持している、項目45に記載のトランスジェニック動物。
・(項目47) 心臓肥大のトランスジェニックマウス動物モデルを作製する方法であって、上記方法は、
a)マウス胚に、カルシニューリン、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼIV(CaMKIV)、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼIIα(AおよびB)(CaMKIIα)、YY1、p38およびMKK6からなる群より選択される遺伝子産物またはその酵素的に活性な改変体をコードするコード領域を含むポリヌクレオチドを導入する工程であって、上記コード領域は、心筋細胞特異的プロモーターを含む転写調節エレメントに作動可能に連結されている、工程;および
b)養育母マウスに上記胚を移入する工程、
を包含し、
ここで、上記トランスジェニックマウスは、非トランスジェニック同腹仔と比較した場合、心臓肥大を自発的に発症する可能性が実質的に増加しているという点において、特徴付けられる、
方法。
・(項目48) 項目47に記載の方法に従って得られたマウスを交配することによって生産される、トランスジェニックマウス。
・(項目49) 項目48に記載のマウスであって、該子孫は、前記遺伝子産物のうちの少なくとも2つを含む、マウス。
・(項目50) 項目37に記載のトランスジェニック動物から得られた細胞。
・(項目51) 上記細胞が心筋細胞である、項目50に記載の細胞。
・(項目52) 項目44に記載のトランスジェニック動物から得られた細胞。
・(項目53) 上記細胞が心筋細胞である、項目51に記載の細胞。
・(項目54) 心臓肥大を減少または低減させる能力について物質をスクリーニングする方法であって、上記方法は、
a)項目37に記載のトランスジェニック動物に上記物質を投与する工程;および
b)上記動物における心臓パラメーターまたは心臓機能を測定して、上記物質を投与していないトランスジェニック同腹仔と比較する工程、
を包含する、方法。
・本発明はさらに、以下を提供し得る:
・(項目1) 心臓肥大が誘導する機能不全を処置する方法であって、
上記機能不全の進行を減退または逆転させるために有効な量の組成物を、心臓肥大が誘導する機能不全を処置する必要がある被験体に投与する工程
を包含し、上記組成物は、カルシニューリン、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼIV(CaMKIV)、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼIIα(AおよびB)(CaMKIIα)、YY1、p38およびMKK6、またはそれらの誘導体からなる群より選択されるタンパク質の活性を阻害する、方法。
・(項目2) 上記組成物が、上記タンパク質またはそれらの誘導体の活性を阻害する、シクロスポリン、FK506、およびそれらの誘導体からなる群より選択される物質を含む、項目1に記載の方法。
・(項目3) 上記組成物が、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子または遺伝子産物の活性を調節する、項目1に記載の方法。
・(項目4) 肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される上記少なくとも1つの遺伝子が、β−ミオシン重鎖、α−骨格筋アクチン、心筋アクチン、心房性ナトリウム利尿因子、およびb型ナトリウム利尿因子からなる群より選択される、項目3に記載の方法。
・(項目5) 上記組成物が、カルシニューリンの活性を低減させる、項目1に記載の方法。
・(項目6) 上記組成物が、カルシニューリンホスファターゼ活性のインヒビターを含む、項目5に記載の方法。
・(項目7) 上記物質がカルシウムカルモジュリン依存性キナーゼIV(CaMKIV)の活性を低減させる、項目1に記載の方法。
・(項目8) 上記物質がCaMKIVキナーゼ活性のインヒビターである、項目7に記載の方法。
・(項目9) 上記物質が、CaMKIVをコードする遺伝子の発現レベルを低減させる、項目7に記載の方法。
・(項目10) 上記物質が、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼIIα(CaMKIIα)の活性を増加させる、項目1に記載の方法。
・(項目11) 上記物質が、CaMKIIαキナーゼ活性のアクチベータである、項目10に記載の方法。
・(項目12) 上記物質が、CaMKIIαをコードする遺伝子の発現レベルを増加させる、項目11に記載の方法。
・(項目13) 上記物質が、YY1の活性を増加させる、項目1に記載の方法。
・(項目14) 上記物質がp38の活性を低減させる、項目13に記載の方法。
・(項目15) 上記物質が、p38キナーゼ活性を阻害する、項目1に記載の方法。
・(項目16) 上記物質が、p38をコードする遺伝子の発現レベルを低減させる、項目15に記載の方法。
・(項目17) 上記物質が、MKK6の活性を低減させる、項目1に記載の方法。
・(項目18) 上記物質が、MKK6キナーゼ活性を阻害する、項目17に記載の方法。
・(項目19) 上記物質が、MKK6をコードする遺伝子の発現レベルを低減させる、項目18に記載の方法。
・(項目20) 上記組成物が、心臓肥大に対する治療的活性を有する、項目1に記載の方法。
・(項目21) 上記組成物が、薬学的に受容可能な賦形剤をさらに含む、項目1に記載の方法。
・(項目22) 心臓肥大が誘導する疾患状態を処置することにおける使用のために適切な物質をスクリーニングする方法であって、上記方法は、
a)実質的に単離された酵素と、上記物質とを接触させる工程であって、上記酵素は、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の活性産物のレベルの調節に関与する、工程;
b)上記物質の存在下での上記酵素の活性を測定する工程;および
c)上記物質の非存在下での上記酵素の活性を測定することによってコントロールを提供する工程、
を包含し、
ここで、上記コントロールと比較して、上記物質による上記酵素の活性の調節は、上記物質が上記心臓肥大が誘導する心臓疾患状態を処置することにおける使用のために適切であることを示す、
方法。
・(項目23) 上記実質的に単離された酵素が、カルシニューリン、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼIV(CaMKIV)、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼIIα(AおよびB)(CaMKIIα)、YY1、p38およびMKK6、またはそれらの誘導体である、項目22に記載の方法。
・(項目24) 肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される上記少なくとも1つの遺伝子が、β−ミオシン重鎖、α−骨格筋アクチン、心房性ナトリウム利尿因子、心筋アクチン、およびb型ナトリウム利尿因子からなる群より選択される、項目22に記載の方法。
・(項目25) 心臓肥大が誘導する疾患状態を処置することにおいて使用するための物質をスクリーニングする方法であって、上記方法は、
a)第1の実質的に単離された心筋細胞と、物質とを接触させる工程;
b)上記物質の存在下での第1の心筋細胞の肥大に関連する心筋細胞パラメーターを測定する工程;および
c)上記物質が接触していない第2の実質的に単離された心筋細胞における肥大に関連する上記心筋細胞パラメーターを測定することによってコントロールを提供する工程、
を包含し、
ここで、上記コントロールと比較して、上記物質による上記心筋細胞パラメーターの調節は、上記物質が、上記心臓肥大が誘導する心臓疾患状態を処置することにおける使用のために適切であることを示す、
方法。
・(項目26) 上記第1および第2の心筋細胞が、初代心筋細胞である、項目25に記載の方法。
・(項目27) 上記第1および第2の心筋細胞がトランスジェニック非ヒト動物から実質的に単離され、かつ上記トランスジェニック動物が、心筋細胞において発現されるトランスジーンを含み、かつ上記トランスジーンの発現産物が、心筋シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の活性産物のレベルを調節する、項目26に記載の方法。
・(項目28) 上記トランスジーンの発現産物が、カルシニューリン、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼIV(CaMKIV)、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼIIα(AおよびB)(CaMKIIα)、YY1、p38およびMKK6、またはそれらの誘導体である、項目26に記載の方法。
・(項目29) 測定される上記心筋細胞パラメーターが、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の発現レベルである、項目26に記載の方法。
・(項目30) 肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される上記少なくとも1つの遺伝子が、β−ミオシン重鎖、α−骨格筋アクチン、心房性ナトリウム利尿因子、心筋アクチン、およびb型ナトリウム利尿因子からなる群より選択されるタンパク質をコードする、項目29に記載の方法。
・(項目31) 測定される上記心筋細胞パラメーターが細胞直径である、項目25に記載の方法。
・(項目32) 測定される上記心筋細胞パラメーターが細胞質量である、項目25に記載の方法。
・(項目33) 測定される上記心筋細胞パラメーターが、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の活性産物のレベルである、項目25に記載の方法。
・(項目34) 肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される上記少なくとも1つの遺伝子が、β−ミオシン重鎖、α−骨格筋アクチン、心房性ナトリウム利尿因子、心筋アクチン、およびb型ナトリウム利尿因子からなる群より選択されるタンパク質をコードする、項目33に記載の方法。
・(項目35) 心臓肥大が誘導する疾患状態を処置することにおける使用のための物質をスクリーニングする方法であって、上記方法は、
a)非ヒトトランスジェニック動物またはそのインビトロ部分に物質を投与する工程であって、上記非ヒトトランスジェニック動物またはそのインビトロ部分は、カルシニューリン、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼIV(CaMKIV)、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼIIα(AおよびB)(CaMKIIα)、YY1、p38およびMKK6、またはそれらの誘導体をコードするコード領域と、心筋特異的転写調節エレメントとを含むトランスジーンを含むゲノムを有する、工程;
b)上記動物またはその一部の心臓パラメーターを、上記物質の存在下で測定する工程;および
c)上記物質を投与しない対応する動物またはその一部における上記心臓パラメーターを測定することによってコントロールを提供する工程、
を包含し、
ここで、上記コントロールと比較して、上記物質による心臓パラメーターの調節は、上記物質が、心臓肥大が誘導する心臓疾患状態を処置することにおける使用のために適切であることを示す、
方法。
・(項目36) 測定される上記心臓パラメーターが、心室質量、拡張型心筋症、類線維沈着、心筋細胞組織化、カルシウムイオンフラックス、拍動の長さ、および心室拍出量、およびdP/dTからなる群より選択される、項目35に記載の方法。
・(項目37) トランスジーンを含むトランスジェニック非ヒト動物であって、上記動物は、
a)少なくとも1つの心臓肥大感受性遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードするコード領域;および
b)上記コード領域に作動可能に連結された転写調節エレメント(TRE)であって、上記TREは、心筋細胞特異的プロモーターを含み、
ここで、上記トランスジェニック動物は、非トランスジェニック同腹仔と比較した場合、心臓肥大を自発的に発症する可能性が実質的に増加しているという点において、特徴付けられる、
トランスジェニック非ヒト動物。
・(項目38) 上記少なくとも1つの心臓肥大感受性遺伝子が、心房性ナトリウム利尿因子遺伝子、b型ナトリウム利尿ペプチド遺伝子、β−ミオシン重鎖遺伝子、およびα−骨格筋アクチン遺伝子からなる群より選択される、項目37に記載のトランスジェニック動物。
・(項目39) 上記心筋細胞特異的プロモーターが、α−ミオシン重鎖プロモーターである、項目37に記載のトランスジェニック動物。
・(項目40) 上記TREが誘導性プロモーターエレメントをさらに含む、項目37に記載のトランスジェニック動物。
・(項目41) 上記誘導性プロモーターエレメントが、テトラサイクリントランスアクチベーターによって調節される、項目40に記載のトランスジェニック動物。
・(項目42) 上記コード領域が、カルシニューリン、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼIV(CaMKIV)、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼIIα(AおよびB)(CaMKIIα)、YY1、p38およびMKK6、またはそれらの誘導体をコードする、項目37に記載のトランスジェニック動物。
・(項目43) 上記カルシニューリンのホスファターゼ活性が、構成的に活性である、項目42に記載のトランスジェニック動物。
・(項目44) トランスジーンを含むトランスジェニック非ヒト動物であって、上記動物は、
a)少なくとも1つの心臓肥大感受性遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードするコード領域;および
b)上記コード領域に作動可能に連結された転写調節エレメント(TRE)であって、上記TREは、心筋細胞特異的プロモーターを含み、
ここで、上記トランスジェニック動物は、非トランスジェニック同腹仔と比較した場合、心臓肥大を自発的に発症する可能性が実質的に減少しているという点において、特徴付けられる、
トランスジェニック非ヒト動物。
・(項目45) 上記コード領域が、カルシニューリンのドミナントネガティブ変異体をコードする、項目44に記載のトランスジェニック動物。
・(項目46) 上記変異体が、ホスファターゼ活性を実質的に欠失しており、ここで、上記変異体がカルモジュリン結合を保持している、項目45に記載のトランスジェニック動物。
・(項目47) 心臓肥大のトランスジェニックマウス動物モデルを作製する方法であって、上記方法は、
a)マウス胚に、カルシニューリン、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼIV(CaMKIV)、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼIIα(AおよびB)(CaMKIIα)、YY1、p38およびMKK6からなる群より選択される遺伝子産物またはその酵素的に活性な改変体をコードするコード領域を含むポリヌクレオチドを導入する工程であって、上記コード領域は、心筋細胞特異的プロモーターを含む転写調節エレメントに作動可能に連結されている、工程;および
b)養育母マウスに上記胚を移入する工程、
を包含し、
ここで、上記トランスジェニックマウスは、非トランスジェニック同腹仔と比較した場合、心臓肥大を自発的に発症する可能性が実質的に増加しているという点において、特徴付けられる、
方法。
・(項目48) 項目47に記載の方法に従って得られたマウスを交配することによって生産される、トランスジェニックマウス。
・(項目49) 項目48に記載のマウスであって、該子孫は、前記遺伝子産物のうちの少なくとも2つを含む、マウス。
・(項目50) 項目37に記載のトランスジェニック動物から得られた細胞。
・(項目51) 上記細胞が心筋細胞である、項目50に記載の細胞。
・(項目52) 項目44に記載のトランスジェニック動物から得られた細胞。
・(項目53) 上記細胞が心筋細胞である、項目51に記載の細胞。
・(項目54) 心臓肥大を減少または低減させる能力について物質をスクリーニングする方法であって、上記方法は、
a)項目37に記載のトランスジェニック動物に上記物質を投与する工程;および
b)上記動物における心臓パラメーターまたは心臓機能を測定して、上記物質を投与していないトランスジェニック同腹仔と比較する工程、
を包含する、方法。
(発明を実施するための形態)
本発明は、トランスジーンとして、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードするコード配列を含む、組換えポリヌクレオチドを含む、トランスジェニック非ヒト動物を提供する。このトランスジーンに依存して、本発明のトランスジェニック動物は、実質的に増大された、または実質的に減少された、心臓肥大を自発的に発症する可能性を有する。
本発明は、トランスジーンとして、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードするコード配列を含む、組換えポリヌクレオチドを含む、トランスジェニック非ヒト動物を提供する。このトランスジーンに依存して、本発明のトランスジェニック動物は、実質的に増大された、または実質的に減少された、心臓肥大を自発的に発症する可能性を有する。
心臓肥大のための可能な処置を試験するために組換えポリヌクレオチドを用いる、トランスジェニック動物モデルの構築が、記載される。本発明は、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードするコード配列を含む、組換えポリヌクレオチドを含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。この構築物は、マイクロインジェクションまたは胚幹細胞のような標準技術を用いて動物胚に導入される。
本発明は、トランスジェニック非ヒト動物、およびトランスジェニック非ヒト動物から単離された細胞を提供する。ここでトランスジーンが、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードし、そしてここで単離された細胞は、トランスジーンを発現する。
本発明は、トランスジェニック動物またはそれから単離された細胞を包含する。これらは、種々のパラメーターによって測定されるように、心臓肥大を減少させ得る物質についてスクリーニングするために使用され得る。このパラメーターとしては、左心室重量/体重、心筋細胞の大きさおよび組織化の変化、心臓遺伝子発現の変化および心臓機能の変化が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明は、トランスジェニック動物またはそれから単離された細胞のいずれかを使用する、心臓肥大に対する治療能を有する物質を検出するための方法を提供する。さらに、本発明は、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子のレベルを調節することに関与する、実質的に単離された酵素を使用する、スクリーニングアッセイを提供する。このスクリーニングアッセイはまた、非トランスジェニック動物由来の細胞を用いても実施され得る。
本発明は、心臓肥大が誘導する機能不全を処置するための方法をさらに提供し、この方法は、このような処置を必要とする個体に、肥大シグナルに応答して発現される少なくとも1つの遺伝子産物の活性レベルを調節する物質を含む組成物を投与する工程を包含する。これらの組成物に含まれる物質には、本発明の方法によって検出される物質、ならびに既知の物質およびそれらの誘導体が含まれる。
(一般技術)
本発明の実施は、他に示されなければ、分子生物学(組換え技術を包含する)、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来の技術を使用する。これらは当該技術の範囲内である。このような技術は、文献に十分に説明されている(例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第2版(Sambrookら、1989);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編,1984):Animal Cell Culture(R.I.Freshney編、1987);Methods in Enzymology(Academic Press, Inc.);Handbook of Experimental Immunology(D.M.WeirおよびC.C.Blackwell編);Gene Transfer Vectors for Mammlian Cells(J.M.MillerおよびM.P.Calos編、1987);Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubelら編、1987);PCR: The Polymerase Chain Reaction,(Mullisら編、1994);およびCurrent Protocols in Immunology(J.E.Coliganら編、1991)。
本発明の実施は、他に示されなければ、分子生物学(組換え技術を包含する)、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来の技術を使用する。これらは当該技術の範囲内である。このような技術は、文献に十分に説明されている(例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第2版(Sambrookら、1989);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編,1984):Animal Cell Culture(R.I.Freshney編、1987);Methods in Enzymology(Academic Press, Inc.);Handbook of Experimental Immunology(D.M.WeirおよびC.C.Blackwell編);Gene Transfer Vectors for Mammlian Cells(J.M.MillerおよびM.P.Calos編、1987);Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubelら編、1987);PCR: The Polymerase Chain Reaction,(Mullisら編、1994);およびCurrent Protocols in Immunology(J.E.Coliganら編、1991)。
トランスジェニック動物の生産に関連した技術について、特に、Hoganら(1986)Manipulating the Mouse Embryo − A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor, N.Y. 1986)を参照のこと。
本明細書中で使用される用語「肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の転写を調節する遺伝子産物」は、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の転写を調節する任意の遺伝子産物(タンパク質またはRNAのいずれか)をいう。これはまた、転写および/または翻訳のレベルを減少させる、あるいはタンパク質活性を減少させる(例えば、競合または非競合阻害によるか、もしくはタンパク質濃度を減少させることによる)ことなどにより、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の活性を減少させるかまたは調節する遺伝子産物である。「調節」は、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される遺伝子のダウンレギュレーションまたはアップレギュレーションのいずれかであり得る。
肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される遺伝子はまた、本明細書中で、「心臓肥大感受性遺伝子」または「心臓肥大応答性遺伝子」と称される。肥大シグナルに応答して発現される遺伝子の例としては、図1に図解的に示されるように、心房性ナトリウム利尿因子(ANF)、α骨格筋アクチン、b型ナトリウム利尿ペプチド(BNP)、心臓アクチン、およびβ−ミオシン重鎖(β−MHC)が挙げられるが、これらに限定されない。
用語「トランスジェニック動物」は、その生殖系列DNAに、動物に導入した1つ以上のDNA配列を組み込んだ非ヒト動物(好ましくは非ヒト哺乳動物)をいう。
本明細書中で使用される用語「肥大シグナル」は、心臓肥大の測定可能な症状を生じる任意の刺激(機械的または化学的)を示す。心臓肥大シグナルとしては、機械的伸展、β−アドレナリン作用アゴニスト、α1−アドレナリン作用レセプターアゴニスト、およびアンジオテンシンIIが挙げられるが、これらに限定されない。心臓肥大の症状は、種々のパラメーターによって測定され得る。このパラメーターとしては、左心室重量:体重比;心筋細胞の大きさ、重量および組織化の変化;心臓遺伝子発現の変化;心臓機能の変化;フィブロイド沈着;dP/dTの変化、すなわち、時間に対する心室圧の変化率;カルシウムイオン流動;脈拍長;および心室拍出量が挙げられるが、これらに限定されない。
用語「転写調節エレメント」(TRE)および「転写制御領域」、「転写応答エレメント」、および「転写制御エレメント」(これらは、本明細書中で交換可能に使用される)は、宿主細胞において作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の転写を選択的に活性化するポリヌクレオチド配列(好ましくは、DNA配列)をいう。TREは、通常、プロモーター領域を含み、そして、プロモーターに加えて、他の制御配列(例えば、エンハンサーおよびサイレンサー)を必要に応じて含み得る。
「異種」TRE、プロモーター、またはエンハンサーは、遺伝子の5’隣接配列と細胞において通常関連していないものであるか、またはそれに由来しないものである。肥大感受性遺伝子の少なくとも1つの遺伝子産物の活性レベルを調節する産物をコードする遺伝子の文脈において、異種プロモーターまたはエンハンサーの例は、α−ミオシン重鎖遺伝子5’隣接領域を含む。
用語「作動可能に連結された」とは、機能的関係におけるポリヌクレオチドエレメントの向きに関連する。TREは、そのTREがコード配列の転写を促進する場合、コードセグメントに作動可能に連結される。作動可能に連結されたとは、連結されるDNA配列が、ほぼ隣接しており、そして2つのタンパク質コード領域を結合させることが必要である場合、隣接し、かつ同じリーディングフレームにあることを意味する。しかし、エンハンサーは、数キロ塩基プロモーターから離れているときに一般に機能するので、いくつかのポリヌクレオチドエレメントは、作動可能に連結しているが、隣接していない。
用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」(本明細書中で交換可能に用いられる)は、任意の長さのヌクレオチド(リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれか)のポリマー形態をいう。従って、この用語は、二本鎖および一本鎖のDNAおよびRNAを包含する。当業者は、点変異および欠失が、本発明で使用されるプロモーター配列およびコード領域配列に対して、配列がその機能を実行する能力を変えることなく(その機能が転写を活性化させることであろうが、あるいは機能的タンパク質をコードすることであろうが)なされ得ることを認識する。好ましくは、そのポリヌクレオチドはDNAである。本明細書中で使用される「DNA」は、塩基A、T、C、およびGだけでなく、それらのアナログまたはこれらの塩基の改変形態(例えば、メチル化ヌクレオチド、ヌクレオチド間改変(例えば、非荷電連結およびチオエート)、糖アナログの使用、ならびに改変および/または代替の骨格構造(例えば、ポリアミド))のいずれかもまた包含する。
「実質的に単離された」または「精製された」ポリヌクレオチドは、それが天然に関連している物質を実質的に含まないポリヌクレオチドである。実質的に含まないとは、それが天然に関連した物質の少なくとも50%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、そしてさらにより好ましくは少なくとも90%を含まないことを意味する。本明細書中で使用されるように、「実質的に単離された」ポリヌクレオチドはまた、起源または操作によって、(1)それが天然に関連しているポリヌクレオチドの全てまたは一部と関連していないか、(2)それが天然に連結しているもの以外のポリヌクレオチドに連結されているか、または(3)天然に生じない組換えポリヌクレオチドを意味する。
本明細書中で使用される用語「抗体」は、免疫グロブリン分子、または特定の抗原に特異的に結合する能力を有する免疫グロブリン分子のフラグメントをいう。抗体は、免疫学の科学における当業者に周知である。本明細書中で使用される用語「抗体」は、インタクトな抗体分子だけでなく、抗原結合能力を保持する抗体分子のフラグメントもまた意味する。このようなフラグメントもまた、当該分野において周知であり、そしてインビトロおよびインビボの両方でしばしば使用される。特に、本明細書中で使用される用語「抗体」は、任意のイソタイプのインタクトな免疫グロブリン分子(IgA、IgG、IgE、IgD、IgM)だけでなく、周知の活性フラグメントF(ab’)2、Fab、Fv、scFv、Fd、VH、およびVLをも意味する。抗体フラグメントについては、例えば、「Immunochemistry in Practice」(JohnstoneおよびThorpe編、1996;Blackwell Science)69頁を参照のこと。
本明細書中で使用されるように、「心臓肥大が誘導する機能不全」は、心臓肥大に関連した状態または疾患であり、心臓肥大、複合心臓肥大、拡張型心臓肥大、代償不全心臓肥大、および心不全を包含する。心臓肥大が誘導する機能不全は、1つ以上の以下の症状または事象によって特徴付けられる:同心肥大型心室塊;偏心拡大型心室塊;拡張型心筋障害への進行;広範囲のフィブロイド沈着;dP/dTの変化;心筋細胞乱脈;カルシウムイオン放出および取り込み(すなわち、Ca2+流動);脈拍短縮;逓減心室拍出量;不整脈;頻拍;中枢要求量の変化;および心不全。
(トランスジェニック動物)
本発明のトランスジェニック動物は、非トランスジェニック同腹仔と比較されたとき、実質的に減少された、心臓肥大を自発的に発症する可能性を有する動物、および実質的に増大された、心臓肥大を自発的に発症する可能性を有する動物を含む。「実質的に増大された」または「実質的に減少された」心臓肥大を自発的に発症する可能性とは、トランスジェニック動物を非トランスジェニック動物と比較したとき、それぞれ、心臓肥大の測定可能な症状の統計学的に有意な増大または減少が観察されることを意味する。
本発明のトランスジェニック動物は、非トランスジェニック同腹仔と比較されたとき、実質的に減少された、心臓肥大を自発的に発症する可能性を有する動物、および実質的に増大された、心臓肥大を自発的に発症する可能性を有する動物を含む。「実質的に増大された」または「実質的に減少された」心臓肥大を自発的に発症する可能性とは、トランスジェニック動物を非トランスジェニック動物と比較したとき、それぞれ、心臓肥大の測定可能な症状の統計学的に有意な増大または減少が観察されることを意味する。
本発明のトランスジェニック動物が、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードするコード領域を含むトランスジーンを用いて生産される。本発明のトランスジーンを構築することにおいて使用するためのコード領域としては、MEF−2、p38、カルシニューリン(calcineurin)(CaN)、CaMKIIα、CaMKIV、GATA4、およびYY1をコードする領域が挙げられるが、これらに限定されない。コード領域は、ポリペプチドの所望の機能が保持される限り、すなわち、ポリペプチドが、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の転写を調節し得る限り、完全ポリペプチドまたはそれらのフラグメントをコードし得る。本発明のトランスジーンを構築することにおいて使用するためのコード領域は、変異を含む領域をさらに含み、これには、サイレント変異、アミノ酸配列の変化を導くが機能的変化を生じない変異、より活性なタンパク質を生じる変異、構成的に活性なタンパク質を生じる変異、減少した活性を有するタンパク質を生じる変異、およびドミナントネガティブ変異体が含まれる。コード領域は、ヒト、ラット、またはマウス配列に由来し得、それらのいくつかが開示されている。ヌクレオチド配列は、マウスCaN触媒サブユニットmRNA(GenBank登録番号M81475およびJ05479);ヒトp38 mRNA(GenBank登録番号AF015256);ヒトYY1 mRNA(GenBank登録番号Z14077);およびラットCaMKIIα
mRNA(GenBank登録番号J02942)について開示されている。上述のように、これらの配列またはそれらの改変または変異が用いられ得る。構成的に活性な変異体の例として、CaN、CaMKII、およびCaMKIVの構成的に活性な形態が、記載されている。Sunら(1994)Genes Dev.8:2527−2539;CruzaleguiおよびMeans(1993)J.Biol.Chem.268:26171−26178;およびO’Keefeら(1992)Nature 357;692−694。
mRNA(GenBank登録番号J02942)について開示されている。上述のように、これらの配列またはそれらの改変または変異が用いられ得る。構成的に活性な変異体の例として、CaN、CaMKII、およびCaMKIVの構成的に活性な形態が、記載されている。Sunら(1994)Genes Dev.8:2527−2539;CruzaleguiおよびMeans(1993)J.Biol.Chem.268:26171−26178;およびO’Keefeら(1992)Nature 357;692−694。
トランスジェニック動物の生産において使用するための、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードするコード領域を含むトランスジーンは、少なくとも1つの肥大感受性遺伝子の転写を調節する遺伝子産物が、1)心筋細胞特異的プロモーターの制御下にあり;2)心筋細胞特異的プロモーターの制御下の心筋細胞において構成的に発現され;3)心筋細胞特異的プロモーターの制御下にあるが誘導様式で発現されるトランスジーンを含む。
(転写調節エレメント)
本発明のトランスジェニック動物は、トランスジーンとして、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の発現を調節する遺伝子産物をコードするコード領域を含む、ポリヌクレオチドを含む。コード領域の転写は、転写調節エレメント(TRE)によって制御される。本発明の使用に適したTREは、心筋細胞において優先的に作動可能に連結されるコード領域の転写を方向付けるTREを包含する。「優先的に」とは、心筋細胞におけるトランスジーンの発現が少なくとも約10倍、より好ましくは少なくとも約10倍から約50倍、さらにより好ましくは少なくとも約50倍から100倍、さらにより好ましくは100倍を超えて、非心筋細胞におけるより大きいことを意味する。好ましくは、トランスジーンの発現は、レポーター遺伝子アッセイ(例えば、実施例に示されるアッセイ)により示されるように、心筋細胞以外の細胞では検出限界以下である。
本発明のトランスジェニック動物は、トランスジーンとして、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の発現を調節する遺伝子産物をコードするコード領域を含む、ポリヌクレオチドを含む。コード領域の転写は、転写調節エレメント(TRE)によって制御される。本発明の使用に適したTREは、心筋細胞において優先的に作動可能に連結されるコード領域の転写を方向付けるTREを包含する。「優先的に」とは、心筋細胞におけるトランスジーンの発現が少なくとも約10倍、より好ましくは少なくとも約10倍から約50倍、さらにより好ましくは少なくとも約50倍から100倍、さらにより好ましくは100倍を超えて、非心筋細胞におけるより大きいことを意味する。好ましくは、トランスジーンの発現は、レポーター遺伝子アッセイ(例えば、実施例に示されるアッセイ)により示されるように、心筋細胞以外の細胞では検出限界以下である。
種々の心筋細胞特異的TREが文献に記載されており、本発明において使用され得る。これらとしては、以下の遺伝子由来のTREが挙げられるが、これらに限定されない:ミオシン軽鎖−2、α−ミオシン重鎖、AE3、心臓トロポニンC、および心筋αアクチン。Franzら(1997)Cardiovasc.Res.35:560−566;Robbinsら(1995)Ann.N,Y,Acad.Sci.752:492−505;Linnら(1995)Circ.Res.76:584−591;Parmacekら(1994)Mol.Cell.Biol.14:1870−1885;Hunterら(1993)Hypertension 22:608−617;およびSartorelliら(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4047−4051。
1つの実施態様では、TREは、α−MHC遺伝子の5’隣接領域由来のプロモーター領域を含む。マウスα−MHC遺伝子の5443bpの5’隣接配列が、登録番号U71441でGenBankにおいて提供される。完全な5.4kb配列が本発明のトランスジーンにおいて使用され得るが、心筋細胞において優先的に作動可能に連結されたコード領域の転写を方向付けるそれらの一部もまた使用され得る。実施例*に記載のα−MHC発現ベクターは、所望のコード領域を、このコード領域がα−MHCプロモーターに作動可能に連結されるように挿入するために使用され得る。Jonesら、(1994)Dev.Dyn.22:17−128。
別の実施態様では、TREは、b型ナトリウム利尿ペプチド遺伝子(BNP)の5’隣接領域由来のプロモーター領域を含む。ThueraufおよびGlembotski(1997)J.Biol.Chem.272:7464−7472;およびLaPointeら、(1996)Hypertension 27:715−722。ヒトBNPの5’隣接領域のヌクレオチド配列は開示されている(GenBank登録番号D16641)。
他の実施態様では、コード領域は、誘導性調節エレメントに作動可能に連結される。種々の誘導性プロモーター系が文献に記載されており、本発明において使用され得る。これらとしては、テトラサイクリン調節性系、(WO94/29442;WO96/40892;およびWO96/01313);ホルモン応答性系、インターフェロン誘導性系、金属誘導性系、および熱誘導性系(WO93/20218);およびエクジソン誘導性系が挙げられるが、これらに限定されない。これらの系のいくつか(エクジソン誘導性系およびテトラサイクリン誘導性系を包含する)は、Invitorogen(Carlsbad,CA)およびClontech(Palo Alto,CA)からそれぞれ市販されている。
いくつかの実施態様では、誘導性(調節性)プロモーター系は、その産物が肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の転写を調節するコード領域に作動可能に連結されたテトラサイクリン結合オペレーター、tetO(動物の水または食餌にテトラサイクリン(またはそのアナログ)を添加することによって調節される)を含む。本発明の使用に適した系は、周知である。Yuら(1996)Circ.Res.79:691−697;Gossenら(1992)Proc.Batl.Acad.Sci.USA 89:5547−5551;ならびにHillenおよびWissmann、Protein−Nucleic Acid Interaction、Topics in
Molecular and Structual Biology、SaengerおよびHeinemann編、Macmillian、London(1989)、143〜162頁。一般には、この系は、ハイブリッド融合タンパク質であるテトラサイクリントランスアクチベーター(tTA)を利用する。このタンパク質は、ウイルスタンパク質VP16由来のような転写活性化ドメインに結合されたE.coli由来のtetリプレッサー(tetR)タンパク質のようなポリペプチドに由来のtetOに結合し得るDNA結合ドメインを含む。これにより、tTA16がtetO配列を含有する最小プロモーターに結合する場合、標的遺伝子の転写が活性化される。tTAへのテトラサイクリン結合は、おそらくtTAのtetR部分のコンホメーション変化を引き起こし、tTAのtetOへの結合を阻止することによって、活性化を妨害する。遺伝子活性化は、テトラサイクリンを除去することによって生じる。
Molecular and Structual Biology、SaengerおよびHeinemann編、Macmillian、London(1989)、143〜162頁。一般には、この系は、ハイブリッド融合タンパク質であるテトラサイクリントランスアクチベーター(tTA)を利用する。このタンパク質は、ウイルスタンパク質VP16由来のような転写活性化ドメインに結合されたE.coli由来のtetリプレッサー(tetR)タンパク質のようなポリペプチドに由来のtetOに結合し得るDNA結合ドメインを含む。これにより、tTA16がtetO配列を含有する最小プロモーターに結合する場合、標的遺伝子の転写が活性化される。tTAへのテトラサイクリン結合は、おそらくtTAのtetR部分のコンホメーション変化を引き起こし、tTAのtetOへの結合を阻止することによって、活性化を妨害する。遺伝子活性化は、テトラサイクリンを除去することによって生じる。
さらに、細胞型特異的TREが用いられ得る。細胞型特異的TREとしては、以下の例示の遺伝子(TREが特異的に機能性である細胞型は括弧内である)に由来するTREが挙げられるが、これらに限定されない:血管内皮成長因子レセプター(内皮)、アルブミン(肝臓)、第VII因子(肝臓)、脂肪酸シンターゼ(肝臓)、フォン・ビルブラント因子(脳内皮)、α−アクチンおよびミオシン重鎖(ともに平滑筋)、シンテターゼI(小腸)、Na−K−Cl輸送因子(腎臓)、前立腺特異的抗原(前立腺)、および腺カリクレイン−1遺伝子(前立腺)。
別のクラスのTREは、低酸素条件に応答して作動可能に連結されたポリヌクレオチドの転写を活性化するTREである。これらには、低酸素誘導性因子−1によって少なくとも部分的に調節されるTREが含まれる。BunnおよgびPoyton(1996)Physiol.Rev.76:839−885;DachsおよびStratford(1996)Br.J.Cancer 74:5126−5132;GuilleminおよびKrasnow(1997)Cell 89:9−12。Firthら(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:6496−6500;およびJiangら(1997)Cancer Res.57:5328−5335。
広範な種々のウイルスプロモーターが当該分野で公知であり、用いられ得る。このようなプロモーターとしては、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、SV40プロモーター、およびMMTV LTRプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。それらの調節の性質に依存して、プロモーターは、構成的であり得るか、または実験条件によって調節可能であり得る。
トランスジーンに含まれ得る他の調節配列には、ポリアデニル化シグナルおよび終結シグナルが含まれ、後者は、メッセージレベルを増強し、そして他の配列への読み通しを最小化するように作用し得る。これらの調節配列は当該分野で公知である。
(トランスジェニック動物の作製において使用するためのポリヌクレオチド)
本発明のトランスジェニック動物の作製において使用するための実質的に単離されたポリヌクレオチドは、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードするコード領域を含むポリヌクレオチドを含む。このような遺伝子産物には、ポリペプチド、アンチセンスポリヌクレオチド、およびリボザイムが含まれる。
本発明のトランスジェニック動物の作製において使用するための実質的に単離されたポリヌクレオチドは、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードするコード領域を含むポリヌクレオチドを含む。このような遺伝子産物には、ポリペプチド、アンチセンスポリヌクレオチド、およびリボザイムが含まれる。
肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の転写を調節するポリペプチド遺伝子産物としては、カルシニューリン、YY1、p38/Hog1、CaMKIV、およびCaMKIIαが挙げられるが、これらに限定されない。
トランスジェニック動物を作製するための本発明における使用に適したいくつかのcDNAクローンは、記載されている:p38、Wangら、(1997)J.Biol.Chem.272:23668−23674(ヒト配列、GenBank登録番号AF015256);カルシニューリン触媒サブユニット(MuramatsuおよびKincaid(1992)Biochim.Biophys Res.Comm.188:265−271(触媒サブユニットのヒト配列、GenBank登録番号S46622)、Kincaidら(1990)J.Biol.Chem.265:11312−11319(触媒サブユニットのマウス配列、GenBank登録番号J05479およびM81475);およびYY1、Shiら(1991)Cell 67:377−388(ヒト配列、GenBank登録番号Z14077)。
トランスジェニックマウスを作製するための発現クローンはまた、コード領域が、コード化タンパク質の活性に影響する1つ以上の変異を有するように構築され得る。例えば、アミノ酸75−82を欠損するCaM変異体は、野生型CaMに類似した速度論特性でCa2+に結合するが、インビトロでいくつかのCaM依存性標的酵素を活性化し得ない。Van Berkumら(1990)J.Biol.Chem.265:3750−3756。
有用な変異は、コード化タンパク質の構成的に活性な形態を生じる変異を包含する。例えば、CaMKIV、CaMKIIα、およびCaNの構成的に活性な変異形態をコードする遺伝子は、トランスジェニック動物を生産するために用いられ得る。例えば、pSR−CaMKII(1−290)と称される構築物(これは、この野生型CaMKIIの構成的に活性な短縮型変異形態を有する)が記載されている。Seiら(1991)J.Biol.Chem.266:15910−15916。
他の有用な変異には、ドミナントネガティブ変異体が含まれる。例えば、カルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼのドミナントネガティブ変異体は、短縮型であるか、またはそのカルシウムイオン感受性を喪失するがカルモジュリンに対する感受性は維持するように変異される変異体であり得る。それはまた、キナーゼ活性を喪失したが、なおカルモジュリンに結合する変異体であり得る。このような変異体は、CaMに結合するが酵素活性を欠損するので、下流の事象は影響される。
有用であるポリヌクレオチド遺伝子産物には、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の産物の発現を調節するアンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、および三重ヘリックスポリヌクレオチドが含まれる。アンチセンスポリヌクレオチドおよびリボザイムは、十分に記載される。S.T.CrookおよびB.Lebleu編、Antisense Research and Applications(1993)CRC Press;およびAntisense RNA and DNA(1988)D.A.Melton編、Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor、NY。アンチセンスRNAおよびDNA分子は、標的化されたmRNAに結合し、そしてタンパク質翻訳を妨害することにより、mRNAの翻訳を直接的に阻止するように作用する。アンチセンスポリヌクレオチドの例は、翻訳開始部位(例えば、関連ヌクレオチド配列の−10領域と+10領域との間)由来のオリゴデオキシリボヌクレオチドである。
リボザイムは、RNAの特異的切断を触媒し得る酵素的RNA分子である。リボザイム作用の機構は、相補的標的RNAに対するリボザイム分子の配列特異的相互作用、続くヌクレオチド内部分解切断を包含する。本発明の範囲内には、タンパク質複合体成分をコードするRNA配列のヌクレオチド内部分解切断を特異的かつ効率的に触媒する遺伝子操作されたハンマーヘッドまたは他のモチーフのリボザイム分子がある。
任意の可能なRNA標的内の特異的リボザイム切断部位は、標的分子を、以下の配列(GUA、GUU、およびGUC)を含むリボザイム切断部位について走査することによりまず同定される。いったん同定されると、切断部位を含有する標的遺伝子の領域に相当する、15リボヌクレオチドと20リボヌクレオチドとの間の短いRNA配列が、オリゴヌクレオチド配列を不適切とし得る推定の構造特徴(例えば、二次構造)について評価され得る。候補標的の適合性もまた、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに対するそれらの接近可能性を試験することにより評価され得る。Draper PCT WO93/23569;および米国特許第5,093,246号を参照のこと。
転写の阻害のための三重ヘリックス形成において用いられる核酸分子は、一般に、一本鎖であり、デオキシリボヌクレオチドから構成される。塩基組成は、Hoogsteen塩基対合規則によって三重ヘリックス形成を促進するように設計されなければならない。これは、一般に、プリンまたはピリミジンのいずれかの相当な大きさのストレッチが二重鎖の1つの鎖に存在することを必要とする。ヌクレオチド配列は、ピリミジンベースであり得る。これは、得られる三重ヘリックスの3つの会合された鎖を越えてTATおよびCGC+トリプレットを生じる。ピリミジンリッチ分子は、その鎖に対して平行方向にある二重鎖の単鎖のプリンリッチ領域に対する塩基相補性を提供する。さらに、例えば、G残基のストレッチを含有する、プリンリッチである核酸分子が、選択され得る。これらの分子は、GC対が豊富なDNA二重鎖と三重ヘリックスを形成する。ここでは、プリン残基の大部分が標的化された二重鎖の単鎖に位置し、三重鎖における3つの鎖を越えてGGCトリプレットを生じる。
あるいは、三重ヘリックス形成について標的化され得る可能な配列は、いわゆる「スイッチバック」核酸分子を作製することにより増大され得る。スイッチバック分子は、交互の5’−3’,3’−5’様式で合成される。これにより、それらは、まず二重鎖の一方の鎖と、次いで他方と塩基対合し、プリンまたはピリミジンのいずれかの相当の大きさのストレッチが二重鎖の一方に存在する必要性を排除する。
アンチセンスRNAおよびDNA分子、リボザイム、および三重ヘリックス分子は、DNA分子およびRNA分子の合成について当該分野で公知の任意の方法によって調製され得る。Draper、同上を参照のこと。これらは、当該分野で周知のオリゴデオキシリボヌクレオチドを化学合成するための技術を包含する。このような技術としては、固相ホスホルアミダイト化学合成が挙げられるが、それらに限定されない。あるいは、RNA分子は、アンチセンスRNA分子をコードするDNA配列のインビトロおよびインビボでの転写によって生成され得る。このようなDNA配列は、広範な種々のベクターに組み込まれ得る。このベクターは、適切なRNAポリメラーゼプロモーター(例えば、T7またはSP6ポリメラーゼプロモーター)を組み込む。あるいは、用いられるプロモーターに依存してアンチセンスRNAを構成的または誘導可能に合成するアンチセンスcDNA構築物が、細胞に安定にまたは一過的に導入され得る。
DNA分子に対する種々の周知の改変は、細胞内安定性および半減期を増大させる手段として導入され得る。可能な改変としては、分子の5’および/もしくは3’末端へのリボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドの隣接配列の付加、またはオリゴデオキシリボヌクレオチド骨格内のホスホジエステラーゼ連結よりむしろホスホロチオエートもしくは2’O−メチルの使用が挙げられるが、これらに限定されない。
肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の転写を調節する遺伝子産物は、当該分野で公知の任意の手段によって同定され得、この手段には、酵母2ハイブリッド系、当該分野で公知でそしてより詳細には以下に記載される種々の手段を含むが、これに限定されない。酵母2ハイブリッド系のような転写活性アッセイは、タンパク質−タンパク質相互作用の同定および操作を可能にする。FieldsおよびSong(1989)Nature 340:245−246。転写活性化アッセイのための概念的な基礎は、機能的に分離可能なDNA結合およびトランス活性化ドメインからなる転写因子のモジュラー特徴に対して予想される。別のタンパク質として発現された場合、これらの2つのドメインは、遺伝子転写を媒介することができない。しかし、DNA結合ドメインおよびトランス活性化ドメインがタンパク質−タンパク質相互作用を介して一緒に架橋される場合、転写活性化の能力は、回復され得る。これらのドメインに付加されたタンパク質は互いに他と相互作用し得る場合、これらのドメインは架橋され得る(例えば、融合タンパク質(ハイブリッドとして)DNA結合ドメインおよびトランス活性化ドメインを発現することにより)。ハイブリッドのタンパク質−タンパク質相互作用は、転写的にコンピテントな複合体を生成するためのDNA結合およびトランス活性化ドメインを一緒にもたらし得る。GATA4のようなシグナル伝達経路の公知の成分は、「ベイト(bait)」として作用し得、そしてDNA結合タンパク質に融合され得る。発現cDNAライブラリーが作製され得、転写性のアクチベーターに融合したタンパク質を含む融合タンパク質の発現を可能にする。次いで、GATA4に機能的に結合するタンパク質は、lacZ遺伝子の転写を開始させる。次いで、lacZ遺伝子の産物は、増殖基質へ色素生産性基質を添加することにより検出され得る。このようなアッセイを行うためのキットは市販されている。
(トランスジェニック動物作製のために用いた核酸構築物)
トランスジェニック動物生産における使用のための構築物は、動物細胞における構築物発現のためのTREおよび肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードする領域を含む。
トランスジェニック動物生産における使用のための構築物は、動物細胞における構築物発現のためのTREおよび肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードする領域を含む。
いくつかの実施態様では、トランスジェニック動物の生産における使用のための構築物は、心筋細胞において少なくとも1つの肥大感受性遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードする領域を含む。ここで、遺伝子産物をコードする領域は、遺伝子産物が心筋細胞において過剰発現されるように、異種のプロモーターに作動可能に連結される。「過剰発現」は、この遺伝子産物が、野生型における遺伝子の発現と比較した場合、またはその異種プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の発現と比較した場合、少なくとも約2倍〜約5倍、好ましくは、少なくとも約5倍〜約50倍、より好ましくは少なくとも約50倍〜約100倍、さらにより好ましくは少なくとも約100倍発現されることを示す。
他の実施態様では、トランスジェニック動物の生産に用いるための構築物は、心筋細胞において少なくとも1つの肥大感受性遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードする領域を含む。ここで、遺伝子産物をコードする領域は、コードされた遺伝子産物が心筋細胞において恒常的に活性であるように、異種のTREに作動可能に連結され、そして遺伝子産物をコードする領域は変異される。
他の実施態様において、トランスジェニック動物生産における使用のための構築物は、トランスジェニック動物の生産に用いるための構築物は、心筋細胞において少なくとも1つの肥大感受性遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードする領域を含む。ここで、遺伝子産物をコードする領域は、異種のTREに作動可能に連結され、そしてここで、遺伝子産物をコードする領域の転写は誘導性である。誘導性の系は当該分野で公知であり、本明細書において記載される。
他の実施態様において、トランスジェニック動物生産における使用のための構築物は、心筋細胞において少なくとも1つの肥大感受性遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードする領域を含む。ここで、遺伝子産物はドミナントネガティブ変異体である。
マイクロインジェクションのためのDNAクローンは、当該分野で公知の任意の手段により調製され得る。例えば、マイクロインジェクションのためのDNAクローンは、細菌のプラスミド配列を除くために適切な酵素で切断され得、そしてこのDNAフラグメントは、標準的技術を用いて電気泳動され得る。このDNAバンドを、エチジウムブロマイドを用いた染色により可視化し、発現配列を含むバンドを切り出す。次いで、切り出したバンドは、0.3M酢酸ナトリウム、pH7.0を含む透析バッグに入れる。DNAは、透析バッグ内で電気的に溶出し、1:1フェノール:クロロホルム溶液で抽出し、そして2容量のエタノールで沈殿する。このDNAを、1mlの低塩緩衝液(0.2M NaCl、20mM Tris、pH7.4および1mM EDTA)に再溶解し、そしてElute−DTMカラムで精製する。このカラムを、3mlの高塩緩衝液(1M NaCl、20mM Tris、pH 7.4、および1mM EDTA)で初回プライムし、次いで、5mlの低塩緩衝液で洗浄する。このDNA溶液を、カラムを3回通し、カラムの基質にDNAを結合させる。3mlの低塩緩衝液での1回洗浄後、このDNAを、0.4mlの高塩緩衝液で溶出し、2容量のエタノールにより沈殿する。DNA濃度をUV分光光度計において260nmの吸光度で測定する。マイクロインジェクションのために、DNA濃度を、5mM Tris、pH 7.4および0.1mM EDTA中で3μg/mlに調節する。
マイクロインジェクションのためのDNAの精製の他の方法は、Hoganら、Manipulating the Mouse Embryo(Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY、1986)、Palmiterら、Nature 300:611(1982);The Qiagenologist、Application Protocols、第3版、Qiagen、Inc.,Chatsworth CA.発行;および Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory、Cold SpringHarbor、NY,1989)に記載されている。
(細胞培養内におけるトランスジーン構築物試験)
トランスジーン構築物は、実施例に記載のように、インビトロ培養において活性について(所望ならば)試験され得る。TRE活性は、例えば、培養された心筋細胞に対して、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の転写を調節する能力が試験されるべき遺伝子に作動可能に連結されるTREを含むポリヌクレオチド構築物を導入すること、および肥大性感受性の遺伝子の発現モニタリングによって試験され得る。あるいは、TRE活性は、培養された心筋細胞に対して、検出可能な、望ましくは定量可能な、シグナルを提供するレポーター遺伝子に作動可能に連結されるTREを含むポリヌクレオチド構築物を導入することによって試験され得る。
トランスジーン構築物は、実施例に記載のように、インビトロ培養において活性について(所望ならば)試験され得る。TRE活性は、例えば、培養された心筋細胞に対して、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の転写を調節する能力が試験されるべき遺伝子に作動可能に連結されるTREを含むポリヌクレオチド構築物を導入すること、および肥大性感受性の遺伝子の発現モニタリングによって試験され得る。あるいは、TRE活性は、培養された心筋細胞に対して、検出可能な、望ましくは定量可能な、シグナルを提供するレポーター遺伝子に作動可能に連結されるTREを含むポリヌクレオチド構築物を導入することによって試験され得る。
試験されるべき配列は、レポータータンパク質をコードする適切なレポーター遺伝子に作動可能に連結されるように、ベクターに挿入され得る。これには、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、βガラクトシダーゼ(lacZ遺伝子によりコードされている)、ルシフェラーゼ(luc遺伝子によりコードされている)、アルカリホスファターゼ、グリーン蛍光タンパク質、および西洋ワサビペルオキシダーゼが挙げられるがこれに限定されない。このようなベクターおよびアッセイは、(とりわけ)商業的供給源から、容易に入手可能である。このように構築されたプラスミドは、当該分野で公知のトランスフェクション方法(例えば、リン酸カルシウム沈降、エレクトロポレーション、リポゾーム(リポフェクション)、およびDEAEデキストラン)用いてTREによりコントロールされるように、レポーター遺伝子の発現について試験するために適切な宿主細胞にトランスフェクトされる。
構築物は、構築物のそれぞれの成分を、都合の良い制限部位、制限部位を含み得る、末端に特定の配列を導入するためのPCR、などを用いることによって、プラスミドに導入する、伝統的な方法に従って調製され得る。発現構築物が調製された後に、構築物は、任意の都合のよい手段により、細胞内に導入され得る。
細胞内に発現構築物を導入するための方法には、トランスフェクション、陽イオン化合物を用いる複合、リポフェクション、エレクトロポレーションなどが挙げられる。発現構築物は、任意の送達ビヒクルとともに細胞に導入され得、これには下記のような、ウイルスおよび非ウイルス送達ビヒクルが挙げられる。細胞への発現構築物の導入後、レポーター遺伝子の発現は、伝統的手段によって決定され得る。レポーター遺伝子によりコードされたタンパク質を直接的に検出することによるか、またはレポーター遺伝子がコードする酵素の酵素産物を検出することによるかのいずれかによって、レポーター遺伝子の産物を検出する任意のアッセイは、本発明における試用に適している。アッセイとしては比色アッセイ、蛍光アッセイもしくは発光アッセイ、またはタンパク質タグの場合には、ラジオイムノアッセイもしくは他の免疫学的アッセイも挙げられる。トランスフェクション効率は、レポーター遺伝子に作動可能に連結した活性プロモーターを構成的に含む発現構築物を同時にトランスフェクトすることによってモニターされ得る。
TREレポーター遺伝子構築物内のTREの活性は、一過性の発現後に評価され得、または安定な細胞株が作製され得る。安定な細胞株が作製される場合、構築物はまた、選択遺伝子(選択可能マーカーともいう)を含む。この遺伝子は、選択的培養培地において増殖する形質転換された宿主細胞の生存または増殖のために必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含むベクターで形質転換されない宿主細胞は、培養培地中で生存しない。代表的な選択遺伝子は、抗生物質および他の毒素(例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートまたはテトラサイクリン)に対する抵抗性、相補的栄養要求性欠乏を付与するか、または複合培地から利用不可な重要栄養を供給するタンパク質をコードする。あるいは、選択可能マーカーは、TREレポーター遺伝子を含む構築物とは別々に構築物に含まれ得、そしてこの2つの構築物が宿主細胞に同時に導入される。
TREの活性を調節するための1つ以上の遺伝子産物の能力を評価するために、試験されるべき産物をコードする遺伝子を含む発現構築物は、TREレポーター遺伝子構築物に加えて、心筋細胞内に同時トランスフェクトされ得る。次いで、レポーター遺伝子の発現に対する遺伝子産物の影響は、上記のように評価され得る。
1つ以上の肥大感受性遺伝子の転写を調節するための1つ以上の遺伝子産物の能力を評価するために、肥大感受性遺伝子からのTREを含む発現構築物は、上記のように、レポーター遺伝子に作動可能に連結され得、そして上記の様に細胞内に導入され得る。1つ以上の肥大感受性遺伝子の転写を調節するための能力を試験される産物をコードする遺伝子を含む発現構築物は、細胞内に同時トランスフェクトされ得る。次いで、レポーター遺伝子の発現における遺伝子産物の影響は、上記のように評価され得る。
必要に応じて、さらなる因子が培養培地に添加され得る(例えば、アドレナリンレセプターアゴニストまたはアンタゴニストを含むが、これに限定されない、レセプターアゴニストおよびアンタゴニスト)。肥大感受性遺伝子の転写に対する影響は(あるとすれば)、上記の様に測定され得る。
本発明における使用のために適切なアゴニストおよびアンタゴニストには、アルブテロール(ALB)およびドブタミン(DOB)のようなβ1特異的アゴニスト;メトプロロール(MET)のようなβ1−特異的アンタゴニスト;フェニレフリン(PE)のようなα1特異的アゴニスト;プラゾシンのようなα1特異的アンタゴニスト;イソプロテレノール(ISO)のような混合βアゴニスト;プロパノロール(PROP)のような混合βアンタゴニスト;およびアンジオテンシンIIが挙げられるが、これに限定されない。
(細胞へのポリヌクレオチド構築物の送達)
ポリヌクレオチド構築物は、種々の経路により細胞内に導入され得る。細胞内へのポリヌクレオチドの送達のために適する送達ビヒクル(インビボか、エクスビボか、またはインビトロにかかわらず)には、ウイルスおよび非ウイルス送達ビヒクルが挙げられる。通常、ポリヌクレオチド配列は、転写的調節エレメント(TRE)および異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結される。肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードするコーディング領域を含むポリヌクレオチド、または肥大感受性遺伝子を含むポリヌクレオチドは、当該分野で周知の方法を用いてクローニングまたは発現ベクター内に含まれ得る。次いで、これらのベクター(特に発現ベクター)は、細胞内に例えば、送達する、そして/または入ることを容易にし得る任意の多くの形態をとるために操作され得る。真核生物細胞への、詳しくは哺乳動物細胞への、より詳しくは心筋細胞への本発明のポリヌクレオチド構築物の送達は、任意の適切な分野の公知の方法により成し遂げられ得る。送達は、インビボ、エクスビボまたはインビトロで成し遂げられ得る。
ポリヌクレオチド構築物は、種々の経路により細胞内に導入され得る。細胞内へのポリヌクレオチドの送達のために適する送達ビヒクル(インビボか、エクスビボか、またはインビトロにかかわらず)には、ウイルスおよび非ウイルス送達ビヒクルが挙げられる。通常、ポリヌクレオチド配列は、転写的調節エレメント(TRE)および異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結される。肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードするコーディング領域を含むポリヌクレオチド、または肥大感受性遺伝子を含むポリヌクレオチドは、当該分野で周知の方法を用いてクローニングまたは発現ベクター内に含まれ得る。次いで、これらのベクター(特に発現ベクター)は、細胞内に例えば、送達する、そして/または入ることを容易にし得る任意の多くの形態をとるために操作され得る。真核生物細胞への、詳しくは哺乳動物細胞への、より詳しくは心筋細胞への本発明のポリヌクレオチド構築物の送達は、任意の適切な分野の公知の方法により成し遂げられ得る。送達は、インビボ、エクスビボまたはインビトロで成し遂げられ得る。
宿主細胞内への導入のためのポリヌクレオチドの組み込みに適する送達ビヒクルは、非ウイルスビヒクルおよびウイルスベクターを含む。VermaおよびSomia(1997)Nature 389:239−242。
ポリヌクレオチドの送達のための広範な種々の非ウイルスビヒクルは、当該分野で公知であり、そして本発明に包含される。ポリヌクレオチドは、細胞へ、裸のDNAとして送達され得る(米国特許第5,692,622号;WO97/40163)。あるいは、ポリヌクレオチドは、広範な物質(送達の形態)を用いて、種々の経路で、関連の細胞に送達され得る。この物質は、以下を含むがこれに限定されない;陽イオン脂質;天然のポリマーおよび合成ポリマーを含む生体適合性ポリマー;リポタンパク質;ポリペプチド;ポリサッカライド;リポポリサッカライド;人工のウイルスエンベロープ;金属粒子;および細菌。送達ビヒクルは微細粒子であり得る。これらの種々の物質の混合物または結合体はまた、送達ビヒクルとして用いられ得る。ポリヌクレオチドは、送達のこれらの種々の形態と非共有結合的にまたは共有結合的に結合され得る。リポソームは、特別な細胞型へ、例えば心筋細胞へ標的化され得る。
ウイルスベクターには、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスのようなポックスウイルスおよびパルボウイルスに基づくベクターのようなDNAウイルスベクター(アデノ随伴ウイルスを含む);ならびにレトロウイルスベクターを含むがこれに限定されないRNAウイルスベクターが挙げられるがこれに限定されない。レトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルスおよびヒト免疫不全ウイルスのようなレンチウイルスが挙げられる。Naldiniら(1996)Science 272:263−267。
ポリヌクレオチドを含む非ウイルス送達ビヒクルは、例えば、リン酸カルシウム共沈殿技術によるトランスフェクション;エレクトロポレーション;電気浸透;リポソーム媒介トランスフェクション;衝撃トランスフェクション;微粒子ボンバードメント(bombardment)、ジェット注入ならびに針およびシリンジ注入を含む微粒子銃(biolistic)工程;またはマイクロインジェクションによる当該分野で公知の任意の方法によって宿主細胞および/または標的細胞に導入され得る。トランスフェクションの多数の方法は、当業者に公知である。
ウイルス送達ビヒクルは、感染により細胞に導入され得る。あるいは、ウイルスビヒクルは、細胞に送達するために、上記の任意の非ウイルス送達ビヒクルに組み込まれ得る。例えば、ウイルスベクターは、陽イオン脂質(HodgsonおよびSolaiman(1996)Nature Biotechnol.14:339−342)と、またはラメラリポソーム(Wilsonら、(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:3471;およびFallerら(1984)J.Virol.49:269)と混合され得る。
インビボ送達のために、送達ビヒクルは、それぞれ当該分野で周知の任意の多くの方法により、個体に導入され得る。
(動物供給源)
本発明のトランスジェニック動物の生産のために適切な動物は、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物であり、そしてマウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシおよびヒツジが挙げられるがこれに限定されない。
本発明のトランスジェニック動物の生産のために適切な動物は、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物であり、そしてマウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシおよびヒツジが挙げられるがこれに限定されない。
トランスジェニック実験のために適切な動物は、Charles River(Wilmington、MA)、Taconic(Germantown、NY)、およびHarlan Sprague Dawley(Indianapolis、IN)のような標準的な商業的供給源から得られ得る。例えば、トランスジェニック動物がマウスである場合、多くのマウス系統が適切であるが、C57BL/6雌性マウスが胚回収および移入に好ましい。C57BL/6雄性マウスは、交配のために使用され得、そして精管切除されたC57BL/6繁殖用雄性マウスは、偽妊娠を刺激するために用いられ得る。精管切除されたマウスおよびラットは、供給業者から得られ得る。
(トランスジェニック動物)
トランスジェニック動物は、マイクロインジェクション法、および胚性幹細胞法を含む任意の公知の手順によって作製され得る。げっ歯類の胚の操作のためおよびDNAのマイクロインジェクションのための手順は、その教示が一般に公知でありそして本明細書において援用されている、Hoganら、Manipulating the Mouse Embryo(Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY、1986)に詳細に記載されている。
トランスジェニック動物は、マイクロインジェクション法、および胚性幹細胞法を含む任意の公知の手順によって作製され得る。げっ歯類の胚の操作のためおよびDNAのマイクロインジェクションのための手順は、その教示が一般に公知でありそして本明細書において援用されている、Hoganら、Manipulating the Mouse Embryo(Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY、1986)に詳細に記載されている。
マイクロインジェクションの例として、6週齢の雌性マウスは、妊娠牝馬血清ゴナドトロピン(PMSG;Sigma)の5IU注入(0.1cc腹腔内)、次いで、48時間後のヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG;Sigma)の5IU注入(0.1cc、腹腔内)により、過剰排卵させるために導入される。hCG注入直後にメスをオスと一緒におく。hCG注入21時間後、交配したメスを、CO2窒息または頚椎脱臼により屠殺し、そして取り出した卵管から胚を回収し、そして0.5%ウシ血清アルブミン(BSA,Sigma)含有ダルベッコリン酸緩衝液化生理食塩水に入れる。周囲の丘細胞をヒアルロニダーゼ(1mg/ml)で除去する。次いで、前核胚を洗浄し、0.5%BSA含有Earle‘s平衡化塩溶液(EBSS)に入れて、注入時まで、5%CO2、95%空気の湿潤環境で37.5℃インキュベーターに入れる。胚は、2細胞期で移植され得る。
性周期を一致させていない(randomly cycling)成体雌性マウスを、精管切除雄性マウスとつがいにする。C57BL/6もしくはSwissマウスまたは他の匹敵する系統がこの目的に用いられ得る。レシピエント雌性マウスをドナーマウスと同時につがいにする。胚移入の時に、レシピエント雌性マウスを体重1グラムあたり0.015mlの2.5%アベリチンの腹腔内注入で麻酔する。卵管を一ヶ所の背面正中線切開により露出する。次いで、切開を、卵管を直接超えて体壁を介して行う。次いで、卵巣嚢を時計用のピンセットで裂く。移入する胚を、DPBS(ダルベッコリン酸緩衝液化生理食塩水)に入れ、そして移入ピペットのチップに入れる(約10〜12胚)。このピペットチップを卵管漏斗に挿入し、胚を移入する。移入後、切開を2つの縫合により閉じる。
(トランスジェニック動物の同定と特徴づけ)
トランスジェニック動物は、それらのDNAを分析することにより同定され得る。この目的のため、トランスジェニック動物がげっ歯類である場合、尾のサンプル(1〜2cm)は、3週齢の動物から切り取られ得る。次いで、これらまたは他のサンプルからのDNAを調製し、サザーンブロット、PCRまたはスロットブロットにより分析して、トランスジェニック創始(F0)動物およびそれらの子孫(F1およびF2)を検出する。
トランスジェニック動物は、それらのDNAを分析することにより同定され得る。この目的のため、トランスジェニック動物がげっ歯類である場合、尾のサンプル(1〜2cm)は、3週齢の動物から切り取られ得る。次いで、これらまたは他のサンプルからのDNAを調製し、サザーンブロット、PCRまたはスロットブロットにより分析して、トランスジェニック創始(F0)動物およびそれらの子孫(F1およびF2)を検出する。
(1.病理学的研究)
トランスジーンを有する種々のF0、F1およびF2動物は、免疫組織学、電子顕微鏡、心電図ならびに心臓全体および心臓の一部分の重量の測定、心筋細胞の断面積測定および心筋細胞数の決定を含む、任意の種々の技術により分析され得る。適切な特異性の抗体を用いることによるトランスジーンの発現のための免疫組織学的な分析は、公知の方法を用いて実行され得る。部分重量、心筋細胞断面積および心筋細胞核数を決定するための形態測定的分析は、公知の方法を用いて実行され得る。心臓は、胎仔の心臓遺伝子の機能、組織学、および発現のために分析され得る。
トランスジーンを有する種々のF0、F1およびF2動物は、免疫組織学、電子顕微鏡、心電図ならびに心臓全体および心臓の一部分の重量の測定、心筋細胞の断面積測定および心筋細胞数の決定を含む、任意の種々の技術により分析され得る。適切な特異性の抗体を用いることによるトランスジーンの発現のための免疫組織学的な分析は、公知の方法を用いて実行され得る。部分重量、心筋細胞断面積および心筋細胞核数を決定するための形態測定的分析は、公知の方法を用いて実行され得る。心臓は、胎仔の心臓遺伝子の機能、組織学、および発現のために分析され得る。
(2.mRNAレベル測定によるトランスジーン発現の分析)
メッセンジャーRNAは、当該分野で公知の任意の方法(グアニジニウム酸チオシアネート−フェノール:クロロホルム抽出法(ChomczynskiおよびSacchi(1987)Anal.Biochem.162:156〜159)が挙げられるが、これに限定されない)によりトランスジェニック動物の細胞株および組織から単離され;ノーザンブロット、RNAse、定量的PCRおよびヌクレアーゼ保護アッセイにより発現レベルを決定が決定され得る。
メッセンジャーRNAは、当該分野で公知の任意の方法(グアニジニウム酸チオシアネート−フェノール:クロロホルム抽出法(ChomczynskiおよびSacchi(1987)Anal.Biochem.162:156〜159)が挙げられるが、これに限定されない)によりトランスジェニック動物の細胞株および組織から単離され;ノーザンブロット、RNAse、定量的PCRおよびヌクレアーゼ保護アッセイにより発現レベルを決定が決定され得る。
(3.タンパク質レベル測定によるトランスジーン発現の分析)
タンパク質レベルは、当該分野で公知の任意の手段により測定され得る。この手段には、トランスジーンによってコードされたタンパク質に特異的な1つ以上の抗体を使用するウエスタンブロット分析、ELISAおよびラジオイムノアッセイが挙げられるが、これに限定されない。
タンパク質レベルは、当該分野で公知の任意の手段により測定され得る。この手段には、トランスジーンによってコードされたタンパク質に特異的な1つ以上の抗体を使用するウエスタンブロット分析、ELISAおよびラジオイムノアッセイが挙げられるが、これに限定されない。
ウエスタンブロット分析のために、タンパク質画分は、例えば、Harlowら Antibodies:A Laboratory Manual、(Cold Spring Harbor、NY、1988)によって記載されたように、組織ホモジネートおよび細胞溶解物から単離され得、そしてウエスタンブロット分析に供され得る。
例えば、タンパク質画分は、Laemmliサンプル緩衝液中で変性され得、そしてSDSポリアクリルアミドゲル上で電気泳動され得る。次いで、タンパク質を、電気ブロッティングによりニトロセルロースフィルターに転写する。このフィルターをブロックし、一次抗体とともにインキュベートし、そして最後に酵素と結合した二次抗体と反応させる。適切な色素生産性基質との次のインキュベーションは、トランスジーンにコードされたタンパク質の位置を表す。
(交雑トランスジェニック動物)
本発明は、さらに、本発明のトランスジェニック動物と第二の動物との間の交雑の子孫であるトランスジェニック非ヒト動物を、提供する。本発明のトランスジェニック動物は、肥大応答に影響し、そしてまた薬剤の標的としても働き得る他の因子を同定するために他の動物とともに飼育され得る。トランスジェニック動物は、ある遺伝子産物に対する別の遺伝子産物の効果を試験するため、または2つの遺伝子産物の組み合わせ効果を試験するために、他のトランスジェニック動物とともに飼育され得る(ここで、この2つのトランスジェニック動物は、異なるトランスジーンを用いて生み出されたている)。
本発明は、さらに、本発明のトランスジェニック動物と第二の動物との間の交雑の子孫であるトランスジェニック非ヒト動物を、提供する。本発明のトランスジェニック動物は、肥大応答に影響し、そしてまた薬剤の標的としても働き得る他の因子を同定するために他の動物とともに飼育され得る。トランスジェニック動物は、ある遺伝子産物に対する別の遺伝子産物の効果を試験するため、または2つの遺伝子産物の組み合わせ効果を試験するために、他のトランスジェニック動物とともに飼育され得る(ここで、この2つのトランスジェニック動物は、異なるトランスジーンを用いて生み出されたている)。
いくつかの実施態様において、第1のトランスジェニック動物は、異種の心筋細胞特異的TREに作動可能に連結された少なくとも1つの心臓肥大感受性遺伝子の転写を増加する遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドをトランスジーンとして含む(ここでトランスジーンの発現は胚致死的であるか、またはそうでなければ動物が分析に十分な期間、生存しないように有害である)。トランスジーンは、トランスジーンが所望されるまで実質的に発現されないように、誘導性プロモーター(例えば上記のtet誘導性システム)の転写制御下におかれ得る。このような動物は、トランスジーンとして、テトラサイクリン制御下にtTAを含むポリヌクレオチドを含むtTA構成的「創始(founder)」トランスジェニック動物と交雑させられ得る。
他の実施態様では、第1のトランスジェニック動物(第1の動物が心臓肥大の1つ以上の症状を示すように、異種の心筋細胞特異的TREに作動可能に連結された少なくとも1つの心臓肥大感受性遺伝子の転写を増加させる遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを、トランスジーンとして含む)は、少なくとも1つの心臓肥大感受性遺伝子の転写を増加する遺伝子産物のドミナントネガティブ変異体をトランスジーンとして含む第2のトランスジェニック動物と交雑される。このような交雑の子孫は、心臓肥大に関する1つ以上の症状の軽減を示す。
他の実施態様では、第1のトランスジェニック動物(第1の動物が心臓肥大の症状を示さず、そして心臓肥大の発症に対して実質的に抵抗性であるよう異種の心筋細胞特異的TREに作動可能に連結された少なくとも1つの心臓肥大感受性遺伝子の転写を減少または抑制する遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを、トランスジーンとして含む)は、少なくとも1つの心臓肥大感受性遺伝子の転写を増加する遺伝子産物の構成的に活性な変異体をコードするポリヌクレオチドをトランスジーンとして含む第2のトランスジェニック動物と交雑される。
他の実施態様では、少なくとも1つの心臓肥大感受性遺伝子の転写を調節する遺伝子産物へ標的されるアンチセンスポリヌクレオチドであるポリヌクレオチドを、トランスジーンとして含む第1のトランスジェニック動物は、少なくとも1つの心臓肥大感受性遺伝子の転写を増加する遺伝子産物の構成的に活性な変異体をコードするポリヌクレオチドをトランスジーンとして含む第2のトランスジェニック動物と交雑される。ここで、このアンチセンスポリヌクレオチドは、第2のトランスジェニック動物のトランスジーンの発現を阻害する。
(心臓肥大の処置のための物質のスクリーニング)
トランスジェニック動物、トランスジェニック動物から単離された動物細胞、または単離された酵素は、心臓肥大の処置における潜在的な効果について物質をスクリーニングするために用いられ得る。
トランスジェニック動物、トランスジェニック動物から単離された動物細胞、または単離された酵素は、心臓肥大の処置における潜在的な効果について物質をスクリーニングするために用いられ得る。
(酵素ベースのスクリーニングアッセイ)
酵素ベースのスクリーニングアッセイにおいて、心筋細胞において肥大シグナルへの応答に関与する、実質的に単離された酵素を、試験する物質と接触させる。酵素の活性は、物質の存在下で、適切な時間後に測定される。酵素アゴニストまたはアンタゴニストの候補と酵素との相互作用のための十分な時間および条件は、酵素で変わる。しかし、通常、結合に適切な条件は、約4℃と約40℃との間で、好ましくは4℃と37℃の間で;適切なイオンを適切な濃度範囲(この条件は所定の酵素によって変化し得る;そしてpH5から9の間のpH範囲にある)に含む緩衝液中で生じる。結合と反応のために十分な時間は、通常、曝露後、約1ミリ秒と約24次間の間である。
酵素ベースのスクリーニングアッセイにおいて、心筋細胞において肥大シグナルへの応答に関与する、実質的に単離された酵素を、試験する物質と接触させる。酵素の活性は、物質の存在下で、適切な時間後に測定される。酵素アゴニストまたはアンタゴニストの候補と酵素との相互作用のための十分な時間および条件は、酵素で変わる。しかし、通常、結合に適切な条件は、約4℃と約40℃との間で、好ましくは4℃と37℃の間で;適切なイオンを適切な濃度範囲(この条件は所定の酵素によって変化し得る;そしてpH5から9の間のpH範囲にある)に含む緩衝液中で生じる。結合と反応のために十分な時間は、通常、曝露後、約1ミリ秒と約24次間の間である。
試験される物質の存在下の酵素活性は、試験される物質の非存在下での活性と比較される。測定される活性の増加または減少は、物質が、心臓肥大が誘導する機能不全の軽減に用いるために適切であることの指標である。測定される活性が、試験される物質の非存在下で測定された酵素活性の活性と比べて、少なくとも約2倍、より好ましくは、少なくとも約5倍、より好ましくは少なくとも約10倍またはより多く増加されるかまたは減少される場合、物質は、酵素活性に対して効果を有すると考えられる。このような物質は、以下に記載のように、細胞ベースのアッセイおよび/または動物そのものがベースのアッセイでさらに試験され得る。
心筋細胞における肥大シグナルへの応答に関与する酵素には、カルシニューリン、CaMKIV、CaMKIIα、p38、YY1、CaMKキナーゼ、およびMKK6が挙げられるがこれに限定されない。酵素は、それらの天然形態で;変化した酵素活性および/またはインビトロ安定性または溶解性を有する変異した形態で;酵素の調節または他の成分を欠いている変異体形態で用いられ得る;しかし、(インビトロ安定性を付与するため、固体支持体への付着を容易にするため、抗原決定基を提供するためなどのために、別の分子と共有結合的にまたは非共有結合的に会合した)酵素は、肥大シグナルへの応答に関する酵素活性を保持している。この酵素は、検出シグナルまたは他の機能的な部分の産生を可能にする標識と結合され得る。適切な標識には、放射性核種、他の酵素、基質、コファクター、インヒビター、蛍光性色素、化学発光性色素、生物発光性化合物および磁気粒子が挙げられるがこれに限定されない。
好ましくは、スクリーニングアッセイにおける使用について、酵素は実質的に精製される。「実質的に単離した」または「精製した」酵素は、自然状態で関連している物質(material)、特に他のタンパク様の物質(material)、または肥大シグナルに対する応答に関連した酵素的活性を阻害し得る物質が実質的にない酵素である。実質的にないとは、自然状態で関連する物質が、少なくとも50%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、およびなおより好ましくは少なくとも90%ないことを意味する。本明細書中に使用される「実質的に単離した」酵素はまた、以下の起源または操作による組換え体酵素を言う:(1)自然状態で関連する酵素の全てまたは一部と関連していない、(2)自然状態で連結しているポリペプチド以外のポリペプチドに連結されるか、または(3)自然状態で生じない。
これらのアッセイにおける使用のための酵素は、当該分野において公知の任意の方法(天然の供給源、化学合成、または組換え技術を含むがこれらに限定されない)により得られ得る。本発明のスクリーニングアッセイにおける使用のための酵素は、任意の公知の方法で精製され得る。広範な種々の方法は当該分野において公知である。例えば、Protein Purification:Principles and Practice,R.Scopes編(1987)Springer−Verlagを参照のこと。
酵素活性は任意の公知の方法で測定され得る。例えば、p38のキナーゼ活性は、この酵素をタンパク質基質およびγ32p−ATPとともにインキュベートして、そして例えばシンチレーション計数によるこの基質への32P取り込みを検出することにより測定され得る。p38キナーゼ活性についてのアッセイは記述された。例えば、PCT公開番号WO 98/27098を参照のこと。
(細胞ベースのスクリーニングアッセイ)
本発明の細胞ベースのスクリーニングアッセイにおいて、試験される化合物は、期間中、種々の用量で、細胞の培養培地中に導入され、次にこの細胞は1つ以上の機能(肥大感受性遺伝子の発現レベルにおける変化、肥大感受性遺伝子のポリペプチド産物のレベルにおける変化、および細胞サイズおよび/または形態における変化を含むがこれらに限定されない)について試験される。
本発明の細胞ベースのスクリーニングアッセイにおいて、試験される化合物は、期間中、種々の用量で、細胞の培養培地中に導入され、次にこの細胞は1つ以上の機能(肥大感受性遺伝子の発現レベルにおける変化、肥大感受性遺伝子のポリペプチド産物のレベルにおける変化、および細胞サイズおよび/または形態における変化を含むがこれらに限定されない)について試験される。
化合物の治療的潜在性を測定するためのスクリーニングアッセイは、細胞培養物中で開示した導入遺伝子構築物についてのトランスジェニック動物由来の、ならびにこの開示した構築物で安定的にまたは一過性にトランスフェクトした動物細胞を使用して行われ得る。細胞ベースのスクリーニングアッセイはまた、初代細胞(例えば、非トランスジェニック動物由来の心筋細胞)を使用して実施され得、この細胞は、ポリヌクレオチド構築物で安定にまたは一過性にトランスフェクトされるか、あるいはアンジオテンシンIIまたはα−アドレナリンアゴニストのような肥大シグナルで刺激される。
肥大感受性遺伝子のポリペプチド産物のレベルにおける変化を検出するために、種々のアッセイ法が使用されるが、この各々は当該分野において公知である。例えば、肥大感受性遺伝子の1つ以上のポリペプチド産物について特異的な1つ以上の抗体を使用して、ELISAのような免疫学的アッセイが使用され得る。
肥大感受性遺伝子の発現レベルにおける変化を検出するために、以下を含むがこれらに限定されない任意の公知の方法が使用され得る:この遺伝子のRNA産物に相補的なポリヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーション;およびこの遺伝子のRNA産物のcDNAコピーの伸長をプライムするオリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応。幾つかの肥大感受性遺伝子のヌクレオチド配列が開示された。そしてこの情報を使用して、オリゴヌクレオチドプライマーを設計し得る。
あるいは、この細胞はTRE、特に肥大感受性遺伝子由来のTREに作動可能に連結したレポーター遺伝子を含むレポーター遺伝子構築物でトランスフェクトされ得る。これらのアッセイにおいて、これらのアッセイからの読み出しは、活性レポーター遺伝子産物のレベルである。幾つかの肥大感受性遺伝子の5’隣接領域のヌクレオチド配列は開示された。そしてこれを使用し、レポーター遺伝子に作動可能に連結した心臓肥大感受性遺伝子TREを含む構築物を産生し得る。例えばこのようなヌクレオチド配列には、ラットANF5’隣接配列(GenBank受託番号J03267);およびマウスβ−MHC5’隣接配列(GeneBank受託番号U86076)が挙げられる。
本明細書中に記載される細胞ベースのスクリーニングアッセイは一次スクリーニング用に使用され得るか、あるいは二次スクリーニング用に使用され、上述の酵素ベースのスクリーニングで活性である化合物をさらに試験し得る。
これらのアッセイについて、適切な細胞には、以下があるがこれらに限定されない:トランスジェニックまたは非トランスジェニック動物のいずれかから単離した初代心筋細胞。細胞ベースのスクリーニングアッセイにおける使用に適切な他の細胞には、線維芽細胞のような非心筋細胞細胞型が挙げられる。
幾つかの実施態様において、細胞は、レポーター遺伝子と作動可能に連結した肥大感受性遺伝子由来のTREを含有する構築物でトランスフェクトされる。レポーター遺伝子は、当該分野において公知であり、上述される。1つの例はグリーン蛍光タンパク質(GFP)およびその改変体がある。例えば、HeimおよびTsien(1996)Curr.Biol.6:178−182;Mitraら(1996)Gene 173:13−17;およびYangら(1996)Nucl.Acids Res.24:4592−4593を参照のこと。次にトランスフェクトした細胞を96ウェル培養ディッシュに、適切な培養培地(例えば、ダルベッコ最小必須培地および10%ウシ胎仔血清)中に、1ウェルあたり1.5〜2.5×104細胞で配置する。5%二酸化炭素で平衡化したインキュベーター中37℃で一晩インキュベーション後、培地を除去して、試験される化合物を含む培地で置換し、そして適切な期間にわたってインキュベートする。本発明について、試験される物質を用いるインキュベーションについての適切な期間は、約0.5時間〜約24時間であり得る。試験化合物に加えて、肥大誘導物質は培養培地に添加される。肥大誘導物質が試験物質の添加と同時、前または後に添加され得る。肥大誘導物質には、アンジオテンシンIIおよびPEが挙げられるがこれら限定されない。試験される化合物を含むストックは、まず適切な溶媒中に調製される。この試験化合物の幾つかの希釈液が試験される。適切なコントロールには、試験物質を含まない溶媒が添加される細胞、ならびに試験物質が添加されたが、肥大誘導物質は添加されない細胞が挙げられる。
処理後、試験化合物の効果は、レポーター遺伝子産物についての適切なアッセイを使用して測定される。
使用され得るレポーター遺伝子は周知であり、以下を含むがこれらに限定されない:ルシフェラーゼ;グリーン蛍光タンパク質(GFP)、例えば、Aequorea victoria由来のGFP、または当該分野で公知の任意の種々のGFP;β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ;ヒト成長ホルモンのような免疫学的に検出可能なタンパク質「タグ」など。例えば、Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubelら,編、1987)および定期的な改訂版を参照のこと。
レポーター遺伝子によりコードされるタンパク質を直接検出するか、またはレポーター遺伝子がコードする酵素の酵素的産物を検出するかのいずれかにより、レポーター遺伝子の産物を検出する任意のアッセイは、本発明の使用に適切である。アッセイには、比色定量的、蛍光定量的、または発光アッセイがあり、あるいはなおタンパク質タグの場合には、ラジオイムノアッセイまたは他の免疫学的アッセイがある。
物質は、作動可能に連結したレポーター遺伝子の転写が細胞中、この物質を露出しなかったコントロール細胞と比較して、少なくとも約2倍、より好ましくは少なくとも約5倍、より好ましくは少なくとも約10倍以上増加または減少する場合、効果を有すると考えられる。
この物質の細胞傷害性効果は、当該分野において公知の任意の手段により測定され得る。例えば、この物質の細胞傷害性効果は、Hansenら,(1989)J.Immunol.Method.119:203−210の方法の改変により測定され得る。組織培養ディッシュに残存する細胞に、25μlの3,(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)ストック溶液(5mg/ml)を最終濃度の1mg/mlまで添加する。細胞は37℃で1時間インキュベートされ、そして細胞活性は等量のMTT溶解緩衝液(50%ジメチルホルムアミド中20%w/vドデシル硫酸ナトリウム、pH4.7)を添加することにより停止される。完全な抽出は室温で一晩振盪することにより達成される。OD562nmとOD650nmとの差異は、Molecular Device UVmaxマイクロプレートリーダー、または細胞生存度のインジケーターのような等価物で測定される。細胞生存度についての他のアッセイとしてはトリパンブルー排除が挙げられる。
(動物そのものがベースのスクリーニングアッセイ)
本発明の動物そのものがベースのスクリーニングアッセイにおいて、この化合物は、期間中、種々の用量で本発明のトランスジェニック動物に投与され、次いでこの動物は、以下を含むがこれらに限定されない種々のパラメーターにより測定されるように、心機能について試験される:左心室質量:体重比;心筋細胞サイズおよび組織化;心臓肥大感受性遺伝子発現;心機能;dP/dT;類線維沈着物;カルシウムイオン束密度;脈拍長;ならびに心室拍出量。動物そのものがベースのアッセイは、一次スクリーニングとして使用され得るか、または二次スクリーニングとしてとして使用され、酵素および/または細胞ベースのスクリーニングで同定された物質をさらに評価し得る。幾つかの実施態様において、本発明のトランスジェニック動物の一部は、インビトロスクリーニングアッセイに使用され得る。例えば、トランスジェニック動物から単離した心臓は、インビトロスクリーニングアッセイに使用され得る。測定され得るパラメータ−は、動物そのものでの薬物スクリーニングに関するパラメーターである。
本発明の動物そのものがベースのスクリーニングアッセイにおいて、この化合物は、期間中、種々の用量で本発明のトランスジェニック動物に投与され、次いでこの動物は、以下を含むがこれらに限定されない種々のパラメーターにより測定されるように、心機能について試験される:左心室質量:体重比;心筋細胞サイズおよび組織化;心臓肥大感受性遺伝子発現;心機能;dP/dT;類線維沈着物;カルシウムイオン束密度;脈拍長;ならびに心室拍出量。動物そのものがベースのアッセイは、一次スクリーニングとして使用され得るか、または二次スクリーニングとしてとして使用され、酵素および/または細胞ベースのスクリーニングで同定された物質をさらに評価し得る。幾つかの実施態様において、本発明のトランスジェニック動物の一部は、インビトロスクリーニングアッセイに使用され得る。例えば、トランスジェニック動物から単離した心臓は、インビトロスクリーニングアッセイに使用され得る。測定され得るパラメータ−は、動物そのものでの薬物スクリーニングに関するパラメーターである。
(肥大シグナルの応答に関する酵素と相互作用するタンパク質を検出するアッセイ)
上述の酵素ベースのスクリーニングアッセイに使用する酵素標的はまた、他の因子(この酵素標的と相互作用するポリペプチドであり得る)を同定するに有用である。次に、このような因子は、心臓肥大が誘導する機能不全の処置における治療標的としてそれらの有用性が評価され得る。このような因子はまた、この標的遺伝子産物の生物学的機能を調節する潜在的な役割について分析され得る。
上述の酵素ベースのスクリーニングアッセイに使用する酵素標的はまた、他の因子(この酵素標的と相互作用するポリペプチドであり得る)を同定するに有用である。次に、このような因子は、心臓肥大が誘導する機能不全の処置における治療標的としてそれらの有用性が評価され得る。このような因子はまた、この標的遺伝子産物の生物学的機能を調節する潜在的な役割について分析され得る。
任意の公知の方法が使用され、酵素標的と相互作用するポリペプチドを同定し得る。適切なアッセイには、インビトロおよびインビボアッセイが挙げられる。インビトロアッセイには、共沈降、タンパク質相互作用トラップ、およびELISAが挙げられるがこれらに限定されない。アッセイは、標的遺伝子産物と結合し、標的遺伝子産物と相互作用する他の細胞性または細胞外タンパク質と結合し、そして標的遺伝子産物の他の細胞性タンパク質との相互作用を妨害する化合物を同定するように設計され得る。
タンパク質相互作用トラップの実施例として、酵母ツーハイブリッドスクリーニングが、ベイトにマウスGATA4を使用して行われ、記述のとおり成体心筋層中の潜在的相互作用因子を同定し得る。Molkentinら(1998)Cell 93:215−228。この実施例において、GATA4ベイトは、インフレームでGAL4 DNA結合ドメインと融合したアミノ酸130−409を含む。GATA4のこの領域は、二つのジンクフィンガードメインを包囲し、PstI−NsiIフラグメント(pAS酵母発現ベクター中でPstI部位にクローン化された)内にコードされる。pAS−GATA4は、ランダムcDNAと融合したGAL4活性化ドメインを含む成体マウス心臓ライブラリーを用いて酵母中に同時形質転換され、5百万を超える一次コロニーは、陽性の相互作用についてスクリーニングされた。約100の陽性酵母コロニーは、最初に同定された。それぞれ個々のコロニーから、活性化プラスミドがレスキューされ、このcDNA挿入物は配列決定された。アンチセンス配向で、またはアウトオブフレームでcDNA挿入物を含むクローンは処分した。この残りのクローン(約21)を酵母に形質転換し直し、特異性について試験した。
結合特異性は、以下の判定基準を使用して決定され得る:1)この単離したクローンは、本来のベイトとの相互作用を再利用するはずである;2)この単離したクローンは、このGAL4−E12融合の場合、非特異的ベイトと相互作用しないはずである。特異性のさらなる試験として、高程度のアミノ酸配列相同性を占める関連タンパク質との相互作用を試験し得る。
(トランスジェニック動物またはこれに由来する細胞の使用)
本発明に従って生産したトランスジェニック動物は、ヒト医薬に適用できる改善された治療処置または診断方法を開発する目的で、肥大型心筋症の処置および/または肥大型心筋症に関連した調査用の物質または潜在薬物をスクリーニング、および同定または試験するために特に有用である。
本発明に従って生産したトランスジェニック動物は、ヒト医薬に適用できる改善された治療処置または診断方法を開発する目的で、肥大型心筋症の処置および/または肥大型心筋症に関連した調査用の物質または潜在薬物をスクリーニング、および同定または試験するために特に有用である。
試験される物質には、天然の物質および合成物質が挙げられる。これらの物質には、種々のコア構造に基づく天然および合成の無機および有機化合物のみでなく、オリゴペプチドおよびオリゴヌクレオチドのようなオリゴマーが挙げられる。種々の天然の供給源は、ジャングルおよび海洋などに見出されるものを含む活性化合物についてスクリーニングされ得る。さらに化合物のコンビナトリアルライブラリーが、産生され、試験され得る。遺伝子産物、特に心臓肥大感受性遺伝子の転写の調節に関する遺伝子のポリペプチドに対する抗体はまた、試験用に含まれる。
(心臓肥大または心不全の処置に有用な物質を含む組成物)
本発明は、心臓肥大が誘導する機能不全の処置に使用するための物質を含む組成物を提供する。本発明の目的のための、心臓肥大が誘導する機能不全の処置に使用するための物質は、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の活性産物のレベルを調節する物質である。適切な物質には、以下の天然または合成の有機または無機の化合物が挙げられる:1)肥大感受性遺伝子の発現を調節する;2)遺伝子産物が肥大感受性遺伝子の発現を調節するこの遺伝子の発現を調節する;および/または3)肥大感受性遺伝子の発現を調節する遺伝子産物の活性を調節する。「物質」にはまた、以下のポリヌクレオチドが挙げられる:1)肥大感受性遺伝子の発現を調節する;2)遺伝子産物が肥大感受性遺伝子の発現を調節するこの遺伝子の発現を調節する;3)肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の活性産物のレベルを調節する。
本発明は、心臓肥大が誘導する機能不全の処置に使用するための物質を含む組成物を提供する。本発明の目的のための、心臓肥大が誘導する機能不全の処置に使用するための物質は、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の活性産物のレベルを調節する物質である。適切な物質には、以下の天然または合成の有機または無機の化合物が挙げられる:1)肥大感受性遺伝子の発現を調節する;2)遺伝子産物が肥大感受性遺伝子の発現を調節するこの遺伝子の発現を調節する;および/または3)肥大感受性遺伝子の発現を調節する遺伝子産物の活性を調節する。「物質」にはまた、以下のポリヌクレオチドが挙げられる:1)肥大感受性遺伝子の発現を調節する;2)遺伝子産物が肥大感受性遺伝子の発現を調節するこの遺伝子の発現を調節する;3)肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の活性産物のレベルを調節する。
物質の「有効量」は、本発明の方法により処置される心臓肥大性または他の状態の改善または緩和を達成するために必要な物質の量である。
本発明はまた、心臓肥大を処置する公知の物質の使用を包含する。このような物質には、カルシニューリンインヒビターFK506およびシクロスポリンならびに関連薬物が挙げられるが、これらに限定されない。これらの薬物は、移植患者において免疫抑制剤として慣用的に使用されるが、心臓肥大または心不全の処置にはまだ使用されていない。「シクロスポリン」はサイクリックウンデカペプチドである。CaNのホスファターゼ活性を阻害する種々のシクロスポリンは記述されており、用語「シクロスポリン」中に包含される。これらは以下を含むがこれらに限定されない:シクロスポリンA;(O−(2−ヒドロキシエチル)−D−ser)8および(3’−デスヒドロキシ(deshydroxy)−3’−ケト−MeBmt)1−(Val)2誘導体(米国特許第5,284,826号および同第5,525,590号)を含むがこれらに限定されないシクロスポリンAの誘導体;ならびにシクロスポリンG。本発明の処置方法の使用に適切であり得るシクロスポリンの薬学的処方物には、以下に記載の処方物が挙げられるがこれらに限定されない:英国特許出願第GB2,257,359号;PCT公開番号WO 95/34285およびWO 97/07787;ならびに米国特許第5,739,105号および同第5,641,745号。FK596は大環状ラクトンである。本明細書中に使用の用語「FK506」には、FK506、ならびに米国特許第5,530,120号および同第5,493,019号に開示された誘導体を含むがこれらに限定されないCaNのホスファターゼ活性を阻害する誘導体が挙げられる。CaMKIVのキナーゼ活性を阻害するKN62、KN93および関連薬物を含むCaMKIVのインヒビターである物質がまた含まれる。PCT公開番号WO 98/27098に記載されるようなp38キナーゼのインヒビターもさらに含まれる。
心臓肥大および心不全の処置について潜在性を有する物質には、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の転写を通常抑制する1つ以上の遺伝子産物の発現を増大し、これにより肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の発現を減少する物質が挙げられる。例えば、転写因子YY1は心臓肥大応答性遺伝子の一般的なリプレッサーであることが発見された。培養心筋細胞中のYY1の過剰発現は心臓肥大を予防し、全ての肥大感受性遺伝子発現を封じる。次にYY1の調節因子である物質は、心臓肥大、心筋細胞増殖、および心機能を調節するに潜在的に使用され得る。さらなる例として、構成的な活性CaMKIIαは、心筋細胞培養中全ての肥大感受性遺伝子を封じる。CaMKIIαを活性化する物質は心臓肥大を調節する能力を有する。
心臓肥大および心不全の処置の潜在能力を有する物質はまた、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の転写を通常増加させる1つ以上の遺伝子産物の発現を減少し、これにより肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の発現を減少する物質を含む。
本発明の範囲内の組成物には、活性成分が、処置される状態の症状を緩和するに効果的な量で含まれる。この有効量の決定は、経験的に当業者により容易に行われ得る。
本発明の物質は、単独でまたは以下を含む他の薬物治療と共に投与され得る:β−アドレナリンレセプターアンタゴニスト、エンドセリンレセプターアンタゴニスト、およびACEインヒビターなど。ACEインヒビターには、商標Accupril(登録商標)、Altace(登録商標)、Capoten(登録商標)、Lotensin(登録商標)、Monopril(登録商標)、Prinivil(登録商標)、Vasotec(登録商標)およびZestril(登録商標)により命名された薬物が挙げられる。
薬学的組成物は、物質を使用して、または物質を適切なキャリア(これ自体免疫学的アジュバントであり得る)と組み合せることにより調製される。これらの組成物は、意図した目的を達成する任意の方法により投与され得る。例えば、投与は、皮下、皮膚、静脈内、皮内、筋肉内、または腹腔内であり得る。
投与される物質の量、ならびに投与の頻度は、年齢、性別、受容者の健康および体重、ならびに所望される効果の性質による。
本発明のスクリーニング方法により同定される物質に加えて、これらの薬学的組成物は、この活性化合物の薬学的に使用され得る調製物への加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む、適切な薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。好ましくは、この調製物、特に経口的に投与され得、かつ錠剤、糖剤、およびカプセル剤のような好ましい型の投与で使用され得る調製物、およびまた坐剤のような直腸に投与され得る調製物、ならびに注射によるまたは経口的な投与に適切な溶液は、賦形剤と共に、約0.1〜99重量%、および好ましくは約25〜85重量%の活性成分を含む。
本発明の薬学的調製物は、それ自体公知である方法で、例えば従来の混合、顆粒形成、糖剤生成、溶解、または凍結乾燥プロセスにより製造される。従って、経口使用のための薬学的調製物は、所望されるか必要であれば、適切な補助剤を添加後、この活性化合物を固体賦形剤と組み合せ、必要に応じて得られる混合物を粉砕し、そしてこの混合物の顆粒を加工し、錠剤または糖剤コアを得ることにより得られ得る。
適切な賦形剤は特に、糖(例えば、ラクトース、ショ糖、マンニトール、またはソルビトール)のような充填剤、セルロース調製物および/またはリン酸カルシウム(例えばリン酸トリカルシウム、またはリン酸水素カルシウム)、ならびにスターチペースト(例えば、トウモロコシスターチ、コムギスターチ、コメスターチ、ジャガイモスターチ)、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および/またはポリビニルピロリドンのような結合剤である。所望であれば、崩壊剤(例えば、上述のスターチおよびその誘導体、ならびにカルボキシメチルスターチ、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムのようなその塩)が添加され得る。補助剤には、流量調節剤および滑沢剤(例えば、シリカ、滑石、ステアリン酸、またはステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸カルシウムのようなその塩、ならびに/あるいはポリエチレングリコール)が挙げられる。糖剤コアは、所望であれば胃液に耐性である適切なコーティングを伴って提供され得る。この目的について、濃縮糖溶液が使用され得るが、これは必要に応じて、アラビアゴム、滑石、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、および/または二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに適切な有機溶媒もしくは溶媒混合物を含み得る。胃液に耐性なコーティングを産生するために、適切なセルロース調製物の溶液(例えば、アセチルセルロースフタレート、またはヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート)が使用される。例えば同定用、または活性化合物用量の異なる組み合せを特徴付けるために、染料または顔料が、この錠剤または糖剤コーティングに添加され得る。
経口で使用され得る他の薬学的調製物には、ゼラチンから作製された押し込みばめカプセル剤、ならびにゼラチンおよびグリセロールもしくはソルビトールのような可塑剤から作製された軟封着(sealed)カプセル剤がある。押込みばめカプセル剤は、ラクトースのような充填剤、スターチのような結合剤、および/または滑石もしくはステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤、ならびに必要に応じて安定剤と混合され得る顆粒の形態の活性化合物を含み得る。軟カプセル剤において、この活性化合物は好ましくは溶解されるか、または適切な液体(例えば、脂肪油、流動パラフィン、または流動ポリエチレングリコール)中に懸濁される。さらに、安定剤が添加され得る。
直腸に投与され得る薬学的調製物としては坐剤が含まれ、この坐剤は、この活性化合物の坐剤基剤との組み合せからなる坐剤がある。適切な坐剤基剤は、例えば、天然または合成トリグリセリド、パラフィン系炭化水素、ポリエチレングリコール、またはより高級なアルカノールである。さらに、この活性化合物と適切な基剤の組み合せからなるゼラチン直腸カプセル剤を使用することもまた可能である。適切な基剤物質には、例えば、流動トリグリセリド、ポリエチレングリコール、およびパラフィン系炭化水素が挙げられる。
物質の組織への制御した送達を可能にする種々のデバイスは、公知である。持続性放出調製物の適切な例には、タンパク質を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスが挙げられ、これらのマトリクスは成形品(例えば、フィルムまたはミクロカプセル)の形態である。
非経口投与の適切な処方物には、水溶性形態の活性化合物の水溶液が挙げられる。さらに、適切な油性注射懸濁液のような活性化合物の懸濁液は投与され得る。適切な親油性溶媒またはビヒクルには、脂肪油(例えば、ゴマ油)または合成脂肪酸エステル(例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリド)が挙げられる。水性注射懸濁液は、この懸濁液の粘度を増加させる物質(例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および/またはデキストラン)を含み得る。必要に応じて、この懸濁液は安定剤を含み得る。
薬学的な賦形剤は当該分野で周知であり、本明細書中には詳細に記載する必要はない。例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy(第19版、1995),Gennaro編を参照のこと。
(心臓肥大が誘導する機能不全を処置する方法)
本発明は、心臓肥大が誘導する機能不全を処置する方法を提供し、この方法は、この機能不全の進行を減退するか、または覆すに有効な物質の量を、これを必要とする個体(「被験体」)に投与する工程を包含する。本明細書中に記載される方法に使用について、上述のような、「物質」には、1)肥大感受性遺伝子の発現を調節する;2)その産物が肥大感受性遺伝子の発現を調節する遺伝子の発現を調節;または3)肥大感受性遺伝子の発現を調節する遺伝子産物の活性を調節する、天然または合成の有機または無機化合物が挙げられる。
本発明は、心臓肥大が誘導する機能不全を処置する方法を提供し、この方法は、この機能不全の進行を減退するか、または覆すに有効な物質の量を、これを必要とする個体(「被験体」)に投与する工程を包含する。本明細書中に記載される方法に使用について、上述のような、「物質」には、1)肥大感受性遺伝子の発現を調節する;2)その産物が肥大感受性遺伝子の発現を調節する遺伝子の発現を調節;または3)肥大感受性遺伝子の発現を調節する遺伝子産物の活性を調節する、天然または合成の有機または無機化合物が挙げられる。
本明細書中に使用される「処置」は、恩恵のあるまたは所望の臨床結果を得るためのアプローチである。本発明の目的について、恩恵のあるまたは所望の臨床結果には、検出可能または検出不可能のいずれの場合においても、症状の緩和、疾患の程度の減退、疾患の安定状態(すなわち、悪化していない)、疾患進行の遅延または緩徐化、疾患状態の回復または緩和、ならびに寛解(部分的にまたは全体的にのいずれか)があるがこれらに限定されない。「処置」はまた、処置を受けない場合に予想される生存期間と比較して、生存期間を延長することを意味し得る。本明細書中に使用する用語「処置」には、予防が含まれる。
疾患を「緩和する」は、本発明の方法により検出した物質がない場合と比較して、疾患状態の程度および/または所望でない臨床的発現が減少されること、ならびに/あるいは、進行の時間経過が緩徐化または伸ばされることを意味する。
本方法は、これを必要とする個体(「被験体」)に、この機能不全の進行を減退または覆すに有効な物質の量を投与する工程を包含する。予防法の状況において、「これを必要とする被験体」は以下を含むがこれらに限定されない:55歳以上の一般の集団における個体;心臓肥大の発症に対する遺伝的素因を有する個体;拡張型心筋症患者;高血圧患者;腎不全および血管性高血圧を有する患者;圧力過剰負荷、溶積過剰負荷、または増加末梢床抵抗に起因する血管性高血圧を有する個体;気腫または嚢胞性線維症のような呼吸性の病気を有する個体;慢性の喘息;結核を有する個体;ならびに器官移植患者。
幾つかの実施態様において、本方法は、特にNFAT−3または他のNFATファミリーメンバーのような心転写因子上での脱リン酸作用に関して、心カルシニューリン(CaN)の活性をブロックする工程を包含する。幾つかの実施態様において、本方法は、CaN媒介脱リン酸により活性化したNFATまたは他の核転写因子の転写活性化をブロックするためのCaNのインヒビターの使用を含む。他の実施態様において、本方法は、心筋細胞の細胞質ゾルおよび/または核において、免疫抑制ファミリーのメンバーのシクロスポリンA誘導体を含む臨床上認可された特異的インヒビター薬物によりCaNを阻害し、CaNの脱リン酸化活性を減少させる工程を包含する。CaNを特異的に阻害する免疫抑制薬物によるNFAT転写因子の脱リン酸のブロックは、これらの転写因子の心筋細胞核画分への移行を実質的に減少または予防し、それらをGATA4との活性へテロ二重鎖の形成について無能にする。活性化NFATメンバーとGATA転写因子との間のNFAT−3/GATA−4ヘテロ二重鎖または類似の複合体を形成する能力がないことは、このような複合体が多くの心臓肥大感受性プロモーターでその特異的エンハンサー部位に結合することを予防する。多くの心臓肥大感受性プロモーターは、このような結合部位を含み、NFAT−3/GATA−4または類似の複合体に応答性であるので、それらの遺伝子産物は、CaN活性によりアップレギュレートされ得、そしてそれ故CaN特異的免疫抑制インヒビターにより阻害され得る。
CaN−特異的免疫抑制インヒビターは、心血管系圧の過剰負荷で誘導される心臓肥大によるCaNを通して集中する大部分の核シグナル伝達をブロックし、そして慢性肥大に導き、次いで長期的に未処置の動物における拡大する心筋障害に導く転写誘導をブロックする。他の実施態様において、CaNのインヒビターの使用は、心血管肥大の転写誘導のためのすべての圧負荷膜レセプター媒介核シグナル伝達をブロックする。昇圧剤(α−1−アドレナリン性レセプターを通したアンジオテンシンII(AngII)、エンドセリン−1(ET−1)、トロンビン(Thrb))を通した心血管肥大のレセプター媒介転写誘導、およびαアドレナリン性シグナル伝達は、CaNにおいて核転写活性化シグナルとして集中する。これらの経路がCaNに集中するので、肥大感受性の心臓の遺伝子の、昇圧剤およびα−1−アドレナリン性レセプター媒介転写誘導は、CaNインヒビターによってブロックされ得る。
他の実施態様において、この方法は遺伝子産物の発現を阻害し、これはNFAT転写因子、すなわち肥大感受性遺伝子の遺伝子産物のCaN脱リン酸化に応答して発現される。これらの実施態様のいくつかにおいて、1つ以上の肥大感受性遺伝子の発現を阻害する薬剤は、肥大感受性遺伝子を標的とするアンチセンスポリヌクレオチドである。
CaNを阻害する薬剤の投与を含む実施態様において、それによってNFAT−3および/または1つ以上の関連するファミリーメンバーの脱リン酸化をブロックすることによってCaNをブロックする薬剤は、免疫抑制薬物のサイクロスポリンファミリーのメンバー(例えば、サイクロスポリンA(CsA)またはFK506)である。1つ以上のNFAT転写因子ファミリーメンバーの脱リン酸化をブロックするために心臓CaN活性を阻害する任意の薬剤が有用であると証明され得る。
いくつかの実施態様において、その方法は心臓CaNの発現を減少させる薬剤を投与する。このような薬剤は、CaNのドミナントネガティブ形態(例えば、CaNのαサブユニットのコーディング領域のネガティブ短縮形態);CaN遺伝子を標的化するアンチセンス構築物;およびCaNのβサブユニットの短縮された、不活性形態を含むがこれらに限定されない。CaNのβ−サブユニットの短縮された、不活性形態は、CaNの活性なαサブユニットと隔絶し得、そして活性化のための能力を与えない。他の実施態様において、この方法はCaN、またはそのαサブユニットもしくはβサブユニットについての特異的な抗体を投与する工程を含む。これらのいくつかの実施態様において、その抗体は単鎖抗体である。他の実施態様において、その抗体はCaN活性をブロックするか、あるいはNFAT−3および/またはNFATファミリーメンバーを、心臓CaNによって脱リン酸化されることから妨害する。
このような化合物の毒性および治療的な有効性は、細胞培養中または実験動物中で、例えば、LD50(集団の50%に致死的な用量)およびED50(集団の50%において治療的に有効な用量)を決定するために、標準的な薬学的手順によって決定され得る。毒性および治療効果との間の用量比が治療指標であり、そしてそれはLD50およびED50の比として表現され得る。大きい治療指標を示す化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物が使用され得る一方、非標的細胞に対する潜在的な損害を最小化し、それによって副作用を減少するために、影響を受けた組織の部位にそのような化合物を標的化する送達系が設計され得る。
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための広範な用量の処方範囲において使用され得る。このような化合物の用量は、好ましくは、毒性をほとんど有さないか、またはまったく有さないED50を含む循環濃度の範囲内にある。用量は、そこから使用される投薬形態および利用される投与の経路に依存するこの範囲内で変動し得る。本発明の方法において使用される任意の化合物について、治療的な有効な用量は、最初に細胞培養アッセイから見積もられ得る。用量は、動物モデルにおいて処方され、細胞培養において、および/または動物全体において決定されるような、IC50(すなわち、症状の1/2の最大阻害を達成する試験化合物の濃度)を含む循環血漿濃度範囲を達成し得る。このような情報は、ヒトにおいてより正確に有用な用量を決定するために使用され得る。
心臓肥大の処置における本発明の方法によって検出される基質の治療的有効性は、公知の診断および処置の原理を使用して、当業者によって達成され得る。
以下の実施例は例示のために提供されるが、本発明を限定するものではない。
(実施例1)
(初代心筋細胞におけるCsAおよびFK506によるAngIIおよびPEの肥大性効果の阻害)
(実験プロトコール)
初代心筋細胞およびそれらの肉腫組織を可視化するために、抗αアクチニンマウスモノクローナル抗体を使用した(Sigma)。この抗体は、心臓および骨格筋α−アクチンタンパク質に特異的である。細胞を、1×リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中で洗浄し、3.7% パラホルムアルデヒド中で5分間固定化し、1×PBSで3回洗浄し、次いで2% ウシ血清、2% BSA、および0.1% 非イオン系界面活性剤NP−40を含む1×PBSで30分間プレブロッキングを行った。抗α−アクチニン抗体を、新鮮なプレブロック溶液中で1:800の希釈で添加し、そしてさらに30分間インキュベートした。続いて、細胞を0.1% NP40を含む1×PBS中で3回洗浄した。次いで、抗マウスTRITC結合体化二次抗体をプレブロック溶液中に30分間、1:400の希釈で添加し、そしてこの細胞を再び3回0.1% NP40を含む1×PBS中で3回洗浄した。DNAについての核染色を、PBS中の0.5μg/mlのビスベンズイミドを用いて15分間行い、その後PBSで3回リンスした。
(初代心筋細胞におけるCsAおよびFK506によるAngIIおよびPEの肥大性効果の阻害)
(実験プロトコール)
初代心筋細胞およびそれらの肉腫組織を可視化するために、抗αアクチニンマウスモノクローナル抗体を使用した(Sigma)。この抗体は、心臓および骨格筋α−アクチンタンパク質に特異的である。細胞を、1×リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中で洗浄し、3.7% パラホルムアルデヒド中で5分間固定化し、1×PBSで3回洗浄し、次いで2% ウシ血清、2% BSA、および0.1% 非イオン系界面活性剤NP−40を含む1×PBSで30分間プレブロッキングを行った。抗α−アクチニン抗体を、新鮮なプレブロック溶液中で1:800の希釈で添加し、そしてさらに30分間インキュベートした。続いて、細胞を0.1% NP40を含む1×PBS中で3回洗浄した。次いで、抗マウスTRITC結合体化二次抗体をプレブロック溶液中に30分間、1:400の希釈で添加し、そしてこの細胞を再び3回0.1% NP40を含む1×PBS中で3回洗浄した。DNAについての核染色を、PBS中の0.5μg/mlのビスベンズイミドを用いて15分間行い、その後PBSで3回リンスした。
(結果)
初代心筋細胞のAngIIおよびPEへの曝露は、明白な肥大応答を生じ、これは細胞のサイズおよび肉腫の集合の増加、いくつかの胎児収縮性タンパク質遺伝子のアップレギュレーション、ならびに収縮性の増強によって特徴付けられる。これらの事象の前には、細胞内カルシウムの増加がある。これらのアゴニストに対する心筋細胞の肥大応答がカルシニューリンによって媒介されるかどうかを決定するために、新生仔ラット心筋細胞を、CsAまたはFK506の存在下または非存在下で、AngII(10nM)またはPE(10μM)に曝露した。心筋細胞は、AngIIまたはPE(図2Bおよび2E)への72時間の曝露後、サイズおよび肉腫の集合体の劇的な増加を実証した。CsA(図2Cおよび2F)またはFK506の存在下において、AngIIへの応答は完全に消滅し、そしてPEへの応答は劇的に減少した。
初代心筋細胞のAngIIおよびPEへの曝露は、明白な肥大応答を生じ、これは細胞のサイズおよび肉腫の集合の増加、いくつかの胎児収縮性タンパク質遺伝子のアップレギュレーション、ならびに収縮性の増強によって特徴付けられる。これらの事象の前には、細胞内カルシウムの増加がある。これらのアゴニストに対する心筋細胞の肥大応答がカルシニューリンによって媒介されるかどうかを決定するために、新生仔ラット心筋細胞を、CsAまたはFK506の存在下または非存在下で、AngII(10nM)またはPE(10μM)に曝露した。心筋細胞は、AngIIまたはPE(図2Bおよび2E)への72時間の曝露後、サイズおよび肉腫の集合体の劇的な増加を実証した。CsA(図2Cおよび2F)またはFK506の存在下において、AngIIへの応答は完全に消滅し、そしてPEへの応答は劇的に減少した。
AngIIに応答する心筋細胞遺伝子発現の変化がまた、カルシニューリン依存性シグナル伝達経路によって制御されているかどうかを決定するために、AngIIで処理した心筋細胞におけるANF mRNAの発現を、ドットブロットアッセイによってCsAの存在下または非存在下で調べた。AngIIへの曝露は、心房性ナトリウム利尿因子(ANF)mRNAの15倍の増加を生じ、これはCsAによって完全にブロックされた(図23G)。GAPDH mRNAをコントロールとして測定した。共に、これらの形態学的および分子的データは、AngIIおよびPEシグナル伝達経路が、CsA−/FK506感受性であることを実証する。カルシニューリンは、CsAおよびFK506の両方による阻害についての唯一の公知の標的であるので、これらの結果は、カルシニューリン活性化が、心臓肥大のAngII−およびPE−依存的誘導についてのシグナル伝達経路における必須の工程であることを示唆する。
(実施例2)
(インビボにおける心臓肥大の誘導)
(実験プロトコール)
トランスジェニックマウス。心臓においてカルシニューリンを発現するトランスジェニックマウスを、以下のようにして作製した。カルシニューリンA触媒サブユニットの構成的な活性型(O’Keefeら、(1992)Nature 357:692−694)をコードするcDNAを、5’SalIリンカーおよび3’HindIIIリンカーを用いるPCRによって、α−MHCプロモーターを含む発現ベクターにクローニングした。この発現ベクターの発現パターンおよび特徴は、以前に記載されている(Jonesら(1994)Dev.Dyn.22:117−128)。カルシニューリン−α−MHCベクターを、NotIを用いて消化し、pBluescript骨格を遊離させ、そしてα−MHC−融合cDNAフラグメントの精製を可能にする。このフラグメントを、Qiaex IIゲル抽出キット(Qiagen)を使用してアガロースゲル上で精製し、そして卵母細胞注入緩衝液(5mM Tris−HCl pH 7.4および0.2mM EDTA)中で溶出させた。精製したフラグメントを、受精して間もないFVBマウス由来の卵母細胞に注入し、偽妊娠ICRマウスの卵管に移した。
(インビボにおける心臓肥大の誘導)
(実験プロトコール)
トランスジェニックマウス。心臓においてカルシニューリンを発現するトランスジェニックマウスを、以下のようにして作製した。カルシニューリンA触媒サブユニットの構成的な活性型(O’Keefeら、(1992)Nature 357:692−694)をコードするcDNAを、5’SalIリンカーおよび3’HindIIIリンカーを用いるPCRによって、α−MHCプロモーターを含む発現ベクターにクローニングした。この発現ベクターの発現パターンおよび特徴は、以前に記載されている(Jonesら(1994)Dev.Dyn.22:117−128)。カルシニューリン−α−MHCベクターを、NotIを用いて消化し、pBluescript骨格を遊離させ、そしてα−MHC−融合cDNAフラグメントの精製を可能にする。このフラグメントを、Qiaex IIゲル抽出キット(Qiagen)を使用してアガロースゲル上で精製し、そして卵母細胞注入緩衝液(5mM Tris−HCl pH 7.4および0.2mM EDTA)中で溶出させた。精製したフラグメントを、受精して間もないFVBマウス由来の卵母細胞に注入し、偽妊娠ICRマウスの卵管に移した。
心臓でCaMKIVを発現するトランスジェニックマウスを、以下のように作製した。CaMKIVの構成的な活性型をコードするcDNA(O’Keefeら、(1992)Nature 357:692−694)を、カルシニューリンマウスについて上記のように、PCRによってクローニングし、そしてα−MHCプロモーターを含む発現ベクターに挿入した。DNAを卵母細胞に注入するために調製し、そしてトランスジェニックマウスを、上記のように生産した。
RNA分析。全RNAを、推奨されるようにTriazol試薬(Gibco
BRL)を用いて収集および精製した。野生型およびトランスジェニック心臓由来の、ならびに培養された心筋細胞由来のRNAを、以前に記載されたように(Jonesら、(1996)J.Clin.Invest.98、1906−1917)、オリゴヌクレオチドプローブのパネルに対する、ドットブロットハイブリダイゼーションに供した。
BRL)を用いて収集および精製した。野生型およびトランスジェニック心臓由来の、ならびに培養された心筋細胞由来のRNAを、以前に記載されたように(Jonesら、(1996)J.Clin.Invest.98、1906−1917)、オリゴヌクレオチドプローブのパネルに対する、ドットブロットハイブリダイゼーションに供した。
組織学。野生型およびトランスジェニックマウス由来の心臓を、組織学的分析に供した。手短に言えば、心臓を収集し、PBSで緩衝化した10% ホルマリン中で一晩固定し、エタノール中で脱水し、キシレン、次いでパラフィンに移した。パラフィンに包埋された心臓を、4μmに切片化し、次に、慣用的な組織学的試験についてはヘマトキシリンおよびエオシンで、またはコラーゲンについてはマッソン三色染料で染色した(WoodsおよびEllis、Laboratory Histopathology:A Complete Reference(1994)Churchill Livingstone Publishers 7.1−13頁)。
(結果)
活性化されたカルシニューリンによるインビボでの心臓肥大の誘導。上記の結果は、カルシニューリンが、培養された初代心筋細胞において心臓肥大の潜在的な調節因子であることを示した。このシグナル伝達経路が、心筋層でインビボでもまた作用し得るかどうかを決定するために、発現を駆動するためのα−MHCプロモーターを使用して心臓におけるカルシニューリン触媒サブユニットの構成的な活性型を発現するトランスジェニックマウスを生産した。以前の研究は、この心臓特異的プロモーターが、主に誕生後に心室において活性であることを示した(Jonesら (1994)Dev.Dyn.22:117−128)。合計10の独立した初代のトランスジェニックマウスを生産し、これらはα−MHC−カルシニューリントランスジェニックの2〜68の間のコピーを含んだ(表1)。
活性化されたカルシニューリンによるインビボでの心臓肥大の誘導。上記の結果は、カルシニューリンが、培養された初代心筋細胞において心臓肥大の潜在的な調節因子であることを示した。このシグナル伝達経路が、心筋層でインビボでもまた作用し得るかどうかを決定するために、発現を駆動するためのα−MHCプロモーターを使用して心臓におけるカルシニューリン触媒サブユニットの構成的な活性型を発現するトランスジェニックマウスを生産した。以前の研究は、この心臓特異的プロモーターが、主に誕生後に心室において活性であることを示した(Jonesら (1994)Dev.Dyn.22:117−128)。合計10の独立した初代のトランスジェニックマウスを生産し、これらはα−MHC−カルシニューリントランスジェニックの2〜68の間のコピーを含んだ(表1)。
分析されたあらゆるカルシニューリントランスジェニックマウスは、非トランスジェニック同腹仔に比較して、心臓のサイズにおいて劇的な増加を示した。心臓対体重比は、コントロールの同腹仔に比較して、出生後18日という早い時期においてさえカルシニューリントランスジェニックにおいて平均で2〜3倍高かった(図3;表1)。オスおよびメスの心臓表現型において違いは見られなかった。組織学的分析は、同心性の肥大を示し、ここで心室壁の横断面の領域および心室内の隔壁が劇的に増加された(図3C)。左心室が最も影響を受けたが、右心室および心房室もまた、拡大した。よく組織化された正常な心室壁の横紋筋系とは対照的に、カルシニューリントランスジェニック心臓由来の心筋細胞は、組織破壊され、そして明らかに肥大していた(図3Dおよび3E)。この肥大性心筋細胞は、しばしば劇的な核肥大(karyomegaly)を有した。左心室壁内での筋細胞の横断面の領域の測定は、コントロールと比較して、カルシニューリントランスジェニックにおいて2倍以上の増加を示した。
ヒトにおいて、心臓肥大は、しばしば心室拡張、心不全および突然死に進行する。同様に、カルシニューリントランスジェニックマウスにおいて、齢の増加に伴う心室の拡張が観察された(図3Fおよび3G)。カルシニューリントランスジェニックマウスはまた、突然死に対して高度に感受性である。これは、自発的に、ならびに操作または麻酔の間に起こる。突然死したマウスは、心不全の指標である右および左の心室の拡大を示した。肺の組織学もまた、広範な脈管周囲の水腫および赤血球細胞を含む肺胞内マクロファージを示し、知見は心不全と一致した。心不全の悪い特徴の1つは、心室壁の線維症である。カルシニューリントランスジェニックの心臓は、三色染色によって示されるように、広範な、主要な間質性のコラーゲンの沈着を含む(図3H)。顕著な線維症を有する病巣において、筋線維変性が明白である。
同様に、CaMKIVの構成的な活性形態を発現するトランスジェニックマウスは、α−MHCプロモーターの制御下において、図5に示すように、非トランスジェニック同腹仔と比較して、心臓のサイズが劇的に増加することを示した。
カルシニューリンによるインビボにおける肥大に応答する分子の活性化。活性化されたカルシニューリンが、肥大および心不全に特徴的な心臓の遺伝子発現の変化を誘導するかどうかを決定するために、定量的ドットブロットアッセイを使用して、カルシニューリントランスジェニックおよび非カルシニューリントランスジェニック同腹仔の心臓由来のRNAを調べた。遺伝子発現の胎仔プログラムの再活性化と一致して、MHC、α−骨格筋アクチン、およびBNP転写物が、トランスジェニック心臓において劇的にアップレギュレートされたが、一方α−MHCはダウンレギュレートされた。筋小胞体Ca++−ATPase(SERCA)およびホスホランバン(PLB)の転写物が、破損した心筋層がCa++の操作の欠損を示す場合、心不全の間にダウンレギュレートされることが以前に示された(Mercadierら、(1995)J.Clin.Invest.85:305−309;Schwingerら(1995)Circulation
92:3220−3228);両方の転写物はカルシニューリントランスジェニックにおいて減少した。グルタルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)発現の有意な変化はなかった。
92:3220−3228);両方の転写物はカルシニューリントランスジェニックにおいて減少した。グルタルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)発現の有意な変化はなかった。
CsAを有する心臓肥大の予防。インビボにおけるカルシニューリン活性の阻害が心臓肥大を予防する効果的な手段であるかどうかを決定するために、本発明者らは、CsAの皮下注射がカルシニューリントランスジェニックマウスの心機能不全を予防し得るかどうかを試験した。これらの実験のために、トランスジェニックマウス#37(表1)の同腹仔からの8匹のトランスジェニック同腹仔を使用した。
4匹のトランスジーン陽性子孫に、1日に2回、25mg/ml CsAを注射し、そして4匹にはビヒクルを単独で注射した。4匹の非トランスジェニック同腹仔をまた、CsAで処置し、CsAによって誘導される潜在的な毒性効果または任意の心臓異常について制御した。CsA処置は9日齢で開始し、そしてその動物を16日後に屠殺した。図4Cに示すように、ビヒクル処置動物の心臓は高度に肥大し、そして25日までに拡張したが、CsA処置同腹仔は非トランスジェニックコントロールとはサイズにおいて有意な差はなかった。カルシニューリントランスジェニックの心臓対身体重量比は、図4Bに示すように、CsA−処置トランスジェニックおよび非トランスジェニックのそれらよりもおよそ3倍大きかった。CsA処置はまた、カルシニューリントランスジェニックの心臓の線維症を予防した。
細胞レベルにおいて、カルシニューリントランスジェニックの心筋細胞の肥大性応答は、大部分はCsAによって阻害されるが、筋線維の乱れた配列および顕著な高色素性の核を有する散乱した細胞の単離された領域が存在する。CsA処置は、インビボにおいて活性化されたカルシニューリンに応答する全体の心臓肥大および関連する病理学を予防した。
(実施例3)
(培養された心筋細胞モデルにおける肥大感受性遺伝子の発現におけるCaMKIIおよびCaNの効果の特徴付け)
(プロトコール)
初代心筋細胞培養。胎仔ラット心筋細胞の初代培養を、1〜4日齢のSprague−Dawleyラットを使用して調製した。仔ラット(調製1回あたり平均15仔ラット)を、断首し、そして心臓を胸腔から無菌的に取り除き、そしてMedium 199(Life Technologies,Gaithersburg,MD)で洗浄して、残存する血液を除去した。心房を取り除き、そして心室を細かくミンチし、そして各18分間の3つの連続的なViokase(A.H.Robbins Company,Richmond,VA)消化に供した。リパーゼ、プロテアーゼ、およびアミラーゼならびに他の膵臓の酵素を含むViokaseを、PBS緩衝液中で1mg/mlに作製し、そして心臓15個あたり120mlの割合で使用した。3つの消化物からプールした上清を、消化反応をクエンチするためにアイスバス上に置いた。次いで上清を、Beckman TJ−6ローター中で室温で8分間2000rpmで遠心分離した。細胞ペレットを、10%ウシ胎仔血清および50μg/mlゲンタマイシンで補充したMedium199中に再懸濁した。次いで細胞を100mm組織培養ディッシュ中にプレートし、そして37℃で細胞培養インキュベーター中でインキュベートした。「プレ−プレーティング」と呼ばれるこのプロセスは、選択的に,迅速に結合した、非心筋細胞(例えば、細胞集団からの線維芽細胞)を取り除き、それゆえに細胞集団を心筋細胞について富化させる。45〜50分間後、長期培養の開始のために、約150細胞/mm2の密度で非結合細胞を新鮮な60mmディッシュに移した。20〜24時間後、心筋細胞培養物を洗浄して、上記のように60mmディッシュ中で、10%ウシ胎仔血清で補充した新鮮な培地中に維持した。心筋細胞の培養物を7日まで維持し得る。
(培養された心筋細胞モデルにおける肥大感受性遺伝子の発現におけるCaMKIIおよびCaNの効果の特徴付け)
(プロトコール)
初代心筋細胞培養。胎仔ラット心筋細胞の初代培養を、1〜4日齢のSprague−Dawleyラットを使用して調製した。仔ラット(調製1回あたり平均15仔ラット)を、断首し、そして心臓を胸腔から無菌的に取り除き、そしてMedium 199(Life Technologies,Gaithersburg,MD)で洗浄して、残存する血液を除去した。心房を取り除き、そして心室を細かくミンチし、そして各18分間の3つの連続的なViokase(A.H.Robbins Company,Richmond,VA)消化に供した。リパーゼ、プロテアーゼ、およびアミラーゼならびに他の膵臓の酵素を含むViokaseを、PBS緩衝液中で1mg/mlに作製し、そして心臓15個あたり120mlの割合で使用した。3つの消化物からプールした上清を、消化反応をクエンチするためにアイスバス上に置いた。次いで上清を、Beckman TJ−6ローター中で室温で8分間2000rpmで遠心分離した。細胞ペレットを、10%ウシ胎仔血清および50μg/mlゲンタマイシンで補充したMedium199中に再懸濁した。次いで細胞を100mm組織培養ディッシュ中にプレートし、そして37℃で細胞培養インキュベーター中でインキュベートした。「プレ−プレーティング」と呼ばれるこのプロセスは、選択的に,迅速に結合した、非心筋細胞(例えば、細胞集団からの線維芽細胞)を取り除き、それゆえに細胞集団を心筋細胞について富化させる。45〜50分間後、長期培養の開始のために、約150細胞/mm2の密度で非結合細胞を新鮮な60mmディッシュに移した。20〜24時間後、心筋細胞培養物を洗浄して、上記のように60mmディッシュ中で、10%ウシ胎仔血清で補充した新鮮な培地中に維持した。心筋細胞の培養物を7日まで維持し得る。
一過性トランスフェクション。血清応答エレメントを通して媒介される遺伝子発現への効果を除去するために、無血清培地中で単離された心筋細胞を培養することが必要であった。初代心筋細胞を、最初に無血清増殖培地で洗浄し、次いでヒト血清アルブミン、ウシインスリンおよびヒトトランスフェリンを含む、Nutridoma HU(Boehringer Mannheim Corporation,Indianapolis,IN)で補充した無血清培地199中で維持した。トランスフェクションを、リポソームに基づくトランスフェクト剤、Lipofectamine(Life Technologies,Grand Island,NY)を用いて行った。一過性トランスフェクションのために使用される手順は、製造者の説明書に従った。DNA濃度、lipofectamine濃度、およびトランスフェクションの時間の長さを含む最適値を、本研究において行う実験に先立って決定した。手短に言えば、各々のトランスフェクションについて、2μg DNAおよび20μg lipofectamineを300μlの無血清nutridoma補充培地を含む別個のバイアル中に希釈した。次いで、2つの溶液を合わせて、室温で15〜45分間インキュベートして、DNA−リポソーム複合体を形成させた。各々のトランスフェクションについて、2.4mlの無血清nutridoma補充培地を、DNA−リポソーム複合体を含むチューブに添加し、そしてその希釈混合物を、60mm組織培養プレート中の2mlの無血清培地で1回リンスした、付着した心筋細胞に重層した。細胞培養を、37℃で、5% CO2を含むCO2インキュベーター中で24時間インキュベートした。その時点で種々の試験化合物を添加した。細胞抽出物由来のプロモーター活性を、トランスフェクションの開始後48時間以内にアッセイした。
α1−アドレナリン作動性刺激については、100μM PE(Sigma,St.Louis,MO)を細胞に添加した。選択性β1−アドレナリン作動性アゴニストである、DOB(Gensia Laboratories,Ltd.,Irving,CA)を、10μMの濃度で添加した。トランスフェクション効率における変動を修正するために、pβGal−Controlを内部標準として使用した。化学発光性のβ−ガラクトシダーゼ活性を、ルシフェラーゼアッセイについて収集した同じ細胞溶解物のアリコートを使用することによってアッセイし、そして下記のように同じルミノメーター中で測定した。
ホタルルシフェラーゼアッセイ。ホタルルシフェラーゼアッセイは、市販の生物ルミネッセンスアッセイの長時間「成長」型(Promega,Madison,WI)に基づく。手短に言えば、ルシフェリンの活性化が、酵素結合型ルシフェリルアデニル酸(ルシフェリル−AMP)の形成を生じる。その酵素中間体、ルシフェリル−AMPは、コエンザイムA(CoA)の存在下で酸化され、そして励起された酵素結合生成物の形成に導き、これは続いて光および強く酵素結合した生成物を放出するために分解する。より好ましい全体の反応速度論を有するルシフェニル−CoAの代わりに、酸化はCoAの存在下において生じる。ルシフェラーゼ活性についてアッセイされる細胞をPBS緩衝液で2回すすぎ、そしてReporter Lysis 1×緩衝液(Promega)に溶解し、次いでかきとることによって収集した。大きな細片を短い遠心分離によってペレット化し、そして上清を新しいチューブに移した。ルシフェラーゼアッセイについては、20μlの細胞抽出物を、20mM Tricine、1.07mM (MgCO3)4Mg(OH)25H2O、2.67mM MgSO4、0.1mM
EDTA、33.3mM DTT、270μM コエンザイムA、470μM
ルシフェリン、よび530μM ATPを含む100μlのLuciferase Assay Reagent(Promega)と混合した。10秒間〜5分間にわたる完全な光放射を、Turner Designs Luminometer Model 20(Promega)で測定した。すべてのアッセイを細胞溶解の1時間以内に、室温で行った。
EDTA、33.3mM DTT、270μM コエンザイムA、470μM
ルシフェリン、よび530μM ATPを含む100μlのLuciferase Assay Reagent(Promega)と混合した。10秒間〜5分間にわたる完全な光放射を、Turner Designs Luminometer Model 20(Promega)で測定した。すべてのアッセイを細胞溶解の1時間以内に、室温で行った。
ノーザン分析。ANFメッセージ分析については、市販のTRIzol試薬(Life Technologies,Grand Island,NY)を使用して、ChomczynskiおよびSacchiの方法に従って、全RNAを1〜3日齢新生仔ラット心筋細胞細胞培養から抽出した。ラット初代細胞培養物をTRIzol中でホモジナイズし、そしてこのRNAをクロロホルムの添加によって抽出し、そしてイソプロパノ−ルの存在下で沈殿させた。単離した全RNAを、1%アガロース/ホルムアルデヒドゲル上で分画し、そしてキャピラリーブロッティングによってナイロンメンブレンに転写した。ブロットを50%ホルムアミド溶液(Life Technologies,Grand Island,NY)中で、3〜4時間、42℃でプレハイブリダイズし、次いでランダムプライマー、ビオチン標識ANF cDNAプローブを用いて一晩ハイブリダイズした。高ストリンジェンシー(0.1×SSPE、0.1%SDS、65℃)での洗浄後、ハイブリダイズしたビオチン化cDNAを、Chemiluminescent Detection System(TROPIX,Inc.,Bedford,MA)を用いて検出し、次いでX線フィルムに曝露した。ANFバンドをHowteckゲルスキャナー(PDI,Huntington station,NY)を用いて定量し、そして28S rRNAシグナルに対して標準化して、ローディングおよび/または転写効率に対して修正した。
自律的なCaMキナーゼII活性の測定。ラット心臓組織ホモジネートにおけるCaMIIキナーゼの自律的な活性を、外因性基質として、合成ペプチド基質、autocamtide−2(KKALRRQETVDAL)(Marら(1990)Mol.Cell.Biol.10:4271−4283;およびFarranceら(1992)J.Biol.Chem.267:17234−17240)を使用して測定した。このペプチドは、ラット脳α−CaMキナーゼIIのコアの自己リン酸化配列を模倣し、そしてCaMキナーゼIIに高度に選択性である。自律的なCaMキナーゼII活性を、Ca2+/カルモジュリンの非存在下でのautocamtide−2のリン酸化によってアッセイし、そしてこれらのコファクターの存在下で得られる活性の割合として表現した。組織切片を、必要とされる時間、種々の薬物化合物の存在下または非存在下でインキュベートした。インキュベートの終了時に、組織切片を氷冷した緩衝液(20mM Tris−HCl、pH 7.5、0.5mM EGTA、1.0mM EDTA、2.0mM ジチオスレイトール、10mM ピロリン酸ナトリウム、0.4mM モリブデン酸アンモニウム、100mg/ml ロイペプチン)中で超音波処理によりホモジナイズした。上清を遠心分離(12,000×g、2分間)により清澄化し、次いで50mM PIPES(pH 7.0)、10mM MgCl2、0.1mg/ml ウシ血清アルブミン、10mM autocamtide−2、20mM [γ−32P]ATP、およびCa2+−刺激活性についての0.5mM CaCl2、5mg/ml カルモジュリン、または自律的な活性についての1mM EGTAのいずれかを含む反応混合液中でアッセイした。このアッセイを30℃で30秒間行い、そしてトリクロロ酢酸の最終濃度5%までの添加により停止させた。内因性タンパク質を遠心分離によって沈殿させ、そしてautocamtide−2を含む上清をp81ホスホセルロースの小片にスポットし、5回洗浄し、乾燥させ、そして32P−PO4含量をチェレンコフ放射によって定量した。
プラスミドの構築。種々のラット心臓ANFプロモーターフラグメントおよびラットANF cDNAを含む一連のネスティングした欠失変異体を使用した。このプロモーター−レポーター構築物のシリーズを、ルシフェラーゼに基づくpxp2ベクターにサブクローニングした。適切な制限酵素部位を使用、またはPCR増幅によって、5’欠失を生成した。ANF転写を調節すると考えられている、鍵となるエンハンサーエレメントの模式図を図8Aに示す。トリ心臓骨格筋α−アクチン遺伝子(ホタルルシフェラーゼ遺伝子の構造部分に連結する増殖シグナル伝達に応答性のエンハンサードメインの大部分を含む)の骨格筋α−アクチンレポーター(約400bpの近位の上流プロモータードメイン(転写開始部位に対して−394bp〜+24)を含む)を使用した。別のルシフェラーゼに基づくプロモーター−レポーター構築物(トリ心筋α−アクチン遺伝子の400bpの近位の上流プロモータードメインを含む)もまた使用した。pSRα発現ベクターに含まれるδ−CaMキナーゼ(δAおよびδB)の2つのイソ型を使用した。全長型(CaMKIVwt)および変異型(CaMKIV313)の両方を含むCaMキナーゼIVについての発現プラスミドを使用した。ニューロン起源のカルシニューリンの構成的に活性な形態を、ポリメラーゼ連鎖反応変異誘発技術によって生成し、これはカルシニューリンの自己阻害ドメインの欠失を生じた。次いで、変異フラグメントを、pSRα発現ベクターにサブクローニングした。変異体脳α−CaMキナーゼIIについての発現プラスミドを、野生型CaMキナーゼII酵素の短縮型(アミノ酸1〜290)をコードするcDNAをサブクローニングすることによって構築した。これは、pCMV5(複数のクローニング配列を、サイトメガロウイルスの強力なウイルスプロモーターからすぐ下流に含む哺乳動物発現プラスミド)のEcoRI部位中で構成的に活性である。この構築物は、心筋細胞培養物にトランスフェクトした場合、Ca2+またはカルモジュリンに結合しないCaMキナーゼII酵素を構成的に産生する。
(結果)
(ANF、骨格筋α−アクチン、および心筋α−アクチン遺伝子に関するプロモーター−レポーター活性に対する外因性CaMキナーゼIIおよびカルシニューリンの効果)
本研究において、本発明者らは、ANF、骨格筋α−アクチンおよび心筋α−アクチンの遺伝子の発現の調節において、カルシウム依存性プロテインキナーゼ(CaMキナーゼII(CaMKII))、およびカルシウム感受性ホスファターゼ(カルシニューリン(CaN))の潜在的な機能的役割を調査した。上記記載のようなほぼ完全長のANF、骨格筋α−アクチンまたは心筋α−アクチンのプロモーター領域を含む、3つのルシフェラーゼに基いたプロモーター−レポーター構築物を、本研究に使用した。変異体である構成的に活性なCaMKIIα−イソフォームまたはCaNの構成的に活性な変異形態を保持しているベクター構築物をANF/ルシフェラーゼ、骨格筋α−アクチン/ルシフェラーゼまたは心筋α−アクチン/ルシフェラーゼ融合遺伝子とともに使用する同時トランスフェクションプロトコルを、1〜4日齢のラットの子から調製した新生仔心筋細胞培養物上で実行した。ルシフェラーゼレポーター活性を評価した。図6に示すように、外因性CaMKIIα−イソフォームの過剰発現は、ANF、骨格筋α−アクチンおよび心筋α−アクチンに対するプロモーターレポーター活性をコントロール培養物(空ベクターを用い同時トランスフェクションした)と比較して50%沈黙した。対照的に、外因性の構成的に活性なCaNの過剰発現は、ANF、骨格筋α−アクチンおよび心筋α−アクチンプロモーター活性をコントロール細胞より300%〜600%増加した。本実験の結果は、異種のCaMKIIα−イソフォームの過剰発現が、心臓胚遺伝子(ANFおよび骨格筋α−アクチン)と構成的な収縮性のタンパク質遺伝子(心筋α−アクチン)との両方に対してプロモーター活性の沈黙を導く。対照的に、外因性CaNの活性化は、これらの3つの遺伝子に対するプロモーター活性の超誘導を生じる。
(ANF、骨格筋α−アクチン、および心筋α−アクチン遺伝子に関するプロモーター−レポーター活性に対する外因性CaMキナーゼIIおよびカルシニューリンの効果)
本研究において、本発明者らは、ANF、骨格筋α−アクチンおよび心筋α−アクチンの遺伝子の発現の調節において、カルシウム依存性プロテインキナーゼ(CaMキナーゼII(CaMKII))、およびカルシウム感受性ホスファターゼ(カルシニューリン(CaN))の潜在的な機能的役割を調査した。上記記載のようなほぼ完全長のANF、骨格筋α−アクチンまたは心筋α−アクチンのプロモーター領域を含む、3つのルシフェラーゼに基いたプロモーター−レポーター構築物を、本研究に使用した。変異体である構成的に活性なCaMKIIα−イソフォームまたはCaNの構成的に活性な変異形態を保持しているベクター構築物をANF/ルシフェラーゼ、骨格筋α−アクチン/ルシフェラーゼまたは心筋α−アクチン/ルシフェラーゼ融合遺伝子とともに使用する同時トランスフェクションプロトコルを、1〜4日齢のラットの子から調製した新生仔心筋細胞培養物上で実行した。ルシフェラーゼレポーター活性を評価した。図6に示すように、外因性CaMKIIα−イソフォームの過剰発現は、ANF、骨格筋α−アクチンおよび心筋α−アクチンに対するプロモーターレポーター活性をコントロール培養物(空ベクターを用い同時トランスフェクションした)と比較して50%沈黙した。対照的に、外因性の構成的に活性なCaNの過剰発現は、ANF、骨格筋α−アクチンおよび心筋α−アクチンプロモーター活性をコントロール細胞より300%〜600%増加した。本実験の結果は、異種のCaMKIIα−イソフォームの過剰発現が、心臓胚遺伝子(ANFおよび骨格筋α−アクチン)と構成的な収縮性のタンパク質遺伝子(心筋α−アクチン)との両方に対してプロモーター活性の沈黙を導く。対照的に、外因性CaNの活性化は、これらの3つの遺伝子に対するプロモーター活性の超誘導を生じる。
(ANFプロモーター−レポーター活性に対するCaMキナーゼイソ酵素の効果)
CaMキナーゼファミリーは、構造、分布、調節、および酵素活性の異なる少なくとも10のメンバーを有する。図6に示した結果は、変異されたα−CaMKIIが、肥大感受性遺伝子のダウンレギュレーションを誘導したことを示唆する。他のCaMキナーゼファミリーのメンバーのどの効果が、原型の肥大感受性遺伝子ANFにおいて役割を果たすかを決定することが目的であった。野生型CaMKII(CaMKIIwt)、δ−CaMKII(δAおよびδB)、およびCaMKIV(野生型および改変形態)を含むCaMキナーゼファミリーのメンバーの選択を、上記記載のANFプロモーター−レポーター構築物での同時トランスフェクションのために使用した。ANFのPE誘導もまた、それぞれの外因性のCaMキナーゼメンバーの存在下で評価した。図7に示すように、CaMKIIwtは、ANFプロモーター活性を約400%減少した。対照的に、CaMKIVwtは、ANFプロモーター活性を270%増加したが、CaMKIVmutは、ANFプロモーター活性を約400%増加した。δAおよびδBの両方を含むCaMKIIδイソフォームは、事実上、ANFのプロモーター活性を変化させなかった。類似の結果が、図7Bに示すように、トランスフェクションされた心筋細胞においてPE刺激の存在下で得られた。まとめると、これらのデータは、異なったCaMキナーゼファミリーのメンバーが、ANFの発現に対して差次的な効果を示すことを示す。
CaMキナーゼファミリーは、構造、分布、調節、および酵素活性の異なる少なくとも10のメンバーを有する。図6に示した結果は、変異されたα−CaMKIIが、肥大感受性遺伝子のダウンレギュレーションを誘導したことを示唆する。他のCaMキナーゼファミリーのメンバーのどの効果が、原型の肥大感受性遺伝子ANFにおいて役割を果たすかを決定することが目的であった。野生型CaMKII(CaMKIIwt)、δ−CaMKII(δAおよびδB)、およびCaMKIV(野生型および改変形態)を含むCaMキナーゼファミリーのメンバーの選択を、上記記載のANFプロモーター−レポーター構築物での同時トランスフェクションのために使用した。ANFのPE誘導もまた、それぞれの外因性のCaMキナーゼメンバーの存在下で評価した。図7に示すように、CaMKIIwtは、ANFプロモーター活性を約400%減少した。対照的に、CaMKIVwtは、ANFプロモーター活性を270%増加したが、CaMKIVmutは、ANFプロモーター活性を約400%増加した。δAおよびδBの両方を含むCaMKIIδイソフォームは、事実上、ANFのプロモーター活性を変化させなかった。類似の結果が、図7Bに示すように、トランスフェクションされた心筋細胞においてPE刺激の存在下で得られた。まとめると、これらのデータは、異なったCaMキナーゼファミリーのメンバーが、ANFの発現に対して差次的な効果を示すことを示す。
(ANFプロモーター−レポーターのネスト化された欠失構築物に対する外因性のCaMKIIまたはCaNの効果)
これらの研究において、ラット心臓ANF遺伝子の5’プロモーター/エンハンサードメインから生成したネスト化された欠失構築物のシリーズを使用した。3つの異なった長さの元来のANFプロモーターフラグメントを、上記記載のように、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の構造的部分に連結した。ANF遺伝子について同定された機能的エンハンサーエレメントの全ての図を、図8Aに示す。PEに曝露された心筋細胞培養物における、各ネスト化された欠失構築物に対するレポーター活性を、図8Bに示す。PERE(PE応答エレメント)モチーフを含む(ANF700(NP337)およびANF135(NP325))十分な上流配列を含むプロモーター−レポーター構築物は、PE曝露により活性化され、このモチーフを欠いたプロモーター配列ANF50(NP338)は、活性化されなかった。外因性CaMKII/CaNの発現によるANFプロモーター−レポーター活性の沈黙/誘導が、ANFプロモータードメインの領域に局在し得るかどうか評価した。上記記載のANFプロモーター−レポーターのネスト化された欠失構築物を、それぞれ構成的に活性なCaMKIIまたは構成的に活性なCaNで同時トランスフェクションした。図8Cに示すように、外因性のCaMKIIの過剰発現は、コントロール培養物と比較して50%、3つ全てのANF5'−欠失プロモーター構築物の沈黙を生じたが、外因性のCaNの過剰発現は、コントロール培養物の200〜600%の範囲で3つのANFプロモーター構築物のそれぞれを増加した。これらのデータは、CaMKII/CaNによるANFプロモーター−レポーター活性の阻害/誘導が、ANFプロモーターについての規定の領域またはドメインに制限され得なかったことを示す。
これらの研究において、ラット心臓ANF遺伝子の5’プロモーター/エンハンサードメインから生成したネスト化された欠失構築物のシリーズを使用した。3つの異なった長さの元来のANFプロモーターフラグメントを、上記記載のように、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の構造的部分に連結した。ANF遺伝子について同定された機能的エンハンサーエレメントの全ての図を、図8Aに示す。PEに曝露された心筋細胞培養物における、各ネスト化された欠失構築物に対するレポーター活性を、図8Bに示す。PERE(PE応答エレメント)モチーフを含む(ANF700(NP337)およびANF135(NP325))十分な上流配列を含むプロモーター−レポーター構築物は、PE曝露により活性化され、このモチーフを欠いたプロモーター配列ANF50(NP338)は、活性化されなかった。外因性CaMKII/CaNの発現によるANFプロモーター−レポーター活性の沈黙/誘導が、ANFプロモータードメインの領域に局在し得るかどうか評価した。上記記載のANFプロモーター−レポーターのネスト化された欠失構築物を、それぞれ構成的に活性なCaMKIIまたは構成的に活性なCaNで同時トランスフェクションした。図8Cに示すように、外因性のCaMKIIの過剰発現は、コントロール培養物と比較して50%、3つ全てのANF5'−欠失プロモーター構築物の沈黙を生じたが、外因性のCaNの過剰発現は、コントロール培養物の200〜600%の範囲で3つのANFプロモーター構築物のそれぞれを増加した。これらのデータは、CaMKII/CaNによるANFプロモーター−レポーター活性の阻害/誘導が、ANFプロモーターについての規定の領域またはドメインに制限され得なかったことを示す。
(β−アドレナリン作動性レセプターのシグナル伝達および心臓CaMキナーゼIIの活性化)
これらの実験は、β1−アドレナリン作動性レセプターサブタイプによるシグナル伝達が、心臓CaMKIIを活性化し得るかどうか決定した。1〜4日齢新生仔ラット由来の心組織切片を、新鮮に単離し、そしてβ1選択性アゴニスト(ドルブタミン(dolbutamine:DOB))、または混合β1(β1およびβ2)アゴニスト(イソプロテレノール(ISO))のどちらかで処理した。類似の研究において、アゴニストを加える前に、β1アンタゴニスト(プロパノロール(PROP))を、15秒加えた。後で、CaMKIIの自律的な活性(カルシウム依存性活性の%)をアッセイした。このような実験の結果を図9に示す。CaMKIIの自律的な活性化は、DOBまたはISOによる処理の30秒後、刺激していない心組織において観察した活性より約170%増加した。さらに、DOBまたはISOのどちらかの添加の前に添加した場合、β1アンタゴニスト(PROP)は、CaMKIIの自律的活性の活性化を阻止した。これらの結果は、β1−アドレナリン作動性アゴニストへの曝露が、心臓の内因性CaMKIIの活性化を導くことを示す。CaMKII活性のこの活性化は、β1−レセプター媒介応答である。
これらの実験は、β1−アドレナリン作動性レセプターサブタイプによるシグナル伝達が、心臓CaMKIIを活性化し得るかどうか決定した。1〜4日齢新生仔ラット由来の心組織切片を、新鮮に単離し、そしてβ1選択性アゴニスト(ドルブタミン(dolbutamine:DOB))、または混合β1(β1およびβ2)アゴニスト(イソプロテレノール(ISO))のどちらかで処理した。類似の研究において、アゴニストを加える前に、β1アンタゴニスト(プロパノロール(PROP))を、15秒加えた。後で、CaMKIIの自律的な活性(カルシウム依存性活性の%)をアッセイした。このような実験の結果を図9に示す。CaMKIIの自律的な活性化は、DOBまたはISOによる処理の30秒後、刺激していない心組織において観察した活性より約170%増加した。さらに、DOBまたはISOのどちらかの添加の前に添加した場合、β1アンタゴニスト(PROP)は、CaMKIIの自律的活性の活性化を阻止した。これらの結果は、β1−アドレナリン作動性アゴニストへの曝露が、心臓の内因性CaMKIIの活性化を導くことを示す。CaMKII活性のこの活性化は、β1−レセプター媒介応答である。
(ANF、骨格筋α−アクチンおよび心筋α−アクチン遺伝子についてのプロモーター−レポーター活性に対するアドレナリン受容体アゴニストの効果)
上記に示した実験の結果は、CaNが新生仔ラット心筋細胞におけるこれら3つの遺伝子の誘導を導くことを示唆した。ANF、骨格筋α−アクチンおよび心筋α−アクチンの発現について、α−およびβ−アドレナリン作動性刺激の効果を決定することが目的であった。上記記載のようなANF、骨格筋α−アクチンおよび心筋α−アクチンプロモータードメインを保持するルシフェラーゼに基いたプロモーター−レポーター構築物を、初代新生仔ラット心筋細胞培養物へトランスフェクトした。次に、トランスフェクトされた心筋細胞を、α1−アドレナリン作動性アゴニスト(フェニレフリン(PE))、β1−アドレナリン作動性アゴニスト(DOB)、またはβ型トランスフォーミング増殖因子(TGF−β1)に曝露した。図10のパネルA、B、およびCに示すように、これらの各プロモーター−レポーター活性は、DOBでの処理により約50%減少した。ANFおよび骨格筋α−アクチンについてのレポーター活性は、図10のパネルAおよびBに示すように、心筋細胞をPEに曝露した場合、コントロール細胞におけるレポーター活性より200%トランス活性化された。心筋α−アクチンについてのプロモーター活性は、PE処理した心筋細胞において有意には刺激されなかったが、TGF−β1での処理は、以前の研究と一致して、コントロール細胞より700%の心筋α−アクチンプロモーター−レポーター活性を誘導した。これらのデータは、α−アドレナリン作動性刺激およびβ−アドレナリン作動性刺激の両方が、ANF、骨格筋α−アクチンおよび心臓β−アクチンのような心臓肥大感受性遺伝子の発現を調節することを示す。β1−アドレナリン作動性刺激は、ANF、骨格筋α−アクチンのような胚遺伝子、および心筋α−アクチンのような構成的な収縮性のタンパク質遺伝子の両方についてのプロモーター活性を阻害し得る。従って、上記の実験において観察されたANFレポーター活性の変化が、ANFメッセージプールの変化に応答するかどうか評価することが目的であった。
上記に示した実験の結果は、CaNが新生仔ラット心筋細胞におけるこれら3つの遺伝子の誘導を導くことを示唆した。ANF、骨格筋α−アクチンおよび心筋α−アクチンの発現について、α−およびβ−アドレナリン作動性刺激の効果を決定することが目的であった。上記記載のようなANF、骨格筋α−アクチンおよび心筋α−アクチンプロモータードメインを保持するルシフェラーゼに基いたプロモーター−レポーター構築物を、初代新生仔ラット心筋細胞培養物へトランスフェクトした。次に、トランスフェクトされた心筋細胞を、α1−アドレナリン作動性アゴニスト(フェニレフリン(PE))、β1−アドレナリン作動性アゴニスト(DOB)、またはβ型トランスフォーミング増殖因子(TGF−β1)に曝露した。図10のパネルA、B、およびCに示すように、これらの各プロモーター−レポーター活性は、DOBでの処理により約50%減少した。ANFおよび骨格筋α−アクチンについてのレポーター活性は、図10のパネルAおよびBに示すように、心筋細胞をPEに曝露した場合、コントロール細胞におけるレポーター活性より200%トランス活性化された。心筋α−アクチンについてのプロモーター活性は、PE処理した心筋細胞において有意には刺激されなかったが、TGF−β1での処理は、以前の研究と一致して、コントロール細胞より700%の心筋α−アクチンプロモーター−レポーター活性を誘導した。これらのデータは、α−アドレナリン作動性刺激およびβ−アドレナリン作動性刺激の両方が、ANF、骨格筋α−アクチンおよび心臓β−アクチンのような心臓肥大感受性遺伝子の発現を調節することを示す。β1−アドレナリン作動性刺激は、ANF、骨格筋α−アクチンのような胚遺伝子、および心筋α−アクチンのような構成的な収縮性のタンパク質遺伝子の両方についてのプロモーター活性を阻害し得る。従って、上記の実験において観察されたANFレポーター活性の変化が、ANFメッセージプールの変化に応答するかどうか評価することが目的であった。
新生仔心筋細胞の初代培養物を、無血清培地中で維持し、そしてβ1アゴニスト、DOBを、種々の時間で細胞に適用した。ANFメッセージRNAを、上記記載のようにノザン分析プロトコルにより終わりに評価した。図10Dに示すように、細胞培養物をDOBに曝露した場合、ANFメッセージの量が、16時間以内には低下し始め、コントロール培養物(非薬物添加)において観察された約半分でしかなかった。この傾向は続き、DOB曝露24時間後には、ANF mRNAが、コントロールの値と比較して75%減少した。これらの結果は、レポーター活性における変化の全てでないとしても一部は、遺伝子転写のレベルで起こったことを示唆する。
(実施例4)
(誘導可能カルシニューリン発現系による肥大感受性遺伝子の転写調節)
(プラスミド構築)
テトラサイクリンで調節されたトランスアクティベーター(tTA)発現プラスミドpUHD15−1は、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターおよびエンハンサーの制御下にキメラタンパク質tTAをコードする。tTAは、tetRタンパク質由来のアミノ酸残基1〜207およびVP16由来の残基363〜490からなる(GossenおよびBujard(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547〜5551)。
(誘導可能カルシニューリン発現系による肥大感受性遺伝子の転写調節)
(プラスミド構築)
テトラサイクリンで調節されたトランスアクティベーター(tTA)発現プラスミドpUHD15−1は、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターおよびエンハンサーの制御下にキメラタンパク質tTAをコードする。tTAは、tetRタンパク質由来のアミノ酸残基1〜207およびVP16由来の残基363〜490からなる(GossenおよびBujard(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547〜5551)。
プラスミドpUHD10−3は、キメラのtetオペロン/CMV最小プロモーターを多重クローニング部位の上流に含む(Bujard、1996)。pUHC13−3は、キメラのtetオペロン/CMV最小プロモーターにより駆動されるホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子発現プラスミドである(GossenおよびBujard(1992))。
カルシニューリンの構成的に活性な遺伝子形態(ΔCaM−AI)は、pSRα発現ベクター内に自己阻害ドメイン欠失カルシニューリン遺伝子変異体をサブクローン化することにより生成したプラスミドpCN(α)ΔCaM−AIからもともと回収した(Parsonら、1994)。tTA誘導可能カルシニューリン構築物p10−3CaNを生成するために、構成的に活性なカルシニューリンをコードしているpCN(α)ΔCaM−AIの1.2Kbp EcoRIフラグメントを、EcoRIクローニング部位の前にtTA依存性サイトメガロウイルス(CMV)最小プロモーターを含むプラスミドpUHD10−3の唯一のEcoRI開裂部位中にサブクローン化した(Bujard、1996)。
ANFルシフェラーゼプロモーター−レポーター構築物であるNP337を、以前に他で記載したように(McBrideら、1993)、ルシフェラーゼに基いたpXP−2ベクター内に、約700bpヌクレオチドのANF近位のプロモーターフラグメントをクローニングすることにより作製した。
骨格筋α−アクチンレポーターであるSkA−Lucを、ホタルルシフェラーゼ発現ベクターpXP1内に、トリの骨格筋α−アクチン遺伝子(MacLellanら、1994)の約420bpの近位の上流プロモーター(−394bpから+24hp)をサブクローン化することにより構築した。別のレポーター構築物である心筋α−アクチンプロモーター−ルシフェラーゼ(CardA−Luc)は、pGL2ベーシックルシフェラーゼベクターのHindIIIクローニング部位内に、ニワトリ心筋α−アクチンプロモーターおよび中間の上流領域の330bpフラグメント(−315から+15、転写開始点に対して)をサブクローン化することにより生成した(ChenおよびSchwartz、1996)。
(細胞培養物)
初代心筋細胞培養 初代心室心筋細胞を、実施例3に記載のように、1〜4日齢のSprague−Dawleyラットから調製した。
初代心筋細胞培養 初代心室心筋細胞を、実施例3に記載のように、1〜4日齢のSprague−Dawleyラットから調製した。
(結果)
(初代新生仔ラット心筋細胞におけるテトラサイクリン依存性トランスアクティベーター(tTA)発現系による外因性標的遺伝子転写の調節)
レポーター遺伝子としてのホタルルシフェラーゼ遺伝子は、pUHC13−3におけるキメラtetオペロン/CMV最小プロモーターの制御下にあった。一過性のトランスフェクションを、実施例3に記載のように実行した。この構築物およびtTA発現プラスミドpUHD15−1を、エフェクター物質ドキシサイクリン(doxcycline)の非存在下または存在下において、細胞に同時トランスフェクションした場合、ルシフェラーゼ活性の変化は、標的遺伝子転写の転写を制御するためのtTA系の能力を示す。テトラサイクリン調節化遺伝子発現系が、初代ラット心筋細胞において機能するかどうかを試験するために、細胞培養物を、tTA発現プラスミドpUHD15−1(0.25μg)およびtTA刺激化ルシフェラーゼ遺伝子発現構築物pUHC13−3(0.25μg)で同時トランスフェクションした。コントロールとして、同量のレポータープラスミドpUHC13−3と空ベクターであるpUHD10−3を、同じ細胞調製由来の心筋細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション後、細胞抽出物におけるルシフェラーゼ活性を、種々の時間点で、実施例3に記載したようなルシフェラーゼアッセイを用いて試験した。tTAの非存在下では、非常に低レベルのレポーター遺伝子活性のみが、トランスフェクション後48時間の間に検出された。tTA発現は、図11Aに示すように、この期間中レポーター活性の劇的な増加を生じ、そして標的遺伝子活性は、トランスフェクション後12時間で最大に達した。トランスフェクション後12時間で、tTAをトランスフェクションされた細胞におけるルシフェラーゼ活性は、tTAトランスフェクションのない細胞におけるルシフェラーゼ活性より30倍以上高かった(図11Aおよび11B)。細胞をトランスフェクション後1μg/mlのドキシサイクリン(Fluka Chemical Corp.)で処理した場合、標的遺伝子のトランス活性化は、顕著に抑圧された。しかし、ドキシサイクリン処理それ自体は、標的遺伝子の一過性の低レベルの発現(トランスフェクション後12時間で約4倍増加)を引き起こした(図11Aおよび11B)。このことは、初代心筋細胞における標的遺伝子のドキシサイクリン抑圧が完全でないことを示唆する一過性のトランスフェクションにおける外因性の遺伝子の発現は、これらの細胞において、元来の遺伝子調節機構のしっかりとした制御下にはない可能性がある。ドキシサイクリン処理は、この標的遺伝子の低レベルの発現を刺激するために弱いシグナルを生じさせ得る。従って、ドキシサイクリンは、この系において心臓遺伝子転写を調節するための最もよいエフェクターではないようである。
(初代新生仔ラット心筋細胞におけるテトラサイクリン依存性トランスアクティベーター(tTA)発現系による外因性標的遺伝子転写の調節)
レポーター遺伝子としてのホタルルシフェラーゼ遺伝子は、pUHC13−3におけるキメラtetオペロン/CMV最小プロモーターの制御下にあった。一過性のトランスフェクションを、実施例3に記載のように実行した。この構築物およびtTA発現プラスミドpUHD15−1を、エフェクター物質ドキシサイクリン(doxcycline)の非存在下または存在下において、細胞に同時トランスフェクションした場合、ルシフェラーゼ活性の変化は、標的遺伝子転写の転写を制御するためのtTA系の能力を示す。テトラサイクリン調節化遺伝子発現系が、初代ラット心筋細胞において機能するかどうかを試験するために、細胞培養物を、tTA発現プラスミドpUHD15−1(0.25μg)およびtTA刺激化ルシフェラーゼ遺伝子発現構築物pUHC13−3(0.25μg)で同時トランスフェクションした。コントロールとして、同量のレポータープラスミドpUHC13−3と空ベクターであるpUHD10−3を、同じ細胞調製由来の心筋細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション後、細胞抽出物におけるルシフェラーゼ活性を、種々の時間点で、実施例3に記載したようなルシフェラーゼアッセイを用いて試験した。tTAの非存在下では、非常に低レベルのレポーター遺伝子活性のみが、トランスフェクション後48時間の間に検出された。tTA発現は、図11Aに示すように、この期間中レポーター活性の劇的な増加を生じ、そして標的遺伝子活性は、トランスフェクション後12時間で最大に達した。トランスフェクション後12時間で、tTAをトランスフェクションされた細胞におけるルシフェラーゼ活性は、tTAトランスフェクションのない細胞におけるルシフェラーゼ活性より30倍以上高かった(図11Aおよび11B)。細胞をトランスフェクション後1μg/mlのドキシサイクリン(Fluka Chemical Corp.)で処理した場合、標的遺伝子のトランス活性化は、顕著に抑圧された。しかし、ドキシサイクリン処理それ自体は、標的遺伝子の一過性の低レベルの発現(トランスフェクション後12時間で約4倍増加)を引き起こした(図11Aおよび11B)。このことは、初代心筋細胞における標的遺伝子のドキシサイクリン抑圧が完全でないことを示唆する一過性のトランスフェクションにおける外因性の遺伝子の発現は、これらの細胞において、元来の遺伝子調節機構のしっかりとした制御下にはない可能性がある。ドキシサイクリン処理は、この標的遺伝子の低レベルの発現を刺激するために弱いシグナルを生じさせ得る。従って、ドキシサイクリンは、この系において心臓遺伝子転写を調節するための最もよいエフェクターではないようである。
(tTA制御カルシニューリン発現系により誘導された肥大感受性遺伝子の転写は、カルシニューリン遺伝子用量に依存する)
構成的に発現した活性なカルシニューリンは、初代ラット心筋細胞においてANFレポーター遺伝子の転写を活性化する。さらに、心筋α−アクチンレポーター遺伝子の転写は、Pac−1平滑筋細胞においてtTAで刺激した活性カルシニューリン発現により誘導される。初代心筋細胞における心臓遺伝子転写に対する活性カルシニューリンの効果を検出するために、および心臓遺伝子発現を誘導するためのトランスフェクションにおけるカルシニューリン構築物の最適な濃度を決定するために、種々の量のtTA依存性活性化カルシニューリン発現構築物p10−3CaN、0.25μgのtTA発現プラスミドpUHD15−1および0.25μgの心筋α−アクチンプロモーター−レポータープラスミドCardA−Lucを、初代ラット心筋細胞内にトランスフェクションした。結果を図12に示す。空ベクターであるpUHD10−3を、p10−3CaNの代わりをするために、または0.75μg/ウエルにまで全DNAを補うために、コントロールとして使用した。トランスフェクション後24時間で、心筋α−アクチンレポーター遺伝子の発現レベルを、実施例3に記載したようにルシフェラーゼアッセイにより分析した。図12に示すように、外因性の活性カルシニューリンの不在下で、レポーター遺伝子発現のレベルは極めて低かったが、心筋α−アクチンレポーター遺伝子の転写は、トランスフェクションしたp10−3CaNの用量の漸増により徐々に高められた。カルシニューリンDNAの量が0.25μgまでの場合、レポーター遺伝子の発現は、ほぼ最大レベルに増加した。明らかに、心筋α−アクチン遺伝子の発現は、活性カルシニューリン遺伝子用量依存性である。0.25μgのp10−3CaNを、次の実験において最適用量として使用した。
構成的に発現した活性なカルシニューリンは、初代ラット心筋細胞においてANFレポーター遺伝子の転写を活性化する。さらに、心筋α−アクチンレポーター遺伝子の転写は、Pac−1平滑筋細胞においてtTAで刺激した活性カルシニューリン発現により誘導される。初代心筋細胞における心臓遺伝子転写に対する活性カルシニューリンの効果を検出するために、および心臓遺伝子発現を誘導するためのトランスフェクションにおけるカルシニューリン構築物の最適な濃度を決定するために、種々の量のtTA依存性活性化カルシニューリン発現構築物p10−3CaN、0.25μgのtTA発現プラスミドpUHD15−1および0.25μgの心筋α−アクチンプロモーター−レポータープラスミドCardA−Lucを、初代ラット心筋細胞内にトランスフェクションした。結果を図12に示す。空ベクターであるpUHD10−3を、p10−3CaNの代わりをするために、または0.75μg/ウエルにまで全DNAを補うために、コントロールとして使用した。トランスフェクション後24時間で、心筋α−アクチンレポーター遺伝子の発現レベルを、実施例3に記載したようにルシフェラーゼアッセイにより分析した。図12に示すように、外因性の活性カルシニューリンの不在下で、レポーター遺伝子発現のレベルは極めて低かったが、心筋α−アクチンレポーター遺伝子の転写は、トランスフェクションしたp10−3CaNの用量の漸増により徐々に高められた。カルシニューリンDNAの量が0.25μgまでの場合、レポーター遺伝子の発現は、ほぼ最大レベルに増加した。明らかに、心筋α−アクチン遺伝子の発現は、活性カルシニューリン遺伝子用量依存性である。0.25μgのp10−3CaNを、次の実験において最適用量として使用した。
(カルシニューリンの活性形態の誘導された発現は、心筋細胞における3つの肥大感受性遺伝子の転写を迅速に活性化する)
心筋細胞において心臓遺伝子の発現を調節するカルシニューリンの能力をさらに評価するために、本発明者らは、活性カルシニューリン発現の誘導下の3つの肥大応答遺伝子の発現の経時変化を研究した。心筋α−アクチン、骨格筋α−アクチン、およびANFプロモーター−Lucプラスミドを、レポーターとして使用した。初代新生仔ラット心筋細胞を、レポーターであるpUHD15−1およびp10−3CaN、またはp10−3CaNの代わりに空ベクターpUHD10−3のどちらかと、pUHD15−1およびレポータープラスミドと共に同時トランスフェクションした。各プラスミド量は0.25μgであった。トランスフェクションを、実施例3に記載のように実行した。トランスフェクション後種々の時間点で、細胞抽出物のルシフェラーゼ活性を、実施例3に記載のように測定した。各実験において、ルシフェラーゼ活性の最高レベルを、レポーター遺伝子の最大応答として使用し、全てのデータを、最大応答のパーセンテージに基準化した。外因性の活性カルシニューリンの発現の不在下では、3つの心臓遺伝子の転写レベルは、非常に低かった。しかし、活性カルシニューリンの発現は、図13に示すように、3つの心臓遺伝子の転写を顕著に誘導した。心筋α−アクチン、骨格筋α−アクチン、およびANF遺伝子の発現は全て、転写後48時間でほぼ最大レベルにまで有意に増加した。このことは、活性カルシニューリンが、初代心筋細胞においてこれらの肥大応答遺伝子の転写を迅速に活性化することを示唆する。
心筋細胞において心臓遺伝子の発現を調節するカルシニューリンの能力をさらに評価するために、本発明者らは、活性カルシニューリン発現の誘導下の3つの肥大応答遺伝子の発現の経時変化を研究した。心筋α−アクチン、骨格筋α−アクチン、およびANFプロモーター−Lucプラスミドを、レポーターとして使用した。初代新生仔ラット心筋細胞を、レポーターであるpUHD15−1およびp10−3CaN、またはp10−3CaNの代わりに空ベクターpUHD10−3のどちらかと、pUHD15−1およびレポータープラスミドと共に同時トランスフェクションした。各プラスミド量は0.25μgであった。トランスフェクションを、実施例3に記載のように実行した。トランスフェクション後種々の時間点で、細胞抽出物のルシフェラーゼ活性を、実施例3に記載のように測定した。各実験において、ルシフェラーゼ活性の最高レベルを、レポーター遺伝子の最大応答として使用し、全てのデータを、最大応答のパーセンテージに基準化した。外因性の活性カルシニューリンの発現の不在下では、3つの心臓遺伝子の転写レベルは、非常に低かった。しかし、活性カルシニューリンの発現は、図13に示すように、3つの心臓遺伝子の転写を顕著に誘導した。心筋α−アクチン、骨格筋α−アクチン、およびANF遺伝子の発現は全て、転写後48時間でほぼ最大レベルにまで有意に増加した。このことは、活性カルシニューリンが、初代心筋細胞においてこれらの肥大応答遺伝子の転写を迅速に活性化することを示唆する。
同じ心臓細胞調製物を、同量のレポーター、tTA、およびカルシニューリンプラスミドDNAを、図14に示すように同時トランスフェクションした場合、3つの心臓遺伝子の発現レベルを、トランスフェクション後48時間で検出した。カルシニューリンプラスミドの代わりに空ベクターpUHD10−3のみを、レポーターおよびtTAプラスミドと共に、心筋細胞にトランスフェクションしたコントロールと比較して、カルシニューリンは、約8〜10倍心筋α−アクチンの転写を強く活性化し、そして、図14Bおよび14Cに示すように、約6倍および約3倍中程度にANFおよび骨格筋α−アクチン発現を活性化した。
これらの結果は、肥大感受性遺伝子の転写に対するカルシニューリンの刺激性の効果を示しただけでなく、誘導可能遺伝子発現系の有用性もまた示した。心筋細胞における肥大応答遺伝子の転写を誘導する活性化カルシニューリンの能力は、カルシニューリンの構成的に活性な形態を過剰発現するトランスジェニックマウスからの結果(Molkentinら、1998)と一致する。例えば、カルシニューリントランスジェニックマウスの心臓における骨格筋α−アクチン遺伝子のmRNAレベルは、正常マウスの心臓におけるレベルよりも約5倍高かった。本発明者らの誘導可能発現系におけるカルシニューリンにより誘導されたANF遺伝子発現の増加倍は、カルシニューリントランスジェニックマウスにおけるBNP遺伝子活性化の増加倍と類似している。しかし、本発明者らの系における心筋α−アクチン遺伝子の転写レベルの増加倍は、カルシニューリンを過剰発現するトランスジェニックマウスにおける増加倍よりも大きい。
(シクロスポリンAによる肥大応答遺伝子発現のカルシニューリン誘導の抑圧)
活性化されたカルシニューリンによる肥大感受性遺伝子の転写の活性化が、カルシニューリンの特異的インヒビターであるCsAにより阻害され得るかどうかを評価するために、実施例3に記載されているように、p10−3CaN構築物または空ベクターpUND10−3のどちらかと、tTAおよびcardA−Lucレポータープラスミドと共にトランスフェクションされた両方の心筋細胞培養物を、トランスフェクション後0時間から異なった濃度のCsA(Sandoz Pharmaceuticals Corp.,East Hanover,NJ)またはCsA処理なしで処理した。種々の時間点で、これらの細胞におけるルシフェラーゼ活性をアッセイし、そして比較した。カルシニューリントランスフェクションを有さないコントロール群において、CsA処理のみが、図15に示すように、処理なしと比較して、心筋α−アクチン遺伝子の転写レベルの少ない減少を生じた。しかし、活性化されたカルシニューリンにより刺激された心筋α−アクチン遺伝子の発現は、図15に示すように、全ての異なった濃度のCsAにより有意に抑圧された。このことは、さらにこれらの心臓肥大応答遺伝子の発現が、カルシニューリン依存性シグナル伝達経路により活性化されるという結論を支持する。トランスフェクション後72時間で、カルシニューリンにより誘導された心筋α−アクチン遺伝子活性は、図15に示すように、100nMまたは150nM CsA処理により80%以上阻害された。このことは、非常に低濃度のCsAが、カルシニューリンにより誘導された心筋α−アクチン遺伝子の転写の活性化を阻害し得ることを示す。従って、100nMを、以下の実験においてCsAの最適濃度として選択した。
活性化されたカルシニューリンによる肥大感受性遺伝子の転写の活性化が、カルシニューリンの特異的インヒビターであるCsAにより阻害され得るかどうかを評価するために、実施例3に記載されているように、p10−3CaN構築物または空ベクターpUND10−3のどちらかと、tTAおよびcardA−Lucレポータープラスミドと共にトランスフェクションされた両方の心筋細胞培養物を、トランスフェクション後0時間から異なった濃度のCsA(Sandoz Pharmaceuticals Corp.,East Hanover,NJ)またはCsA処理なしで処理した。種々の時間点で、これらの細胞におけるルシフェラーゼ活性をアッセイし、そして比較した。カルシニューリントランスフェクションを有さないコントロール群において、CsA処理のみが、図15に示すように、処理なしと比較して、心筋α−アクチン遺伝子の転写レベルの少ない減少を生じた。しかし、活性化されたカルシニューリンにより刺激された心筋α−アクチン遺伝子の発現は、図15に示すように、全ての異なった濃度のCsAにより有意に抑圧された。このことは、さらにこれらの心臓肥大応答遺伝子の発現が、カルシニューリン依存性シグナル伝達経路により活性化されるという結論を支持する。トランスフェクション後72時間で、カルシニューリンにより誘導された心筋α−アクチン遺伝子活性は、図15に示すように、100nMまたは150nM CsA処理により80%以上阻害された。このことは、非常に低濃度のCsAが、カルシニューリンにより誘導された心筋α−アクチン遺伝子の転写の活性化を阻害し得ることを示す。従って、100nMを、以下の実験においてCsAの最適濃度として選択した。
カルシニューリンにより誘導された肥大感受性遺伝子の転写に対するCsAの効果をさらに示すために、本研究者らは、活性カルシニューリン刺激下で心筋α−アクチンプロモーター−レポーター遺伝子の発現が、いかにCsAに応答するかを分析した。初代心筋細胞を、tTA,心筋α−アクチンレポーター構築物、およびカルシニューリン、またはtTA、心筋α−アクチンレポーター遺伝子、およびコントロールとしての空ベクターのどちらかで同時トランスフェクションした。CsA処理(100nM)を、トランスフェクション後0時間で開始した。心臓細胞培養物中の心筋α−アクチン遺伝子の活性を、ルシフェラーゼアッセイにより試験し、そして結果を、最大応答のパーセンテージに規準化した。空ベクターでトランスフェクションした細胞では、図16に示すように、心筋α−アクチン遺伝子の発現は低く、そしてCsA処理細胞と未処理細胞の間の遺伝子活性において顕著な差異はなかった。しかし、CsA処理は、活性なカルシニューリンをトランスフェクションされた細胞において心臓遺伝子の転写の劇的な減少を導く。CsA処理後48時間で、カルシニューリンにより活性化された心筋α−アクチン遺伝子の発現は、図16に示すように、ほぼ基底のレベルに減少した。
上記の結果に基づき、本発明者らは、ANF、心筋α−アクチンおよび骨格筋α−アクチン遺伝子のカルシニューリンに媒介された転写の活性化に対するCsAの効果を試験した。等量の各レポーター構築物を、tTAおよびp10−3CaN DNAと共に、同じ初代培養調製由来の細胞内に同時トランスフェクションした。p10−3CaNの代わりの空ベクターpUHD10−3を、コントロールとして使用した。トランスフェクション後、活性カルシニューリンでトランスフェクションされた細胞を、100nM CsA含有培地またはCsAを欠いた培地のどちらかで48時間培養した。空ベクターでトランスフェクションした細胞を、同じ時間、CsAを欠いた培地中で培養した。次に、これらの心筋細胞を、これらの心臓肥大応答遺伝子の活性を分析するために溶解した。結果を図17に示す。活性カルシニューリンにより媒介されたANFおよび骨格筋α−アクチン遺伝子の転写の活性化は、初代ラット心筋細胞においてCsAによりほとんど完全に阻止された:カルシニューリンの作用によりアップレギュレートされた心筋α−アクチン遺伝子の転写の活性の約80%が、CsAにより阻害された。
(CsA処理による肥大感受性遺伝子の転写の抑圧は可逆的である)
複合的な研究における実際的な要求のために、外因性遺伝子の発現を双方向的に調節する能力は、遺伝子機能の研究ならびに遺伝子治療において多大な有意性を有する。本発明者らの系における外因性の肥大応答遺伝子の抑圧された発現が、CsA処理を中止することにより可逆的に制御され得るかどうかを評価するために、同一調製由来の初代心筋細胞を、tTA、カルシニューリン構築物、および心筋α−アクチンレポータープラスミドでトランスフェクションした。トランスフェクション後、全細胞を、100nM CsAで処理した。24時間後、細胞の一部を、CsA含有培地中で連続的に培養したが、細胞の別の部分を、CsAを含まない培地に変えた。種々の時間点で、これらの心筋細胞におけるレポーター遺伝子の発現を、ルシフェラーゼアッセイにより調べた。図18に示すように、72時間の間、CsA処理細胞におけるレポーター遺伝子の活性は低かった。しかし、心臓遺伝子の発現は、CsA処理を中止した後急速に上昇した。培地からCsAを除去した後48時間で(72時間点)、心筋α−アクチンレポーター遺伝子活性は、CsAで処理した細胞における活性と比較して約2.5倍増加した。データは、CsAによる心臓遺伝子の抑圧された発現が速やかに逆転し得ることを示した。従って、上記に示したこれらの結果に基くと、使用した実験条件下では、初代心筋細胞における外因性の肥大感受性遺伝子の発現は、ポジティブな経路またはネガティブな経路のどちらかで速やかに調節され得る。
複合的な研究における実際的な要求のために、外因性遺伝子の発現を双方向的に調節する能力は、遺伝子機能の研究ならびに遺伝子治療において多大な有意性を有する。本発明者らの系における外因性の肥大応答遺伝子の抑圧された発現が、CsA処理を中止することにより可逆的に制御され得るかどうかを評価するために、同一調製由来の初代心筋細胞を、tTA、カルシニューリン構築物、および心筋α−アクチンレポータープラスミドでトランスフェクションした。トランスフェクション後、全細胞を、100nM CsAで処理した。24時間後、細胞の一部を、CsA含有培地中で連続的に培養したが、細胞の別の部分を、CsAを含まない培地に変えた。種々の時間点で、これらの心筋細胞におけるレポーター遺伝子の発現を、ルシフェラーゼアッセイにより調べた。図18に示すように、72時間の間、CsA処理細胞におけるレポーター遺伝子の活性は低かった。しかし、心臓遺伝子の発現は、CsA処理を中止した後急速に上昇した。培地からCsAを除去した後48時間で(72時間点)、心筋α−アクチンレポーター遺伝子活性は、CsAで処理した細胞における活性と比較して約2.5倍増加した。データは、CsAによる心臓遺伝子の抑圧された発現が速やかに逆転し得ることを示した。従って、上記に示したこれらの結果に基くと、使用した実験条件下では、初代心筋細胞における外因性の肥大感受性遺伝子の発現は、ポジティブな経路またはネガティブな経路のどちらかで速やかに調節され得る。
(実施例5)
(培養された心筋細胞モデルにおける肥大感受性遺伝子の発現に対するCaMKIVおよびYY1の効果の特徴付け)
心筋細胞培養、心筋細胞の一過性のトランスフェクション、およびルシフェラーゼ活性測定に関する実験手順を、実施例3に記載のように行なった。心臓肥大感受性プロモーター−レポーター構築物は、実施例3に記載の通りである。
(培養された心筋細胞モデルにおける肥大感受性遺伝子の発現に対するCaMKIVおよびYY1の効果の特徴付け)
心筋細胞培養、心筋細胞の一過性のトランスフェクション、およびルシフェラーゼ活性測定に関する実験手順を、実施例3に記載のように行なった。心臓肥大感受性プロモーター−レポーター構築物は、実施例3に記載の通りである。
(結果)
構成的に活性なCaMKIVは、新生仔心筋細胞において心臓肥大感受性遺伝子プロモーター−レポーター活性の転写を増加する。
構成的に活性なCaMKIVは、新生仔心筋細胞において心臓肥大感受性遺伝子プロモーター−レポーター活性の転写を増加する。
上記記載のように、CaMKIVの構成的に活性な形態をコードするcDNAを、α−MHCプロモーターを含む発現ベクターに挿入した。新生仔心筋細胞を、実施例3に記載した骨格筋α−アクチン−ルシフェラーゼプラスミド、および発現プラスミド中のCaMKIVの構成的に活性な変異形態で同時トランスフェクションした。pSG(空ベクター)は、ネガティブコントロールとして使用した。ルシフェラーゼ活性を、トランスフェクション後種々の時間で測定した。結果を図19に示す。構成的に活性な外因性CaMKIVの過剰発現は、コントロールより300%以上に骨格筋α−アクチンプロモーター活性を増加した。
新生仔心筋細胞における心臓α−アクチンプロモーター−レポーター構築物に対する構成的に活性な外因性CaMKIVの過剰発現の効果を調査した。心筋細胞を、実施例3に記載のような心筋α−アクチンプロモーター−レポーター構築物、および構成的に活性なCaMKIVをコードする種々の量の発現プラスミドで同時トランスフェクションした。図20に示した結果は、構成的に活性なCaMKIVの過剰発現が、心筋α−アクチンプロモーター活性において適度の増加を生じることを示す。ピークの誘導(コントロールより約7倍)は、0.01μgのCaMKIV発現プラスミドを使用して成し遂げられ、そして0.10μgのCaMKIV発現プラスミドを使用した場合、ほぼコントロールのレベルに低下した。
対照的に、類似の用量依存性研究を、骨格筋α−アクチンプロモーター−レポータープラスミドを用いて行なった場合、構成的に活性なCaMKIVの過剰発現は、図21に示すように、骨格筋α−アクチンプロモーター活性における実質的な増加を生じた。類似の結果が、図22に示すように、ANFプロモーター−レポーター構築物を用いて観察された。
明細書中で言及した全ての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願が詳細にそして個々に参考として援用されるかのように、同じ程度で本明細書中で参考として援用される。
上記の発明は、理解を明確にする目的のために、説明および例示によっていくらか詳細に記載されているが、特定の変更および改変が実行されることは、当業者にとって明白である。従って、説明および例示は、本発明の範囲を限定するとして解釈されるべきでなく、発明の範囲は、添付の請求の範囲によって外延を定められる。
Claims (33)
- 心臓肥大が誘導する疾患状態を処置することにおける使用のために適切な物質をスクリーニングする方法であって、該方法は、
a)実質的に単離された酵素と、該物質とを接触させる工程であって、該酵素は、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の活性産物のレベルの調節に関与する、工程;
b)該物質の存在下での該酵素の活性を測定する工程;および
c)該物質の非存在下での該酵素の活性を測定することによってコントロールを提供する工程、
を包含し、
ここで、該コントロールと比較して、該物質による該酵素の活性の調節は、該物質が該心臓肥大が誘導する心臓疾患状態を処置することにおける使用のために適切であることを示す、
方法。 - 前記実質的に単離された酵素が、カルシニューリン、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼIV(CaMKIV)、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼIIα(AおよびB)(CaMKIIα)、YY1、p38およびMKK6、またはそれらの誘導体である、請求項1に記載の方法。
- 肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される前記少なくとも1つの遺伝子が、β−ミオシン重鎖、α−骨格筋アクチン、心房性ナトリウム利尿因子、心筋アクチン、およびb型ナトリウム利尿因子からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 心臓肥大が誘導する疾患状態を処置することにおいて使用するための物質をスクリーニングする方法であって、該方法は、
a)第1の実質的に単離された心筋細胞と、物質とを接触させる工程;
b)該物質の存在下での第1の心筋細胞の肥大に関連する心筋細胞パラメーターを測定する工程;および
c)該物質が接触していない第2の実質的に単離された心筋細胞における肥大に関連する該心筋細胞パラメーターを測定することによってコントロールを提供する工程、
を包含し、
ここで、該コントロールと比較して、該物質による該心筋細胞パラメーターの調節は、該物質が、該心臓肥大が誘導する心臓疾患状態を処置することにおける使用のために適切であることを示す、
方法。 - 前記第1および第2の心筋細胞が、初代心筋細胞である、請求項4に記載の方法。
- 前記第1および第2の心筋細胞がトランスジェニック非ヒト動物から実質的に単離され、かつ該トランスジェニック動物が、心筋細胞において発現されるトランスジーンを含み、かつ該トランスジーンの発現産物が、心筋シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の活性産物のレベルを調節する、請求項5に記載の方法。
- 前記トランスジーンの発現産物が、カルシニューリン、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼIV(CaMKIV)、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼIIα(AおよびB)(CaMKIIα)、YY1、p38およびMKK6、またはそれらの誘導体である、請求項5に記載の方法。
- 測定される前記心筋細胞パラメーターが、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の発現レベルである、請求項5に記載の方法。
- 肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される前記少なくとも1つの遺伝子が、β−ミオシン重鎖、α−骨格筋アクチン、心房性ナトリウム利尿因子、心筋アクチン、およびb型ナトリウム利尿因子からなる群より選択されるタンパク質をコードする、請求項8に記載の方法。
- 測定される前記心筋細胞パラメーターが細胞直径である、請求項4に記載の方法。
- 測定される前記心筋細胞パラメーターが細胞質量である、請求項4に記載の方法。
- 測定される前記心筋細胞パラメーターが、肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される少なくとも1つの遺伝子の活性産物のレベルである、請求項4に記載の方法。
- 肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現される前記少なくとも1つの遺伝子が、β−ミオシン重鎖、α−骨格筋アクチン、心房性ナトリウム利尿因子、心筋アクチン、およびb型ナトリウム利尿因子からなる群より選択されるタンパク質をコードする、請求項12に記載の方法。
- 心臓肥大が誘導する疾患状態を処置することにおける使用のための物質をスクリーニングする方法であって、該方法は、
a)非ヒトトランスジェニック動物またはそのインビトロ部分に物質を投与する工程であって、該非ヒトトランスジェニック動物またはそのインビトロ部分は、カルシニューリン、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼIV(CaMKIV)、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼIIα(AおよびB)(CaMKIIα)、YY1、p38およびMKK6、またはそれらの誘導体をコードするコード領域と、心筋特異的転写調節エレメントとを含むトランスジーンを含むゲノムを有する、工程;
b)該動物またはその一部の心臓パラメーターを、該物質の存在下で測定する工程;および
c)該物質を投与しない対応する動物またはその一部における該心臓パラメーターを測定することによってコントロールを提供する工程、
を包含し、
ここで、該コントロールと比較して、該物質による心臓パラメーターの調節は、該物質が、心臓肥大が誘導する心臓疾患状態を処置することにおける使用のために適切であることを示す、
方法。 - 測定される前記心臓パラメーターが、心室質量、拡張型心筋症、類線維沈着、心筋細胞組織化、カルシウムイオンフラックス、拍動の長さ、および心室拍出量、およびdP/dTからなる群より選択される、請求項14に記載の方法。
- トランスジーンを含むトランスジェニック非ヒト動物であって、該動物は、
a)少なくとも1つの心臓肥大感受性遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードするコード領域;および
b)該コード領域に作動可能に連結された転写調節エレメント(TRE)であって、該TREは、心筋細胞特異的プロモーターを含み、
ここで、該トランスジェニック動物は、非トランスジェニック同腹仔と比較した場合、心臓肥大を自発的に発症する可能性が実質的に増加しているという点において、特徴付けられる、
トランスジェニック非ヒト動物。 - 前記少なくとも1つの心臓肥大感受性遺伝子が、心房性ナトリウム利尿因子遺伝子、b型ナトリウム利尿ペプチド遺伝子、β−ミオシン重鎖遺伝子、およびα−骨格筋アクチン遺伝子からなる群より選択される、請求項16に記載のトランスジェニック動物。
- 前記心筋細胞特異的プロモーターが、α−ミオシン重鎖プロモーターである、請求項16に記載のトランスジェニック動物。
- 前記TREが誘導性プロモーターエレメントをさらに含む、請求項16に記載のトランスジェニック動物。
- 前記誘導性プロモーターエレメントが、テトラサイクリントランスアクチベーターによって調節される、請求項19に記載のトランスジェニック動物。
- 前記コード領域が、カルシニューリン、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼIV(CaMKIV)、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼIIα(AおよびB)(CaMKIIα)、YY1、p38およびMKK6、またはそれらの誘導体をコードする、請求項16に記載のトランスジェニック動物。
- 前記カルシニューリンのホスファターゼ活性が、構成的に活性である、請求項21に記載のトランスジェニック動物。
- トランスジーンを含むトランスジェニック非ヒト動物であって、該動物は、
a)少なくとも1つの心臓肥大感受性遺伝子の転写を調節する遺伝子産物をコードするコード領域;および
b)該コード領域に作動可能に連結された転写調節エレメント(TRE)であって、該TREは、心筋細胞特異的プロモーターを含み、
ここで、該トランスジェニック動物は、非トランスジェニック同腹仔と比較した場合、心臓肥大を自発的に発症する可能性が実質的に減少しているという点において、特徴付けられる、
トランスジェニック非ヒト動物。 - 前記コード領域が、カルシニューリンのドミナントネガティブ変異体をコードする、請求項23に記載のトランスジェニック動物。
- 前記変異体が、ホスファターゼ活性を実質的に欠失しており、ここで、該変異体がカルモジュリン結合を保持している、請求項24に記載のトランスジェニック動物。
- 心臓肥大のトランスジェニックマウス動物モデルを作製する方法であって、該方法は、
a)マウス胚に、カルシニューリン、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼIV(CaMKIV)、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼIIα(AおよびB)(CaMKIIα)、YY1、p38およびMKK6からなる群より選択される遺伝子産物またはその酵素的に活性な改変体をコードするコード領域を含むポリヌクレオチドを導入する工程であって、該コード領域は、心筋細胞特異的プロモーターを含む転写調節エレメントに作動可能に連結されている、工程;および
b)養育母マウスに該胚を移入する工程、
を包含し、
ここで、該トランスジェニックマウスは、非トランスジェニック同腹仔と比較した場合、心臓肥大を自発的に発症する可能性が実質的に増加しているという点において、特徴付けられる、
方法。 - 請求項26に記載の方法に従って得られたマウスを交配することによって生産される、トランスジェニックマウス。
- 請求項27に記載のマウスであって、該子孫は、前記遺伝子産物のうちの少なくとも2つを含む、マウス。
- 請求項16に記載のトランスジェニック動物から得られた細胞。
- 前記細胞が心筋細胞である、請求項29に記載の細胞。
- 請求項23に記載のトランスジェニック動物から得られた細胞。
- 前記細胞が心筋細胞である、請求項30に記載の細胞。
- 心臓肥大を減少または低減させる能力について物質をスクリーニングする方法であって、該方法は、
a)請求項16に記載のトランスジェニック動物に該物質を投与する工程;および
b)該動物における心臓パラメーターまたは心臓機能を測定して、該物質を投与していないトランスジェニック同腹仔と比較する工程、
を包含する、方法。
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