ES2241173T3 - Modelos de animales transgenicos para hipertrofia cardiaca y usos de los mismos. - Google Patents

Abstract

Uso de una composición que inhibe la actividad de calcineurina y modula la actividad de al menos un gen o producto génico que se expresa en cardiomiocitos como respuesta a una señal hipertrófica para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de hipertrofia cardiaca, hipertrofia cardiaca descompensada, hipertrofia cardiaca compuesta, hipertrofia cardiaca dilatada e insuficiencia cardiaca.,

Description

Modelos de animales transgénicos para hipertrofia cardiaca y usos de los mismos.

Campo técnico

La presente invención se refiere al uso de modelos de animales transgénicos para hipertrofia cardiaca. Se refiere además al uso de dichos animales transgénicos para detectar sustancias con actividad terapéutica hacia hipertrofia cardiaca. Se refiere además al uso de una composición para los fabricantes de un medicamento para tratar la hipertrofia cardiaca.

Técnica anterior Hipertrofia cardiaca

La hipertrofia cardiaca es una respuesta adaptativa del corazón a prácticamente todas las formas de enfermedad cardiaca, incluidas las que se producen por hipertensión, carga mecánica, infarto de miocardio, arritmias cardiacas, trastornos endocrinos y mutaciones genéticas en genes cardiacos de proteínas contráctiles. Mientras que la respuesta hipertrófica es inicialmente un mecanismo compensador que aumenta el rendimiento cardiaco, la hipertrofia sostenida puede conducir a cardiomiopatía dilatada, insuficiencia cardiaca y muerte súbita. En los Estados Unidos, cada año se diagnostica insuficiencia cardiaca en aproximadamente medio millón de individuos, con una tasa de mortalidad que se acerca al 50%.

A pesar de los diversos estímulos que conducen a hipertrofia cardiaca, existe una respuesta molecular final prototípica de cardiomiocitos a señales hipertróficas que implica un aumento en el tamaño celular y la síntesis de proteínas, una organización sarcomérica mejorada, regulación por incremento de genes cardiacos fetales e inducción de genes tempranos inmediatos, como c-fos y c-myc. Véase Chien y col. (1993) Ann. Rev. Physiol. 55:77-95; y Sadoshima e Izumo (1997) Ann. Rev. Physiol. 59:551-571. Las causas y efectos de la hipertrofia cardiaca se han documentado extensamente, pero los mecanismos moleculares subyacentes que asocian señales hipertróficas iniciadas en la membrana celular con la reprogramación de expresión de genes de cardiomiocitos siguen siendo escasamente conocidos. La elucidación de estos mecanismos es una cuestión central en biología cardiovascular y será esencial para el diseño de nuevas estrategias para la prevención o tratamiento de hipertrofia cardiaca y la insuficiencia
cardiaca.

Numerosos estudios se han referido al Ca^{2+} intracelular como una señal de hipertrofia cardiaca. Como respuesta al alargamiento del miocito a un aumento en las cargas en las preparaciones cardiacas de trabajo, las concentraciones de Ca^{2+} intracelular aumentan (Marban y col. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6005-6009; Bustamante y col. (1991) J. Cardiovasc. Pharmacol. 17:S110-S113; y Hongo y col. (1995) Am. J. Physiol. 269:C690-C697, consistente con un papel de Ca^{2+} en la coordinación de respuestas fisiológicas con un rendimiento cardiaco mejorado. Una diversidad de factores humorales, incluyendo angiotensina II (AngII), fenilefrina (PE) y endotelina-1 (ET-1), que inducen la respuesta hipertrófica en cardiomiocitos, comparten también la capacidad de elevar las concentraciones de Ca^{2+} intracelular. Karliner y col. (1990), Experientia 46:81-84; Sadoshima e Izumo (1993) Circ. Res. 73:424-438; Sadoshima y col. (1993) Cell 75:977-984; y Leite y col. (1994) Am. J. Physiol. 267:H2193-H2203.

Los estímulos hipertróficos tienen como resultado la reprogramación de expresión génica en el miocardio adulto, de forma que los genes que codifican isoformas de proteína fetal como cadena pesada de \beta-miosina (MHC) y \alpha-actina esquelética están regulados por incremento, mientras que las isoformas adultas correspondientes, \alpha-MHC y \alpha-actina cardiaca, están reguladas por decremento. Los péptidos natriuréticos, el factor natriurético auricular (ANF) y el péptido natriurético de tipo b (BNP), que reducen la presión sanguínea por vasodilatación y natriuresis, están también regulados rápidamente por incremento en el corazón como respuesta a señales hipertróficas. Komuro y Yazaki (1993), Ann. Rev. Physiol. 55:55-75. Los mecanismos implicados en la regulación coordinadamente de estos genes cardiacos durante la hipertrofia se desconocen, aunque para la activación de genes cardiacos fetales como respuesta a hipertrofia son importantes los sitios de unión para varios factores de transcripción, incluyendo el factor de respuesta a suero (SRF), TEF-1, AP-1 y Sp1. Sadoshima e Izumo (1993); Sadoshima y col. (1993); Kariya y col. (1994) J. Biol. Chem. 269:3775-3782; Karns y col. (1995) J. Biol. Chem. 270:410-417; y Kovacic-Milivojevic y col. (1996) Endocrinol. 137:1108-1117. Más recientemente, se ha demostrado que se requiere el factor de transcripción de dedo de cinc restringido cardiaco GATA4 para activación transcripcional de los genes para receptor Ang II de tipo 1a y \beta-MHC durante hipertrofia. Herzig y col. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:7543-7548; Hasegawa y col. (1997) Circulation 96:3943-3953; y Molkentin y Olson (1997) Circulation 96:3833-3835.

Se ha implicado a una serie de rutas de señalización intracelular en la transducción de estímulos hipertróficos. Por ejemplo, la ocupación de los receptores de superficies celulares para Ang II, PE y ET-1 conduce a la activación de fosfolipasa C, lo que tiene como resultado la producción de diacilglicerol y trifosfato de inositol, lo que a su vez tiene como resultado la movilización de Ca^{2+} intracelular y la activación de protein-quinasa C (PKC). Sadoshima e Izumo (1993); Yamazaki y col. (1996) J. Biol. Chem. 271:3221-3228; y Zou y col. (1996) J. Biol. Chem. 271:33592-33597. Existe también evidencia de que las rutas de Ras y proteína activada por mitógeno (MAP) quinasa son transductores de señales hipertróficas. Thorburn y col. (1993) J. Biol. Chem. 268:2244-2249; y Force y col. (1996) Circ. Res. 78:947-953. La extensión en que estas rutas de señalización están coordinadas durante hipertrofia cardiaca se desconoce. Sin embargo, todas estas rutas se asocian con un aumento en el Ca^{2+} intracelular consistente con un papel regulador central de Ca^{2+} en la coordinación de las actividades de múltiples rutas de señalización hipertróficas.

En linfocitos B y T se ha demostrado que la calcineurina fosfatasa dependiente de calmodulina de Ca^{2+} se une a rutas de señalización intracelulares que tienen como resultado la elevación de Ca^{2+} intracelular con activación de la respuesta inmunitaria. La calcineurina regula los genes de respuesta inmunitaria a través de la desfosforilación de una familia de factores de transcripción conocidos como NF-AT (factores nucleares de linfocitos T activados). Rao y col. (1997) Ann. Rev. Immunol. 15:707-747. Una vez desfosforilados por calcineurina, los factores de transcripción NF-AT se translocan al núcleo y activan directamente genes de respuesta inmunitaria. Flanagan y col. (1991) Nature 352:803-807; Loh y col. (1996) Mol. Cell. Biol. 16:3945-3954; y Loh y col. (1996) J. Biol. Chem. 271:10884-10891. Los fármacos inmunosupresores ciclosporina A (CsA) y FK506 suprimen la respuesta inmunitaria inhibiendo la capacidad de la calcineurina de activar factores de transcripción NF-AT. Shaw y col. (1995) Proc. Natl. Acad Sci. USA 92:11205-11209; Loh y col. (1996) J. Biol. Chem. 271:10884-10891.

No existen mutaciones espontáneas en ratones con suficientes semejanzas con la hipertrofia cardiaca como para que sean útiles como modelos experimentales. Se ha producido una línea de roedores transgénicos que sobreexpresa la calmodulina bajo el control del gen del factor natriurético auricular humano. Gruver y col. (1993) Endocrinology 133:376-388. En estos ratones, la sobreexpresión de desarrollo de CaM en cardiomiocitos de ratón produjo una respuesta de crecimiento cardiaco notablemente exagerada, caracterizada por la presencia de hipertrofia de cardiomiocitos en regiones que demostraron sobreexpresar CaM y por hiperplasia de cardiomiocitos, visible en fases tempranas del desarrollo. Sin embargo, la expresión de calmodulina en estos animales es constitutiva y, así, no es reflejo de condiciones fisiológicas en seres humanos. Se han creado ratones transgénicos en los que un gen indicador está regulado por un transactivador controlado por tetraciclina (tTA), que a su vez está bajo el control transcripcional de 2,9 kb de secuencia flanqueante 5' a partir del gen de cadena pesada de \alpha-miosina de rata. Yu y col. (1996) Circ. Res. 79:691-697.

El tratamiento médico actual de la hipertrofia cardiaca incluye el uso de tres tipos de fármacos: agentes bloqueantes del canal de calcio, agentes bloqueantes \beta-adrenérgicos y diisopiramida. Kikura y Levy (1995) Int. Anesthesiol. Clin. 33:21-37. Entre los agentes terapéuticos para insuficiencia cardiaca se incluyen inhibidores de enzima convertidora de angiotensina II (ACE) y diuréticos. Entre otros agentes farmacéuticos que se han desvelado para el tratamiento de hipertrofia cardiaca se incluyen antagonistas de receptor de angiotensina II (patente de EE.UU. nº 5.604.251); y antagonistas de neuropéptido Y (Publicación de Patente Internacional nº WO 98/33791). A pesar de los compuestos farmacéuticos actualmente disponibles, la prevención y el tratamiento de la hipertrofia cardiaca, y la insuficiencia cardiaca subsiguiente, siguen presentando un reto terapéutico.

Así, existe la necesidad del desarrollo de nuevas estrategias farmacológicas para la profilaxis y tratamiento de la hipertrofia cardiaca en seres humanos. Para desarrollar dichas estrategias, se necesitan modelos animales que reflejen con precisión el perfil patológico de la enfermedad, para permitir la identificación de nuevos objetos de intervención terapéutica. Además, existe la necesidad de nuevos ensayos que permitan la identificación de nuevos agentes terapéuticos potenciales para tratar la hipertrofia cardiaca.

Resumen de la invención

La presente invención usa animales no humanos como modelos. Dichos modelos son útiles para identificar objetos adicionales para el tratamiento de hipertrofia cardiaca, y para probar la eficacia de sustancias en el tratamiento de hipertrofia cardiaca. En un aspecto, la invención proporciona el uso de un animal transgénico no humano que comprende como transgén un polinucleótido que, cuando se introduce en una fase temprana en un huevo fecundado o embrión de un animal mamífero no humano, puede integrarse funcionalmente en el genoma del mismo, con lo que se produce un animal transgénico, caracterizado porque el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que codifica calcineurina que modula la transcripción de al menos un gen que se expresa en cardiomiocitos como respuesta a una señal hipertrófica cardiaca, en combinación con secuencias de control, incluyendo, por ejemplo, un promotor, que dirige y regula la expresión del gen en células somáticas del animal transgénico, en particular en cardiomiocitos.

Dichos animales transgénicos son útiles para identificar nuevos objetos para profilaxis y terapia de hipertrofia cardiaca y disfunciones inducidas por hipertrofia cardiaca. Estos animales son también útiles con fines de investigación, para examinar rutas de transducción de señales implicadas en respuesta a señales hipertróficas. Estos animales son útiles además para detectar agentes terapéuticos potenciales para tratamiento y/o profilaxis de hipertrofia cardiaca.

Preferentemente, el polinucleótido usado para generar un animal transgénico es una construcción de ADN recombinante en la que el promotor y al menos algunas secuencias de control dirigen la expresión de una secuencia de codificación unida operativamente. En algunas formas de realización, el promotor y las secuencias de control se expresan de una forma específica de cardiomiocitos. La secuencia de codificación se funde en un segmento secuencia abajo que comprende al menos un fragmento de una secuencia de genes eucariotas eficaz para proporcionar señales para terminar la transcripción y para controlar el procesamiento de ARN transcrito durante la expresión del producto génico codificado. En una forma de realización, el promotor se obtiene de un gen de cadena pesada de \alpha-miosina (\alpha-MHC). En otras formas de realización, las secuencias de control transcripcionales comprenden elementos que confieren expresión inducible en la secuencia de codificación unida operativamente. En algunas formas de realización, el animal transgénico comprende un transgén que codifica un polipéptido que modula la transcripción de al menos un gen sensible a hipertrofia cardiaca. En estas formas de realización, el polipéptido puede comprender una secuencia de aminoácidos de tipo natural o una secuencia de aminoácidos mutante tal que el polipéptido ha alterado la función como, por ejemplo, una función enzimática alterada, o ha alterado las propiedades reguladoras, incluyendo, por ejemplo, un mutante negativo dominante. En otras formas de realización, el producto génico codificado por transgén es un polinucleótido antisentido. En otras formas de realización más, el producto génico codificado por transgén es una ribozima.

Las construcciones se introducen en embriones animales usando técnicas estándar como microinyección o células madre embrionarias. Los modelos basados en cultivos celulares pueden prepararse también por varios procedimientos. Por ejemplo, pueden aislarse células de los animales transgénicos o prepararse a partir de cultivos celulares establecidos usando las mismas construcciones con técnicas de transfección celular estándar.

Las construcciones para su uso en la generación de animales transgénicos pueden construirse de manera que la expresión del transgén puede ser constitutiva o inducible. Un polinucleótido, para su uso en la generación de un animal transgénico, comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico que modula la transcripción de al menos un gen que se expresa en cardiomiocitos como respuesta a una señal hipertrófica. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico que modula la transcripción de al menos un gen que se expresa en cardiomiocitos como respuesta a una señal hipertrófica se expresa de forma constitutiva. En otro aspecto, el gen que codifica un producto génico que modula la transcripción de al menos un gen que se expresa en cardiomiocitos como respuesta a una señal hipertrófica se expresa de una manera regulable. En otro aspecto, el gen que codifica un producto génico que modula la transcripción de al menos un gen que se expresa en cardiomiocitos como respuesta a una señal hipertrófica comprende una parte que codifica un mutante negativo dominante de un polipéptido.

Un animal transgénico puede comprender, como transgén, un gen que codifica un producto génico que reprime la transcripción de al menos un gen que se expresa en cardiomiocitos como respuesta a una señal hipertrófica. El producto génico codificado por transgén es calcineurina, que induce generalmente la transcripción de genes que responden a hipertrofia cardiaca.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de cardiomiocitos aislados a partir de los animales transgénicos descritos anteriormente. Los cardiomiocitos aislados a partir de animales transgénicos pueden usarse para probar propiedades cardioterapéuticas de sustancias a las que se exponen las células in vitro. Así, las células son útiles para detectar agentes terapéuticos potenciales para tratamiento y/o profilaxis de hipertrofia cardiaca. Dichas células pueden usarse también para identificar nuevos objetos para profilaxis y terapia de hipertrofia cardiaca y disfunciones inducidas por hipertrofia cardiaca. Estas células son útiles también para fines de investigación, para examinar rutas de transducción de señales implicadas como respuesta a señales hipertróficas.

La invención proporciona así el uso de dichas células para detectar sustancias para su uso en el tratamiento de un estado de enfermedad inducido por hipertrofia cardiaca (disfunción).

En algunas formas de realización, se proporcionan ensayos enzimáticos de detección, en los que las enzimas usadas participan en la modulación de niveles de producto activo de al menos un gen que se expresa en cardiomiocitos como respuesta a una señal hipertrófica. Los procedimientos implican en general la puesta en contacto de la enzima con una sustancia que se va a probar y la medida de una actividad de la enzima, comparada con una muestra de control que comprende la enzima en ausencia de la sustancia que se va a probar.

En otras formas de realización, se proporcionan ensayos celulares de detección, en los que se ponen en contacto cardiomiocitos sustancialmente aislados con una sustancia que se va a someter a prueba, seguido de la medida de una función o parámetro de cardiomiocito. Una alteración en la función de cardiomiocito que se va a medir, cuando se compara con una muestra de células de control a la que no se añade ninguna sustancia, indica que la sustancia es adecuada para su uso en el tratamiento de una disfunción inducida por hipertrofia cardiaca. En algunas de estas formas de realización, los cardiomiocitos se obtienen de un animal transgénico según se ha descrito anteriormente. En otras formas de realización, los cardiomiocitos se obtienen de un animal no transgénico.

En otras formas de realización más, se proporcionan ensayos de detección basados en animales completos. Estas formas de realización comprenden el uso de animales transgénicos o de su corazón aislado de los mismos para probar las propiedades cardioterapéuticas de sustancias administradas a dichos animales, o para probar la actividad de dichas sustancias en el control o inhibición del desarrollo de cardiomiopatía hipertrófica. El procedimiento de detección e identificación o prueba de un fármaco u otra sustancia frente al desarrollo de o en el tratamiento de cardiomiopatía hipertrófica comprende el tratamiento de un animal transgénico o el corazón aislado a partir del animal con dicho fármaco u otra sustancia de interés y la detección u observación de alguna incidencia reducida en el desarrollo de cardiomiopatía hipertrófica y la reducción en la morbilidad, en comparación con animales correspondientes que no son tratados con el fármaco o sustancia, o la detección u observación de una eficacia en el mantenimiento, restauración o mejora de la función cardiaca.

La invención proporciona además el uso de una composición para los fabricantes de un medicamento para tratar hipertrofia cardiaca e insuficiencia cardiaca. Dichas composiciones incluyen sustancias que aumentan los niveles activos de uno o más productos génicos que normalmente reprimen la transcripción de al menos un gen que se expresa en cardiomiocitos como respuesta a una señal hipertrófica, reduciendo así la expresión del al menos un gen que se expresa en cardiomiocitos como respuesta a una señal hipertrófica. Dichas composiciones incluyen también sustancias que reducen los niveles activos de uno o más productos génicos que normalmente aumentan la transcripción de al menos un gen que se expresa en cardiomiocitos como respuesta a una señal hipertrófica, reduciendo así la expresión del al menos un gen que se expresa en cardiomiocitos como respuesta a una señal hipertrófica. Se incluyen además sustancias que son moduladores conocidos de productos génicos que modulan la transcripción de al menos un gen que se expresa en cardiomiocitos como respuesta a una señal hipertrófica, para su uso en el tratamiento de una disfunción inducida por hipertrofia cardiaca. Se incluyen inhibidores conocidos de calcineurina, y derivados de estos inhibidores que inhiben una actividad fosfatasa de calcineurina.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 presenta un modelo de señalización nuclear y control transcripcional de expresión de gen embrionario inducida por hipertrofia. Se usan las siguientes abreviaturas: VDCC, canal del calcio dependiente del voltaje; PLC, fosfolipasa C; AngII, angiotensina II; Et-1, endotelina-1; DAG, diacilglicerol; PKC, protein-quinasa C; IP3, 3-fosfato de inositol; CAM, calmodulina.

La figura 2 muestra la inhibición de hipertrofia inducida por angiotensina II y fenilefrina de cardiomiocitos primarios por CsA y FK506. A-F, se estimularon cardiocitos primarios de rata en medio sin suero con AngII (10 nM) o PE (10 \muM) durante 72 horas. A continuación se fijaron las células y se tiñeron con anticuerpo anti-\alpha-actinina para revelar sarcómeros y tinción de Hoechst para revelar los núcleos. Se añadió CsA (500 ng/ml) a un conjunto de cultivos en el momento de la adición de AngII. G, se aisló ARN total a partir de cultivos de cardiocitos primarios tratados con AngII en presencia o ausencia de CsA como en A y se analizó la expresión de transcriptos de GAPDH y ANF mediante transferencia de puntos. H, se transfectaron transitoriamente cardiomiocitos primarios de rata con un indicador de gen de luciferasa unido a 3 copias en tándem del sitio de unión de consenso NF-AT. A continuación se trataron las células con AngII o PE en presencia o ausencia de CsA, según se describe anteriormente. Cuarenta y ocho horas más tarde, se recogieron las células y se determinó la actividad de luciferasa.

La figura 3 muestra fotografías de corazones de ratones transgénicos de \alpha-MHC-calcineurina. A, se sacrificaron hermanos de camada transgénicos de \alpha-MHC-calcineurina y de control a los 18 días de vida y se extrajeron y fotografiaron los corazones. B,C, se seccionaron longitudinalmente los corazones mostrados en A para revelar las cámaras ventriculares y el tabique interventricular. D, E, vistas de gran aumento de las paredes ventriculares izquierdas de los corazones mostrados en B y C, respectivamente. F, G, secciones transversales de corazones de control y transgénicos de calcineurina a las 9 semanas de vida teñidos con H&E. H, se tiñeron secciones del corazón transgénico de calcineurina mostrado en G con tricromo de Masson para revelar colágeno. ca, arteria coronaria; la, aurícula izquierda; lv, ventrículo izquierdo; ra, aurícula derecha; rv, ventrículo derecho. Barras en B, C, F, G, H = 1 mm. Barras en D, E = 50 \mum.

La figura 4 ilustra los resultados del tratamiento de ratones de \alpha-MHC-calcineurina con CsA. A) Se muestra el régimen para tratamiento con CsA. B) Los ratones transgénicos de \alpha-MHC-calcineurina y no transgénicos se trataron con o sin CsA (25 mg/kg), según se indica. Se expresan relaciones de peso entre corazón y cuerpo \pm desviaciones típicas. Los hermanos de camada transgénicos obtenidos de transgénico de calcineurina macho nº 37 (véase Tabla 1) se trataron con CsA o vehículo en solitario empezando a los 9 días de vida, según se describe en el Ejemplo 2. A los 25 días de vida, se sacrificaron los animales y se extrajeron y seccionaron los corazones longitudinalmente. C) Se trataron secciones teñidas con hematoxilina y eosina de corazones de ratones no transgénicos (control) y transgénicos con vehículo (panel central) o CsA (panel derecho). la, aurícula izquierda; lv, ventrículo izquierdo; ra, aurícula derecha; rv, ventrículo derecho. Se extrajo la aurícula derecha del control y se extrajeron las dos aurículas del transgénico tratado con CsA. Barra = 2 mm.

La figura 5 muestra fotografías de corazones de ratones transgénicos \alpha-MHC CaMKIV. Se sacrificaron hermanos de camada de control y transgénicos \alpha-MHC-CaMKIV a las 3 semanas de vida y se extrajeron y seccionaron longitudinalmente los corazones y se tiñeron con hematoxilina y eosina. la, aurícula izquierda; lv, ventrículo izquierdo; ra, aurícula derecha; rv, ventrículo derecho.

La figura 6 es un gráfico de barras que muestra los efectos de CaMKII y CaN mutados en construcciones de promotor-indicador que comprenden promotores de ANF, \alpha-actina esquelética y \alpha-actina cardiaca que conducen expresión de luciferasa. Se cotransfectaron placas duplicadas de células miocárdicas ventriculares con plásmidos indicadores y CaMKII (1-290) o CaN_{mut}, formas constitutivamente activas de CaMKII y CaN, respectivamente. "Control" representa células cotransfectadas con vectores de expresión sin insertos de ADNc y plásmidos de promotor-indicador. Se corrigen los valores para eficacia de transfección y se expresan como la media \pm desviación típica (DT) entre al menos tres experimentos.

La figura 7 es un gráfico de barras que ilustra los efectos de isoenzimas de CaM quinasa exógenas en actividad de promotor-indicador de ANF. Se cotransfectaron placas duplicadas de cardiomiocitos ventriculares con construcción promotor-indicador de ANF y construcciones de expresión que codifican varias isoformas CaMK. "Control" representa células cotransfectadas con vector de expresión sin un inserto de ADNc y plásmido de promotor-indicador. Se corrigen los valores para eficacia de transfección y se expresan como la media \pm DT entre al menos tres experimentos.

La figura 8 es un gráfico de barras que ilustra los efectos de PE, CaMKII exógena o CaN sobre construcciones de promotor-indicador de deleción anidada de ANF. Se corrigen los valores para eficacia de transfección y se expresan como la media \pm DT entre al menos tres experimentos.

La figura 9 es un gráfico de barras que ilustra la estimulación de actividad CaMKII por receptor \beta_{1}-adrenérgico en tejido de corazón de rata neonata. Se aislaron cortes de tejido cardiaco neonatal (de 1 a 4 días de vida) y se trataron con isoproterenol (ISO, 100 \muM), dolbutamina (DOB, 10 \muM) o vehículo en solitario (control). Se añadió propanolol (PROP, 20 \muM) 2 minutos antes de que se añadieran los agonistas. Después de 30 segundos de tratamiento, se ensayó la actividad de CaMKII autónoma. Los datos se muestran como porcentaje de la proporción entre la actividad independiente de calcio dividida por la actividad total y representada como la media \pm DT entre al menos tres experimentos.

La figura 10 presenta datos que muestran los efectos de agonistas adrenoceptores en actividades de promotor-indicador para ANF, \alpha-actina esquelética y \alpha-actina cardiaca, y un curso de tiempo de efectos de DOB sobre niveles de mensaje de ANF. Las figuras 10A, B y C son gráficos de barras que muestran niveles de indicador de luciferasa después de transfección de ANF, \alpha-actina esquelética y \alpha-actina cardiaca, respectivamente, en células miocárdicas ventriculares, y tratamiento, 24 horas después de transfección, con PE (100 \muM), DOB (10 \muM) o TGF-\beta1 (1 ng/ml). Se corrigen los valores para eficacia de transfección y se expresan como la media \pm DT entre al menos tres experimentos. Figura 10 D. Se cambiaron las células miocárdicas ventriculares a medio sin suero. Se añadió DOB al medio en varios puntos de tiempo. "Control" representa células tratadas con el vehículo DOB. 24 horas después de incubación, se extrajo ARN total y se analizó por transferencia Northern. Los resultados son representativos de n = 3 o superior para cada punto de tiempo.

La figura 11 muestra la regulación de expresión de gen diana dependiente de tTA en cardiomiocitos primarios de rata. Los cardiomiocitos se cotransfectaron con plásmido de expresión tTA pUHD15-1 y una construcción de luciferasa dependiente de tTA pUHC13-3 o un vector vacío como control. 16 horas después de transfección, se incubaron células en cualquier medio sin doxciclina (DOX) o medio con doxciclina. La figura 11A muestra el curso en el tiempo de la transcripción génica diana. Círculos vacíos, vector vacío, sin DOX; círculos rellenos, vector vacío, más DOX; triángulos vacíos, pUHC13-3, sin DOX; triángulos rellenos, pUHC13-3, más DOX. La figura 11B es un gráfico de barras que ilustra la capacidad de tTA para estimular transcripción del gen diana y el efecto inhibidor de doxciclina 12 horas después de transfección.

La figura 12 es un gráfico que muestra la dependencia de la dosis de la transcripción de genes sensibles a hipertrofia cardiaca en células miocárdicas. Se cotransfectaron en células 0,25 \mug de construcción de expresión tTA pUHD-15-1, 0,25 \mug de plásmido promotor-indicador \alpha-actina cardiaca CardA-Luc, y diversas cantidades de construcción de expresión CaN dependiente de tTA p10-3CaN. Los datos son representativos de seis experimentos independientes. Los valores se expresan como media \pm ET; n = 3 cultivos.

La figura 13 presenta gráficos que muestran el curso en el tiempo de la transcripción de genes como respuesta a hipertrofia cardiaca inducidos por CaN activa exógena en células miocárdicas. Los datos están normalizados, y se expresan como un porcentaje de la respuesta máxima. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. Los valores se expresan como media \pm ET; n = 3 cultivos.

La figura 14 presenta gráficos de barras que ilustran los efectos de CaN activada en la transcripción de genes sensibles a hipertrofia en células miocárdicas. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. Los valores se expresan como media \pm ET; n = 3 cultivos.

La figura 15 es un gráfico que ilustra la inhibición por CsA de inducción por CaN de transcripción del gen de respuesta a hipertrofia cardiaca. Se cotransfectaron células miocárdicas con pUHD15-1, CardA-Luc y p10-3CaN o vector vacío. Después de transfección, se trataron las células con CsA 50 nM, 100 nM o 150 nM. 24, 48 y 72 horas después del tratamiento se midió la actividad de luciferasa.

La figura 16 es un gráfico que muestra el curso en el tiempo de la inhibición por CsA de inducción por CaN de transcripción de un gen sensible a hipertrofia cardiaca. Los valores se expresan como media \pm ET; n = 3 cultivos.

La figura 17 es un gráfico de barras que ilustra los efectos de tratamiento con CsA en la activación transcripcional genes sensibles a hipertrofia cardiaca por CaN en células miocárdicas. Los valores se expresan como media \pm ET; n = 3 cultivos.

La figura 18 es un gráfico que muestra la regulación reversible de represión transcripcional de expresión de genes de respuesta a hipertrofia cardiaca por CsA. Los valores se expresan como media \pm ET; n = 3 cultivos.

Modos de realización de la invención

El animal transgénico no humano usado para detectar sustancias adecuadas para tratar hipertrofia cardiaca comprende, como transgenes, polinucleótidos recombinantes que comprenden una secuencia de codificación que codifica calcineurina, que modula la transcripción de al menos un gen que se expresa en cardiomiocitos como respuesta a una señal hipertrófica. Dicho animal transgénico tiene una probabilidad sustancialmente aumentada, o sustancialmente reducida, de desarrollar espontáneamente hipertrofia cardiaca.

Se describe la construcción de modelos de animales transgénicos, usando los polinucleótidos recombinantes para probar tratamientos potenciales para hipertrofia cardiaca. Las construcciones génicas se introducen en embriones animales usando técnicas estándar como microinyección o células madre embrionarias.

Cuando se detectan sustancias que pueden reducir la hipertrofia cardiaca se miden varios parámetros que incluyen, pero no se limitan a, masa ventricular izquierda/peso corporal, cambios en tamaño y organización de cardiomiocitos, cambios en expresión de gen cardiaco y cambios en función cardiaca.

Técnicas generales

La práctica de la presente invención empleará, salvo que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que están dentro de los conocimientos de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía como, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (Sambrook y col., 1989); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir & C.C. Blackwell, ed.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller & M.P. Calos, ed., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel y col., ed., 1937); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis y col., ed., 1994); y Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan y col.; ed., 1991).

Para técnicas relacionadas con la producción de animales transgénicos, véanse, entre otros, Hogarz y col. (1986) Manipulating the Mouse Embryo - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1986.

Según se usa en la presente memoria descriptiva, el término "un producto génico que modula la transcripción de al menos un gen que se expresa en cardiomiocitos como respuesta a una señal hipertrófica" se refiere a cualquier producto génico, ya sea una proteína o un ARN, que modula la transcripción de al menos un gen expresado en cardiomiocitos como respuesta a una señal hipertrófica. Es también aquél que reduce o modula la actividad de al menos un gen que se expresa en cardiomiocitos como respuesta a una señal hipertrófica reduciendo niveles de transcripción y/o traducción o reduciendo la actividad de proteínas, por ejemplo, mediante inhibición competitiva o no competitiva, o reduciendo la concentración de proteínas, y similar. La "modulación" puede ser una regulación por reducción o una regulación por incremento del gen expresado en cardiomiocitos como respuesta a una señal hipertrófica.

Un gen expresado en cardiomiocitos como respuesta a una señal hipertrófica se refiere también en la presente memoria descriptiva como un "gen sensible a hipertrofia cardiaca" o un "gen que responde a hipertrofia cardiaca". Los ejemplos de genes expresados como respuesta a señales hipertróficas incluyen, pero no se limitan a, factor natriurético auricular (ANF), actina \alpha-esquelética, péptido natriurético de tipo b (BNP), actina cardiaca y cadena pesada de \beta-miosina (\beta-MHC), según se muestra esquemáticamente en la figura 1.

El término "animal transgénico" se refiere a un animal no humano, preferentemente un mamífero no humano, que ha integrado en su ADN de línea germinal una o más secuencias de ADN que se han introducido en el animal.

Según se usa en la presente memoria descriptiva, el término "señal hipertrófica" indica cualquier estímulo, mecánico o químico, que tiene como resultado síntomas mensurables de hipertrofia cardiaca. Las señales hipertróficas incluyen, pero no se limitan a, alargamiento mecánico, agonistas \beta-adrenérgicos, agonistas de receptores \alpha_{1}-adrenérgicos y angiotensina II. Los síntomas de hipertrofia cardiaca pueden medirse por varios parámetros que incluyen, pero no se limitan a, relación masa ventricular izquierda:peso corporal; cambios en tamaño, masa y organización de cardiomiocitos; cambios en expresión de gen cardiaco; cambios en función cardiaca; depósito fibroide; cambios en dP/dT, es decir, la velocidad de cambio de la presión ventricular con respecto al tiempo; flujo de iones de calcio; longitud de impulso; y rendimiento ventricular.

Los términos "elemento regulador transcripcional" (TRE) y "región de control transcripcional", "elemento de respuesta transcripcional", y "elemento de control transcripcional", usados indistintamente en la presente memoria descriptiva, se refieren a una secuencia de polinucleótidos, preferentemente una secuencia de ADN, que activa selectivamente la transcripción de una secuencia de polinucleótidos unida operativamente en una célula huésped. Un TRE incluye habitualmente una región de promotor y puede incluir opcionalmente, además de un promotor, otras secuencias de control como potenciadores y silenciadores.

Un TRE, promotor o potenciador "heterólogo" es aquél que normalmente no está asociado en una célula con, ni obtenido de, una secuencia flanqueante 5' del gen. En el contexto de un gen que codifica un producto que modula niveles activos de al menos un producto génico de un gen sensible a hipertrofia, entre los ejemplos de un promotor o potenciador heterólogo se incluye una región flanqueante 5' de gen de cadena pesada de \alpha-miosina.

El término "unido operativamente" se refiere a la orientación de elementos de polinucleótidos en una relación funcional. Un TRE está unido operativamente a un segmento de codificación si el TRE promueve la transcripción de la secuencia de codificación. Unido operativamente significa que las secuencias de ADN que están uniéndose son en general contiguas y, cuando se necesita unir dos regiones de codificación de proteínas, contiguas y en el mismo marco de lectura. Sin embargo, como los potenciadores funcionan en general cuando se separan del promotor por varias kilobases, algunos elementos de polinucleótido pueden estar unidos operativamente pero no contiguos.

Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico", usados indistintamente en la presente memoria descriptiva, se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Así, este término incluye ADN y ARN bicatenarios y monocatenarios. Los expertos en la materia reconocerán que pueden hacerse mutaciones y deleciones puntuales en las secuencias de promotores y las secuencias de región de codificación usadas en la presente invención sin alterar la capacidad de la secuencia de realizar su función, ya sea esta función activar la transcripción o codificar una proteína funcional. Preferentemente, el polinucleótido es ADN. Según se usa en la presente memoria descriptiva, "ADN" incluye no sólo bases A, T, C y G, sino también cualquiera de sus análogos o formas modificadas de estas bases, como nucleótidos metilados, modificaciones internucleótidos como uniones no cargadas y tioatos, uso de análogos de azúcares y estructuras principales modificadas y/o alternativas, como poliamidas.

Un polinucleótido "sustancialmente aislado" o "purificado" es aquél que carece sustancialmente de los materiales con los que se asocia en la naturaleza. Por "carecer sustancialmente" se entiende al menos sin el 50%, preferentemente al menos el 70%, más preferentemente al menos el 80%, y más preferentemente aún al menos el 90% de los materiales con los que está asociado en la naturaleza. Según se usa en la presente memoria descriptiva, un polinucleótido "sustancialmente aislado" se refiere también a polinucleótidos recombinantes, que, en virtud de su origen o manipulación: (1) no se asocian con la totalidad o una parte de un polinucleótido con el que se asocian en la naturaleza, (2) están unidos a un polinucleótido distinto de aquél al que se unen en la naturaleza, o (3) no existen en la naturaleza.

Según se usa en la presente memoria descriptiva, el término "anticuerpo" significa una molécula de inmunoglobina o un fragmento de una molécula de inmunoglobina que tiene la capacidad de unirse específicamente a un antígeno particular. Los anticuerpos son bien conocidos por los expertos en la ciencia de la inmunología. Según se usa en la presente memoria descriptiva, el término "anticuerpo" significa no sólo moléculas de anticuerpo intactas sino también fragmentos de moléculas de anticuerpo que conservan la capacidad de unión a antígenos. Dichos fragmentos son también muy conocidos en la técnica y se emplean regularmente tanto in vitro como in vivo. En particular, según se usa en la presente memoria descriptiva, el término "anticuerpo" significa no sólo moléculas de inmunoglobina intactas de cualquier isotipo (IgA, IgG, IgE, IgD, IgM) sino también los bien conocidos fragmentos activos F(ab')_{2}, Fab, Fv, scFv, Fd, V_{H} y V_{L}. Para fragmentos de anticuerpo, véase, por ejemplo, "Immunochemistry in Practice" (Johnstone y Thorpe, ed., 1996; Blackwell Science), p. 69.

Según se usa en la presente memoria descriptiva, una "disfunción inducida por hipertrofia cardiaca" es una dolencia o enfermedad relacionada con hipertrofia cardiaca e incluye hipertrofia cardiaca, hipertrofia cardiaca compuesta, hipertrofia cardiaca dilatada, hipertrofia cardiaca descompensada e insuficiencia cardiaca. Una disfunción inducida por hipertrofia cardiaca se caracteriza por uno o más de los siguientes síntomas o sucesos: masa ventricular concéntrica agrandada; masa ventricular excéntrica agrandada; progresión hacia miopatía cardiaca dilatada; depósito fibroide extenso; cambios en dP/dT; desorganización de cardiomiocitos; liberación y captación de iones calcio (es decir, flujo Ca^{2+}); acortamiento del latido; rendimiento ventricular disminuido; arritmias; taquicardia; cambios en la demanda central; e insuficiencia cardiaca.

Animales transgénicos

Entre los animales transgénicos útiles según la presente invención se incluyen aquéllos que tienen una probabilidad sustancialmente reducida de desarrollar espontáneamente hipertrofia cardiaca, y aquéllos que tienen una probabilidad sustancialmente aumentada de desarrollar espontáneamente hipertrofia cardiaca, en comparación con hermanos de camada no transgénicos. Una probabilidad "sustancialmente aumentada" o "sustancialmente reducida" de desarrollar espontáneamente hipertrofia cardiaca significa que se observa un aumento o reducción estadísticamente importante, respectivamente, de síntomas mensurables de hipertrofia cardiaca al comparar un animal transgénico con uno o varios hermanos de camada no transgénicos.

Los animales transgénicos se producen con transgenes que comprenden una región de codificación que codifica calcineurina. La región de codificación puede codificar el polipéptido completo, o un fragmento del mismo, en la medida en que se conserve la función del polipéptido deseada, es decir, que el polipéptido pueda modular la transcripción de al menos un gen que se expresa en cardiomiocitos como respuesta a una señal hipertrófica. La región de codificación para el uso en la construcción de los transgenes incluye además las que contienen mutaciones, incluyendo mutaciones silenciosas, mutaciones que conducen a un cambio en la secuencia de aminoácidos pero que no producen alteraciones funcionales, mutaciones que producen una proteína más activa, mutaciones que producen una proteína constitutivamente activa, mutaciones que producen una proteína con actividad reducida y mutantes negativos dominantes. Las regiones de codificación pueden obtenerse de secuencias humanas, de rata o de ratón, varias de las cuales han sido desveladas. Se han desvelado secuencias de nucleótidos para ARNm de subunidad catalítica de CaN de ratón (nº acceso en GenBank M81475 y J05479). Como ejemplos de mutantes constitutivamente activos, se han descrito formas de CaN constitutivamente activas. Sun y col. (1994) Genes Dev. 8:2527-2539; Cruzalegui y Means (1993) J. Biol. Chem. 268:26171-26178; y O'Keefe y col. (1992) Nature 357:692-694.

Los transgenes, para su uso en la generación de animales transgénicos, incluyen aquéllos en que el gen de calcineurina está 1) bajo el control de un promotor específico de cardiomiocitos; 2) expresado constitutivamente en cardiomiocitos bajo el control de un promotor específico de cardiomiocitos; 3) bajo el control de un promotor específico de cardiomiocitos pero expresado de una manera inducible.

Elementos reguladores transcripcionales

La transcripción de la región de codificación está controlada por un elemento regulador transcripcional (TRE). Entre los TRE adecuados para su uso se incluyen aquéllos que dirigen la transcripción de una región de codificación a la que están unidos operativamente preferentemente en cardiomiocitos. Con "preferentemente" se quiere decir que la expresión del transgén en cardiomiocitos es de al menos 10 veces aproximadamente, más preferentemente entre al menos 10 veces aproximadamente y 50 veces aproximadamente, más preferentemente aún entre al menos 50 veces aproximadamente y 100 veces, más preferentemente todavía más de 100 veces más que en no cardiomiocitos. Preferentemente, la expresión del transgén está por debajo de límites detectables en células distintas de cardiomiocitos, según se indica en ensayos de gen indicador, como los descritos en los Ejemplos.

En la bibliografía se ha descrito una diversidad de TRE específicos de cardiomiocitos y pueden usarse. Éstos incluyen, pero no se limitan a, TRE obtenidos de los siguientes genes: cadena ligera de miosina-2, cadena pesada de \alpha-miosina, AE3, troponina cardiaca C y \alpha-actina cardiaca. Franz y col. (1997) Cardiovasc. Res. 35:560-566; Robbins y col. (1995) Ann N.Y. Acad. Sci. 752:492-505; Linn y col. (1995) Circ. Res. 76:584-591; Parmacek y col. (1994) Mol. Cell. Biol. 14:1870-1885; Hunter y col. (1993) Hypertension 22:608-617; y Sartorelli y col. (1992) Proc. Natl. Acad Sci. USA 89:4047-4051.

En una forma de realización, el TRE comprende una región de promotor desde la región flanqueante 5' de un gen \alpha-MHC. En GenBank se proporciona una secuencia flanqueante 5' de base 5443 para el gen \alpha-MHC de ratón con el número de acceso U71441. Aunque en los transgenes de la presente invención puede usarse la secuencia completa de 5,4 kb, pueden usarse también partes de la misma con transcripción directa de una región de codificación unida operativamente preferentemente en cardiomiocitos. Puede usarse el vector de expresión \alpha-MHC descrito en el Ejemplo *
para insertar una región de codificación deseada de manera que la región de codificación esté unida operativamente al promotor \alpha-MHC. Jones y col. (1994) Dev. Dyn. 22:117-128.

En otra forma de realización, el TRE comprende una región de promotor de la región flanqueante 5' de un gen de péptido natriurético de tipo b (BNP). Thuerauf y Glembotski (1997) J. Biol. Chem. 272:7464-7472; y LaPointe y col. (1996) Hypertension 27:715-722. Se ha desvelado una secuencia de nucleótidos para una región flanqueante 5' de BNP humana (nº acceso en GenBank D16641).

En otras formas de realización, la región de codificación está unida operativamente a uno o varios elementos reguladores inducibles. En la bibliografía se ha descrito una diversidad de sistemas promotores inducibles y pueden usarse en la presente invención. Éstos incluyen, pero no se limitan a, sistemas regulables de tetraciclina (documentos WO 94/29442; WO 96/40892 y WO 96/01313); sistemas de respuesta a hormonas, sistemas inducibles por interferón, sistemas inducibles por metal y sistemas inducibles por calor (documento WO 93/20218); y sistemas inducibles por ecdisona. Algunos de estos sistemas, incluyendo los sistemas inducibles por ecdisona e inducibles por tetraciclina, están disponibles comercialmente en Invitrogen (Carlsbad, CA) y Clontech (Palo Alto, CA),
respectivamente.

En algunas formas de realización, el sistema promotor inducible (regulable) comprende un operador de unión a tetraciclina, tetO, regulado por adición de tetraciclina (o un análogo de la misma) al agua o la dieta del animal, unido operativamente a una región de codificación cuyo producto modula la transcripción de al menos un gen expresado en cardiomiocitos como respuesta a una señal hipertrófica. Los sistemas adecuados para su uso en la presente invención son bien conocidos. Yu y col. (1996) Circ. Res. 79:691-697; Gossen y col. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551; y Hillen y Wissmann, en Protein-Nucleic Acid Interaction, Topics in Molecular and Structural Biology, Saenger y Heinemann, ed. Macmillan, Londres (1989), pág. 143-162. En general, este sistema hace uso de una proteína de fusión híbrida, el transactivador de tetraciclina (tTA), que comprende un dominio de unión a ADN, capaz de unión a tetO, obtenido de un polipéptido como la proteína del represor tet (tetR) de E. coli, acoplada a un dominio de activación transcripcional, por ejemplo, de la proteína vírica VP16, de manera que cuando tTA se une a un promotor mínimo que contiene secuencias tetO, se activa la transcripción del gen diana. La unión de tetraciclina a tTA evita la activación, causando presumiblemente un cambio conformacional en la parte tetR de tTA, bloqueando la unión de tTA a tetO. La activación génica tiene lugar eliminando la tetraciclina.

Además, pueden usarse TRE específicos del tipo celular. Los TRE específicos del tipo celular incluyen, pero no se limitan a, los obtenidos de los siguientes genes de ejemplo (tipos celulares en que los TRE son funcionales específicamente están entre paréntesis): receptor de factor de crecimiento endotelial vascular (endotelio), albúmina (hígado), factor VII (hígado), sintasa de ácidos grasos (hígado), factor de von Willebrand (endotelio encefálico), cadena pesada de miosina y alfa-actina (ambas en músculo liso), sintetasa I (intestino delgado), transportador de Na-K-Cl (riñón); antígeno específico de la próstata (próstata) y gen de calicreína-1 glandular (próstata).

Otra clase de TRE son los que activan la transcripción de un polinucleótido unido operativamente como respuesta a condiciones hipóxicas. Entre ellos se incluyen TRE regulados, al menos en parte, por factor 1 inducible por hipoxia. Bunn y Poyton (1996) Physiol. Rev. 76:839-885; Dachs y Stratford (1996) Br. J. Cancer 74:5126-5132; Guillemin y Krasnow (1997) Cell 89:9-12. Firth y col. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:6496-6500; y Jiang y col. (1997) Cancer Res. 57:5328-5335.

En la técnica se conoce y puede usarse una amplia diversidad de promotores víricos, lo que incluye, pero no se limita a, un promotor de citomegalovirus (CMV), un promotor de virus de sarcoma de Rous (VSR), un promotor SV40 y un promotor MMTV LTR. Dependiendo de la naturaleza de su regulación, los promotores pueden ser constitutivos o regulables por condiciones experimentales.

Otras secuencias reguladoras que pueden incluirse en un transgén incluyen señales de poliadenilación y señales de terminación, la última de las cuales puede servir para potenciar los niveles de mensaje y para reducir al mínimo la translectura en otras secuencias. Estas secuencias reguladoras son conocidas en la técnica.

Polinucleótidos para uso en formación de animales transgénicos

Entre los polinucleótidos sustancialmente aislados para su uso en la formación de un animal transgénico se incluyen polinucleótidos que comprenden una región de codificación que codifica una calcineurina.

Se han descrito varios clones de ADNc adecuados para su uso en la presente invención para crear animales transgénicos: subunidad catalítica de calcineurina, Muramatsu y Kincaid (1992) Biochim. Biophys Res. Comm. 188:265-271 (secuencia humana para subunidad catalítica, nº acceso en GenBank S46622), Kincaid y col. (1990) J. Biol. Chem. 265:11312-11319 (secuencias de ratón para subunidad catalítica, nº de acceso en GenBank J05479 y M81475).

Los clones de expresión para hacer ratones transgénicos pueden construirse también de manera que la región de codificación lleve una o más mutaciones que afecten a la actividad de la proteína codificada. Por ejemplo, un mutante CaM carente de aminoácidos 75-82 se une a Ca^{2+} con propiedades cinéticas similares a las de CaM de tipo natural, pero es incapaz de activar varias enzimas diana dependientes de CaM in vitro. Van Berkum y col. (1990) J. Biol. Chem. 265:3750-3756.

Entre las mutaciones útiles se incluyen las que producen formas constitutivamente activas de la proteína codificada. Por ejemplo, para generar animales transgénicos pueden usarse genes que codifican formas mutantes constitutivamente activas de CaN.

Otras mutaciones útiles incluyen mutantes negativos dominantes.

Entre los productos génicos de polinucleótidos que son útiles se incluyen polinucleótidos antisentido, ribozimas y polinucleótidos de triple hélice que modulan la expresión de un producto de al menos un gen que se expresa en cardiomiocitos como respuesta a una señal hipertrófica. Los polinucleótidos antisentido y las ribozimas se han descrito ampliamente. S.T. Crooke y B. Lebleu, editores, Antisense Research and Applications (1993) CRC Press; y Antisense RNA and DNA (1983) D.A. Melton, Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor, NY. Las moléculas de ADN y ARN antisentido actúan bloqueando directamente la traducción de ARNm mediante unión al ARNm diana y evitando la traducción a proteínas. Un ejemplo de un polinucleótido antisentido es un oligodesoxirribonucleótido obtenido del sitio de inicio de traducción, por ejemplo, entre -10 y +10 regiones de la secuencia de nucleótidos relevante.

Las ribozimas son moléculas de ARN enzimáticas capaces de catalizar la escisión específica de ARN. El mecanismo de acción de ribozima implica interacción específica de secuencia de la molécula de ribozima con el ARN diana complementario, seguido de una escisión endonucleolítica. Dentro del ámbito de la invención están moléculas de ribozima diseñadas como de cabeza de martillo u otro motivo que catalizan de forma específica y eficaz la escisión endonucleolítica de secuencias de ARN que codifican componentes complejos de proteínas.

Los sitios de escisión de ribozimas específicos dentro de cualquier ARN diana potencial se identifican inicialmente mediante barrido de la molécula diana para los sitios de escisión de ribozimas que incluyen las siguientes secuencias, GUA, GUU y GUC. Una vez identificados, pueden evaluarse las secuencias de ARN cortas de entre 15 y 20 ribonucleótidos correspondientes a la región del gen diana que contiene el sitio de escisión en cuanto a rasgos estructurales predichos, como estructura secundaria, que pueden convertir en inadecuada la secuencia de oligonucleótidos. La adecuación de los objetos candidatos puede evaluarse también probando su accesibilidad a la hibridación con oligonucleótidos complementarios, usando ensayos de protección de ribonucleasa. Véase Draper PCT WO 93/23569; y patente de EE.UU. nº 5.093.246.

Las moléculas de ácidos nucleicos usadas en la formación de triple hélice para la inhibición de transcripción son en general monocatenarias y están compuestas por desoxirribonucleótidos. La composición de base debe diseñarse para promover la formación de triple hélice a través de las reglas de apareamiento de bases de Hoogsteen, que requieren en general que estén presentes alargamientos dimensionables de purinas o pirimidinas en una cadena de un dúplex. Las secuencias de nucleótidos pueden estar basadas en pirimidina, lo que producirá tripletes TAT y CGC^{+} a través de las tres cadenas asociadas de la triple hélice resultante. Las moléculas ricas en pirimidina proporcionan complementariedad de bases para una región rica en purinas de una única cadena del dúplex en una orientación paralela a dicha cadena. Además, las moléculas de ácidos nucleicos pueden elegirse de manera que sean ricas en purinas, por ejemplo, que contengan un alargamiento de residuos G. Estas moléculas formarán una triple hélice con un dúplex de ADN que es rico en pares GC, en el que la mayoría de los residuos de purina están situados en una única cadena del dúplex diana, lo que produce tripletes GGC a través de las tres cadenas del tríplex.

Alternativamente, las secuencias potenciales que pueden ser objeto para formación de triple hélice pueden aumentarse creando una molécula de ácido nucleico denominada "alternada". Las moléculas alternadas se sintetizan en forma 5'-3', 3'-5' alternante, de manera que formen par de bases primero con una cadena de un dúplex y luego con la otra, eliminando la necesidad de que esté presente un alargamiento dimensionable de purinas o pirimidinas en una cadena de un dúplex.

Las moléculas de ADN y ARN antisentido, las ribozimas y las moléculas de triple hélice pueden prepararse por cualquier procedimiento conocido en la técnica para la síntesis de moléculas de ADN y ARN. Véase, Draper, id. Entre ellas se incluyen técnicas para sintetizar químicamente oligodesoxirribonucleótidos bien conocidas en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, síntesis química de fosforamidita en fase sólida. Alternativamente, las moléculas de ARN pueden generarse por transcripción in vitro y in vivo de secuencias de ADN que codifican la molécula de ARN antisentido. Dichas secuencias de ADN pueden incorporarse en una amplia variedad de vectores que incorporan promotores de ARN polimerasa adecuados como los promotores de polimerasa T7 o SP6. Alternativamente, pueden introducirse en células, de manera estable o transitoria, construcciones de ADNc antisentido de manera constitutiva o inducible, dependiendo del promotor usado.

Pueden introducirse diversas modificaciones bien conocidas en las moléculas de ADN como medio de aumentar la estabilidad intracelular y la semivida. Las modificaciones posibles incluyen, pero no se limitan a, la adición de secuencias flanqueantes de ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos a los extremos 5' y/o 3' de la molécula o el uso de fosforotioato o 2' O-metilo en vez de uniones de fosfodiesterasa dentro de la estructura principal de oligodesoxirribonucleótido.

Los productos génicos que modulan la transcripción de al menos un gen que se expresa en cardiomiocitos como respuesta a una señal hipertrófica pueden identificarse por cualquier medio conocido en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, un sistema doble híbrido de levadura, una diversidad de los cuales son conocidos en la técnica y se describen en mayor detalle más adelante. Un ensayo de activación de transcripción como el sistema doble híbrido de levadura sistema permite la identificación y manipulación de interacciones proteína-proteína. Fields y Song (1989) Nature 340:245-246. La base conceptual de un ensayo de activación de transcripción se preconiza en la naturaleza modular de factores de transcripción, que consisten en dominios de unión a ADN y transactivación funcionalmente separables. Cuando se expresan como proteínas separadas, estos dos dominios no consiguen mediar la transcripción génica. Sin embargo, la capacidad de activar la transcripción puede recuperarse si el dominio de unión a ADN y el dominio de transactivación se puentean conjuntamente a través de una interacción proteína-proteína. Estos dominios pueden puentearse, por ejemplo, mediante expresión del dominio de unión a ADN y el dominio de transactivación como proteínas de fusión (híbridos), en los que las proteínas que se añaden a estos dominios pueden interaccionar entre sí. La interacción proteína-proteína de los híbridos puede llevar a los dominios de unión a ADN y transactivación conjuntamente a crear un complejo transcripcionalmente competente. Un componente conocido de una ruta de transducción de señales como GATA4 puede actuar como "cebo", y puede fundirse con una proteína de unión a ADN. Pueden hacerse bibliotecas de ADNc de expresión que permitan la expresión de proteínas de fusión que comprenden una proteína unida a un activador transcripcional. Las proteínas que se unen funcionalmente a GATA4 permiten así que tenga lugar la transcripción del gen IacZ. El producto del gen IacZ puede detectarse entonces añadiendo un sustrato cromogénico al sustrato de crecimiento. Existen kits comercialmente disponibles para realizar dichos ensayos.

Construcciones de ácidos nucleicos usados para formar animales transgénicos

Las construcciones para su uso en la generación de animales transgénicos comprenden un TRE para expresión de la construcción en una célula animal y una región que codifica un producto génico que modula la transcripción de al menos un gen que se expresa en cardiomiocitos como respuesta a una señal hipertrófica.

En algunas formas de realización, una construcción para su uso en la generación de un animal transgénico comprende una región que codifica un producto génico que modula la transcripción de al menos un gen sensible a hipertrofia en cardiomiocitos, en el que la región que codifica el producto génico está unida operativamente a un promotor heterólogo tal que el producto génico está sobreexpresado en cardiomiocitos. "Sobreexpresado" indica que el producto génico se expresa al menos entre 2 veces aproximadamente y 5 veces aproximadamente, preferentemente al menos entre 5 veces aproximadamente y 50 veces aproximadamente, más preferentemente al menos entre 50 veces aproximadamente y 100 veces aproximadamente, más preferentemente todavía al menos 100 veces aproximadamente, cuando se compara con la expresión del gen en células de tipo natural o cuando se compara con la expresión del gen unido operativamente a su promotor homólogo.

En otras formas de realización, la construcción para su uso en la generación de un animal transgénico comprende una región que codifica un producto génico que modula la transcripción de al menos un gen sensible a hipertrofia en cardiomiocitos, en el que la región que codifica el producto génico está unida operativamente a un TRE heterólogo y la región que codifica el producto génico está mutada de manera que el producto génico codificado es constitutivamente activo en cardiomiocitos.

En otras formas de realización, la construcción para su uso en la generación de un animal transgénico comprende una región que codifica un producto génico que modula la transcripción de al menos un gen sensible a hipertrofia en cardiomiocitos, en el que la región que codifica el producto génico está unida operativamente a un TRE heterólogo y en el que la transcripción de la región que codifica el producto génico es inducible. Los sistemas inducibles se conocen en la técnica y se describen en la presente memoria descriptiva.

En otras formas de realización, la construcción para su uso en la generación de un animal transgénico comprende una región que codifica un producto génico que modula la transcripción de al menos un gen sensible a hipertrofia en cardiomiocitos, en el que el producto génico es un mutante negativo dominante.

Los clones de ADN para microinyección pueden prepararse por cualquier medio conocido en la técnica. Por ejemplo, los clones de ADN para microinyección pueden escindirse con enzimas apropiadas para eliminar las secuencias de plásmidos bacterianos, y los fragmentos de ADN someterse a electroforesis mediante técnicas estándar. Las bandas de ADN se visualizan por tinción con bromuro de etidio, y la banda que contiene las secuencias de expresión se suprime. La banda suprimida se coloca entonces en bolsas de diálisis que contienen acetato de sodio 0,3 M, pH 7,0. Se electroeluye ADN en las bolsas de diálisis, se extrae con una solución de fenol:cloroformo 1:1 y se precipita mediante dos volúmenes de etanol. Se vuelve a disolver el ADN en 1 ml de tampón salino bajo (NaCl 0,2 M, Tris 20 mM, pH 7,4 y EDTA 1 mM) y se purifica sobre una columna Elute-D^{TM}. La columna se activa primero con 3 ml de tampón salino alto (NaCl 1 M, Tris 20 mM, pH 7,4, y EDTA 1 mM) seguido de lavado con 5 ml de tampón salino bajo. Las soluciones de ADN se pasan a través de la columna tres veces para unir el ADN a la matriz de columna. Después de un lavado con 3 ml de tampón salino bajo, se eluye el ADN con 0,4 ml de tampón salino alto y se precipita mediante dos volúmenes de etanol. Se miden las concentraciones de ADN por absorción a 260 nm en un espectrofotómetro UV. Para microinyección, se ajustan las concentraciones de ADN a 3 \mug/ml en Tris 5 mM, pH 7,4 y EDTA 0,1 mM.

Otros procedimientos para purificación de ADN para microinyección se describen en Hogan y col. Manipulating the Mouse Embryo (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1986), en Palmiter y col. Nature 306:611 (1982); en The Qiagenologist, Application Protocols, 3ª edición, publicado por Qiagen, Inc., Chatsworth, CA; y en Sambrook y col. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Pruebas de construcciones de transgenes en cultivo celular

En las construcciones de transgenes puede probarse, si se desea, la actividad en cultivo in vitro, según se describe en los Ejemplos. La actividad TRE puede probarse, por ejemplo, introduciendo en cardiomiocitos en cultivo una construcción de polinucleótido que comprende un TRE unido operativamente a un gen cuya capacidad para modular la transcripción de al menos un gen que se expresa en cardiomiocitos como respuesta a una señal hipertrófica que se va a medir, y monitorizando la expresión del gen o genes sensibles a hipertrofia. Alternativamente, la actividad de un TRE puede probarse introduciendo en cardiomiocitos en cultivo una construcción de polinucleótido que comprende un TRE unido operativamente a un gen indicador que proporciona una señal detectable y cuantificable de forma deseable.

La o las secuencias que se van a probar pueden insertarse en un vector tal que están unidas operativamente a un gen indicador apropiado que codifica una proteína de indicador, que incluye, pero no se limita a, cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), \beta-galactosidasa (codificada por el gen lacZ), luciferasa (codificada por el gen luc), fosfatasa alcalina, proteína fluorescente verde y peroxidasa de rábano. Dichos vectores y ensayos están fácilmente disponibles en, entre otros, fuentes comerciales. Los plásmidos así construidos se transfectan en una célula huésped adecuada para probar la expresión del gen indicador según se controla por el TRE usando procedimientos de transfección conocidos en la técnica, como precipitación por fosfato de calcio, electroporación, liposomas (lipofección) y DEAE dextrano.

El construcción puede prepararse según medios convencionales, introduciendo cada uno de los componentes de la construcción en un plásmido empleando sitios de restricción convenientes, PCR para introducir secuencias específicas en los terminales, que pueden incluir sitios de restricción, y similares. Después de haber preparado la construcción de expresión, puede introducirse en las células mediante cualquier medio conveniente.

Entre los procedimientos para introducir la construcción de expresión en células se incluyen transfección, formación de complejo con compuestos catiónicos, lipofección, electroporación y similares. Una construcción de expresión puede introducirse en una célula en asociación con cualquiera de los vehículos de suministro, incluidos vehículos de suministro víricos y no víricos, según se describe más adelante. Después de la introducción de la construcción de expresión en las células, puede determinarse la expresión del gen indicador por medios convencionales. Cualquier ensayo que detecte un producto del gen indicador, ya sea detectando directamente la proteína codificada por el gen indicador o detectando un producto enzimático de una enzima codificada por gen indicador, es adecuado para su uso en la presente invención. Entre los ensayos se incluyen ensayos colorimétricos, fluorimétricos o luminiscentes o incluso, en el caso de marcadores de proteínas, radioinmunoensayos u otros ensayos inmunológicos. La eficacia de la transfección puede monitorizarse mediante cotransfección de una construcción de expresión que comprende un promotor constitutivamente activo unido operativamente a un gen indicador.

La actividad de un TRE en una construcción de gen indicador de TRE puede evaluarse después de expresión transitoria, o pueden crearse líneas celulares estables. Si va a crearse una línea celular estable, entonces la construcción contiene también un gen de selección referido asimismo como un marcador seleccionable. Este gen codifica una proteína necesaria para la supervivencia o crecimiento de células huésped transformadas desarrolladas en un medio de cultivo selectivo. Las células huésped no transformadas con el vector que contiene el gen de selección no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que confieren resistencia a antibióticos y otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, deficiencias auxotróficas de complemento o nutrientes críticos de suministro no disponibles en medios complejos. Alternativamente, el marcador seleccionable puede estar contenido en una construcción separadamente de la construcción que contiene el gen indicador de TRE, y las dos construcciones introducidas simultáneamente en células huésped.

Para evaluar la capacidad de uno o más productos génicos de modular la actividad de un TRE, una construcción de expresión que comprende un gen que codifica un producto que se va a probar puede cotransfectarse en cardiomiocitos junto con la construcción de gen indicador de TRE. El efecto del producto génico sobre la expresión del gen indicador puede evaluarse entonces según se describe anteriormente.

Para evaluar la capacidad de uno o más productos génicos de modular la transcripción de uno o más genes sensibles a hipertrofia, una construcción de expresión que comprende un TRE de un gen sensible a hipertrofia puede estar unido operativamente a un gen indicador según se describe anteriormente, e introducirse en células según se describe anteriormente. Las construcciones de expresión que comprenden un gen que codifica un producto cuya capacidad de modular la transcripción de uno o más genes sensibles a hipertrofia que se van a probar pueden cotransfectarse en las células. El efecto del producto génico sobre la expresión del gen indicador puede evaluarse entonces según se describe anteriormente.

Opcionalmente, pueden añadirse agentes adicionales al medio de cultivo como agonistas y antagonistas de receptores, lo que incluye, pero no se limita a, agonistas o antagonistas de receptores adrenérgicos. El efecto, si existe, sobre la transcripción de un gen sensible a hipertrofia puede medirse según se describe anteriormente.

Los agonistas y antagonistas adecuados para su uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, agonistas específicos \beta1 como albuterol (ALB) y dobutamina (DOB); antagonistas específicos \beta1 como metoprolol (MET); agonistas específicos \alpha1 como fenilefrina (PE); antagonistas específicos \alpha1 como prazosin; agonistas \beta mixtos como isoproterenol (ISO); antagonistas \beta mixtos como propanolol (PROP); y angiotensina II.

Suministro de construcciones de polinucleótidos en células

Una construcción de polinucleótido puede introducirse en una célula en una diversidad de formas. Entre los vehículos de suministro adecuados para suministro de un polinucleótido en una célula (ya in vivo, ex vivo o in vitro) se incluyen vehículos de suministro víricos y no víricos. En general, una secuencia de polinucleótido estará unida operativamente a un elemento regulador transcripcional (TRE) y un polinucleótido heterólogo. Un polinucleótido que comprende una región de codificación que codifica un producto génico que modula la transcripción de al menos un gen que se expresa en cardiomiocitos como respuesta a una señal hipertrófica, o un polinucleótido que comprende un gen sensible a hipertrofia, puede estar contenido en un vector de clonación o expresión, usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Estos vectores (en especial los vectores de expresión) pueden a su vez ser manipulados para asumir cualquiera de una serie de formas que pueden facilitar, por ejemplo, el suministro y/o la entrada en una célula. El suministro de las construcciones de polinucleótidos de la invención en células eucariotas, en particular a células de mamífero, más en particular en cardiomiocitos, puede llevarse a cabo mediante cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica. El suministro puede realizarse in vivo, ex vivo o in vitro.

Entre los vehículos de suministro adecuados para incorporación de un polinucleótido para introducción en una célula huésped se incluyen vehículosno víricos y vectores víricos. Verma y Somia (1997) Nature 389:239-242.

En la técnica se conoce una amplia variedad de vehículos no víricos para suministro de un polinucleótido y están comprendidos en la presente invención. Un polinucleótido puede administrarse a una célula como ADN desnudo (patente de EE.UU. nº 5.692.622; documento WO 97/40163). Alternativamente, un polinucleótido puede suministrarse a una célula asociada en una diversidad de formas con una diversidad de sustancias (formas de suministro) que incluye, pero no se limita a, lípidos catiónicos, polímeros biocompatibles, incluyendo polímeros naturales y polímeros sintéticos; lipoproteínas; polipéptidos; polisacáridos; lipopolisacáridos; cubiertas víricas artificiales; partículas metálicas y bacterias. Un vehículo de suministro puede ser una micropartícula. Pueden usarse también como vehículos de suministro mezclas o conjugados de estas diversas sustancias. Un polinucleótido puede asociarse de forma no covalente o covalente con estas diversas formas de suministro. Los liposomas pueden dirigirse a un tipo celular particular, por ejemplo, a un cardiomiocito.

Los vectores víricos incluyen, pero no se limitan a, vectores víricos de ADN como los basados en adenovirus, virus del herpes simple, poxvirus como virus Vaccinia, y parvovirus, incluyendo virus adeno-asociados; y vectores víricos de ARN, que incluyen, pero no se limitan a, los vectores retrovirales. Entre los vectores retrovirales se incluyen virus de la leucemia murina y Ientivirus como virus de inmunodeficiencia humana. Naldini y col. (1996) Science 272:263-267.

Los vehículos de suministro no víricos que comprenden un polinucleótido pueden introducirse en células huésped y/o células diana por cualquier procedimiento conocido en la técnica, como transfección por la técnica de coprecipitación con fosfato de calcio; electroporación; electropermeabilización; transfección mediada por liposomas; transfección balística; procedimientos biolísticos incluyendo bombardeo con micropartículas, inyección de chorro e inyección de aguja y jeringuilla; o por microinyección. Los expertos en el campo conocen numerosos procedimientos de transfección.

Los vehículos de suministro vírico pueden introducirse en las células por infección. Alternativamente, los vehículos víricos pueden incorporarse en cualquiera de los vehículos de suministro no víricos descritos anteriormente para suministro en células. Por ejemplo, los vectores víricos pueden mezclarse con lípidos catiónicos (Hodgson y Solaiman (1996) Nature Biotechnol. 14:339-342); o liposomas lamelares (Wilson y col. (1977) Proc. Natl. Acad Sci. USA 74:3471; y Faller y col. (1984) J. Virol. 49:269).

Para suministro in vivo, el o los vehículos de suministro pueden introducirse en un individuo por cualquiera de una serie de procedimientos, cada uno de los cuales es familiar en la técnica.

Fuentes animales

Los animales que son adecuados para la generación de animales transgénicos son animales no humanos, preferentemente mamíferos, e incluyen, pero no se limitan a, ratones, ratas, conejos, cerdos, vacas y ovejas.

Los animales adecuados para experimentos transgénicos pueden obtenerse de fuentes comerciales estándar, como Charles River (Wilmington, MA), Taconic (Genmantown, NY) y Harlan Sprague Dawley (Indianápolis, IN). Por ejemplo, si el animal transgénico es un ratón, existen muchas cepas de ratón adecuadas, aunque se prefieren ratones hembra C57BL/6 para recuperación y transferencia embrionaria. Los machos C57BL/6 pueden usarse para apareamiento y los machos C57BL/6 vasectomizados pueden usarse para estimular una pseudogestación. Pueden obtenerse ratones y ratas vasectomizados a partir del proveedor.

Animales transgénicos

Los animales transgénicos pueden formarse mediante cualquier procedimiento conocido, incluyendo procedimientos de microinyección y procedimientos de células madre embrionarias. Los procedimientos para manipulación del embrión de roedor y para microinyección de ADN se describen en detalle en Hogan y col., Manipulating the Mouse Embryo (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1986), cuyas enseñanzas son en general conocidas y se incorporan en la presente memoria descriptiva.

Como ejemplo de microinyección, se indujo a ratones hembra de seis semanas de vida a superovular con una inyección 5 UI (0,1 ml, ip) de gonadotropina de suero de yegua gestante (PMSG; Sigma) seguido 48 horas más tarde de una inyección de 5 UI (0,1 ml, ip) de gonadotropina coriónica humana (hCG; Sigma). Las hembras se colocan con machos inmediatamente después de inyección de hCG. Veintiuna horas después de inyección de hCG, las hembras apareadas se sacrifican mediante asfixia con CO_{2} o dislocación cervical y se recuperan los embriones de los oviductos extirpados y se colocan en tampón salino fosfatado de Dulbecco con albúmina de suero bovino (BSA; Sigma) al 0,5%. Se eliminan las células de cúmulos circundantes con hialuronidasa (1 mg/ml). A continuación se lavan los embriones pronucleares y se colocan en solución salina equilibrada de Earle que contiene BSA (EBSS) al 0,5% en una incubadora de 37,5ºC con una atmósfera humidificada de CO_{2} al 5%, aire al 95% hasta el momento de la inyección. Los embriones pueden implantarse en una fase de dos células.

Los ratones hembra adultos de ciclo aleatorio se emparejan con machos vasectomizados. Para este fin pueden usarse ratones suizos o C57BL/6 u otras cepas comparables. Las hembras receptoras se emparejan al mismo tiempo como hembras donantes. En el momento de transferencia del embrión, se anestesia a las hembras receptoras con una inyección intraperitoneal de 0,015 ml de avertina al 2,5% por gramo de peso corporal. Se exponen los oviductos mediante una incisión dorsal única de línea media. A continuación se hace una incisión a través de la pared corporal directamente sobre el oviducto. A continuación se desgarra la bolsa ovárica con pinzas de relojero. Los embriones que se van a transferir se colocan en DPBS (tampón salino fosfatado de Dulbecco) y en el extremo de una pipeta de transferencia (aproximadamente de 10 a 12 embriones). El extremo de la pipeta se inserta en el infundíbulo y se transfieren los embriones. Después de la transferencia, se cierra la incisión con dos suturas.

Identificación y caracterización de animales transgénicos

Los animales transgénicos pueden identificarse analizando su ADN. Para este fin, cuando el animal transgénico es un roedor, pueden extraerse muestras de la cola (1 a 2 cm) de animales de tres semanas de vida. A continuación puede prepararse el ADN de estas u otras muestras y analizarse mediante transferencia Southern, PCR o transferencia en ranura para detectar animales fundadores transgénicos (F_{0}) y su progenie (F_{1} y F_{2}).

1. Estudios patológicos

Los diversos animales F_{0}, F_{1} y F_{2} que transportan un transgén pueden analizarse por cualquiera de una diversidad de técnicas, incluyendo inmunohistología, microscopia electrónica, electrocardiografía y realización de determinaciones de pesos cardiacos total y regional, midiendo las áreas de sección transversal de cardiomiocitos y determinando series de cardiomiocitos. Los análisis inmunohistológicos de la expresión de un transgén usando un anticuerpo de especificidad apropiada pueden realizarse usando procedimientos conocidos. Los análisis morfométricos para determinar pesos regionales, áreas de sección transversal de cardiomiocitos y series de núcleos de cardiomiocitos pueden realizarse usando procedimientos conocidos. Pueden analizarse la función, histología y expresión de genes cardiacos fetales de los corazones.

2. Análisis de expresión transgénica midiendo los niveles de ARNm

El ARN mensajero puede aislarse por cualquier procedimiento conocido en la técnica, lo que incluye, pero no se limita, el procedimiento de extracción por tiocianato de guanidinio ácido-fenol:cloroformo (Chomczynski y Sacchi (1987) Anal. Biochem. 162:156-159), a partir de líneas celulares y tejidos de animales transgénicos para determinar los niveles de expresión mediante transferencias Northern, ARNasa, PCR cuantitativa y ensayos de protección de nucleasa.

3. Análisis de expresión transgénica midiendo niveles de proteínas

Los niveles de proteínas pueden medirse por cualquier medio conocido en la técnica, lo que incluye, pero no se limita a, análisis por inmunotransferencia, ELISA y radioinmunoensayo, usando uno o más anticuerpos específicos para la proteína codificada por el transgén.

Para análisis por inmunotransferencia, las fracciones de proteína pueden aislarse de homogenatos de tejido y lisados celulares y someterse a análisis por inmunotransferencia según se describe, por ejemplo, en Harlow y col. Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, NY, 1988).

Por ejemplo, las fracciones de proteína pueden desnaturalizarse en tampón de muestra de Laemmli y someterse a electroforesis sobre geles de SDS-poliacrilamida. Las proteínas se transfieren a continuación a filtros de nitrocelulosa mediante electrotransferencia. Los filtros se bloquean, se incuban con anticuerpos primarios, y finalmente se hacen reaccionar con anticuerpos secundarios conjugados con enzima. La posterior incubación con el sustrato cromogénico apropiado revela la posición de las proteínas codificadas por el transgén.

Cruce de animales transgénicos

Los animales transgénicos no humanos que son progenie de cruces entre un animal transgénico y un segundo animal pueden ser útiles para identificar otros factores que influyen en la respuesta hipertrófica y que podrían servir también como objetos para fármacos. Los animales transgénicos pueden criarse con otros animales transgénicos, en los que los dos animales transgénicos se generaron usando diferentes transgenes, para probar el efecto de un producto génico en otro producto génico o para probar los efectos combinados de dos productos génicos.

En algunas formas de realización, un primer animal transgénico que comprende como transgén un polinucleótido que codifica calcineurina unida operativamente a un TRE heterólogo específico de cardiomiocito, en el que la expresión del transgén es letal en embriones, u otros efectos perjudiciales tales que los animales no sobreviven demasiado tiempo para el análisis, el transgén puede colocarse bajo control transcripcional de un promotor inducible, como el sistema inducible tet descrito anteriormente, de manera que el transgén no se expresa sustancialmente hasta que se desea. Dichos animales pueden cruzarse con un animal transgénico "fundador" constitutivo tTA, que comprende como transgén un polinucleótido que comprende un tTA bajo control de tetraciclina.

En otras formas de realización, un primer animal transgénico, que comprende como transgén una calcineurina unida operativamente a un TRE heterólogo específico de cardiomiocito, de forma que el primer animal muestra uno o más síntomas de hipertrofia cardiaca, se cruza con un segundo animal transgénico que comprende como transgén un mutante negativo dominante de calcineurina. La progenie de dicho cruce mostraría una reducción de uno o más síntomas asociados con hipertrofia cardiaca.

Detección de sustancias para tratamiento de hipertrofia cardiaca

Los animales transgénicos, células animales aisladas de animales transgénicos o enzimas aisladas pueden usarse para detectar sustancias con un efecto potencial en el tratamiento de hipertrofia cardiaca.

Ensayos enzimáticos de detección

En ensayos enzimáticos de detección, se ponen en contacto enzimas sustancialmente aisladas implicadas como respuesta a una señal hipertrófica en cardiomiocitos con una sustancia que va a someterse a prueba. Se mide la actividad de la enzima en presencia de la sustancia, después de un tiempo adecuado. Las condiciones y tiempos suficientes para interacción de un agonista o antagonista enzimático candidato con la enzima variará con la enzima; sin embargo, las condiciones adecuadas en general para la unión se dan entre aproximadamente 4ºC y aproximadamente 40ºC, preferentemente entre aproximadamente 4ºC y aproximadamente 37ºC; en una solución tamponada que contiene iones apropiados en un intervalo de concentración apropiado, que puede variar para una enzima dada; y dentro de un intervalo de pH de entre 5 y 9. El tiempo suficiente para la unión y la respuesta estará en general entre aproximadamente 1 milisegundo y aproximadamente 24 horas después de la exposición.

La actividad enzimática en presencia de la sustancia que se va a probar se compara con la actividad en ausencia de la sustancia que se va a probar. Un aumento o disminución en la actividad medida es un indicio de que la sustancia es adecuada para su uso en la reducción de una disfunción inducida por hipertrofia cardiaca. Se considera que una sustancia tiene un efecto en la actividad enzimática si la actividad medida aumenta o se reduce al menos 2 veces aproximadamente, más preferentemente al menos 5 veces aproximadamente, más preferentemente al menos 10 veces o más aproximadamente, con respecto a la actividad enzimática medida en ausencia de la sustancia que se va a probar. La sustancia puede someterse a prueba además en un ensayo basado en una célula y/o basado en el animal completo, según se describe más adelante.

Las enzimas que participan en una respuesta a una señal hipertrófica en cardiomiocitos son formas de calcineurina. Las enzimas pueden estar en forma nativa; una forma mutada que tenga actividades enzimáticas alteradas y/o estabilidad o solubilidad in vitro; una forma mutante en la que un regulador u otro componente de calcineurina esté ausente, pero la enzima conserve una actividad enzimática relacionada como respuesta a una señal hipertrófica; asociada de forma covalente o no covalente con otra molécula para conferir estabilidad in vitro, facilitar la unión a un soporte sólido, proporcionar un determinante antigénico y similar. Las enzimas pueden conjugarse en una etiqueta capaz de producir una señal detectable u otras fracciones funcionales. Las etiquetas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, radionúclidos, otras enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, tintes fluorescentes, tintes quimioluminiscentes, compuestos bioluminescentes y partículas magnéticas.

Preferentemente, para su uso en un ensayo de detección, una enzima está sustancialmente purificada. Una enzima "sustancialmente aislada" o "purificada" es aquélla que carece sustancialmente de los materiales con que se asocia en la naturaleza, en particular de otro material o sustancias proteináceos que pueden inhibir una actividad enzimática relacionada como respuesta a una señal hipertrófica. Por "carecer sustancialmente" se quiere decir sin al menos el 50%, preferentemente al menos el 70%, más preferentemente al menos el 80%, y más preferentemente todavía al menos el 90% de los materiales con que se asocia en la naturaleza. Según se usa en la presente memoria descriptiva, una enzima "sustancialmente aislada" se refiere también a enzimas recombinantes, que, en virtud de su origen o por manipulación: (1) no están asociadas con la totalidad o parte de una enzima con la que se asocian en la naturaleza, (2) están unidas a un polipéptido distinto de aquél al que están unidas en la naturaleza, o (3) no existen en la
naturaleza.

Las enzimas para su uso en estos ensayos pueden obtenerse mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica, lo que incluye, pero no se limita a, fuentes naturales, síntesis química o técnicas recombinantes. Una enzima para su uso en los ensayos de detección descritos en la presente memoria descriptiva puede purificarse por cualquier procedimiento conocido. En la técnica se conoce una amplia diversidad de procedimientos. Véase, por ejemplo, Protein Purification: Principles and Practice, R. Scopes, ed. (1987) Springer-Verlag.

La actividad enzimática puede determinarse por cualquier procedimiento conocido.

Ensayos celulares de detección

En ensayos celulares de detección, el compuesto que se va someter a prueba se introduce en los medios de cultivo de células, durante un período de tiempo y en varias dosificaciones, a continuación se examinan una o más funciones de las células, lo que incluye, pero no se limita a, cambios en niveles de expresión de un gen sensible a hipertrofia, cambios en niveles de un producto de polipéptido de un gen sensible a hipertrofia y cambios en el tamaño y/o morfología de la célula.

Los ensayos de detección para determinar el potencial terapéutico de compuestos puede realizarse usando células animales obtenidas de transgénicos para las construcciones transgénicas desveladas en cultivos celulares y transfectarse de forma estable o transitoria con las construcciones desveladas. Los ensayos celulares de detección pueden realizarse también usando células primarias, como cardiomiocitos, obtenidas de un animal no transgénico, estando las células transfectadas de forma estable o transitoria con las construcciones de polinucleótido, o estando estimuladas con señales hipertróficas como angiotensina II o agonistas \alpha-adrenérgicos.

Para detectar un cambio en los niveles de producto de polipéptido, de un gen sensible a hipertrofia, puede usarse una diversidad de procedimientos de ensayo, todos los cuales se conocen en la técnica. Por ejemplo, puede usarse un ensayo inmunológico como ELISA, empleando uno o más anticuerpos específicos para uno o más productos de polipéptido de un gen sensible a hipertrofia.

Para detectar un cambio en niveles de expresión de un gen sensible a hipertrofia, puede usarse cualquier procedimiento conocido, lo que incluye, pero no se limita a, hibridación con una sonda de polinucleótido que es complementaria a un producto ARN del gene; y una reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores de oligonucleótidos que ceban la extensión de una copia de ADNc de un producto de ARN del gen. Se han desvelado las secuencias de nucleótidos de algunos genes sensibles a hipertrofia, y esta información puede usarse para diseñar cebadores de oligonucleótidos.

Alternativamente, las células pueden transfectarse con una construcción de gen indicador que comprende un gen indicador unido operativamente a un TRE, en particular uno obtenido de un gen sensible a hipertrofia. En estos ensayos, la lectura de estos ensayos es el nivel de producto de gen indicador activo. Se han desvelado las secuencias de nucleótidos de regiones flanqueantes 5' de algún gen sensible a hipertrofia, y pueden usarse para generar construcciones que comprenden un TRE de gen sensible a hipertrofia cardiaca unido operativamente a un gen indicador. Dichas secuencias de nucleótidos incluyen, por ejemplo, secuencias flanqueantes 5' de ANF de rata (nº de acceso en GenBank J03267); y secuencias flanqueantes 5' de \beta-MHC de ratón (nº de acceso en GenBank U86076).

Los ensayos celulares de detección descritos en la presente memoria descriptiva pueden usarse como detectores primarios, o alternativamente, como detectores secundarios para probar adicionalmente los compuestos que están activos en la detección enzimática descrita anteriormente.

Para estos ensayos, las células adecuadas incluyen, pero no se limitan a, cardiomiocitos primarios, aislados de animales transgénicos o no transgénicos. Otras células adecuadas para su uso en ensayos celulares de detección incluyen tipos celulares no cardiomiocitos, como fibroblastos.

En algunas formas de realización, las células se transfectan con una construcción que comprende un TRE de un gen que responde a hipertrofia unido operativamente a un gen indicador. Los genes indicadores son conocidos en la técnica y se describen anteriormente. Un ejemplo es una proteína fluorescente verde (GFP) y variantes de la misma. Véase, por ejemplo, Heim y Tsien (I996) Curr. Biol. 6:178-182; Mitra y col. (1996) Gene 173:13-17; y Yang y col. (1996) Nucl. Acids Res. 24:4592-4593. Las células transfectadas se colocan entonces en placas de cultivo de 96 pocillos a entre 1,5 y 2,5 x 10^{4} células por pocillo en un medio de cultivo adecuado, como medio esencial mínimo de Dulbecco más suero bovino fetal al 10%. Después de incubación durante toda la noche a 37ºC en una incubadora equilibrada con dióxido de carbono al 5%, se retiran los medios y se sustituyen con medios que contienen un compuesto que se va a someter a prueba y se incuba durante un período de tiempo adecuado. Un período de tiempo adecuado para incubación con una sustancia que se va a someter a prueba puede estar entre aproximadamente 0,5 horas y aproximadamente 24 horas. Además del compuesto de prueba, se añade al medio de cultivo una sustancia que induce hipertrofia. La sustancia que induce hipertrofia puede añadirse simultáneamente, antes o después de la adición de la sustancia de prueba. Las sustancias que inducen hipertrofia incluyen, pero no se limitan a, angiotensina II y PE. Las reservas que contienen el compuesto que se va a someter a prueba se preparan primero en un disolvente adecuado. Se prueban varias diluciones del compuesto de prueba. Entre los controles apropiados se incluyen células a las que se añade disolvente que no contiene sustancia de prueba, y células a las que se añadió una sustancia de prueba, pero a las que no se añade sustancia que induce hipertrofia.

Después del tratamiento, se mide un efecto del compuesto de prueba usando un ensayo adecuado para el producto de gen indicador.

Los genes indicadores que pueden emplearse son bien conocidos e incluyen, pero no se limitan a, luciferasa; una proteína fluorescente verde (GFP) como, por ejemplo, una GFP de Aequorea victoria, o cualquiera de una diversidad de GFP conocidas en la técnica; \beta-galactosidasa, cloranfenicol acetiltransferasa; "marcadores" de proteínas inmunológicamente detectables como hormona del crecimiento humano; y similares. Véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel y col., ed., 1987) y actualizaciones periódicas.

Cualquier ensayo que detecte un producto del gen indicador, ya sea detectando directamente la proteína codificada por el gen indicador o detectando un producto enzimático de una enzima codificada por gen indicador, es adecuado para su uso en la presente invención. Entre los ensayos se incluyen ensayos colorimétricos, fluorimétricos o luminiscentes o incluso, en el caso de marcadores de proteínas, radioinmunoensayos u otros ensayos inmunológicos.

Se considera que una sustancia tiene un efecto si la transcripción del gen indicador unido operativamente aumenta o disminuye en células al menos aproximadamente 2 veces, más preferentemente al menos aproximadamente 5 veces, más preferentemente al menos aproximadamente 10 veces o más, con respecto a las células de control que no se expusieron a la sustancia.

Los efectos citotóxicos de las sustancias pueden medirse por cualquier medio conocido en la técnica. Por ejemplo, los efectos citotóxicos de las sustancias pueden medirse por una modificación del procedimiento de Hansen y col. (1989) J. Immunol. Method. 119:203-210. A las células que quedan en la placa de cultivo de tejido se añaden 25 \muL de una solución de reserva de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) (5 mg/ml) para una concentración final de 1 mg/ml. Las células se incuban a 37ºC durante una hora, y se detiene la actividad celular por la adición de un volumen igual de tampón de lisis de MTT (dodecilsulfato de sodio al 20% p/v en dimetilformamida al 50%, pH 4,7). La extracción completa se consigue agitando durante toda la noche a temperatura ambiente. La diferencia en DO_{562nm} y DO_{650nm} se mide en un lector de microplaca UV_{máx} de Molecular Device, o equivalente, como un indicador de la viabilidad celular. Otros ensayos de viabilidad celular incluyen exclusión de azul de tripano.

Ensayos de detección basados en el animal completo

En los ensayos de detección basados en el animal completo descritos en la presente memoria descriptiva el compuesto se administra a un animal transgénico durante un período de tiempo y en varias dosificaciones, a continuación se examina en los animales la función cardiaca, medida por varios parámetros que incluyen, pero no se limitan a, relación de masa ventricular izquierda:peso corporal; tamaño y organización de cardiomiocitos; expresión de gen sensible a hipertrofia cardiaca; función cardiaca; dP/dT; depósito fibroide; flujo de iones de calcio; duración del latido; y rendimiento ventricular. Un ensayo basado en el animal completo puede usarse como detector primario, o puede usarse como detector secundario para evaluar además sustancias identificadas en una detección enzimática y/o celular. En otra forma de realización, puede usarse una parte de un animal transgénico en un ensayo de detección in vitro. Por ejemplo, puede usarse un corazón aislado a partir de un animal transgénico en un ensayo de detección in vitro. Los parámetros que pueden medirse son los mismos que en detecciones de fármacos en animales completos.

Ensayos para detectar proteínas que interaccionan con enzimas implicadas como respuesta a una señal hipertrófica

Los objetos de enzima usados en los ensayos enzimáticos de detección descritos anteriormente son útiles también para identificar otros factores, que pueden ser polipéptidos, que interaccionan con la enzima diana. Dichos factores pueden evaluarse entonces en términos de utilidad como objetos terapéuticos en el tratamiento de una disfunción inducida por hipertrofia cardiaca. Dichos factores pueden analizarse también en términos de un papel potencial en la modulación de una función biológica del producto génico diana.

Puede usarse cualquier procedimiento conocido para identificar polipéptidos que interaccionan con una enzima diana. Entre los ensayos adecuados se incluyen ensayos in vitro e in vivo. Los ensayos in vitro incluyen, pero no se limitan a, coprecipitación, captura interactiva de proteínas y ELISA. Pueden diseñarse ensayos para identificar compuestos que se unen a productos génicos diana, unirse a otras proteínas celulares o extracelulares que interaccionan con un producto génico diana, e interferir con la interacción de un producto génico diana con otras proteínas celulares.

Como ejemplo de captura interactiva de proteínas, puede realizarse una detección de dos híbridos de levadura usando GATA4 de ratón como cebo para identificar factores de interacción potenciales en el miocardio adulto, según se describe. Molkentin y col. (1998) Cell 93:215-228. En este ejemplo, el cebo de GATA4 contiene aminoácidos 130-409 fusionados en fase con el dominio de unión de ADN GAL4. Esta región de GATA4 abarca los dos dominios de dedo de cinc y se codifica en un fragmento PstI-NsiI, que se clonó en un sitio PstI en el vector de expresión de levadura pAS. pAS-GATA4 se cotransformó en levadura con una biblioteca de corazón de ratón adulto que contenía el dominio de activación GAL4 fusionado con ADNc aleatorios y se detectaron interacciones positivas de más de 5 millones de colonias primaria. Se identificaron inicialmente aproximadamente 100 colonias positivas de levadura. De cada colonia individual, se rescató el plásmido de activación y se secuenció el inserto de ADNc. Se descartaron los clones que contenían insertos de ADNc en la orientación antisentido o fuera de marco. Los restantes clones (aproximadamente 21) se retransformaron de nuevo en levadura para probar su especificidad.

La especificidad de unión puede determinarse usando los siguientes criterios: 1) el clon aislado debe repetir la interacción con el cebo original; 2) el clon aislado no debe interaccionar con un cebo no específico, en este caso una fusión GAL4-E12. Como una prueba adicional de especificidad, puede probarse la interacción con proteínas relacionadas que comparten un alto grado de homología de secuencia de aminoácidos.

Uso de animal transgénico o células obtenidas del mismo

Los animales transgénicos descritos en la presente memoria descriptiva son especialmente útiles para detectar e identificar o probar sustancias o fármacos potenciales para el tratamiento de cardiomiopatías hipertróficas y/o para investigación en conexión con cardiomiopatías hipertróficas con el objeto de desarrollar tratamientos terapéuticos o procedimientos de diagnóstico mejorados aplicables en medicina humana.

Entre las sustancias que van a probarse se incluyen sustancias sintéticas y de ocurrencia natural. Estas sustancias incluyen no sólo compuestos orgánicos e inorgánicos naturales y sintéticos basados en diversas estructuras centrales, sino también oligómeros, como oligopéptidos y oligonucleótidos. Pueden detectarse diversas fuentes naturales para compuestos activos, incluidas las encontradas en selvas, el océano y similares. Además pueden generarse y probarse bibliotecas combinatorias de compuestos. También se incluyen para prueba anticuerpos a un producto génico, en particular un polipéptido, de un gen implicado en modular la transcripción de un gen sensible a hipertrofia cardiaca.

Composiciones que comprenden sustancias útiles para el tratamiento de hipertrofia cardiaca o insuficiencia cardiaca

La presente invención se refiere al uso de composiciones en la fabricación de un medicamento para tratar una disfunción inducida por hipertrofia cardiaca. Para los fines de la presente invención, una sustancia para su uso en el tratamiento de una disfunción inducida por hipertrofia cardiaca es la que modula niveles de un producto activo de al menos un gen que se expresa en cardiomiocitos como respuesta a una señal hipertrófica. Entre las sustancias que son adecuadas se incluyen compuestos orgánicos o inorgánicos naturales o sintéticos que 1) modulan la expresión de un gen sensible a hipertrofia; 2) modulan la expresión de un gen cuyo producto modula la expresión de un gen sensible a hipertrofia; y/o 3) modulan una actividad de un producto génico que modula la expresión de un gen sensible a hipertrofia. Una "sustancia" incluye también un polinucleótido que 1) modula la expresión de un gen sensible a hipertrofia; 2) modula la expresión de un gen cuyo producto modula la expresión de un gen sensible a hipertrofia; 3) modula el
nivel de producto activo de al menos un gen que se expresa en cardiomiocitos como respuesta a una señal hipertrófica.

Las sustancias para tratar la hipertrofia cardiaca incluyen, pero no se limitan a, los inhibidores de calcineurina FK506 y ciclosporina y fármacos relacionados. Estos fármacos se usan rutinariamente como inmunosupresores en pacientes de trasplantes pero todavía no se han usado para tratar hipertrofia cardiaca o insuficiencia cardiaca. "Ciclosporinas" son undecapéptidos cíclicos. Se ha descrito una diversidad de ciclosporinas que inhiben la actividad de fosfatasa de CaN y están comprendidos en el término "ciclosporina". Éstas incluyen, pero no se limitan a, ciclosporina A; derivados de ciclosporina A, que incluyen, pero no se limitan a, derivados (4-(2-hidroxietil)-D-ser)8 y (3'-deshidroxi-3'-ceto-MeBmt)1-(VaI)2 (patentes de EE.UU. nº 5.284.826 y 5.525.590); y ciclosporina G. Las formulaciones farmacéuticas de ciclosporina que pueden adecuadas incluyen, pero no se limitan a, las descritas en la Publicación de Patente del RU nº GB-2.257.359; las publicaciones PCT nº WO 95/34285 y WO 97/07787; y las patentes de EE.UU. nº 5.739.105 y 5.641.745. FK596 es una lactona macrocíclica. El término "FK506", según se usa en la presente memoria descriptiva, incluye FK506 y derivados que inhiben una actividad fosfatasa de CaN, que incluyen, pero no se limitan a, derivados desvelados en las patentes de EE.UU. nº 5.530,120 y 5.493.019. También se incluyen sustancias que son inhibidores de CaMKIV, incluyendo KN62, KN93 y fármacos relacionados que inhiben actividad quinasa de CaMKIV. Se incluyen además inhibidores de p38 quinasa, como los descritos en la publicación PCT nº WO 93/27098.

Entre las sustancias que tienen potencial para el tratamiento de hipertrofia cardiaca e insuficiencia cardiaca se incluyen sustancias que potencian la expresión de uno o más productos génicos que normalmente reprimen la transcripción de al menos un gen que se expresa en cardiomiocitos como respuesta a una señal hipertrófica, reduciendo así la expresión del al menos un gen que se expresa en cardiomiocitos como respuesta a una señal hipertrófica. Por ejemplo, se ha descubierto que el factor de transcripción YY1 es un represor global de genes de respuesta a hipertrofia cardiaca. La sobreexpresión de YY1 en cardiomiocitos en cultivo evita la hipertrofia cardiaca y silencia toda la expresión de gen sensible a la hipertrofia. Las sustancias que son reguladores de YY1 pueden usarse entonces potencialmente para regular la hipertrofia cardiaca, el crecimiento de cardiomiocitos y la función cardiaca. Como un ejemplo adicional, el CaMKII\alpha constitutivamente activo silencia todos los genes sensibles a hipertrofias en cultivos de cardiomiocitos. Las sustancias que activan CaMKII\alpha tienen potencial para regular la hipertrofia cardiaca.

Las sustancias que tienen potencial para el tratamiento de hipertrofia cardiaca e insuficiencia cardiaca incluyen también sustancias que reducen la expresión de uno o más productos génicos que normalmente aumentan la transcripción de al menos un gen que se expresa en cardiomiocitos como respuesta a una señal hipertrófica, reduciendo así la expresión del al menos un gen que se expresa en cardiomiocitos como respuesta a una señal hipertrófica.

Una sustancia puede administrarse sola o conjuntamente con otras terapias farmacológicas, incluyendo antagonistas de receptores \beta-adrenérgicos, antagonistas de receptores de endotelina, inhibidores ACE y similares. Los inhibidores ACE incluyen fármacos diseñados por las marcas comerciales Accupríl®, Altace®, Capoten®, Lotensin®, Monopril®, Prinivil®, Vasotec® y Zestril®.

Las composiciones farmacéuticas se preparan usando una sustancia o combinando una sustancia con el soporte apropiado, que él mismo puede ser un adyuvante inmunológico. Estas composiciones pueden administrarse por cualquier medio que alcance el fin pretendido. Por ejemplo, la administración puede ser subcutánea, cutánea, intravenosa, intradérmica, intramuscular o intraperitoneal.

La cantidad de la sustancia administrada, así como la frecuencia de administración, es dependiente de la edad, el sexo, la salud y el peso del receptor, así como de la naturaleza del efecto deseado.

Además de la sustancia identificada por los procedimientos de detección descritos anteriormente, estas composiciones farmacéuticas pueden contener soportes adecuados farmacéuticamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que pueden usarse farmacéuticamente. Preferentemente, las preparaciones, en particular las que pueden administrarse oralmente y que pueden usarse para el tipo de administración preferido, como comprimidos, grageas y cápsulas, y también preparaciones que pueden administrarse rectalmente, como supositorios, así como soluciones adecuadas para administración por inyección u oralmente, contienen entre aproximadamente el 0,1 y el 99% en peso, y preferentemente entre aproximadamente el 25 y el 85% en peso, de ingrediente activo, junto con el excipiente.

Las preparaciones farmacéuticas se fabrican de una manera que es en sí conocida, por ejemplo, por medio de procedimientos de mezclado, granulado, fabricación de grageas, disolución o liofilización convencionales. Así, las preparaciones farmacéuticas para uso oral pueden obtenerse por combinación de los compuestos activos con excipientes sólidos, puliendo opcionalmente una mezcla resultante, y procesando la mezcla de gránulos, después de añadir auxiliares adecuados, si se desea o es necesario, para obtener núcleos de grageas o comprimidos.

Los excipientes adecuados son, en particular, cargas como azúcares, por ejemplo, lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol, preparaciones de celulosa y/o fosfato de calcio, como fosfato de tricalcio o hidrogenofosfato de calcio, así como aglutinantes como pasta de almidón usando, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio y/o polivinilpirroIidona. Si se desea, pueden añadirse agentes desintegrantes, como los almidones anteriormente mencionados y derivados de los mismos, así como almidón de carboximetilo, polivinilpirrolidona reticulada, agar o ácido algínico o una sal del mismo, como alginato de sodio. Entre los auxiliares se incluyen agentes reguladores de flujo y lubricantes, como sílice, talco, ácido esteárico o sales de los mismos como estearato de magnesio o calcio, y/o polietilenglicol. Los núcleos de grageas pueden proporcionarse con revestimientos adecuados que, si se desea, son resistentes al jugo gástrico. Para este fin, pueden usarse soluciones de azúcar concentradas, que pueden contener opcionalmente goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, soluciones de laca y disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes. Para producir revestimientos resistentes a jugos gástricos se usan soluciones de preparaciones de celulosa adecuadas como ftalato de acetilcelulosa o ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa. A los revestimientos de comprimidos o grageas pueden añadirse colorantes o pigmentos, por ejemplo, para identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis del compuesto activo.

Entre otras preparaciones farmacéuticas que pueden usarse oralmente se incluyen cápsulas de ajuste suave formadas por gelatina, así como cápsulas blandas selladas formadas por gelatina y un plastificante como glicerol o sorbitol. Las cápsulas de ajuste suave pueden contener los compuestos activos en forma de gránulos que pueden mezclarse con cargas como lactosa, aglutinantes como almidones y/o lubricantes como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizadores. En cápsulas blandas, los compuestos activos se disuelven o suspenden preferentemente en líquidos adecuados, como ácidos grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, pueden añadirse estabilizadores.

Las preparaciones farmacéuticas que pueden administrarse rectalmente incluyen supositorios, que consisten en una combinación de los compuestos activos con una base de supositorio. Las bases de supositorios adecuadas son, por ejemplo, triglicéridos naturales o sintéticos, hidrocarburos parafínicos, polietilenglicoles o alcanoles superiores. Además, es posible también usar cápsulas rectales de gelatina que consisten en una combinación de los compuestos activos con una base adecuada. Entre los materiales de base adecuados se incluyen, por ejemplo, triglicéridos líquidos, polietilenglicoles e hidrocarburos parafínicos.

Se conoce una diversidad de dispositivos que permiten el suministro controlado de una sustancia a un tejido. Entre los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida se incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen la proteína, matrices que están en la forma de artículos modelados como, por ejemplo, películas o microcápsulas.

Entre las formulaciones adecuadas para administración parenteral se incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma hidrosoluble. Además, pueden administrarse suspensiones de los compuestos activos como suspensiones de inyecciones oleosas apropiadas. Entre los disolventes o vehículos lipófilos adecuados se incluyen aceites grasos, como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, como oleato de etilo o triglicéridos. Las suspensiones de inyección acuosa pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y/o dextrano. Opcionalmente, la suspensión puede contener estabilizadores.

Los excipientes farmacéuticos son bien conocidos en la técnica y no es necesario describirlos en detalle en la presente memoria descriptiva. Véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19ª edición, 1995), Gennaro, ed.

Procedimientos de tratamiento de una disfunción inducida por hipertrofia cardiaca

Según se usa en la presente memoria descriptiva, "tratamiento" es un enfoque para obtener resultados clínicos beneficiosos o deseados. Para los fines de la presente invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, alivio de síntomas, disminución de la extensión de la enfermedad, estado estabilizado (es decir, sin empeoramiento) de la enfermedad, retraso o ralentización del avance de la enfermedad, mejora o paliación del estado de enfermedad y remisión (parcial o total), ya sea detectable o indetectable. "Tratamiento" puede significar también prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. Según se usa en la presente memoria descriptiva, el término "tratamiento" incluye profilaxis.

"Paliar" una enfermedad significa reducir la extensión y/o las manifestaciones clínicas indeseables de un estado de enfermedad y/o ralentizar o alargar el curso en el tiempo del avance.

Los procedimientos comprenden la administración a un individuo (un "sujeto") necesitado de la misma de una cantidad de una sustancia eficaz paradisminuir o revertir el avance de la disfunción. En el contexto de la profilaxis, un "sujeto necesitado de la misma" incluye, pero no se limita a, individuos en la población general que tienen 55 años de edad o más; individuos que tienen una predisposición genética a desarrollar hipertrofia cardiaca; pacientes de miopatía cardiaca dilatada; pacientes hipertensos; pacientes con insuficiencia renal e hipertensión vascular; individuos con hipertensión vascular debido a sobrecarga de presión, sobrecarga de volumen o resistencia en lecho periférica incrementada; individuos con dolencias respiratorias como enfisema o fibrosis quística; asmáticos crónicos; individuos con tuberculosis; y pacientes de trasplante de órganos.

En algunas formas de realización, los procedimientos implican bloqueo de una actividad de calcineurina cardiaca (CaN), en particular con respecto a su acción de desfosforilación en factores de transcripción cardiacos como NFAT-3 u otros miembros de la familia NFAT. En algunas formas de realización, los procedimientos implican el uso de inhibidores de CaN para bloquear la activación transcripcional de NFAT u otros factores de transcripción nuclear activados por desfosforilación mediada por CaN. En otras formas de realización, los procedimientos implican la inhibición de CaN mediante fármacos inhibidores específicos aprobados clínicamente, incluyendo miembros de la familia inmunosupresora de derivados de ciclosporina A, para reducir la actividad de desfosforilación de CaN, en el citosol y/o el núcleo del cardiomiocito. El bloqueo de la desfosforilación de factores de transcripción NFAT por fármacos inmunosupresores que inhiben específicamente CaN reduce sustancialmente o evita la translocación de estos factores de transcripción al compartimento nuclear de cardiomiocitos, volviéndolos incompetentes para formar un heterodúplex activo con GATA4. La incapacidad para formar el heterodúplex NFAT-3/GATA-4 o complejos similares entre miembros NFAT activados y factores de transcripción GATA evita que dichos complejos se unan a sus sitios potenciadores específicos en una serie de promotores cardiacos sensibles a hipertrofia. Dado que una serie de promotores sensibles a hipertrofia cardiaca contienen dichos sitios de unión y responden a NFAT-3/GATA-4 o complejos similares, sus productos génicos pueden regularse por incremento mediante actividad CaN y, por tanto, pueden inhibirse mediante inhibidores inmunosupresores específicos de
CaN.

Los inhibidores inmunosupresores específicos de CaN bloquean la mayoría de la señalización nuclear que converge a través de CaN debido a la hipertrofia cardiaca inducida por sobrecarga de presión cardiovascular y bloquean la inducción transcripcional que conduce a hipertrofia crónica, conduciendo a su vez a miopatía cardiaca dilatada en el animal crónico sin tratar. En otras formas de realización, el uso de inhibidores de CaN bloquea toda la señalización nuclear mediada por receptor de membrana de sobrecarga de presión para la inducción transcripcional de hipertrofia cardiaca. La inducción transcripcional mediada por receptores de hipertrofia cardiaca a través de agentes presores, Angiotensina II (AngII), Endotelina-1 (ET-1), trombina (Thrb) y señalización alfa adrenérgica a través del receptor alfa-1-adrenérgico converge como una señal de activación de transcripción nuclear en CaN. Dado que estas rutas convergen en CaN, la inducción transcripcional mediada por agentes presores y receptores alfa-1-adrenérgicos de genes cardiacos sensibles a hipertrofia puede bloquearse mediante inhibidores de CaN.

En otras formas de realización, los procedimientos inhiben la expresión de productos génicos que se expresan como respuesta a desfosforilación por CaN de factores de transcripción NFAT, es decir, productos génicos de genes sensibles a hipertrofias. En algunas de estas formas de realización, el agente que inhibe la expresión de uno o más genes sensibles a hipertrofia es un polinucleótido antisentido que se dirige a un gen sensible a hipertrofia.

En formas de realización que comprenden administración de uno o varios agentes que inhiben CaN, bloqueando así la desfosforilación de NFAT-3 y/o uno o más miembros relacionados de la familia, un agente que bloquea CaN es un miembro de la familia de las ciclosporinas de fármacos inmunosupresores, como ciclosporina A (CsA) o FK506. Cualquier agente que inhibe la actividad CaN cardiaca para bloquear la desfosforilación de uno o más miembros de la familia de factores de transcripción NFAT puede mostrarse útil.

En algunas formas de realización, se administra un agente que reduce la expresión de CaN cardiaca. Dichos agentes incluyen, pero no se limitan a, una forma negativa dominante de CaN (por ejemplo, forma truncada negativa de la región de codificación de la subunidad alfa de CaN); una construcción antisentido que se dirige a un gen de CaN; y una forma truncada inactiva de la subunidad beta de CaN. Una forma truncada inactiva de la subunidad \beta de CaN puede secuestrar la subunidad alfa activa de CaN, y hacerla incompetente para activación. En otras formas de realización, los procedimientos comprenden la administración de un anticuerpo específico para CaN, o la subunidad alfa o beta del mismo. En algunas de estas formas de realización, el anticuerpo es un anticuerpo monocatenario. En otras formas de realización, el anticuerpo es un anticuerpo que bloquea la actividad de CaN o impide que NFAT-3 y/o un miembro de la familia NFAT sean desfosforilados por CaN cardiaca.

La toxicidad y la eficacia terapéutica de dichos compuestos puede determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la DL_{50} (la dosis letal para el 50% de la población) y la DE_{50} (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La proporción de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la proporción DL_{50}/DE_{50}. Se prefieren los compuestos que exhiben grandes índices terapéuticos. Mientras pueden usarse compuestos que exhiban efectos secundarios tóxicos, puede diseñarse un sistema de suministro que dirija dichos compuestos al sitio de tejido afectado con el fin de reducir al mínimo el daño potencial en células no diana y, por tanto, reduzca los efectos secundarios.

Los datos obtenidos de los ensayos de cultivo celular y los estudios animales pueden usarse para formular un intervalo de dosificación para su uso en seres humanos. La dosificación de dichos compuestos reside preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen DE_{50} con escasa o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y de la ruta de administración utilizada. Para cualquier compuesto que se va a usar, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Puede formularse una dosis en modelos animales para conseguir un intervalo de concentración de plasma circulante que incluya el CI_{50} (es decir, la concentración del compuesto de prueba que alcanza una inhibición de síntomas semi-máxima) según se determina en el cultivo celular y/o en animales completos. Dicha información puede usarse más precisamente para determinar dosis útiles en seres humanos.

La eficacia terapéutica de una sustancia en el tratamiento de hipertrofia cardiaca puede realizarse por los expertos en la materia usando principios conocidos de diagnóstico y tratamiento.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar, pero no para limitar, la presente invención.

Ejemplo 1 Inhibición de los efectos hipertróficos de AngII y PE por CsA y FK506 en cardiomiocitos primarios Protocolo experimental

Para visualizar cardiomiocitos primarios y su organización sarcomérica, se usó anticuerpo monoclonal de ratón anti-\alpha-actinina (Sigma). Este anticuerpo es específico para las proteínas de \alpha-actina cardiaca y esquelética. Se lavaron las células en tampón salino fosfatado (PBS) 1X, se fijaron en paraformaldehído al 3,7% durante 5 minutos, se lavaron tres veces con PBS 1X y a continuación se prebloquearon en PBS 1X que contenía suero de caballo al 2%, BSA al 2% y detergente no iónico NP40 al 0,1% durante 30 minutos. Se añadió anticuerpo anti-\alpha-actinina a una dilución de 1:800 en solución de prebloque nueva y se incubó durante 30 minutos adicionales. Posteriormente, se lavaron las células tres veces en PBS 1X con NP40 al 0,1%. A continuación se añadió anticuerpo secundario conjugado con TRITC de antirratón a una dilución de 1:400 durante 30 minutos en solución de prebloque y se lavaron de nuevo las células tres veces en PBS 1X que contenía NP40 al 0,1%. Se realizó tinción nuclear para ADN con 0,5 \mug/ml de bisbencimida en PBS durante 15 minutos seguido de tres enjuagados con PBS.

Resultados

La exposición de cardiomiocitos primarios a AngII y PE provoca una respuesta hipertrófica pronunciada, que se caracteriza por un aumento en el tamaño celular y el ensamblaje sarcomérico, regulación por incremento de varios genes de proteínas contráctiles fetales y contractilidad mejorada. Estos sucesos están precedidos por un aumento en calcio intracelular. Para determinar si la respuesta hipertrófica de cardiomiocitos a estos agonistas estuvo mediada por calcineurina, se expusieron cardiomiocitos de rata neonatal a AngII (10 nM) o PE (10 \muM) en presencia y ausencia de CsA o FK506. Los cardiomiocitos mostraron un aumento espectacular de tamaño y ensamblaje sarcomérico después de 72 h de exposición a AngII o PE (figuras 2B y 2E). En presencia de CsA (figuras 2C y 2F) o FK506, la response a AngII estuvo completamente suprimida y la respuesta a PE se redujo espectacularmente.

Para determinar si los cambios en la expresión génica de cardiomiocitos como respuesta a AngII estuvieron también controlados por una ruta de señalización dependiente de calcineurina, se examinó la expresión de ARNm del ANF en cardiomiocitos tratados con AngII en presencia y ausencia de CsA por un ensayo de transferencia de puntos. La exposición a AngII tuvo como resultado un aumento de 15 veces en el ARNm del factor natriurético auricular (ANF), que se bloqueó completamente por CsA (figura 2G). Se midió el ARNm de GAPDH como control. Juntos, estos datos morfológicos y moleculares demuestran que las rutas de señalización de AngII y PE son sensibles a CsA/FKS06. Como la calcineurina es el único objeto conocido para inhibición por CsA y FK506, estos resultados sugieren que la activación de calcineurina es una etapa necesaria en la ruta de señalización para inducción dependiente de AngII y PE de hipertrofia cardiaca.

Ejemplo 2 Inducción de hipertrofia cardiaca in vivo Protocolos experimentales

Ratones transgénicos. Se crearon del modo siguiente ratones transgénicos que expresan calcineurina en el corazón. Se clonó un ADNc que codifica una forma constitutivamente activa de la subunidad catalítica de calcineurina A (O'Keefe y col. (1992) Nature 357:692-694) mediante PCR con un conector SalI 5' y un conector HindIII 3' en un vector de expresión que contenía el promotor \alpha-MHC. El patrón de expresión y las características de este vector de expresión se han descrito previamente (Jones y col. (1994) Dev. Dyn. 22:117-128). Se digirió el vector de calcineurina-\alpha-MHC con NotI para liberar la cadena principal de pBluescript y permitir la purificación del fragmento de ADNc de fusión por \alpha-MHC. Este fragmento se purificó en un gel de agarosa usando el kit de extracción de gel Qiaex II (Qiagen) y se eluyó en tampón de inyección de ovocitos (Tris-HCl 5 mM, pH 7,4 y EDTA 0,2 mM). El fragmento purificado se inyectó en ovocitos recientemente fecundados obtenidos de ratones FVB y se transfirió a los oviductos de ratones ICR pseudogestantes.

Análisis de ARN. Se recogió y purificó ARN total con reactivo de triazol (Gibco BRL) según se recomienda. Se sometió ARN de tipo natural y corazones transgénicos, así como cardiomiocitos en cultivo, a hibridación por transferencia de puntos frente a un panel de sondas de oligonucleótidos según se ha descrito previamente (Jones y col. (1996) J. Clin. Invest. 98, 1906-1917).

Histología. Se sometieron los corazones de tipo natural y ratones transgénicos a análisis histológico. Brevemente, se recogieron los corazones, se fijaron durante toda la noche en tampón de formalina al 10% con PBS, se deshidrató en etanol, se transfirió a xileno y luego a parafina. Los corazones introducidos en parafina se seccionaron en 4 \mum y posteriormente se tiñeron con hematoxilina y eosina para examen histológico rutinario o con tricromo de Masson para colágeno (Woods y Ellis In, Laboratory Histopathology: A Complete Reference (1994) Churchill Livingstone Publishers pág. 7.1-13).

Resultados

Inducción de hipertrofia cardiaca in vivo por calcineurina activada. Los resultados anteriores indicaron que la calcineurina era un potente regulador de hipertrofia cardiaca en cardiomiocitos primarios en cultivo. Para determinar si esta ruta de transducción de señales podría funcionar también en el miocardio in vivo, se generaron ratones transgénicos que expresaban la forma constitutivamente activa de la subunidad catalítica de calcineurina en el corazón, usando el promotor de \alpha-MHC para impulsar la expresión. Estudios previos han demostrado que este promotor específico cardiaco está activo en las cámaras ventriculares principalmente después del nacimiento (Jones y col. (1994) Dev. Dyn. 22:117-128). Se generó un total de 10 ratones transgénicos fundadores independientes, que contenían entre 2 y 68 copias del transgénico de \alpha-MHC-calcineurina (Tabla 1).

TABLA 1 Resumen de líneas transgénicas de \alpha-MHC-calcineurina

1

Las proporciones corazón: peso corporal se calcularon pesando los corazones y cuerpos de hermanos de camada transgénicos y no transgénicos. Los valores se expresan como el peso relativo del corazón transgénico en comparación con un hermano de camada no transgénico. Las edades de los ratones que estaban todavía vivos el 18 de febrero de 1998 se muestran entre paréntesis. 37 y 39 eran transgénicos fundadores y los ratones designados como 37- y 39- eran sus descendientes. El término "N.D." indica que este valor no se determinó.

Cada ratón transgénico de calcineurina analizado mostró un aumento espectacular en el tamaño del corazón con respecto a sus hermanos de camada no transgénicos. La proporción corazón-peso corporal fue en promedio de 2 a 3 veces mayor en los transgénicos de calcineurina en comparación con los hermanos de camada de control, tan pronto como 18 días después del nacimiento (figura 3; tabla 1). No se observó diferencia en el fenotipo cardiaco en machos y hembras. El análisis histológico mostró hipertrofia concéntrica en la que las áreas de sección transversal de las paredes ventriculares y el tabique interventricular aumentaron espectacularmente (figura 3C). El ventrículo izquierdo era el más afectado, pero el ventrículo derecho y las cámaras auriculares también se agrandaron. En contraste con la bien organizada musculatura estriada de la pared ventricular normal, los cardiomiocitos de los corazones transgénicos de calcineurina estaban desorganizados y evidentemente hipertróficos (figuras 3D y 3E). Los cardiomiocitos hipertróficos tenían a menudo una cariomegalia espectacular. La medida de las áreas de sección transversal de miocitos dentro de la pared ventricular izquierda mostró un aumento de más de 2 veces en los transgénicos de calcineurina comparados con los controles.

En seres humanos, la hipertrofia cardiaca avanza frecuentemente hacia dilatación ventricular, insuficiencia cardiaca y muerte súbita. Análogamente, en ratones transgénicos de calcineurina, se observó dilatación de las cámaras ventriculares con el aumento de la edad (figuras 3F y 3G). Los ratones transgénicos de calcineurina eran también altamente susceptibles a muerte súbita. Esto ocurría espontáneamente, así como durante la manipulación o la anestesia. Los ratones que morían de muerte súbita mostraban dilatación ventricular izquierda y derecha indicativa de insuficiencia cardiaca. La histología de los pulmones revelaba también edema perivascular extenso y macrófagos intra-alveolares que contenían glóbulos rojos, hallazgos consistentes con insuficiencia cardiaca. Uno de los hitos de la insuficiencia cardiaca es la fibrosis de la pared ventricular. Los corazones de transgénicos de calcineurina contenían extensos depósitos, principalmente intersticiales, de colágeno, según se reveló mediante tinción de tricromo (figura 3H). En focos con fibrosis acusada, era evidente la degeneración de las miofibras.

Activación de la respuesta molecular a hipertrofia in vivo por calcineurina. Para determinar si la calcineurina activada inducía cambios en expresión de gen cardiaco característica de hipertrofia e insuficiencia cardiaca, se usó un ensayo cuantitativo de transferencia de puntos para examinar el ARN de corazones de transgénicos de calcineurina y hermanos de camada no transgénicos. En coherencia con la reactivación del programa fetal de expresión génica, se regularon espectacularmente por incremento transcriptos de MHC, actina \alpha-esquelética y BNP en corazones transgénicos, mientras que \alpha-MHC se reguló por reducción. Se ha demostrado previamente que los transcriptos Ca^{++}-ATPasa (SERCA) y fosfolamban (PLB) de retículo sarcoplásmico se regulan por reducción durante insuficiencia cardiaca, cuando el miocardio defectuoso muestra manipulación de Ca^{++} defectuosa (Mercadier y col. (1993) J. Clin. Invest. 85:305-309; Schwinger y col. (1995) Circulation 92:3220-3228); ambos transcriptos se redujeron en transgénicos de calcineurina. No hubo cambio significativo en la expresión de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH).

Prevención de hipertrofia cardiaca con CsA. Para determinar si la inhibición de actividad de calcineurina in vivo podría ser un medio efectivo de prevenir la hipertrofia cardiaca, los autores de la invención probaron si la inyección subcutánea de CsA podría prevenir la disfunción cardiaca en ratones transgénicos de calcineurina. Para estos experimentos, se usaron 8 hermanos transgénicos de una camada de ratones transgénicos nº 37 (Tabla 1).

Se inyectó diariamente a cuatro descendientes positivos de transgén 25 mg/ml de CsA y se inyectó a cuatro con vehículo en solitario. Cuatro hermanos de camada no transgénicos fueron tratados también con CsA para controlar posibles efectos tóxicos o cualquier anomalía cardiaca inducida por CsA. El tratamiento con CsA se inició a los 9 días de vida y los animales se sacrificaron 16 días más tarde. Según se muestra en la figura 4C, los corazones de los animales tratados con vehículo estaban altamente hipertróficos y dilatados al día 25, mientras que los hermanos de camada tratados con CsA no tenían tamaño significativamente diferente con respecto a los controles no transgénicos. Las proporciones medias corazón-peso corporal para transgénicos de calcineurina eran casi 3 veces mayores que las de los transgénicos y no transgénicos tratados con CsA, según se muestra en la figura 4B. El tratamiento con CsA prevenía también fibrosis de los corazones de transgénicos de calcineurina.

A un nivel celular, la respuesta hipertrófica de cardiomiocitos en los transgénicos de calcineurina estaba ampliamente inhibida por CsA, aunque existían áreas aisladas de desorganización de miofibras y células dispersas con núcleos hipercromáticos prominentes. El tratamiento con CsA tratamiento prevenía una hipertrofia cardiaca importante y la patología asociada como respuesta a calcineurina activada in vivo.

Ejemplo 3 Caracterización de efectos de CaMKII y CaN en la expresión de genes sensibles a hipertrofia en un modelo celular de cardiomiocitos en cultivo Protocolos

Cultivos celulares miocárdicos primarios. Se prepararon cultivos primarios de miocitos cardiacos de ratas neonatales usando ratas Sprague-Dawley de 1 a 4 días de vida. Se decapitaron crías de rata (un promedio de 15 crías por preparación) y se extrajeron los corazones en condiciones estériles de la cavidad torácica y se lavó con Medio 199 (Life Technologies, Gaithersburg, MD) para eliminar la sangre residual. Se extrajeron las aurículas y se desmenuzaron finamente los ventrículos y se sometieron a tres digestiones secuenciales Viokase (A.H. Robbins Company, Richmond, VA) de 18 minutos cada una. Se preparó Viokase que contenía lipasa, proteasa y amilasa, así como otras enzimas pancreáticas, en 1 mg/ml en tampón PBS y se usó a una velocidad de 120 ml por 15 corazones. Los sobrenadantes de reserva de las tres digestiones se pusieron en baño de hielo para enfriar la reacción de digestión. A continuación se centrifugaron los sobrenadantes a 2.000 rpm durante 8 min a temperatura ambiente en un rotor Beckman TJ-6. Se volvieron a suspender los sedimentos celulares en Medio 199 suplementado con suero bovino fetal al 10% y 50 \mug/ml de gentamicina. A continuación se cultivaron células en placas de cultivo de tejido de 100 mm y se incubaron en una incubadora de cultivo celular a 37ºC. Este procedimiento, denominado "pre-cultivo en placa", elimina selectivamente de forma rápida células de miocito no cardiaco anexas como fibroblastos de la población celular, enriqueciendo por tanto la población celular en cardiomiocitos. De cuarenta y cinco a cincuenta minutos más tarde, las células no anexas se transfirieron a placas nuevas de 60 mm a una densidad de aproximadamente 150 células/mm^{2} para el inicio de cultivo a largo plazo. Después de 20 a 24 horas, se lavaron cultivos de células miocárdicas y se mantuvieron en medio nuevo suplementado con suero bovino fetal al 10% según se describe anteriormente en placas de 60 mm. Los cultivos de cardiomiocito pudieron mantenerse durante hasta 7 días.

Transfección transitoria. Fue necesario cultivar los cardiomiocitos aislados en medio sin suero para eliminar los efectos en la expresión génica mediada a través de elementos de respuesta al suero. Los cultivos miocárdicos primarios primero se lavaron con medio de crecimiento sin suero y a continuación se mantuvieron en Medio 199 sin suero suplementado con Nutridoma HU (Boehringer Mannheim Corporation, Indianápolis, IN) que contenía albúmina sérica humana, insulina bovina y transferrina humana. La transfección se llevó a cabo usando un agente de transfección basado en liposomas, Lipofectamina (Life Technologies, Grand Island, NY). Los procedimientos usados para transfección transitoria se siguieron conforme a las instrucciones del fabricante. Se determinaron los valores óptimos que incluían concentración de ADN, concentración de Iipofectamina y duración temporal de la transfección antes de los experimentos realizados en este estudio. Brevemente, para cada transfección, se diluyeron 2 \mug de ADN y 20 \mug de lipofectamina en viales separados que contenían 300 \mul de medio suplementado con nutridoma sin suero. A continuación, las dos soluciones se combinaron e incubaron a temperatura ambiente durante 15 a 45 minutos para permitir que se formaran complejos de ADN-liposoma. Para cada transfección, se añadieron 2,4 ml de medio suplementado con nutridoma sin suero al tubo que contenía los complejos ADN-liposoma y se extendió la mezcla diluida en los cardiomiocitos adherentes que habían sido enjuagados una vez con 2 ml de medio sin suero en una placa de cultivo de tejido de 60 mm. Se incubaron los cultivos celulares a 37ºC en una incubadora de CO_{2} que contenía CO_{2} al 5% durante 24 horas, momento en el cual se añadieron varios compuestos de prueba. Se sometieron a ensayo actividades de promotor de extractos celulares dentro de las 48 horas siguientes al inicio de la transfección.

Para estimulación \beta-adrenérgica, se añadió PE 100 \muM (Sigma, St. Louis, MO) a las células. Se añadió DOB (Gensia Laboratories, Ltd., Irving, CA), un agonista \beta_{1}-adrenérgico selectivo, a una concentración de 10 \muM. Para corregir la variación en las eficacias de transfección, se usó p\betaGal-Control como control interno. Se sometió a ensayo la actividad de \beta-galactosidasa quimioluminiscente usando una parte alícuota de los mismos lisados celulares recogidos para el ensayo de luciferasa y se midió en el mismo luminómetro, según se describe más adelante.

Ensayo de luciferasa de luciérnaga. El ensayo de luciferasa de luciérnaga se basa en un tipo "brillo" comercial de ensayo de bioluminiscencia a largo plazo (Promega, Madison, WI). Brevemente, la activación de luciferina produce la formación de un adenilato de luciferilo unido a enzima (luciferil-AMP). El intermediario enzimático, Iuciferil-AMP, se oxida en presencia de coenzima A (CoA) y conduce a la formación de un producto excitado unido a enzima que se descompone posteriormente para emitir luz y un producto estrechamente unido a enzima. En presencia de CoA, tiene lugar oxidación en vez de a partir luciferil-CaA con cinética total más favorable. Las células que han de someterse a ensayo para conocer la actividad de luciferasa se enjuagaron dos veces con tampón PBS y se lisaron en Tampón 1X de Lisis de Indicador (Promega) y a continuación se recogieron por raspado. Se peletizaron los residuos grandes mediante breve centrifugado y se transfirió el sobrenadante a tubos nuevos. Para ensayo de luciferasa, se mezclaron 20 \mul de extracto celular con 100 \mul de Reactivo de Ensayo de Luciferasa (Promega) que contenía Tricina 20 mM, (MgCO_{3})_{4}
Mg(OH)_{2} 5H_{2}O 1,07 mM, MgSO_{4} 2,67 mM, EDTA 0,1 mM, DTT 33,3 mM, coenzima A 270 \muM, luciferina 470 \muM y ATP 530 \muM. Se determinó la emisión de luz integrada durante 10 segundos a 5 minutos en un Luminómetro de Turner Designs Modelo 20 (Promega). Todos los ensayos se realizaron a temperatura ambiente dentro de 1 hora de lisis celular.

Análisis Northern. Para análisis de mensajes ANF, se extrajo ARN total decultivos de células de cardiomiocitos de rata neonata de 3 días de vida según el procedimiento de Chomczynski y Sacchi usando el Reactivo TRIzol (Life Technologies, Grand Island, NY) disponible comercialmente. Se homogeneizaron en TRIzol cultivos celulares primarios de rata y se extrajo el ARN por adición de cloroformo y se precipitó en presencia de isopropanol. Se fraccionó el ARN total aislado en un gel de agarosa/formaldehído al 1%, y se transfirió a una membrana de nailon por transferencia capilar. Se prehibridaron las transferencias en una solución de formamida al 50% (Life Technologies, Grand Island, NY) durante 3 a 4 horas a 42ºC y a continuación se hibridó durante toda la noche con un cebador aleatorio, sonda de ADNc de ANF marcada con biotina. Después de lavado en condiciones muy restrictivas (SSPE 0,1 X, SDS al 0,1%, 65ºC), se detectó ADNc biotinilado hibridado usando el Sistema de Detección Quimioluminiscente (TROPIX, Inc., Bedford, MA) y a continuación se expuso a película de rayos X. Se cuantificaron las bandas de ANF con un analizador de gel Howteck (PDT, Huntington Station, NY) y se normalizó a la señal ARNr 28 S para corregir las eficacias de carga y/o transferencia.

Determinación de actividad de CaM quinasa II autónoma. Se determinó la actividad de CaM quinasa II autónoma en homogenatos de tejido de corazón de rata usando el sustrato de péptido sintético, autocamtida-2 (KKALRRQETVDAL) (Mar y col. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:4271-4283; y Farrance y col. (1992) J. Biol. Chem. 267:17234-17240) como sustrato exógeno. Este péptido se modelizó después de la secuencia de autofosforilación del núcleo de la \alpha-CaM quinasa II de cerebro de rata y es altamente selectivo para CaM quinasa II. Se sometió a ensayo la actividad autónoma de CaM quinasa II por la fosforilación de autocamtida-2 en ausencia de Ca^{2+}/calmodulina y se expresó como una proporción de la actividad obtenida en presencia de estos cofactores. Se incubaron cortes de tejido en presencia o ausencia de varios compuestos de fármaco durante el tiempo requerido. Al final de la incubación se homogeneizaron los cortes de tejido en tampón de hielo frío (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, EGTA 0,5 mM, EDTA 1,0 mM, ditiotreitol 2,0 mM, pirofosfato de sodio 10 mM, molibdato de amonio 0,4 mM, 100 mg/ml de leupeptina) por sonicación. Se aclaró el sobrenadante por centrifugado (12.000 x g, 2 minutos) y a continuación se sometió a ensayo en una mezcla de reacción que contenía PIPES 50 mM (pH 7,0), MgCl_{2} 10 mM, 0,1 mg/ml de albúmina sérica bovina, autocamtida-2 10 mM, [\gamma-^{32}P] ATP 20 mM y CaCl_{2} 0,5 mM, 5 mg/ml de calmodulina para actividad estimulada por Ca^{2+} o EGTA 1 mM para actividad autónoma. El ensayo se realizó a 30ºC durante 30 segundos y se terminó con la adición de ácido tricloroacético a una concentración final del 5%. Se sedimentó la proteína endógena por centrifugado y se situaron los sobrenadantes que contenían autocamtida-2 en tiras de fosfocelulosa p81, se lavó 5 veces, se secó y se cuantificó el contenido en ^{32}P-PO_{4} por radiación Cerenkov.

Construcciones de plásmidos. Se usó una serie de mutantes de deleción anidados que contenían varios fragmentos de promotor de ANF cardiaco de rata y el ADNc de ANF de rata. Esta serie de construcciones de promotor-indicador se subclonó en vectores pxp2 basados en luciferasa. Se generaron las deleciones 5' usando sitios enzimáticos de restricción apropiados o por amplificación PCR. En la figura 8A se muestra un diagrama de los elementos potenciadores clave para regular la transcripción de ANF. Se usó el indicador de \alpha-actina esquelética, que porta aproximadamente 400 pb de dominio de promotor proximal secuencia arriba (-394 pb a +24 pb con respecto al sitio de inicio de transcripción) del gen de \alpha-actina esquelética cardiaca aviar (que contiene la mayoría de los dominios potenciadores que responden a señalización de crecimiento unida a la parte estructural del gen de luciferasa de luciérnaga). Se usó también otro construcción de promotor-indicador basada en luciferasa que porta 400 pb de dominio de promotor proximal secuencia arriba del gen de \alpha-actina cardiaca aviar. Se usaron dos isoformas de \delta-CaM quinasa (\delta_{A} y \delta_{B}) portadas en el vector de expresión pSR\alpha. Se usaron los plásmidos de expresión para CaM quinasa IV que incluyen tanto una forma de longitud total (CaMKIVwt) como una forma mutada (CaMKIV313). La forma constitutivamente activa de calcineurina, de origen neuronal, se generó por técnica de mutagénesis de reacción en cadena de la polimerasa que produjo la deleción del dominio autoinhibidor de calcineurina. A continuación se subclonó el fragmento mutado en un vector de expresión pSR\alpha. Se construyó el plásmido de expresión de \alpha-CaM quinasa II de cerebro mutante mediante subclonación de ADNc que codifica una versión truncada (aminoácidos 1 a 240) de la enzima CaM quinasa II de tipo natural que es constitutivamente activa en el sitio EcoRI de pCMV5, un plásmido de expresión de mamífero que contiene una secuencia de clonación múltiple inmediatamente secuencia abajo desde el promotor vírico fuerte de citomegalovirus. Esta construcción, cuando se transfecta en cultivos de cardiomiocitos, produce constitutivamente enzima CaM quinasa II que no se une a Ca^{2+} o calmodulina.

Resultados Efectos de CaM quinasa II y calcineurina exógenas en actividades de promotor-indicador para genes de ANF, \alpha-actina esquelética y \alpha-actina cardiaca

En este estudio, los autores de la invención exploraron un papel funcional potencial para una protein-quinasa dependiente de calcio, CaM quinasa II (CaMKII), y una fosfatasa sensible a calcio, calcineurina (CaN), en la regulación de la expresión de gen de ANF, \alpha-actina esquelética y \alpha-actina cardiaca. En este estudio se emplearon tres construcciones de promotor-indicador basadas en luciferasa que contenían regiones de promotor de ANF, \alpha-actina esquelética o \alpha-actina cardiaca de longitud casi completa según se ha descrito anteriormente. Se llevó a cabo un protocolo de cotransfección que usaba construcciones de vectores que portaban una \alpha-isoforma mutante de CaMKII constitutivamente activa o una forma mutante constitutivamente activa de CaN con los genes de fusión de ANF/luciferasa, \alpha-actina esquelética/luciferasa o \alpha-actina cardiaca/luciferasa en cultivos de cardiomiocitos neonatales preparados a partir de crías de rata de 1 a 4 días de vida. Se evaluaron las actividades de indicadores de luciferasa. Según se muestra en la figura 6, la sobreexpresión de la \alpha-isoforma CaMKII exógena silenció las actividades de promotor-indicador para ANF, \alpha-actina esquelética y \alpha-actina cardiaca en un 50% en comparación con los cultivos de control (cotransfectados con vector vacío). En contraste, la sobreexpresión de la CaN constitutivamente activa exógena aumentó las actividades de promotor de ANF, \alpha-actina esquelética y \alpha-actina cardiaca entre un 300% y un 600% con respecto a las células de control. Los resultados de este experimento sugerían que la sobreexpresión de una \alpha-isoforma CaMKII heteróloga conduce al silenciamiento de las actividades de promotor tanto para genes embrionarios cardiacos como para ANF y \alpha-actina esquelética, y gen de proteínas contráctiles constitutivas, \alpha-actina cardiaca. En contraste, la activación de una CaN exógena produce la superinducción de las actividades de promotor para estos tres genes.

Efectos de isoenzimas de CaM quinasa en actividad de promotor-indicador de ANF

La familia de CaM quinasa tiene al menos diez miembros, que difieren en estructura, distribución, regulación y actividad enzimática. Los resultados, presentados en la figura 6, sugieren que la \alpha-CaMKII mutada indujo regulación por reducción de genes sensibles a hipertrofia. Fue de interés determinar qué efectos de otros miembros de la familia CaM quinasa juegan un papel en el gen sensible a hipertrofia prototípico, ANF. Se usaron miembros seleccionados de la familia CaM quinasa, incluyendo CaMKII de tipo natural (CaMKII_{wt}), \delta-CaMKII (\delta_{A} y \delta_{B}) y CaMKIV (tipo natural y forma mutada), se usaron para cotransfección con la construcción de promotor-indicador de ANF descrito anteriormente. También se evaluó la inducción PE de ANF en presencia de cada uno de los miembros de CaM quinasa exógena. Según se muestra en la figura 7, CaMKII_{wt} redujo la actividad de promotor de ANF en un \sim400%. En contraste, CaMKII_{wt} aumentó la actividad de promotor de ANF en un 270%, mientras que CaMKIV_{mut} aumentó la capacidad de promotor de ANF en un \sim400%. Las isoformas \delta de CaMKII que incluyen \delta_{A} y \delta_{B} no alteran virtualmente las actividades de promotor de ANF. Se obtuvieron resultados similares en presencia de estimulación PE en cardiomiocitos transfectados, según se muestra en la figura 7B. Tomados en conjunto, estos datos indican que miembros diferentes de la familia de CaM quinasa muestran efectos diferenciales en la expresión de ANF.

Efecto de CaMKII o CaN exógenas en construcciones de deleción anidadas de promotor-indicador de ANF

En estos estudios, se usó una serie de construcciones de deleción anidadas generadas a partir del dominio promotor/potenciador 5' del gen de ANF cardiaco de rata. Se ligaron tres longitudes diferentes de los fragmentos de promotor de ANF nativo a la parte estructural del gen de luciferasa de luciérnaga según se ha descrito anteriormente. En la figura 8A se muestra un diagrama de todos los elementos potenciadores funcionales identificados para gen de ANF. La actividad de indicador de cada uno de las construcciones de deleción anidadas en cultivos de cardiomiocitos se expusieron a PE, según se muestra en la figura 8B. Las construcciones de promotor-indicador que contenían suficiente secuencia arriba para incluir el motivo PERE (Elemento de Respuesta PE), ANF700 (NP337) y ANF135 (NP325), pero no secuencias de promotor que han perdido este motivo, ANF50 (NP338), se activaron por exposición a PE. Se evaluó si el silenciamiento/inducción de la actividad de promotor-indicador de ANF por expresión de CaMKII/CaN exógena podía localizarse en una región del dominio de promotor de ANF. Las construcciones de deleción anidadas de promotor-indicador de ANF descritos anteriormente fueron cotransfectados respectivamente con CaMKII o CaN constitutivamente activas. Según se muestra en la figura 8C, la sobreexpresión de CaMKII exógena produjo el silenciamiento de las tres construcciones de promotor de deleción en 5'- de ANF en un 50% en comparación con los cultivos de control, mientras que la sobreexpresión de CaN exógena aumentó las tres construcciones de promotor de ANF en un intervalo del 200 al 600% con respecto a los cultivos de control. Estos datos indican que la inhibición/inducción de la actividad de promotor-indicador de ANF por CaMKII/CaN no podía restringirse a una región o dominio definido para el promotor de ANF.

Señalización de receptor beta-adrenérgico y activación de CaM quinasa II cardiaca

Estos experimentos determinaron si la señalización a través del subtipo de receptor \beta_{1}-adrenérgico podría activar la CaMKII cardiaca. Se aislaron de nuevo cortes de tejido de corazón de ratas neonatales de 1 a 4 días de vida y se trataron con el agonista selectivo \beta_{1}, dolbutamina (DOB), o el agonista mixto \beta_{1} (\beta_{1} y \beta_{2}), isoproterenol (ISO). En estudios paralelos, se añadió antagonista \beta_{1}, propanolol (PROP) 15 segundos antes de añadir los agonistas. Más tarde, se sometió a ensayo la actividad autónoma (% de actividad independiente de calcio) de CaMKII. Los resultados de dicho experimento se muestran en la figura 9. La actividad autónoma de CaMKII aumentó en \sim170% con respecto a la actividad observada en tejidos de corazón sin estimular 30 segundos después del tratamiento por DOB o ISO. Además, el antagonista \beta_{1}, PROP, cuando se añadió antes de adición de DOB o ISO, bloqueó la activación de actividad autónoma de CaMKII. Estos resultados demuestran que la exposición a agonista \beta_{1}-adrenérgico conduce a activación de CaMKII endógena cardiaca. Esta activación de la actividad de CaMKII es una repuesta mediada por el receptor \beta_{1}.

Efecto de agonistas adrenoceptores en actividades de promotor-indicador para genes de ANF, \alpha-actina esquelética y \alpha-actina cardiaca

Los resultados de los experimentos mostrados anteriormente sugirieron que CaN conduce a la inducción de estos tres genes en cardiomiocitos de ratas neonatas. Fue de interés determinar el efecto de estímulos \alpha y \beta-adrenérgicos en la expresión de ANF, \alpha-actina esquelética y \alpha-actina cardiaca. Las construcciones de promotor-indicador basadas en luciferasa que portan dominios de promotores de ANF, \alpha-actina esquelética y \alpha-actina cardiaca según se describe anteriormente se transfectaron en cultivos de cardiomiocitos de rata neonatal primarios. Los cardiomiocitos transfectados se expusieron a continuación al agonista \alpha_{1}- adrenérgico, fenilefrina (PE), al agonista \beta_{1}-adrenérgico, DOB, o al factor de crecimiento de transformación de tipo \beta (TGF-\beta_{1}). Según se muestra en la figura 10, cuadros A, B y C, cada una de estas actividades de promotor-indicador se redujo aproximadamente en el 50% por tratamiento con DOB. Las actividades de indicador para ANF y \alpha-actina esquelética se transactivaron en un 200% con respecto a las de células de control cuando se expusieron los cardiomiocitos a PE, según se muestra en figura 10, cuadros A y B. La actividad de promotor para \alpha-actina cardiaca no se estimuló significativamente en cardiomiocitos tratados con PE, mientras que el tratamiento con TGF-\beta_{1}, de acuerdo con estudios previos, indujo actividad de promotor-indicador de \alpha-actina cardiaca en un 700% con respecto a las células de control. Estos datos muestran que la estimulación \alpha-adrenérgica y \beta-adrenérgica modula la expresión de genes sensibles a hipertrofia cardiaca, como ANF, \alpha-actina esquelética y \alpha-actina cardiaca. La estimulación \beta_{1}-adrenérgica es capaz de inhibir las actividades de promotor para los genes embrionarios, como ANF y \alpha-actina esquelética, y genes de proteínas contráctiles constitutivas, como \alpha-actina cardiaca. Por tanto, fue de interés evaluar si el cambio de actividad de indicador de ANF observado en los experimentos anteriores fue una respuesta a la alteración de las reservas de mensajes de ANF.

Los cultivos primarios de cardiocitos neonatales se guardaron en un medio sin suero y se aplicó agonista \beta_{1}, DOB, a las células en diversos momentos. Se evaluó el ARN de mensaje de ANF al final por protocolos de análisis Northern, según se ha descrito anteriormente. Según se muestra en la figura 10D, cuando los cultivos celulares se expusieron a DOB, la abundancia del mensaje de ANF empezó a caer de manera que en un plazo de 16 horas sólo había aproximadamente la mitad de lo observado en cultivos de control (sin adición de fármaco). Esta tendencia se mantuvo de manera que 24 horas después de exposición a DOB, el ARNm de ANF había descendido en el 75% en comparación con los valores de control. Estos resultados sugieren que parte, si no la totalidad, de los cambios en las actividades de indicador se produjeron en el nivel de transcripción génica.

Ejemplo 4 Regulación transcripcional de genes sensibles a hipertrofia mediante un sistema de expresión de calcineurina inducible Construcciones de plásmidos

El plásmido de expresión de transactivador controlado por tetraciclina (tTA) pUHD15-1 codifica proteína quimérica tTA bajo el control de promotor y potenciador del citomegalovirus (CMV) humano. tTA consta de residuos de aminoácidos 1-207 de la proteína tetR y residuos 363-490 de VP16 (Gossen y Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551).

El plásmido pUHD10-3 contiene un operón tet quimérico/promotor mínimo de CMV secuencia arriba de múltiples sitios de clonación (Bujard, 1996). pUHC13-3 es un plásmido de expresión de gen indicador de luciferasa de luciérnaga impulsado por el operón tet quimérico/promotor mínimo de CMV (Gossen y Bujard (1992)).

Una forma génica constitutivamente activa de calcineurina (\DeltaCaM-AI) se recuperó originalmente del plásmido pCN(\alpha)\DeltaCaM-AI, que se generó por subclonación del mutante de gen de calcineurina suprimido por dominio inhibidor en el vector de expresión pSR\alpha (Parson y col., 1994). Para generar construcción de calcineurina inducible por tTA p10-3CaN, se subclonó un fragmento de EcoRI de 1,2 Kpb de pCN(\alpha)\DeltaCaM-Al, codificando la calcineurina constitutivamente activa en el único sitio de escisión EcoRi del plásmido pUHD10-3, que contiene un promotor mínimo de citomegalovirus (CMV) dependiente de tTA frente al sitio de clonación EcoRI (Bujard, 1996).

La construcción promotor-indicador de ANF-luciferasa, NP337, se formó por clonación de nucleótidos de aproximadamente 700 pb de fragmento de promotor proximal ANF en vector pXP-2 basado en luciferasa según se ha descrito previamente en otras fuentes (McBride y col., 1993).

El indicador de \alpha-actina esquelética, SkA-Luc, se construyó subclonando promotor secuencia arriba proximal de aproximadamente 420 pb (-394 pb a +24 pb) de gen de \alpha-actina esquelética aviar en el vector de expresión de luciferasa de luciérnaga pXP1 (MacLellan y col., 1994).

Se generó otra construcción indicadora, luciferasa de promotor de \alpha-actina cardiaca (CardA-Luc), por subclonación de un fragmento de 330 pb de promotor de \alpha-actina cardiaca de pollo y región secuencia arriba inmediata (de -315 a +15, con respecto al sitio de inicio de transcripción) en el sitio de clonación HindIII del vector de luciferasa básico pGL2 (Chen y Schwartz, 1996). Cell Cultures.

Cultivos celulares miocárdicos primarios. Se prepararon miocitos ventriculares primarios a partir de ratas de Sprague-Dawley de 1 a 4 días de vida, según se ha descrito en el Ejemplo 3.

Resultados Regulación de una transcripción de gen diana exógeno por el sistema de expresión de transactivador dependiente de tetraciclina (tTA) en cardiomiocitos primarios de rata neonatal

El gen de luciferasa de luciérnaga como gen indicador estuvo bajo el control de operón tet quimérico/promotor mínimo de CMV en pUHC13-3. Se llevaron a cabo transfecciones transitorias según se describe en el Ejemplo 3. Cuando esta construcción y el plásmido de expresión tTA pUHD15-1 se cotransfectaron en células, en ausencia o presencia de la sustancia efectora doxciclina, los cambios en la actividad de luciferasa indicarían la capacidad del sistema tTA de regular la transcripción de la transcripción del gen diana. Para probar si el sistema de expresión génica regulado por tetraciclina funciona en cardiomiocitos primarios de rata, se cotransfectaron cultivos celulares con plásmido de expresión tTA pUHD15-1 (0,25 \mug) y construcción de expresión génica de luciferasa estimulada por tTA pUHC13-3 (0,25 \mug). Como control, se transfectaron las mismas cantidades de plásmido indicador pUHC13-3 más un vector vacío, pUHD10-3, en cardiomiocitos a partir de la misma preparación de células. Después de transfección, se examinaron las actividades de luciferasa en extractos celulares en diversos puntos de tiempo, usando el ensayo de luciferasa según se ha descrito en el Ejemplo 3. En ausencia de tTA, se detectaron sólo niveles muy bajos de actividad de gen indicador durante las 48 horas post-transfección. La expresión de tTA produjo un aumento espectacular en la actividad de indicador durante este período, y las actividades de los genes diana alcanzaron un máximo a las 12 horas después de transfección, según se muestra en la figura 12A. A las 12 horas postransfección, las actividades de luciferasa en las células transfectadas con tTA fueron más de 30 veces superiores que las de la célula sin transfección tTA (figuras 11A y 11B). Cuando se trataron las células con 1 \mug/ml de doxciclina (Fluka Chemical Corp.) después de transfección, la transactivación del gen diana se reprimió de manera notable. Sin embargo, el tratamiento con doxciclina en sí causó una expresión transitoriamente de bajo nivel del gen diana (un aumento de aproximadamente 4 veces a las 12 horas post-transfección) (figuras 11A y 11B), lo que sugiere que la represión de doxciclina en el gen diana en cardiomiocitos primarios no es completa. Es posible que la expresión génica exógena en transfección transitoria no esté bajo el control estricto de la maquinaria de regulación de genes nativos de estas células. El tratamiento con doxciclina podría causar una débil señal para estimular la expresión de bajo nivel de este gen diana. Por tanto, la doxciclina no parece ser el mejor efector para regular la transcripción de gen cardiaco en este
sistema.

La transcripción de los genes sensibles a hipertrofia inducidos por sistema de expresión de calcineurina regulado por tTA depende de la dosis de gen de calcineurina

La calcineurina activa expresada constitutivamente activa la transcripción de gen indicador de ANF en cardiomiocitos primarios de rata. Por otra parte, la transcripción de indicador de gen de \alpha-actina cardiaca está inducida por expresión de calcineurina activa estimulada por tTA en células de músculo liso Pac-1. Para detectar los efectos de la calcineurina activa en la transcripción de genes cardiacos en cardiomiocitos primarios y determinar la concentración óptima de construcción de calcineurina en transfección para inducir expresión de gen cardiaco, se transfectaron diversas cantidades de construcción de expresión de calcineurina activada dependiente de tTA p10-3CaN, 0,25 \mug de plásmido de expresión tTA pUHD 15-1 y 0,25 \mug plásmido promotor-indicador de \alpha-actina cardiaca CardA-Luc en cardiomiocitos primarios de rata. Los resultados se muestran en la figura 12. El vector vacío, pUHD10-3, se usó como control para sustitución por p10-3CaN o para complemento de ADN total a 0,75 \mug/por pocillo. A las 24 horas después de transfección, se analizaron los niveles de expresión de gen indicador de \alpha-actina cardiaca por el ensayo de luciferasa, según se describe en el Ejemplo 3. Según se muestra en la figura 12, en ausencia de calcineurina activa exógena, el nivel de expresión de gen indicador fue bastante bajo, mientras que la transcripción de gen indicador de \alpha-actina cardiaca se potenció gradualmente mediante dosis crecientes de p10-3CaN transfectado. Cuando la cantidad de ADN de calcineurina fue de hasta 0,25 \mug, la expresión de gen indicador aumentó hasta casi niveles máximos. Claramente, la expresión de gen de \alpha-actina cardiaca es dependiente de la dosis de gen de calcineurina activa. En experimentos posteriores se usaron 0,25 \mug de p10-3CaN como dosis óptima.

La expresión inducida de una forma activa de calcineurina activa rápidamente la transcripción de tres genes sensibles a hipertrofia en células miocárdicas

Para evaluar más en detalle la capacidad de calcineurina de regular la expresión de gen cardiaco en células miocárdicas, los autores de la invención estudiaron los cursos en el tiempo de expresión de tres genes de respuesta a hipertrofia bajo la inducción de expresión de calcineurina activa. Se usaron como indicadores plásmidos promotor-Luc de \alpha-actina cardiaca, \alpha-actina esquelética y ANF. Se cotransfectaron cardiomiocitos primarios de rata neonatal con cada indicador, pUHD15-1, y p10-3CaN, o vector vacío pUHD10-3 en vez de p10-3CaN, junto con pUHD15-1 y plásmidos indicadores. La cantidad de cada plásmido fue de 0,25 \mug. Las transfecciones se llevaron a cabo según se describe en el Ejemplo 3. En varios puntos de tiempo después de la transfección, se midieron las actividades de luciferasa de extractos celulares, según se describe en el Ejemplo 3. En cada experimento, se usó el nivel más alto de actividad de luciferasa como la respuesta máxima de gen indicador, todos los datos se normalizaron a un porcentaje de la respuesta máxima. En ausencia de la expresión de calcineurina activa exógena, los niveles de transcripción de tres genes cardiacos fueron muy bajos. Sin embargo, la expresión de calcineurina activa indujo acusadamente la transcripción de tres genes cardiacos, como se muestra en la figura 13. La expresión de genes de \alpha-actina cardiaca, \alpha-actina esquelética y ANF aumentó significativamente en todos los casos hasta casi niveles máximos 48 horas post-transfección, lo que sugiere que la calcineurina activa rápidamente la transcripción de estos genes de respuesta a hipertrofia en cardiomiocitos primarios.

Cuando se cotransfectaron las mismas preparaciones de células cardiacas con las mismas cantidades de indicador, tTA y ADN de plásmido de calcineurina según se indica en la figura 14, se detectaron niveles de expresión de tres genes cardiacos a las 48 horas después de transfección. En comparación con los controles en los que sólo se transfectó el vector vacío pUHD10-3 en vez de plásmidos de calcineurina, junto con indicador y plásmido tTA, en los cardiomiocitos, la calcineurina activó intensamente la transcripción de \alpha-actina cardiaca en aproximadamente 8 a 10 veces, y activó moderadamente la expresión de ANF y \alpha-actina esquelética activados en aproximadamente 6 veces y 3 veces, según se muestra en las figuras 14B y 14C.

Estos resultados no sólo indicaban el efecto estimulador de la calcineurina en la transcripción de genes sensible a hipertrofia, sino que también demostraban utilidad en el sistema de expresión de genes inducibles. La capacidad de calcineurina activada para inducir la transcripción de genes de respuesta a hipertrofia en los cardiomiocitos es consistente con el resultado de ratones transgénicos que sobreeexpresan la forma constitutivamente activa de calcineurina (Molkentin y col., 1998). Por ejemplo, el nivel de ARNm de gen de \alpha-actina esquelética en el corazón de ratones transgénicos de calcineurina fue de aproximadamente 5 veces más alto que en el corazón de ratón normal. El número de aumentos de la expresión de gen de ANF inducidos por calcineurina en el sistema de expresión inducible de la invención es similar al de la activación de genes BNP en ratones transgénicos de calcineurina. Sin embargo, el número de aumentos en el nivel de transcripción de gen de \alpha-actina cardiaca en el sistema de la invención es superior al de los ratones transgénicos que sobreexpresan calcineurina.

Represión de inducción por calcineurina de expresión de gen de respuesta hipertrófica por ciclosporina A

Para evaluar si la activación transcripcional de genes sensibles a hipertrofia por calcineurina activada podría inhibirse por CsA, se trató un inhibidor específico de calcineurina, tanto de cultivos celulares miocárdicos transfectados con construcción p10-3CaN o vector vacío pUND 10-3, junto con plásmidos de indicador tTA y CardA-Luc según se describe en el Ejemplo 3, con diferentes concentraciones de CsA (Sandoz Pharmaceuticals Corp., East Hanover, NJ) o sin tratamiento con CsA desde 0 horas después de la transfección. En varios puntos de tiempo, se sometieron a ensayo y se compararon las actividades de luciferasa en estas células. En el grupo de control que no tenía transfección de calcineurina, el tratamiento con CsA sólo produjo un menor descenso en el nivel de transcripción del gen de \alpha- actina cardiaca en comparación con ausencia de tratamiento, según se muestra en la figura 15. Sin embargo, una expresión de gen de \alpha-actina cardiaca estimulado por calcineurina activada fue reprimido significativamente por todas esas concentraciones diferentes de CsA, según se muestra en la figura 15, lo que apoya aún más la conclusión de que la expresión de ese gen de respuesta hipertrófica cardiaca se activa por una ruta de transducción de señales dependientes de calcineurina. A las 72 horas después de transfección, la actividad de gen de \alpha-actina cardiaca inducida por la calcineurina se inhibió en más del 80% por tratamiento con CsA 100nM o 150 nM, según se muestra en la figura 15, lo que indica que concentraciones muy bajas de CsA pueden inhibir la activación transcripcional de gen de \alpha-actina cardiaca inducido por calcineurina. Por tanto, en experimentos posteriores se eligió 100 nM como concentración óptima de CsA.

Para demostrar aún más el efecto de CsA en la transcripción de genes sensibles a hipertrofia inducida por calcineurina, los autores de la invención analizaron el modo en que la expresión de gen promotor-indicador de \alpha-actina cardiaca bajo estimulación por calcineurina activa responde a CsA. Se cotransfectaron cardiomiocitos primarios con tTA, construcciones de indicador de \alpha-actina cardiaca y calcineurina, o tTA, gen indicador de \alpha-actina cardiaca, y vector vacío como control. Se inició tratamiento con CsA (100 nM) 0 horas después de transfección. Se examinó la actividad de gen de \alpha-actina cardiaca en cultivos de células cardiacas por ensayo de luciferasa y se normalizaron los resultados a un porcentaje de la máxima respuesta. En las células transfectadas con el vector vacío, la expresión del gen de \alpha-actina cardiaca fue baja y no hubo una diferencia notable en la actividad génica entre las células tratadas o no tratadas con CsA, según se muestra en la figura 16. Sin embargo, el tratamiento con CsA condujo a una reducción espectacular en la transcripción de gen cardiaco en células transfectadas con calcineurina activa. 48 horas después de tratamiento con CsA, la expresión del gen de \alpha-actina cardiaca activada por calcineurina se redujo casi a niveles basales, según se muestra en la figura 16.

Basándose en los resultados anteriores, los autores de la invención sometieron a ensayo los efectos de CsA en la activación transcripcional mediada por calcineurina de genes de ANF, \alpha-actina cardiaca y \alpha-actina esquelética. Se cotransfectaron cantidades iguales de cada construcción indicadora, junto con tTA y ADN p10-3CaN, en las células obtenidas de las mismas preparaciones de cultivo primarias. Se usó el vector vacío, pUHD10-3, en vez de p10-3CaN como control. Después de transfección, se cultivaron las células transfectadas con calcineurina activa durante 48 horas en medio de cultivo que contenía CsA 100nM o en medio de cultivo sin CsA. Se cultivaron las células transfectadas con vector vacío en medio sin CsA durante la misma cantidad de tiempo. A continuación se lisaron estos cardiomiocitos para analizar las actividades de estos genes de respuesta a hipertrofia cardiaca. Los resultados se muestran en la figura 17. La activación transcripcional de genes de ANF y \alpha-actina esquelética mediada por calcineurina activa quedó casi completamente bloqueada por CsA en cardiomiocitos primarios de rata: aproximadamente el 80% de la actividad transcripcional de gen de \alpha-actina cardiaca regulada por incremento por la acción de la calcineurina quedó inhibido por CsA.

La represión de la transcripción de genes sensibles a hipertrofia por tratamiento con CsA es reversible

Debido a requisitos prácticos en estudios complejos, la capacidad para regular bidireccionalmente la expresión de gen exógeno tendría una gran importancia en los estudios de función génica, así como terapias génicas. Para evaluar si la expresión reprimida de los genes exógenos de respuesta hipertrófica en el sistema de la invención podría controlarse reversiblemente interrumpiendo el tratamiento con CsA, se transfectaron cardiomiocitos primarios de la misma preparación con tTA, construcción de calcineurina y plásmidos de indicador de \alpha-actina cardiaca. Después de la transfección, todas las células se trataron con CsA 100 nM. 24 horas más tarde, se cultivó de manera continua una parte de las células en medio que contenía CsA, mientras otra parte de las células se pasó a un medio sin CsA. En varios puntos de tiempo, se examinó la expresión de gen indicador en estos cardiomiocitos mediante ensayo de luciferasa. Según se muestra en la figura 18, durante un período de 72 horas las actividades de gen indicador en células tratadas con CsA fueron bajas. Sin embargo, la expresión del gen cardiaco se elevó rápidamente después de interrumpir el tratamiento con CsA. 48 horas después de retirar la CsA de los medios (punto de tiempo de 72 horas), la actividad del gen indicador de \alpha-actina cardiaca había aumentado aproximadamente 2,5 veces en comparación con la de las células tratadas con CsA. Los datos demostraron que la transcripción reprimida del gen cardiaco por CsA podría invertirse rápidamente. Por tanto, basándose en los resultados mostrados anteriormente, la expresión de genes sensibles a hipertrofia exógenos en cardiomiocitos primarios, bajo las condiciones experimentales usadas, podría regularse rápidamente en un sentido positivo o negativo.

Claims (6)

1. Uso de una composición que inhibe la actividad de calcineurina y modula la actividad de al menos un gen o producto génico que se expresa en cardiomiocitos como respuesta a una señal hipertrófica para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de hipertrofia cardiaca, hipertrofia cardiaca descompensada, hipertrofia cardiaca compuesta, hipertrofia cardiaca dilatada e insuficiencia cardiaca.

2. Uso de la reivindicación 1, en el que el producto génico es un factor natriurético auricular, un factor natriurético de tipo b, una cadena pesada de \beta-miosina o una \alpha-actina esquelética.

3. Uso de la reivindicación 1, en el que la composición comprende una sustancia seleccionada entre ciclosporina, FK506 y derivados de los mismos.

4. Uso de un mamífero transgénico no humano que comprende un transgén, comprendiendo dicho transgén una región de codificación que codifica calcineurina y un elemento regulador transcripcional (TRE) específico de cardiomiocito, o del corazón aislado de dicho mamífero, para detectar sustancias útiles para el tratamiento de hipertrofia cardiaca, hipertrofia cardiaca descompensada, hipertrofia cardiaca compuesta, hipertrofia cardiaca dilatada e insuficiencia cardiaca, en el que se mide un parámetro cardiaco de dicho mamífero o de dicho corazón después de administración de la sustancia que se va a probar a dicho mamífero o a dicho corazón, y se proporciona un control mediante la medida de dicho parámetro en un mamífero correspondiente, o en el corazón aislado de dicho mamífero correspondiente, al que no se ha administrado la sustancia, en el que la modulación del parámetro cardiaco por la sustancia comparada con el control indica que la sustancia es útil para su uso en el tratamiento de las enfermedades definidas anteriormente.

5. Uso de la reivindicación 4, en el que es el mamífero transgénico no humano el que se usa para la detección.

6. Uso de células cultivadas en medio para detectar sustancias útiles para el tratamiento de hipertrofia cardiaca, hipertrofia cardiaca descompensada, hipertrofia cardiaca compuesta, hipertrofia cardiaca dilatada e insuficiencia cardiaca, en el que se introduce en el medio de cultivo de las células la sustancia que se va a probar, se examina la función de dichas células y se proporciona un control mediante la medición de dicha función en células correspondientes que no se expusieron a la sustancia, y en el que las células son cardiomiocitos obtenidos de un transgénico animal para una construcción, en la que la construcción comprende una región de codificación que codifica calcineurina y un TRE unido operativamente a dicha región de codificación, en el que dicho TRE comprende un promotor específico de cardiomiocitos, o en el que las células son cardiomiocitos primarios obtenidos de un animal no transgénico, estando las células transfectadas de manera estable o transitoria con una región de codificación que codifica calcineurina y un TRE unido operativamente a dicha región de codificación, en el que dicho TRE comprende un promotor específico de cardiomiocitos.