MXPA00003832A - Modelo y tratamiento para hipertrofia cardiaca en relacion con la funcion de nf-at3 - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con hipertrofia cardiaca. Más particularmente, la presente invención define los eventos moleculares que relacionan la estimulación de calcio con la hipertrofia cardiaca. Más específicamente, la presente invención muestra que la estimulación por Ca++ de la respuesta hipertrófica es mediada a través de NF-AT3. Por lo tanto, la presente invención proporciona métodos para tratar hipertrofia cardiaca asícomo construcciones transgénicas para preparar animales transgénicos;se proporcionan además métodos para utilizar los animales transgénicos de la presente invención, o células aisladas de los mismos, para la detección de compuestos que tienen actividad terapéutica hacia la hipertrofia cardiaca.

Description

MODELOS Y TRATAMIENTOS PARA HIPERTROFIA CARDIACA EN RELACIÓN CON LA FUNCIÓN DE NF-AT3 k.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 1. CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona generalmente con el campo (f de la biología molecular. Más particularmente, se relaciona con el descubrimiento de un mediador central de hipertrofia cardiaca. « 2. DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA RELACIONADA La hipertrofia cardiaca es una respuesta adaptativa del corazón a 15 virtualmente todas las formas de enfermedad cardiaca, que incluyen aquellas que se surgen de hipertensión, carga mecánica, infarto al miocardio, arritmias cardiacas, trastornos endocrinos y mutaciones genéticas en los genes para las proteínas contráctiles cardiacas. Aunque la respuesta hipertrófica inicialmente es un mecanismo compensatorio que aumenta el gasto cardíaco, la hipertrofia 20 sostenida puede llevar a cardiomiopatía dilatada, fallo cardíaco y muerte súbita. En los Estados Unidos, aproximadamente medio millón de personas se diagnostican con fallo cardíaco cada año, con una tasa de mortalidad que se aproxima a 50%.

Pese a los diversos estímulos que llevan a hipertrofia cardiaca, existe una respuesta molecular prototipo de los cardiomiocitos a señales hipertróficas que involucran un incremento en el tamaño celular y en la síntesis de proteínas, una organización sarcomérica aumentada, regulación ascendente de los genes cardíacos fetales e inducción de genes tales como c-fos y c-myc (revisado en Chien et al., 1993; Sadoshima e Izumo, 1997). Las causas y efectos de hipertrofia cardiaca se han documentado extensamente, pero aun permanecen poco entendidos los mecanismos moleculares subyacentes que acoplan las señales hipertróficas, iniciadas en la membrana celular para reprogramar la expresión de genes de cardiomiocitos. La dilucidación de estos mecanismos es un tema central en la biología cardiovascular y es critico en el diseño de nuevas estrategias para la prevención o tratamiento de hipertrofia cardiaca y fallo cardíaco. Muchos estudios han implicado al Ca++ intracelular como una señal para la hipertrofia cardiaca. En respuesta a el estirado o cargas aumentadas del miocito cuando se trabajan preparaciones cardiacas, se incrementan las concentraciones intracelulares de Ca++ (Marban eí al., 1987; Bustamante et al., 1991 ; Hongo et al., 1995). Esto es consistente con un papel de Ca++ en coordinar respuestas fisiológicas con gasto cardíaco aumentado. Diversos factores humorales, que incluyen angiotensina II (Angll), fenileprina (PE), y endotelina-1 (ET-1 ), los cuales inducen una respuesta hipertrófica en cardiomiocitos (Karliner eí al., 1990; Sadoshima e Izumo, 1993a, 1993b; Leite eí al., 1994), también comparten la capacidad de elevar las concentraciones intracelulares de Ca2+. Los estímulos hipertróficos resultan en reprogramación de la expresión de genes en el miocardio adulto de manera que se activan los genes que codifican las isoformas de proteína fetal como la cadena pesada de ß-miosina (MHC) y la actina esquelética , mientras que se inactivan las ¡soformas adultas correspondientes, a-MHC y a-actina cardiaca. Los péptidos natriuréticos, el factor natriurético auricular (ANF) y el péptido natriurético tipo ß (BNP), los cuales disminuyen la presión sanguínea por vasodilatación y natriuresis, también se activan rápidamente en el corazón en respuesta a las señales hipertróficas (revisado en Komuro y Yazaki, 1993). Se desconocen los mecanismos involucrados en regular coordinadamente estos genes cardíacos durante la hipertrofia, aunque los sitios de unión para varios factores de transcripción, que incluye el factor de respuesta sérica (SRF), TEF-1 , AP-1 y Sp1 son importantes para la activación de genes cardíacos fetales en respuesta a hipertrofia (Sadoshima e Izumo, 1993a, 1993b; Kariya eí al., 1994; Karns eí al., 1995; Kovacic-Milivojevic et al., 1996). Más recientemente, también se ha demostrado que se requiere el factor GATA4 de transcripción de dedo de zinc restringido a la región cardiaca para la activación transcripcional de los genes para el receptor Ang II tipo 1 a y ß-MHC durante la hipertrofia (Herzig eí al., 1997; Hasegawa et al., 1997; revisado en Molkentin y Olson, 1997). Es claro que la respuesta hipertrófica cardiaca se inicia de alguna manera a través de la vía dependiente de Ca++. Sin embargo, permanece sin dilucidarse la identificación precisa del gen o genes los cuales median la respuesta hipertrófica. La presente invención está dirigida hacia la dilucidación del punto exacto en la vía hipertrófica el cual puede ser manipulado para obtener efectos benéficos sobre la hipertrofia cardiaca. Con el fin de desarrollar estrategias farmacológicas para tratamiento de hipertrofia cardiaca en humanos, será importante establecer modelos animales los cuales reflejen con precisión el perfil patológico de la enfermedad.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención está diseñada para proporcionar modelos y tratamientos de hipertrofia cardiaca y fallo cardíaco relacionado. Por lo tanto, en un aspecto preferido, la presente invención proporciona un método para tratar hipertrofia en una célula de cardiomiocito que comprende la etapa de inhibir la función de NF-AT3. En modalidades particularmente preferidas, la inhibición de la función NF-AT3 comprende inhibir la desfosforilación de NF-AT3. En otras modalidades preferidas, la inhibición de la función de NF-AT3 comprende reducir la expresión de NF-AT3. En otras modalidades preferidas adicionales, la inhibición de la función de NF-AT3 comprende poner en contacto a NF-AT3 con un agente que se une o que inactiva a NF-AT3. En otras modalidades, la inhibición de la función de un NF-AT3 comprende inhibir la interacción de NF-AT3 con GATA4. En modalidades adicionales, el método puede comprender además inhibir la activación de un gen regulado por NF-AT3, en donde el gen se selecciona del grupo que consiste del gen de factor natriurético auricular, un gen de cadena pesada de ß-miosina, un péptido natriurético del tipo ß y un gen de actina natriurético esquelética a- En las modalidades particularmente preferidas, el agente que inhibe la función de los genes puede ser una construcción antisentido. En aquellas modalidades que comprenden la inhibición de desfosforilación de NF-AT3, el agente que inhibe la desfosforilación puede ser ciclosporina A o FK506. Por supuesto, cualquier otro agente que inhiba la desfosforilación de una proteína también puede demostrar utilidad. En las modalidades particulares que reducen la expresión de NF-AT3, el agente que reduce la expresión de NF-AT3 puede ser una construcción antisentido. En otras modalidades, la actividad de NF-AT3, es inhibida por un agente que se une a y que inactiva a NF-AT3, el agente puede ser una preparación de anticuerpo o un inhibidor de molécula pequeña. En las modalidades particularmente preferidas, la preparación de anticuerpo comprende un anticuerpo de cadena sencilla. En otras modalidades preferidas, la preparación de anticuerpo consiste esencialmente de un anticuerpo monoclonal. La presente invención contempla adicionalmente a un mamífero no humano transgénico, cuyas células comprenden un gen NF-AT3 heterólogo bajo el control de un promotor activo en células eucarióticas. En las modalidades particulares, el mamífero es un ratón. En otras modalidades, el gen NF-AT3 heterólogo contiene por lo menos una mutación que destruye un sitio de fosforilación. En modalidades particularmente preferidas, el gen NF-AT3 heterólogo es humano. En modalidades particularmente definidas, el animal transgénico comprende un gen de NF-AT3 que codifica para una proteína que carece de uno o más sitios de fosforilación de NF-AT3 de tipo silvestre. En otras modalidades, el gen de NF-AT3 codifica para una proteína que carece de la totalidad de los sitios de fosforilación de NF-AT3 de tipo silvestre. En modalidades adicionales, el gen de NF-AT3 codifica para una proteína que carece de los aminoácidos 1-137 de NF-AT3 de tipo silvestre. En ciertos aspectos definidos, el promotor utilizado puede ser un promotor especifico de tejido. En aspectos más particulares, el promotor especifico de tejido es un promotor especifico de cardiomiocitos. En las modalidades preferidas, el promotor especifico de cardiomiocitos se puede seleccionar del grupo que consiste de BNP, ß-MHC, troponina I cardiaca, <?-MHC, SM22a y promotor de actina esquelética a- Por supuesto, cualquier otro promotor que esté asociado con el gen específico cardíaco también se puede utilizar como se describe en la presente. Las modalidades adicionales de la presente invención proporcionan un método para analizar moduladores de hipertrofia cardiaca que comprende la etapas de proporcionar una célula que tiene un gen mutante de NF-AT3 que carece de uno o más sitios de fosforilación; poner en contacto la célula con un modulador candidato y monitorear la célula para determinar un efecto que no esté presente cuando la célula no se trata con el modulador candidato. En aspectos particulares, la célula se deriva de una línea de células de cardiomiocito. En otros aspectos, la célula se deriva de un cardiomiocito primario. En las modalidades definidas, el contacto se produce in vitro. En las modalidades particulares, el monitoreo comprende medir la actividad o expresión de un gen que se selecciona del grupo que consiste de un gen de factor natriurético auricular, un gen de cadena pesada de ß-miosina, un gen de actina esquelética . En otras modalidades, el monitoreo comprende medir el tamaño de la masa de la célula. En otras alternativas adicionales el monitoreo comprende monitorear la respuesta de Ca++ en la célula. Más particularmente, el monitoreo de la respuesta de Ca++ puede comprender monitorear la expresión del gen dependiente de Ca++ en la célula. En aspectos particulares, el contacto se produce in vivo. En ciertas modalidades, la célula puede ser parte de un mamífero no humano transgénico. En aspectos particulares, el monitoreo comprende medir la hipertrofia cardiaca. En ciertas modalidades de este aspecto de la invención, el gen NF-AT3 codifica para una proteína que carece de uno o más sitios de fosforilación de NF-AT3 de tipo silvestre. En otras modalidades preferidas, el gen de NF-AT3 codifica para una proteína que carece de la totalidad de los sitios de fosforilación de NF-AT3 de tipo silvestre. En modalidades adicionales, el gen de NF-AT3 codifica para una proteína que carece de los aminoácidos 1-137 de NF-AT3 de tipo silvestre. En las modalidades definidas, el modulador candidato independientemente puede ser una construcción antisentido, una sustancia de una biblioteca de moléculas pequeñas, un anticuerpo o un anticuerpo de cadena sencilla.

Los objetivos, características y ventajas adicionales de la presente invención se volverán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Se debe comprender, sin embargo, que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican modalidades preferidas de la invención, se proporcionan únicamente a modo de ilustración, pues varios cambios y modificaciones dentro del espíritu y alcance de la invención se volverán evidentes para aquellos expertos en la técnica a partir de esta descripción detallada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Los siguientes dibujos forman parte de la presente especificación y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La invención se puede comprender mejor con referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de las modalidades especificas presentadas en este documento. Figura 1A y figura 1B. Interacciones entre GATA4 y NF-AT3 en el sistema de dos híbridos. Figura 1A. Diagramas esquemáticos de las proteínas GATA4 y NF-AT3. La porción de GATA4 utilizada como cebo en el sistema de dos híbridos abarca los aminoácidos 130-409 y se muestra debajo de la proteína de longitud completa. La proteína de NF-AT3 recuperada en el análisis de dos híbridos de levadura de levadura abarcan los aminoácidos 522-902. El dominio de homología a Reí (RHD) se extiende desde los aminoácidos 404-694 y el dominio de fosforilación conservado de 145-275. Figura 1 B. Aminoácidos 522-902 de NF-AT3 que se fusionan en marco al dominio de unión de ADN de GAL4 (DBD) se utiliza como cebo en el ensayo de dos híbridos en células 10T1/2 transfectadas. Figura 2. Resumen de los resultados de coinmunoprecipitación.

F1 y F2 indican los dos dedos de zinc y NLS designa la señal de localización nuclear. Figura 3. Regulación del promotor BNP por NF-AT3 en cardiomiocitos primarios. Se transfectan transitoriamente cardiomiocitos de rata primarios con el gen indicador CAT unido a la región flanqueante 5' de BNP y los vectores de expresión que codifican para NF-AT3, calcineurina activada o GATA4, como se indica. Se cosechan las células 48 h después y se determina la actividad CAT. En el carril etiquetado con el mutante del sitio -927, se utiliza un gen indicador BNP-CAT en el cual se a mutado el sitio en -927 de NF-AT3. Figura 4. Inhibición de hipertrofia dependiente de Ang II y PE de cardiocitos primarios por CsA y FK506. Se transfectan transitoriamente cardiomiocitos primarios de rata con NF-AT-gen indicador dependiente de luciferasa. Las células después se tratan con Ang II o PE en presencia o ausencia de CsA como se describe antes. Se cosechan las células 48 h después y se determina la actividad de luciferasa. Figura 5. Cambios en la expresión cardiaca del gen en un ratón transgénico -MHC-calcineurina. Se aisla el ARN total de los corazones de ratones transgénicos control y a-MHC-calcineurina a las 6 semanas de edad.

Se detectan los transcritos indicados mediante análisis dot blot y se muestran sus niveles en los corazones transgénicos en relación a los controles. Figura 6. Estructura del NF-AT3 y del mutante NF-AT3_317. RHD dominio de homología Reí; Reg., dominio regulador. Se indican las posiciones de los aminoácidos. Figura 7A y figura 7B. Prevención de hipertrofia dependiente de calcineurina por CsA. Figura 7A. Se muestra el régimen para el tratamiento de CsA. Figura 7B. Los ratones transgénicos a-MHC-calcineurina y no transgénicos se tratan con o sin CsA (25 mg/kg), según se indica. Las relaciones de peso cardíaco a corporal se expresan + desviaciones estándar. Los compañeros de carnada transgénicos obtenidos de transgénico de calcineurina macho #37 (véase la tabla 1 ) se tratan con CsA o con vehículo sólo, comenzando a los 9 días de edad, como se describe en el ejemplo 1. A los 25 días de edad, se sacrifica a los animales y se extirpan los corazones y se cortan longitudinalmente. Figura 8. Modelo para la vía transcripcional dependiente de calcineurina en hipertrofia cardiaca. Angll, PE y posiblemente otros estímulos hipertróficos que actúan en la membrana celular llevan a la elevación de Ca++ intracelular y la activación de calcineurina en el citoplasma. Calcineurina desfosforila a NF-AT3, lo que resulta en su traslación al núcleo en donde interactúa con GATA4 para activar sinergísticamente la transcripción. Aun está por determinarse si todas las acciones de NF-AT3 son mediadas por su interacción con GATA4 o si son vías independientes de GATA4 para la activación de ciertas respuestas hipertróficas. Las flechas continuas indican trayectorias que se conocen. Las líneas discontinuas indican posibles vías que no se han demostrado. DESCRIPCIÓN DE LA MODALIDADES PREFERIDAS La hipertrofia cardiaca, la cual resulta en fallo cardíaco, es la causa principal de morbilidad en los Estados Unidos, pero aun no se comprenden los mecanismos moleculares subyacentes. La cardiomiopatía hipertrófica se produce en formas tanto familiares como esporádicas. Este tipo de cardiomiopatía está característica por hipertrofia del ventrículo izquierdo. La cardiomiopatía hipertrófica es característica por una función sistólica aumentada, una fase de contracción isométrica prolongada y anormalmente poderosa seguida por relajamiento dañado y rigidez aumentado de la cámara durante la diástole. La hipertrofia cardiaca en respuesta a una carga de trabajo aumentada impuesta al corazón es un mecanismo adaptativo fundamental. Es un proceso especializado que refleja un incremento cuantitativo en el tamaño y la masa celulares (en vez de en el número de células) como el resultado de cualquiera de una combinación de estímulos neurales, endocrinos o mecánicos. Un precursor frecuente del fallo cardíaco congestivo es la hipertensión, otro factor involucrado en la hipertrofia cardiaca. Cuando se produce un fallo cardíaco, el ventrículo izquierdo habitualmente está hipertrofiado y dilatado y se reducen los índices de función sistólica, tales como la fracción de expulsión.

Claramente, la respuesta hipertrófica cardiaca es un síndrome complejo y la dilucidación de las vías que llevan a hipertrofia cardiaca será benéfica para el tratamiento de la enfermedad cardiaca que resulta de los diversos estímulos. 1. La presente invención Se ha establecido bien que la elevación en Ca++ intracelular se asocia con el inicio de la hipertrofia cardiaca inducida mecánicamente o por agonistas (Marban et al., 1987; Bustamante et al., 1991 ; Hongo et al., 1995; Le Guennec et al., 1991 ; Perreault eí al., 1994; Saeki eí al., 1993). Además, se sabe que la hipertrofia cardiaca resulta de la activación de ciertos genes que lleva a un incremento en el contenido de proteína de los cardiomiocitos con poco o nulo incremento en el número de células. Pese a estas observaciones, antes de la presente invención, se sabía poco acerca de los eventos celulares que provocan este incrementa en el contenido de proteína y finalmente en la masa miocárdica que es típica de la hipertrofia cardiaca. La presente invención establece los fundamentos de la dilucidación de una vía intracelular para la inducción de hipertrofia cardiaca que relaciona la señal de Ca++ en el citoplasma con cambios en la expresión de genes cardíacos. La activación de esta vía hipertrófica, ya sea en el citoplasma o en el núcleo, a través de calcineurina o NF-AT3, respectivamente, resulta en cambios moleculares y patofisiológicos. El aprovechamiento de estas interacciones, tanto en los contextos de diagnostico como terapéutico son la base de la invención como se describe en lo siguiente aquí.

La presente invención proporciona, por primera vez, ratones transgénicos que expresan constitutivamente una forma activada de la proteína NF-AT3. Más particularmente, la proteína NF-AT3 expresada carece de sitios de fosforilación de la NF-AT3 de tipo silvestre, y no requiere activación por la desfosforilación mediada por Ca++, mediada por calcineurina. Puesto que este mutante que carece de sitios de fosforilación, se localiza en el núcleo en donde se une a GATA4 de una manera constitutiva para mediar la activación de los genes que normalmente responden a señales hipertróficas. Los ratones transgénicos que expresan la forma activada de NF-AT3 en el corazón desarrollan hipertrofia cardiaca y fallo cardíaco que imita a la enfermedad cardiaca humana. Por lo tanto, en ciertas modalidades, estos ratones serán útiles para identificar medicamentos y genes que puedan ser utilizados para disminuir la hipertrofia cardiaca y la enfermedad cardiaca humana. Además, dado que la presente invención muestra que la respuesta hipertrófica cardiaca dependiente de Ca++ en mamíferos está mediada a través de la activación de NF-AT3, la presente invención proporciona métodos para tratar hipertrofia cardiaca al inhibir la función de NF-AT3. Esta inhibición puede presentarse en numerosos niveles, en primera instancia, la inhibición de la función de NF-AT3 puede resultar de una inhibición de la activación de NF-AT3. En el sentido más amplio, esto implica inhibir la desfosforilación de la proteína NF-AT3 citoplasmática. Esto se puede obtener utilizando inhibidores específicos de calcineurina tales como ciclosporina A (CsA) o FK-506 o mediante activación de NF-AT3 cinasas. En otra alternativa, la inhibición de NF-AT3 puede involucrar la inhibición de la actividad de NF-AT3 utilizando, por ejemplo, metodologías antisentido, anticuerpos de cadena sencilla, inhibidores de molécula pequeña y similares. En otra solución adicional, en vez de establecer como objetivo la proteína o el gen de NF-AT3, es posible inhibir la hipertrofia cardiaca mediada por NF-AT3 evitando la interacción de NF-AT3 con el NF-AT3 objetivo, por ejemplo, GATA4. En esta modalidad, será posible generar una construcción antisentido, anticuerpo de cadena sencilla y similares que removerán el NF-AT3 objetivo y de esta manera bloquearán el efecto de NF-AT3. Los métodos y composiciones para obtener un resultado potencialmente benéfico se describen con mayor detalle en la presente a continuación. 2. Guía transcripcional para hipertrofia cardiaca Como se establece en lo anterior, se sabe que la activación de Ca++ está involucrada en la hipertrofia cardiaca, sin embargo, de manera notable, no se ha investigado previamente la posibilidad de que la calcineurina pueda participar en la transducción de señales hipertróficas en cardiomiocitos. La presente invención describe una vía dependiente de calcineurina para hipertrofia cardiaca, esta vía se muestra en la figura 8. Los componentes individuales de esta vía conforme se relacionan con la hipertrofia cardiaca, se discuten con mayor detalle en la presente después. a. Calcineurina La calcineurina es una serina-treonina fosfatasa que se expresa de manera ubicua y que existe como un heterodímero, constituido de una subunidad A catalítica que se une a calmodulina de 59 kD, y una subunidad B reguladora que se une a Ca++, de 19 kD (Stemmer y Klee, 1994; Su eí al., 1995). La calcineurina está situada de manera única para mediar la respuesta hipertrófica prolongada de un cardiomiocito a la señalización por Ca++ debido a que la enzima es activada por una meseta (concentración constante) de Ca++ sostenida y es insensible a flujos de Ca++ transitorios que se presentan en respuesta a la contracción de los cardiomiocitos (Dolmetsh eí al., 1997). La activación de calcineurina es mediada por la unión de Ca++ y calmodulina a las subunidades reguladora y catalítica, respectivamente. Estudios previos han demostrado que la expresión de calmodulina en el corazón también resulta en hipertrofia, pero el mecanismo involucrado aun no se ha determinado (Gruver eí al., 1993). Dadas las observaciones presentadas aquí, ahora es claro que la calmodulina actúa a través de la vía de calcineurina para inducir la respuesta hipertrófica. b. NF-AT3 NF-AT3 es un miembro de la familia de genes múltiples que contiene cuatro miembros, NF-ATc, NF-ATp, NF-AT3 y NF-AT4 (McCaffery eí al., 1993; Northrup eí al., 1994; Hoey eí al., 1995; Masuda eí al., 1995; Park eí al., 1996; Ho eí al., 1995). Estos factores unen la secuencia de ADN de consenso GGAAAAT como monómeros o dímeros a través de un dominio de homología Reí (RHD) (Rooney eí al., 1994; Hoey eí al., 1995). Tres de los genes de NF-AT están restringidos en su expresión a células T y músculo esquelético, mientras que NF-AT3 se expresa en diversos tejidos, incluyendo el corazón (Hoey eí al., 1995). Para una descripción adicional respecto a las proteínas NF-AT, se hace referencia a los expertos en la técnica a la patente U.S. No. 5,708,158, incorporado específicamente en la presente como referencia. NF-AT3 es una proteína de 902 aminoácidos (por ejemplo la SEC. DE IDENT. NO.: 8, codifica por la SEC. DE IDENT. NO.: 9) con un dominio regulador que, en su parte amino terminal, mediada la translocación nuclear y el dominio de homología Reí cerca de su parte carboxilo terminal que media la unión de ADN (figura 1A). La región de NF-AT3 recuperada de un análisis de dos híbridos de levadura se extiende desde el aminoácido 522, el cual está cerca de la parte media del dominio de homología Reí, a la parte carboxilo terminal. Existen tres etapas diferentes involucradas en la activación de las proteínas NF-AT, específicamente, desfosforilación, localización nuclear e incremento en la afinidad por ADN. En las células en reposo, las proteínas de NF-AT son fosforilación y residen en el citoplasma. Estas proteínas de NF-AT citoplasmáticas muestran poca o nula afinidad por ADN. Los estímulos que indican la movilización de calcio resultan en la desfosforilación rápida de las proteínas NF-AT y su traslación al núcleo. Las proteínas NF-AT desfosforiladas muestran una afinidad aumentada por ADN. Cada etapa de la vía de activación se puede bloquear por CsA o FK506. Esto implica, y los estudios de inventores lo han demostrado, que la calcineurina es la proteína responsable de la activación de NF-AT. Por lo tanto, en la células T, muchos de los cambios en la expresión de genes en respuesta a la activación de calcineurina están mediados por miembros de la familia NF-AT de factores de transcripción, los cuales se trasladan al núcleo después de la desfosforilación por calcineurina. Tres observaciones independientes presentadas aquí sustentan la conclusión de que NF-AT también es un mediador importante de la hipertrofia cardiaca en respuesta a la activación de calcineurina. En primer lugar, se induce la actividad de NF-AT por tratamiento de los cardiomiocitos con Angll y PE. Esta inducción es bloqueada por CsA y FK506, lo que indica que es dependiente de calcineurina. En segundo lugar, NF-AT3 sinergiza con GATA4 para activar el promotor BNP especifico cardíaco en cardiomiocitos. En tercer lugar, la expresión de NF-AT3 activada en el corazón es suficiente para desviar todos los elementos corriente arriba en la vía de señalización hipertrófica e inducir una respuesta hipertrófica. La presente invención demuestra que la porción C terminal del dominio de homología Reí de NF-AT3 interactúa con el segundo dedo de zinc de GATA4, así como con GATA5 y GATA6, los cuales también se expresan en el corazón. La estructura cristalina de la región de unión a ADN de NF-ATc ha mostrado que la porción C terminal del dominio de homología Reí se proyecta alejándose del sitio de unión de ADN y también media la interacción con AP-1 en células inmunes (Wolfe et al., 1997). Dada la capacidad de los factores de NF-AT para mediar los cambios en la expresión de genes en respuesta a la señalización de Ca++ en células T, los resultados de los inventores son particularmente interesantes en la medida en que GATA4, un efector conocido de la expresión de genes cardíacos, y NF-AT3, son capaces de interactuar. Esta interacción sugiere un mecanismo potencial para el acoplamiento de la señalización de Ca++ a la transcripción cardíaca, como se sabe ocurre durante la hipertrofia cardíaca. Los resultados que aquí se presentan son consistentes con una vía molecular para la hipertrofia cardíaca, como se muestra en la figura 8. De acuerdo con este modelo, los estímulos hipertróficos tales como Angll y PE, los cuales llevan a una elevación de Ca++ intracelular, resultan en la activación de calcineurina. NF-AT3 dentro del citoplasma se desfosforila por calcineurina, lo que permite que se traslade al núcleo en donde puede interactuar con GATA4. Los resultados de este estudio muestran que la activación por calcineurina de NF-AT3 regula la hipertrofia en respuesta a diversos estímulos patológicos y sugiere un mecanismo detector para una función sarcomérica alterada. Es de notarse que existen varias cardiomiopatías hipertróficas familiares (FHC) causadas mutaciones en los genes de proteínas contráctiles, los cuales resultan en una desorganización subyacente en la estructura fina similar a cristales del sarcómero. Se desconoce la manera en que la desorganización sarcomérica es detecta por el cardiomiocito, pero es evidente que esto lleva a un manejo alterado de Ca++ (Watkins eí al., 1995; Vikstrom y Leinwand, 1996). La calcineurina puede representar la molécula detectora que acopla el manejo alterado de Ca++ con FHC con hipertrofia cardíaca y fallo cardíaco. Los resultados de la presente invención hacen surgir además la cuestión respecto a si los inhibidores de calcineurina tales como CsA o FK506 pueden ser útiles en el tratamiento de hipertrofia cardíaca y fallo cardíaco en humanos. Estos inmunosupresores se utilizan habitualmente en pacientes de transplante para evitar el rechazo de tejido, pero datos clínicos que correlacionan el tratamiento de CsA con la función cardíaca en pacientes con transplante no son concluyentes (Haverich eí al., 1994). Sin embargo, se ha reportado en un estudio de pacientes con transplante cardíaco que CsA incrementa la función cardíaca y la fracción de expulsión ventricular izquierda y resulta en menos episodios isquémicos (Reid y Yancoub, 1988). c. Gata 4 Muchos factores de transcripción se han implicado en la hipertrofia cardíaca, e incluyen a TEF-1 (Karns eí al., 1995; Kariya eí al., 1994), SRF (Sadoshima e Izumo, 1993a; 1993b), AP-1 (Kovacic-Milivojevic eí al., 1996) y GATA4 (Herzig eí al., 1997; Hasegawa eí al., 1997). A la luz de la cooperatividad entre NF-AT y AP-1 en el control de la expresión de genes en célula T, es probable que un mecanismo similar regule ciertos genes cardíacos en respuesta a hipertrofia.

Se han identificado en especies en vertebrados seis factores de transcripción GATA, cada uno de los cuales contiene un dominio de unión a ADN altamente conservado que consiste de dos dedos de zinc del motivo Cys-X2-Cys-X? Cys-X2-Cys (revisado en Evans 1997). En base en la homología de la secuencia y los patrones de expresión, las proteínas GATA se pueden dividir en dos subfamilias. GATA1/2/3 se expresan en células hematopoyéticas, mientras que GATA4/5/6 se expresan principalmente en el corazón y en el sistema vascular, así como en derivados endodérmicos viscerales. Dada la importancia de GATA1/2/3 en células hematopoyéticas y los papeles bien documentados de las proteínas NF-AT en células T, será de interés determinar si estas dos familias de factores de transcripción pueden interactuar en estas células. La activación cooperativa del promotor del péptido ß-natriurético (BNP), un gen de respuesta hipertrófica, por NF-AT3 y GATA4 requieren la unión de NF-AT a una secuencia objetivo y la región corriente arriba de BNP. Estudios previos han demostrado que los sitios de unión de GATA4 localizados cerca del promotor BNP proximal también se requieran para la activación del gen (Grepin et al, 1994). Por lo tanto, en este gen específico de respuesta hipertrófica, y tal vez en otros, estos factores actúan de manera combinatoria para activar la transcripción. Las proteínas NF-AT regulan ciertos genes de células T al unir una secuencia de ADN compuesta junto con AP-1 (Wolfe eí al., 1997). En el caso del promotor BNP, no hay evidencia para este tipo de unión de ADN conjunto entre GATA4 y NF-AT3, puesto que los sitios de unión para estos factores no están inmediatamente adyacentes, y los sitios para ambos factores se requieren para activación sinergística. Además, en los ensayos de unión de ADN, los inventores no encontraron evidencia para la unión de GATA4 y NF-AT3 para cualquier tipo de sitio. Los estudios previos han demostrado los importantes papeles para Ras, MAP cinasa y las vías de señalización de PKC en la respuesta hipertrófica. Todas estas vías de transducción de señales se asocian con un incremento inotrópico en la concentración intracelular de Ca++. En las células T, se activa la vía de señalización de calcineurina independientemente de, pero integrada con las vías de Ras/MAP cinasa y PKC. La inducción completa de la transcripción de IL-2 requiere la coestimulación vía calcineurina y las vías de Ras, lo que resulta en la activación de NF-AT y AP-1 , respectivamente, y su convergencia en una secuencia objetivo corriente abajo común (revisado en Rao eí al., 1997). Esto tipo de señalización integrada presenta similitudes obvias con respecto a los mecanismos para inducción de hipertrofia cardíaca. Aunque estos resultados demuestran que la vía de señalización de calcineurina-NF-AT3 es suficiente para inducir hipertrofia in vivo, también parece probable que esta vía y la vía de Ras/MAPcinasa pueda ser interdependiente en cardiomiocitos, así como en células inmunes. d. Inhibidores de calcineurina CsA y FK506, que unen los inmunofilinas de ciclofilina y la proteína que une FK506 (FKBP12) respectivamente, forman complejos que unen la subunidad catalítica de calcineurina e inhiben su actividad. Los resultados que se presentan aquí muestran que CsA y FK506 bloquean la capacidad de los cardiomiocitos cultivados de experimentar hipertrofia en respuesta a Angll y PE. Ambos agonistas hipertróficos se ha demostrado que actúan elevando el Ca++ intracelular, lo que resulta en una activación de las vías de señalización de PKC y MAP cinasa (Sadoshima e Izumo, 1993a, 1993b; Kudoh eí al., 1997; Yamazaki eí al., 1997; Zou eí al., 1996). CsA no interfiere con los eventos de señalización temprana en la membrana celular, tales como el recambio de Pl, la movilización de Ca++ o la activación PKC (Emmel, eí al., 1989). Por lo tanto, su capacidad para abrogar las respuestas hipertróficas de Angll y PE sugiere que la activación de calcineurina es una etapa esencial en las vías de transducción de señal de Angll y PE. Por lo tanto, los agentes tales como CsA, FK-506y otras composiciones relacionadas se pueden utilizar para evitar, bloquear, inhibir o abrogar de alguna otra manera la disfunción cardíaca, y en particular la disfunción inducida por hipertrofia cardíaca. Como se utiliza en la presente, el término "función inducida por hipertrofia cardíaca" se utiliza para describir una condición o estado mórbido relacionado con la hipertrofia cardíaca e incluye pero no se limita a hipertrofia cardíaca, hipertrofia cardíaca compuesta, hipertrofia cardíaca dilatada, hipertrofia cardíaca descompensada y fallo cardíaco. La hipertrofia inducida por hipertrofia cardíaca está caracterizada por cualquiera de uno o más síntomas o eventos que incluyen pero que no se limitan a masa ventricular agrandada concéntrica, masa ventricular agrandada excéntrica, progresión hacia miopatía cardíaca dilatada, deposición fibroide extensa, desarreglo de cardiomiocitos; acortamiento de la carrera de liberación y captación de ion calcio (es decir, flujo de Ca2+), gasto ventricular disminuido, arritmias, taquicardia, cambios de la demanda central y fallo cardíaco. e. Genes hipertróficos En respuesta a los estímulos hormonales, genéticos y mecánicos, el miocardio se adapta a cargas de trabajo aumentadas mediante la hipertrofia de las células musculares individuales (Morgan eí al., 1987). Debido a que la célula miocárdica adulta está diferenciada terminalmente y a perdido su capacidad de proliferar, el crecimiento cardíaco durante el proceso hipertrófico resulta principalmente de un incremento en el contenido de proteína por célula miocárdica individual, con poco o nulo cambio en el número de células musculares. Por lo tanto, las características centrales de la respuesta hipertrófica miocárdica son un incremento en el contenido de proteína contráctil, la inducción de isoformas de proteínas contráctiles y la expresión de marcadores embriónicos, los cuales parecen depender en gran medida de la activación de la transcripción del gen cardíaco correspondiente que codifica para estas proteínas. La activación de genes de proteínas contráctiles expresados constitutivamente en el miocardio, tales como el gen de la cadena-2 ligera de miosina cardíaca de rata (MLC-2), resulta en un incremento cuantitativo en los niveles de MLC-2 y una acumulación correspondiente de esta proteína contráctil en células miocárdicas individuales. La hipertrofia de células de miocardio también se ha asociado con cambios cualitativos en la composición de la proteína contráctil, que incluyen la inducción de genes de proteína contráctil que normalmente se expresa en el desarrollo embriónico, por ejemplo, la reactivación de a-actina esquelética (Schwartz eí al., 1986) y la expresión de la cadena pesada de ß-miosina (MHC) en modelos de roedor y de conejo de hipertrofia cardíaca. Además de la inducción de los componentes de proteínas contráctil específicos, la hipertrofia ventricular también está caracterizada por alteraciones en la expresión de los genes de proteína no contráctil. De los genes de proteínas no contráctiles conocidos que son activados durante la hipertrofia ventricular, la reactivación de la expresión del factor natriurético auricular (ANF) puede ser el mejor caracterizado. El ANF es una hormona peptídica vasorreguladora la cual es secretada por los miocitos auriculares y se almacena dentro de los granulos secretores los cuales experimentan exocitosis en respuesta a la tensión del tejido, o a hormonas tales como catecolaminas o endotelina (ET). El péptido natriurético tipo ß (BNP), el cual disminuye la presión sanguínea por vasodilatación y natriuresis, también es activado rápidamente en el corazón en respuesta a las señales hipertróficas (revisado en Komuro y Yazaki, 1993). 3. Métodos para producir ratones transqénicos Como se indica antes, una modalidad particular de la presente invención proporciona animales transgénicos los cuales contienen una NF-AT3 activa. Estos animales muestran todas las características asociadas con la patofisiología de la hipertrofia cardíaca. Los animales transgénicos que expresan transgenes de NF-AT3, líneas de células recombinantes derivadas de tales animales y embriones transgénicos pueden ser útiles en métodos para análisis y para identificar agentes que reprimen la función de NF-AT3 y por lo tanto alivian la hipertrofia cardíaca. En un aspecto general, se produce un animal transgénico por la integración de un transgen dado en el genoma de manera que se permite la expresión del transgen. Los métodos para producir animales transgénicos se describen generalmente por Wagner y Hoppe (Patente U.S. No. 4,873,191 ; la cual se incorpora en la presente como referencia), Brinster eí al., 1985; la cual se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) y en "Manipulating the Mouse Embryo; A Laboratory Manual" 2 edición (eds., Hogan, Beddington, Costantimi y Long, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994; la cual se incorpora en la presente como referencia en su totalidad). Típicamente, se transfiere por microinyección a un huevo fertilizado un gen flanqueado por las secuencias genómicas. Los huevos microinyectados se implantan en una hembra huésped y se analiza la progenie para determinar la expresión del transgen. Se pueden producir animales transgénicos a partir de huevos fertilizados de numerosos animales que incluyen, pero que no se limitan a reptiles, anfibios, aves, mamíferos y peces. Dentro de una modalidad particularmente preferida, se generan ratones transgénicos los cuales expresan una forma mutante de polipéptido NF-AT3 la cual carece de los dominios de fosforilación de NF-AT3 de tipo silvestre. Se pueden preparar clonas de ADN para microinyección por cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, se pueden separar clonas de ADN para microinyección con enzimas apropiadas para remover las secuencias plasmídicas bacterianas, y los fragmentos de ADN se pueden someter a electroforesis en geles de agarosa 1% en amortiguador TBE, utilizando técnicas estándar. Las bandas de ADN se visualizan por tinción con bromuro de etidio y se corta la banda que contenga las secuencias de expresión. La banda cortada después se coloca en bolsas de diálisis que contienen acetato de sodio 0.3M, pH 7.0. El ADN se electroeluye dentro de las bolsas de diálisis, se extrae con una solución 1 :1 de fenol:cloroformo y se precipita por dos volúmenes de etanol. El ADN se vuelve a disolver en 1 ml de amortiguador bajo en sales (NaCI 0.2M, Tris 20 mM, pH 7.4, y EDTA 1 mM) y se purifica en una columna Elutip-D . La columna primero se ceba con 3 ml de amortiguador alto en sales (NaCI 1 M, Tris 20 mM, pH 7.4 y EDTA 1 mM) seguido por lavado con 5 ml de amortiguador bajo en sales. Las soluciones de ADN se hacen pasar a través de la columna tres veces para unir ADN a la matriz de la columna. Después de un lavado con 3 ml de amortiguador bajo en sales, se eluye el ADN con 0.4 ml de amortiguador alto en sales y se precipita por dos volúmenes de etanol. Se miden las concentraciones de ADN por absorción a 260 nm en un espectrofotómetro de radiación UV. Para microinyección, se ajustan las concentraciones de ADN a 3 µg/ml en Tris 5 mM, pH 7.4 y EDTA 0.1 mM.

Otros métodos para purificación de ADN para microinyección se describen en Hogan eí al., Manipulating the Mouse Embryo (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1986), en Palmiter eí al., Nature 300:611 (1982); en The Quiagenologist, Application Protocols, 3 edición, publicado por Qiagen, Inc., Chatsworth, CA.; y en Sambrook eí al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989). En un procedimiento de microinyección ejemplar, se inducen a superovular a ratas hembras de seis semanas de edad con una inyección de 5 Ul (0.1 transgénico, ip) de gonadotropina sérica de yegua embarazada (PMSG; Sigma) seguido por 48 horas después de una inyección de 5 Ul (0.1 transgénico, ip) de gonadotropina coriónica humana (hCG; Sigma). Las hembras se colocan con los machos inmediatamente después de la inyección de hCG. A las 21 horas después de la inyección con hCG, las hembras que se han apareado se sacrifican por asfixia con CO2 o por dislocación cervical y se recuperan los embriones de los oviductos extirpados y se colocan en solución salina amortiguada con fosfato de Dulbecco con albúmina sérica bovina 0.5% (BSA; Sigma). Se remueven las células de cúmulo circundantes con hialuronidasas (1 mg/ml). Los embriones pronucleares después se lavan y se colocan en solución salina balanceada de Earle que contiene BSA 0.5% (EBSS) en un incubador a 37.5°C con una atmósfera humidificada, a CO2 5%, aire 95% hasta el momento de la inyección. Los embriones se pueden implantar en la etapa de dos células.

Se permite que se apareen ratones hembras adultos distribuidos aleatoriamente con machos vasectomizados. Para este propósito se pueden f utilizar ratones C57BL/6 o Swiss u otras cepas comparables. Las hembras receptoras se permiten que se apareen al mismo tiempo que las hembras 5 dominadoras. En el momento de la transferencia de los embriones, las hembras receptoras son anestesiadas con una inyección intraperitoneal de 0.015 ml de avertin 2.5% por gramo de peso corporal. Se exponen los oviductos mediante una incisión dorsal en la línea media única. Después se realiza una incisión a través de la pared del cuerpo directamente sobre el oviducto. Después se lo desgarra la bolsa del ovario con un fórceps de relojero. Los embriones que van a ser transferidos se colocan en DPBS (solución salina amortiguada con fosfato de Dulbecco) y en la punta de una pipeta de transferencia (aproximadamente 10 a 12 embriones). Se inserta la punta de la pipeta dentro del infundíbulo y se transfieren los embriones. Después de la transferencia, la incisión se cierra con dos suturas. Como se indica antes, los animales transgénicos y las líneas celulares derivadas de tales animales pueden encontrar uso en ciertos experimentos de prueba. A este respecto, los animales transgénicos y las líneas de células capaces de expresar NF-AT3 mutante se pueden exponer a sustancias de prueba. Estas sustancias de prueba pueden ser analizadas para determinar su capacidad para disminuir la expresión de NF-AT3 y/o la función o para dañar la expresión. Los compuestos identificados por tales procedimientos serán útiles en el tratamiento de enfermedades cardíacas. 4. Ratones transgénicos y su uso Los animales transgénicos de la presente invención incluyen aquellos los cuales tienen una probabilidad sustancialmente aumentada de desarrollar espontáneamente hipertrofia cardíaca, cuando se comparan con sus compañeros de carnada no transgénicos. Los animales transgénicos de la presente invención se producen con transgenes los cuales comprenden una región codificante que codifica para un producto de gen el cual modula la transcripción de por lo menos un gen que se expresa en cardiomiocitos, en respuesta a una señal hipertrófica. Como se utiliza en la presente, el término "señal hipertrófica" indica cualquier estimulo, mecánico o químico, que resulte en síntomas mensurables de hipertrofia cardíaca. Las señales hipertrófica incluyen, pero no se limitan a tensión mecánica, agonistas ß-adrenérgicos, agonistas receptores ai-adrenérgicos y angiotensina II. Los síntomas de hipertrofia cardíaca se pueden medir por diversos parámetros que incluyen, pero que no se limitan a masa ventricular izquierda/peso corporal, cambios en el tamaño y organización de los cardiomiocitos, cambios en la expresión del gen cardíaco y cambios en a función cardíaca. Las regiones codificantes para uso en la construcción de ratones transgénicos incluyen los genes NF-AT y en particular NF-AT3. También se contempla un ratón transgénico GATA4. Las regiones codificantes puede codificar un polipéptido completo, o un fragmento del mismo, en la medida en que se retenga la función deseada del polipéptido, es decir, el polipéptido puede regular la transcripción de por lo menos un gen que se expresa en cardiomiocitos en respuesta a una señal hipertrófica. Las regiones codificantes para uso de transgenes de la presente invención incluyen además aquellos que contienen mutaciones, que incluyen mutaciones silenciosas, mutaciones que resultan en una proteína más activa, mutaciones que resultan en una proteína activa constitutivamente, y mutaciones que resultan en una proteína con actividad reducida. En la medida en que NF-AT3 media la respuesta hipertrófica de un animal como se identifica en la presente, la siguiente discusión se basa en un ratón transgénico de NF-AT3, sin embargo, se debe entender que las enseñanzas que se proporcionan aquí son igualmente aplicables a otros transgenes que también pueden afectar la hipertrofia cardíaca corriente arriba o corriente abajo del efecto de NF-AT3. En una modalidad de la presente invención, se proporciona un animal transgénico que expresa formas activadas de NF-AT3. Por "gen de NF-AT3 activado", se quiere significar al gen de NF-AT3 que expresa una proteína funcional que es capaz de traslación al núcleo. Una forma preferida del animal es un ratón que contiene una interrupción o sustitución de los sitios de fosforilación que normalmente se remueven por la interacción de calcineurina. Sorprendentemente, los corazones de ratones transgénicos que expresan el gen NF-AT3 activado constitutivamente, muestran similitud remarcable con las respuestas molecular y patofisiológica del fallo cardíaco humano. El ratón transgénico de la presente invención tiene muchos usos diferentes. En primer lugar, al crear un modelo animal el cual se activa constantemente NF-AT3, los presentes inventores han proporcionado un "receptor" vivo en el cual se puede analizar de manera más profunda la función de NF-AT3. Por ejemplo, la provisión de diversas formas de NF-AT3 - mutantes por supresión, mutantes por sustitución, mutantes por inserción, fragmentos y proteínas de tipo silvestre -, marcadas o no marcadas, permitirán numerosos estudios respecto a la hipertrofia cardíaca que antes no eran posibles. En un escenario particular, el ratón transgénico se puede utilizar para dilucidar las interacciones de NF-AT3 con factores nucleares adicionales tales como GATA4. Así, de manera clara, la presente invención también abarca el aislamiento de factores nucleares que actúan vía una interacción con NF-AT3. Otro uso para los ratones transgénicos de la presente invención es en la identificación in vivo de un modulador de actividad de NF-AT3, y finalmente de hipertrofia cardíaca. La presencia de NF-AT3 activa constitutivamente en un ratón transgénico representa una función hipertrófica cardíaca mediada 100% por NF-AT3. El tratamiento de un ratón transgénico con un supuesto inhibidor de NF-AT3, y la comparación de la respuesta hipertrófica de este ratón tratado con una animal transgénico no tratado, proporciona un medio para evaluar la actividad del inhibidor candidato. Otro uso del ratón transgénico NF-AT3 descrito en la presente proporciona un modelo de enfermedad nuevo para hipertrofia cardíaca. Como se demuestra en los datos de los ejemplos, el ratón transgénico de la presente invención presenta todas las características clínicas de hipertrofia cardíaca. Por lo tanto, el ratón transgénico NF-AT3 proporciona un modelo novedoso para el estudio de las enfermedades cardíacas. Este modelo puede ser aprovechado al tratar al animal con compuestos que inhiban potencialmente la hipertrofia cardíaca y que traten la enfermedad cardíaca.

. Tratamiento de las enfermedades cardíacas Aunque ha habido informes de que la vía mediada por Ca++ está involucrada en ciertas enfermedades cardíacas, la presente invención proporciona la primera evidencia de NF-AT3 como el mediador central de la respuesta hipertrófica. Esencialmente, se ha encontrado que la proteína calcineurina, dependiente de Ca++ activa a NF-AT3 citoplasmática por desfosforilación. NF-AT3 desforforilada es trasladada al núcleo en donde interactúa con GATA4 y activa los genes involucrados en la respuesta hipertrófica (por ejemplo actina esquelética, ß-MHC, ANF, BNP). Por lo tanto, en una modalidad particular de la presente invención, se proporcionan métodos para el tratamiento de hipertrofia cardíaca. Estos métodos aprovechan la observación de los inventores descrita con detalle después, de que NF-AT3 parece activar la expresión de genes involucrados en la respuesta hipertrófica. En su manera más básica, esta modalidad funcionará al reducir la actividad in vivo de NF-AT3 en individuos sospechosos o que han experimentado una respuesta hipertrófica, actualmente experimentando una respuesta hipertrófica o en daño de hipertrofia cardíaca. Esto se puede llevar a cabo mediante uno de varios mecanismos diferentes. En primer lugar, uno puede bloquear la expresión de la proteína NF-AT3. En segundo lugar, uno puede bloquear directamente la función de la proteína NF-AT3 al proporcionar un agente que se una o que inactive la proteína NF-AT3. Una tercera manera, puede uno bloquear indirectamente el efecto de NF-AT3 al interferir con uno o más objetivos de NF-AT3, tales como GATA4 o un gen afectado por la interacción de GATA4 y NF-AT3, tal como actina a esquelética, ß-MHC, ANF, BNP. Las composiciones terapéuticas de la presente invención se pueden administrar de una manera similar a la administración de los tratamientos actuales para condiciones cardíacas, tales aspirina, nitratos y bloqueadores beta. Por lo tanto, las formulaciones terapéuticas pueden ser para administración oral en forma de una tableta que puede ser ingerida (tal como la aspirina) o que se puede disolver debajo de la lengua (por ejemplo como con los nitratos). Estos medicamentos también se pueden proporcionar como un parche para ser utilizados sobre la piel, o como una crema tópica para ser aplicada a la piel. a. Bloqueo de la expresión de nf-at3 El método para directo para bloquear la expresión de NF-AT3 es vía tecnología antisentido. Se pretende que el término "antisentido" haga referencia a moléculas polinucleotídicas complementarias a una porción del ARN para NF-AT3, o el ADN correspondiente al mismo. Los polinucleótidos "complementarios" son aquellos los cuales son capaces de pareamiento de bases de acuerdo con las reglas de complementariedad estándar de Watson-Crick. Esto es, las purinas más grandes parearán bases con las pirimidinas más pequeñas para formar combinaciones de guanina pareada con citosina (G:C) y adenina pareada con timina (A:T) en el caso de ADN, o adenina pareada con uracilo (A:U) en el caso de ARN. Las inclusión de bases menos comunes tales como inosina, 5-metilcitosina, 6-metiladenina, hipoxantina y otras en las secuencia hibridizantes no interfiere con el pareamiento. El ADN de cadena doble objetivo (ds) con polinucleótidos lleva a la formación de triples hélices; el ARN objetivo producirá la formación de una doble hélice. Los polinucleótidos antisentido, cuando se introducen en una célula objetivo, se unen específicamente a su polinucleótido objetivo e interfieren con la transcripción, procesamiento de ARN, transporte, traslación y/o estabilidad. Las construcciones de ARN antisentido, o ADN que codifica para tales ARN antisentido, se pueden utilizar para inhibir la transcripción o traducción de genes o ambas cosas dentro de una célula huésped, ya sea in vitro o in vivo, por ejemplo dentro de un animal huésped, que incluye a un sujeto humano. Las construcciones antisentido se pueden diseñar para unirse al promotor o a otras regiones de control, exones, intrones o incluso límites de exón-intrón de un gen. Se contempla que las construcciones antisentido más efectivas para la presente invención incluirán regiones complementarias al sitio de inicio de ARNm. Uno puede probar fácilmente tales construcciones simplemente al probar las construcciones in vitro para determinar si se alteran los niveles de la proteína objetivo. De manera similar, también se puede medir la inhibición no especifica dañina de la síntesis de proteína al determinar la viabilidad in vitro de la célula objetivo. Como se utiliza en la presente, los términos "complementario" o "antisentido" significa polinucleótidos que son sustancialmente complementarios a toda su longitud y tienen algunos malos pareamientos de bases. Por ejemplo, las secuencias de 15 bases de longitud se pueden denominar complementarias cuando tienen un nucleótido complementario de 13 ó 14 nucleótidos de los 15. Naturalmente, las secuencias las cuales son "completamente complementarias" serán secuencias las cuales son complementarias por completo a toda su longitud y no tienen malos pareamientos de bases. Se contemplan otras secuencias con grados menores de homología. Por ejemplo, se puede diseñar una construcción antisentido la cual tiene regiones limitadas de homología, pero que también contiene una región no homologa (por ejemplo una ribozima). Estas moléculas, aunque tienen una homología menor de 50%, se pueden unir a las secuencias objetivo bajo condiciones apropiadas. Los polinucleótidos de acuerdo con la presente invención pueden codificar para un gen NF-AT3 o una porción de estos genes que sea suficiente para llevar a cabo la inhibición antisentido de la expresión de proteína. Los polinucleótidos se pueden derivar de ADN genómico, es decir, se pueden clonar directamente del genoma de un organismo particular. En otras modalidades, sin embargo, los polinucleótidos pueden ser ADN complementario (ADNc). El ADNc es ADN que se prepara utilizando ARN mensajero (ARNm) como plantilla. Por lo tanto, un ADNc no contiene ninguna secuencia codificante interrumpida y habitualmente contiene casi exclusivamente regiones codificantes para la proteína correspondiente. En otras modalidades, el polinucleótido antisentido se puede producir de manera sintética. Puede ser ventajoso combinar porciones del ADN genómico con ADNc o secuencias sintéticas para generar construcciones especificas. Por ejemplo, cuando se desea un intrón en la construcción final, necesitará utilizarse una clona genómica. El ADNc o un polinucleótido sintetizado puede proporcionar sitios de restricción más convenientes para la porción restante de la construcción y, por lo tanto, se puede utilizar para el resto de la secuencia. El ADN y la secuencia de proteína para los miembros de la familia de NF-AT humanos se han publicado y se describen en la patente U.S. No. 5,708,158, cuya totalidad de texto se incorpora específicamente en la presente como referencia. Se contempla que las variantes naturales existentes que tengan secuencias diferentes a las descritas aquí. Por lo tanto, la presente invención no se limita al uso de la secuencia polinucleotídica proporcionada para NF-AT3, más bien incluye el uso de cualquier variante que se presente de manera natural. Dependiendo de la secuencia particular de tales variantes, pueden proporcionar ventajas adicionales en términos de selectividad de objetivo, es decir, evitar inhibición antisentido no deseada de transcriptos relacionados. La presente invención también abarca mutantes sintetizados químicamente de estas secuencias.

Como se establece en lo anterior, aunque las secuencias antisentido pueden ser copias genómicas de longitud completa o de ADNc, o fragmentos grandes de las mismas, también pueden ser fragmentos más cortos u "oligonucleótidos" definidos en la presente como polinucleótidos de 50 o menos bases. Aunque los oligómeros más cortos (8-20) son más fáciles de fabricar e incrementan su accesibilidad in vitro, numerosos factores adicionales están involucrados en la determinación de la especificidad de pareamientos de bases. Por ejemplo, tanto la afinidad de unión como la especificidad de secuencia de un oligonucleótido o su objetivo complementario se incrementan con una mayor longitud. Se contempla que se utilizarán oligonucleótidos de 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 pares de bases. Aunque la totalidad o parte de la secuencia del gen se puede utilizar en el contexto de la construcción de antisentido, estadísticamente, cualquier secuencia de 17 pares de bases de largo puede presentarse sólo una vez en el genoma humano y por lo tanto, es suficiente para especificar una secuencia objetivo única. En ciertas modalidades, uno puede desear utilizar construcciones antisentido las cuales incluyan otros elementos, por ejemplos aquellos los cuales incluyen pirimidinas propino C-5. Los oligonucleótidos los cuales contienen análogos de propino C-5 de uridina y citidina se han demostrado que unen ARN con alta afinidad y son potentes inhibidores antisentido de expresión de genes. Como una alternativa al suministro antisentido dirigido, se pueden utilizar ribozimas dirigidas. El término "ribozima" se refiere a una enzima basada en ARN capaz de dirigir y separar secuencias de bases particulares en ADN y ARN. Las ribozimas pueden ser dirigidas directamente a las células, en forma de oligonucleótidos de ARN que incorporan la secuencia de ribozima, o se pueden introducir en la célula como un vector de expresión que codifica para el ARN riobosomal deseado. Las ribosomas se pueden utilizar y aplicar de una manera muy similar a la descrita para el polinucleótido antisentido. Las secuencias de ribozima también se pueden modificar de una manera muy similar a la descrita para polinucleótidos antisentido. Por ejemplo, uno puede incorporar bases diferentes a las de Watson-Crick, o puede elaborar oligonucleótidos mixtos de ARN/ADN, o modificar la estructura principal fosfodiéster, o modificar el 2'-hidroxi en el grupo azúcar ribosa del ARN. Alternativamente, los oligonucleótidos y polinucleótidos antisentido de acuerdo con la presente invención se pueden proporcionar como ARN vía la transcripción a partir de construcciones de expresión que presenten ácidos nucleicos que codifican para los oligonucleótidos y polinucleótidos. A través de esta solicitud, el término "construcción de expresión" quiere significar incluir cualquier tipo de construcción genética que contenga un ácido nucleico que codifica para un producto antisentido en el cual parte o la totalidad de la secuencia de ácido nucleico es capaz de ser transcrita. Los vectores de expresión típicos incluyen plásmidos bacterianos o fagos, tales como cualquiera de la serie de plásmidos pUc o BluescriptMR o, como se discute adicionalmente después, vectores virales adaptados para uso en células eucarióticas.

En modalidades preferidas, el ácido nucleico codifica para un oligonucleótido o polinucleótido antisentido y se coloca en un vehículo de clonación replicable que soporta la expresión de la molécula antisentido con señales transcripcionales y traduccionales de acción cis. Las construcciones de expresión comprenderán el gen en cuestión y varios elementos reguladores, como se describe aquí posteriormente. b. Bloqueo de la función de NF-AT3 En otra modalidad, puede ser deseable bloquear la función de un polipéptido NF-AT3 en vez de inhibir su expresión. Esto se puede llevar a cabo mediante el uso de composiciones organoquímicas que interfieren con la función de NF-AT3, mediante el uso de un anticuerpo que bloque un sitio activo o un sitio de unión de NF-AT3, o mediante el uso de una molécula que imita al objetivo de NF-AT3. Con respecto a los inhibidores organoquímicos, tales compuestos se pueden identificar en ensayos de análisis estándar. Por ejemplo, se sabe que NF-AT3 posee una función de unión a calcineurina. Se pueden poner en contacto varias sustancias candidato con NF-AT3 seguido por determinación adicional de la capacidad de NF-AT3 tratado para unir calcineurina. Alternativamente, dado el conocimiento de que NF-AT3 se activa como resultado de la desfosforilación por calcineurina, y es esta activación al que produce la activación de la respuesta hipertrófica, ahora es posible proporcionar un inhibidor in vivo a un animal apropiado, por ejemplo un ratón, y buscar la hipertrofia cardíaca disminuida. Una vez identificado, tal inhibidor se puede utilizar para inhibir la función NF-AT3 en un contacto terapéutico. Con respecto a los anticuerpos, se debe hacer notar que no todos los anticuerpos se espera que tengan los mismos efectos funcionales en sus objetivos. Esto se fundamenta tanto de las especificidades diferentes de los anticuerpos como de su carácter, es decir, su isotipo. Por lo tanto, será útil generar una gran cantidad de preparaciones diferentes monoclonales y policlonales contra osteocalcinas. También se demostrará que es útil generar anticuerpos antiidiotípicos para los anticuerpos contra osteocalcina. Estos compuestos se pueden utilizar como sondas para los supuestos asociados de unión de NF-AT3, tales como GATA4 y otros factores transcripcionales nucleares. Los métodos por medio de los cuales se generan los anticuerpos son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica, y están detalladas en otra parte en la especificación. Nuevamente, se pueden analizar los anticuerpos que se unen a NF-AT3 para otros atributos funcionales, por ejemplo bloqueo de unión de calcineurina en ensayos in vitro antes de su implementación in vivo. Un anticuerpo particularmente útil para bloquear la acción de NF-AT3 es un anticuerpo de cadena única. Los métodos para la producción anticuerpos de cadena única son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Se refiere a los expertos en técnica a la patente U.S. No. 5,359,046 (incorporada en la presente como referencia) para tales métodos. Un anticuerpo de cadena único, preferido para la presente invención, se genera al fusionar juntos los dominios variables de las cadenas pesada y ligera utilizando un enlazador peptidico corto, por lo que se reconstituye un sitio de unión antigénico en una sola molécula. Los fragmentos variables de anticuerpo de cadena sencilla (Fv) en los cuales la parte C terminal de un dominio variable es retenido en la parte N terminal de otro por medio de un péptido de 15 a 25 aminoácidos o enlazador, se ha desarrollado sin alterar significativamente la unión o especificidad de antígeno de la unión (Bedzyk eí al., 1990; Chaudhary eí al., 1990). Esto Fv carecen de regiones constantes (Fe) presentes en las cadena pesada y ligera del anticuerpo nativo. Con respecto a los inhibidores que imitan a los objetivos NF-AT3, el uso de miméticos proporcionan un ejemplo de moléculas diseñadas de manera adaptada. Tales moléculas pueden ser inhibidores moleculares pequeños que inhiben específicamente la actividad de la proteína NF-AT3 o que se unen a GATA4. Tales moléculas pueden ser estéricamente similares a los compuestos objetivo actuales, por lo menos en las porciones clave de la estructura objetivo y en la organoquímica en la estructura. Alternativamente, estos inhibidores pueden ser compuesto peptidilo que se denominan miméticos peptídicos. Los miméticos peptídicos son moléculas que contienen péptidos los cuales imitan a los elementos de una estructura secundaria proteínica. Véase, por ejemplo, Johnson eí al., (1993). El razonamiento subyacente detrás del uso de los miméticos peptídicos es que la estructura principal peptídica de las proteínas existe principalmente para orientar las cadenas laterales de aminoácidos de manera tal que se faciliten las interacciones moleculares, tal como las del ligando y el receptor. Un mimético peptidico ejemplar de la presente invención se uniría, cuando se administra a un sujeto, a NF-AT3 de una manera análoga a GATA4. Las aplicaciones exitosas del concepto de miméticos peptídicos hasta ahora se ha enfocado en la imitación de los giros ß dentro de las proteínas las cuales se saben son altamente antigénicos. De igual manera, las estructuras con giros ß dentro del antígeno de la invención se pueden predecir por algoritmos basados en computadora como se discute antes. Una vez que los aminoácidos constitutivos del giro se determinan, se puede construir un mimético para obtener una orientación espacial similar de los elementos esenciales de las cadenas laterales de aminoácidos como se discute en Johnson eí al., (1993). c. Bloqueo del NF-AT3 objetivo Como se discute en lo anterior, uno de los beneficios de la presente invención es la identificación de objetivos mediante los cuales actúa NF-AT3. Estos objetivos pueden ser asociados de unión tales como calcineurina y GATA4 u otros genes que son activados por interacción de NF-AT3 activada con GATA4, tal como actina a esquelética, ß-MHC, ANF, BNP. Con el fin de evitar que NF-AT3 interactúe con estos objetivos, uno puede asumir alguna de las muchas soluciones. Por ejemplo, uno puede generar anticuerpos contra el objetivo y después proporcionar los anticuerpos al sujeto en cuestión, por lo que se bloque el acceso de NF-AT3 a la molécula objetivo. En otra modalidad, se pueden utilizar metodologías antisentido con el fin de inhibir la interacción de NF-AT3 con su objetivo, al considerar al asociado de unión de NF-AT3 como la molécula de ADN. Alternativamente, uno puede diseñar un polipéptido o un mimético peptidico que sea capaz de interactuar con el NF-AT3 objetivo de la misma manera que NF-AT3, pero sin ningún efecto similar a NF-AT3 en el objetivo. En una modalidad preferida, la presente invención proporcionará un agente que se une competitivamente a GATA4. En una modalidad más preferida, el agente tendrá una afinidad incluso mayor que por GATA4 que la de NF-AT3. La afinidad por GATA4 se puede determinar in vitro al realizar estudios cinéticos respecto a las velocidades de unión. Se pueden desarrollar otros compuestos en base al modelado en computadora y se pueden predecir una estructura de orden superior, tanto en la molécula de NF-AT3 como para las moléculas objetivo identificadas. Este enfoque ha demostrado ser exitoso en el desarrollo de inhibidores para numerosas interacciones de receptor-ligando. 6. Construcciones genéticas y transferencia de genes En aspectos particulares de la presente invención, puede ser deseable colocar una variedad de genes cardíacos en construcciones expresión y monitorear su expresión. Por ejemplo, un gen de hipertrofia cardíaca tal como BNP, MHC y similar se puede probar al introducir en cardiomiocitos cultivados una construcción de expresión que comprende un promotor unido operablemente a un gen o genes sensibles a hipertrofia y monitorear la expresión del gen o genes sensibles a hipertrofia. También se pueden utilizar construcciones de expresión para generar animales transgénicos que incluyen un promotor para la expresión de la construcción en una célula animal y una regio que codifica para un producto de gen el cual modula la transcripción de por lo menos un gen que se expresa en cardiomiocitos en respuesta a una señal hipertrófica. En otras modalidades, la construcción de expresión codifica para un oligonucleótido o polinucleótido antisentido y se coloca en un vehículo de clonación replicable que sostiene la expresión de la molécula antisentido para propósitos terapéuticos discutidos antes. a. Construcciones genéticas A través de esta solicitud, el término "construcción de expresión" quiere significar incluir cualquier tipo de construcción genética que contenga un ácido nucleico que codifique para los productos de gen en el cual parte o la totalidad de la secuencia codificante del ácido nucleico es capaz de ser transcrita. El transcrito puede ser traducido en una proteína, pero no necesariamente necesita ser así. En ciertas modalidades, la expresión incluye tanto la transcripción de un gen como la traducción de ARNm en un producto de gen. En otras modalidades, la expresión únicamente incluye la transcripción de los genes que codifican para el ácido nucleico de interés.

/. Elementos reguladores específicos de cardiomiocitos Los elementos reguladores transcripcionales los cuales son adecuados para uso en la presente invención incluyen aquellos los cuales dirigen la transcripción de una región codificante a la cual se unen de manera operable y preferencial en cardiomiocitos. Por "preferencial" se quiere significar que la expresión del transgen en cardiomiocitos es de por lo menos aproximadamente 10 veces, de manera más preferible por lo menos aproximadamente 10 veces a aproximadamente 50 veces, e incluso de manera más preferible de por lo menos 50 veces a 100 veces, y de manera mucho más preferible más de 100 veces mayor que en los no cardiomiocitos.

Preferiblemente, la expresión del transgen está por debajo de los límites detectables en células diferentes a los cardiomiocitos, como se indica por los ensayos del gen indicador bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Se han descrito en la literatura muchos TRE específicos para cardiomiocito y se pueden utilizar en la presente invención. Por ejemplo, estos incluyen pero no se limitan a los TRE derivados de la cadena-2 ligera de miosina, la cadena pesada de miosina a, AE3, troponina C cardíaca y a-actina cardíaca (Frans et al., 1997; Robbins et al., 1995; Linn et al., 1995; Parmacek eí al., 1994; Hunter eí al., 1993; Sartorelli et al., 1992). En una modalidad preferida, el TRE comprende un región promotora de la región flanqueante 5' de un gen a-MHC. Se proporciona una secuencia flanqueante 5' de 5443 bases para el gen a-MHC de ratón en GenBank bajo el número de acceso U71441. Aunque se puede utilizar la totalidad de la secuencia de 5.4 kD en los transgenes de la presente invención, también se pueden utilizar porciones del mismo las cuales dirigen la transcripción de una región codificante unida operablemente de manera preferencial en los cardiomiocitos. La clona 26 de vector de expresión de a-MHC se puede utilizar para insertar una región codificante deseada tal como la región codificante la cual se unirá operablemente al promotor a-MHC como se describe por Jones eí al., (1994). En otra modalidad, el TRE comprende un región promotora de la región flanqueante 5' del gen peptidico natriurético de cerebro (BNP; Thuerauf y Glembotski, 1997; LaPointe eí al., 1996, cada una incorpora específicamente en la presente como referencia en su totalidad).

//'. Promotores generales El ácido nucleico que codifica para un producto de gen está bajo el control transcripcional del promotor. Un "promotor" se refiere a una secuencia de ADN reconocida por la maquinaria de síntesis de la célula, o que introduce la maquinaria de síntesis necesaria para iniciar la transcripción especifica de un gen. La frase "bajo control transcripcional" significa que el promotor está en la posición y orientación correctas en relación al ácido nucleico para controlar el inicio y por ARN polimerasa y la expresión del gen. El término promotor se utilizará aquí para referirse a un grupo de módulos de control transcripcionales que se agrupan alrededor del sitio de iniciación para ARN polimerasa II. Muchos de los conceptos acerca de cómo se organizan los promotores se deriva del análisis de varios promotores virales, que incluyen los de HSV timidina cinasa (í/ ) y las unidades de transcripción tempranas de SV40. Estos estudios, aumentados por el trabajo más reciente, han demostrado que los promotores están compuestos de módulos funcionales separados, cada uno consiste de aproximadamente 7-20 pb de ADN que contiene uno o más sitios de reconocimiento para las proteínas transcripcionales activadoras o represoras. Por lo menos un modulo en cada promotor funciona para colocar en cada promotor funciona para colocar el sitio de inicio para la síntesis de ARN. El ejemplo mejor conocido de esto es la caja TATA, pero en algunos promotores que carecen de la caja TATA, tal como el promotor para el gen para desoxinucleotidil transferasa terminal de mamífero para los genes tardíos de SV40, el elemento separado que se superpone al sitio de inicio mismo ayuda a fijar el lugar de inicio. Los elementos promotores adicionales regulan la frecuencia del inicio transcripcional. Típicamente, estos se localizan en la región de 30-110 pb hacia el extremo 5' del sitio de inicio, aunque el número de promotores se ha demostrado recientemente que contiene elementos funcionales hacia el extremo 3' del sitio de inicio también. La separación entre los elementos promotores con frecuencia es flexible, de manera que se conserva la función del promotor cuando los elementos se invierten o se mueven uno en relación al otro. En el promotor tk se puede incrementar la separación entre los elementos promotores a 50 pb separados antes de que la actividad comience a declinar. Dependiendo del promotor, parece que los elementos individuales pueden funcionar ya sea cooperativamente o de manera independientemente para activar la transcripción. El promotor particular utilizado para controlar la expresión de la secuencia de ácido nucleico de interés no se considera como importante, en la medida en que sea capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico en la célula objetivo. Por lo tanto, cuando el objetivo es una célula humana, es preferible colocar la región codificante de ácido nucleico adyacente y bajo el control de un promotor que es capaz de ser expresado en una célula humana. Hablando de manera general, tal promotor puede incluir ya sea un promotor humano o viral. En varias modalidades, el promotor del gen temprano inmediato de citomegalovirus humano (CMV), el promotor temprano SV40, la secuencia repetida terminal larga del virus de sarcoma de Rous, ß-actina, promotor de insulina de rata y gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa se pueden utilizar para obtener un nivel de expresión alto de la secuencia codificante de interés. El uso de otros promotores virales o de células de mamífero o fagos bacterianos los cuales son bien conocidos en la técnica para obtener la expresión de la secuencia codificante de interés también se contempla, con la condición de que los niveles de expresión sean suficientes para un propósito dado. Al utilizar un promotor con propiedades bien conocidas, se puede optimizar el patrón de expresión de la proteína de interés posterior a la transfección o transformación. La selección de un promotor que es regulado en respuesta a señales fisiológicas o sintéticas especificas puede permitir una expresión inducible del producto del gen. Por ejemplo, en el caso en el que la expresión de un transgen o transgenes cuando se utiliza un vector multicistrónica, resulta tóxico para las células en la cuales se produce el vector, puede ser deseable impedir o reducir la expresión de uno o más de los transgenes. Los ejemplos de transgenes que pueden ser tóxicos para la línea de células productoras son los genes proapoptóticos y de citosina. Estas disponibles para producción de vectores virales varios sistemas promotores inducibles en donde el producto de transgen puede ser tóxico. El sistema de ecdisona (Invitrogen, Carlsbad, CA) es uno de tales sistemas. Este sistema se diseña para permitir la expresión regulada del gen de interés en célula de mamífero. Consiste de un mecanismo de represión estrechamente regulado que permite que virtualmente no existe expresión a nivel basal del transgen, pero más de 200 veces de capacidad de inducción. El sistema se basa en el receptor de ecdisona heterodimérico de Drosophila, y cuando ecdisona o un análogo tal como muristerona A se unen al receptor, el receptor activa un promotor para activar la expresión de altos niveles de transgen hacia el extremo 3' a los transcritos de ARNm se obtienen. En este sistema, ambos monómeros del receptor heterodimérico se expresan constitutivamente desde un vector, mientras que el promotor que responde a ecdisona, el cual activa la expresión del gen de interés en otro plásmido. El procesamiento por ingenierías genética de este tipo de sistema en el vector de transferencia de gen de interés por lo tanto puede ser útil. La cotransfección de plásmidos que contienen el gen de interés y los monómeros receptores en la línea celular producida después puede permitir la producción del vector de transferencia del gen sin la expresión de un transgen potencialmente tóxico. En el momento apropiado, la expresión del transgen se puede activar con ecdisona o muristerón A. Otros sistemas de promotor inducibles incluyen sistemas que responden a hormonas, sistemas inducibles por interferón, sistemas inducibles por metales y sistemas inducibles por calor (WO 93/20218). Un sistema inducible particular que puede ser útil es el sistema Tet-OffMR o Tet-OnMR (Clontech, Palo Alto, CA), desarrollado originalmente por Gossen y Bujard (Gossen y Bujard, 1992; Gossen eí al., 1995 WO 94/29442; WO 96/40892 y WO 96/01313, cada uno incorporan en la presente como referencia). Este sistema también permite niveles elevados de expresión de genes los cuales son regulados en respuesta a tetraciclina o derivados de tetraciclina tales como doxiciclina. En el sistema Tet-OnMR, se activa la expresión del gen en presencia de doxiciclina, mientras que el sistema Tet-OffMR, se inactiva la expresión del gen en ausencia de doxiciclina. Estos sistemas se basan en dos elementos reguladores derivados del operón de resistencia a tetraciclina de E. coli. La secuencia de operadora de tetraciclina al cual se une el represor de tetraciclina y la proteína represora de tetraciclina. El gen de interés se clona en un plásmido detrás de un promotor que tiene presentes en el mismo elementos que responden a tetraciclina. Un segundo plásmido contiene un elemento regulador denominado transactivador controlado por tetraciclina, el cual está compuesto, en el sistema Tet-OffMR del dominio VP16 del virus de herpes simplex y el represor de tetraciclina de tipo silvestre. Por lo tanto, en ausencia de doxiciclina, se activa de manera constitutiva la transcripción. En el sistema Tet-OnMR, el represor de tetraciclina no es de tipo silvestre y, en presencia de doxiciclina, activa la transcripción. Para la producción del vector de transferencia del gen, el sistema Tet-Off1^ preferiblemente sería en donde las células productoras pueden crecer en presencia de tetraciclina o doxiciclina y evitar la expresión de un transgen potencialmente tóxico, pero cuando el vector se introduce al paciente, la expresión del gen se activa constitutivamente. En algunas circunstancias, puede ser deseable regular la expresión de un transgen en un vector de transferencia del gen. Por ejemplo, se pueden utilizar diferentes promotores virales con fuerzas variables de actividad, dependiendo del nivel de expresión que se desee. En células de mamífero, con frecuencia se utiliza el plásmido temprano inmediato de CMV para promover una fuerte activación transcripcional. También se han utilizado versiones modificadas del plásmido CMV que son menos potentes, cuando se desean niveles reducidos de expresión del transgen. Cuando se desea la expresión del transgen en células hematopoyéticas, con frecuencia se utilizan promotores retrovirales tales como los LTR de MLV o MMTV. Otros promotores virales que pueden ser utilizados dependiendo de los efectos que se deseen incluyen SV40, RSV, LTR, HIV-1 y HIV-2 LTR, promotores de adenovirus tales como los E1A, E2A o la región MLP, AAV LTR, virus de mosaico de coliflor, HSV-TK y virus de sarcoma aviar. De manera similar, se pueden utilizar promotores específicos de tejido para llevar a cabo la transcripción en tejidos o células especificas de manera que se reduzca la toxicidad potencial o los efectos deseables de los tejidos a los que no se dirige. Por ejemplo, los promotores tales como PSA, probasina, fosfatasa acida prostática o calicreína glandular especifica de próstata (hK2) se pueden utilizar para dirigir la expresión del gen en la próstata. De manera similar, se pueden utilizar los siguientes promotores para dirigir la expresión del gen en otros tejidos. Tales TRE específicos del tipo de célula, incluyen pero no se limitan a los derivados del receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (especifico para endotelio), albúmina (especifica para hígado), factor Vil (hígado), ácido graso sintasa (hígado), factor de von Willebrand (endotelio de cerebro), alfa actina y cadena pesada de miosina (ambas en músculo liso), sintetasa I (intestino delgado), transportador de Na-K-Cl (riñon), antígeno especifico de próstata (próstata) y el gen de calicreína-1 glandular (próstata). Otra clase adicional de los TRE son aquellos los cuales activan la transcripción de un polinucleótido unido operablemente en respuesta a condiciones epóxicas. Estos incluyen los reguladores por TRE, por lo menos parcialmente, por el factor 1 inducible por hipoxia (Bunn y Poyton, 1996; Dachs y Stafford, 1996; Guillemin y Krasnow, 1997; Firth eí al., 1994; Jiang eí al., 1997). Se tiene consideración que cualquiera de los promotores anteriores, sólo o en combinación con otro, puede ser útil de acuerdo con la presente invención, dependiendo de la acción que se desee. Además, la lista de promotores no se debe considerar como exhaustiva o limitante, aquellos expertos en la técnica conocerán otros promotores que pueden ser utilizados juntos con los promotores y métodos descritos en la presente.

///'. Alargadores Los alargadores son elementos genéticos que incrementan la transcripción de un promotor localizado en una posición distante en la misma molécula de ADN. Los alargadores se organizan de una manera muy similar a los promotores. Esto, están compuestos de muchos elementos individuales, cada uno de los cuales se une a una o más proteínas transcripcionales. La distinción básica entre los alargadores y promotores es operacional. Una región alargadora en su totalidad debe ser capaz de estimular la transcripción a distancia; esto no necesita ser cierto para una región promotora o sus elementos componentes. Por otra parte, un promotor debe tener uno o más elementos que dirijan el inicio de la síntesis de ARN en un sitio particular y en una orientación particular, mientras que los alargadores carecen de estas especificidades. Los promotores y alargadores con frecuencia se superponen y son contiguos, con frecuencia parecen tener un organización modular muy similar. En las modalidades preferidas de la invención, la constricción de expresión comprende un virus o una construcción sometida a ingeniería genética derivada de un genoma viral. La capacidad de ciertos virus a entrar en las células vía endocitosis mediada por receptor e integrarse en el genoma de la célula huésped y expresar genes virales estable y eficientemente los ha vuelto candidatos atractivos para la transferencia de genes extraños a células de mamíferos (Ridgeway, 1988; Nicolás y Rubenstein, 1988; Baichwal y Sugden, 1986; Temin, 1986). Los primeros virus utilizados como vectores de genes fueron los ADN virus que incluyen papovavirus (virus de simio 40, virus de papiloma y polioma) (Ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986) y adenovirus (Ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986). Estos tienen una capacidad relativamente baja para secuencias de ADN extraño y tienen un espectro de huéspedes restringido. Además, su potencial oncogénico sus efectos citopáticos en células permisivas generan preocupaciones respecto a su inocuidad. Se pueden acomodar únicamente hasta 8 kB de material genético extraño, pero se puede introducir fácilmente en diversas líneas celulares y animales de laboratorio. (Nicolás y Rubenstein, 1988; Temin, 1986). iv. Señales de poliadenilación Cuando se utiliza una inserción de ADNc, uno típicamente deseará incluir una señal de poliadenilación para llevar a cabo la poliadenilación adecuada del transcripto del gen. La naturaleza de la señal de poliadenilación no se considera crucial para la práctica exitosa de la invención, y se puede utilizar cualquier de tales secuencias tales como las señales de poliadenilación de hormona del crecimiento humano bovina y de SV40. También se contempla como un elemento del cásete de expresión como un terminador. Estos elementos pueden servir para alargar los niveles de mensaje y minimizar la lectura a través del cásete dentro de otras secuencias. b. Transferencia de gen Existen muchas maneras en las cuales se pueden introducir vectores de expresión en las células. En ciertas modalidades de la invención, la construcción de expresión comprende un virus o una construcción sometida a ingeniería genética derivada de un genoma viral. En otras modalidades, se contempla el suministro no viral. La capacidad de ciertos virus de entrar a la célula vía endocitosis mediada por receptor, para integrarse en el genoma de la célula huésped y expresar genes virales estable y eficientemente los ha vuelto candidatos atractivos para la transferencia de genes extraños a células de mamíferos (Ridgeway, 1988; Nicolás y Rubenstein, 1988; Baichwal y Sugden, 1986; Temin, 1986). Los mecanismos de suministro se discuten de manera más detallada aquí en lo siguiente.

/'. Transferencia no viral La presente sección proporciona una discusión de los métodos y composiciones de una transferencia no viral de genes. Las construcciones de ADN de la presente invención generalmente se suministran a una célula, y en ciertas situaciones, el ácido nucleico o la proteína que se van a transferir se pueden transferir utilizando métodos no virales. Por la presente invención se contemplan varios métodos no virales para la transferencia de construcciones de expresión dentro de células de mamífero cultivadas. Estos incluyen precipitación por fosfato de calcio (Graham y Van Der Eb, 1973; Chen y Okayama, 1987; Rippe eí al., 1990) DEAE-dextrano (Gopal, 1985), electroporación (Tur-Kaspa et al., 1986; Potter eí al., 1984), microinyección directa (Harland y Weintraub, 1985), liposomas cargados con ADN (Nicolau y Sene, 1982; Fraley eí al., 1979), sonicación celular (Fechheimer eí al., 1987), bombardeo de genes utilizando microproyectiles de alta velocidad (Yang eí al., 1990) y transfeccion mediada por receptor (Wu y Wu, 1987; Wu y Wu, 1988). Una vez que se ha suministrado la construcción dentro de la célula, el ácido nucleico que codifica para el gen particular de interés se puede colocar y expresar en sitios diferentes. En ciertas modalidades, el ácido nucleico que codifica para el gen puede estar integrado establemente en el genoma de la célula. Esta integración puede ser en una posición y orientación semejante vía recombinación homologa (sustitución de genes) o se puede integrar en una posición aleatoria no especifica (aumento de genes). En modalidades adicionales, el ácido nucleico se puede mantener establemente en la célula como un segmento episómico separado de ADN. Tales segmentos de ácido nucleico o "episomas" codifican para secuencias lo suficiente para permitir el mantenimiento y replicación independiente o en sincronización con el ciclo de la célula huésped. La manera en que se suministra la construcción de expresión a una célula y el lugar en que permanece el ácido nucleico en la célula dependen del tipo de construcción de expresión que se utilice. En otra modalidad particular de la invención, la construcción de expresión puede estar atrapada en un liposoma. Los liposomas son estructuras vesiculares caracterizadas por una membrana de bicapa fosfolipídica y un medio acuoso interior. Los liposomas multilamerales tiene capas lipídicas múltiples separadas por un medio acuoso. Se forman espontáneamente cuando se suspenden fosfolípidos en un exceso de solución acuosa. Los componentes lipidíeos experimentan autorrearreglo antes de la formación de las estructuras cerradas y atrapan agua y solutos disueltos entre las bicapas lipídicas (Ghosh y Bachhawat, 1991 ). La adición de ADN a liposomas catiónicos provoca una transición topológica desde los liposomas a glóbulos condensados cristalinos líquidos ópticamente birrefringentes (Radler eí al., 1997). Estos complejos de ADN-lípido son vectores no virales potenciales para uso en el suministro de genes. El suministro de ácido nucleico mediado por liposomas y la expresión de ADN extraño in vitro ha sido muy exitoso. Utilizando el gen de ß-lactamasa, Wong eí al., (1980) demostraron lo factible del suministro mediado por liposoma y la expresión de ADN extraño en células de embrión de pollo cultivadas, células HeLa y de hepatoma. Nicolau eí al., (1987) llevaron a cabo una transferencia de genes mediada por liposoma exitosa en ratas después de inyección intravenosa. También se incluyen diversos enfoques comerciales que fjf involucran la tecnología de "lipofección". En ciertas modalidades de la invención, el liposoma puede formar 5 complejos con un virus hemaglutinante (HVJ). Esto ha demostrado que facilita la fusión con la membrana celular y promueve la entrada en la célula del ADN encapsulado por liposomas (Kaneda eí al., 1989). En otras modalidades, el liposoma puede formar complejos o se puede utilizar junto con proteínas cromosómicas nucleares diferentes de histona (HMG-1 ) (Kato eí al., 1991 ). 10 En modalidades adicionales, el liposoma puede estar formando complejos o se puede utilizar junto tanto con HVJ como con HGM-1. Tales construcciones de expresión se han utilizado con éxito en la transferencia y expresión de ácido nucleico in vitro e in vivo, y son aplicables para la presente invención. Otros sistemas de suministro de vector los cuales pueden ser 15 utilizado para suministrar un ácido nucleico que codifica para un gen particular en células son los vehículos de suministro mediados por receptor. Estos aprovechan la captación selectiva de macromoléculas por endocitosis mediada por receptor en casi todas las células eucarióticas. Debido a la distribución especifica a tipo de célula de los diversos receptores, el suministro puede ser 2 o altamente especifico (Wu y Wu, 1993). Los vehículos dirigidos de genes mediados por receptor generalmente consisten de dos componentes: un ligando especifico para la célula receptora y un agente que une ADN. Se han utilizando diversos ligandos para la transferencia de genes mediada por receptor. Los ligandos caracterizados de manera más extensa son asialoorosomucoide (ASOR) (Wu y Wu, 1987) y transferrina (Wagner eí al., 1990). Recientemente también se ha utilizado una neoglicoproteína sintética, la cual reconoce el mismo receptor que ASOR, como vehículo como suministro de genes (Ferkol eí al., 1993; Perales eí al., 1994) y también se ha utilizado el factor de crecimiento epidérmico (EGF) para suministrar genes a células de carcinoma escamoso (Myers, EPO 0273085). En otras modalidades, el vehículo de suministro puede comprender un ligando y un liposoma. Por ejemplo, Nicolau eí al., (1987) utiliza lactosil-ceramida, un asialogangliósido galactosa terminal, incorporado en los liposomas y se observa un incremento en la captación del gen de insulina por hepatocitos. En otra modalidad de la invención, la construcción de expresión simplemente puede consistir de ADN recombinante desnudo o de plásmidos. La transferencia de la construcción se puede llevar a cabo por cualquiera de los métodos mencionados antes los cuales permeabilizan física o químicamente la membrana celular. Esto es aplicable particularmente para la transferencia in vitro, sin embargo, también se puede aplicar para uso in vivo. Dubenski eí al., (1984) inyectaron con éxito ADN de poliomavirus en forma de precipitado de CaPO en hígado y bazo de ratones adultos y recién nacidos, demostrando replicación viral activa e infección aguda. Benvenisty y Neshif (1986) también demuestran que la inyección intraperitoneal directa de plásmidos precipitados con CaPO resulta en la expresión de los genes transfectados. Se considera que el ADN que codifica para NF-AT3 también se puede transferir de una manera similar in vivo y puede expresar NF-AT3. Otra modalidad de la invención para transferir construcción de expresión de ADN desnudo en las células puede involucrar el bombardeo de partículas. Este método depende de la capacidad de acelerar microproyectiles recubiertos con ADN a alta velocidad y permitir que perforen las membranas celulares y entren en las células sin destruirlas (Klein eí al., 1987). Se han desarrollado varios dispositivos para acelerar partículas pequeñas. Uno de tales dispositivos se basa en una descarga de alto voltaje para generar una corriente eléctrica lo cual a su vez proporciona un fuerza motriz (Yang eí al., 1990). Los microproyectiles utilizados han consistido de sustancias biológicamente inertes tales como tungsteno o esferas de oro. En ciertas modalidades, la transferencia de genes se puede llevar a cabo más fácilmente bajo condiciones ex vivo. La aplicación de genes ex vivo se refiere al aislamiento de células del animal, el suministro del ácido nucleico al interior de las células in vitro y después el retorno de las células modificadas nuevamente al animal. Esto puede involucrar la remoción quirúrgica de tejido/órganos del animal o el cultivo primario de células y tejidos.

/'/'. Transferencia viral Adenovirus Uno de los métodos preferidos para el suministro in vivo involucra el uso de un vector de expresión de adenovirus. El término "vector de expresión de adenovirus" quiere significar cualquier construcción que contenga secuencias de adenovirus suficientes para: (a) sostener el empacado de la construcción, y (b) expresar un polinucleótido antisentido, una proteína, un polinucleótido (por ejemplo ribozima o un ARNm) que haya sido clonado en el mismo. En este contexto, la expresión no requiere que se sintetice el producto del gen. El vector de expresión comprende una forma de adenovirus sometida ingeniería genética. El conocimiento de la organización genética del adenovirus, un ADN virus de cadena doble, lineal, de 36 kb, permite la sustitución de piezas grandes del ADN adenoviral con secuencias extrañas de hasta 7 kb (Grunhaus y Horwitz, 1992). En contraste con los retrovirus, la infección adenoviral de células huésped no resulta en integración cromosómica debido a que el ADN adenoviral se puede replicar de manera episómica sin genotoxicidad potencial. Como se utiliza en la presente, el término "genotoxicidad" se refiere a una alteración genética de la célula huésped heredable y permanente. Además, los adenovirus son estructuralmente estables, y no se ha detectado un rearreglo de genoma después de amplificación extensa de derivados normales. Los adenovirus pueden infectar virtualmente todas las células epiteliales sin importar su etapa en el ciclo celular. Hasta ahora, la infección adenoviral parece estar relacionada únicamente con enfermedades moderadas tales como enfermedad respiratoria aguda y en humanos no ¡nmunosuprimidos.

El adenovirus es particularmente adecuado para uso como un vector de transferencia de genes debido a su genoma de tamaño medio, su facilidad de manipulación, su título elevado, la amplia gama de células objetivo y la elevada infectividad. Ambos extremos del genoma viral contienen 5 secuencias repetidas invertidas de 100-200 pares de bases (ITR), las cuales son elementos cis necesarios para la replicación y empacado del ADN viral. Las regiones tempranas (E) y tardías (L) del genoma contienen unidades de transcripción diferentes que se dividen por el inicio de replicación del ADN viral. La región E1 (E1A y E1 B) codifica para proteínas responsables de la regulación 0 de la transcripción del genoma viral y algunos genes celulares. La expresión de la expresión E2 (E2A y E2B) resulta en la síntesis de proteínas para la replicación del ADN viral. Estas proteínas están involucradas en la replicación de ADN, la expresión tardía de genes y la inactivación de células huésped (Renán, 1990). Los productos de los genes tardíos incluyen la mayor parte de 5 las proteínas de la cápside viral y se expresan sólo después de procesamiento significativo de un transcripto primario único presentado por el promotor tardío principal (MLP). El MLP, (localizado a las 16.8 m.u.) es particularmente eficiente durante la fase tardía de infección, y la totalidad del ARNm suministrado desde el promotor posee una secuencia líder 5' tripartita (TPL) la cual lo vuelve el o ARNm preferido para traducción. La región E3 codifica para proteínas que parecen ser necesarias para la lisis eficiente de células infectadas con Ad así como la prevención de citólisis mediada por TNF y lisis mediada por CTL de células infectadas. En general, se considera que la región E4 codifica para siete proteínas, algunas de las cuales activan al promotor E2. Se ha demostrado que el bloqueo del transporte de ARNm del huésped y un mejoramiento del transporte del ARN viral al citoplasma. Además, el producto E4 en parte es responsable de la disminución de la expresión del gen temprana observada posteriormente en la infección. E4 también inhibe la expresión de E1A y E4 (pero no de E1 B) durante el crecimiento lítico. Algunas proteínas E4 son necesarias para replicación eficiente del ADN, sin embargo se desconoce el mecanismo de esta relación. E4 también está involucrado en los eventos postranscripcionales en la expresión del gen tardío viral; es decir, la separación alternativa del líder tripartita en el crecimiento lítico. No obstante, las funciones E4 no se requieren de manera absoluta para la replicación de ADN, pero su carencia retarda la replicación. Otras funciones incluyen la regulación negativa de la síntesis de ADN viral, la inducción de reorganización subnuclear normalmente observada durante la infección por adenovirus, y otras funciones que son necesarias para replicación viral, la acumulación de ARNm viral tardío y la inactivación transcripcional de la célula huésped. En un sistema actual, el adenovirus recombinante se genera a partir de recombinación homologa entre el vector lanzadera y el vector de provirus. La recombinación posible entre el vector proviral y las secuencias Ad en células 293, o en el caso del plásmido pJM17 la supresión espontánea de las secuencias pBR322 insertadas, puede generar un adenovirus Ad5 de tipo silvestre de longitud completa. Por lo tanto, es crítico aislar una sola clona de virus a partir de una placa individual y examinar su estructura genómica. La generación y propagación de los vectores de adenovirus actuales, los cuales son deficientes en su replicación, depende de una línea de células auxiliares única, denominada 293, la cual se transforma a partir de células de riñon embriónica humana por fragmentos de ADN Ad5 y expresan constitutivamente proteínas E1 (Graham et al., 1977). Puesto que región E3 es dispensable para el genoma del adenovirus (Jones y Shenk, 1978), los actuales vectores de adenovirus, con la ayuda de las células 293, transportan ADN extraño en las regiones E1 , E3 o en ambas (Graham y Prevea, 1991 ). En la naturaleza, el adenovirus puede empacar aproximadamente 105% del genoma de tipo silvestre (Ghosh-Choudhury eí al., 1987), lo que proporciona capacidad de aproximadamente 2 kb adicionales de ADN. Combinado con aproximadamente 5.5 kb de ADN que es sustituible en las regiones E1 y E3, la capacidad máxima del vector de adenovirus actual es inferior a 7.5 kb, o aproximadamente 15% de la longitud total del vector. Más del 80% del genoma viral del adenovirus permanece en la estructura principal del vector y es la fuente de la citotoxicidad presentada por el vector. Además, la deficiencia de replicación del virus suprimido en E1 es incompleta. Por ejemplo, se ha observado una fuga de expresión de gen viral con los vectores disponibles actualmente a elevadas multiplicidades de infección (MOI) (Mulligan, 1993; Shenk, 1978). Las líneas de células auxiliares se pueden derivar de células humanas tales como células renales embriónicas humanas, células de músculo, células hematopoyéticas u otras células embriónicas humanas de mesenquimal o epiteliales. Alternativamente, las células auxiliares se pueden ?fí derivar de las células de otras especies de mamífero que son permisivos para adenovirus humano. Tales células incluyen, por ejemplo, las células Vero u 5 otras células embriónicas de modo de mesenquimal o epiteliales. Como se establece antes, la línea de células auxiliares preferidas es 293. Recientemente, Racher eí al., (1995) describe métodos mejorados para cultivar células 293 y propagar adenovirus. En un formato, se hacen crecer agregados de células naturales al inocular células individuales en matraces de agitación siliconizados de 1 litro (Techne, Cambridge, Reino Unido) que contienen 100-200 ml de medio. Después de agitar a 40 rpm, se estima la viabilidad de células con azul de tripán. En otro formato, se utilizan microportadores de Fibra-Cel (Bibby Sterlin, Stone, Reino Unido) (5 g/l) como sigue. Se agrega un inoculo de células, resuspendidas en 5 ml de medio, a 50 ml de portador en un matraz Erlenmeyer de 250 ml y se deja estacionario, con agitación ocasional, durante 1 a 4 h. El medio después se sustituye con 50 ml de medio fresco y se inicia la agitación. Para producción del virus, se permite que las células crezcan a aproximadamente 80% de confluencia, tiempo después del cual se sustituye el medio (a 25% del volumen final) y se agrega 2 o adenovirus a una MOI de 0.05. Los cultivos se dejan estacionarios durante la noche, después de lo cual se incrementa el volumen a 100% y se comienza la agitación durante otras 72 horas. Además del requerimiento de que el vector de adenovirus debe ser defectuoso en cuanto a su replicación, o por lo menos defectuoso condicionalmente, no se considera que a naturaleza del vector de adenovirus sea crucial para la practica exitosa de la invención. El adenovirus puede ser de cualquiera de 42 serotipos diferentes conocidos o subgrupos A-F. El adenovirus 5 tipo 5 o subgrupo C es el material inicial preferido con el fin de obtener un vector de adenovirus defectuoso en su replicación condicional para uso en la presente invención. Esto es debido a que el adenovirus tipo 5 es un adenovirus humano del cual se conoce mucha información respecto a sus aspectos bioquímico, médico y genético, y se ha utilizado históricamente para la mayor 0 parte de las construcciones que utilizan adenovirus como un vector. Como se ha establecido antes, el vector típico de acuerdo con la presente invención es defectuoso en cuanto a su replicación y no tendrá la región E1 de adenovirus. Por lo tanto, será más conveniente introducir el polinucleótido que codifica para el gen de interés en la posición desde la cual se 5 ha removido la secuencia codificante de E1. Sin embargo, la posición de la inserción del construcción dentro de la secuencia de adenovirus no es crítica para la invención. El polinucleótido que codifica para el gen de interés también se puede insertar en vista de región E3 suprimida en los vectores de sustitución E3, como se describe por Karlsson eí al., (1986), o en región E4, en donde una o línea de células auxiliares o virus auxiliares complementan el defecto de E4. El adenovirus es fácil de hacer crecer y manipular, y muestra una amplia gama de huéspedes in vitro e in vivo. Este grupos de virus se pueden obtener con títulos elevados, por ejemplo 109-1011 unidades formadoras de placa por ml, y son altamente infectivos. El ciclo de vida del adenovirus no requiere la integración en el genoma de la célula huésped. Los genes extraños suministrados por vectores adenovirales son episómicos y, por lo tanto, tienen poca genotoxicidad para las células huésped. No se han reportado efectos colaterales en estudios de vacunación con adenovirus tipo silvestre (Couch eí al., 1963; Top eí al., 1971 ), lo que demuestra su inocuidad y potencial terapéutico como vectores de transferencia de genes in vivo. Se han utilizados vectores de adenovirus en investigaciones de expresión de genes eucarióticos (Levrero eí al., 1991 ; Gomez-Foix eí al., 1992) y desarrollo de vacunas (Grunhaus y Horwitz, 1992; Graham y Prevec, 1992). Recientemente, los estudios en animales sugieren que el adenovirus recombinante se puede utilizar para transferencia de genes (Strattford-Perricaudet y Perricaudet 1991 ; Strattford-Perricaudet eí al., 1990; Rich eí al., 1993). Los estudios que administran adenovirus recombinante a diferentes tejidos incluyen instilación en la traquea (Rosenfeld eí al., 1991 ; Rosenfeld eí al., 1992), inyección en músculo (Ragot eí al., 1993), inyecciones intravenosas periféricas (Herz y Gerard, 1993), inoculación intranasal (Ginsberg et al., 1991), administración en aerosol al pulmón (Bellon, 1996), administración intraperitoneal (Song eí al., 1997), inyección intrapleural (Elshami eí al., 1996) como una administración para la vejiga utilizando la administración intravesicular (Werthman eí al., 1996), inyección subcutánea que incluye la inyección intraperitoneal, intrepleural, intramuscular o subcutánea) (Ogawa, 1989), inyección ventricular en el miocardio (de corazón, French eí al., 1994), perfusión hepáticas (arteria hepática o vena porta, Shiraishi eí al., 1997) e inoculación estereotáctica dentro del cerebro (Le Gal La Salle et al., 1993).

Retrovirus Los retrovirus son grupos de ARN virus de cadena sencilla caracterizados por una capacidad de convertir su ARN en ADN de cadena doble en células infectadas en un proceso de transcripción inversa (Coffin, 1990). El ADN resultante después se integra de manera estable en los cromosomas celulares como un provirus y dirige la síntesis de proteínas virales. La integración resulta en la retención de las secuencias del gen viral en la célula receptora y sus descendientes. El genoma retroviral contiene 3 genes gag, pol y env que codifican para las proteínas de la cápside, la enzima polimerasa y los componentes de la envoltura, respectivamente. Una secuencia que se encuentra en la dirección 5' del gen gag contiene una señal para empacado del genoma en viriones. Están presentes dos secuencias repetidas terminales largas (LTR) en los extremos 5' y 3' del genoma viral. Estas contienen la secuencia promotora fuerte y alargadora, también se requieren para la integración en el genoma de la célula huésped (Coffin, 1990). Con el fin de construir un vector retroviral, se inserta un ácido nucleico que codifica para un gen de interés dentro del genoma viral en lugar de ciertas secuencias virales para producir un virus que es defectuoso en su replicación. Con el fin de producir viriones, se construye una línea de células empacadas que contienen los genes gag, pol y env, pero sin los componentes LTR y de empacado (Mann eí al., 1983). Cuando un plásmido recombinante que contiene un ADNc junto con las secuencias retrovirales de LTR y empacado se produce dentro de esta línea celular (por precipitación con fosfato de calcio por ejemplo), la secuencia empacada permite que se empaque dentro de las partículas virales el transcrito de ARN del plásmido recombinante, el cual después se secreta en el medio de cultivo (Nicolás y Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann eí al., 1983). El medio que contiene los retrovirus recombinantes después se recolectan, opcionalmente se concentra y se utiliza para transferencia de genes. Los vectores retrovirales son capaces de infectar una amplia variedad de tipos de células. Sin embargo, la integración y expresión estable requiere la división de células huésped (Paskind et al., 1975). Un enfoque novedoso diseñado para permitir el direccionamiento especifico de vectores retrovirales recientemente se ha desarrollado en base en la modificación química de un retrovirus por la adición química de residuos lactosa a la envoltura viral. Esta modificación puede permitir la infección especifica de hepatocitos vía receptores de sialoglicoproteína. Se ha diseñado un enfoque diferente para dirigir el retrovirus recombinante en el cual se utilizan anticuerpos biotinados contra una proteína de envoltura retroviral y contra un receptor de célula especifico. Los anticuerpos se acoplan vía los componentes de biotina mediante la utilización de estreptavidina (Roux eí al., 1989). Utilizando anticuerpos contra los antígenos del complejo principal de histocompatibilidad clase I y clase II, demostraron que la infección de diversas células humanas que presentan estos antígenos de superficie con un virus ecotrópico in vitro (Roux eí al., 1989). Existen ciertas limitaciones al uso de vectores retrovirales en todos los aspectos de la presente invención. Por ejemplo, los vectores de retrovirus habitualmente se integran en sitios aleatorios en el genoma de la célula. Esto puede llevar a mutagénesis insercional mediante la interrupción de genes huéspedes o a través de la inserción de secuencias reguladoras virales que pueden interferir con la función de los genes flanqueantes (Varmus eí al., 1981 ). Otra preocupación con el uso de vectores retrovirales defectuosos es la potencial aparición de un virus competente en cuanto a su replicación, de tipo silvestre, en las células empacadas. Esto puede resulta de la combinación de eventos en los cuales se inserta en la dirección 5' una secuencia intacta del virus recombinante, de la secuencia gag, pol, env integrada en el genoma de la célula huésped. Sin embargo, las nuevas líneas de células empacadas están disponibles ahora y pueden disminuir en gran medida la probabilidad de recombinación (Markowitz eí al., 1988; Hersdorffer eí al., 1990).

Herpes virus Debido a que el virus de herpes simplex (HSV) es neurotrópico, a generado interés considerable para el tratamiento de trastornos del sistema nervioso. Además, la capacidad de HSV para establecer infecciones latentes en células neuronales que no se dividen sin integrarse en el cromosoma de la célula huésped o alterar de alguna otra manera el metabolismo de la célula huésped, junto con la existencia de un promotor que es activo durante la latencia, vuelve a HSV un vector atractivo. Además, aunque se a enfocado mucha atención respecto a las aplicaciones neurotrópicas de HSV, este vector también puede ser aprovechado para otros tejidos dada su amplia gama de huéspedes. Otro factor que vuelve a HSV un vector atractivo es el tamaño y organización del genoma. Debido a que HSV es grande, la incorporación de genes múltiples o casetes de expresión es menos problemático que en los otros sistemas virales más pequeños. Además, la disponibilidad de secuencias de control viral diferentes con funcionamiento variable (temporal, en base a la fuerza, etc.), hace posible controlar la expresión en mayor medida, que en otros sistemas. También es una ventaja que el virus tenga mensajes relativamente poco divididos, lo que facilita adicionalmente las manipulaciones genéticas. HSV también es relativamente fácil de manipular y puede crecer con títulos elevados. Por lo tanto, el suministro es menos que un problema, tanto en términos de volúmenes necesarios para obtener MOI suficiente como una necesidad disminuida para repetir dosificaciones. Para una revisión de HSV como un vector de transferencia de genes, véase Glorioso eí al., (1995). HSV, designado con subtipos 1 y 2, son virus con envoltura que se encuentran entre los agentes infecciosos más comunes encontrados en los humanos, infectando a millones de seres humanos en todo el mundo. El genoma de ADN de cadena doble, complejo y grande, codifica para docenas de diferentes productos genéticos, algunos de los cuales se derivan de transcriptos divididos. Además del virión y los componentes estructurales de envoltura, el virus codifica para numerosas proteínas adicionales que incluyen una proteasa, un ribonucleótido reductasa, un ADN polimerasa, una proteína de unión de ssADN, una helicasa/primasa, una ATPasa dependiente de ADN y una dUTPasa y otras. Los genes HSV forman varios grupos cuya expresión es regulada coordinadamente y ordenada de manera secuencial de manera en cascada (Honess y Roizman, 1974; Honess y Roizman, 1975; Roizman y Sears, 1995). Se mejora la expresión de los genes a, el primer conjunto de genes que se van a expresar después de la infección por la proteína de virión número 16, o el factor transductor a (Post eí ai, 1981 ; Batterson y Roizman, 1983). La expresión de los genes ß requiere los productos del gen a funcional, de manera más notable ICP4, el cual es codificado por el gen a4 (DeLuca eí ai, 1985). Los genes ?, un grupo heterogéneo de genes codifican principalmente para proteínas estructurales de virión, y requieren el inicio de la síntesis de ADN viral para expresión óptima (Holland eí ai, 1980). En concordancia con la complejidad del genoma, el ciclo de vida de HSV está muy involucrado. Además del ciclo lítico, lo que resulta en la síntesis de partículas de virus, y finalmente, la muerte celular, el virus tiene la capacidad de entrar en un estado latente en el cual se mantiene el genoma en los ganglios neurales hasta que alguna de las señales hasta ahora no definida activa la recurrencia del ciclo lítico. Se han desarrollado variantes avirulentas de HSV y están disponibles fácilmente para uso en contextos de transferencia de genes (patente U.S. 5,672,344).

Virus adenoasociados Recientemente han surgido los virus adenoasociados (AAV) como una alternativa potencial a los vectores retrovirales y adenovirales utilizados más comúnmente. Aunque los estudios con la transferencia de genes mediada retroviral y adenoviral genera preocupaciones respecto a las propiedades oncogénicas potenciales de los primeros y los problemas inmunogénicos asociados con los últimos, los AAV no han sido asociados con ninguna de tales indicaciones patológicas. Además, AAV poseen varias características únicas que los vuelven más deseables que otros vectores. A diferencia de los retrovirus, AAV puede infectar a células que no estén en división; se ha caracterizado a AAV de tipo silvestre por integración, de una manera específica del sitio, en el cromosoma 19 de células humanas (Kotin y Berns, 1989; Kotin eí ai, 1990; Kotin eí ai, 1991 ; Samulski eí ai, 1991); y AAV también posee propiedades antioncogénicas (Ostrove eí ai, 1981 ; Berns y Giraud, 1996). Se construyen genomas de AAV recombinantes al clonar molecularmente secuencias de ADN de interés entre los ITR de AAV, eliminado la totalidad de las secuencias codificantes del genoma de AAV de tipo silvestre. Los vectores de AAV producidos de esta manera carecen de cualquier secuencia codificante de AAV de tipo silvestre, pero retienen la propiedad de integración cromosómica estable y expresión de los genes recombinantes ante la transducción tanto in vitro como in vivo (Berns, 1990; Berns y Bohensky, 1987; Bertrán eí ai, 1996; Kearns eí ai, 1996; Ponnazhagan eí ai, 1997a). Antes se consideraba que AAV infectaba casi todos los tipos de células, e incluso cruzaba barreras entre especies. Sin embargo, ahora se ha determinado que la infección por AAV es mediada por receptor (Ponnazhagan et al., 1996; Mizukami et al., 1996). AAV utiliza un ADN de cadena doble, lineal, de aproximadamente 4700 pares de bases. Secuencias repetidas terminales invertidas flanquean el genoma. Están presentes dos genes dentro del genoma, lo que da lugar a numerosos productos genéticos distintos. El primero, el gen cap, produce tres proteína diferentes de virión (VP), denominadas VP-1 , VP-2 y VP-3. El segundo, el gen rep, codifica para cuatro proteínas no estructurales (NS). Uno o más de estos productos del gen rep es responsable de transactivar la transcripción de AAV. La secuencia de AAV se proporciona por Srivastava eí ai, (1983) y en la patente U.S. 5,252,479 (cuyo texto completo se incorpora específicamente en la presente como referencia). Los tres promotores AAV se designan por su posición, en unidades de mapa, en el genoma. De izquierda a derecha estas son, p5, p19 y p40. La transcripción día lugar a seis transcriptos, dos iniciados en cada uno de los tres promotores, en donde uno de cada par está dividido. El sitio dividido, derivado de las unidades de mapa 42-46, es el mismo para cada transcripto. Las cuatro proteínas no estructurales aparentemente se derivan de la parte más larga de los transcriptos, y tres proteínas de virión se producen del transcripto más pequeño. AAV no se asocia con ningún estado patológico en humanos. De manera interesante, para una replicación eficiente, AAV requiere de funciones "auxiliares" de virus tales como el virus de herpes simplex I y II, citomegalovirus, virus de seudorrabia y, por supuesto, adenovirus. El mejor caracterizado de los auxiliares es adenovirus, y muchas funciones "tempranas" de este virus han demostrado que ayudan en la replicación de AAV. Se considera que el bajo nivel de expresión de las proteínas rep de AAV mantiene verificada la expresión estructural de AAV y se considera que la infección por virus auxiliares remueve este bloqueo.

Virus de vaccinia Los vectores de virus de vaccinia se han utilizado extensamente debido a la facilidad de su construcción, niveles de expresión relativamente altos obtenidos, amplio intervalo de huéspedes y gran capacidad para transportar ADN. Vaccinia contiene un genoma de ADN de cadena doble, lineal, de aproximadamente 186 kb que muestra una marcada preferencia por "A-T". Secuencias repetidas terminales invertidas de aproximadamente 10.5 kb flanquean al genoma. La mayor parte de los genes esenciales parecen mapear dentro de la región central, la cual es la más altamente conservada entre los poxvirus. Los marcos de lectura abierta estimados en el virus de vaccinia constituyen de 150 a 200. Aunque ambas cadenas son codificantes, no es común una superposición extensa de marcos de lectura. Dentro del genoma de virus de vaccinia se pueden insertar por lo menos 25 kb (Smith y Moss, 1983). Los vectores de vaccinia prototípicos contienen transgenes insertados en el gen de timidina cinasa viral vía recombinación homologa. Los vectores se seleccionan en base en un fenotipo tk. Mediante la inclusión de una secuencia líder no traducida de virus de encefalomiocarditis, el nivel de expresión es mayor que el de los vectores convencionales, con los transgenes acumulándose a 10% o más de la proteína de las células infectadas en 24 h (Elroy-Stein eí ai, 1989). c. Métodos de selección Los cultivos celulares primarios de mamíferos se puede preparar de diversa maneras. Con el fin de que las células se mantengan viables mientras están in vitro y en contacto con la construcción de expresión, es necesario asegurar que las células mantengan el contacto con la relación correcta de oxígeno y bióxido de carbono y los nutrientes, pero que estén protegidas de contaminación microbiana. Las técnicas de cultivo celular están bien documentadas y se describen aquí como referencia (Freshner, 1992). Una modalidad de lo anterior involucra el uso de transferencia de genes para inmortalizar células para la producción de proteínas. El gen para la proteína de intereses se puede transferir como se describe antes en células huésped apropiadas seguido por cultivo de células bajo condiciones apropiadas. De esta manera se puede utilizar el gen para virtualmente cualquier polipéptido. La generación de vectores de expresión recombinantes y los elementos incluidos en los mismos se discutieron antes. Alternativamente, la proteína que se va a producir puede ser una proteína endógena sintetizada normalmente por la célula en cuestión.

Los ejemplos de líneas de células huésped de mamíferos útiles son las células Vero y HeLa y las líneas de células de ovario de hámster chino, y las células W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, NIH3T3, RIN y MDCK. Además, se puede elegir una cepa de células huésped que module la expresión de las secuencias insertadas o que modifique y procese el producto de genes de la manera deseada. Tales modificaciones (por ejemplo glicosilación) y procesamiento (por ejemplo separación) de los productos proteínicos puede ser importante para el funcionamiento de la proteína. Diferentes células huésped tienen características y mecanismos específicos para el procesamiento y modificación postraduccional de las proteínas. Las líneas de células apropiadas o los sistemas de huésped se pueden elegir para asegurar la modificación y procesamiento correctos de la proteína extraña que se exprese. Así, posterior a la inducción de la construcción de expresión en las células, se puede determinar por medios convencionales la expresión del gen indicador. Un ensayo el cual detecte un producto del gen indicador, ya sea detectando directamente la proteína codificada por el gen indicador o mediante la detección de un producto enzimático de una enzima codificada por el gen indicador, es adecuado para uso en la presente invención. Los ensayos incluyen ensayos colorimétrico, fluorométrico o luminiscente, o incluso, en el caso de etiquetas proteínicas, radioinmunoensayos u otros ensayos inmunológicos. Se puede monitorear la eficiencia de transfección mediante cotransfección de una construcción de expresión que comprende un promotor constitutivamente activo unido operablemente a un gen indicador.

Se pueden utilizar numerosos sistemas de selección que incluyen, pero que no se limitan a timidina cinasa de HSV, hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa y genes de adenina fosforibosiltransferasa, en células tk-, hgprt- o aprt-, respectivamente. Además, se puede utilizar la resistencia contra metabolitos como la base de la selección para dhfr, que confiere resistencia a; gpt, que confiere resistencia a ácido micofenólico; neo, que confiere resistencia a aminoglicósido G418; e hygro, que confiere resistencia a higromicina. Las células animales se puede propagar en dos modos, in vitro: como células dependientes sin anclaje que crecen en suspensión a través del volumen de cultivo, o como células dependientes de anclaje que requieren la unión a un sustrato sólido para su propagación (es decir, un tipo de crecimiento celular en monocapas). 7. Monitoreo de la expresión transqénica Con el fin de determinar si NF-AT3 activa ha sido incorporada exitosamente en el genoma del animal transgénico, se pueden realizar diversos ensayos diferentes. Los animales transgénicos se pueden identificar al analizar su ADN. Para este propósito, cuando el animal transgénico es un roedor, se pueden extirpar muestras de cola (1 a 2 cm) de los animales de tres semanas de edad. El ADN de estas y otras muestras después se pueden preparar y analizar mediante la prueba de Southern blot, PCR o slot blot para detectar los animales fundadores transgénicos (Fo) y su progenie (Fi y F2). a. Estudios patológicos Los diversos animales FO, F1 y F2 que transportan el transgen se pueden analizar por cualquiera de diversas técnicas que incluyen inmunohistología, microscopía electrónica, electrocardiografía y se pueden realizar determinaciones de los pesos cardíacos totales y regiones midiendo las áreas en sección transversal de los cardiomiocitos y determinar el número de cardiomiocitos. El análisis inmunohistológico para la expresión de un transgen mediante la utilización de un anticuerpo de especificidad apropiada se puede llevar a cabo utilizando métodos conocidos. Los análisis morfométricos para determinar los pesos regionales, las áreas en sección transversal de los cardiomiocitos y las cantidades de núcleos cardiomiocíticos se pueden llevar a cabo utilizando métodos conocidos. Los corazones se pueden analizar para determinar función, histología y expresión de genes cardíacos fetales. El análisis basado en inmunología, puede ser necesario basarse en anticuerpos que se unan a NF-AT3. Se proporciona una revisión general de las técnicas de producción de anticuerpos. Aunque estas técnicas se pueden utilizar en diversos animales, un huésped preferido para la producción de anticuerpos es un ratón carente del gen para NF-AT3 de la presente invención. Como es bien sabido en la técnica, una composición dada puede variar en su inmunogenicidad. Con frecuencia, por lo tanto es necesario reforzar el sistema inmune del huésped y esto se puede obtener al acoplar un péptido o polipéptido inmunógeno a un portador. Los portadores ejemplares y preferidos son inmunocianina de lapa de ojo de cerradura (KLH) y albúmina sérica bovina (BSA). También se pueden utilizar como portadores otras albúminas tales como ovalbúmina, albúmina sérica de ratón o albúmina sérica de conejo. Los medios para conjugar un polipéptido a una proteína portadora son bien conocidos en la técnica e incluyen glutaraldehído, m-maleimidobencoil-N-hidroxisuccinimida éster, carbodiimida y bencidina bis-biazotizada. Se puede mejorar la inmunogenicidad de una composición inmunógena particular mediante el uso de simuladores no específicos de la respuesta inmune, conocidos como adyuvantes. Los adyuvantes ejemplares y preferidos incluyen adyuvante completo de Freund (un estimulador no específico de la respuesta inmune que contiene Mycobacterium tuberculosis inactivado), adyuvantes incompletos de Freund y adyuvante de hidróxido de aluminio. La cantidad de composición de inmunógeno utilizada en la producción de anticuerpos policlonales varía en base a la naturaleza del inmunógeno así como el animal utilizado para inmunización. Se pueden utilizar diversas rutas para administrar el inmunógeno (subcutánea, intramuscular, intradérmica, intravenosa e intraperitoneal). Se puede monitorear la producción de anticuerpos policlonales mediante muestreo de sangre del animal inmunizado en diversos puntos después de la inmunización. También se puede proporcionar una segunda inyección de refuerzo. El proceso de refuerzo y titulación se repite hasta que se obtiene un título adecuado. Cuando se obtiene el nivel deseado de inmunogenicidad, el animal inmunizado puede ser sangrado y se puede aislar y almacenar el suero, y/o el animal se puede utilizar para generar anticuerpos monoclonales (mAb). Se prepara un anticuerpo policlonal al inmunizar un animal con un inmunógeno que comprende un polipéptido NF-AT3, o un fragmento del mismo, y recolectar antisuero de este animal inmunizado. Se puede utilizar una amplia gama de especies animales para la producción de antisueros. Típicamente, un animal utilizado para la producción de antisueros es un conejo, un ratón, una rata, un hámster o un cobayo. Debido al volumen relativamente grande de sangre de los conejos, se puede preferir en la elección a un conejo para la producción de anticuerpos policlonales. Para obtener anticuerpos monoclonales, uno también puede inmunizar un animal de experimentación, preferiblemente un ratón agónico con una composición de NF-AT3. Posteriormente, después de un período de tiempo suficiente para permitir la generación de anticuerpo, se puede obtener una población de células del bazo o de linfa del animal. Las células del bazo o de linfa después se pueden fusionar con líneas celulares tales como cepas de mieloma humano o de ratón para producir hibridomas que secretan anticuerpos. Estos hibridomas se pueden aislar para obtener clonas individuales las cuales pueden ser analizadas para determinar la producción de anticuerpo para el péptido objetivo deseado. Se propone que los anticuerpos monoclonales de la presente invención también encontrarán aplicación útil en procedimientos inmunoquímicos estándar, tales como ELISA y métodos de la prueba Western blot., así como en otros procedimientos los cuales pueden utilizar anticuerpos específicos para los epitopos NF-AT3. Adicionalmente, se propone que se puedan utilizar anticuerpos monoclonales específicos para NF-AT3 en otras aplicaciones útiles. Por ejemplo, un anticuerpo anti-idiotipo para un anticuerpo contra NF-AT3 puede imitar bien el sitio de unión de NF-AT3, con lo que se 5 proporciona una herramienta para la identificación de los NF-AT3 objetivos. b. Análisis de la expresión transqénica midiendo los niveles de ARNm Se puede aislar ARN mensajero por cualquier método conocido 0 en la técnica que incluye, pero que no se limita a extracción con ácido tiocianato guanidinio-fenol:cloroformo (Chomczynski y Sacchi 1987), de células y tejidos de animales transgénicos para determinar los niveles de expresión mediante Northern blot, ARNasa y ensayos de protección de nucleasa. c. Análisis de la expresión transqénica al medir los niveles de proteína Se pueden medir los niveles de proteína por cualquier medio conocido en la técnica que incluye, pero que no se limita a análisis Western blot, ELISA y radioinmunoensayo, utilizando uno o más anticuerpos específicos o para la proteína codificada por el transgen. Para el análisis Western blot, se pueden aislar fracciones de proteína de los homogeneizados de tejido y los lisados celulares, y se someten a análisis Western blot como se describe, por ejemplo por Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, NY, 1988); Brown et al., (1983); y Tate-Ostroff eí al. (1989). Por ejemplo, las fracciones de proteína se pueden desnaturalizar en amortiguador de muestra de Laemmli y se pueden someter a electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. Después las proteínas se transfieren a filtros de nitrocelulosa por electrotransferencia. Se bloquean los filtros, se incuban con anticuerpos primarios y finalmente se hacen reaccionar con anticuerpos secundarios conjugados a enzima. La incubación subsecuente con el sustrato cromogénico apropiado muestra la posición de las proteínas codificadas por el transgen. Se utiliza de manera preferible ELISA junto con la invención. Por ejemplo, se puede llevar a cabo un ensayo de ELISA en donde se inmoviliza NF-AT3 de una muestra en una superficie seleccionada, preferiblemente una superficie que muestra afinidad por la proteína tal como los pozos de una placa de microtitulación de poliestireno. La placa se lava para remover el material absorbido incompletamente y la placa se recubre con una proteína no específica que es conocida como antigénicamente neutra con respecto al anticuerpo de prueba, tal como albúmina sérica bovina (BSA), caseína o soluciones de leche en polvo. Esto permite el bloqueo de los sitios de adsorción no específicos sobre la superficie inmovilizante y por lo tanto reduce el ruido de fondo provocado por la unión no específica de antisuero sobre la superficie. Después, se agrega el anticuerpo contra NF-AT3 a la placa de una manera que lleva a cabo la formación de un complejo inmune (antígeno/anticuerpo). Tales condiciones preferiblemente incluyen diluir en antisuero/anticuerpo con diluyentes tales como BSA, gamma globulina bovina (BGG) y solución salina amortiguada con fosfato (PBS)/TweenMR. Estos agentes agregados también tienden a ayudar en la reducción del ruido de fondo no específico. Después se permite que la placa se incube de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 h, a temperaturas preferiblemente en el orden de aproximadamente 25°C a aproximadamente 27°C. Después de la incubación, se lava la placa de manera que se remueve el material que no ha formado complejos inmunes. Un procedimiento de lavado preferido incluye un lavado con una solución tal como PBS/TweenMR o amortiguador de borato. Después de la formación de los complejos inmunes específicos entre la muestra y el anticuerpo, y el lavado posterior, se puede determinar la presentación y la cantidad de formación de complejos inmunes al someter la placa a una segunda sonda de anticuerpo, el segundo anticuerpo tiene especificidad por el primero (habitualmente la porción Fe del primero es el objetivo). Para proporcionar un medio de detección, el segundo anticuerpo preferiblemente tendrá una enzima asociada que generará un desarrollo de color cuando se incube con un sustrato cromogénico apropiado. Así, por ejemplo, se deseará poner en contacto e incubar la superficie unida a anticuerpo con un anticuerpo contra IgG humana, conjugada con ureasa o peroxidasa durante un período de tiempo y bajo condiciones las cuales favorecen el desarrollo de la formación de un complejo inmune (por ejemplo, incubación durante 2 h a temperatura ambiente en una solución que contiene PBS tal como PBS/TweenMR). Después de la incubación con el segundo anticuerpo marcado con la enzima, y el lavado subsecuente para remover cualquier material no unido, se cuantifica la cantidad de etiqueta por incubación con un sustrato cromogénico tal como urea y púrpura de bromocresol o ácido 2,2'-azino-di(3-etil-benzotiazolin)-6-sulfónico (ABTS) y H2?2, en caso de peroxidasa como la enzima marcadora. La cuantificación después se obtiene al medir el grado de generación de color, por ejemplo, utilizando un espectrofotómetro de espectro visible. Las variaciones a este ensayo, así como ensayos completamente diferentes (radioinmunoprecipitación, cromatografía de inmunoafinidad, Western blot) también se contemplan como parte de la presente invención. Una variante de ELISA es el ensayo de coagulación unido a enzima o ELCA (patente U.S. 4,668,621), el cual utiliza la cascada de combinación combinado con una enzima marcadora RW-XA como el sistema de detección universal. La ventaja de este sistema para la presente invención es que las reacciones de coagulación se pueden llevar a cabo a pH fisiológico en presencia de una amplia variedad de amortiguadores. Por lo tanto, es posible retener la integridad del análisis complejo. Otros inmunoensayos abarcados por la presente invención incluyen, pero no se limitan a los descritos en la patente US No. 4,367,110 (ensayo de interposición de anticuerpo monoclonal doble) y la patente US No. 4,452,901 (Western blot). Otros ensayos incluyen inmunoprecipitación de los ligandos marcados e inmunocitoquímica, ambos in vitro e in vivo. 8. Análisis para determinar moduladores de la hipertrofia cardíaca La presente invención también contempla el análisis de compuestos para determinar su capacidad para inhibir la hipertrofia cardíaca. La capacidad de los presentes inventores de crear sistemas celulares, de órganos y de organismos los cuales imiten esta enfermedad proporciona un establecimiento ideal en el cual probar los diversos compuestos para determinar actividad terapéutica. Los compuestos particularmente preferidos serán aquéllos útiles para inhibir la hipertrofia cardíaca y evitar o revertir la enfermedad cardíaca. En los ensayos de análisis de la presente invención, la sustancia candidato primero se puede analizar para determinar su actividad bioquímica básica por ejemplo unión a una molécula objetivo y después se prueba para determinar su capacidad para inhibir un fenotipo hipertrófico, a nivel celular, de tejido o de animal completo. a. Inhibidores y formatos de ensayo /'. Formaciones de ensayo La presente invención proporciona métodos para el análisis de inhibidores de hipertrofia cardíaca. Se contempla que estas técnicas de análisis demostrarán ser útiles en la identificación de compuestos que bloquearán la hipertrofia cardíaca y/o reducirán la hipertrofia cardíaca una vez desarrollada. En estas modalidades, la presente invención se dirige a un método para determinar la capacidad de una sustancia candidato para inhibir la hipertrofia, que generalmente incluye las etapas de: (a) proporcionar un cardiomiocito que muestre un fenotipo hipertrófico; (b) poner en contacto la célula con un inhibidor candidato; y (c) monitorear la célula en búsqueda de un efecto antihipertrófico en comparación con una célula similar que no ha sido tratada con el inhibidor candidato. Para identificar una sustancia candidato como capaz de inhibir un fenotipo hipertrófico en el ensayo anterior, se debe medir o determinar diversas características de la célula, por ejemplo, crecimiento, masa ventricular agrandada concéntrica, masa ventricular agrandada excéntrica, progresión hacia miopatía cardíaca dilatada, deposición fibroide extensa, desarreglo del cardiomiocito; liberación y captación de ¡ones calcio (es decir, flujo de Ca2+) acortamiento del ataque, gasto ventricular disminuido, arritmias, taquicardia, cambios en la demanda central, fallo cardíaco, expresión del gen dependiente de Ca++ similar en ausencia de la sustancia candidato agregada. Después uno puede agregar la sustancia candidato a la célula y determinar la respuesta en presencia de la sustancia candidato. Una sustancia candidato la cual disminuye el crecimiento de la expresión hipertrófica de genes en comparación con su ausencia, es indicativo de una sustancia candidato con capacidad inhibidora. En los ensayos de análisis de la presente invención, el compuesto se agrega a las células, durante un período de tiempo y en diversas dosificaciones, y se mide la hipertrofia cardíaca.

En los aspectos particularmente preferidos, las células que expresan una forma mutante de NF-AT que carece de los sitios de fosforilación de NF-AT3 de tipo silvestre, el cual es una forma activada constitutivamente de este factor. En ciertas modalidades, los otros genes involucrados en la vía de NF-AT3 se pueden alterar para obtener el mismo efecto, tal como la forma mutante de GATA4 que es capaz de funcionar sin la asistencia de NF-AT3.

/'/'. Inhibidores y activadores de NF-AT3 Un inhibidor de acuerdo con la presente invención puede ser uno el cual ejerza el efecto inhibidor corriente arriba o corriente abajo de NF-AT3 o sobre NF-AT3 directamente. Sin importar el tipo de inhibidor identificado por los presentes métodos de análisis, el efecto de la inhibición por tales compuestos resulta en la inhibición de la hipertrofia cardíaca, o algún aspecto bioquímico o fisiológico relacionado de la misma, por ejemplo crecimiento, expresión de un gen dependiente de Ca++ y similar, en ausencia de una sustancia candidato agregada. En otras modalidades, uno puede buscar compuestos que en realidad aumenten la vía de calcíneurina-NF-AT3-GATA4. Esto puede no requerir el uso de células mutantes NF-AT3, como se describe antes, sino más bien una célula en la cual por lo menos parte de la vía normal está intacta, pero en donde se instale un elemento de señalización corriente abajo dentro de la célula de manera que un incremento en una señal puede indicar un incremento en la actividad en la vía. Una señal concebible podría ser un gen tal como una proteína fluorescente verde unida a una región de control regulador que se active por NF-AT3/GATA4.

//'/'. Sustancias candidato 5 Como se utiliza en la presente, el término "sustancia candidato" se refiere a cualquier molécula que pueda inhibir potencialmente la hipertrofia cardíaca. La sustancia candidato puede ser una proteína o fragmento de la misma, un inhibidor de molécula pequeña o incluso una molécula de ácido nucleico. Se puede demostrar que es en caso de que los compuestos farmacológicos más útiles serán los compuestos que están relacionados estructuralmente con otros moduladores conocidos de hipertrofia, tales como ciclosporina A (publicación de patente UK No. GB 2,257,359, incorporado en la presente como referencia), AP1510, FK1012 y FK506 y otros medicamentos relacionados. Tal trabajo con frecuencia se conoce como "diseño racional de medicamento", e incluye no sólo comparaciones con inhibidores conocidos, sino también predicciones en relación a la estructura de las moléculas objetivo. Estos medicamentos habitualmente se utilizan como ¡nmunosupresores pero no se han utilizado para tratar hipertrofia cardíaca o fallo cardíaco. El objetivo del diseño racional de medicamentos es producir análogos estructurales de polipéptidos biológicamente activos o compuestos objetivo. Al crear tales análogos es posible adaptar los medicamentos los cuales son más activos o estables que las moléculas naturales, los cuales tienen una susceptibilidad a alteración diferente o los cuales pueden alterar la función de diversas moléculas adicionales. En un enfoque, uno puede generar una estructura tridimensional para una molécula como NF-AT3 o un fragmento de la misma, esto se puede llevar a cabo por cristalografía de rayos X, modelado en computadora o por una combinación de ambos enfoques. También es posible utilizar anticuerpos para determinar la estructura de un compuesto objetivo o un inhibidor. En principio, este enfoque proporciona un núcleo farmacéutico (farmanúcleo) sobre el cual se puede basar el diseño del medicamento subsecuente. Es posible desviar la cristalografía de proteína en su totalidad al generar anticuerpos anti-idiotípicos para un anticuerpo farmacológicamente activo y funcional. Como una imagen al espejo de una imagen al espejo, el sitio de unión de un anti-idiotipo se puede esperar que sea un análogo del antígeno original. Después se puede utilizar el anti-idiotipo para identificar y aislar péptidos a partir de bancos de péptidos producidos química o biológicamente. Después, los péptidos seleccionados pueden servir como el núcleo farmacéutico. Los anti-idiofipos se pueden generar utilizando los métodos descritos en la presente para producir anticuerpos, utilizando un anticuerpo como el antígeno. Por otra parte, uno simplemente puede adquirir de diversas fuentes comerciales bibliotecas de moléculas pequeñas que se considera satisfacen el criterio básico para los medicamentos útiles en un esfuerzo por una identificación a "graso modo" de los compuestos útiles. El análisis de tales bibliotecas, que incluyen bibliotecas generadas combinatoriamente (por ejemplo bibliotecas de péptidos) es una manera rápida y eficiente para analizar una gran cantidad de compuestos relacionados (y no relacionados) para determinar su actividad. Los enfoques de combinación en sí mismos han llevado a una rápida evolución de medicamentos potenciales mediante la creación de compuestos de la segunda, tercera y cuarta generación modelados de compuestos activos, pero de otra manera indeseables. Los compuestos candidato pueden incluir fragmentos o parte de los compuestos que se presentan de manera natural o se pueden encontrar como combinaciones activas de compuestos conocidos los cuales de otra manera son inactivos. Se propone que los compuestos aislados de fuentes naturales, tales como animales, bacterias, hongos, fuentes vegetales que incluyen hojas y corteza, y muestras marinas, se pueden ensayar como candidatos para determinar la presencia de agentes farmacéuticos potencialmente útiles. Se comprenderá que los agentes farmacéuticos que van a ser analizados también se pueden derivar o sintetizar de composiciones químicas o compuestos elaborados por el hombre. Por lo tanto, se entiende que la sustancia candidato identificada por la presente invención puede ser un polipéptido, polinucleótido, inhibidores de moléculas pequeñas o cualquier otro compuesto que pueda ser diseñado mediante un diseño racional de medicamentos a partir de inhibidores conocidos de la respuesta hipertrófica. Otros inhibidores adecuados incluyen moléculas antisentido, ribozimas y anticuerpos (que incluye anticuerpos de cadena sencilla, cada uno de los cuales puede ser específico para un objetivo que se localiza dentro de la vía calcineurina-NF-AT3-GATA4. Tales compuestos se describen con mayor detalle en otra parte, en este documento. Por ejemplo, una molécula antisentido que se une a un sitio de inicio traduccional o transcripcional de NF-AT3, o un anticuerpo que se une a la parte C terminal de NF-AT3, pueden ser los inhibidores candidatos ideales. En ciertas circunstancias, las "cantidades efectivas" son aquéllas cantidades efectivas para disminuir de manera reproducible la hipertrofia de células, en comparación con sus niveles normales. Se utilizarán compuestos que generen cambios apropiados significativos en la actividad. Los cambios significativos en la hipertrofia cardíaca, por ejemplo, medida utilizando el crecimiento de cardiomiocitos, la respuesta de Ca++, la expresión del gen cardíaco y similares, están representados por una disminución en la actividad de por lo menos aproximadamente 30%-40% y de manera más preferible, por cambios de por lo menos aproximadamente 50% con valores más elevados, por supuesto, como posible. Los compuestos activos de la presente invención también se pueden utilizar para la negación de anticuerpos los cuales después se pueden utilizar en técnicas analíticas y de preparación para detectar y cuantificar tales inhibidores adicionales. Por supuesto, se comprenderá que todos los métodos de análisis de la presente invención son útiles en sí mismos sin importar el hecho de que no se puedan encontrar candidatos efectivos. La invención proporciona métodos para analizar tales candidatos, y no solo métodos para encontrarlos. b. Ensayos in vitro Un ensayo rápido, barato y fácil para realizar es el ensayo de unión. La unión de una molécula a un objetivo puede ser, en sí mismo y para sí mismo, inhibidor, debido a las interacciones esféricas, alostéricas o de carga-carga. Esto se puede realizar en solución o en una fase sólida, o se puede utilizar como un análisis de primera ronda para eliminar rápidamente ciertos compuestos antes de desplazarse a ensayos de análisis más sofisticados. En una modalidad de esta clase, se proporciona el análisis de compuestos que se unen a una molécula NF-AT3 o un fragmento de la misma. El objetivo puede estar libre en solución, fijo sobre un soporte, expresado en o sobre la superficie de una célula. Ya sea el objetivo o el compuesto pueden estar marcados, por lo que se permite la determinación de unión. En otro experimento, el ensayo puede medir la inhibición de unión de un objetivo a un sustrato natural o artificial o asociado de unión (tal como NF-AT3 y GATA4). Se pueden realizar ensayos de unión competitivos en los cuales uno de los agentes (por ejemplo NF-AT3) esté marcado. Habitualmente, el objetivo será la especie etiquetado, disminuyendo la oportunidad de que la etiqueta interfiera con la función de la porción de unión. Uno puede medir la cantidad de etiqueta libre versus etiqueta unida para determinar la unión o la inhibición de unión. Una técnica para un análisis de alto rendimiento de compuestos se describe en WO 84/03564. Se sintetizan en un sustrato sólido grandes cantidades de compuestos de prueba peptídícos pequeños, tales como puntas plásticas o alguna otra superficie. Los compuestos de prueba peptídicos se hacen reaccionar, por ejemplo, con NF-AT3 y se lavan. Se detecta por varios métodos el polipéptido unido. Él objetivo purificado, tal como NF-AT3, se puede recubrir directamente sobre las placas para uso en las técnicas de análisis de medicamento mencionadas antes. Sin embargo, se pueden utilizar anticuerpos no neutralizantes para el polipéptido con el fin de inmovilizar el polipéptido a una fase sólida. Además, se pueden utilizar proteínas de fusión que contienen una región reactiva (preferiblemente una región terminal) para unir una región activa (por ejemplo la parte C terminal de NF-AT3) a una fase sólida. c. Ensayos In cito Se pueden utilizar para el análisis de las sustancias candidato varias líneas celulares que muestran características hipertróficas cardíacas. Por ejemplo, se pueden utilizar las células que contienen mutantes de NF-AT3 sometidos a ingeniería genética, como se discute antes, para estudiar los diferentes atributos funcionales de los compuestos candidato. En tales ensayos, el compuesto se puede formular apropiadamente, dada su naturaleza bioquímica, y se pone en contacto con la célula objetivo. Dependiendo del ensayo, se puede requerir cultivo. Como se discute antes, la célula puede ser examinada después en virtud del número de diferentes ensayos fisiológicos (crecimiento, tamaño, efectos sobre Ca++). Alternativamente, se puede realizar un análisis molecular en el cual se puede explorar la función de NF-AT3 y vías relacionadas. Esto involucra ensayos tales como los de la expresión de proteína, función enzimática, utilización de sustrato, expresión de ARNm (que incluye exhibición diferencial de la célula completa o de ARN para poli(A) y otros. d. Ensayos in vivo La presente invención contempla particularmente el uso de diversos modelos animales. Aquí, se han creado ratones transgénicos y se proporciona un modelo para hipertrofia cardíaca en un sistema de animal completo. La generación de estos animales se ha descrito en otra parte en este documento. Por lo tanto, estos modelos se pueden utilizar no sólo para el análisis en búsqueda de inhibidores de la respuesta hipertrófica sino también para el seguimiento del progreso de la enfermedad cardíaca. El tratamiento de estos animales con compuestos de prueba involucrará la administración del compuesto, en una forma apropiada, al animal. La administración será por cualquier ruta que pueda ser utilizada para propósitos clínicos, que incluye, pero que no se limita a las vías oral, nasal, bucal o incluso tópica. Alternativamente, la administración puede ser por instilación intratraqueal, instilación bronquial, intradérmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o inyección intravenosa. Se contempla específicamente la inyección intravenosa sistémica, la administración regional vía suministro sanguíneo o linfático. La determinación de la efectividad de un compuesto in vivo puede involucrar una variedad de criterios diferentes. Tales criterios incluyen, pero no se limitan a, supervivencia, reducción del tamaño o la masa del corazón y una mejoría en el estado físico general que incluye actividad. También es posible realizar estudios histológicos en los tejidos de estos ratones, o examinar el estado molecular de las células, lo que incluye el tamaño de las células o la alteración en la expresión de genes relacionados con la hipertrofia. 9. Composiciones farmacéuticas Cuando se consideran aplicaciones clínicas de un ingrediente activo (medicamentos, polipéptidos, anticuerpos o liposomas que contienen oligonucleótidos o polinucleótidos antisentido o vectores de expresión), será necesario preparar una composición farmacéutica apropiada para la aplicación propuesta. Generalmente, esto implicará preparar una composición farmacéutica que está esencialmente libre de pirógenos, así como cualquier otra impureza que pueda ser dañina para los humanos o animales. Uno también generalmente deseará utilizar amortiguadores apropiados para volver el complejo estable y para permitir la captación por las células objetivo. Las composiciones acuosas de la presente invención comprenden una cantidad efectiva del ingrediente activo, como se discute antes, dispersado adicionalmente en un portador o un medio acuoso farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones también se denominan como inóculos. Las frases "farmacéutica o farmacológicamente aceptables" se refiere a composiciones que no producen una reacción adversa, alérgica o no deseada cuando se administran a un animal, o a un humano, según sea apropiado. Como se utiliza en la presente, un "portador farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera de los solventes, medios de aspersión, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antimicóticos, agentes que retardan la absorción e isotónicos y similares. El uso de tales medios y agentes para sustancias activas farmacéuticas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio convencional o agente sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. También se pueden incorporar en las composiciones ingredientes activos suplementarios. Se pueden preparar soluciones de las composiciones terapéuticas en agua mezclada adecuadamente con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones también se pueden preparar en glicerol, polietilenglicoles líquidos, mezclas de los mismos y en aceites. Bajo condiciones habituales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservador para evitar el crecimiento de microorganismos. Las composiciones terapéuticas de la presente invención se administran ventajosamente en forma de composiciones inyectables como soluciones o suspensiones líquidas; formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en un líquido antes de su inyección las cuales también se pueden preparar. Estas preparaciones también pueden ser emulsificadas. Una composición típica para tal propósito comprende un portador farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, la composición puede contener 10 mg, 25 mg, 50 mg o hasta 100 mg de albúmina sérica humana por mililitro de solución salina amortiguada con fosfato. Otros portadores farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones acuosas, excipientes no tóxicos que incluyen sales, conservadores, amortiguadores y similares. Los ejemplos de solventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceite vegetal y esteres orgánicos inyectables tales como etiloleato. Los portadores acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, soluciones salinas, vehículos parenterales tales como cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, etc. Los vehículos intravenosos incluyen fluidos y reabastecedores de nutrientes. Los conservadores incluyen agentes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes. El pH y la concentración exacta de los diversos componentes de la composición farmacéutica se ajustan de acuerdo con parámetros bien conocidos. Las formulaciones adicionales son adecuadas para administración oral. Las formulaciones orales incluyen excipientes típicos, tales como, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio y similares. Las composiciones toman la forma de soluciones, suspensiones, tabletas, grageas, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos. Cuando la ruta es tópica, la forma puede ser como crema, ungüento o un parche de liberación controlada, salve o aspersión Las composiciones terapéuticas de la presente invención pueden incluir preparaciones terapéuticas clásicas. La administración de las composiciones terapéuticas de acuerdo con la presente invención será vía cualquier ruta común en la medida en que el tejido objetivo esté disponible vía esa ruta. Esto incluye oral, nasal, bucal, rectal, vaginal o tópica. Alternativamente, la administración será ortotópica, intradérmica subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o inyección intravenosa. Tales composiciones normalmente se administrarán como composiciones farmacéuticamente aceptables que incluyen portadores fisiológicamente aceptables, amortiguadores u otros excipientes. Una vía de suministro de la modalidad preferida para el tratamiento de un estado mórbido diseminado es sistémico, sin embargo, también se contempla el suministro regional. Una cantidad efectiva de la composición terapéutica se determina en base en el objetivo propuesto. El término "dosis unitaria" o "dosificación" se refiere a unidades físicamente diferentes adecuadas para uso en un sujeto, cada unidad contiene una cantidad predeterminada de la composición terapéutica calculada para producir las respuestas deseadas, discutidas antes, en asociación con su administración, es decir, la ruta y régimen de tratamiento apropiados. La cantidad que se va a administrar, tanto de acuerdo al número de tratamientos como de dosis unitarias depende de la protección deseada. Las cantidades precisas de la composición terapéutica también dependen del juicio del médico y son peculiares para cada individuo. Los factores que afectan las dosis incluyen el estado físico y clínico del paciente, la vía de administración, el objetivo propuesto del tratamiento y la potencia, estabilidad y toxicidad de la sustancia terapéutica particular.

. Ejemplos Se incluyen los siguientes ejemplos para demostrar las modalidades preferidas de la invención. Se debe apreciar por aquéllos expertos en la técnica que las técnicas que se describen en los ejemplos que siguen representan técnicas descubiertas por el inventor que funcionan bien en la práctica de la invención, y por lo tanto se pueden considerar que constituyen modos preferidos para su práctica. Sin embargo, aquéllos expertos en la técnica podrán apreciar, a la luz de la presente descripción, que se pueden realizar muchos cambios en las modalidades específicas las cuales se describen y aún obtener resultados parecidos o similares sin apartarse del espíritu y alcance de la invención.

EJEMPL0 1 Materiales v métodos Análisis de dos híbridos. Se utiliza cebo GATA4 para el análisis de dos híbridos de levadura que contienen los aminoácidos 130-409 fusionados en marco con el dominio de unión de ADN GAL4. Esta región de GATA4 abarca los dos dominios de dedos de zinc y se codifica dentro de un fragmento Pstl - Nsil el cual se clona en un sitio Pst I en el vector de expresión de levadura pAS. Se cotransforma pAS-GATA4 en levadura con una biblioteca de ADNc de ratón 10.5 embriónico que contiene el dominio de activación GAL4 fusionado a ADNc aleatorios. A partir de más de 5 millones de colonias primarias analizadas, se identificaron aproximadamente 100 colonias positivas. A partir de cada colonia individual, el plásmido activante se rescata y se inserta y se secuencia del ADNc. Se desechan clonas que contienen inserciones de ADNc en la orientación antisentido o fuera de marco. Las clonas restantes (aproximadamente 21 ) se transforman nuevamente en levadura para probar su especificidad. Se establecen tres criterios separados para la determinación de especificidad. En primer lugar, las clonas aisladas deben recapitular la interacción. En segundo lugar, las clonas aisladas no deben interactuar con un cebo no específico en este caso la fusión GAL4-E12. El tercer criterio se enfoca en factores que pueden también ¡nteractuar con GATA5, puesto que existe más de 92% de consecución de aminoácidos dentro de los dominios de dedo de zinc de GATA4 y GATA5. La clona prey NF-AT3 satisface estos criterios. El fragmento de ADNc NF-AT3 rescatado también se subclona como un fragmento Xhol en el sitio SALÍ del plásmido de fusión GAL4 de mamífero pM1 y se prueba para activación del indicador dependiente de GAL4. Los métodos para cultivo y transfección de células 10T1/2 junto con el análisis de la actividad de CAT se describen previamente (Mokentin eí ai, 1996).

Traducción e inmunoprecipitación in vitro La región de ADNc de NF-AT3 parcial rescatado del plásmido prey de dos híbridos se subclona como un fragmento Xhol en el sitio Salí del vector de expresión de mamífero pECE-Flag. Para generar un vector adecuado para traducción in vitro, se corta el fragmento de ADNc de NF-AT3 junto con el epitopo de bandera 5' de pECE-Flag-NF-AT3 como un fragmento Notl - Xbal y se clona en el promotor T7 pCite2B que contiene el vector de transcripción in vitro (Invitrogen). Esto permite la generación de una proteína de fusión NF-AT3-Flag de 387 aminoácidos. Los fragmentos Sall-Xbal que corresponden a los aminoácidos indicados en GATA4 se subclonan para generar pCite2A-GATA4 80-441 , p,Cite2A-GATA4 181-441 , pCite2A-GATA4 239-441 , pCite2A-GATA4 80-328, pCite-GATA4 181-328 y pCite2A 80-441/d265-294. Un fragmento de ADNc que codifica para los aminoácidos 130-350 de GATA6 de ratón también se clona como un fragmento Sall-Xbal en pCite2A. Además, se utiliza en estos estudios una construcción dirigida al promotor T7 que codifica para la totalidad del dominio de homología Reí de la proteína NF-AT3 humana (aminoácidos 404-649) (Hoey eí ai, 1995). La transcripción y traducción in vitro acoplada a partir del 35 promotor T7 se realiza en presencia de S-mefionina, de acuerdo con el protocolo del equipo TNT (Promega, Madison, Wl). Las inmunoprecipitaciones se dirigen contra el epitopo Flag utilizando el anticuerpo Flag (Kodak IBI, New Haven, CT) o contra el dominio de homología Reí de NF-AT3 (anticuerpo descrito en Lyakh et al., 1997). La transcripción-traducción in vitro se realiza en un volumen de reacción de 25 µl con 0.5 µg de cada construcción. Se inmunoprecipitan 5 µl de esta mezcla de reacción de acuerdo con las condiciones recomendadas por el fabricante (Kodak IBI, New Haven, CT) en un volumen total de 100 µl con 2 µl de anticuerpo monoclonal contra Flag, o 5 µl de anticuerpo específico para NF-AT3 junto con 25-µl de proteína-A/agarosa G. Los productos precipitados se analizan por SDS-PAGE y autorradiografía.

Preparación de los cardiomiocitos de rata primarios Se preparan cultivos de cardiomiocito por disociación de corazones de rata neonatales de un día de edad y se siembran en placa diferencialmente para remover fibroblastos. Para inducir una respuesta hipertrófica, se agregan a los cultivos de cardiomiocito Angll y PE a 10 nM y 10 µM, respectivamente, en medio M199 libre de suero. El medio de cultivo que contiene cualquier agonista se carga cada 12 horas durante un período de 72 horas. CsA y FK-506 están presentes a 500 ng/ml y 150 ng/ml, respectivamente, durante la totalidad del período de cultivo de 72 horas. Para analizar los efectos de estos agentes sobre la actividad de NF-AT3, se transfecta un indicador dependiente de NF-AT3 dentro de los cardiomiocitos por transfección con fosfato de Ca++ en medio libre de suero M199. Después se cultivan los cardiomiocitos durante 72 horas con el agente identificado. El indicador dependiente de NF-AT contiene tres sitios de unión de NF-AT del promotor IL-2 clonado corriente arriba del promotor mínimo de timidina cinasa y del gen de luciferasa. Los métodos para preparación de extractos celulares y los ensayos de luciferasa se han descrito (Molkentin eí ai, 1994).

Ensayos de desplazamiento de movilidad en gel y mutagénesis Para identificar los sitios potenciales de unión de NF-AT dentro del promotor BNP, se realizaron ensayos de desplazamiento de movilidad en gel con oligonucleótidos de cadena doble que corresponden a los supuestos sitios localizados a -927, -327 y -27, en relación al sitio de inicio de transcripción (Owaga eí ai, 1995), o al sitio de consenso del promotor IL-2. Las secuencias de las sondas fueron como sigue: BNP-927: 5'-CTATCCTTTTGTTTTCCATCCTG-S'; (SEC. DE IDENT. NO: 1 ) BNP-327: 5'-TCCCTGCCTTTTCCAGCAACGGT-3'; (SEC. DE IDENT. NO: 2) BNP-27: 5'-GCTCCAGGATAAAAGGCCACGGT-3'; (SEC. DE IDENT. NO: 3) IL-2: 5'-TACATTGGAAAATTTTATTACAC-3' (SEC. DE IDENT. NO: 4). Para los ensayos de desplazamiento de movilidad en gel, el dominio de homología Reí de NF-AT3, se incuban dos microlitros de un producto de transcripción-traducción acoplado in vitro (TNT, Kit, Promega, Madison, Wl) con la sonda oligonucleotídica indicada (40,000 cpm de una sonda marcada con 32P por reacción) en presencia de 1 µg de poli(dl-dC) durante 20 minutos a temperatura ambiente, seguido por electroforesis no desnaturalizante. Los oligonucleótidos competidores no marcados se agregan con un exceso molar de 100 veces y se agregan 2 µl de antisuero específico para NF-AT3 (Gift de N. Rice; Lyah et al., 1997) para los experimentos de superdesplazamiento. Los amortiguadores de desplazamiento de movilidad en gel y las condiciones de electroforesis se describen en otra parte (Molkentin et al., 1994). Se introducen mutaciones dirigidas al sitio dentro del promotor BNP de 1800 pb (Ogawa et al., 1995) mediante reacción en cadena de polimerasa de círculo rodante, como se describe (Molkentin eí ai, 1994).

Inmunocitoquímica Para visualizar la organización sarcomérica en los cardiomiocitos primarios, se utiliza un anticuerpo monoclonal de ratón contra a-actina (Sigma). Las células se lavan en PBS 1X, se fijan en paraformaldehído 3.7% durante 5 minutos, se lavan tres veces con PBS 1X y después se bloquean previamente en PBS 1X que contiene suero de caballo**, BSA 2% y NP40 0.1% durante 30 minutos. Se agrega un anticuerpo contra a-actina a una dilución de 1 :800 en solución de bloqueo previo fresca y se incuba durante 30 minutos adicionales. Alternativamente, las células se incuban con antisuero policlonal contra NF-AT3 a una dilución de 1 :400 (Lyak et ai, 1997). Subsecuentemente, las células se lavan tres veces en 1X PBS con NP40 0.1 %. El anticuerpo secundario conjugado con TRITC contra ratón después se agrega a una dilución 1:400 durante 30 minutos en una solución de bloqueo previo y las células se lavan nuevamente tres veces en 1X PBS que contiene NP40 0.1%. Se realiza la tinción nuclear para ADN con 0.5 µg/ml de bis-bencimida en PBS durante 15 min, seguido por tres enjuagados con PBS.

Ratones transgénicos Los ratones transgénicos que expresan calcineurina y NF-AT3 en el corazón se crean como sigue. Se clona por PCR un ADNc que codifica para una forma constitutivamente activa de la subunidad catalítica de calcineurina A (O'Keefe et al., 1992) con un enlazador 5' Salí y un enlazador Hindlll en un vector de expresión que contiene el promotor a-MHC. El patrón de expresión y las características de este vector de expresión se han descrito (Jones et al., 1994). Para generar ratones transgénicos que expresen la forma constitutiva nuclear de la proteína NF-AT3 en el corazón, se generan cebadores PCR para permitir la amplificación específica de una región de la secuencia que codifica para los aminoácidos 317-902 de la proteína NF-AT3 humana, denominada como NF-AT3?317. LOS enlazadores Xhol en los extremos de estos cebadores permiten la clonación en el sitio Salí del vector de expresión a-MHC. Los vectores tanto de calcineurina como de NF-AT3?317-a-MHC se digieren con Notl, el fragmento de fusión de ADNc a-MHC se purifica y eluye en un amortiguador de inyección de oocitos (Tris - HCl 1 mM, pH 7.4, y EDTA 0.2 mM). El ADN después se inyecta en oocitos fertilizados derivados de ratones FVB y los oocitos se transfieren a los oviductos de ratones ICR pseudoembarazados.

Análisis de RNA Se recolecta el ARN total y se purifica por reactivo Triazol (Gibco BRL) según se recomienda. El ARN de corazones de tipo silvestre y transgénicos, así como de cardiomiocitos cultivados se somete a hibridización dot blot contra un panel de sondas oligonucleotídicas como se describe previamente (Jones et al., 1996).

Histología Los corazones de ratones de tipo silvestre y transgénicos se someten a análisis histológico. Brevemente, se recolectan corazones, se fijan durante la noche en formalina 10% amortiguada con PBS, se deshidratan en etanol, se transfieren a xileno y después en parafina. Los corazones embebidos en parafina se cortan a 4 µM y posteriormente se tiñen con hematoxilina y eosina para examen histológico sistemático o con tricromo de Masson para colágeno (Woods y Ellis, 1994).

EJEMPLO 2 Interacción entre NF-AT3 Y GATA 4 Un objetivo de la presente investigación es identificar proteínas, utilizando el sistema de dos híbridos de levadura que pueden actuar como cofactores para GATA4 en el corazón. El sebo de GATA 4 consiste de los aminoácidos 130-409 fusionados en marco con la proteína GAL4 de levadura (FIGURA 1A). Esta región de GATA4 comprende los dos dedos de zinc y la mayor parte de la sección carboxilo terminal, pero carece del dominio de activación de transcripción amino terminal y por lo tanto no activa la transcripción por sí mismo en levadura. El análisis de una biblioteca de ADNc de embriones de ratón de 10.5 días resulta en la identificación de numerosos factores de interacción con GATA4, uno de los cuales es NF-AT3. Los otros factores que interactúan con GATA4 identificados en este análisis se describirán en otra parte. La especificidad de interacción entre GATA4 y NF-AT3 se prueba por retransformación de levadura en el plásmido de dominio de activación de NF-AT3GAL4 rescatado y diversos plásmidos de cebo de dominio de unión de 5 ADN para GAL4. En este ensayo, también se encuentra que NF-AT3 interactúa con los residuos 133-265 de GATA5, lo cual abarca únicamente el dominio de unión de ADN del dedo de zinc. Sin embargo, NF-AT3 no interactúa con la proteína E12 básica de hélice-rizo-hélice o con el dominio de unión de ADN de GAL4 sólo. o Para validar adicionalmente la interacción entre GATA4 y NF-AT3, se fusiona el fragmento de ADNc de NF-AT3 rescatado al dominio de unión de ADN de GAL4 y se prueba para determinar su capacidad para interactuar con GATA4 de longitud completa en células de mamífero transfectadas. Se utiliza pG5E1 bCAT como un plásmido indicador, el cual contiene 5 sitios de unión de 5 ADN de GAL4 en batería hacia el extremo 5' del promotor E1 b mínimo unido a CAT. Este indicador no es activado significativamente ya sea por GAL4-NF-AT3 o por GATA4 sólo, pero es fuertemente activado por los dos factores juntos en fibroblastos 10T1/2 (FIGURA 1 B), así como en cardiomiocitos de rata neonatales primarios. NF-AT3 de longitud completa también interactúa con el o cebo GAL4-GATA4 en el ensayo de transfección en mamífero.

EJEMPLO 3 Mapeo de los determinantes proteínicos de la interacción GATA4-NF-AT3 Para definir adicionalmente la interacción entre GATA4 y NF-AT3, se prueba si se pueden detectar las interacciones entre los productos de 35 traducción in vitro marcados con S-metionina correspondientes. NF-AT3 con una etiqueta de epitopo Flag (bandera) y GATA4 se traduce en el lisado de reticulocito de conejo en presencia de 35S-metionina. Después se utiliza anticuerpo anti-Flag para ensayos de coinmunoprecipitación. Las proteínas se separan por SDS-PAGE. El anticuerpo anti-Flag inmunoprecipita selectivamente NF-AT3, pero no reconoce GATA4. Sin embargo, cuando se mezcla NF-AT3 con GATA4, GATA4 coinmunoprecipita. Por lo tanto, la cotraducción de GATA4 de longitud completa con el mutante de supresión de NF-AT3 que contiene a los residuos 522-902 fusionado al epitopo Flag en la parte C terminal, seguido por inmunoprecipitación con el anticuerpo anti-Flag y SDS-PAGE muestra que las dos proteínas coinmunoprecipitan y que el anticuerpo anti-Flag no inmunoprecipita a GATA4 en ausencia de NF-AT3-Flag. Para mapear más precisamente los determinantes de esta interacción, se prueban una serie de cuatro mutantes de supresión GATA4 para determinar la capacidad para coinmunoprecipitar con NF-AT3-Flag. Los residuos 181-328 de GATA4, los cuales abarcan los dos dedos de zinc y NLS, ¡nteractúan con NF-AT3 tan eficientemente como GATA4 de longitud completa. Los residuos 181-328 de GATA4, los cuales se extienden desde el segundo de zinc a la parte C terminal, también interactúan con NF-AT3, mientras que el mutante de supresión interna que carece del segundo dedo (80-441/d265-294) no lo hace. Estos experimentos demuestran que el segundo dedo de zinc de GATA4 es esencial para interacción con NF-AT3, mientras que la parte N terminal el primer dedo de zinc y la parte C terminal no son importantes para esta interacción (FIGURA 2). También es de notar que la región del dedo de zinc (aminoácidos 130-350) de GATA6 inmunoprecipitan con NF-AT3. La región C terminal de NF-AT3, que abarca el dominio de homología Reí (RHD) y que contiene la etiqueta del epitopo Flag, se traducen por separado o juntos con el mutante de supresión GATA4 80-328. Los resultados de la inmunoprecipitación con el anticuerpo anti-NF-AT que reconoce NF-AT3 RHD muestran que esta región es suficiente para la interacción con GATA 4. Un mutante de supresión de NF-AT3 que abarca únicamente el dominio de homología Reí, los residuos 404-649 también se prueba. Esta región es suficiente para interactuar con GATA4. Estos resultados juntos indican que la región de homología Reí de NF-AT3 contiene determinantes que median la interacción con el segundo dedo de zinc de GATA4.

EJEMPLO 4 Activación sinerqística del gen BNP por GATA4 y NF-AT3 Para comenzar a investigar si la interacción de GATA4-NF-AT3 tiene un papel funcional en la expresión en el gen cardíaco, se prueban los promotores de ANF, BNP y troponina I cardíaca, los cuales se activan durante la hipertrofia, para determinar su capacidad de respuesta a estos factores en cardiomiocitos de rata neonatales transfectados. El promotor BNP muestra una respuesta notable y por lo tanto se analiza más. Para estos experimentos, también se utiliza un plásmido de expresión de ADNc que codifica para una forma constitutivamente activa de la subunidad A catalítica de calcineurina que carece del dominio autoinhibidor C terminal (O'Keefe eí ai, 1992). Este mutante de calcineurina funciona como una fosfatasa independiente de Ca++, pero retiene sensibilidad a CsA y FK506. Como se muestra en la figura 6, el promotor de BNP se activa más de 100 veces en presencia de GATA4, NF-AT3 y calcineurina. GATA4 solo también es capaz de activar este promotor, como se ha indicado previamente (Grepin et ai, 1994), pero el grado de activación es menor de un décimo a aquél que se obtiene cuando también está presente NF-AT3 y calcineurina. Puesto que GATA4 y NF-AT3 se expresan en cardiomiocitos de rata neonatales, parece que son limitantes de este tipo de ensayo de transfección, lo que hace necesario expresar las proteínas exógenas para ver la respuesta máxima del promotor BNP. Dada la notable capacidad de respuesta del promotor BNP a NF-AT3, se examina la región promotor ade 1800 pb en los ensayos de transfección anteriores para determinar los sitios de unión de consenso NF-AT potenciales (GGAAAAT). Tres secuencias relacionadas con este sitio se identifican en -927 (TGGAAAACAA, SEC. DE IDENT. NO: 5), -327 (TGGAAAAGGC, SEC. DE IDENT. NO: 6), y -27 (AGGATAAAAG, SEC. DE IDENT. NO: 7). El sitio -27 también une GATA4 y se requiere para la expresión de BNP (Grepin et al., 1994). Utilizando sondas oligonucleotídicas marcadas con 32P que corresponden a estas secuencias, se utilizaron los ensayos de desplazamiento de movilidad en gel para unirse a proteína NF-AT3 traducida in vitro generada en lisado de reticulocito de conejo. El sitio putativo en -927 unido a NF-AT3 es tan ávido como el sitio NF-AT de consenso del promotor IL-2 mientras que no se detecta unión en los sitios -327 o -27. Para confirmar que NF-AT3 de los cardiomiocitos también puede unir el sitio -927 del promotor BNP, se utilizan extractos de proteína cardíaca en el ensayo de desplazamiento de movilidad en gel con el sitio -927 como una sonda. El extracto cardíaco da lugar a complejos múltiples que pueden ser eliminados en presencia de un exceso del mismo oligonucleótido no etiquetado o por una secuencia que corresponde al sitio en NF-AT en el promotor IL-2, pero no por secuencias no específicas. El complejo de cardiomiocito también se puede eliminar en gran medida utilizando un anticuerpo específico para NF-AT3. Para determinar si el sitio -927 se requiere para la activación transcripcional por NF-AT3, se muta este sitio. Se encuentra que el promotor mutante es insensible a NF-AT3 (FIGURA 3). Estos resultados demuestran que el promotor BNP es un objetivo transcripcional directo para la activación sinergística por GATA4 y NF-AT3 en cardiomiocitos.

EJEMPLO 5 CsA y FK506 inhiben los efectos hipertróficos de Angll y PE.

La exposición de cardiomiocitos primarios a Angll y PE resulta en un incremento en Ca++ intracelular y una respuesta hipertrófica. Para determinar si la respuesta hipertrófica de los cardiomiocitos de estos agonistas es mediada por calcineurina, se exponen cardiomiocitos de rata neonatal a Angll (10 nM) o PE (10 uM) en presencia y ausencia de CsA o FK-506. Los cardiomiocitos demuestran un incremento notable en el tamaño y el montaje sarcomérico después de 72 h de exposición a Angll o PE. En presencia de CsA o FK-506, se suprime por completo la respuesta a Angll y se reduce notablemente la respuesta a PE. Para determinar si los cambios en la expresión de gen de cardiomiocitos en respuesta a Angll también es controlado por una vía de señalización dependiente de calcineurina, se realizan ensayos dot blot para detectar la expresión de ARNm de ANF en cardiomiocitos tratados con Angll en presencia o ausencia de CsA. La exposición a Angll resulta en un incremento de 15 veces el ARNm de ANF, el cual es bloqueado completamente por CsA. Se mide como control ARNm de GAPDH. Juntos, estos datos morfológicos y moleculares demuestran que las vías de señalización hipertróficas de Angll y PE son sensibles a CsA-/FK-506 y por lo tanto involucran activación de ?r calcineurina.

Si la activación de NF-AT media la señalización hipertrófica dependiente de Ca++, entonces se puede esperar que Angll y PE induzcan actividad de NF-AT. Para probar esto, se transfectan cardiomiocitos de rata primarios con indicador de luciferasa dependiente de NF-AT que contiene tres copias de la secuencia de consenso NF-AT unida al promotor mínimo de timidina cinasa. En presencia de Angll (10 nM) o PE (10 uM), se activa la expresión del gen indicador. Esta activación se suprime completamente en presencia de CsA o FK-506, lo que soporta la conclusión de que Angll y PE activan NF-AT a través de una vía de transducción de señal dependiente de calcineurina.

EJEMPLO 6 Inducción de hipertrofia cardíaca in vivo por calcineurina activada.

Para determinar si la vía de transducción de señal de calcineurina puede también funcionar en el miocardio in vivo, se generaron ratones 20 transgénicos que expresan la forma constitutivamente activa de la subunidad catalítica de calcineurina en el corazón, utilizando el promotor a-MHC para activar la expresión. Estudios previos han demostrado que este promotor específico cardíaco es activo en cámaras ventriculares principalmente después del nacimiento (Jones et al., 1994). Se generaron un total de 10 ratones transgénicos fundadores independientes, los cuales contienen entre 2 y 68 copias del transgen a-MHC calcineurina (Tabla 1).

CUADRO 1 Resumen de las líneas transqénicas de a-MHC-calcineurina Línea Copia del Causa de Edad en Peso/cardíaco Fenotipo Transqénica Transqen Muerte la muerte Corporal Cardíaco 46 8 Sacrificado 18 días 2.2 Hipertrófica s? 22 22 Súbito 10 semanas 2.3 Dilatado 110 3 Súbito 4 semanas 1.6 Hipertrófico 106 2 Súbito 9 semanas N.D. N.D. 108 3 Aún vivo (14 semanas) - - 41 68 Aún vivo (24 semanas) - - 37 15 Aún vivo (23 semanas) - - 37-1 15 Sacrificado 5 semanas 2.3 Hipertrófico 37-2 15 Súbito 4 semanas N.D. Hipertrófico CUADRO 1 (Continuación) 37-3 15 Súbito 3 semanas 2.5 Hipertrófico 37-4 15 Aún vivo (8 semanas) - - 37-5 15 Súbito 12 semanas 2.9 Dilatado 39 3 Súbito 11 semanas 2.7 Hipertrófico 39-1 3 Súbito 3 semanas N.D. Hipertrófico 39-2 3 Súbito 4 semanas N.D. N.D. 39-3 3 Aún vivo (10 semanas) - Se calcularon las relaciones de peso cardíaco/corporal al pesar los corazones y los cuerpos de compañeros de carnada de corazón transgénico en comparación con los no transgénicos. Las edades de los ratones que aún están vivos se muestran en paréntesis como 2/18/98. 37 y 39 fueron fundadores transgénicos y los ratones se designaron como 37- y 39- fueron su descendencia. N.S., no determinado. Cada ratón transgénico para calcineurina analizado muestra un incremento notable en el tamaño del corazón en relación a sus compañeros de carnada no transgénicos. La masa de los corazones promedia 2 a 3 veces más en los animales transgénicos de calcineurina en comparación con sus compañeros de carnada control, incluso de una manera tan temprana como a los 18 días después del nacimiento (tabla 1). El análisis histológico muestra hipertrofia concéntrica en donde las áreas en sección transversal de las paredes ventriculares y el septo interventricular se incrementan notablemente. El ventrículo izquierdo es el más afectado, pero el ventrículo derecho y las cámaras auriculares también están agrandadas. En contraste con la musculatura estriada bien organizada de la pared ventricular normal, los cardiomiocitos de corazones transgénicos con calcineurina están desorganizados y obviamente hipertróficos. Los cardiomiocitos hipertróficos con frecuencia tienen cariomegalia notable. La medición de las áreas en sección transversal de los miocitos dentro de la pared ventricular izquierda muestra un incremento mayor de 2 veces en los transgénicos de calcineurina en comparación con los controles.

En humanos, la hipertrofia cardíaca con frecuencia progresa a dilatación ventricular, fallo cardíaco y muerte súbita. De manera similar, en ratones transgénicos de calcineurina existe una dilatación de las cámaras ventriculares al aumentar la edad. Los ratones transgénicos de calcineurina también son altamente susceptibles a muerte súbita. Esto se produce espontáneamente, así como durante el manejo o anestesia. El ratón que muere de muerte súbita muestra dilatación ventricular derecha e izquierda, indicativa de fallo cardíaco. La histología de los pulmones también muestra edema perivascular extenso y macrófagos intraalveolares que contienen eritrocitos, hallazgos consistentes con un fallo cardíaco. Uno de los rasgos característicos de fallo cardíaco es la fibrosis de la pared ventricular. Los corazones de los transgénicos de calcineurina contienen depósitos de colágeno principalmente intersticiales extensos, como se revela por la tinción tricrómica. En focos con fibrosis marcada, es evidente la degeneración de miofibra.

EJEMPLO 7 Activación de la respuesta molecular a hipertrofia in vivo por calcineurina Se utiliza un ensayo dot blot cuantitativo para examinar ARN de corazones de compañeros de carnada transgénicos de calcineurina y no transgénicos para determinar si los cambios inducidos por calcineurina activada, las características de superación del gen cardíaco de hipertrofia y fallo cardíaco. Consistente con la reactivación del programa fetal de expresión de genes, se activan de manera notable ß-MHC, actina esquelética ß y transcritos de BNP en corazones transgénicos, mientras que a-MHC se inactiva (FIGURA 5). Se ha demostrado previamente que los transcritos para retículo sarcoplástico de Ca++-ATPasa (SERCA) y fosfolambano (PLB) se inactivan durante fallo cardíaco, pues el miocardio que falla muestra un manejo defectuoso de Ca++ (Schwinger et ai, 1995); ambos transcritos están disminuidos en animales transgénicos de calcineurina. No hay un cambio significativo en la expresión de GAPDH.

EJEMPLO 8 Inducción de hipertrofia cardíaca in vivo por NF-AT 3 activado Aunque la activación de las proteínas NF-AT3 es un mecanismo bien caracterizado de acción de calcineurina en células T, y NF-AT es capaz de sinergizar con GATA4 y calcineurina para activar el promotor BNP en cardiomiocitos cultivados, formalmente es posible que la respuesta hipertrófica a calcineurina in vivo puede involucrar un mecanismo independiente de NF-AT. Para determinar si NF-AT3 activado puede sustituir todos los elementos hacia el extremo 5' en la cascada de señalización hipertrófica, se genera un mutante de NF-AT3 constitutivamente activo al suprimir el dominio regulador de la parte N terminal. Este mutante, denominado como NF-AT3?317, carece de los primeros 317 aminoácidos de la proteína, pero retiene la homología Reí y los dominios de transactivación (FIGURA 6). Cuando se expresa NF-AT3?317 en cardiomiocitos transfectados, se vuelve constitutivamente localizado al núcleo, en contraste con la proteína de tipo silvestre la cual requiere señalización de calcineurina para localización nuclear. El mutante NF-AT3?317 también activa la construcción del indicador dependiente de NF-AT en ensayos de transfección transitorios. Por lo tanto, este mutante se expresa en los corazones de ratones transgénicos, bajo el control del promotor a-NHC. Se obtuvieron tres ratones transgénicos fundadores independientes y todos mostraron hipertrofia concéntrica ventricular izquierda y derecha pronunciada. Al igual que los transgénicos de calcineurina, las paredes ventriculares de los transgénicos de NF-AT3?317 muestran fibrosis extensa con desarreglo de miofibras y agrandamiento de los cardiomiocitos. En contraste, la expresión de NF-AT3 de tipo silvestre bajo el control die promotor a-MHC no lleva a hipertrofia. Por lo tanto, NF-AT3 activado sólo es suficiente para sustituir las señales de Ca++ en el corazón e inducir una respuesta hipertrófica in vivo.

EJEMPLO 9 Prevención de hipertrofia cardíaca con CsA.

Para comenzar a determinar si la inhibición de calcineurina in vivo puede ser un medio efectivo para evitar la hipertrofia cardíaca, los inventores probaron si las inyecciones subcutáneas de CsA pueden evitar la disfunción cardíaca en el ratón transgénico de calcineurina. Para estos experimentos, se utilizaron 8 compañeros de carnada transgénicos de una carnada de ratones transgénicos #37 (véase la Tabla 1 ). Se inyectó a cuatro descendientes transgen positivos dos veces diariamente con 25 mg/ml de CsA y a cuatro se les inyectó únicamente con vehículo. Cuatro compañeros de carnada no transgénicos también se trataron con CsA para control para los efectos tóxicos potenciales o anormalidades cardíacas inducidas por CsA. El tratamiento con CsA se inició a los 9 días de edad y los animales se sacrificaron 16 días después. Como se muestra en la FIGURA 7A y la FIGURA 7B, los corazones de los animales tratados con vehículo son altamente hipertróficos y dilatados en el día 25, mientras que sus compañeros de carnada tratados con CsA no son significativamente diferentes en tamaño de los controles no transgénicos. Las relaciones en peso medio de corazón a cuerpo para los transgénicos de calcineurina son casi tres veces más grande que para los transgénicos tratados con CsA y los no transgénicos. El tratamiento con CsA también evita la fibrosis de los corazones de transgénicos de calcineurina. A nivel celular, la respuesta hipertrófica de cardiomiocitos en los transgénicos de calcineurina se inhibe en gran medida por CsA, aunque existen áreas aisladas de desarreglo de miofibras y celdas dispersas con núcleos hipercromáticos prominentes. Cuando estas células ya han sido hipertróficas en el momento en que se inicia la administración de CsA o si son algunas células que escaparon a los efectos de CsA requiere investigación adicional. No obstante, el tratamiento con CsA evita la hipertrofia cardíaca gruesa y la patología asociada en respuesta a calcineurina activada in vivo. * * * Todas las composiciones y/o métodos descritos y reivindicados en la presente se pueden elaborar y ejecutar sin experimentación indebida a la luz de la presente descripción. Aunque las composiciones y métodos de esta invención se han descrito en términos de modalidades preferidas, será evidente para aquéllos expertos en la técnica que se pueden aplicar a las composiciones y/o métodos variaciones, así como las etapas o en la secuencia de etapas del método descrito en la presente, sin apartarse del concepto, espíritu y alcance de la invención. De manera más específica, será evidente que ciertos agentes los cuales están relacionados química y fisiológicamente pueden ser sustituidos por los agentes descritos aquí mientras que se pueden obtener resultados iguales o similares. La totalidad de tales sustitutos similares y modificaciones evidentes para aquéllos expertos en la técnica se considera que están dentro del espíritu y alcance así como del concepto de la invención como se define por las reivindicaciones anexas.

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• LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: The Board of Regents, The University of Texas (B) CALLE: 201 W. 7th Street (C) CIUDAD: Austin (D) ESTADO: TX 0 (E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 78701 (G) TELÉFONO: (512) 418-3000 (H) TELEFAX: (512) 474-7577 (ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA INTERVENCIÓN TERAPÉUTICA EN HIPERTROFIA CARDÍACA (iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 9 o (iv) FORMA LEÍBLE DE LA COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco flexible (B) COMPUTADORA: PC IBM Compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE O PROGRAMA: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.30 (EPO) (vi) DATOS DE SOLICITUD ANTERIORES: (A) NÚMERO DE SOLICITUD: US 09/061 ,417 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 16 DE ABRIL DE 1998 (vi) DATOS DE SOLICITUD ANTERIORES: (A) NÚMERO DE SOLICITUD: US 60/081 ,853 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 15 DE ABRIL DE 1998 (vi) DATOS DE SOLICITUD ANTERIORES: (A) NÚMERO DE SOLICITUD: US 09/065,178 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 10 DE NOVIEMBRE DE 1997 (vi) DATOS DE SOLICITUD ANTERIORES: (A) NÚMERO DE SOLICITUD: US 09/062,864 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 10 DE OCTUBRE DE 1997 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO: 1 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 23 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 1 : CTATCCTTTT GTTTTCCATC CTG 23 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 23 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 2: TCCCTGCCTT TTCCAGCAAC GGT 23 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 23 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 3: GCTCCAGGAT AAAAGGCCAC GGT 23 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 23 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 4: TACATTGGAA AATTTTATTA CAC 23 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 10 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA'SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 5: TGGAAAACAA 10 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 10 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 6: TGGAAAAGGC 10 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 10 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 7: AGGATAAAAG 10 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 902 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 8: Met Gly Ala Ala Ser Cys Glu Asp Glu Glu Leu Glu Phe Leu Leu Val 1 5 10 15 Phe Gly Glu Glu Leu Glu Ala Pro Pro Leu Gly Ala Gly Gly Leu Gly 20 25 30 Glu Glu Leu Asp Ser Glu Asp Ala Pro Pro Cys Cys Arg Leu Ala Leu 40 45 Gly Glu Pro Pro Pro Tyr Gly Ala Ala Pro lie Gly lie Pro Arg Pro 5 50 55 60 Pro Pro Pro Arg Pro Gly Met His Ser Pro Pro Pro Arg Pro Ala Pro 65 70 75 80 Ser Pro Gly Thr Trp Glu Ser Gln Pro Ala Arg Ser Val Arg Leu Gly 85 90 95 i o Gly Pro Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Gly Arg Val Leu Glu 100 105 110 Cys Pro Ser lie Arg He Thr Ser lie Ser Pro Thr Pro Glu Pro Pro 115 120 125 Ala Ala Leu Glu Asp Asn Pro Asp Ala Trp Gly Asp Gly Ser Pro Arg 15 130 135 140 Asp Tyr Pro Pro Pro Glu Gly Phe Gly Gly Tyr Arg Glu Ala Gly Ala 145 150 155 160 Gln Gly Gly Gly Ala Phe Phe Ser Pro Ser Pro Gly Ser Ser Ser Leu 165 170 175 2 o Ser Ser Trp Ser Phe Phe Ser Asp Ala Ser Asp Glu Ala Ala Leu Tyr 180 185 190 Ala Ala Cys Asp Glu Val Glu Ser Glu Leu Asn Glu Ala Ala Ser Arg 195 200 205 Phe Gly Leu Gly Ser Pro Leu Pro Ser Pro Arg Ala Ser Pro Arg Pro 210 215 220 Trp Thr Pro Glu Asp Pro Trp Ser Leu Tyr Gly Pro Ser Pro Gly Gly 225 230 235 240 Arg Gly Pro Glu Asp Ser Trp Leu Leu Leu Ser Ala Pro Gly Pro Thr 245 250 255 Pro Ala Ser Pro Arg Pro Ala Ser Pro Cys Gly Leu Arg Arg Tyr Ser 260 265 270 Ser Ser Gly Thr Pro Ser Ser Ala Ser Pro Ala Leu Ser Arg Arg Gly 275 280 285 Ser Leu Gly Glu Glu Gly Ser Glu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro 290 295 300 Leu Ala Arg Asp Pro Gly Ser Pro Gly Pro Phe Asp Tyr Val Gly Ala 305 310 315 320 Pro Pro Ala Glu Ser lie Pro Gln Leu Thr Arg Arg Thr Ser Ser Glu 325 330 335 Gln Ala Val Ala Leu Pro Arg Ser Glu Glu Pro Ala Ser Cys Asn Gly 340 345 350 Leu Leu Pro Leu Gly Ala Glu Glu Ser Val Ala Pro Pro Gly Gly Ser 355 360 365 Arg Lys Glu Val Ala Gly Met Asp Tyr Leu Ala Val Pro Ser Pro Leu 370 375 380 Ala Trp Ser Leu Ala Arg lie Gly Gly His Ser Pro lie Phe Arg Thr 385 390 395 Ser Ala Leu Pro Pro Leu Asp Trp Pro Leu Pro Ser Gln Tyr Glu Gln 400 405 410 415 Leu Glu Leu Arg He Glu Val Gln Pro Arg Ala His His Arg Ala His 5 420 425 430 Tyr Glu Thr Glu Gly Ser Arg Gly Ala Val Leu Ala Ala Pro Gly Gly 435 440 445 His Pro Val Val Leu Leu Leu Gly Tyr Ser Glu Leu Pro Leu Thr Leu 450 455 460 i o Gln Met Phe He Gly Thr Ala Asp Glu Arg Asn Leu Arg Pro His Ala 465 470 475 Phe Tyr Gln Val His Arg He Thr Gly Leu Met Val Ala Thr Ala Ser 480 485 490 495 Tyr Glu Ala Val Val Ser Gly Thr Leu Val Leu Glu Met Thr Leu Leu 15 500 505 510 Pro Glu Asn Asn Met Ala Ala Asn lie Asp Cys Ala Gly He Leu Leu 515 520 525 Leu Arg Asn Ser Asp He Glu Leu Arg Lys Gly Glu Thr Asp lie Gly 530 535 540 o Arg Lys Asn Thr Arg Val Arg Leu Val Phe Arg Val His Val Pro Gln 545 550 555 Gly Gly Gly Leu Val Val Ser Val Gln Ala Ala Ser Val Pro He Glu 560 565 570 575 Cys Ser Gln Arg Ser Ala Gln Glu Leu Pro Gln Val Glu Ala Tyr Ser 580 585 590 Pro Ser Ala Cys Ser Val Arg Gly Gly Glu Glu Leu Val Leu Thr Gly 595 600 605 Ser Asn Phe Leu Pro Asp Ser Leu Val Val Phe He Glu Arg Gly Pro 610 615 620 Asp Gly Leu Leu Gln Trp Glu Glu Glu Ala Thr Val Asn Arg Leu Gln 625 630 635 640 Ser Asn Glu Val Thr Leu Thr Leu Thr Val Pro Glu Tyr Ser Asn Leu 645 650 655 Arg Val Ser Arg Pro Val Gln Val Tyr Phe Tyr Val Ser Asn Gly Arg 660 665 670 Arg Lys Arg Ser Pro Thr Gln Ser Phe Arg Phe Leu Pro Val He Cys 675 680 685 Leu Glu Glu Pro Leu Pro Asp Ser Ser Leu Arg Gly Phe Pro Ser Ala 690 695 700 Ser Ala Thr Pro Phe Gly Thr Asp Met Asp Phe Ser Pro Pro Arg Pro 705 710 715 720 Pro Tyr Pro Ser Tyr Pro His Glu Asp Pro Ala Cys Glu Thr Pro Tyr 725 730 735 Leu Ser Glu Gly Phe Gly Tyr Gly Met Pro Pro Leu Tyr Pro Gln Thr 740 745 750 Gly Pro Pro Pro Ser Tyr Arg Pro Gly Leu Arg Met Phe Pro Glu Thr 755 760 765 Arg Gly Thr Thr Gly Cys Ala Gln Pro Pro Ala Val Ser Phe Leu Pro • 770 775 780 Arg Pro Phe Pro Ser Asp Pro Tyr Gly Gly Arg Gly Ser Ser Phe Pro 5 785 790 795 800 Leu Gly Leu Pro Phe Ser Pro Pro Ala Pro Phe Arg Pro Pro Pro Leu 805 810 815 Pro Ala Ser Pro Pro Leu Glu Gly Pro Phe Pro Ser Gln Ser Asp Val 820 825 830 i o His Pro Leu Pro Ala Glu Gly Tyr Asn Leu Val Gly Pro Gly Tyr Gly 835 840 845 Pro Gly Glu Gly Ala Pro Glu Gln Glu Leu Ser Arg Gly Gly Tyr Ser 850 855 860 Ser Gly Phe Arg Asp Ser Val Pro He Gln Gly He Thr Leu Glu Glu 15 865 870 875 880 ™ Val Ser Glu He He Gly Arg Asp Leu Ser Gly Phe Pro Ala Pro Pro 885 890 895 Gly Glu Glu Pro Pro Ala 900 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 2881 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 9: GCTTCTGGAG GGAGGCGGCA GCGACGGAGG AGGGGGCTTC TCAGAGAAAG GGAGGGAGGG 60 AGCCACCCGG GTGAAGATAC AGCAGCCTCC TGAACTCCCC CCTCCCACCC AGGCCGGGAC 120 CTGGGGGCTC CTGCCGGATC CATGGGGGCG GCCAGCTGCG AGGATGAGGA GCTGGAATTT 180 AAGCTGGTGT TCGGGGAGGA AAAGGAGGCC CCCCCGCTGG GCGCGGGGGG ATTGGGGGAA 240 GAACTGGACT CAGAGGATGC CCCGCCATGC TGCCGTCTGG CCTTGGGAGA GCCCCCTCCC 300 TATGGCGCTG CACCTATCGG TATTCCCCGA CCTCCACCCC CTCGGCCTGG CATGCATTCG 360 CCACCGCCGC GACCAGCCCC CTCACCTGGC ACCTGGGAGA GCCAGCCCGC CAGGTCGGTG 420 AGGCTGGGAG GACCAGGAGG GGGTGCTGGG GGTGCTGGGG GTGGCCGTGT TCTCGAGTGT 480 CCCAGCATCC GCATCACCTC CATCTCTCCC ACGCCGGAGC CGCCAGCAGC GCTGGAGGAC 540 » AACCCTGATG CCTGGGGGGA CGGCTCTCCT AGAGATTACC CCCCACCAGA AGGCTTTGGG 600 5 GGCTACAGAG AAGCAGGGGC CCAGGGTGGG GGGGCCTTCT TCAGCCCAAG CCCTGGCAGC 660 AGCAGCCTGT CCTCGTGGAG CTTCTTCTCC GATGCCTCTG ACGAGGCAGC CCTGTATGCA 720 GCCTGCGACG AGGTGGAGTC TGAGCTAAAT GAGGCGGCCT CCCGCTTTGG 10 CCTGGGCTCC 780 CCGCTGCCCT CGCCCCGGGC CTCCCCTCGG CCATGGACCC CCGAAGATCC CTGGAGCCTG 840 TATGGTCCAA GCCCCGGAGG CCGAGGGCCA GAGGATAGCT GGCTACTCCT CAGTGCTCCT 900 15 GGGCCCACCC CAGCCTCCCC GCGGCCTGCC TCTCCATGTG GCAAGCGGCG CTATTCCAGC 960 TCGGGAACCC CATCTTCAGC CTCCCCAGCT CTGTCCCGCC GTGGCAGCCT GGGGGAAGAG 1020 GGGTCTGAGC CACCTCCACC ACCCCCATTG CCTCTGGCCC GGGACCCGGG 20 CTCCCCTGGT 1080 CCCTTTGACT ATGTGGGGGC CCCACCAGCT GAGAGCATCC CTCAGAAGAC ACGGCGGACT 1140 TCCAGCGAGC AGGCAGTGGC TCTGCCTCGG TCTGAGGAGC CTGCCTCATG CAATGGGAAG 1200 CTGCCCTTGG GAGCAGAGGA GTCTGTGGCT CCTCCAGGAG GTTCCCGGAA GGAGGTGGCT 1260 GGCATGGACT ACCTGGCAGT GCCCTCCCCA CTCGCTTGGT CCAAGGCCCG GATTGGGGGA 1320 CACAGCCCTA TCTTCAGGAC CTCTGCCCTA CCCCCACTGG ACTGGCCTCT GCCCAGCCAA 1380 TATGAGCAGC TGGAGCTGAG GATCGAGGTA CAGCCTAGAG CCCACCACCG GGCCCACTAT 1440 GAGACAGAAG GCAGCCGTGG AGCTGTCAAA GCTGCCCCTG GCGGTCACCC CGTAGTCAAG 1500 CTCCTAGGCT ACAGTGAGAA GCCACTGACC CTACAGATGT TCATCGGCAC TGCAGATGAA 1560 AGGAACCTGC GGCCTCATGC CTTCTATCAG GTGCACCGTA TCACAGGCAA GATGGTGGCC 1620 ACGGCCAGCT ATGAAGCCGT AGTCAGTGGC ACCAAGGTGT TGGAGATGAC TCTGCTGCCT 1680 GAGAACAACA TGGCGGCCAA CATTGACTGC GCGGGAATCC TGAAGCTTCG GAATTCAGAC 1740 ATTGAGCTTC GGAAGGGTGA GACGGACATC GGGCGCAAAA ACACACGTGT ACGGCTGGTG 1800 TTCCGGGTAC ACGTGCCCCA GGGCGGCGGG AAGGTCGTCT CAGTACAGGC AGCATCGGTG 1860 CCCATCGAGT GCTCCCAGCG CTCAGCCCAG GAGCTGCCCC AGGTGGAGGC CTACAGCCCC 1920 AGTGCCTGCT CTGTGAGAGG AGGCGAGGAA CTGGTACTGA CCGGCTCCAA CTTCCTGCCA 1980 GACTCCAAGG TGGTGTTCAT TGAGAGGGGT CCTGATGGGA AGCTGCAATG GGAGGAGGAG 2040 GCCACAGTGA ACCGACTGCA GAGCAACGAG GTGACGCTGA CCCTGACTGT CCCCGAGTAC 2100 AGCAACAAGA GGGTTTCCCG GCCAGTCCAG GTCTACTTTT ATGTCTCCAA TGGGCGGAGG 2160 AAACGCAGTC CTACCCAGAG TTTCAGGTTT CTGCCTGTGA TCTGCAAAGA GGAGCCCCTA 2220 CCGGACTCAT CTCTGCGGGG TTTCCCTTCA GCATCGGCAA CCCCCTTTGG CACTGACATG 2280 GACTTCTCAC CACCCAGGCC CCCCTACCCC TCCTATCCCC ATGAAGACCC TGCTTGCGAA 2340 ACTCCTTACC TATCAGAAGG CTTCGGCTAT GGCATGCCCC CTCTGTACCC CCAGACGGGG 2400 CCCCCACCAT CCTACAGACC GGGCCTGCGG ATGTTCCCTG AGACTAGGGG TACCACAGGT 2460 TGTGCCCAAC CACCTGCAGT TTCCTTCCTT CCCCGCCCCT TCCCTAGTGA CCCGTATGGA 2520 GGGCGGGGCT CCTCTTTCCC CCTGGGGCTG CCATTCTCTC CGCCAGCCCC CTTTCGGCCG 2580 CCTCCTCTTC CTGCATCCCC ACCGCTTGAA GGCCCCTTCC CTTCCCAGAG TGATGTGCAT 2640 CCCCTACCTG CTGAGGGATA CAATAAGGTA GGGCCAGGCT ATGGCCCTGG GGAGGGGGCT 2700 CCGGAGCAGG AGAAATCCAG GGGTGGCTAC AGCAGCGGCT TTCGAGACAG TGTCCCTATC 2760 CAGGGTATCA CGCTGGAGGA AGTGAGTGAG ATCATTGGCC GAGACCTGAG TGGCTTCCCT 2820 GCACCTCCTG GAGAAGAGCC TCCTGCCTGA ACCACGTGAA CTGTCATCAC CTGGCAACCC 2880 C 2881

Claims (5)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- El uso de un agente para la preparación de una composición farmacéutica para tratar hipertrofia en una célula de cardiomiocito que comprende la etapa de inhibir la función de NF-AT3. 2.- El uso de un agente como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde la función de NF-AT3 comprende inhibir la desfosforilación de NF-AT3. 3.- El uso de un agente como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde la inhibición de la función NF-AT3 comprende reducir la expresión de NF-AT3. 4.- El uso de un agente como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde la inhibición de la función de NF-AT3 comprende poner en contacto NF-AT3 con un agente que se une a que inactiva a NF-AT3. 5.- El uso de un agente como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el uso comprende además inhibir la activación de un gen regulado por NF-AT3, en donde el gen se selecciona del grupo que consiste de un gen de factor natriurético auricular, un gen de cadena pesada de ß-miosina, un péptido natriurético de tipo ß y un gen de actina esquelética a- 6.- El uso de un agente como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde la inhibición de la función de NF-AT3 comprende inhibir la interacción de NF-AT3 con GATA4. 7.- El uso de un agente como el que se reclama en la reivindicación 2, en donde el agente que inhibe la desfosforilación es ciclosporina A o FK506. 8.- El uso de un agente como el que se reclama en la reivindicación 3, en donde el agente que reduce la expresión de NF-AT3 es una construcción antisentido. 9.- El uso de un agente como el que se reclama en la reivindicación 4, en donde el agente que se une y que inactiva a NF-AT3 es una preparación de anticuerpo o un inhibidor de molécula pequeña. 10.- El uso de un agente como el que se reclama en la reivindicación 9, en donde la preparación de anticuerpo comprende un anticuerpo de cadena sencilla. 11.-- El uso de un agente como el que se reclama en la reivindicación 9, en donde la preparación de anticuerpo consiste esencialmente de un anticuerpo monoclonal. 12.- El uso de un agente como el que se reclama en la reivindicación 5, en donde el agente que inhibe la función de los gentes es una construcción antisentido. 13.- Un mamífero no humano transgénico, cuyas células comprende un gen NF-AT3 heterólogo bajo el control de un promotor activo en células eucarióticas. 14.- El mamífero transgénico de la reivindicación 13, en el que el mamífero es un ratón. 15.- El mamífero transgénico de la reivindicación 13, en el que el gen NF-AT3 heterólogo contiene por lo menos una mutación que destruye un sitio de desfosforilación. 16.- El mamífero transgénico de la reivindicación 13, en el que el gen NF-AT3 heterólogo es humano. 17.- El mamífero transgénico de la reivindicación 15, en el que el gen NF-AT3 codifica para una proteína que carece de uno o más de los sitios de fosforilación de NF-AT3 de tipo silvestre. 18.- El mamífero transgénico de la reivindicación 15, en el que el gen de NF-AT3 codifica para una proteína que carece de todos los sitios de fosforilación de NF-AT3 de tipo silvestre. 19.- El mamífero transgénico de la reivindicación 15, en el que el gen de NF-AT3 codifica para una proteína que carece de los aminoácidos 1-37 de NF-AT3 de tipo silvestre. 20.- El mamífero transgénico de la reivindicación 13, en el que el promotor es un promotor específico de tejido. 21- El mamífero transgénico de la reivindicación 20, en el que el promotor específico de tejido es un promotor específico de cardiomiocito. 22.- El mamífero transgénico de la reivindicación 21 , en el que el promotor específico de cardiomiocitos se selecciona del grupo que consiste de BNP, ß-MHC, troponina I cardíaca, a-MHC, SM22a y promotor de actina esquelética a. 23.- Un método para analizar moduladores de hipertrofia cardíaca, que comprende las etapas de: (a) proporcionar una célula que tiene un gen de NF-AT3 mutante que carece de uno o más sitios de fosforilación; (b) poner en contacto la célula con un modulador candidato; y (c) monitorear la célula para determinar un efecto que no está presente cuando la célula no es tratada con el modulador candidato. 24.- El método de la reivindicación 23, en el que la célula se deriva de una línea de células de cardiomiocito. 25.- El método de la reivindicación 23, en el que la célula se deriva de un cardiomiocito primario. 26.- El método de la reivindicación 23, en el que el contacto se realiza in vitro. 27.- El método de la reivindicación 26, en el que el monitoreo comprende medir la actividad o la expresión de un gen que se selecciona del grupo que consiste del gen de factor natriurético auricular, un gen de la cadena pesada de ß-miosina, un gen de actina cardíaca y un gen de actina esquelética a- 28.- El método de la reivindicación 24, en el que el monitoreo comprende medir el tamaño o la masa de la célula. 29.- El método de la reivindicación 24, en el que el monitoreo comprende monitorear la respuesta a Ca++ en la célula. 30.- El método de la reivindicación 29, en el que el monitoreo de la respuesta de Ca++ comprende monitorear la expresión del gen dependiente de Ca++ en la célula. 31.- El método de la reivindicación 23, en el que el gen de NF-AT3 codifica para una proteína que carece de uno o más sitios de fosforilación de NF-AT3 de tipo silvestre. 32.- El método de la reivindicación 23, en el que el gen de NF-AT3 codifica para una proteína que carece de todos los sitios de fosforilación de NF-AT3 de tipo silvestre. 33.- El método de la reivindicación 23, en el que el gen de NF-AT3 codifica para una proteína que carece de los aminoácidos 1-37 de NF-AT3 de tipo silvestre. 34.- El método de la reivindicación 23, en el que el modulador candidato es una construcción antisentido. 35.- El método de la reivindicación 23, en el que el modulador candidato es de una biblioteca de moléculas pequeñas. 36.- El método de la reivindicación 23, en el que el modulador candidato es un anticuerpo. 37.- El método de la reivindicación 39, en el que el anticuerpo es un anticuerpo de cadena sencilla.