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Das
allgemeine Gebiet der Erfindung ist ein Verfahren zur Impfung von
Tieren mit Nucleinsäuren,
um sie vor Parvovirus-Infektionen zu schützen. Diese Erfindung betrifft
speziell die Herstellung und Verwendung von Parvovirus-DNA und deren
Verabreichung an Hunde, Katzen und Nerze um eine Immunreaktion zu
induzieren, welche diese Tiere vor Krankheiten schützen kann,
die durch einen virulenten Parvovirus verursacht werden. Nucleinsäure-Immunogene
sind so konstruiert, dass sie die antigenen Teile des Parvovirus-Genoms umfassen,
welche in bakterielle Plasmide eingebaut sind. Diese Plasmide stellen
das gewünschte
parvovirale Genprodukt her, wenn sie durch Transfektion in Wirtszellen
eingeführt
werden. Wirtszellen, die mit Plasmiden transfiziert sind, die das
parvovirale Immunogen exprimieren, produzieren einen Strom von antigenen
Proteinen, gegen die das Wirtsimmunsystem eine schützende Immunreaktion
einleitet.
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Parvoviren
stellen eine Familie von eng verwandten kleinen DNA-Viren dar, welche
aus einem Proteincapsid aufgebaut sind, das eine einzelsträngige DNA
enthält.
Parvoviren verursachen verschiedene Krankheiten in einer Vielzahl
von Säugerarten.
Das feline Panleukopenievirus, das Nerzenteritisvirus und das Hundeparvovirus
sind Wirtsbereichvarianten der felinen Parvovirus-Untergruppe und
haben mehr als 98% DNA-Homologie gemeinsam (Martyn et al., J. Gen.
Virol. 71: 2747–2753
(1990)). Bei dem Hundeparvovirus handelt es sich um ein relativ
neues Pathogen aller Hundeartigen, welches zuerst in den späten 1970ern
als der ursächliche
Erreger einer weltweiten Pandemie einer im hohen Maße tödlichen
Gastroenteritis erkannt worden ist. Der Theorie nach handelt es
sich bei diesem Virus um eine Wirtsbereichvariante des felinen Parvovirus.
Als man die Nucleotidsequenzen von felinen und Hundeparvoviren verglich,
identifizierte man 31 Basenänderungen,
welche in gerade einmal 9 Aminosäuren
zu Veränderungen
führten
(Martyn et al., 1990) Sechs dieser Amino säureänderungen betrafen die Haupthüllproteingene
VP1 und VP2. Das Hunde-spezifische
antigene Epitop wird durch einen Unterschied in einer einzigen Aminosäure zum
felinen Panleukopenievirus bestimmt. Weitere genetische Kartierungen
haben kürzlich
die Zeit des Ursprungs des Hundeparvovirus bestätigt, die Theorie von dessen
Entstehung aus dem felinen Parvovirus untermauert und einen Hinweis
auf eine weitergehende Evolution des Virus in die Feldstämme geliefert,
die jetzt isoliert werden (Truyen et al., J. of Virology 69 (8):
4702–4710
(1995)).
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Die
zwei Nucleocapsidproteine VP1 und VP2 werden von derselben RNA exprimiert,
wobei VP2 von einem im Leseraster innerhalb des offenen Leserahmens
von VP1 befindlichen ATG-Codon stammt. VP2 wird in Mengen exprimiert,
die fast 10 Mal höher
sind als für
VP1, was darauf hinweist, dass das interne Startcodon von dem Translationsapparat
effizienter als solches erkannt wird (Turiso et al., J. of Gen.
Virol. 72: 2445–2456 (1991).
Experimente zur Epitopkartierung haben gezeigt, dass alle diejenigenen
antigenen Epitope, welche neutralisierende Antikörper erzeugen, innerhalb von
VP2 liegen (Turiso et al., 1991, a.a.O.). Diese umfassen die ersten
16 Aminosäuren
von VP2 (Langeveld of al., J. of Virology 68 (7): 4506–4513 (1994);
Casal et al., J. of Virology 69 (11): 7274–7277 (1995)).
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Die
Immunisierung bleibt der hauptsächliche
Mechanismus, durch den Menschen und Tierarten gegen die Geißel der
Infektionskrankheit geschützt
werden. Mit dem kürzlichen
Trend bei der Impfstoffentwicklung weg von lebenden, attenuierten
Erregern wegen Sicherheitsbedenken, entweder auf Grund von Impfdurchbrüchen, unvollständiger Attenuierung,
Reversion oder von Amplifizierung in immunsupprimierten Patienten
war auch eine damit einhergehende Abnahme der Wirkdauer und der
Effizienz von Impfstoffen zu verzeichnen. Die Verwendung von abgetöteten Erregern,
clonierten rekombinanten Proteinen oder Peptiden erfordert hohe
Dosierungen und die Anwesenheit von Adjuvantien. Die Langzeitwirkungen
solcher Adjuvantien sind jedoch nicht untersucht worden, und diese
sind kürzlich
als ursächliche
Agentien bei Impfstoff-induzierten Sarkomen von Katzen ins Spiel
gebracht worden (Hendrick et al., J. Am. Vet. Med. Assoc. 205: 1425–1429 (1994)).
Außerdem wirft
die extrazelluläre
Lage des injizierten Antigens Fragen über die Art und Weise auf,
in der diese Antigene dem Immunsystem präsentiert werden und in Bezug
auf deren Eignung, einen Schutz gegenüber natürlich vorkommenden Infektionen
zu erzeugen.
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Derzeitige
Immunisierungsverfahren für
Hundeparvovirus spielen kaum eine Rolle (Schultz, R.D., (1994) The
Challenge of Controling a Newly Recognized Disease: Canine Parvovirus
Vaccines, IBC International Symposium, October 27–28, 108).
Impfstoffe, die entweder aus attenuierten oder abgetöteten Organismen
bestehen, müssen
wiederholt gegeben werden, um Immunität zu erzeugen, und angesichts
von im Kreislauf befindlicher mütterlicher
Antikörpertiter
erfolgt gewöhnlich
keine Immunisierung. Dieses Problem wird zusätzlich durch die Fähigkeit
von mütterlichem
Antikörper
verschärft,
den Impfstoff zu inaktivieren, während
dieser auf Spiegel herabgesetzt worden ist, welche keinen Schutz
verleihen, was zu einem „Fenster
der Verwundbarkeit" führt (Pollock
und Carmichael, J. Am. Vet. Med. Assoc. 130: 37–42 (1982)). Die Clonierung
des Hundeparvovirus hat zur Entwicklung von zwei unterschiedlichen
Impfstrategien geführt.
Die erste bestand in der Einführung
der gesamten Sequenz von VP2 in ein Baculovirus-Expressionssystem.
Das Proteinprodukt wurde geerntet und erfolgreich dazu verwendet,
Hunde zu immunisieren (Turiso et al., J. of Virology 66 (5): 2748–2753 (1992)).
Die zweite Strategie umfasst die Subclonierung oder die Synthese
von Peptidepitopen, welche dazu verwendet werden, Hunde zu immunisieren.
Bei diesen Peptiden hat man sich die Sequenz des Aminoterminus von
VP2 zunutze gemacht (Casal et al., 1995, a.a.O.), was zu der erfolgreichen
Immunisierung von Hunden führte.
Die mit Hilfe dieser Strategien entwickelten Impfstoffe sind auch
bei Nerzenteritisvirus getestet worden, einer anderen eng verwandten
Wirtsbereichvariante von Parvovirus. Eine Verabreichung von entweder
rekombinantem Protein oder Peptid führt zu einer Schutz verleihenden
Immunität
gegen diese kommerziell relevante Nerzkrankheit (Langeveld of al.,
Vaccine 13 (11): 1033–1037
(1995)).
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Impfstoffe
gegen Parvovirus, die aus Peptiden zusammengesetzt sind, die antigenen
Epitopen der parvoviralen Hüllproteine
entsprechen, sind in der EP-A-0647655 und in Turiso et al., (J.
General Virology 72, Seiten 2445 bis 2456 (1991)) beschrieben worden.
Darüber
hinaus offenbart Langeveld et al., Vaccine, Band 12, Seiten 1473
bis 1480 (1994) durch Bezugnahme die Impfung von Hunden unter Verwendung
von modifiziertem Lebendvirus oder inaktiviertem Virusmaterial.
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Modifizierte
Lebendvirus-Impfstoffe für
felines Panleukopenievirus sind wirksam für den Schutz von ausgewachsenen
Katzen, können
aber Geburtsfehler bei Kätzchen-Embryos in utero
hervorrufen. Folgerichtig werden diese daher nicht für die Impfung
von unversehrten Katzenweibchen empfohlen, die trächtig sein
könnten.
Wegen der schwerwiegenden Limitierungen modifizierter Lebendvirus-Impfstoffe
begannen Forscher die Möglichkeit
zu untersuchen, Zellen in vivo mit Genen zu transfizieren, die Antigene
von infektiösen
Organismen exprimieren (in Donnelly et al., J. Imm. Meth. 176: 145–152 (1994);
Fynan et al., Int. J. Immunopharmac. 17 (2): 79–83 (1995); Whalen et al.,
DNA Mediated Immunization to the Hepatitis B Surface Antigen; Activation and
Entrainment of the Immune Response in DNA Vaccines, New York, New
York Academy of Sciences (1995) in Übersichtsartikeln besprochen).
Ein solcher Immunisierungsmechanismus würde den Weg der viralen Genexpression
imitieren, ohne das Begleitrisiko, welches durch attenuierte Organismen
dargestellt wird, wobei man gleichzeitig das Erfordernis für übliche Adjuvantien
umgeht. Die zufällige
Entdeckung, dass die intramuskuläre
Injektion von „nackter" Plasmid-DNA, die
einen Säuger-Promotor
trägt dazu
führt,
dass die DNA von Muskelzellen aufgenommen und exprimiert wird (Wolff
et al., Science 247: 1465–1468
(1990)), hat zu einer dramatischen Erweiterung des neuen Gebiets
der Impfung mit Nucleinsäuren
geführt.
Im Anschluss an die ursprüngliche
Studie sind die Bedingungen, welche die intramuskuläre Injektion
von Plasmid-DNA beeinflussen weiter charakterisiert und ausgedehnt
worden (Wolff et al., Biofechniques 11: 474–485 (1991)). Die Effizienz des
Transfers ist mit einem Bereich von 1–5% relativ gering, diese Effizienz
kann jedoch bis zu 40-fach erhöht werden,
indem man vor der Injektion von Plasmid-DNA eine Muskeldegeneration
induziert (Vitadello et al., Hum. Gene Ther. 5: 11–18 (1994);
Danko und Wolff, Vaccine 12 (16): 1499–1502 (1994); Davis et al.,
Hum. Gene Ther. 4: 733–740
(1993)). Zwei der am häufigsten
verwendeten myonekrotischen Wirkstoffe sind das Lokalanästhetikum
Bupivicain sowie Cardiotoxin (Danko und Wolff, 1994, a.a.O.; Davis
et al., 1993, a.a.O.). Man hat eine Anzahl von anderen Techniken
eingesetzt, um Gene in Muskel zu transferieren, einschließlich retroviraler
Vektoren, adenoviraler Vektoren und Liposomen. Jedoch scheint die
direkte Injektion von nackter DNA der effizienteste dieser Transportmechanismen
beim Transfer und der Expression fremder DNA zu sein (Davis et al.,
1993, a.a.O.).
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Man
hat mehrere Verabreichungswege neben der intramuskulären Injektion
untersucht. Allen diesen Wegen ist gemeinsam, dass kein Wirkstoff
oder Vektor erforderlich ist, um den Eintritt der Nucleinsäure in Zielzellen
zu ermöglichen.
Intravenöse,
intraperitoneale, intradermale, intranasale und subkutane Injektion
von DNA-Plasmiden
haben alle zu einer Immunisierung gegen das Hämagglutinin (HA) von Influenzavirus
in Küken
geführt
(in einem Übersichtsartikel
in Pardoll und Beckerkleg, Immunity 3: 165–169 (1995) besprochen). Interessanterweise
gaben diese Studien Hinweise dafür,
dass eine mucosale (intranasale) Immunisierung mit DNA nicht die
erwartete IgA-Reaktion sondern vielmehr eine IgG-Reaktion hervorrief,
wie man sie bei intramuskulären
Injektionen beobachtet. Darüber
hinaus wurde gezeigt, dass eine intradermale Immunisierung durch
eine Bombardierung mit DNA-beschichteten Gold-Mikropartikeln ebenso
wirksam war wie andere Gentransfermethoden, bei 100- bis 1000-fach niedrigeren
DNA-Konzentrationen als bei den anderen Methoden. Ähnliche
Experimente haben gezeigt, dass die intradermalen und intravenösen Wege
zu einer Immunisierung von Mäusen
und Kaninchen führen
(Raz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 9519–9523 (1994)).
Indem sie die Einfachheit des Ansatzes hervorhoben, haben Raz und
Kollegen darauf hingewiesen, dass die Möglichkeit besteht, die teure
und möglicherweise
umständliche
Ausrüstung
zu umgehen, welche für
eine Bombardierung von Gewebe und eine intradermale Immunisierung
notwendig ist, indem man einen Tuberkulin-PPD (gereinigtes Proteinderivat)-Plastikstempel
mit DNA beschichtet und die Haut ritzt, um ein ähnliches Ergebnis zu erreichen
wie mit der biolistischen Bombardierung. Man hat die Immunisierung
mit DNA mit unterschiedlichem Erfolg in mehreren Säugerarten
einschließlich
Rindern, Schweinen und nicht-menschlichen Primaten getestet, hauptsächlich über den
intramuskulären
Weg.
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Eine Übersicht über genetische
Immunisierung kann man in Ertl et al., Viral Immunology, Band 9,
Seiten 1 bis 9 (1996) finden. Es ist berichtet worden, dass die
Art der Immunreaktion auf Antigene, die nach einer intramuskulären Injektion
von DNA-Expressionskonstrukten
vorliegen, sowohl den humoralen als auch den zellulären Arm
des Immunsystems umfasst. Wenn Reporter-DNA-Konstrukte injiziert
werden, scheinen sie in reifen Muskelfasern enthalten zu sein. Dies
wird durch den Nachweis gestützt,
dass eine Muskelregeneration die Effizienz der Plasmidexpression
zu erhöhen
scheint. Die Antigen-Präsentation
könnte über eine MHC-Klasse
I-Präsentation
durch die Muskelzelle, eine Aufnahme des Antigens von Myocyten durch
vom Knochenmark abgeleitete Antigen-präsentierende Zellen (APCs) oder über eine
direkte DNA-Transfektion von durch den Muskel wandernden APCs erfolgen
(in Übersichtsartikeln
in Pardoll und Beckerkleg, 1995, a.a.O.; Whalen et al., 1995, a.a.O.
besprochen). Eine einfache Antigen-Präsentation durch Myocyten würde aus
zwei Gründen
unwahrscheinlich scheinen, vollständig für dieses Phänomen verantwortlich zu sein.
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Der
erste liegt in der zunehmenden Zahl von Hinweisen, dass die Präsentation
von Antigenen in Abwesenheit von co-stimulatorischen Signalen wie
z.B. B7 und B7-2 eine Tolerierung gegenüber den Antigenen zur Folge
hat (Chen und Nabavi, Immunity 1: 147–154 (1994)). Zweitens ist
berichtet worden, dass Muskel extrem niedrige Expressionsspiegel
von MHC Klasse I aufweist (Karpati et al., Ann. Neurol. 23: 64–72 (1988)). Es
scheint daher wahrscheinlich zu sein, dass die Antigen-Präsentation
durch qualifizierte APCs erfolgt, welche das Antigen entweder dadurch
erlangt haben, dass sie es aufgesammelt haben oder durch eine direkte Aufnahme
und Expression des transferierten Gens (Pardoll und Beckerkleg,
1995, a.a.O.; Whalen et al., 1995, a.a.O.). Ein Experiment, das
mit einer biolistischen Partikelbombardierung in der Maus durchgeführt wurde, scheint
den letzteren Ansatz zu favorisieren. Die Mäuse wurden in der Ohrmuschel
bombardiert und das Ohr wurde 5 Minuten nach der Bombardierung chirurgisch
entfernt. Diese Mäuse
behielten die Fähigkeit,
eine Immunantwort auszubilden, und diese Antwort unterschied sich
qualitativ nicht von derjenigen, die durch die Bombardierung allein
induziert wurde. Es ist klar, dass eine hoch mobile Zellpopulation
für die
Einleitung und die Aufrechterhaltung der Immunantwort in diesen
Mäusen
verantwortlich sein muss. Man hat vorgeschlagen, dass es sich bei
dieser Zelle um die dendritische Zelle handelt (Fynan et al., 1995,
a.a.O.). Bezeichnenderweise unterscheidet sich die Art der Immunantwort,
die durch die Partikelbombardierung hervorgerufen wird, ein wenig
von der Reaktion, die sich aus einer intramuskulären Injektion ergibt, wobei
IgG1 in intramuskulären
Injektionen vorherrscht, wohingegen bei intradermalen Injektionen
IgG2 vorherrscht. Der Hauptgrund für diesen Unterschied kann in
den Myocyten liegen, welche bei einer intramuskulären Immunisierung
für Zeiträume, die einen
Monat übersteigen,
weiter Antigen exprimieren (Pardoll und Beckerkleg, 1995, a.a.O.).
Diese fortwährende
Expression hat eine sogenannte Immuneinstellung zur Folge (Whalen
et al., 1995, a.a.O.). Das praktische Ergebnis dieses Phänomens liegt
darin, dass die Expression im Muskel als ein fortwährender
Boost fungiert.
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Die
Titer aus einer einzelnen Injektion können häufig über einen Zeitraum von 4 bis
8 oder sogar noch mehr Wochen steigen. Klassische Booster-Reaktionen
hat man auch bei Injektionen von DNA beobachtet, die mehr als 6
Monate nach der primären
Injektion gegeben wurden. Merkwürdigerweise
haben DNA-Booster-Injektionen, welche während des Zeitraums steigender
Antikörpertiter
gegeben werden, gegenebenfalls keine Wirkung oder vermindern die
Reaktion auf das Antigen möglicherweise
sogar (Davies et al., „Introduction
of systemic and mucosal immunity to HBV with plasmid DNA", International Meeting
on Nucleic Acid Vaccines, 5.–7.
Februar 1996, Bethesda, Maryland, USA).
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Die
Fähigkeit,
eine messbare Immunantwort zu erzeugen ist nicht a priori ausreichend
für eine
Impfung. Vielmehr muss die Immunantwort die geeigneten Elemente
enthalten, den Wirt vor einer Infektion, einer Invasion und Krankheit
zu schützen.
Daher bleibt der Schutz gegen eine Infektion in Belastungsstudien
der überzeugendste
Nachweis der Wirksamkeit des Impfstoffs. DNA-basierte Impfstoffe
sind in der Lage gewesen, Küken
gegen letale Belastungsinfektionen mit Influenzavirus (Robinson
et al., Vaccine 9: 957–960
(1993)) und Mäuse
gegen eine Infektion mit Mycoplasma pulmonis (Lai et al., DNA and
Cell Biology 14 (7): 643–651 (1995))
zu schützen.
Außerdem
konnten Mäuse
durch DNA-Immunisierung gegen die Etablierung persistenter Infektionen
durch lymphocytären
Choriomeningitisvirus geschützt
werden (Martins et al., J. of Virology 69 (4): 2574–2582 (1995)).
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Der
Stand der Technik hinsichtlich der Impfung mit Nucleinsäuren in
Bezug auf die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Artikel
zusammengefasst: Donnely et al., 1994, a.a.O.; Fynan et al., 1995, a.a.O.;
Whalen et al., 1995, a.a.O., was die Impfung mit Nucleinsäuren anbelangt,
und Turiso et al., 1992, a.a.O. und Casal et al., 1995, a.a.O.,
was die parvovirale Impfung anbelangt.
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Der
vorstehend wiedergegebene Stand der Technik hat nur nur die Immunantwort
von Mäusen
auf die Impfung mit Nucleinsäuren
getestet. Wie auf dem Fachgebiet wohlbekannt ist, lassen sich experimentelle
Ergebnisse, die man mit Mäusen
erhalten hat, auf Grund des taxonomischen Unterschieds zwischen
diesen Tieren nicht auf Tiere wie Katzen, Hunde und Nerze übertragen.
Da andererseits im Stand der Technik keine geeigneten Impfstoffe
gegen parvovirale Infektionen von Hundeartigen, Katzenartigen und
Marderartigen bereitgestellt werden konnten, bestand das der Erfindung
zugrundeliegende technische Problem darin, einen solchen Impfstoff
bereitzustellen. Dieser Impfstoff sollte vor allem Hunde, Katzen
und Nerze vor den möglicherweise
lebensbedrohlichen Infektionen mit Parvovirus wirksam schützen. Die
Lösung
des vorstehenden technischen Problems wird erreicht, indem die in
den Ansprüchen
dargestellten Ausführungsformen
bereitgestellt werden.
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Dementsprechend
betrifft die vorliegende Erfindung einen Anti-Parvovirus-Impfstoff,
wie er in den angefügten
Ansprüchen
genau beschrieben ist.
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Die
vorliegende Patentschrift beschreibt auch einen Anti-Parvovirus-Impfstoff,
umfassend Nucleinsäuremoleküle, welche
mindestens ein Parvovirus-spezifisches Epitop codieren, sowie einen
pharmazeutisch verträglichen
Träger.
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Überraschenderweise
hat man erfindungsgemäß jetzt
festgestellt, dass eine Immunisierung mit „nackter" DNA, die mindestens ein Parvovirus-spezifisches
Epitop codiert, eine Immunantwort erzeugt, welche das geimpfte Tier
bei einer nachfolgenden parvoviralen Infektion vor Parvovirus-induzierter
Krankheit schützt.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
des Anti-Parvovirus-Impfstoffes der Erfindung ist mindestens eines
der Parvovirus-spezifischen Epitope ein T-Zell-Epitop.
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Der
Fachmann ist bei der Konstruktion eines schützenden Impfstoffes im Licht
der Lehren der vorliegenden Erfindung in der Lage, einen Impfstoff
zu entwickeln, der eine Nucleinsäuresequenz
umfasst, welche nur ein T-Zell-Epitop codiert, das in dem Impfstoff
der Erfindung verwendet wird.
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Auf ähnliche
Weise ist der Fachmann in der Lage, einen Impfstoff zu entwickeln,
der nur eine DNA umfasst, die ein B-Zell-Epitop zur Verwendung in
einem Nucleinsäure-impfstoff gemäß der vorliegenden
Erfindung codiert. Daher umfasst der Anti-Parvovirus-Impfstoff in
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform mindestens
ein B-Zell- Epitop.
Alternativ können
die Nucleinsäuren,
die das mindestens eine B-Zell-Epitop codieren, in diesem Impfstoff
zusammen mit Nucleinsäuren
enthalten sein, die mindestens ein T-Zell-Epitop codieren. T- und
B-Zell-Epitope können
von demselben oder von verschiedenen DNA-Molekülen codiert werden.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
des erfidnunggemäßen Anti-Parvovirus-Impfstoffes handelt
es sich bei den Nucleinsäuremolekülen um DNA-Moleküle oder
um RNA-Moleküle.
Der Begriff „DNA-Moleküle" wird hier im weitesten
Sinn verwendet und schließt
z.B. cDNA-Moleküle,
genomische DNA, synthetische und semisynthetische DNA-Moleküle ein.
Ebenso wird der Begriff „RNA-Moleküle" hierin im weitest
möglichen
Sinn verwendet.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
des Anti-Parvovirus-Impfstoffes gemäß der Erfindung codieren diese
Nucleinsäuremoleküle die parvoviralen
VP1- und/oder VP-2
Nucleocapsidproteine.
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Das
Parvovirus-Genom ist ungefähr
5000 Basenpaare lang und enthält
ungefähr
vier offene Leserahmen. Zwei von diesen offenen Leserahmen codieren
VP1 und VP2, die Haupthüllproteine
des Parvovirus. VP2 ist innerhalb von VP1 enthalten und besteht
aus fast dem gesamten VP1-Gen mit Ausnahme eines kleinen Teils des
5'-Endes oder des Aminoterminus
des VP1-Proteins. Es ist bekannt, dass die Sequenz, die exklusiv für VP1 ist,
ein Epitop codiert, welches für
die Stimulierung einer T-Zell-Antwort
verantwortlich ist. Die Sequenz, die VP1 und VP2 gemeinsam ist,
codiert mindestens ein Epitop, welches eine Antikörper-Antwort
stimuliert. Natürliche
Infektionen mit Parvoviren erzeugen innerhalb einer Woche nach der
Infektion signifikante schützende
Antworten. Die Expression des gesamten VP1-Gens oder des Epitops
innerhalb von VP1 (und VP2) führt
auch zu einer schützenden
Immunität
durch sowohl den zellulären
als auch den humoralen Arm des Immunsystems.
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Dementsprechend
kann ein Fachmann zur Herstellung eines Impfstoffes zur Immunisierung
von Hundeartigen, Katzenartigen oder Marderartigen Nucleinsäuresequenzen
verwenden, welche entweder die Sequenz umfassen, welche das VP1-Epitop
als ein stellvertretendes Beispiel eines parvoviralen T-Zell-Epitops codiert
oder eine Nucleinsäuresequenz,
welche das VP2-Epitop als ein stellvertretendes Beispiel eines parvoviralen
B-Zell-Epitops codiert oder eine Kombination von beiden.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Impfstoffes
umfassen die Nucleinsäuremoleküle den gesamten
offenen Leserahmen von VP1, d.h. den Leserahmen, der das VP1-Nucleocapsidprotein
codiert. In dem Fall des Hundeparvovirus beträgt die vollständige Länge des
offenen Leserahmens 2169 Basenpaare. Dieser ORF wird bevorzugt unter
der Kontrolle eines geeigneten fremden Promotors exprimiert.
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Die
Patentschrift beschreibt des Weiteren, dass in dem erfindungsgemäßen Impfstoff
das Epitop von einem Parvovirus-Genom abgeleitet ist, wobei dieses
Parvovirus in der Lage ist, Hundeartige, Katzenartige oder Marderartige
und vorzugsweise Hunde, Katzen oder Nerze zu infizieren. Auf Grund
der starken Gesamthomologie des Genoms der Parvoviren, die entweder
Hundeartige, Katzenartige oder Marderartige infizieren, kann ein
Impfstoff, der von einer Nucleinsäure abgeleitet ist, welche
entweder von Hundeartigen, Katzenartigen oder Marderartigen abgeleitet
ist, dazu verwendet werden, eine beliebige der anderen erwähnten Tiergruppen
erfolgreich zu immunisieren.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Impfstoffes
sind die Nucleinsäuremoleküle, welche
mindestens ein Parvovirus-spezifisches Epitop codieren, in einem
Expressionsvektor enthalten, wobei dieser Expressionsvektor in Säugerzellen
funktionell ist.
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Für einen
Fachmann sind zahlreiche geeignete Expressionsvektoren verfügbar, um
die vorliegende Erfindung auszuführen.
Dementsprechend sind die in den angehängten Beispielen als eine Ausgangsbasis
für die
Entwicklung des erfindungsgemäßen Impfstoffes
aufgeführten
Vektoren in keiner Weise dazu gedacht, den Umfang der vorliegenden
Erfindung zu beschränken.
Weitere geeignete Vektoren sind von kommerziellen Firmen erhältlich,
wozu Invitrogen, Vical und Agracetus gehören, und können leicht von einem Fachmann
hergestellt werden.
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Eine
weitere bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung betrifft einen Anti- Parvovirus-Impfstoff, wobei dieser Impfstoff
mindestens weiteres Antigen enthält
oder der Expressionsvektor mindestens ein weiteres Antigen codiert.
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Dieses
weitere Antigen kann dazu dienen, die Immunantwort auf das Parvovirus-spezifische Epitop
zu verstärken.
In dieser Hinsicht hat das weitere Antigen die Funktion eines Trägerproteins.
Alternativ kann das unterschiedliche Antigen eine Immunantwort gegen
ein anderes Pathogen induzieren und somit dazu dienen, einen multivalenten
Impfstoff zu erzeugen. Es ist auch möglich, dass das weitere Antigen
beide Funktionen erfüllt.
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Es
gibt mehrere Wege, einen Vektor zu entwickeln, welcher mindestens
ein Parvovirus-spezifisches Epitop sowie mindestens ein zusätzliches
Antigen codiert. So kann zum Beispiel die Nucleinsäure, die
das zusätzliche
Antigen codiert, in die Nucleinsäuresequenz
cloniert werden, welche das mindestens eine Parvovirus-spezifische Epitop
codiert. Falls keine geeignete Restriktionsstelle innerhalb dieser
Nucleinsäuresequenz vorhanden
ist, welche das Parvovirus-spezifische Epitop codiert, kann eine
solche Restriktionsstelle mit herkömmlichen Methoden erzeugt werden.
Umgekehrt kann die Nucleinsäuresequenz,
welche das mindestens eine Parvovirus-spezifische Epitop codiert,
in eine DNA-Sequenz cloniert werden, welche das mindestens eine zusätzliche
Antigen codiert. Das so erhaltene Polypeptid kann ein Fusionsprotein
sein. Alternativ können
das mindestens eine Parvovirus-spezifische
Epitop und das mindestens eine zusätzliche Antigen als getrennte proteinhaltige
Einheiten exprimiert werden.
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Aus
den in dem vorhergehenden Paragraphen gemachten Aussagen geht klar
hervor, dass eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung einen
Impfstoff betrifft, wobei es sich bei dem zusätzlichen Antigen um ein Immunogen
handelt.
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Ein
Beispiel für
ein solches Immunogen, von dem es sich herausgestellt hat, dass
es als ein Trägermolekül wirksam
ist, ist das Hepatitis B-Oberflächenantigen
und bevorzugt das menschliche Hepatitis B-Oberflächenantigen-Protein prä-S2.
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Des
Weiteren beschreibt die Patentschrift einen Impfstoff, welcher den
rekombi nanten Vektor pGT36VP1 umfasst. Dieser Vektor umfasst ein
Nucleinsäuremolekül, welches
den vollständigen
offenen Leserahmen von VP1 darstellt. Die genaue Konstruktion dieses
Vektors ist in Beispiel 2 beschrieben.
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In
einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform des Impfstoffes
der vorliegenden Erfindung ist das Nucleinsäuremolekül, welches mindestens ein T-Zell-Epitop codiert, aus
der Gruppe von Epitopen ausgewählt,
die durch die degenerierte Nucleinsäuresequenz
CCNAARATHTTYATHAAYYTNGCNAARAARAARAARGCNGGC;
codiert
ist, wobei N eine beliebige Base bezeichnet, R ein Purin bezeichnet,
Y ein Pyrimidin bezeichnet und H für A, C oder T steht;
und
ist bevorzugt das Epitop, welches durch die Nucleinsäuresequenz
CCGAAAATATTCATCAACCTGGCTAAGAAGAAGAAAGCTGGC.
codiert
ist. In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform
des Impfstoffes der vorliegenden Erfindung ist das Nucleinsäuremolekül, welches
mindestens ein B-Zell-Epitop codiert, aus der Gruppe ausgewählt, welche
durch die degenerierte Nucleinsäuresequenz
TSNGAYGGNGCNGTNCARCCNGAYGGNGGNCARCCNGCNGTNMGN;
codiert
ist, wobei N eine beliebige Base bezeichnet, R ein Purin bezeichnet,
Y ein Pyrimidin bezeichnet, S für G
oder C steht und M für
C oder A steht; und ist bevorzugt das Epitop, welches durch die
Nucleinsäuresequenz
TCAGACGGTGCTGTACAGCCAGATGGAGGACAACCCGCGGTTCGC.
codiert
ist.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
umfasst der erfindungegemäße Impfstoff
ein Gemisch von Nucleinsäuren,
die sowohl T-Zell als auch B-Zell-Epitope codieren.
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Ein
Beispiel dieser Ausführungsform
der Erfindung ist der Fall, dass beliebige der zuvor erwähnten Nucleinsäuremoleküle, welche
das mindestens eine B- und T-Zell-Epitop codieren, in verschiedenen Expressionsvektoren
enthalten sind.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
des Anti-Parvovirus-Impfstoffes der Erfindung enthält der Impfstoff
zusätzlich
ein Adjuvans.
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Adjuvantien
für die
Immunisierung sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und geeignete
Adjuvantien können
zur Formulierung eines Impfstoffes von einem Fachmann mit den Nucleinsäuresequenzen
kombiniert werden, die in den zuvor erwähnten Ausführungsformen beschrieben sind.
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Eine
besonders bevorzugte Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung betrifft einen Impfstoff, wobei es sich
bei dem Adjuvans um ein DNA-Molekül handelt, das unmethylierte
CpG-Motive umfasst.
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Es
ist seit langem bekannt, dass DNA die genetische Information enthält, die
jedes Individuum einzigartig macht. Zusätzlich zu dieser Rolle als
Blaupause der Zelle hat Dr. Arthur Krieg kürzlich einen kurzen Abschnitt
von DNA entdeckt, welcher ein CpG-Motiv genannt wird, der eine starke
Immunaktivierung bewirkt (Nature Band 374: 546 (1995)). DNA mir
CpG-Motiven („CpG-DNA") kann leicht und
kostengünstig
hergestellt und dazu verwendet werden, das Immunsystem selektiv
zu aktivieren. Therapeutische Anwendungen für CpG-DNA-vermittelte Immunaktivierung
schließen
die Erhöhung
der Wirksamkeit von Impfstoffen ein, die Unterstützung des Immunsystems bei
der Zerstörung
von Krebs und die Vorbeugung oder Behandlung von Infektionen. DNA
ist ein natürlicher
Teil des Körpers
und ist möglicherweise
viel sicherer als die Medikamente, die heute eingesetzt werden,
um das Immunsystem zu stärken;
siehe die US-Patentanmeldungen mit den Seriennummern 08/386,063;
08/461,036; 08/462,799.
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Diese
Erfindung kombiniert zum ersten Mal die Verwendung von Plasmid-DNA
als einen Impfstoff mit CpG-enthaltenden Oligonucleotiden, die als
Adjuvans für
den DNA-basierten Impfstoff fungieren.
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Die überlegenen
immunologischen Eigenschaften dieses Impfstoffes sind in den angehängten Beispielen
beschrieben.
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Besonders
bevorzugt ist ein Anti-Parvovirus-Impfstoff, wobei es sich bei dem
die unmethylierten CpG-Motive umfassenden DNA-Molekül um
TCCATGACGTTCCTGATGCT.
handelt.
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In
einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungegemäßen Anti-Parvovirus-Impfstoffes
umfasst das die unmethylierten CpG-Motive umfassende DNA-Molekül ein Phosphorothioat-modifiziertes
Gerüst.
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Die
Phosphorothioat-Modifikation ist besonders vorteilhaft, weil sie
die Leistungsfähigkeit
der unmethylierten CpG-Motive als Adjuvans weiter zu verstärken scheint,
siehe z.B. Krieg et al., a.a.O.
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Mit
dem Impfstoff gemäß der vorliegenden
Erfindung ist es möglich,
eine wirksame Immunisierung zu erreichen, selbst wenn der Impfstoff
nur einmal verabreicht wird.
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Außerdem betrifft
die vorliegende Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen Anti-Parvovirus-Impfstoffes
für die
Impfung von Hundeartigen, Katzenartigen oder Marderartigen, ein
Verfahren zur Impfung von Hundeartigen, Katzenartigen oder Marderartigen
durch die Verabreichung einer geeigneten Dosis des erfindungsgemäßen Impfstoffes
an ein Tier, welches diesen benötigt
sowie die Verwendung der Inhaltsstoffe des hierin vorstehend erwähnten erfindungsgemäßen Impfstoffes
wie z.B. in den verschiedenen Ausführungsformen beschriebenen
Nucleinsäuren
oder Adjuvantien wie z.B. die unmethylierten CpG-Motive oder eine
beliebige Kombination davon zur Herstellung eines Impfstoffes für die Immunisierung
von Hundeartigen, Katzenartigen oder Marderartigen gegen parvovirale
Krankheit.
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Bevorzugt
handelt es sich bei den Hundeartigen, Katzenartigen oder Marderartigen
um Hunde, Katzen oder Nerze. Der Fachmann, hier ein Tierarzt, weiß genau,
welche Dosis und welcher Verabreichungsweg angewandt werden sollte.
Des Weiteren ist er mit der Anzahl der Verabreichungen des Impfstoffes
ebenso vertraut wie mit der optimalen Zeitspanne zwischen primären und
Booster-Impfungen.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
wird der Impfstoff gemäß der Erfindung
für eine Impfprozedur
eingesetzt, in welcher der Impfstoff nur einmal angewandt wird und
zu einer ausreichenden Immunisierung führt („Einzeldosis-immunisierung"".
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Der
erfindungsgemäße Impfstoff
wird bevorzugt über
eine der folgenden Routen verabreicht: intramuskulär durch
Nadel und Spritze, intramuskulär
durch Biojector 2000®, intradermal durch Nadel
und Spritze, intradermal durch Partikelbombardierung, intradermal
durch Skarifizierung, intravenös
oder intraperitoneal.
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Die
Beispiele erläutern
die Erfindung.
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BEISPIEL 1: SYNTHESE VON
ANTIGENISCHEN EPITOPEN DER UNTERGRUPPE DER FELINEN PARVOVIREN
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Synthetische
Desoxyribonuclein-Oligonucleotide wurden mit der Sequenz
AATTCCCCGAAAATATTCATCAACCTGGCTAAGAAGAAGAAAGCTGGC
sowie
dem komplementären
Strang
TCGAGCCAGCTTTCTTCTTCTTAGCCAGGTTGATGAATATTTTCGGGG
hergestellt,
die, wenn man sie aneinander anlagert, Überhänge enthalten, die an eine
EcoRI- und Xho I-Restriktionsstelle binden, und im richtigen Leserahmen
das T-Zell-Epitop
von VP1 PKIFINLAKKKKAG codieren. Diese Oligonucleotide wurden in
die EcoRI- und Xho I-Stellen in der prä-S2-Region des menschlichen
Hepatitis B Oberflächenantigens
in dem Plasmid pCMV-S2S (Michel of al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
92: 5307–5311
(1995)) ligiert, wobei im Verlauf dieses Prozesses der Großteil der
prä-S2-Region
deletiert wurde. Das so erhaltene Konstrukt wurde als pCMVS-VP1e bezeichnet.
Das RNA-Transkript, das von dem CMV-Promotor in diesem Konstrukt
erzeugt wird, enthält
einen offenen Leserahmen mit einem internen Start-Codon (AUG). Wenn
das erste ATG benutzt wird, werden das VP1-Epitop, ein Teil der
prä-S2-Region
und die gesamte S-Region als ein einziges Protein erzeugt. Das interne
AUG erzeugt nur das S-Protein. Auf ähnliche Weise wurden Desoxyribonuclein-Oligonucleotide
mit der Sequenz
AATTCAGACGGTGCTGTACAGCCAGATGGAGGACAACCCGCGGTTCGC
und
dem komplementären
Strang
TCGAGCGAACCGCGGGTTGTCCTCCATCTGGCTGTACAGCACCGTCTG
welche
das Peptidepitop SDGAVQPDGGQPAVR von VP2 codieren, auf die gleiche
Weise wie das VP1-Epitop in pCMV-S2S cloniert. Da so erhaltene Plasmid
wurde als pCMVS-VP2e bezeichnet. Beide DNA-Sequenzen, die diese
Epitope codieren, sind künstliche
Sequenzen und stellen nicht die DNA-Sequenz von natürlich vorkommenden
Parvoviren dar.
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BEISPIEL 2: CLONIERUNG
DES VP1-VP2-GENS VON HUNDE-PARVOVIRUS UND KONSTRUKTION VON PLASMIDEN,
WELCHE PARVOVIRUS-GENE EXPRIMIEREN
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Die
gesamte codierende Region von VP1 von Hundeparvovirus (VP1 und VP2)
wurde mit Hilfe einer Polymerasekettenreaktion-Amplifikation aus
Gewebekultur-Überständen cloniert,
welche CPV vom Typ 2a enthielten. Die Primer lagen gerade außerhalb
des offenen Leserahmens für
VP1, umfassten Not I-(stromabwärts)
und BamHI-(stromaufwärts)Restriktionsstellen
und hatten die folgenden Sequenzen:
cgg gat ccG AGA CGA CTT
GGA TTA AGG TA für
den 5'- oder Stromaufwärts-Primer und gtg cgg
ccg CTA GTT GAT ATG TAA TAA AC für
den 3'- oder Stromabwärts-Primer.
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Das
PCR-Produkt wurde nacheinander mit Not 1 und BamHI gespalten und
in der Sinn-Orientierung in das gleichermaßen gespaltene verdaute bakterielle
Expressionsplasmid pGT36 (Conry et al., Cancer Gene Therapy 2 (1):
33–38
(1995)) ligiert. Die Orientierung und die Sequenz von VP1 (und VP2)
wurden durch DNA-Sequenzierung
der gesamten VP1-Insertion bestätigt.
Diese clonierte DNA wird als pGT36VP1 bezeichnet.
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BEISPIEL 3: EXPRESSION
DES CLONIERTEN PARVOVIRUS-VPI-VP2-GENS IN ZELLKULTUR
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Ein
Maus-Fibroblast (NIH 3T3) wurde mit dem Clon pGT36VP1 transfiziert.
Die Zellen wurden dann mit einem Immunfluoreszenz-Assay mit einem
Hunde-Antiserum gegen Hundeparvovirus auf die Anwesenheit von immunoreaktiven
Proteinen von Hundeparvovirus untersucht. Das Färbungsmuster war nicht unterscheidbar
von Zellen, die mit Hundeparvovirus infiziert waren, wohingegen
Negativkontrollen (pGT36, keine DNA) keine Färbung zeigten, was darauf hinweist,
dass der Clon pGT36VP1 ein Proteinprodukt erzeugte, welches von
Anti-Parvovirus-Antikörpern
erkannt wurde.
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BEISPIEL 4: IMMUNISIERUNG
VON HUNDEN MIT PARVOVIRUS (EPITOP)-NUCLEINSÄURE-IMPFSTOFFEN
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Drei
11 Wochen alte Welpen wurden mit 150 μg pCMVS-VP1e und 100 μg des synthetischen
Phosphorothioat-Oligonucleotids TCCATGACGTTCCTGATGCT (ISO) in den
rechten Quadrizeps-Muskel immunisiert, drei 11 Wochen alte Welpen
wurden mit 150 μg
pCMVS-VP2e und 100 μg
ISO immunisiert, und drei 11 Wochen alte Welpen wurden mit 150 μg pCMVS-VP1e,
150 μg pCMVS-VP2e
und 100 μg
ISO immunisiert. Man gab den Welpen drei Wochen später eine
Boosterimpfung mit identischen Dosen und verfolgte die Entwicklung
von Antikörpertitern
gegen das Trägerprotein,
das Hepatitis B Oberflächenantigen
und die Hundeparvovirus-Epitope. Es war eine signifikante Antikörperreaktion
sowohl gegen Hepatitis als auch gegen Hundeparvovirus in den Tieren
in den pCMVS-VP1e plus pCMVS-VP2e- und in den pCMVS-VP2e-Gruppen
zu sehen. Bei pCMVS-VP1e erwartete man keine Antikörperreaktion
gegen Hundeparvovirus, da dies ein T-Zell-Epitop darstellt. Diese
Erwartung wurde experimentell bestätigt. Die Reaktion war am höchsten in
der pCMVS-VP1e plus pCMVS-VP2e, was darauf hinweist, dass der multivalente
Impfstoff wirksamer war.
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BEISPIEL 5: IMMUNISIERUNG
VON TIEREN MIT EINER NUCLEINSÄURE,
WELCHE DIE PARVOVIRUS-GENE VP1 UND VP2 EXPRIMIERT
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- (a) Eine von drei BALB/c-Mäusen, die mit pGT36VP1 immunisiert
worden waren, zeigte eine Woche nach einer Partikel-Bombardierung
mit 1 μg
des Plasmids eine Immunreaktion, speziell eine Antikörperreaktion gegen
Hundeparvovirus.
- (b) Drei junge Beagle-Hunde (in einem Alter von ungefähr 6 Monaten)
ohne Anti-Hundeparvovirus-Antikörpertiter
wurden mit 150 μg
pGT36VP1 und 100 μg
ISO in den rechten Quadrizeps-Muskel immunisiert. In einem Tier
entwickelten sich signifikante Anti-Hundeparvovirus-Antikörperreaktionen,
beginnend innerhalb von zwei Wochen nach der Immunisierung, die
für mindestens
drei Wochen in allen drei Tieren weiterstiegen. Ein Kontroll-Beagle, dem man Vektor-DNA
und ISO injiziert hatte, zeigte keinen Anstieg des Antikörpertiters.
- (c) Sechs junge Hunde ohne Anti-Hundeparvovirus-Antikörpertiter
wurden mit 400 μg
pGT36VP1 in den rechten Quadrizeps-Muskel immunisiert. Drei dieser
Hunde erhielten zusätzlich
400 μg DNA
aus E. coli als ein immunstimulierendes Adjuvans, welche zusammen
mit dem pGT36VP1 verabreicht wurde. Alle sechs Hunde zeigten eine
Anti-Parvovirus-Antikörperreaktion
innerhalb von zwei Wochen nach der Immunisierung, welche in 3 bis
5 Wochen Titer erreichte, die signifikant über denen lagen, von denen
bekannt ist, dass sie einen Schutz bieten. Die drei Hunde, welche
immunstimulierende DNA erhielten, erreichten höhere Antikörpertiter schneller als die
anderen Hunde, was auf einen positiven immunstimulierenden Effekt
von CpG hinweist.
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BEISPIEL 6: SCHUTZ VON
HUNDEN, DIE MIT EINEM NUCLEINSÄURE-IMPFSTOFF
IMMUNISIERT WURDEN, DER DIE PARVOVIRUS-GENE VP1 UND VP2 EXPRIMIERT,
VOR EINER BELASTUNGSINFEKTION MIT HUNDEPARVOVIRUS
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- (a) Die drei in Beispiel 5 immunisierten Beagle-Hunde
wurden über
die intranasale Route einer Belastungsinfektion mit einer trivalenten
Standarddosis von Hundeparvovirus ausgesetzt, welche in Parvovirus-Impfversuchen
verwendet wurde. Keiner der Hunde zeigte irgendwelche Anzeichen
einer Parvovirus-bedingten Erkrankung, was auf einen Schutz vor
der Krankheit hinwies. Zwei Hunde zeigten, in Übereinstimmung mit dem Trend
vor der Belastungsinfektion, eine leichte Erhöhung der Anti-Hundeparvovirus-Antikörperreaktionen
ohne ein Ausscheiden von Parvovirus im Kot, was auf einen vollständigen Schutz
vor der Infektion hindeutet. Der Kontroll-Beagle zeigte nach der
Belastungsinfektion Zeichen einer parvoviralen Krankheit, begleitet
von einem dramatischen Anstieg der Anti-Hundeparvovirus-Antikörperreaktion.
- (b) Vier junge Hunde ohne Anti-Hundeparvovirus-Antikörpertiter
wurden intramuskulär
mit Dosen von pGT36VP1 immunisiert, die 200, 400, 600 und 800 μg des Plasmids
enthielten. Alle Hunde entwickelten innerhalb einer Woche Anti-Hundeparvovirus-Antikörper, die
innerhalb von zwei Wochen einen Spitzenwert von schützenden
Titern erreichten. Ein Hund als Negativkontrolle, dem Kochsalzlösung injiziert
worden war, zeigte keinen Anti-Hundeparvovirus-Antikörper. Der
Hund, der 600 μg
Plasmid-DNA erhielt, erhielt einen Antikörpertiter länger als die anderen Hunde
aufrecht. Allen Hunden injizierte man 16 Wochen nach der anfänglichen
Injektion wieder die gleiche Zubereitung und Dosis. Alle Hunde mit
Ausnahme der Negativkontrolle und der 200 μg-Dosis zeigten eine anamnestische
Antikörperreaktion.
Alle Hunde mit Ausnahme der Negativkontrolle, aber einschließlich der
200 μg-Dosis
zeigten nach der wiederholten Injektion neutralisierende Antikörpertiter
im Serum, von denen bekannt ist, dass sie einen Schutz bieten. Alle
Hunde wurden 24 Wochen nach der anfänglichen Injektion einer Belastungsinfektion
mit einem virulenten Straßenvirus ausgesetzt,
welcher drei Virusisolate enthielt, von denen bekannt war, dass
sie in nicht immunisierten Hunden eine Erkrankung verursachen. Alle
Hunde, die mit dem pGT36VP1-Nucleinsäureimpfstoff immunisiert worden
waren, waren vor einer Infektion und vor Krankheit geschützt. Der
Hund der Negativkontrolle hatte eine für Hundeparvovirus typische
klinische Krankheit und schied Virus mit dem Stuhl aus. Dieses Experiment
zeigt, dass Dosen von pGT36VP1 in einem Bereich von 200 bis 800 μg Plasmid,
welche als primäre und
als Booster-Injektion gegeben wurden, die Produktion von Antikörpertitern
stimulierten und gegen eine virulente Belastungsinfektion Schutz
boten.
- (c) Drei jungen Hunden ohne Anti-Hundeparvovirus-Antikörpertiter
injizierte man 150 μg
pGT36VP1 plus 150 μg
Oligonucleotid-DNA, die so synthetisiert wurde, dass sie optimale
CpGs enthielt. Alle Hunde entwickelten Anti-Hundeparvovirus-Antikörper und
waren vor einer Belastungsinfektion mit virulentem Virus geschützt. Dieses
Experiment zeigt, dass eine Immunisierung mit einer geringeren Dosis
von pGT36VP1 eine Schutz bietende Immunität verleiht, wenn die Immunisierung
durch immunstimulierende Oligonucleotide amplifiziert wird.
- (d) Sechs jungen Hunden ohne Anti-Hundeparvovirus-Antikörpertiter
injizierte man eine Einzeldosis von 200 oder 800 μg pGT36VP1.
Alle Hunde entwickelten anfänglich
Anti-Hundeparvovirus-Antikörpertiter,
welche 12 Wochen nach der Immunisierung auf nicht nachweisbare Spiegel
abfielen. Ohne eine Booster-Injektion zu geben wurden alle Hunde
einer Belastungsinfektion mit virulentem Virus ausgesetzt und keiner wurde
infiziert oder erkrankte. Dieses Experiment zeigt, dass eine Schutz
bietende Immunität
nach einer Einzeldosis von pGT36VP1 erreicht wird, und dass dieser
Schutz unabhängig
von dem Vorhandensein von messbarem Anti-Hundeparvovirus-Antikörper ist.
Dieses Ergebnis lässt
sich so deuten, dass es auf eine zelluläre Immunität zurückzuführen ist, welche durch langlebige
immunologische Gedächtnis-T-Zellen
verliehen wird.
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Diese
Studien zeigen, dass ausgewählte
DNA-Sequenzen aus der Untergruppe der felinen Parvoviren Zellen
in Kultur und in Tieren transfizieren können, wenn man sie in ein Säuger-Expressionsplasmid
einsetzt. Darüber
hinaus ist gezeigt worden, dass unsere DNA-Expressionsplasmide eine
Antikörperreaktion
in Tieren hervorrufen können,
welche zu einem Schutz gegen eine Belastungsinfektion mit virulentem
Virus führen
kann. Annex SEQUENZPROTOKOLL
