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TECHNISCHES
GEBIET
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Impfstoffformulierung zur prophylaktischen
oder therapeutischen Immunisierung von Wirbeltieren gegen Tollwut.
Die Impfstoffzusammensetzung weist ein Minimum an zwei Komponenten
auf, wobei eine Komponente einen Desoxyribonucleotid-(DNA-)Impfstoff
darstellt, der ein DNA-Molekül
umfasst, das für
ein Virusoberflächenglykoprotein
kodiert, und die andere Komponente aus einer inaktivierten Form
des Virus besteht. Die durch die gemeinsame Verabreichung dieser
beiden Komponenten induzierte schützende Immunantwort ist besser
als jene, die durch alleiniges Verabreichen der einzelnen Komponenten
induziert wird. Folglich kann diese Erfindung verwendet werden,
um einen Kombinationsimpfstoff zu entwickeln, der aus einem DNA-Impfstoff
und einem inaktivierten Virus besteht. In einem weiteren Aspekt
kann diese Erfindung verwendet werden, um kostengünstige Impfstoffe
auf Basis von inaktivierten Viren zu entwickeln, die eine weitaus
geringere Menge des Virus aufweisen, als dies bei ähnlichen
Impfstoffen nach dem Stand der Technik gegenwärtig der Fall ist.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Seit
Edward Jenner vor mehr als 200 Jahren als Erster eine erfolgreiche
Impfstrategie gegen Pocken dokumentiert hat, hat sich die Impfstoffentwicklung
stark verändert.
Die erste Impfstoffgeneration umfasste die Verwendung von abgeschwächten, inaktivierten
oder Lebendpathogenen als Impfstoffe, und diese Impfstoffart trug
hauptsächlich
dazu bei, dass Krankheiten wie Kinderlähmung, Pocken, etc. ausgerottet
wurden. Der rasante Fortschritt in der tierischen Zellkulturtechnologie
führte
zur Entwicklung von Impfstoffen auf Zellkulturbasis, worin die pathogenen
Organismen industriell kultiviert, gereinigt, inaktiviert und als
Impfstoffe verwendet wurden. Die Verwendung von Viren auf Basis
von Totvakzinen bzw. inaktivierten Impfstoffen bei Krankheiten, wie
z.B. Kinderlähmung,
Tollwut, Masern, etc., ist weit verbreitet. Bei diesem Impfverfahren
wird das Virus dem Immunsystem in nicht-infizierender Form zugeführt, sodass
das jeweilige Individuum eine Immunantwort dagegen aufbauen kann.
Viren auf Basis von Totvakzinen bzw. inaktivierten Impfstoffen stellen
Schutz bereit, indem sie direkt T-Helferzellen und humorale Immunantworten
gegen Immunogene des Virus produzieren. Dennoch wird bei dieser
Impfform keine zellvermittelte Immunantwort durch zytotoxische T-Lymphozyten
(CTL) hervorgerufen, da das Virus nicht repliziert oder einen Infektionszyklus
durchläuft.
In Abwesenheit einer effizienten CTL-Antwort verleihen diese Impfstoffe
häufig
keinen vollständigen
Schutz gegen Pathogene. Ein weiteres Hauptproblem in Zusammenhang
mit Impfstoffen auf Basis von Totvakzinen oder inaktivierten Viren
liegt in den hohen Herstellungskosten. Obwohl für Krankheiten wie etwa Tollwut
mehrere solcher inaktivierten Virusimpfstoffe auf Gewebekulturbasis
verfügbar
sind, gelten diese Impfstoffe aufgrund der hohen Herstellungskosten
des Virus in hohen Titern in vielen Teilen der Welt als unwirtschaftlich,
insbesondere in Entwicklungsländern,
wo die Nachfrage nach Impfstoffen auf Basis von inaktivierten Viren
das Angebot weit übersteigt.
Somit liegt ein Hauptnachteil dieser Impfstofftypen in deren hohen
Herstellungskosten und der Schwierigkeit, sie in großen Mengen
herzustellen. Strategien, die darauf abzielen, die Menge des inaktivierten
Virus in der Impfstoffformulierung zu verringern ohne dabei die
Impfstoffpotenz zu verschlechtern, können die Herstellungskosten
von Impfstoffen auf Basis von inaktivierten Viren verringern. Folglich
besteht die Notwendigkeit, neuartige Impfstoffe zu entwickeln, die
alle oder einige in Zusammenhang mit Impfstoffen auf Basis von inaktivierten
Viren stehenden Nachteile beseitigen können.
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Der
Verwendung von Plasmid-DNA als Impfstoff kommt dabei eine wichtige
Rolle zu, da diese zu sehr geringen Kosten hergestellt und bei Raumtemperatur
gelagert werden kann. In der von Wolff et al. durchgeführten Ausgangsstudie über "Plasmid- oder Nackt-" DNA-Impfungen in
vivo wurde gezeigt, dass die direkte intramuskuläre Impfung von Plasmid-DNA,
die für
mehrere unterschiedliche Reportergene kodiert, eine Proteinexpression
in den Muskelzellen (1) induzieren könnte. Diese Studie lieferte
eine gute Grundlage für
die Annahme, dass gereinigte, rekombinante Nucleinsäuren ("nackte DNA") in vivo abgegeben
werden und eine Proteinexpression steuern können. Diese Beobachtungen wurden
in einer Studie von Tang et al. (2) fortgesetzt, worin demonstriert
wird, dass Mäuse,
denen hGH-kodierende Plasmid-DNA injiziert wurde, Antigen-spezifische
Antikörperantworten
auslösen
konnten. In darauf folgenden Studien zeigten Ulmer et al. (3) und
Robinson et al. (4), dass DNA-Impf stoffe Mäuse bzw. Hühner vor einer Grippeinfektion
schützen
konnten, was ein bemerkenswertes Beispiel dafür darstellt, wie DNA-Impfungen
schützende
Immunität
verleihen könnten.
Die Studie an Mäusen
zeigte zudem, dass sowohl Antworten von Antikörpern als auch zytotoxischen
CD8
+ T-Lymphozyten (CTL) bewirkt wurden
(3,4), die mit den DNA-Impfstoffen übereinstimmen, welche sowohl
die humorale als auch die zelluläre
Immunität
stimulieren. Darauf folgten mehrere Berichte, die in Versuchsmodellen
die Nützlichkeit
von DNA-Impfstoffen zur Induktion von schützenden Immunantworten gegen
mehrere Infektionskrankheiten, einschließlich Krebs, aufzeigten. Wie
aus mehreren zu dieser Thematik veröffentlichten Büchern (5
bis 9) und Rezensionen (10 bis 38) hervorgeht, ist die Literatur
auf dem Gebiet der Erfindung hinsichtlich DNA-Impfstoffen reichhaltig.
Eine Website, die sich mit DNA-Impfstoffen beschäftigt, bietet auch wertvolle
Informationen über
den auf diesem Gebiet erbrachten Fortschritt (39). Zudem sind auch
Leitlinien zur Verwendung von DNA-Impfstoffen in klinischen Versuchen
an Tieren und Menschen verfügbar
(40). Andere nützliche Informationen
zum besseren Verständnis
und zur praktischen Umsetzung der DNA-Impfstofftechnologie liegt in
folgenden Patenten vor:
US05580859 ,
US05589466 ,
US05620896 ,
US05736524 ,
US05939400 ,
US05989553 ,
US06063385 ,
US06087341 ,
US06090790 ,
US06110898 ,
US06156322 ,
US05576196 , 5707812,
US5643578 ,
US0557619 ,
US0570781 ;
US05916879 ,
US05958895 ,
US05830876 ,
US05817637 ,
US6133244 ,
US6020319 ,
US5593972 , WO00/24428, WO99/51745,
WO99/43841, WO99/388880, WO99/02132, WO98/14586, WO98/08947, WO98/04720,
WO00/77188, WO00/77043, WO00/77218, WO0077188, WO00037649, WO00044406,
WO09904009, WO00053019, WO00050044, WO00012127, WO09852603, WO9748370
und WO097730587. Das umfangreiche Literaturangebot an DNA-Impfstoffen weist
darauf hin, dass DNA-Impfstoffe bei der Prävention und Behandlung mehrerer
infektiöser
Krankheiten, einschließlich
Krebs, viel versprechende Impfstoffe darstellen. Die allgemeine
Anwendbarkeit von DNA-Impfstoffen zur Induktion von Schutzimmunitäten wurde
in mehreren Tierversuchsmodellen festgestellt, was zur Phase I der
menschlichen klinischen Versuche führte. Die in den letzten Jahren
durchgeführten
Studien deuten darauf hin, dass bei bestimmten Krankheiten die DNA-Impfung
allein nicht den gewünschten
Effekt erzielt; bei einer Kombination mit anderen prophylakti schen
oder therapeutischen Maßnahmen
können
die gewünschten Ergebnisse
jedoch erzielt werden. Eine solche Maßnahme, die nach dem Stand
der Technik als "Prime-Boost-Strategie" bezeichnet wird,
umfasst die Verabreichung eines DNA-Impfstoffs, um das Immunsystem zu "primen", gefolgt von der
Verabreichung eines rekombinanten Proteins oder von Lebendimpfstoffen
oder Impfstoffen auf Basis von inaktivierten Pathogenen, um das
Immunsystem zu "boosten" (41 bis 59). Außer der Prime-Boost-Strategie
werden im Stand der Technik mehrere andere Strategien zur Verbesserung
der Potenz von DNA-Impfstoffen beschrieben. Diese umfassen:
- 1. Co-Impfung mehrfacher Plasmide, die unterschiedliche
Antigene eines Pathogens exprimieren, oder Plasmide, die mehrere
Epitope unterschiedlicher Antigene eines Pathogens exprimieren (60
bis 71).
- 2. Co-Impfung von Plasmiden, die für Cytokine oder co-stimulierende
Moleküle
kodieren, und Plasmiden, die Antigene von Interesse exprimieren
(72 bis 94).
- 3. Einschluss bestimmter Verbindungen, wie z.B. Saponine, Alaun,
Chitosan, Liposome, kationische Lipide, etc., in die DNA-Impfstoffpräparate (95
bis 106).
- 4. Einschluss spezifischer Sequenzen, die in der Plasmid-DNA
als CpG-Motive bezeichnet werden (107 bis 117).
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Zudem
wurde eine Reihe von Strategien zur Modifizierung des Plasmidvektors
und/oder des Gens, welches für
das Antigen kodiert, angeführt,
um die Potenz von DNA-Impfstoffen
zu verbessern (118 bis 136). Folglich gibt es einen gewissen Raum
zur Entwicklung von neuartigen Zusammensetzungen, die die Potenz von
DNA-Impfstoffen verbessern können.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Diese
Erfindung beschreibt ein neuartiges Verfahren zur Verbesserung der
Potenz von DNA-Tollwutimpfstoffen durch Zugabe geringer Mengen an
inaktiviertem Virus zum DNA-Impfstoffpräparat. In einer Ausführungsform
kann diese Erfindung zur Entwicklung von Kombinationsimpfstoffen
führen,
die einen DNA-Impfstoff und ein inaktiviertes Virus aufweisen. In
einer anderen Ausführungsform
kann diese Erfindung zur Entwicklung von Impfstoffen führen, die
viel geringere Mengen an inaktiviertem Virus aufweisen, als dies
in herkömmlichen
Impfstoffen auf Basis von inaktivierten Viren der Fall ist. Diese
Erfindung beschreibt auch ein Verfahren zur Herstellung einer neuartigen
Impfstoffzusammensetzung gegen das Tollwutvirus.
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KURZE BESCHREIBUNG DER
FIGUREN
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1 ist
eine schematische Darstellung des DNA-Tollwutimpfstoffplasmids (pCMV-Rab), welches für das Tollwutvirusoberflächenglykoprotein
kodiert.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung beschreibt eine Tollwutimpfstoffformulierung
zur Verwendung bei der Immunisierung von Wirbeltieren gegen Tollwut
unter Verwendung einer Impfstoffformulierung, die DNA-Sequenzen umfasst,
welche für
das Oberflächenglykoprotein
von Tollwutviren und inaktivierten Tollwutviren kodieren. Das in
der vorliegenden Erfindung beschriebene Verfahren kann verwendet
werden, um einen Kombinationsimpfstoff zu entwickeln, der hauptsächlich aus
inaktiviertem Virus und einer Plasmid-DNA besteht, die für ein oder mehrere
Polypeptide des Virus kodiert. Die aus inaktiviertem Tollwutvirus
und DNA-Impfstoff bestehende Impfstoffformulierung weist eine viel
höhere
Potenz als jene Formulierungen auf, die über ein inaktiviertes Virus allein
oder einen DNA-Impfstoff allein verfügen, und zwar in Mengen, die
im Kombinationsimpfstoff vorliegen. Für alle Ausführungsformen der vorliegenden
Erfindung gilt, dass die Impfstoffformulierung keine Lebendviren oder
abgeschwächte
Viren enthält.
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Die
in vorliegender Erfindung beschriebene Potenz bezieht sich auf die
Fähigkeit
von Impfstoffen, Virus-neutralisierende Antikörper zu induzieren und/oder
den immunisierten Wirt gegen eine nachfolgende Virus-Provokation
zu schützen.
In einer Ausführungsform
wird die Potenz des Tollwutimpfstoffs durch Messung des Titers zur
Antikörperneutralisierung
des Tollwutvirus im Serum von immunisierten Tieren mittels eines
Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test bzw. RFFIT (137) bewertet.
In einer weiteren Ausführungsform
wird die Potenz des Tollwutimpfstoffs anhand der Ausmaßes an Schutz
bewertet, der im immunisierten Wirt gegen eine Tollwutvirus-Provokation verliehen
wird.
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Die
in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Impfstoffe auf Basis
von inaktivierten Viren können durch
Zell-/Gewebekulturverfahren unter Verwendung von allen _ nach dem
Stand der Technik bekannten Wirbeltieren-Zelllinien hergestellt
werden. Beispielsweise können
Tollwutimpfstoffe auf Basis von inaktivierten Viren unter Verwendung
von Wirbeltierenzellen in Kulturen hergestellt werden, die in folgenden
US-Patenten beschrieben
sind: 3.423.505, 3.585.266, 4.040.904, 3.769.415, 4.115.195, 3.397.267,
4.664.912 und 4.726.946. In einer Ausführungsform wurde ein aus Hühnerembryozellen
hergestellter gereinigter Hühnerembryozellen-Tollwutimpfstoff
(PCEC) in Kombination mit DNA-Tollwutimpfstoff verwendet. In einer
weiteren Ausführungsform
wurde ein aus Verozellen hergestellter gereinigter Verozellen-Tollwutimpfstoff
(PVRV) in Kombination mit DNA-Tollwutimpfstoff verwendet. In einer
weiteren Ausführungsform
wurden die Hamsterbabynierenzellen (BHK) als Quelle für ein inaktiviertes
Tollwutvirus verwendet. Darüber
hinaus werden die erfindungsgemäßen Verfahren
als geeignet zur Immunisierung von Wirbeltierspezies, wie z.B. der
Spezies der Murinae, der Spezies der Caninae, der Spezies der Ovinae
oder Menschen, angesehen. In einer Ausführungsform ist die Spezies
der Murinae eine Maus. In einer weiteren Ausführungsform ist die Spezies
der Caninae ein Hund. In eine weiteren Ausführungsform ist die Spezies
der Bovinae ein Rind.
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Die
Menge an inaktiviertem Virus im Kombinationsimpfstoff kann je nach
Immunogenität
und Potenz der Formulierungen auf Basis inaktivierter Viren stark
variieren. In einer Ausführungsform
beträgt
die Menge an inaktiviertem Tollwutvirus im Kombinationsimpfstoff
600 Mal weniger als jene in Gewebekultur-Tollwutimpfstoffen nach
dem Stand der Technik vorliegende Menge. Die in Kombination mit
dem DNA-Tollwutimpfstoff zu verwendende Menge an inaktiviertem Tollwutvirus
wurde bezogen auf die vorsichtige Titration unterschiedlicher Verdünnungen
des Tollwutimpfstoffs auf Basis von inaktivierten Viren ermittelt.
Die Dosis, die nicht ausreichte, um einen merklichen Grad an VNA
im immunisierten Wirt zu induzieren, und/oder die keinen 100%igen Schutz
nach einer Tollwutvirus-Provokation verleihen konnte, wurde als jene
in Kombination mit dem DNA-Impfstoff zu verwendende Dosis ausgewählt, um
einen Kombinationsimpfstoff mit höherer Potenz zu entwickeln.
Fachleuten auf dem Gebiet der Herstellung von Tollwutimpfstoffen
ist klar, dass die in der Impfstoffformulierung vorzuliegende Endkonzentration
des inaktivierten Tollwutvirus und der Plasmid-DNA anhand von nach
dem Stand der Technik beschriebenen Vorschriften bestimmt werden
soll; dafür
kommen beispielsweise jene in der US-amerikanischen oder britischen
Pharmakopöe
erwähnten
in Frage, und zwar unter Verwendung von Impfstoffstandards, die
der Weltgesundheitsbehörde
(WHO) entnommen sind.
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Die
in der vorliegenden Erfindung verwendete Plasmid-DNA bezieht sich
auf extrachromosomale, kovalente, ringförmige DNA-Moleküle, die
zur autonomen Replikation in Bakterienzellen fähig sind und aus Transkriptionseinheiten
(nämlich
Polypeptid-kodierende Nucleotidsequenzen) bestehen, die jenen im
Virus von Interesse ähnlich
oder damit ident sind, und operabel mit Transkriptional- und Translational-Regulationssequenzen
verbunden sind, die zur Expression von Proteinen in Wirbeltierzellen
erforderlich sind.
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Die
Transkriptionseinheit des in der vorliegenden Erfindung beschriebenen
Plasmids kann jede beliebig große
Anzahl an bekannten eukaryotischen Promotoren aufweisen, wie z.B.
jene, die in Genomen von tierischen Viren und Tieren, einschließlich Menschen,
vorliegen. Zudem kann die Transkriptionseinheit eine DNA aufweisen,
die Polypeptide von Wirbeltierpathogenen aufweist, wie z.B. Viren,
Bakterien, Parasiten, etc. Die Transkriptionseinheit besteht aus
einer DNA, die für
das Oberflächenglykoprotein
von Tollwutviren kodiert.
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Die
Einführung
von DNA, die für
Polypeptide von Wirbeltierpathogenen kodiert, in Plasmide kann mittels
jeder beliebigen im Stand der Technik beschriebenen Vorschrift durchgeführt werden
(138). Zudem können Verfahren
zur Einführung
solcher Plasmide in Bakterien, das Kultivieren in einem Nährmedium
und die Reinigung der Plasmide aus Bakterienkulturen unter Verwendung
jedes beliebigen nach dem Stand der Technik bekannten Vorgangs durchgeführt werden
(138, 139).
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Im
Folgenden sind Beispiele zur Veranschaulichung der verschiedenen
Aspekte der vorliegenden Erfindung angeführt. Diese Beispiele dienen
nur zur Veranschaulichung und keineswegs als Einschränkung der übrigen Offenbarung.
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Beispiel 1: Herstellung
und Reinigung von DNA-Tollwutimpfstoff
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Das
DNA-Tollwutimpfstoffplasmid wurde wie folgt konstruiert. Der unmittelbar
frühe Cytomegalievirus-Promotor
und das Intron wurden aus dem pCMVintBL-Plasmid durch Verdau mit
den Restriktionsenzymen HINDIII und PstI isoliert (140) und an den
HindIII- und PstI-Stellen des pEGFPI-Plasmids geklont (Clontech, CA,
USA), um ein pCMVEGFP-Konstrukt zu erhalten. Die Tollwutvirus-Oberflächenglykoprotein
kodierende cDNA wurde als ein BgIII-Restriktionsfragment aus dem
ptg155-Vektor (141) isoliert und in eine BamHI-Stelle von pCMVEGFP
geklont. Schließlich
wurde die EGFP kodierende cDNA als SbaI-NotI-Fragment herausgeschnitten
und der Vektor religiert, um ein pCMVRab-Konstrukt zu erhalten.
Bei der Konstruktion von pCMVRab wurden nach dem Stand der Technik
beschriebene DNA-Standardrekombinationstechniken (138) angewandt. Das
schematische Diagramm von pCMVRab ist in 1 dargestellt.
Mittels alkaliner Lyse wurde eine großtechnische Isolierung und
Reinigung des pCMVRab durchgeführt
(138, 139). Das Endplasmidpräparat
wurde in Kochsalzlösung
(0,15 M NaCl) gelöst
und als DNA-Tollwutimpfstoff verwendet. Fachleuten auf dem Gebiet der
Herstellung von eukaryotischen Expressionsplasmiden ist klar, dass
zur Entwicklung von DNA-Tollwutimpfstoffplasmiden mehrere Veränderungen
des obigen Protokolls möglich
sind. Beispielsweise kann die Tollwutglykoprotein kodierende cDNA
aus anderen Tollwutvirussträngen
stammen, wie z.B. Challenge Virus Standard (CVS), Street-Alabama-Dufferin
(SAD), Evelyn Rokitniki Abelseth (ERA), etc. Auf ähnliche
Weise kann der Cytomegalovirus-Promotor aus mehreren handelsüblichen
eukaryotischen Expressionsplasmiden erhalten werden.
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Beispiel 2: Herstellung
von Tollwutimpfstoff auf Basis von inaktivierten Viren aus Gewebekulturen
von Wirbeltierzellen
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Der
Tollwutimpfstoff auf Basis von inaktivierten Viren kann mittels
jedes beliebigen, Verfahrens nach dem Stand der Technik hergestellt
werden, wie die in folgenden US-Patenten beschriebenen: 3.423.505, 3.585.266,
4.040.904, 3.769.415, 4.115.195, 3.397.267, 4.664.912 und 4.726.946.
Kurz gefasst werden Wirbeltierzellen, wie z.B. Verozellen, Babyhamsternierenzellen
(BHK), etc. mit dem Tollwutvirus infiziert. Das Virus wird von den
Zellbruchstücken
mittels Filtrieren getrennt und anschließend durch Zugabe von β-Propiolacton oder
Bromethylenimin inaktiviert. Das Virus wird sodann konzentriert
und ein Teil davon durch Impfung der sensitiven Monoschichtzellkulturen
und intrazerebrale Impfung von Mäusen
auf Nichtansteckungsgefahr durch infektiöse Viren untersucht. Das konzentrierte
Viruspräparat
wird mit Hilfsmitteln, wie z.B. Aluminiumhydroxid (3 mg pro Dosis),
vermischt und der flüssige
Impfstoff zur Impfung von Tieren verwendet. Alternativ dazu wird
das Virus mittels Zonenzentrifugation weitergereinigt, gefolgt von
Lyophilisierung in Gegenwart von Verbindungen wie etwa menschlichem
Serumalbumin Maltose etc., und das lyophilisierte Präparat wird
als Tollwutimpfstoff verwendet. In einer Ausführungsform wurde der aus dem
von Indian Immunologicals Ltd, Hyderabad, Indien hergestellte und
als Abhayrab® bekannte
Tollwutimpfstoff, der aus gereinigten Verozellen stammt, als Quelle für den Tollwutimpfstoff
auf Basis von inaktivierten Viren verwendet. In einer weiteren Ausführungsform
wurde der von Hoechst Marion Roussel, Indien, hergestellte und als
Rabipur® bekannte
Tollwutimpfstoff, der aus gereinigten Hühnerembryozellen (PCEC) stammt,
als Quelle für
den Tollwutimpfstoff auf Basis von inaktivierten Viren verwendet.
In einer weiteren Ausführungsform
wurde der von Indian Immunologicals Ltd, Hyderabad, Indien, hergestellte
und als bekannte veterinäre
Tollwutimpfstoff, der aus Babyhamsternierenzellen (BHK) stammt,
als Quelle für
den Tollwutimpfstoff auf Basis von inaktivierten Viren verwendet.
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Beispiel 3: Herstellung
eines Kombinationsimpfstoffs bestehend aus einem inaktivierten Tollwutvirus
und einem DNA-Tollwutimpfstoff
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Die
Tollwutimpfstoffe auf Basis von inaktivierten Viren, wie z.B. Abhayrab®,
Raksharab® oder
Rabipur®, wurden
mit einer Kochsalzlösung
625fach verdünnt,
und 0,5 ml der verdünnten
Probe wurden mit 100 μg DNA-Tollwutimpfstoff
vermischt und das Gemisch als Kombinationstollwutimpfstoff zur Immunisierung
von Mäusen,
Hunden oder Vieh eingesetzt. Bei Bedarf wurde Aluminiumhydroxid
in einer Endkonzentration von 3,0 mg pro Dosis zugesetzt. Das Endimpfstoffpräparat kann
auch Konservierungsstoffe, wie z.B. Thiomersol (0,015 %), aufweisen
und entweder als Flüssigimpfstoff
oder als lyophilisiertes Präparat
verwendet werden.
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Beispiel 4: Potenz des
DNA-Tollwutimpfstoffs, des Tollwutimpfstoffs auf Basis von inaktivierten
Viren und des Kombinationsimpfstoffs, der aus inaktiviertem Tollwutvirus
und DNA-Impfstoff besteht, untersucht mittels eines Tollwutvirus-Provokationsversuchs
an Mäusen
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Die
Potenz des DNA-Tollwutimpfstoffs wurde in einem peripheren Tollwutvirus-Provokationsversuch an
Mäusen
untersucht. Eine Gruppe von zehn Mäusen wurde mit 100 μg DNA-Tollwutimpfstoff
zweimal pro Maus in zweiwöchigen
Intervallen geimpft. Zwei Wochen nach Verabreichung der zweiten
Dosis wurden die Mäuse
mit einem virulenten Tollwutvirus des Standardprovokationsvirusstrangs
(CVS) in den Fußballen
geimpft und 14 Tage lang beobachtet. Die in Tabelle 1 angeführten Ergebnisse
deuten darauf hin, dass nur 80 % der mit dem DNA-Tollwutimpfstoff
geimpften Mäuse
vor einer Tollwutvirusprovokation geschützt sind. Die Erfinder müssen deshalb
herausfinden, ob Zusatz geringer Mengen an inaktiviertem Tollwutvirus
zum DNA-Tollwutimpfstoffpräparat zu
einem höheren
Schutz führen
kann. Vor der Zugabe des inaktivierten Tollwutvirus zum DNA-Impfstoff
untersuchten die Erfinder in einem Tollwutvirus-Provokationsversuch
an Mäusen
die Potenz von Abhayrab®, einem aus Verozellen
hergestellten Tollwutimpfstoff auf Basis von inaktivierten Viren.
Zu jeder der Abhayrab®-Ampullen (> 2,5 IU) wurden 200 μl Kochsalzlösung zugesetzt
und jede der Mäuse
in einer Gruppe von zehn Mäusen
wurde intramuskulär
mit 0,1 ml des Impfstoffs geimpft. Es wurden zudem fünffache
Verdünnungen
von Abhayrab® (1:5,
1:25, 1:125, 1:625) hergestellt und 0,1 ml jedes der verdünnten Abhayrab®-Präparate pro
Maus auf intraperitonalem Weg injiziert. Die Immunisierungen wurden
14 Tage später
wiederholt. Die Mäuse
wurden in die Fußballen
mit einem virulenten Tollwutvirus des CVS-Strangs zwei Wochen nach
Verabreichung der zweiten Dosis geimpft und 14 Tage lang beobachtet.
Die in Tabelle 1 angeführten
Ergebnisse deuten darauf hin, dass der unverdünnte Abhayrab®-Impfstoff
sowie der 5-, 25-, oder 125fach verdünnte Impfstoff einen 100%igen
Schutz gegen eine Tollwutvirusprovokation verleiht. Folglich wurden
diese Verdünnungen
nicht in Kombination mit dem DNA-Impfstoff
verwendet, da der Impfstoff auf Basis von inaktivierten Viren bei
diesen Verdünnungen
einen 100%igen Schutz verliehen hatte. Bei einer 625fachen Verdünnung nam
die Potenz von Abhayrab® jedoch signifikant ab,
und lediglich 50 % der Mäuse
waren gegen eine Tollwutvirusprovokation geschützt. Diese Abhayrab®-Dosis,
die einen suboptimalen Schutz verleiht, wurde verwendet, um die Wirkung
von inaktivierten Tollwutviren auf die Potenz von DNA-Tollwutimpfstoffen
zu untersuchen. Die Immunisierungsexperimente wurden wiederholt,
und die Mäuse
wurden zweimal in zweiwöchigen
Intervallen mit 0,1 ml des 625fach verdünnten Abhayrab® allein
oder mit 100 μg
des DNA-Tollwutimpfstoffs allein oder mit einer Kombination von
beiden geimpft. Die Mäuse
wurden zwei Wochen später
provoziert, und die in Tabelle 1 angeführten Ergebnisse lassen den
Schluss zu, dass Abhayrab® und der DNA-Tollwutimpfstoff
einen 50%igen bzw. 80%igen Schutz verleihen, wohingegen es bei einer
Kombination dieser beiden Wirkstoffe zu einem 100%igen Schutz gegen
eine Tollwutvirusprovokation kommt. Folglich führt die Zugabe einer suboptimalen Dosis
von inaktivierten Tollwutviren zum DNA-Tollwutimpfstoff zur Entwicklung
eines neuartigen Tollwutkombinationsimpfstoffs mit höherer Potenz.
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Zur
Untersuchung ob inaktivierte Tollwutviren, die aus Hühnerembryozellen
hergestellt werden, auch die Potenz des DNA-Tollwutimpfstoffs verbessern
können,
wurden unter Verwendung von Rabipur®, einem
aus Hühnerembryozellen
hergestellten Tollwutimpfstoff auf Basis von inaktivierten Viren,
Virusprovokationsversuche durch geführt. Zu jeder der Rabipur®-Ampullen
(> 2,5 IU) wurden
200 μl Kochsalzlösung zugesetzt,
wobei 100 μl
bis zu 625fach mit Kochsalzlösung
verdünnt
wurden. Der verdünnte
Impfstoff wurde entweder allein oder in Kombination mit dem DNA-Tollwutimpfstoff
(100 μl)
jeder der Mäuse
zweimal in zweiwöchigen
Intervallen injiziert, und die Mäuse
wurden, wie oben beschrieben, zwei Wochen nach der letzten Immunisierung
provoziert. Die in Tabelle 1 angeführten Ergebnisse lassen den
Schluss zu, dass Rabipur®, 625fach verdünnt, einen
60%igen Schutz gegen eine Tollwutvirusprovokation verleiht, während der
Schutz bei einer Kombination mit dem DNA-Tollwutimpfstoff auf 100
% erhöht
wird.
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Folglich
kann ein aus entweder Verozellen oder Hühnerembryozellen hergestelltes
Präparat
aus inaktivierten Tollwutviren die Potenz des DNA-Tollwutimpfstoffs
erhöhen.
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Beispiel 5: Potenz des
DNA-Tollwutimpfstoffs, des Tollwutimpfstoffs auf Basis von inaktivierten
Viren und des Kombinationsimpfstoffs, der aus inaktiviertem Tollwutvirus
und DNA-Impfstoff besteht, untersucht mittels eines RFFIT in einem
Versuch an Mäusen
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Die
Potenz des DNA-Tollwutimpfstoffs kann auch durch dessen Fähigkeit
zur Induktion von Virus-neutralisierenden Antikörpern (VNA) im immunisierten
Wirt mittels RFFIT (137) bestimmt werden. Kurz gefasst werden unterschiedliche
Verdünnungen
des Serums mit einer Standarddosis des Provokationsviruspräparats in
den Wells von Gewebekultur-Kammerobjektträgern inkubiert, wobei die Objektträger bei
35 °C 60
bis 90 Minuten lang in einem befeuchteten Kohlendioxidinkubator
inkubiert werden. Anschließend
werden BHK-Zellen zugesetzt (1 × 105 Zellen pro Well) und das Gemisch wie oben
beschrieben weitere 20 Stunden lang inkubiert. Die Objektträger werden
in Phosphatpufferlösung
(PBS) gewaschen und in kaltem Aceton fixiert. Nach dem Trocknen
wird ein mit Fluoresceinisothiocyanat konjugiertes Antitollwut-Nucleoprotein in
geeigneter Verdünnung
zugesetzt und die Inkubation weitere 20 bis 30 Minuten bei 37 °C fortgesetzt.
Schließlich
werden die Objektträger
in PBS gewa schen und unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet.
Die Virusneutralisierenden Titer werden unter Verwendung bekannter
Vorschriften ermittelt. Nationales oder internationales Referenzserum,
das auf eine Potenz von 1,0 IU/ml verdünnt ist, wird in jedem Test
zum Titrieren des Testserumtiters verwendet, und die Ergebnisse
sind in IU/ml angeführt.
Ein Tollwutimpfstoff, der einen VNA-Titer von 0,15 IU/ml und mehr
induziert, wird als schützend
angesehen. Somit ist die VNA-Konzentration im immunisierten Wirt
ein Maßstab
für die
Tollwutimpfstoffpotenz, wobei Impfstoffe mit besserer Potenz höhere VNA-Titer
induzieren. Die Erfinder haben deshalb untersucht, ob die Verabreichung
eines Kombinationsimpfstoffs, der aus 625fach verdünntem Abhayrab® und
einem DNA-Tollwutimpfstoff (100 μg)
besteht, die Induktion von höheren
VNA im immunisierten Tier bewirken kann. Dazu wurden aus 10 Mäusen bestehende
Gruppen mit dem DNA-Tollwutimpfstoff allein, unterschiedlichen Verdünnungen
von Abhayrab® oder
einer Kombination von 625fach verdünntem Abhayrab® und
dem DNA-Tollwutimpfstoff wie oben beschrieben geimpft. Den Mäusen wurde
mittels retroorbitaler Punktion vor Verabreichung der zweiten Dosis
(Postimmunisierung an Tag 14) sowie zwei Wochen nach der Verabreichung
der zweiten Dosis (Postimmunisierung an Tag 28) Blut abgenommen.
Die Serumproben von Mäusen
aus allen Gruppen wurden eingesammelt und der Wert der Tollwut-VNA
mittels RFFIT untersucht. Die in Tabelle 2 angeführten Ergebnisse weisen darauf
hin, dass es 14 Tage nach der Verabreichung einer einmaligen Dosis
des DNA-Tollwutimpfstoffs allein, des 1:625 verdünnten Abhayrab® oder
beiden zu einem VNA-Titer (IU/ml) von 0,287, 0,095 bzw. 1,42 kommt.
Wenn die Sera zwei Wochen nach Verabreichung der zweiten Dosis analysiert
wurden, stieg der VNA-Titer (IU/ml) bei Mäusen, die nur mit dem DNA-Tollwutimpfstoff,
dem 1:625 verdünnten
Abhayrab® oder
beiden immunisiert worden waren, auf 1,96, 0,55 bzw. 4,07. Die Ergebnisse
deuten klar darauf hin, dass eine Kombination aus einem Tollwutimpfstoff
auf Basis von inaktivierten Viren und einem DNA-Tollwutimpfstoff
bei Mäusen
zu höheren
VNA-Werten führt,
als dies der Fall wäre, wenn
diese jeweils einzeln verwendet werden.
-
Beispiel 6: Potenz des
DNA-Tollwutimpfstoffs, des Tollwutimpfstoffs auf Basis von inaktivierten
Viren und des Kombinationsimpfstoffs, der aus inaktiviertem Tollwutvirus
und DNA-Impfstoff besteht, untersucht mittels eines RFFIT in einem
Versuch an Hunden
-
Zur
Untersuchung ob die bei Mäusen
erhaltenen Ergebnisse in einer anderen Wirbeltierspezies reproduziert
werden könnten,
wurden die Immunisierungsexperimente mit Hunden wiederholt. Es wurden
3 bis 4 Monate alte Hunde, die bezüglich Tollwut-VNA seronegativ sind,
auf intramuskulärem
Weg mit 625fach verdünntem
Abhayrab®,
100 μg DNA-Tollwutimpfstoff
oder beiden zweimal in zweiwöchigen
Intervallen immunisiert. Jede der Gruppen bestand aus einem Tier.
An den Tagen 7, 14, 21, 28 und 35 nach der Immunisierung wurde den
Tieren Blut abgenommen und der Tollwut-VNA-Titer in den Seren mittels
RFFIT analysiert. Die in Tabelle 3 angeführten Ergebnisse weisen klar
darauf hin, dass der VNA-Titer bei mit 625fach verdünntem Abhayrab® und
DNA-Tollwutimpfstoff geimpften Tieren an allen Testpunkten höher war
als jener bei den Tieren, die entweder mit dem DNA-Impfstoff oder
dem 625fach verdünnten
Abhayrab® allein
geimpft wurden.
-
Folglich
induziert die Impfung einer Kombination aus einem Tollwutimpfstoff
auf Basis von inaktivierten Viren und einem DNA-Tollwutimpfstoff
nicht nur bei Mäusen,
sondern auch bei Hunden höhere
Tollwut-VNA-Werte.
-
Beispiel 7: Potenz des
DNA-Tollwutimpfstoffs, des Tollwutimpfstoffs auf Basis von inaktivierten
Viren und des Kombinationsimpfstoffs, der aus inaktiviertem Tollwutvirus
und DNA-Impfstoff besteht, untersucht mittels eines RFFIT in einem
Versuch an Rindern
-
Nachdem
die Erfinder die Potenz des Kombinationsimpfstoffs, der aus einem
Tollwutimpfstoff auf Basis von inaktivierten Viren und dem DNA-Tollwutimpfstoff
besteht, bei Mäusen
und Hunden aufgezeigt hatten, untersuchten sie dessen Immunogenität in einem
Versuch mit Großtieren,
nämlich
Rindern. In diesem Versuch wurden Raksharab®, ein
aus BHK-Zellen hergestellter Tollwutimpfstoff auf Basis von veterinären inaktivierten Viren,
sowie Abhayrab® eingesetzt.
Es wurden 12 bis 16 Monate alte gekreuzte Kälber, die bezüglich Tollwut-VNA
seronegativ sind, auf intramuskulärem Weg mit 625fach verdünntem Abhayrab® oder
Raksharab® entweder
allein oder in Kombination mit 100 μg DNA-Tollwutimpfstoff zweimal
in zweiwöchigen
Intervallen immunisiert, und die Blutproben wurden an den Tagen
7, 14, 21, 28 und 35 nach der Immunisierung eingesammelt. Jede der
Gruppen bestand aus drei Rindern, und an allen Testpunkten wurden
die Rindersera aus allem Gruppen eingesammelt und anschließend einer
RFFIT-Analyse unterzogen. Die in Tabelle 4 angeführten Ergebnisse weisen klar
darauf hin, dass der VNA-Titer bei Rindern, die mit inaktivierten
Tollwutviren (entweder Abhayrab® oder
Raksharab®)
und dem DNA-Tollwutimpfstoff geimpft worden waren, weitaus höher war
als jener bei den Tieren, die mit dem Tollwutimpfstoff auf Basis
von inaktivierten Viren oder dem DNA-Tollwutimpfstoff allein geimpft
wurden.
-
In
einem weiteren unabhängigen
Experiment wurde die Wirkung von Hilfsmitteln, wie z.B. Aluminiumhydroxid,
auf die Potenz des Kombinationsimpfstoffs (inaktivierte Tollwutviren
+ DNA-Impfstoff) untersucht. Rinder wurden zweimal in zweiwöchigen Intervallen
(Tag 0 und Tag 14) mit dem DNA-Impfstoff, 625fach verdünntem Raksharab® oder
beiden in Gegenwart oder Abwesenheit von Aluminiumhydroxid immunisiert.
Den Rindern wurde in regelmäßigen Abständen Blut
abgenommen und der VNA-Wert
mittels RFFIT untersucht. Die in Tabelle 5 angeführten Ergebnisse lassen darauf
schließen,
dass die Zugabe von Aluminiumhydroxid die Potenz des Kombinationstollwutimpfstoffs
zusätzlich
erhöht.
-
Diese
Beispiele, welche die Verwendung des DNA-Tollwutimpfstoffs in Kombination
mit unterschiedlichen Tollwutimpfstoffen auf Basis von inaktivierten
Viren beschreiben, dienen nur zur Veranschaulichung und nicht als
Einschränkung
der in den beigefügten
Ansprüchen
definierten Erfindung.
-
TABELLE
1 Schutz
vor einer Tollwutvirus-Provokation bei mit dem DNA-Tollwutimpfstoff,
dem Tollwutimpfstoff auf Basis von inaktivierten Viren (Abhayrab
® oder
Rabipur
®)
oder dem Kombinationsimpfstoff geimpften Mäusen
-
TABELLE
2 Induktion
von Tollwutviren-neutralisierenden Antikörpern (VNA) bei Mäusen mittels
DNA-Impfstoff, Tollwutimpfstoff auf Basis inaktivierter Viren oder
Kombinationsimpfstoff
-
TABELLE
3 Induktion
von Tollwutviren-neutralisierenden Antikörpern (VNA) bei Hunden mittels
DNA-Impfstoff, Tollwutimpfstoff auf Basis inaktivierter Viren (Abhayrab
®)
oder Kombinationsimpfstoff
-
TABELLE
4 Induktion
von Tollwutviren-neutralisierenden Antikörpern (VNA) bei Rindern mittels
DNA-Impfstoff, Tollwutimpfstoff auf Basis inaktivierter Viren (Abhayrab
® oder
Raksharab
®)
oder Kombinationsimpfstoff
-
TABELLE
5 Wirkung
von Hilfsmitteln, wie z.B. Aluminiumhydroxid, auf die Induktion
von Tollwutviren-neutralisierenden Antikörpern (VNA) bei Rindern mittels
DNA-Impfstoff, Tollwutimpfstoff auf Basis inaktivierter Viren (Raksharab) oder
Kombinationsimpfstoff
-
Literaturverweise:
-
- 1. Wolff JA, Malone RW, Williams P, Chong W, Acsadi G, Jani
A, Felgner PL. 1990. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo.
Science. 247:1465-68.
- 2. Tang DC, De Vit M, Johnston SA. 1992. Genetic immiunization
is a simple method for eliciting an immune response. Nature 356:152-54,
- 3. Ulmer JB, Donnelly JJ, Parker SE, Rhodes GH, Felgner PL,
Dwarki VJ, Gromkowski SH, Deck RR, De Witt DM, Friedman A, Hawe
LA, Leander KR, Martinez D, Perry HC, Shiver JW, Montgomery DC,
Liu MA 1993. Heterologous protection against influenza by injection
of DNA encoding a viral protein. Science 259:1745-49.
- 4. Robinson HL, Hunt LA, Webster RG. 1993. Protection against
a lethal influenza virus challenge by immunization with a haemagglutinin-expressing
plasmid DNA Vaccine 11:957-60.
- 5. DNA Vaccines: Methods and Protocols. Robert G. Whalen, Douglas
B. Lowrie (Editor)/Hardcover/Humana Press/August 1999.
- 6. Gene Vaccination: Theory and Practice. Eyal Raz (Editor)/Hardcover/Springer-Verlag New York,
Incorporated/July 1998.
- 7. DNA Vaccines: A New Era in Vaccinology. Margaret A. Liu,
Reinhard Kurth (Editor), Maurice R. Hilleman (Editor)/Paperback/New
York Academy of Sciences/October 1995.
- 8. Curreut Topics in Microbiology and Immunology (vol. 226)
entitled: DNA Vaccination/Genetic Vaccination edited by David Weiner
and Hilary Koprowski,
- 9. Lewis PJ, Cox GJ, van Drunen Littel-vanden Hurk S, Babiuk
LA. 1997. Polynucleotide vaccines in animals: enhancing and modulating
responses. Vaccine.
- 10. Babiuk LA, Lewis J, Suradhat S, Baca-Estrada M, Foldvari
M, Babiuk S (1999). Polynucleotide vaccines: potential for inducing
immunity in animals J Biotechnol, 73: 131-140.
- 11. Babiuk LA, Lewis J, van den Hurk S, Braun R (1999) DNA immunization:
present and future Adv Vet Med, 41: 163-179.
- 12. Babiuk LA (1999) Broadening the approaches to developing
more effective vaccines Vaccine, 17: 1587-1595.
- 13. Boyle JS, Barr IG, Lew AM (1999) Strategies for improving
responses to DNA vaccines Mol Med, 5: 1-8.
- 14. Cichutek K (1999) Development and standardisation of DNA
vaccines Dev Biol Stand, 100: 119-129.
- 15. Davis HL (1999) DNA vaccines for prophylactic or therapeutic
immunization against hepatitis B virus Mt Sinai J Med, 66: 84-90.
- 16. Donnelly JJ, Ulmer JB (1999) DNA vaccines for viral diseases
Braz J Med Biol Res, 32: 215-222.
- 17. Encke J, zu Putlitz J, Wands JR (1999) DNA vaccines Intervirology,
42: 117-124.
- 18. Fomsgaard A (1999) HIV-1 DNA vaccines Immunol Lett, 65:
127-131.
- 19. Freis PC (1999) DNA vaccines [letter] N Engl J Med, 341:
1623-1624.
- 20. Gendon Iu Z (1999) Progress in developing viral polynucleotide
(DNA) vaccines Vopr Virusol, 44: 148-154.
- 21. Gorecki DC, Simons JP (1999) The dangers of DNA vaccination
[letter] Nat Med, 5: 126.
- 22. Gursel M, Tunca S, Ozkan M, Ozcengiz G, Alaeddinoglu G (1999)
Immunoadjuvant action of plasmid DNA in liposomes Vaccine, 17: 1376-1383.
- 23. Hasan UA, Abai AM, Harper DR, Wren BW, Morrow WJ (1999)
Nucleic acid immunization: concepts and techniques associated with
third generation vaccines J Immunol Methods, 229: 1-22.
- 24. Haynes JR (1999) Genetic vaccines Infect Dis Clin North
Am, 13: 11-26,
- 25. Kowalczyk DW, Ertl HC (1999) Immune responses to DNA vaccines
Cell Mol Life Sci, 55: 751-770.
- 26. Kurane I (1999) Present status of basic studies and development
of DNA vaccines Nippon Rinsho, 57: 975-981.
- 27. Leitner WW, Ying H, Restifo NP (1999) DNA and RNA-based
vaccines: principles, progress and prospects Vaccine, 18: 765-777.
- 28. Lewis PJ, Babiuk LA (1999) DNA vaccines: a review Adv Virus
Res, 54: 129-188.
- 29. Ramsay AJ, Kent S7, Strugnell RA, Suhrbier A, Thomson SA,
Ramshaw IA (1999) Genetic vaccination strategies for enhanced cellular,
humoral and mucosal immunity Immunol Rev, 171: 27-44.
- 30. Sasaki S, Inamura K, Okuda K (1999) Genes that induce immunity-DNA
vaccines Microbiol Immunol, 43: 191-200.
- 31. Seder RA, Gurunathan S (1999) DNA vaccines-designer vaccines
for the 21st century N Engl J Med, 341: 277-278.
- 32. Spiegelberg HL, Raz E (1999) DNA vaccines Allergy, 54: 47-48.
- 33. Stevenson FK (1999) DNA vaccines against cancer. from genes
to therapy Ann Oncol, 10: 1413-1418.
- 34. Stevenson FK, Link CJ, Jr., Traynor A, Yu H, Corr M (1999)
DNA vaccination against multiple myeloma Semin Hematol, 36: 38-42.
- 35. Tuteja R (1999) DNA vaccines; a ray of hope Crit Rev Biochem
Mol Biol, 34: 1-24.
- 36. Watts AM, Kennedy RC (1999) DNA vaccination strategies against
infectious diseases Int J Parasitol, 29: 1149-1163.
- 37. Weiner DB, Kennedy RC (1999) Genetic vaccines Sci Am, 281;
50-57.
- 38. Whitton JL, Rodriguez F, Zhang J, Hassett DE (1999) DNA
immunization: mechanistic studies Vaccine, 17: 1612-1619.
- 39. www.dnavaccine.com.
- 40. U.S. Food and Drug Administration. Points to Consider.
http://www.fda.gov/cber/points.html.
- 41. De Rose R, McKenna RV, Cobon G, Tennent J, Zakrzewski H,
Gale K, Wood PR, Scheerlinck JP, Willadsen P (1999) Bm86 antigen
induces a protective immune response against Boophilus microplus
following DNA and protein vaccination in sheep Vet Immunol Immunopathol,
71; 151-160.
- 42. Okuda K, Xin KO, Tsuji T, Bukawa H, Tanaka S, Koff WC, Tani
K, Honma K, Kawamoto S, Hamajima K, Fukushima J, 1997. DNA vaccination
followed by macromolecular multicomponent peptide vaccination against HIV-1
induces strong antigen-specific immunity. Vaccine 15:1049-56.
- 43. Barnett SW, Rajasekar S, Legg H, Doe B, Fuller DH, Haynes
JR, Walker CM, Steimer KS. 1997, Vaccination with HIV-1 gp120 DNA
induces immune responses that are boosted by a recom-binant gp120
protein subunit, Vaccine 15:869-73.
- 44. Letvin NL, Montefiori DC, Yasutomi Y, Perry HC, Davies ME,
Lekutis C, Alroy M, Freed DC, Lord CI, Handt LK, Liu MA, Shiver
JW. 1997, Potent, protective anti-HIV immune responses generated
by bimodal HIV envelope DNA plus protein vaccination. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 94:9378-83.
- 45. Fuller DH, Corb MM, Barnett S, Steimer K, Haynes JR. 1997.
Enhancement of immunodeficiency virus-specific immune responses
in DNA-immunized rhesus macaques. Vaccine 15:924-26.
- 46. Hanke T, Blanchard TJ, Schneider J, Hannan CM, Becker M,
Gilbert SC, Hill AV, Smith GL, McMichael A. 1998. Enhancement of
MHC class I-restricted peptidespecific T cell induction by a DNA
prime/MVA boost vaccination regime. Vaccine 16: 439-45.
- 47. Haddad D, Liljeqvist S, Stahl S, Hansson M, Perlmann F,
Ahlborg N, Berzins K (1999) Characterization of antibody responses
to a Plasmodium falciparum bloodstage antigen induced by a DNA prime/protein
boost immunization protocol Scand J Immunol, 49; 506-514.
- 48. Fensterle J, Grode L, Hess J, Kaufmann SH (1999) Effective
DNA vaccination against listeriosis by prime/boost inoculation with
the gene gun J Immunol, 163: 4510-4518.
- 49. Sedegah M, Jones TR, Kaur M, Hedstrom R, Hobart P, Tine
JA, Hoffman SL. 1998. Boosting with recombinant vaccinia increases
immunogenicity and protective efficacy of malaria DNA, vaccine.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 7648-53.
- 50. Schneider J, Gilbert SC, Blanchard TJ, Hanke T, Robson KJ,
Hannan CM Becker M, Sinden R, Smith GL, Hill AV, 1998. Enhanced
immunogenicity for CD8 ' T
cell induction and complete protective efficacy of malaria DNA vaccination
by boosting with modified vaccinia virus Ankara. Nat. Med 4:397-402.
- 51. Kent ST, Zhao A, Best SJ, Chandler JD, Boyle DB, Ramshaw
IA. 1998. Enhanced T-cell
immunogenicity and protective efficacy of a human immunodeficiency
virus type 1 vaccine regimen consisting of consecutive priming with
DNA and boosting with recombinant fowlpox virus. J. Virol. 72:10184-88.
- 52. Xiang ZQ, Pasquini S, Ertl HC (2994) Induction of genital
immunity by DNA. priming and intranasal booster immunization with
a replication-defective adenoviral recombinant J Immunol, 162: 6716-6723,
- 53. Robinson HL, Montefiori DC, Johnson RP, Manson KH, Kalish
ML, Lifson JD, Rizvi TA, Lu S, Hu SL, Mazzara GP, Panicali DL, Herndon
JG, Glickman R, Candido MA, Lydy SL, Wyand MS, McClure HM. 1999.
Neutralizing antibodyindependent containment of immunodeficiency
virus challenges by DNA priming and recombinant pox virus booster
immunizations. Nat. Med 5:526-34.
- 54. Richmond JF, Mustafa F, Lu S, Santoro JC, Weng J, O'Connell M, Fenyo
EM, Hurwitz JL, Montefiori DC, Robinson HL. 1997. Screening of HIV-1
Env glycoproteins for the ability to raise neutralizing antibody
using DNA immunization and recombinant vaccinia virus boosting.
Virology 230:265-74.
- 55. Richmond JF, Lu S, Santoro JC, Weng J, Hu SL, Montefiori
DC, Robinson HL. 1998, Studies of the neutralizing activity and
avidity of anti-human immunodeficiency virus type I Env antibody
elicited by DNA priming and protein boosting. J. Virol. 72:9092-100.
- 56. Hanke T, McMichael A (1999) Pre-clinical development of
a multi-CTL epitopebased DNA prime MVA boost vaccine for AIDS Immunol
Lett, 66: 177-181,
- 57. Hanke T, Samuel RV, Blanchard TJ, Neumann VC, allen TM Boyson
JE, Sharpe SA, Cook N, Smith GL, Watkins DI, Cranage MP, McMichael
AJ (1999) Effective induction of simian immunodeficiency virus-specific cytotoxic
T lymphocytes in macaques by using a multiepitope gene and DNA prime-modified
vaccinia virus Ankara boost vaccination regimen J Virol, 73: 7524-7532.
- 58. Calarota SA, Leandersson AC, Bratt G, Hinkula J, Klinman
DM, Weinhold KJ, Sandstrom E, Wahren B (1999) Immune responses in
asymptomatic HIV-1-infected patients after HIV-DNA immunization
followed by highly active antiretroviral treatment J Immunol.
- 59. Caver TE, Lockey TD, Srinivas RV, Webster RG, Hurwitz JL
(1999) A novel vaccine regimen utilizing DNA, vaccinia virus and
protein immunizations for HIV-1 envelope presentation Vaccine, 17:
1567-1572.
- 60. Bot A, Bot S, Bona C. 1998. Enhanced protection against
influenza virus of mice immunized as newborns with a mixture of
plasmids expressing hemagglutinin and nucleoprotein. Vaccine 16:1675-82.
- 61. Kim JJ, Ayyavoo V, Bagarazzi, ML, Chattergoon M, Boyer JD,
Wang B, Weiner DB. 1997. Development of a multicomponent candidate
vaccine for HIV-1. Vaccine 15:879-83.
- 62. Whitton JL, Rodriguez F, Zhang J, Hassett DE. 1999. DNA
immunization: mechanistic studies. Vaccine 17:1612-19.
- 63. Ciernik IF, Berzofsky JA, Carbone DP, 1996, Induction of
cytotoxic T-lymphocyte and antitumor immunity with DNA vaccines
expressing single T-cell epitopes. J. Immunol. 156:2369-75.
- 64. Iwasaki A, Dela Cruz CS, Young AR, Barber BH. 1999. Epitope-specific
cytotoxic T lymphocyte induction by mini-gene DNA immunization.
Vaccine 17:2081-88.
- 65. Yu Z, Karem KL, Kanangat S, Manickan E, Rouse BT. 1998.
Protection by minigenes: a novel approach of DNA vaccines. Vaccine
16:1660-67.
- 66. Hanke T, Schneider J, Gilbert SC, Hill AV, McMichael A.
1998. DNA multi-CTL epitope vaccines for HIV and Plasmodium falciparum:
immunogenicity inmice. Vaccine 16:426-35.
- 67. Thomson SA, Sherritt MA, Medveczky J, Elliott SL, Moss DJ,
Fernando JG, Brown LE, Suhrbier A. 1998. Delivery of multiple CD8
cytotoxic T cell epitopes by DNA vaccination. J. Immunol. 160:1717-23.
- 68. Suhrbier A. 1997, Multi-epitope DNA vaccines. Immunol. Cell
Biol. 75:402-8.
- 69. Wang R, Doolan DL, Charoenvit Y, Hedstrom RC, Gardner NJ,
Hobart P, Tine J, Sedegah M, Fallarme V, Sacci JB Jr, Kaur M, Klinman
DM, Hoffman SL, Weiss WR. 1998. Simultaneous induction of multiple
antigen-specific cytotoxic T lymphocytes in nonhuman primates by
immunization with a mixture of four Plasmodium falciparum DNA plasmids.
Infect. Immun. 66:4193-202.
- 70. Shi YP, Hasnain SE, Sacci JB, Holloway BP, Fujioka H, Kumar
N, Wohlhueter R, Hoffman SL, Collins WE, Lal AA 1999, Immunogenicity
and in vitro protective efficacy of a recombinant multistage Plasmodium
falciparum candidate vaccine. Proc. Natl, Acad. Sci. USA 96:1615-20.
- 71. Mossman SP, Pierce CC, Robertson MN, Watson AJ, Montefiori
DC, Rabin M, Kuller L, Thompson J, Lynch JB, Morton WR, Benveniste
RE, Munn R, Hu SL, Greenberg P, Haigwood NL (1999) Immunization
against SIVmne in macaques using multigenic DNA vaccines J Med Primatol,
28: 206-213.
- 72. Mendoza RB, Cantwell MJ, Kipps TJ. 1997. Immunostimulatory
effects of a plasmid expressing CD40 ligand (CD154) on gene immunization.
J. Immunol. 159:5777-81.
- 73. Kim JJ, Simbiri KA, Sin JI, Dang K, Oh J, Dentchev T, Lee
D, Nottingham LK, Chalian AA, McCallus D, Ciccarelli R, Agadjanyan
MG, Weiner DB (1999) Cytokine molecular adjuvants modulate immune
responses induced by DNA vaccine constructs for HIV-1 and SIV J
Interferon Cytokine Res, 19: 77-84,
- 74. Corr M, Tighe H, Lee D, Dudler J, Trieu M, Brinson DC, Carson
DA, 1997. Costimulation provided by DNA immunization enhances antitumor
immunity. J. Immunol. 159:4999-5004.
- 75. Lee AH, Suh YS, Sung YC (1999) DNA inoculations with HIV-1
recombinant genomes that express cytokine genes enhance HIV-1 specific
immune responses Vaccine, 17: 473-479.
- 76. Kim JJ, Bagarazzi ML, Trivedi N, Hu Y, Kazahaya K, Wilson
DM, Ciccarelli R, Chattergoon MA, Dang K, Mahalingam S, Chalian
AA, Agadjanyan MG, Boyer JD, Wang B, Weiner DB. 1997, Engineering
of in vivo immune responses to DNA immunization via codelivery of
costimulatory molecule genes. Nat. Bio-technol. 15:641-46.
- 77. Tsuji T, Harnajima K, Ishii N, Aoki I, Fukushima J, Xin
KQ, Kawamoto S, Sasaki S, Matsunaga K, Ishigatsubo Y, Tani K, Okubo
T, Okuda K. 1997. Immunomodulatory effects of a plasmid expressing
B7-2 on human immunodeficiency virus-1-specific cell-mediated immunity
induced by a plasmid encoding the viral antigen. Eur. J. Immunol.
27:782-87.
- 78. Xiang Z, Ertl HC. 1995. Manipulation of the immune response
to a plasmid-encoded viral antigen by coinoculation with plasmids
expressing cytokines. Immunity 2:129-35.
- 79. Lee AH, Suh YS, Sung YC. 1999. DNA inoculations with HIV-1
recombinant genomes that express cytokine genes enhance HIV-1 specific
immune responses. Vaccine 17: 473-79.
- 80. Weiss WR, Ishii KJ, Hedstrom RC, Sedegah M, Ichino M, Barnhart
K, Klinman DM, Hoffman SL. 1998. A plasmid encoding murine granulocyte-macrophage
colonystimulating factor increases protection conferred by a malaria
DNA vaccine. J. Immunol. 161:2325-32.
- 81. Svanholm C, Lowenadler B, Wigzell H. 1997. Amplification
of T-cell and anti-body responses in DNA based immunization with
HIV-1 Nef by co-injection with a GM-CSF expression vector. Scand. J. Immunol.
46:298-303.
- 82. Tsuji T, Hamajima K, Fukushima J, Xin KQ, Ishii N, Aoki
I, Ishigatsubo Y, Tani K, Kawamoto S, Nitta Y, Miyazaki J, Koff
WC, Okubo T, Okuda K. 1997. Enhancement of cell-mediated immunity
against HIV-I induced by coinoculation of plasmidencoded HIV-1 antigen
with plasmid expressing IL-12. J. Immunol 158:4008-13.
- 83. Kim JJ, Ayyavoo V, Bagarazzi ML, Chat-tergoon MA, Dang K,
Wang B, Boyer JD, Weiner DB. 1997. In vivo engineering of a cellular
immune response by coadministration of IL-12 expression vector with
a DNA immunogen. J. Immu-nol. 158:816-26.
- 84. Larsen DL, Dybdahl-Sissoko N, Mc-Gregor MW, Drape R, Neumann
V, Swain WF, Lunn DP, Olsen CW. 1998. Coadministration of DNA encoding
interleukin-6 and hemagglutinin confers protection from influenza
virus challenge in mice. J. Virol. 72:1704-8.
- 85. Kim JJ, Simbiri KA, Sin JL, Dang K, Oh J, Dentchev T, Lee
D, Nottingham LK, Chalian AA, McCallus D, Ciccarelli E, Agadjanyan
MG, Weiner DB. 1999. Cytokine molecular adjuvants modulate immune
responses induced by DNA vaccine constructs for HIV-1 and STV. J.
Interferon Cytokine Res. 19:77-84.
- 86. Chow YH, Chiang BL, Lee YL, Chi WK, Lin WC, Chen YT, Tao
MH. 1998. Development of Th1 and Th2 population and the nature of
immune responses to hepatitis B virus DNA vaccines can be modulated
by codelivery of various cytokine genes. J. Immmunol. 160:1320-29.
- 87. Geissler M, Gesien A, Tokushige K, Wands JR. 1997. Enhancement
of cellular and humoral immune responses to hepatitis C virus core
protein using DNA-based vaccines augmented with cytokine-expressing
plasmids, J. Immunol. 158:1231-37.
- 88. Chow YH, Huang WL, Chi WK, Chu YD, Tao MH. 1997. Improvement
of hepatitis B virus DNA vaccines by plasmids coexpressing hepatitis
B surface antigen and interleukin-2. J. Virol. 71:169-78.
- 89. Kim JJ, Trivedi NN, Nottingham LK, Morrison L, Tsai A, Hu
Y, Mahalingam S, Dang K, Ahn L, Doyle NK, Wilson DM, Chattergoon
MA, Chalian AA, Boyer JD, Agadjanyan MG, Weiner DB, 1998. Modulation
of amplitude and direction of in vivo immune responses by co-administration
of cytokine gene expression cassettes with DNA immunogens. Eur.
J. Immunol. 28:1089-103.
- 90. Gurunathan S, Irvine KR, Wu CY, Cohen JI, Thomas E, Prussin
C, Restifo NP, Seder RA. 1998. CD40 ligand/trimer DNA enhances both
humoral and cellular immune responses and induces protective immunity
to infectious and tumor challenge. J. Immunol. 161:4563-71.
- 91. Maecker HT, Umetsu DT, DeKruyff RH, Levy S. 1997. DNA vaccination
with cytokine fusion constructs biases the immune response to ovalbumin.
Vaccine 15:1687-96.
- 92. Hakim I, Levy S, Levy R, 1996. A nine amino acid peptide
from IL-1β augments
antitumor immune responses induced by protein and DNA vaccines.
J. Immunol. 157:5503-11.
- 93. Ishii KJ, Weiss WR, Ichino D, Verthelyi D, Klinman DM. 1999.
Activity and safety of DNA plasmids encoding IL-4 and IFN-c. Gene
Ther. 6:237-44.
- 94. Okada E, Sasaki S, Ishii N, Aoki I, Yasuda T, Nishioka K,
Fukushima J, Miyazaki J, Wahren B, Okuda K. 1997. Intranasal immunization
of a DNA vaccine with IL-12- and
granulocyte-miacrophage colony stimulating factor (GM-CSF) expressing
plasmids in lipo-somes induces strong mucosal and cell-mediated
immune responses aginst HIV-1 antigens. J. Immunol 159:3638-47.
- 95. Iwasaki A., Stiernholm BJ, Chan AK, Berinstein NL, Barber
BH, 1997. Enhanced CTL responses mediated by plasmid DNA immunogens
encoding costimulatory molecules and cytokines. J. Immunol. 158:4591-601.
- 96. Operschall E, Schuh T, Heinzerling L, Pavlovic J, Moelling
K (1999) Enhanced protection against viral infection by co-administration
of plasmid DNA coding for viral antigen and cytokines in mice J
Clin Virol, 13: 17-27.
- 97. Ishii N, Tsuji T, Xin KQ, Mohri H, Okuda K. 1998. Adjuvant
effect of Uben-imex on a DNA vaccine for HIY-1. Clin. Exp. Immunol.
111:30-35.
- 96. Sasaki S, Sumino K, Hamajima K, Fukushima J, Ishii N, Kawamoto
S, Mohri H, Kensil CR, Okuda K. 1998, Induction of systemic and
mucosal immune responses to human immunodeficiency virus type 1
by a DNA, vaccine formulated with QS-21 saponin adjuvant via intramuscular
and intranasal routes J. Virol. 72:4931-39.
- 99. Sasaki S, Hamajima K, Fukushima J, Ihata A, Ishii N, Gorai
J, Hirahara F, Mohri H, Okuda K. 1998. Comparison of intranasal
and intramuscular immunization against human immunodeficiency virus
type 1 with a DNA-monophosphoryl lipid A adjuvant vaccine. Infect.
Immun. 66:823-26.
- 100. Roy K, Mao HQ, Huang SK, Leong KW, 1999. Oral gene delivery
with chitosan-DNA
nanoparticles generates immunologic protection in a murine model
of peanut allergy. Nat. Med 5:387-91.
- 101. Klavinskis LS, Gao L, Barnfield C, Lehner T, Parker S.
1997, Mucosal immunization with DNA-liposome complexes. Vaccine
15:818-20.
- 102. Haigwood NL, Pierce CC, Robertson MN, Watson AJ, Montefiori
DC, Rabin M, Lynch JB, Kuller L, Thompson J, Morton WR, Benveniste
RE, Hu SL, Greenberg P, Mossman SP (1999) Protection from pathogenic
SIV challenge using multigenic DNA vaccines Immunol Lett, 66: 183-188.
- 103. Herrmann JE, Chen SC, Jones DH, Tin-sley-Bown A, Fynan
EF, Greenberg HB, Farrar GH. 1999. Immune responses and protection
obtained by oral immunization with rotavirus VP4 and VP7 DNA vaccines
encapsulated in microparticles. Virology 29:148-53.
- 104. Chen SC, Jones DH, Fynan EF, Farrar GH, Clegg JC, Greenberg
HB, Hermann JE. 1998. Protective immunity induced by oral immunization
with a rotavirus DNA vaccine encapsulated in microparticles. J.
Virol. 72:5757-61.
- 105. Jones DH, Corris S, McDonald S, Clegg JC, Farrar GH, 1997.
Poly(DL-lactide-co-glycolide)-encapsulated plasmid
DNA elicits systemic and mucosal antibody responses to encoded protein
after oral administration. Vaccine 15:814-17.
- 106. Lodmell DL, Ray NB, Ulrich JT, Ewalt LC (2000) DNA vaccination
of mice against rabies virus: effects of the route of vaccination
and the adjuvant monophosphoryl lipid A (MPL) Vaccine, 18; 1059-1066.
- 107. Krieg AM (1999) CpG DNA: a novel immunomodulator Trends
Microbiol 7.
- 108. Sato Y, Roman M, Tighe J, Lee D, Corr M, Nguyen MD, Silverman
GJ, Lotz M, Carson DA, Raz E. 1996. Immunostimulatory DNA sequences
necessary for effective intradermal gene immunization. Science 273:352-54.
- 109. Krieg AM, Yi AK, Matson S, Wald-schmidt TJ, Bishop GA,
Teasdale R, Koretzky GA, Klinman DM. 1995. CpG motifs in bacterial
DNA trigger direct B-cell activation. Nature 374:546-49.
- 110. Klinman DM, Yamshchikov G, Ishigat-subo Y. 1997. Contribution
of CpG motifs to the immunogenicity of DNA vaccines. J. Immunol.
158:3635-39.
- 111. Brazolot Millan CL, Weeratna R, Krieg AM, Siegrist CA,
Davis HL. 1998. CpG DNA can induce strong Th1 humoral and cell-mediated
immune responses against hepatitis B surface antigen in young mice.
Proc. Natl. Acad Sci. USA 95:15553-58
- 112. Klinman DM. 1998. Therapeutic applications of CpG-containing
oligodeoxy nucleotides. Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 8:181-84.
- 113. Klinman DM, Barnhart KM, Conover J. 1999, CpG motifs as
immune adjuvants. Vaccine 17:19-25.
- 114. Zimmermann S, Egeter O, Hausmann S, Lipford GB, Rocken
M, Wagner H, Heeg K. 1998. CpG oligodeoxynucleotides trigger protective
and curative Th1 responses in lethal murine leishmaniasis. J. Immunol. 160:3627-30.
- 115. Roman M, Martin-Orozco E, Goodman JS, Nguyen MD, Sato Y,
Ronaghy A, Kornbluth RS, Richman DD, Carson DA, Raz E, 1997. Immunostimulatory
DNA sequences function as T helper-1 promoting adjuvants. Nat. Med
3:849-54.
- 116. Oxenius A, Martinic MM, Hengartner H, Klenerman P (1999)
CpG-containing oligonucleotides are efficient adjuvants for induction
of protective antiviral immune responses with T-cell peptide vaccines
J Virol, 73: 4120-4126.
- 117. Paillard F (1999) CpG: the double-edged sword [comment]
Hum Gene Ther, 10: 2089-2090.
- 118. Bryder K, Sbai H, Nielsen HV, Corbet S, Nielsen C, Whalen
RG, Fomsgaard A (1999) Improved immunogenicity of HIV-1 epitopes
in HBsAg chimeric DNA vaccine plasmids by structural mutations of
HBsAg DNA Cell Biol.
- 119. Norman JA, Hobart P, Manthorpe M, Felgner P, Wheeler C.
1997. Development of improved vectors for DNA-based immunization
and other gene therapy applications. Vaccine 15:801-3.
- 120. Wild B, Gruner B, Metzger K, Kuhrober A, Pudollek HP, Hauser
H, Schirmbeck R, Reimann J. 1998, Polyvalent vaccination against
hepatitis B surface and core antigen using a dicistronic expression
plasmid, Vaccine 16:353-60.
- 121. Uchijima M, Yoshida A, Nagata T, Koide Y, 1998, Optimization
of codon usage of plasmid DNA vaccine is required for the effective
MHC class I-restricted T cell responses against an intracellular
bacterium. J. Immunol. 161:5594-99.
- 122. Andre S, Seed B, Eberle J, Schraut W, Bultmann A, Haas
J. 1998. Increased immune response elicited by DNA vaccination with
a synthetic gp120 sequence with optimized codon usage, J. Virol.
72:1497-503.
- 123. Vinner L, Nielsen HV, Bryder K, Corbet S, Nielsen C, Fomsgaard
A. 1999. Gene gun DNA vaccination with Rev-independent synthetic
HIV-1 gp160 envelope gene using mammalian codons. Vaccine 17:2166-75.
- 124. Inchauspe G, Vitvitski L, Major ME, Jung G, Spengler U,
Maisonnas M, Trepo C. 1997. Plasmid DNA expressing a secreted or
a nonsecreted form of hepatitis C virus nucleocapsid: comparative
studies of antibody and T-helper responses following genetic immunization.
DNA Cell Biol. 16:185-95.
- 125. Rice J, King CA, Spellerberg MB, Fairweather N, Stevenson
FK. 1999. Manipulation of pathogen-derived genes to influence antigen
preseatation via DNA vaccines. Vaccine 17:3030-38.
- 126. Wu Y, Kipps TJ. 1997. Deoxyribonucleic acid vaccines encoding
antigens with rapid proteasome-dependent degradation are highly
efficient inducers of cytolytic T lymphocytes. J. Immunol. 159:6037-43.
- 127. Tobery TW, Siliciano RF. 1997, Targeting of HIV-1 antigens
for rapid intracellular degradation enhances cytotoxic T lymphocyte
(CTL) recognition and the induction of de novo CTL responses in
vivo after immunization. J. Exp. Med 185:909-20.
- 128. Rodriguez F, Zhang J, Whitton JL. 1997, DNA immunization:
ubiquitination of a viral protein enhances cytotoxic T-lymphocyte
induction and antiviral protection but abrogates antibody induction.
J. Virol. 71:8497-503.
- 129. Chaplin PJ, De Rose R, Boyle JS, McWaters P, Kelly J, Tennent
JM, Lew AM, Scheerlinck JP (1999) Targeting improves the efficacy
of a DNA vaccine against Corynebacterium pseudotuberculosis in sheep
Infect Immun, 67: 6434-6438.
- 130. Forns X, Emerson SU, Tobin GJ, Mushahwar IK, Purcell RH,
Bukh J(1999) DNA immunization of mice and macaques with plasmids
encoding hepatitis C virus envelope E2 protein expressed intracellularly
and on the cell surface Vaccine, 17: 1992-2002.
- 131. Lewis PJ, van Drunen Littel-van den H, Babiuk LA (1999)
Altering the cellular location of an antigen expressed by a DNA-based
vaccine modulates the immune response J Virol, 73: 10214-10223.
- 132. Li Z, Howard A, Kelley C, Delogu G, Collies F, Morris S
(1999) Immunogenicity of DNA vaccines expressing tuberculosis proteins
fused to tissue plasminogen activator signal sequences Infect Immun,
67: 4780-4786.
- 133. Lowrie DB, Tascon RE, Bonato VL, Lima VM, Faccioli LH,
Stavropoulos E, Colston MJ, Hewinson RG, Moelling K, Silva CL (1999)
Therapy of tuberculosis in mice by DNA vaccination Nature, 400:
269-271.
- 134. Nagata T, Uchijima M, Yoshida A, Kawashima M, Koide Y (1999)
Codon optimization effect on translational efficiency of DNA vaccine
in mammalian cells: analysis of plasmid DNA encoding a CTL epitope
derived from microorganisms Biochem Biophys Res Commun, 261: 445-451.
- 135. Svanholm C, Bandholtz L, Lobell A, Wigzell H (1999) Enhancement
of antibody responses by DNA immunization using expression vectors
mediating efficient antigen secretion J Immunol Methods, 228: 121-130.
- 136. Torres CA, Yang K, Mustafa F, Robinson HL (1999) DNA, immumunization:
effect of secretion of DNA-expressed hemagglutinins on antibody
responses Vaccine, 18: 805-814.
- 137. Smith J S, Yager P A, Baer GM in Laboratory techniques
in rabies, by Meslin F-X, Kaplan M M & Koprowski H, (WHO, Geneva) 1996,
181.
- 138. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. (1989) Molecular cloning;
A laboratory Manual, 2nd ed. (Cold Spring Harbour
laboratory press, Cold Spring Harbour, NY).
- 139. Prazeres DMF, Ferreira GNM, Monteiro GA, Cooney CL, Cabral
JMS. (1999) large scale production of pharmaceutical-grade plasmid
DNA for gene therapy: problems and botlenecks. TIBTECH 17: 169-174.
- 140. Manthorpe M, Cornefert-Jensen F, Hartikka J, Felgner J,
Rundell A, Margalth M, Dwarki VJ. (1993) Gene therapy by intramuscular
injection of plasmid DNA: studies on firefly luciferase gene expression
in mice. Hum. Gene Ther. 4: 419-421.
- 141. Keiny, MP, Lathe R, Drillen R, Spehner D, Skory S, Schmitt
D, Wiktor T, Koprowski H, Lecocq JP. (1984) Expression of rabies
virus glycoprotein from a recombinant vaccinia virus. Nature 312:
163-166.