CN1494432A - 一种包含dna疫苗和灭活病毒的新的疫苗制剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种预防性或治疗性的脊椎动物免疫的新的疫苗制剂，以抗由脊椎动物病毒所引起的感染。所述疫苗含有最低量的两种成分，一种是含有编码病毒多肽DNA分子的脱氧核糖核酸(DNA)疫苗，另外一种组分包含灭活形式的病毒。本发明也可用来开发低成本的基于灭活病毒的疫苗，该疫苗含有比现有领域已知的类似疫苗中存在的病毒更低数量的所述病毒。本发明也涉及一种生产所述新的疫苗制剂的方法以及所述制剂的用途。

Description

一种包含DNA疫苗和灭活病毒的新的疫苗制剂

技术领域

本发明涉及一种预防性或治疗性的脊椎动物免疫方法，以对抗脊椎动物病毒引起的感染。该方法包括脊椎动物的用药、一种疫苗组合物，该疫苗组合物含有最低量的两种成分，一种是由编码病毒多肽的DNA分子组成的脱氧核糖核酸(DNA)疫苗，另外一种成分由灭活形式的病毒组成。联合施用这两种成分所诱发的保护性免疫应答要优于单独施用单个成分所诱发的免疫应答。因此，本发明可用来开发一种包含DNA疫苗和灭活病毒的联合疫苗。另一方面，本发明可用来开发低成本的基于灭活病毒的疫苗，与现有领域已知类似疫苗中存在的所述病毒比较，该疫苗含有更低数量的所述病毒。

背景技术

自从爱德华·詹纳(Edward Jenner)两百多年前第一次记载了针对天花的成功接种疫苗方法以来，疫苗发展经历了巨大的变化。第一代疫苗包括使用减毒的、活的或杀死的病原体作为疫苗，这种模式的接种疫苗主要负责消灭诸如脊髓灰质炎、天花等疾病。动物细胞培养技术的快速进展导致基于细胞培养的疫苗的发展，其中，大规模培养、纯化、灭活病源性的生物，并用作疫苗。对于诸如脊髓灰质炎、狂犬病、麻疹等疾病，广泛使用杀死或灭活的病毒做为疫苗的用途。在本接种疫苗方法中，病毒以非感染的形式呈递给免疫系统，因此，个体能增加抗病毒的免疫应答。杀死的或灭活的病毒通过直接产生抗病毒免疫原的T-辅助细胞和体液免疫应答来提供保护。然而，在这种类型的接种疫苗中，因为病毒不能复制或经历感染循环，不会产生由细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)介导的细胞介导免疫应答。在缺乏足够的CTL应答的情况下，这些疫苗经常不能赋予抗病原体的完全保护。与基于杀死的或灭活的病毒疫苗相关联的另一个主要问题是其高的生产成本。尽管可以商购得到一些针对疾病如狂犬病的基于组织培养的灭活病毒疫苗，但使用组织培养的方法获得高滴度病毒的高生产成本使得这些疫苗在世界很多地方，特别是发展中国家变得很不经济，而在这些地方对基于灭活病毒疫苗的需求远超过供应。因此，这些类型疫苗的一个主要缺点就是高的生产成本和大量生产的困难。在疫苗制剂中减少灭活病毒的量，而不损害疫苗效力的策略能降低基于灭活病毒疫苗的生产成本。因此，有必要开发一种新型疫苗，该疫苗能克服与基于灭活病毒疫苗相关联的所有或某些缺点。

因为质粒DNA能以很低的成本生产并且能在室温贮藏，所以认为质粒DNA作为疫苗的用途具有重要意义。在Wolff等人进行的“质粒或裸”DNA体内接种的精液研究中，表明编码几种不同报道基因的质粒DNA的直接肌肉内接种能在肌肉细胞内诱导蛋白质的表达(1)。这一研究为以下观点提供了强有力的基础，即纯化的/重组核酸(“裸DNA”)可以被递送到体内并且能指导蛋白的表达。这些发现进一步在Tang等人研究中得到扩展(2)，他们证明注射了编码hGH的质粒DNA的小鼠能诱导抗原特异的抗体应答。随后，Ulmer等人(3)和Robinson等人(4)证明DNA疫苗能分别保护小鼠或小鸡免受流感的感染，这提供了DNA接种怎样介导保护性免疫的显著例子。小鼠研究进一步记载了抗体和CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞应答(CTL)都能诱发出来(3，4)，这与DNA疫苗激发体液和细胞免疫是一致的。这一研究后，又有几篇报告证明了DNA疫苗在实验模型中诱导保护性免疫应答以抗包括癌症在内的几种感染性疾病的用途。这一技术在关于DNA疫苗的文献中有很丰富的记载，关于该主题，从出版的一些书籍(5-9)和综述文章中可以很明显的看出来。关于这一领域所取得的进展，一个DNA疫苗的专门网站也提供了有价值的信息(39)。进一步也可以得到DNA疫苗在动物和人临床试验中应用的指南。其它有助于理解和进行DNA疫苗技术的信息可在以下专利中找到，即专利US05580859、US05589466、US05620896、US05736524、US05939400、US05989553、US06063385、US06087341、US06090790、US06110898、US06156322、US05576196、US05707812、US5643578、US0557619、US0570781、US05916879、US05958895、US05830876、US05817637、US6133244、US6020319、US5593972、W000/24428、WO99/51745、WO99/43841、WO99/388880、WO99/02132、WO98/14586、WO98/08947、WO98/04720、WO00/77188、WO00/77043、WO00/77218、WO0077188、WO00037649、WO00044406、WO09904009、WO00053019、W00050044、WO00012127、WO09852603、WO9748370和WO097730587。可得到的大量关于DNA疫苗的文献表明DNA疫苗在预防和治疗包括癌症在内的一些感染性疾病方面具有良好的前景。在几种动物模型已经很好地建立了DNA疫苗诱导保护性免疫的一般性应用，并且已经进行到人一期临床试验。过去许多年开展的研究表明，对于某些疾病，单独的DNA接种不能产生预期的效果，但如果联合使用其它的预防性或治疗性的策略就能产生预期的效果。一个如现有技术“启动-加强(prime-boost)策略”所提及的策略包括施用DNA疫苗以“启动”免疫系统，随后施用重组蛋白或活的减毒疫苗或基于灭活的病原体疫苗以“加强”免疫系统(41-59)。除了启动-加强(prime-boost)策略之外，在现有技术中描述了几种提高DNA疫苗效力的其它策略。这些策略包括：

1.共接种多个表达病原体不同抗原的质粒或表达病原体不同抗原多个表位的质粒(60-71)。

2.共接种编码细胞因子或共刺激分子的质粒和表达目的抗原的质粒(72-94)。

3.在DNA疫苗制剂中包含一些化合物如皂甙、明矾、壳聚糖、脂质体、阳离子脂质等化合物(95-106)。

4.在质粒DNA中包含如CpG基序之类的特异序列(107-117)。

而且，证明对质粒载体和/或编码抗原的基因进行修饰的各种策略能提高DNA疫苗的效力(118-136)。因此，存在开发能提高DNA疫苗效力的新的组合物的余地。

发明概述

本发明描述了一种通过在DNA疫苗制剂中添加少量灭活病毒来增强DNA疫苗效力的新的方法。在一个实施方案中，本发明致力于开发含有DNA疫苗和灭活病毒的联合疫苗。在另一个实施方案中，本发明致力于开发含有比基于传统灭活病毒疫苗中存在的灭活病毒更低量的灭活病毒疫苗。本发明也描述了一种生产抗狂犬病毒的新的疫苗组合物的方法。

附图说明

图1为编码狂犬病毒糖蛋白的狂犬病毒DNA疫苗质粒(pCMVRab)的示意图。

发明详述

本发明描述了一种新的抗传染性疾病的脊椎动物免疫方法，该方法使用一种疫苗制剂，其含有最低量的杀死或灭活形式的病毒以及编码存在于灭活病毒中的一种或多种多肽的质粒DNA。本发明中描述的方法可用来开发一种联合疫苗，主要包含灭活病毒和编码病毒的一种或多种多肽的质粒DNA。当以存在于联合疫苗中的数量使用包含灭活病毒和DNA疫苗的疫苗制剂时，其比单独含有灭活病毒或单独含有DNA疫苗的疫苗制剂具有更高的效力。如本发明所有实施方案所述事实，本疫苗制剂不包含活的或减毒病毒。

本发明在开发联合疫苗中的用途可以用狂犬病毒作为例子来解释，但由于涉及DNA疫苗或基于灭活病毒的疫苗所诱发的保护性免疫机理对所有脊椎动物病毒都是相似的，故本发明的方法对其它脊椎动物病毒也是适用的。

本发明所描述的效力是指疫苗诱导病毒中和抗体和/或保护免疫的宿主抗随后的病毒攻击的能力。在一个实施方案中，通过用快速荧光聚焦抑制试验或RFFIT测量免疫动物血清中狂犬病毒中和抗体的效价评价狂犬病疫苗效力(137)。在另外一个实施方案中，通过免疫宿主体内抗狂犬病毒攻击的狂犬病疫苗所赋予的的保护水平评价狂犬病疫苗效力。

使用本领域已知的任何脊椎动物细胞系，通过细胞/组织培养的方法可以生产本发明所描述的基于灭活病毒的疫苗。例如，灭活狂犬病毒可以如美国专利3423505、3585266、4040904、3769415、4115195、3397267、4664912和4726946所描述的那样用脊椎动物细胞培养来生产。在一个实施方案中，产自小鸡胚胎细胞的纯化的小鸡胚胎细胞狂犬病疫苗(PCEC)和狂犬病DNA疫苗一起联合使用。在另一个实施方案中，产自Vero细胞的纯化的Vero细胞狂犬病疫苗(PVRV)与狂犬病DNA疫苗一起联合使用。在另一个实施方案中，产自幼仓鼠肾(BHK)细胞的狂犬病毒被用作灭活狂犬病毒的来源。进一步，认为本发明的方法适合脊椎动物物种如鼠科动物、犬科动物、绵羊科动物或人类的免疫。在一个实施方案中，鼠科动物物种是小鼠。在另一个实施方案中，犬科动物物种是狗。在另一个实施方案中，牛科动物物种是牛。

联合疫苗中灭活病毒的数量可以广泛变化，这取决于基于灭活病毒的疫苗制剂的免疫原性和效力。在一个实施方案中，联合疫苗中灭活狂犬病毒的数量比现有技术已知的组织培养狂犬病疫苗中存在的病毒数量低600倍。在仔细滴定分析不同稀释度的灭活狂犬病毒疫苗的基础上，确定与狂犬病DNA疫苗一起使用的灭活狂犬病毒的数量。狂犬病毒攻击后，在免疫宿主中不能诱导出可测量的VNA水平和/或不能赋予100％保护的剂量被选作同DNA疫苗一起使用的剂量，以开发更高效力的联合疫苗。疫苗制剂中存在的灭活狂犬病毒和质粒DNA的最终浓度应该用现有技术所描述的标准程序来确定，如那些用世界卫生组织(WHO)的疫苗标准的美国或英国药典中所提到的程序，这是生产狂犬病疫苗领域的专业技术人员所熟知的。

正如本发明所使用的，质粒DNA是指染色体外的、共价闭合的环状DNA分子，该DNA分子能在细菌细胞中自主复制，并由转录单位(即编码多肽的核苷酸序列)组成，这些转录单位与存在于目的病毒中的转录单元相似或相同，其可操作性地与在脊椎动物细胞中蛋白表达所必需的转录和翻译调节序列连接在一起。

本发明所描述的质粒转录单位可以含有任何大量的已知的真核启动子，如那些在动物病毒和包括人类在内的基因组中所发现的启动子。进一步，转录单位可以含有编码脊椎动物病原体如病毒、细菌、寄生虫等多肽的DNA。在一个优选实施方案中，转录单位包含编码狂犬病毒表面糖蛋白的DNA。

将编码脊椎动物病原体多肽的DNA导入质粒可以用现有技术所描述的任何已知的程序来实现(138)。进一步，将这些质粒导入细菌、在营养培养基中培养以及从细菌培养物中纯化质粒的方法可以使用现有技术已知的任何方法来实现(138，139)。

下面给出示例本发明各个方面的实施例。这些实施例仅仅是示例性的而不是以任何方式限制本公开的其它部分。

实施例1：狂犬病DNA疫苗的制备和纯化

狂犬病DNA疫苗质粒的构建如下。用限制性内切酶HindIII和PstI消化pCMVmtBL质粒分离巨细胞病毒立即早期启动子和内含子，并将其克隆在pEGFPI质粒(Clontech，CA，USA)的HindIII和PstI位点，得到pCMVEGFP构建体。从pgt155载体上分离出做为BglII限制性片段的编码狂犬病毒表面糖蛋白cDNA(141)，并将其克隆至pCMVEGFP的BamHI位点。最后，以XbaI-NotI片段的形式切除编码EGFP的cDNA，载体重新连接得到pCMVRab构建体。在构建pCMVRab过程中使用了现有技术所描述的标准重组DNA技术(138)。pCMVRab的示意图如图1所示。用碱裂解方法(138，139)进行pCMVRab的大量分离和纯化。最终的质粒制备物溶解在盐(0.15M NaCl)中，并用作狂犬病DNA疫苗。上述方法的多个变化可用于狂犬病DNA疫苗质粒的开发，这一点是制备真核表达质粒的本领域技术人员所熟知的。例如，编码狂犬糖蛋白的cDNA可以从其它狂犬病毒株系如Challenge Virus Standard(CVS)、Street-Alabama-Dufferin(SAD)、Evelyn RokitnikiAbelseth(ERA)等获得。类似地，巨细胞病毒启动子可以从多种商购而来的真核表达质粒中获得。

实施例2：从脊椎动物细胞组织培养物中制备灭活狂犬病毒疫苗。

可以用现有技术公开的任何方法制备灭活的狂犬病毒疫苗，如在美国专利3423505、3585266、4040904、3769415、4115195、3397267、4664912、4726946中所描述的方法。简言之，用狂犬病毒感染脊椎动物细胞如Vero细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞等。用过滤的方法从细胞碎片中分离得到病毒，然后通过加入β-丙内酯或溴乙亚胺来灭活病毒。然后，将病毒浓缩，取出一部分，采用接种敏感的单层细胞培养物和小鼠脑内接种的方法检验其中不含感染性的病毒。浓缩的病毒制备物与佐剂如氢氧化铝(每剂量3毫克)混合，该液态疫苗用作动物接种。可替代地，可以通过区带离心进一步纯化病毒，之后，在化合物如人血清白蛋白、麦芽糖存在的情况下冻干病毒，该冻干的病毒制备物即用作狂犬病疫苗。在一个实施方案中，由印度的Indian Immunologicals Ltd.，Hyderabad，生产的纯化Vero细胞来源的狂犬病疫苗(PVRV)，已知也称为Abhayrab^R，被用作灭活狂犬病毒疫苗的来源。在另一个实施方案中，印度Hoechst Marion Roussel生产的纯化小鸡胚胎细胞(PCEC)来源的狂犬病疫苗，已知也称为Rabipur^R，被用作灭活狂犬病毒疫苗的来源。在另一个实施方案中，印度Indian Immunologicals Ltd.，Hyderabad从幼仓鼠肾(BHK)细胞生产的兽用狂犬病毒疫苗，已知称为Raksharab^R，被用作灭活狂犬病毒疫苗的来源。

实施例3：制备包含灭活狂犬病毒和狂犬病DNA疫苗的联合疫苗。

灭活的狂犬病毒疫苗如Abhayrab^R，Raksharab^R或Rabipur^R用盐稀释625倍，取0.5毫升稀释的样品与100毫克狂犬病DNA疫苗混合，用该混合物做为联合狂犬病疫苗免疫小鼠、狗或牛。必要时，加入氢氧化铝至终浓度为每剂量3毫克。最终的疫苗制备物也可以含有防腐剂如Thiomersol(0.015％)，并且可以被用作液态或冻干疫苗。

实施例4：在鼠的狂犬病毒攻击模型中评价狂犬病DNA疫苗、灭活的狂犬病毒疫苗

以及包含灭活的狂犬病毒和DNA疫苗的联合疫苗的效力。

在鼠的外周狂犬病毒攻击模型中评价狂犬病DNA疫苗的效力。十只小鼠为一组，每只小鼠接种100毫克狂犬病DNA疫苗，共两次，每次间隔两周。第二次剂量用药之后两周，在小鼠脚肉趾部位接种challenge virus standard(CVS)株系的毒性狂犬病毒并观察14天。表1给出的结果显示仅有80％的用狂犬病DNA疫苗接种的小鼠从狂犬病毒攻击中得到保护。因此，我们研究了是否在狂犬病DNA疫苗制备物中添加少量灭活的狂犬病毒能得到更高的保护水平。在加入灭活的狂犬病毒到DNA疫苗之前，我们检验了Abhayrab^R的效力，这是一种灭活的狂犬病毒疫苗，产自鼠的狂犬病毒攻击模型的Vero细胞。在每一小瓶Abhayrab^R(大于2.5IU)中加入两百毫升盐水，十只小鼠为一组，每只肌内注射0.1毫升疫苗。按5倍稀释制备Abhayrab^R系列溶液(1∶5、1∶25、1∶125、1∶625)，取0.1毫升每一稀释的Abhayrab^R制备物，通过腹膜内途径注射每一只小鼠。14天后，重复该免疫。第二次剂量用药之后两周，在小鼠肉趾部位接种CVS株系的毒性狂犬病毒，并观察14天。表1给出的结果显示未稀释的Abhayrab^R疫苗和5、25、125倍稀释的疫苗赋予了抗狂犬病毒攻击的100％保护。既然这些稀释物中的灭活病毒疫苗赋予100％的保护，因此，不在DNA疫苗中一起使用这些稀释度。然而，当稀释到625倍时，Abhayrab^R的效力显著减少，只有50％的小鼠在狂犬病毒攻击中得到保护。用赋予次优保护的Abhayrab^R的剂量研究灭活的狂犬病毒对狂犬病DNA疫苗效力的影响。重复免疫实验，单独用0.1毫升625倍稀释的Abhayrab^R或单独用100毫克狂犬病DNA疫苗或两者联合使用接种小鼠两次，每次间隔两周。两周后对小鼠进行攻击，表1给出的结果显示Abhayrab^R和狂犬病DNA疫苗分别赋予50％和80％的保护，但这两种疫苗联合使用导致抗狂犬病毒攻击的100％保护。因此，在狂犬病DNA疫苗中添加次优剂量的灭活狂犬病毒致使开发出一种具有更高效力的新的联合狂犬病疫苗。

为研究是否产自小鸡胚胎细胞的灭活的狂犬病毒也能增强狂犬病DNA疫苗的效力，用一种产自小鸡胚胎细胞的灭活的狂犬病毒Rabipur^R进行了病毒攻击实验。在每一小瓶Rabipur^R(大于2.5IU)中加入两百毫升盐水，取100毫升，用盐水稀释到625倍。用稀释的疫苗(100毫升)单独或与狂犬病DNA疫苗联合注射每只小鼠两次，每次间隔两周。如上所述，最后一次免疫两周后对小鼠进行攻击。表1给出的结果显示625倍稀释的Rabipur^R赋予抗狂犬病毒攻击的60％保护，但与狂犬病DNA疫苗联合使用，保护水平上升至100％。

因此，产自Vero细胞或小鸡胚胎细胞的灭活的狂犬病毒疫苗制备物都能增强狂犬病DNA疫苗的效力。

实施例5：在鼠模型中用RFFIT评价狂犬病DNA疫苗、灭活的狂犬病毒疫苗以及包含灭活的狂犬病毒和DNA疫苗的联合疫苗的效力。

狂犬病疫苗的效力也可以通过RFFIT评价其在免疫宿主中诱导病毒中和抗体(VNA)的能力来确定。简言之，在组织培养箱载片小孔中温育不同稀释度的血清与标准剂量的攻击病毒制备物，并使载片在35℃温度下，湿润的二氧化碳培养箱中温育60至90分钟。然后加入BHK细胞(每孔1×10⁵个细胞)，混合物如上所述进一步温育20小时。在磷酸缓冲液中(PBS)洗载片，在冷的丙酮中固定。干燥之后，以合适的稀释度加入共轭结合荧光素异硫氰酸酯的抗狂犬核蛋白，在37℃继续温育20至30分钟。最后，在PBS中漂洗载片并在荧光显微镜下观察。使用已知的程序计算病毒的中和滴度。在滴定实验血清效价的每一测试中使用稀释到1.0IU/毫升效力的国家或国际参考血清，结果以术语IU/毫升表达。诱导VNA效价达0.5及0.5以上IU/毫升的狂犬病疫苗即认为具有保护性。因此，免疫宿主中VNA的水平是狂犬病疫苗效力的测量标准，具有更好效力的疫苗诱导更高的VNA效价。因而，我们研究了是否施用包含625倍稀释的Abhayrab^R和狂犬病DNA疫苗(100毫克)的联合疫苗能在免疫的动物中引起更高的VNA诱导。如上所述，十只小鼠一组，单独用狂犬病DNA疫苗，不同稀释度的Abhayrab^R或联合用625倍稀释的Abhayrab^R和狂犬病DNA疫苗接种每组小鼠。在第二次剂量施用之前(免疫后14天)以及第二次剂量施用之后两周(免疫后28天)，由眼眶后穿刺对小鼠进行取血。收集每组小鼠的血清样本，用RFFIT检测狂犬病VNA的水平。表2给出的结果显示在单独施用单一剂量的狂犬病DNA疫苗、1/625倍稀释的Abhayrab^R或两种联合后14天，产生的VNA效价(IU/毫升)分别为0.287、0.095和1.42。当施用第二剂量两周后分析血清时，单独用狂犬病DNA疫苗、1/625倍稀释的Abhayrab^R或两种联合免疫的小鼠体内VNA效价分别增加到1.96、0.55和4.07。这些结果清楚地显示灭活的狂犬病毒疫苗与狂犬病DNA疫苗的联合使用比单独使用两者之一在小鼠体内诱导更高水平的VNA。

实施例6：在狗体内用RFFIT评价狂犬病DNA疫苗、灭活的狂犬病毒疫苗以及包含灭活的狂犬病毒和DNA疫苗的联合疫苗的效力。

为检验在小鼠体内得到的结果是否能在其它脊椎动物物种体内得到重复，在狗体内重复了免疫实验。用625倍稀释的Abhayrab^R、100毫克狂犬病DNA疫苗或两者联合通过肌肉内途径对狂犬病VNA血清反应阴性的3至4个月龄的狗进行免疫两次，每次间隔两周。每一组包括一只动物。在免疫之后7、14、28和35天对动物进行取血，用RFFIT分析血清中狂犬病VNA的效价。表3给出的结果清楚显示用625倍稀释的Abhayrab^R和DNA疫苗接种的动物体内产生的VNA效价在所有测试的时间点都比单独用DNA疫苗或单独用625倍稀释的Abhayrab^R接种的动物体内所产生的效价高。

因而，灭活的狂犬病毒和狂犬病DNA疫苗联合接种既能在小鼠体内也能在狗体内诱导更高水平的狂犬病VNA。

实施例7：在牛体内用RFFIT评价狂犬病DNA疫苗、灭活的狂犬病毒疫苗以及包含灭活的狂犬病毒和DNA疫苗的联合疫苗的效力

已经证明包含灭活的狂犬病毒疫苗和狂犬病DNA疫苗的联合疫苗在小鼠和狗体内的效力，接着我们又评价了其在大动物模型牛体内的免疫原性。实验中，使用了产自BHK细胞的灭活兽药用狂犬病毒疫苗Raksharab^R和Abhayrab^R。单独用625倍稀释的Abhayrab^R或Raksharab^R，或者与100毫克狂犬病DNA疫苗一起通过肌肉内途径对狂犬病VNA血清反应阴性的12至16个月龄的杂种牛进行免疫接种两次，每次间隔两周，并在免疫后7、14、28和35天收集血样。每一组由3头牛组成，在每一个时间点，收集每一组的牛血清，然后进行RFFIT分析。表4给出的结果清楚显示用灭活的狂犬病毒(Abhayrab^R或Raksharab^R)和狂犬病DNA疫苗接种的牛比单独用灭活的狂犬病毒或单独用狂犬病DNA疫苗免疫的牛有更高水平的狂犬病VNA。

在另一独立的实验中，评价了佐剂如氢氧化铝对联合疫苗(灭活的狂犬病毒+DNA疫苗)效力的影响。在存在或不存在氢氧化铝的情况下，用DNA疫苗、625倍稀释的Raksharab^R或两者一起免疫牛两次，中间间隔两周(第0天和第14天)。在固定的间隔时间对牛进行取血，用RFFIT评价VNA水平。表5给出的结果显示添加氢氧化铝进一步增强了联合狂犬病疫苗的效力。

描述狂犬病DNA疫苗和不同灭活的狂犬病毒疫苗一起使用的这些实施例应被认为是示例而不是限制本发明，本发明是由所附权利要求所限定的。

                            表1

接种了狂犬病DNA疫苗、灭活的狂犬病毒疫苗(Abhayrab^R或Rabipur^R)

          或联合疫苗的小鼠获得的免受狂犬病毒攻击的保护

动物组	狂犬病疫苗	接种的小鼠数目	存活的小鼠数目	保护百分比
					1.	DNA疫苗	10	8	80
2.	AbhayrabR(未稀释)	10	10	100
					3.	AbhayrabR1∶5稀释	10	10	100
4.	AbhayrabR1∶25稀释	10	10	100
					5.	AbhayrabR1∶125稀释	10	10	100
6.	AbhayrabR1∶625稀释	10	5	50
					7.	AbhayrabR1∶625稀释+DNA疫苗	10	10	100
8.	Rabipur1∶625稀释	10	6	60
					9.	Rabipur1∶625稀释+DNA疫苗	10	10	100
10.	盐水	10	0	0

                   表2

狂犬病DNA疫苗、灭活的狂犬病毒疫苗或联合疫苗

  在小鼠体内诱导狂犬病毒中和抗体(VNA)。

动物组	狂犬病疫苗	VNA效价(IU/ml)
				免疫后第14天	免疫后第28天
		1.	DNA疫苗			0.287	1.96
2.	AbhayrabR(未稀释)			2.46	4.65
		3.	AbhayrabR1∶5稀释			0.62	2.82
4.	AbhayrabR1∶25稀释			0.5	2.13

5.	AbhayrabR1∶125稀释	0.19	1.0
				6.	AbhayrabR1∶625稀释	0.095	0.55
7.	AbhayrabR1∶625稀释+DNA疫苗	1.42	4.07
				8.	RabipurR1∶625稀释	0.095	0.38
9.	RabipurR1∶625稀释+DNA疫苗	0.54	4.26

                         表3

狂犬病DNA疫苗、灭活的狂犬病毒疫苗(Abhayrab^R)或联合疫苗

               在狗体内诱导狂犬病毒中和抗体(VNA)。

动物组	狂犬病疫苗	狗的数目	VNA效价(IU/ml)#
									第0天	第7天	第14天	第21天	第28天	第35天
			1.	DNA疫苗	1	＜0.095	＜0.095	0.217							0.575	0.76	1.0
2.	AbhayrabR(1∶625稀释)	1							＜0.095	＜0.095	0.217	0.28	0.5	0.575
			3.	DNA疫苗+AbhayrabR(1∶625稀释)	1	＜0.095	＜0.095	0.575							2.0	3.02	3.02

                               表4

狂犬病DNA疫苗、灭活的狂犬病毒疫苗(Abhayrab^R或Raksharab^R)或联合疫苗

               在牛体内诱导狂犬病毒中和抗体(VNA)

动物组	狂犬病疫苗	牛的数目	VNA效价(IU/ml)
									第0天	第7天	第14天	第21天	第28天	第35天
			1.	DNA疫苗	3	＜0.095	0.66	0.36							0.80	0.87	0.96
2.	AbhayrabR(1∶625稀释)	3							＜0.095	0.21	0.33	0.32	0.47	0.64

3.	DNA疫苗+AbhayrabR(1∶625稀释)	3	＜0.095	0.34	0.76	2.0	3.5	3.82
									4.	RaksharabR(1∶625稀释)	3	＜0.095	0.14	0.21	0.31	0.54	1.06
5.	DNA疫苗+RaksharabR(1∶625稀释)	3	＜0.095	0.16	0.28	1.81	2.68	3.25

                              表5

佐剂如氢氧化铝对狂犬病DNA疫苗、灭活的狂犬病毒疫苗(Raksharab)或联

        合疫苗在牛体内诱导狂犬病毒中和抗体(VNA)的影响

动物组	狂犬病疫苗	牛的数目	VNA效价(IU/ml)
							第0天	第14天	第21天	第60天
			1.	DNA疫苗	4	＜0.095					0.09	0.29	0.39
2.	RaksharabR(1∶625稀释)	4					＜0.095	0.13	0.30	0.11
			3.	DNA疫苗+RaksharabR(1∶625稀释)	4	＜0.095					0.56	1.28	1.37
4.	RaksharabR(1∶625稀释)+氢氧化铝	4					＜0.095	0.20	0.79	0.49
			5.	DNA疫苗+RaksharabR(1∶625稀释)+氢氧化铝	4	＜0.095					0.79	2.12	1.88

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85.Kim JJ，Simbiri KA，Sin JI，I Dang K，Oh J，Dentchev T，Lee D，Nottingham LK，Chalian AA，McCallus D，Ciccarelli E，Agadjanyan MG，Weiner DB.1999，细胞因子分子佐剂调节HIV-1和SIV DNA疫苗构建体诱导的免疫应答(Cytokinemolecular adjuvants modulate immune responses induced by DNA vaccine constructsfor HIV-1 and SIV)，J.Interferon Cytokine Res.19：77-84。

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89.Kim JJ，Trivedi NN Nottingham LK，Morrison L，Tsai A，Hu Y，Mahalingam S，DangK，Ahn L，Doyle NK，Wilson DM，Chattergoon MA，Chalian AA，Boyer JD，Agadjanyan MG，Weiner DB，1998，通过用DNA免疫原共施用细胞因子基因表达盒子，体内免疫应答的放大和定向调节(Modulation of amplitude and direction ofinvivo immune responses by co-administration of cytokine gene expression cassettes withDNAimmunogens)，Eur.J.Immunol.28：1089-103。

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Claims (10)

1、一种新的疫苗制剂，包含具有编码一个或多个病毒多肽的DNA序列的质粒和灭活病毒制备物。

2、如权利要求1所述的新的疫苗制剂，其中具有编码一个或多个病毒多肽的DNA序列的质粒具有以下特征：

a.来自病毒编码多肽的基因序列，当其在目的物种中表达时能够赋予靶物种抗病毒的保护性免疫力；

b.来自真核基因组的启动子和增强子序列，当其与病毒基因序列相连时能引起脊椎动物细胞中病毒多肽的合成；以及

c.细菌复制起点。

3、如权利要求1所述的新的疫苗制剂，其中，质粒携带有编码如构建体pCMVRab所描述的狂犬病毒表面糖蛋白的DNA序列。

4、如权利要求1所述的新的疫苗制剂，包含产自脊椎动物细胞如Vero细胞、幼仓鼠肾细胞、小鸡胚胎细胞等的灭活病毒制备物。

5、如权利要求1所述的新的疫苗制剂，其中灭活病毒是狂犬病毒。

6、一种生产新的包含特异DNA疫苗和灭活的病毒制备物的疫苗制剂的方法。

7、如权利要求6所述的生产新的疫苗制剂的方法，包括下面步骤：

a)构建能在脊椎动物细胞中表达病毒多肽的质粒；

b)由已知的方法大规模生产质粒；

c)由已知的方法生产灭活的病毒；

d)混合质粒构建体和灭活的病毒制备物；

e)pH值在8.0和9.0之间的缓冲液如磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液等；

f)盐如氯化钠；

g)稳定剂或防腐剂如Thiomersol、人血清白蛋白、麦芽糖等；

h)可选使用佐剂如氢氧化铝；

i)混合制备物；以及

j)按定义的剂量用瓶子分装制备物。

8、如权利要求6所述的一种生产新的抗狂犬病疫苗制剂的方法，包括下面步骤：

a)用已知的方法制备具有狂犬病毒表面糖蛋白基因序列的质粒构建体(pCMVRab)；

b)用已知的方法制备灭活的狂犬病毒制备物；

c)混合pCMVRab(1-200毫克)与灭活的狂犬病毒制备物；

d)pH值在8.0和9.0之间的缓冲液如磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液等；

e)盐如氯化钠；

f)稳定剂或防腐剂如Thiomersol、麦芽糖、人血清白蛋白等；

g)可选使用佐剂如氢氧化铝；

h)用已知方法混合制备物；以及

i)用已知方法用瓶子分装制备物。

9、包含具有编码一个或多个病毒多肽DNA序列的质粒和灭活病毒的新的疫苗制剂在抗病毒疾病的脊椎动物免疫中的用途。

10、包含具有编码狂犬病毒表面糖蛋白DNA序列的质粒和灭活狂犬病毒的新的狂犬病疫苗制剂在脊椎动物的免疫，如牛、狗、人等的用途。

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