DE69935136T2

DE69935136T2 - DNS Pferdeimpfstoffe adjuviert mit Acryl- oder Methacrylpolymersäuren oder EMA (R)

Info

Publication number: DE69935136T2
Application number: DE69935136T
Authority: DE
Inventors: Francis Jean-Christophe Audonnet; Maarten Jules MINKE
Original assignee: Merial SAS
Current assignee: Boehringer Ingelheim Animal Health France SAS
Priority date: 1998-04-03
Filing date: 1999-03-22
Publication date: 2007-11-29
Anticipated expiration: 2019-03-23
Also published as: CA2327389A1; WO1999051269A1; DK1066055T3; AR037062A1; JP2002510651A; ZA992478B; PL194348B1; FR2776928A1; US7163926B1; PL343602A1; ATE353670T1; EP1066055A1; ES2283105T3; CY1108013T1; PT1066055E; FR2776928B1; AU744964B2; AU2844899A; DE69935136D1; BR9909342A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Verbesserung von DNA-Impfstoffen, auch Plasmid- oder Polynucleotid-Impfstoffe genannt, die ein oder mehrere heterologe Gene umfassen und in vivo exprimieren. Sie betrifft insbesondere solche verbesserten Impfstoffe, die Verwendung von bestimmten Adjuvantien zur Herstellung solcher Impfstoffe sowie die betreffenden Impfverfahren. Gegenstand ist ferner ein Verfahren zur Herstellung dieser Impfstoffe.
Die Patentanmeldungen WO-A-90 11092, WO-A-93 19183, WO-A-94 21797, WO-A-95 11307 und WO-A-95 20660 verwendeten die kürzlich entwickelte Technik der Polynucleotid-Impfstoffe. Es ist bekannt, dass diese Impfstoffe ein Plasmid verwenden, das in der Lage ist, in den Zellen des Wirts ein in das Plasmid inseriertes Gen zu exprimieren, das ein Immunogen codiert. Alle Verabreichungswege werden vorgeschlagen (intraperitoneal, intravenös, intramuskulär, transkutan, intradermal, mukosal, etc.). Es können auch verschiedene Impfmittel verwendet werden, wie auf der Oberfläche von Goldpartikeln abgelagerte DNA, die eingeschossen wird, um in die Hautzellen des Tieres einzudringen (Tang et al., Nature 356, 152-154, 1992), und das Injizieren per Flüssigkeitsstrahl, was eine gleichzeitige Transfektion in der Haut, in dem Muskel, in den Fettgeweben und in den Brustgeweben erlaubt (Furth et al., Analytical Biochemistry, 205, 365-368, 1992).
Diese Polynucleotid-Impfstoffe können als nackte DNA oder als Komplex mit Liposomen oder kationischen Lipiden verwendet werden.
Gegenstand der Erfindung ist es, die Wirksamkeit der DNA-Impfstoffe zu verbessern, indem sie neue einfache Impfstoff-Formulierungen vorschlägt, die leicht herzustellen sind.
Gegenstand der Erfindung ist es ferner, eine solche Lösung bereitzustellen, die keine starken Wechselwirkungen zwischen der DNA und dem Drittbestandteil zur Folge hat, die zur Bildung eines Komplexes zu führen vermögen.
Gegenstand der Erfindung ist es auch, eine solche Lösung vorzuschlagen, die es erlaubt, entweder durch einfaches Mischen stabile, in flüssiger Form formulierte Impfstoffe herzustellen oder einen flüssigen Impfstoff durch Mischen nach Rezept unschwer herzustellen.
Die Anmelderin hat überraschenderweise gefunden, dass die Verbindungen der Klasse der Carbomere diesen verschiedenen Zielsetzungen entsprechen und insbesondere in der Lage sind, einfach, allerdings in sehr vorteilhaften Maßen, die nackten DNA-Impfstoffe zu adjuvieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher einen DNA-Impfstoff, der eine nackte DNA, insbesondere ein zirkuläres Impfstoff-Plasmid, supercoiled oder nicht, oder ein lineares DNA-Molekül umfasst, das eine Nucleotidsequenz einschließt und in vivo exprimiert, die ein antigenes Polypeptid codiert, vorzugsweise ein Gen eines Krankheitserregers, und der mindestens ein Adjuvans umfasst, das aus der Gruppe der Acrylsäure- oder Methacrylsäurepolymere und der Copolymere aus Maleinsäureanhydrid und aus Alkenylderivat ausgewählt ist.
Wie es derzeit Allgemeinen akzeptiert ist, wird unter nackter DNA eine DNA-Transkriptionseinheit in Form einer Polynucleotidsequenz verstanden, die mindestens eine Nucleotidsequenz, die ein antigenes Polypeptid oder ein Antigen einer Valenz codiert, und die zu seiner in vivo Expression notwendigen Elemente einschließt. Die zirkuläre Plasmid-Form, supercoiled oder nicht, wird bevorzugt. Unter Valenz wird bei der vorliegenden Erfindung mindestens ein Antigen verstanden, das den Schutz vor einem Krankheitserreger gewährleistet, wobei die Valenz ein oder mehrere natürliche oder modifizierte Gene eines oder mehrerer Stämme des betrachteten Krankheitserregers als Unter-Valenz enthalten kann.
Die bevorzugten adjuvanten Verbindungen sind die Acrylsäure- oder Methacrylsäure-Polymere, die insbesondere mittels Polyalkenylethern von Zuckern oder Polyalkoholen vernetzt sind. Diese Verbindungen sind unter der Bezeichnung Carbomer bekannt (Pharmeuropa vol. 8, Nr. 2, Juni 1996). Der Fachmann kann auch auf die US-A-2909462 (durch Bezugnahme eingeschlossen) verwiesen werden, die solche Acrylpolymere beschreibt, die mittels einer polyhydroxylierten Verbindung mit mindestens 3, vorzugsweise nicht mehr als 8 Hydroxylgruppen vernetzt sind, wobei die Wasserstoffatome von mindestens 3 Hydroxylgruppen durch ungesättigte aliphatische Reste mit wenigstens 2 Kohlenstoffatome ersetzt sind. Die bevorzugten Reste sind diejenige, die 2 bis 4 Kohlenstoffatomen enthalten, z. B. Vinyle, Allyle, und andere ethylenisch ungesättigte Gruppen. Die ungesättigten Reste können selbst andere Substituenten, wie Methyl, enthalten. Die unter der Bezeichnung Carbopol^® (BF Goodrich, Ohio, USA) vertriebenen Produkte sind besonders geeignet. Sie sind mittels einer Allylsaccharose oder mittels Allylpentaerythritol vernetzt. Unter ihnen können Carbopol^® 974P, 934P und 971P genannt werden.
Unter den Copolymeren aus Maleinsäureanhydrid und aus Alkenylderivat werden die EMA^® (Monsanto) bevorzugt, die lineare oder vernetzte Maleinsäureanhydrid-Ethylen-Copolymere, zum Beispiel mittels Divinylether vernetzt, sind. Es kann auf J. Fields et al., Nature, 186: 778-780, 4 Juni 1960 (durch Bezugnahme eingeschlossen) verwiesen werden.
Was ihre Struktur betrifft, werden die Acrylsäure- oder Methacrylsäurepolymere und die EMA^® vorzugsweise aus Grundeinheiten der folgenden Formel gebildet:
wobei:

– R₁ und R₂, gleich oder verschieden, H oder CH₃ darstellen
– x = 0 oder 1, vorzugsweise x = 1 bedeutet
– y = 1 oder 2, mit x + y = 2, bedeutet.

Für die EMA^® gilt x = 0 und y = 2. Für die Carbomere gilt x = y = 1.
Die Lösung dieser Polymere in Wasser ergibt eine saure Lösung, die vorzugsweise bis zum physiologischen pH neutralisiert wird, um die adjuvante Lösung zu ergeben, in die der eigentliche Impfstoff eingearbeitet wird. Die Carboxylgruppen des Polymers liegen dann teilweise in der Form COO^– vor.
Vorzugsweise wird eine Lösung von erfindungsgemäßem Adjuvans, insbesondere eine Carbomer-Lösung, in destilliertem Wasser hergestellt, vorzugsweise in Gegenwart von Natnumchlorid, wobei die erhaltene Lösung einen sauren pH-Wert aufweist. Diese Stammlösung wird verdünnt durch Zusatz der notwendigen Menge (zum Erhalt der gewünschten Endkonzentration) oder eines großen Teils davon, von mit NaCl beladenem Wasser, vorzugsweise physiologische Kochsalzlösung (9 g/l NaCl), in einem oder mehreren Schritten unter gleichzeitiger oder späterer Neutralisierung (pH 7,3 bis 7,4), vorzugsweise mit NaOH. Diese Lösung mit physiologischem pH-Wert wird an sich zum Mischen mit dem Impfstoff, der insbesondere in lyophilisierter Form, flüssig oder tiefgefroren aufbewahrt wird, verwendet.
Die Polymerkonzentration in der fertigen Impfstoff-Zusammensetzung beträgt 0,01 bis 2 % G/V, insbesondere 0,06 bis 1 % G/V, vorzugsweise 0,1 bis 0,6 % G/V.
Zur Impfung von Schweinen kann die Erfindung insbesondere Anwendung finden bei der Impfung gegen das Virus der Aujeszky'schen Krankheit (PRV-Virus oder Pseudorabiesvirus), gegen das Schweine-Influenzavirus (virus influenza porcin, SIV), gegen das Virus des Porcinen Reproduktiven und Respiratorischen Syndroms (PRRS-Virus), gegen das Virus der Schweine-Parvovirose (PPV-Virus), gegen das Virus der klassischen Schweinepest (HCV-Virus, oder Hog Cholera Virus) und gegen das Bakterium, das für die Actinobacillose (A. pleuropneumoniae) verantwortlich ist. Die bei der Erfindung verwendbaren Plasmide enthalten für jede Valenz ein oder mehrerer der Gene, die die Hauptimmunogene der betrachteten Krankheitserreger codieren. Insbesondere können die Gene gB und gD für das Virus der Aujeszky'schen Krankheit, die Gene HA, NP, N für das Schweine-Influenzavirus, die Gene ORF5 (E), ORF3, ORF6 (M) für das PRRS Virus, VP2 für das Virus der Parvovirose, E2, E1 + E2, E1 + E2 + C für das Virus der klassischen Schweinepest und apxI, apxII und apxIII für A. pleuropneumoniae genannt werden. Besonders vorteilhaft kann auf die Formulierung der Polynucleotid-Impfstoffe verwiesen werden, die in der durch Bezugnahme eingeschlossenen Patentanmeldung WO-A-98 03 658 (FR-A-2 751 224) beschrieben sind, die Impfstoffe gegen die respiratorischen und reproduktiven Pathologien der Schweine betrifft. Diese Anmeldung beschreibt insbesondere einige Plasmide, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung in Kombination mit einem erfindungsgemäßen Adjuvans direkt als Beispiele verwendet werden können. Der Fachmann kann demnach mit den erfindungsgemäßen Adjuvantien die spezifisch in dieser früheren Anmeldung beschriebenen Plasmide kombinieren, nämlich pAB090, das das Gen gB des PRV-Virus umfasst, pPB098, das das Gen gD des PRV-Virus umfasst, pPB143, das das Gen HA der Schweinegrippe, Stamm H1N1, umfasst, pPB142, das das Gen NP der Schweinegrippe, Stamm H1N1, umfasst, pPB144, das das Gen HA der Schweinegrippe, Stamm H3N2, umfasst, pPB132, das das Gen NP der Schweinegrippe, Stamm H3N2, umfasst, pAB025, das das ORF5 des PRRS-Virus, Stamm Lelystad, umfasst, pAB001, das das ORF5 des PRRS-Virus, Stamm USA, umfasst, pAB091, das das ORF3 des PRRS-Virus Stamm Lelystad umfasst, pAB092, das das ORF3 des PRRS-Virus Stamm USA umfasst, pAB004, das das Gen VP2 des porcinen Parvovirus umfasst, pAB069, das das Gen E1 des Virus der Schweinepest (HCV) umfasst, pAB061, das das Gen E2 des Virus der Schweinepest (HCV) umfasst, pAB162, das das deletierte Gen apxI von A. pleuropneumoniae umfasst, pPB163, das das deletierte Gen apxII von A. pleuropneumoniae umfasst, pPB174, pPB189 und pPB190, die das deletierte Gen apxIII von A. pleuropneumoniae umfassen.
Für die Impfung von Pferden, können insbesondere die Impfung gegen das Virus der equinen Rhinopneumonie (EHV), insbesondere von Typ 1 (EHV-1) und Typ 4 (EHV-4), gegen das Virus der Pferdegrippe EIV, gegen Tetanus (Cl. tetani), gegen das Virus der Eastern-Equine-Encephalitis (EEV), gegen das Virus der Western-Equine- Encephalitis (WEV) und gegen das Virus der Venezuelan-Equine-Encephalitis (VEV), oder auch gegen die Lyme-Krankheit (B. burgdorferi), gegen die Pferdearteritis (EAV) und gegen Tollwut genannt werden. Unter den Genen, die die erfindungsgemäß verwendbaren Hauptimmunogene codieren, können die Gene gB und gD für die Pferde-Rhinopneumonie-Valenz, insbesondere von Typ 1 und 4, die Gene HA, NA und NP für die Pferdegrippe, die gegebenenfalls durch Mutation oder Deletion modifizierte Untereinheit C für die Tetanus-Valenz, die Gene C und E2 für die Encephalitis, die Gene OspA, OspB und p100 für die Lyme-Krankheit, die Gene E, M und N für die Pferdearteritis, das Gen G für die Tollwut genannt werden. Solche Formulierungen von Polynucleotid-Impfstoffen gegen die Pathologien des Pferdes sind insbesondere in der durch Bezugnahme eingeschlossenen Patentanmeldung WO-A-98 03 198 (FR-A-2 751 226) beschrieben. Genau diese Anmeldung beschreibt einige Plasmide, die bei der vorliegenden Erfindung direkt in Kombination mit einem erfindungsgemäßen Adjuvans verwendbar sind. Der Fachmann kann demnach mit dem erfindungsgemäßen Adjuvans ein Plasmid kombinieren, wie in dieser Anmeldung genau beschrieben, nämlich pAB042, das das Gen gB des EHV-1-Virus umfasst, pAB031, das das Gen gB des EHV-4-Virus umfasst, pAB013, das das Gen gD des EHV-1-Virus umfasst, pAB032, das das Gen gD des EHV-4-Virus umfasst, pAB043, das das Gen HA der Pferdegrippe, Stamm Prag, umfasst, pAB033, das das Gen HA der Pferdegrippe, Stamm Suffolk, umfasst, pAB099, das das Gen HA der Pferdegrippe, Stamm Fontainebleau, umfasst, pAB085, das das Gen NP der Pferdegrippe, Stamm Prag, umfasst, pAB084, das das Gen NP der Pferdegrippe, Stamm Jillin, umfasst, pAB070, das das Gen der Untereinheit C des Tetanus-Toxins umfasst, pAB017, das das Gen OspA von Borrelia burgdorferi umfasst, pAB094, das das Gen E2 des Virus der Eastern-Equine-Encephalitis umfasst, pAB093, das das Gen C des Virus der Eastern-Equine-Encephalitis umfasst, pAB096, das das Gen E2 des Virus der Western-Equine-Encephalitis umfasst, pAB095, das das Gen C des Virus der Western-Equine-Encephalitis umfasst, pAB098, das das Gen E2 des Virus der Venezuelan-Equine-Encephalitis umfasst, pAB097, das das Gen C des Virus der Venezuelan-Equine-Encephalitis umfasst, pAB041, das das Gen G des Virus der Tollwut umfasst.
Für die Impfung von Hunden findet die Erfindung insbesondere Anwendung bei der Impfung gegen das Virus der Carré-Krankheit (CDV), gegen das Canine Parvovirus (CPV), gegen das Canine Coronavirus (CCV), gegen das Canine Herpesvirus (CHV), gegen die Lyme-Krankheit, gegen die Tollwut. Unter den Genen, die die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendbaren Hauptimmunogene codieren, können insbesondere die Gene HA, F, M und N für das Virus der Carré-Krankheit, das Gen VP2 für das Canine Parvovirus, die Gene S und M für das Canine Coronavirus (CCV), die Gene gB und gD für das CHV-Virus, die Gene OspA und OspB und p100 für B. burgdorferi (Lyme-Krankheit), das Gen G für die Tollwut genannt werden. Solche Formulierungen für Polynucleotid-Impfstoffe sind insbesondere in der durch Bezugnahme eingeschlossenen Patentanmeldung WO-A-98 03 199 (FR-A-2 751 227) beschrieben. Der Fachmann kann demnach auf die in dieser Anmeldung beschriebenen Plasmide Bezug nehmen, in Kombination mit den erfindungsgemäßen Adjuvantien. Insbesondere kann er mit den erfindungsgemäßen Adjuvantien die in dieser Anmeldung speziell beschriebenen Plasmide kombinieren, nämlich pAB044, das das Gen HA von CDV umfasst, pAB036, das das Gen F von CDV umfasst, pAB024, das das Gen VP2 des Caninen Parvovirus umfasst, pAB021, das das Gen S von CCV umfasst, pAB022, das das Gen M von CCV umfasst, pAB037, das das Gen gB von CHV umfasst, pAB038, das das Gen gD von CHV umfasst, pAB017, das das Gen OspA von B. burgdorferi umfasst, pAB041, das das Gen G des Virus der Tollwut umfasst.
Für die Impfung von Rindern findet die Erfindung insbesondere Anwendung bei der Impfung gegen das Rinder-Herpesvirus von Typ 1 oder 5 (BHV-1 und BHV-5, das für die nervöse Form der Krankheit verantwortlich ist), das Bovine Respiratorische Syncytialvirus (BRSV), das Bovine Virusdiarrhoe/Mucosal Disease-Virus (BVD), das Rinder-Parainfluenza-Virus von Typ 3 (BPI-3). Unter den Genen, die die Hauptimmunogene codieren, die die Impfung gegen diese Viren ermöglichen, können insbesondere die Gene gB und gD für das Rinder-Herpesvirus, F und G für das Bovine Respiratorische Syncytialvirus, E2, C + E1 + E2 und E1 + E2 für das Bovine Virusdiarrhoe/Mucosal Disease-Virus, HN und F für das Rinder-Parainfluenza-Virus von Typ 3 genannt werden. Solche Formulierungen für Impfstoffe sind insbesondere in der durch Bezugnahme eingeschlossenen Patentanmeldung WO-A-98 03 200 (FR-A-2 751 229) beschrieben. Der Fachmann kann demnach die in dieser Anmeldung beschriebenen Plasmide in Kombination mit den erfindungsgemäßen Adjuvantien verwenden. Insbesondere kann er mit den erfindungsgemäßen Adjuvantien die in dieser Anmeldung speziell beschriebenen Plasmide kombinieren, nämlich pPB156, das das Gen gB von BHV-1 umfasst, pAB087, das das Gen gD von BHV-1 umfasst, pAB011, das das Gen F von BRSV umfasst, pAB012, das das Gen G von BRSV umfasst, pAB058, das das Gen C von BVD umfasst, pAB059, das das Gen E1 von BVD umfasst, pAB060, das das Gen E2 von BVD umfasst, pAB071, das das Gen HN von BPI-3 umfasst, pAB072, das das Gen F von BPI-3 umfasst.
Für die Impfung von Katzen findet die Erfindung insbesondere Anwendung bei der Impfung gegen das Katzenleukämievirus FeLV, insbesondere von Subtyp A und B, das Virus der Katzen-Panleukopenie (FPV), das Virus der Felinen Infektiösen Peritonitis (FIPV), das Coryza-Virus oder das Katzen-Herpesvirus (FHV), das Katzen-Calicivirus (FCV), das Virus der Katzen-Immundefizienz (FIV) und das Virus der Tollwut (Rhabdovirus). Unter den Genen, die die Hauptimmunogene codieren, die die Impfung gegen diese Erreger ermöglichen, können insbesondere die Gene env und gag/pol für die Katzen-Leukämie, VP2 für die Panleukopenie, modifiziertes S (FR-A-2 724 385, durch Bezugnahme eingeschlossen) und M für die Infektiöse Peritonitis, gB und gD für Coryza, Kapsid für die Calcivirose, env und gag/pro für die Katzen-Immundefizienz und G für die Tollwut genannt werden. So sind Formulierungen für Polynucleotid-Impfstoffe in der durch Bezugnahme eingeschlossenen Patentanmeldung WO-A-98 03 660 (FR-A-2 751 223) beschrieben. Der Fachmann kann die Plasmide, wie in dieser Anmeldung beschrieben, mit den erfindungsgemäßen Adjuvantien kombinieren. Insbesondere kann er mit den erfindungsgemäßen Adjuvantien die in dieser Anmeldung speziell beschriebenen Plasmide kombinieren, nämlich pPB179, das das Gen env des FeLV-A-Virus umfasst, pPB180, das das Gen env des FeLV-B-Virus umfasst, pPB181, das das Gen gag/pol von FeLV-A umfasst, pAB009, das das Gen VP2 von FPV umfasst, pAB053, das das modifizierte Gen S des FIPV-Virus umfasst, pAB052, das das Gen M von FIPV umfasst, pAB056, das das Gen N von FIPV umfasst, pAB028, das das Gen gB von FHV umfasst, pAB029, das das Gen gD von FHV umfasst, pAB010, das das Gen C von FCV umfasst, pAB030, das das Gen env von FIV umfasst, pAB083, das das Gen gag/pro von FIV umfasst, pAB041, das das Gen G des Virus der Tollwut umfasst.
Für die Impfung von Vogelarten findet die Erfindung insbesondere Anwendung bei der Impfung gegen das Virus der Marek'schen Krankheit (MDV), das Newcastle-Disease-Virus (NDV), das Virus der Gumboro-Krankheit (IBDV oder Infectious Bursal Disease Virus), das Virus der Infektiösen Bronchitis (IBV oder Virus der Infektiösen Bronchitis), das Virus der Infektiösen Anämie (CAV), das Virus der Infektiösen Laryngotracheitis (ILTV), das Virus der Enzephalomyelitis (AEV oder Virus der Aviären Leukose ALV), das Pneumovirus, und das Virus der Vogelgrippe oder Vogelpest. Unter den Genen, die die bei der vorliegenden Erfindung verwendbaren Hauptimmunogene codieren, können insbesondere die Gene gB und gD für das Virus der Marek'schen Krankheit, HN und F für das Newcastle-Disease-Virus, VP2 für das Virus der Gumboro-Krankheit, S, M und N für das Virus der Infektiösen Bronchitis, C + NS1 für das Virus der Infektiösen Anämie, gB und gD für das Virus der Infektiösen Laryngotracheitis, env und gag/pro für das Virus der Enzephalomyelitis, F und G für das Pneumovirus und HA, N und NP für das Virus der Vogelpest genannt werden. Solche Formulierungen für Polynucleotid-Impfstoffe sind in der durch Bezugnahme eingeschlossenen Patentanmeldung WO-A-98 03 659 (FR-A-2 751 225) beschrieben. Der Fachmann kann sich demnach auf die in dieser Anmeldung beschriebenen Plasmide beziehen, um sie mit den erfindungsgemäßen Adjuvantien zu kombinieren. Insbesondere kann der Fachmann mit den erfindungsgemäßen Adjuvantien die in dieser Anmeldung speziell beschriebenen Plasmide kombinieren, nämlich pAB045, das das Gen gB von MDV umfasst, pAB080, das das Gen gD von MDV umfasst, pAB046, das das Gen HN von NDV umfasst, pAB047, das das Gen F von NDV umfasst, pAB048, das das Gen VP2 von IBDV umfasst, pAB049, das das Gen S1 von IBV umfasst, pAB050, das das Gen M von IBV umfasst, pAB051, das das Gen N von IBV umfasst, pAB054, das das Gen VP1 von CAV umfasst, pAB055, das das Gen VP2 von CAV umfasst, pAB076, das das Gen gB von ILTV umfasst, pAB089, das das Gen gD von ILTV umfasst, pAB086, das das Gen env von AEV umfasst, pAB081, das das Gen gag/pro von AEV umfasst, pAB082, das das Gen G des Pneumovirus umfasst, pAB077, das das Gen HA der Vogelpest Stamm H2N2 umfasst, pAB078, das das Gen HA der Vogelpest Stamm H7N7 umfasst, pAB088, das das Gen NP der Vogelpest Stamm H1N1 umfasst, pAB079, das das Gen N der Vogelpest Stamm H7N1 umfasst.
Jede nackte DNA, insbesondere Plasmid, umfasst einen Promotor, der in der Lage ist, in den Wirtszellen die Expression des Gens, das unter seiner Abhängigkeit eingefügt wurde, sicherzustellen. Es handelt sich im Allgemeinen um einen starken eukaryontischen Promotor, und insbesondere einen frühen CMV-IE-Promotor des Cytomegalovirus menschlichen oder murinen Ursprungs, oder gegebenenfalls auch eines anderen Ursprungs, wie Ratte, Schwein, Meerschweinchen. Allgemeiner, kann der Promotor entweder viralen oder zellulären Ursprungs sein. Als viraler Promotor, außer dem CMV-IE, können der frühe oder späte Promotor des SV 40-Virus oder der LTR Promotor des Rous-Sarkom-Virus genannt werden. Es kann sich auch um einen Promotor des Virus handeln, aus dem das Gen stammt, zum Beispiel der eigene Promotor des Gens. Als zellulärer Promotor können der Promotor eines Gens des Cytoskeletts, wie zum Beispiel der Promoter des Desmins (Bolmont et. al., Journal of Submicroscopic Cytology and Pathology, 1990, 22, 117-122; und Zhenlin et al., Gene, 1989, 78, 243-254), oder auch der Promoter des Actins genannt werden. Wenn mehrere Gene in der gleichen nackten DNA, insbesondere im Plasmid, vorhanden sind, können sie in derselben Transkriptionseinheit oder in zwei unterschiedlichen Einheiten präsentiert werden.
Selbstverständlich kann ein Impfstoff für jede der oben beschriebenen Valenzen mehrere Gene innerhalb der gleichen nackten DNA, insbesondere Plasmid, und/oder mehrere nackte DNAs, insbesondere Plasmide, die jeweils ein oder mehrere Gene des gleichen Virus enthalten, kombinieren.
Gegenstand der Erfindung sind auch multivalente rekombinante Impfstoffe, d. h. die eine oder insbesondere zwei oder mehrere nackte DNAs, insbesondere Plasmide, die Antigene zweier oder mehrerer Krankheiten exprimieren, als Mischung in einer erfindungsgemäß adjuvanten Lösung enthalten.
In dem gebrauchsfertigen Impfstoff ist die nackte DNA, insbesondere das Impfstoff-Plasmid, in den Mengen vorhanden, die allgemein verwendet und in der Literatur beschrieben sind.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Impfverfahren, das darin besteht, parenteral vorzugsweise intramuskulär, intradermal, oder mukosal, einen erfindungsgemäßen DNA-Impfstoff durch eine oder mehrere Anwendungen zu verabreichen.
Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung der erfindungsgemäßen Adjuvantien zur Herstellung von adjuvierten DNA-Impfstoffen, wie hier beschrieben.
Die Erfindung wird nun mit Hilfe von Ausführungsformen, die als nicht einschränkende Beispiele herangezogen werden, und unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren ausführlicher beschrieben.
Liste der Figuren:
1: Sequenz des Hämagglutinin-Gens (HA) des Virus der Pferdegrippe, Stamm Newmarket 2/93
2: Sequenz des Hämagglutinin-Gens (HA) des Virus der Pferdegrippe, Stamm Kentucky 1/94
3: Sequenz des Neuraminidase-Gens (NA) des Virus der Pferdegrippe, Stamm Newmarket 2/93
4: Sequenz des Neuraminidase-Gens (NA) des Virus der Pferdegrippe, Stamm Kentucky 1/94
5: Sequenz des Nucleoprotein-Gens (NP) des Virus der Pferdegrippe, Stamm Newmarket 2/93
6: Sequenz des Nucleoprotein-Gens (NP) des Virus der Pferdegrippe, Stamm Kentucky 1/94
Liste der Sequenzen:

SEQ ID Nr. 1: Oligonucleotid CCL007
SEQ ID Nr. 2: Oligonucleotid CCL018
SEQ ID Nr. 3: Sequenz des HA-Gens, Stamm EIV Newmarket 2/93
SEQ ID Nr. 4: Oligonucleotid CCL020
SEQ ID Nr. 5: Sequenz des HA-Gens, Stamm EIV Kentucky 1/94
SEQ ID Nr. 6: Oligonucleotid AB260
SEQ ID Nr. 7: Oligonucleotid AB262
SEQ ID Nr. 8: Sequenz des NA-Gens, Stamm EIV Newmarket 2/93
SEQ ID Nr. 9: Sequenz des NA-Gens, Stamm EIV Kentucky 1/94
SEQ ID Nr. 10: Oligonucleotid CCL019
SEQ ID Nr. 11: Oligonucleotid CCL021
SEQ ID Nr. 12: Sequenz des NP-Gens, Stamm EIV Newmarket 2/93
SEQ ID Nr. 13: Sequenz des NP-Gens, Stamm EIV Kentucky 1/94

Beispiel 1: Adjuvans
Das Carbomer, das in den erfindungsgemäßen Impfstoffen verwendet ist, ist das von der Firma BF Goodrich hergestellte Carbopol^® 974P (MG etwa 3 Millionen).
Zuerst wird eine Stammlösung mit 1,5 % Carbopol^® 974P in destilliertem Wasser, das 1 g/l Natriumchlorid enthält, hergestellt.
Diese Stammlösung wird dann zur Herstellung einer Carbopol^®-Lösung in physiologischer Kochsalzlösung bei 4 mg/ml verwendet. Die Stammlösung wird zu der gesamten physiologischen Kochsalzlösung (oder dem größten Teil davon) auf einmal oder gegebenenfalls in mehreren Malen zugegeben, wobei der pH-Wert jedes Mal mit NaOH (zum Beispiel 1 N oder höher konzentriert) auf einen Wert von etwa 7,3 bis 7,4 eingestellt wird.
Somit wird eine gebrauchsfertige Carbopol^®-Lösung erhalten.
Beispiel 2: Kultur der Viren
Die Viren werden auf dem entsprechenden Zellsystem bis zum Erhalt eines cytopathischen Effekts kultiviert. Die für jedes Virus zu verwendenden Zellsysteme sind dem Fachmann gut bekannt. Kurz gesagt, werden Zellen, die für das verwendete Virus sensitiv sind und in Minimum Essential Medium Eagle (MEM) oder in einem anderen entsprechenden Medium kultiviert wurden, mit dem zu untersuchenden Virusstamm bei einer Infektionsmultiplizität von 1 beimpft. Die infizierten Zellen werden dann bei 37°C für die Zeit inkubiert, die für das Auftreten eines vollständigen cytopathischen Effekts notwendig ist (im Durchschnitt 36 Stunden).
Beispiel 3: Extraktion von viraler genomischer DNA
Nach der Kultur werden der Überstand und die lysierten Zellen geerntet, und die Gesamtheit der Virussuspension wird bei 1000 g 10 für Minuten bei + 4 °C zentrifugiert, um die Zelltrümmer zu entfernen. Die Viruspartikel werden dann durch Ultrazentrifugation bei 400000 g für 1 Stunde bei + 4 °C geerntet. Der Niederschlag wird in einem möglichst geringen Volumen des Puffers (Tris 10 mM, EDTA 1 mM) aufgenommen. Diese konzentrierte Virussuspension wird mit der Proteinase K (100 μg/ml Endkonzentration) in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (SDS) (0,5% Endkonzentration) für 2 Stunden bei 37 °C behandelt. Die virale DNA wird anschließend mit einer Mischung von Phenol/Chloroform extrahiert, dann mit 2 Volumina Ethanol (absolut) gefällt. Nach einer Nacht bei – 20 °C wird die DNA bei 10000 g für 15 Minuten bei + 4 °C zentrifugiert. Der DNA-Niederschlag wird getrocknet und dann in einem möglichst geringen Volumen von sterilem hoch reinem Wasser aufgenommen. Er kann dann mit Restriktionsenzymen verdaut werden.
Beispiel 4: Isolierung von viraler genomischer RNA
Die RNA-Viren wurden nach dem Fachmann gut bekannten Techniken gereinigt. Anschließend wurde die genomische virale RNA jedes Virus isoliert, wobei die von P. Chomczynski und N. Sacchi beschriebene "Guanidinium Thiocyanate/Phenol-Chloroform" Extraktionsmethode verwendet wurde (Anal. Biochem. 1987, 162, 156-159).
Beispiel 5: Molekularbiologische Techniken
Alle Plasmidkonstruktionen wurden unter Anwendung der von J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New York. 1989) beschriebenen Standardtechniken der Molekularbiologie hergestellt. Alle bei der vorliegende Erfindung verwendeten Restriktionsfragmente wurden mit dem Kit "Geneclean" (BIO101 Inc. La Jolla, CA) isoliert.
Beispiel 6: RT-PCR Technik
Spezifische Oligonucleotide (die an ihren 5'-Enden Restriktionsstellen umfassen, um das Klonieren der amplifizierten Fragmente zu vereinfachen) wurden so hergestellt, dass sie die kodierenden Regionen der zu amplifizierenden Gene ganz abdecken (siehe spezifische Beispiele). Die Reverse-Transkriptions (RT)-Reaktion und die Polymerasekettenreaktion (PCR) wurden nach Standardtechniken (J. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Ausg, Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New York. 1989) durchgeführt. Jede RT-PCR-Reaktion wurde mit einem spezifischen Amplimer-Paar durchgeführt, wobei die extrahierte virale genomische RNA als Matrize herangezogen wurde. Die amplifizierte komplementäre DNA wurde mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) extrahiert, bevor sie mit den Restriktionsenzymen verdaut wurde.
Beispiel 7: Plasmid pVR1012
Das Plasmid pVR1012 wurde bei Vical Inc. San Diego, CA, USA bezogen. Seine Konstruktion ist in J. Hartikka et al. (Human Gene Therapy, 1996, 7, 1205-1217, durch Bezugnahme eingeschlossen) beschrieben.
Beispiel 8: Konstruktion des Plasmids pCCL027 (Gen EIV HA Newmarket 2/93)
Eine RT-PCR-Reaktion nach dem in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren wurde mit der genomischen RNA des Virus der Pferdegrippe (Equine Influenza Virus oder EIV) (Stamm Newmarket 2/93) (Daly et al., J. Gen. Virol. 1996, 77, 661-671), die nach dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, und mit den folgenden Oligonucleotiden durchgeführt:
CCL007 (40-mer) (SEQ ID Nr. 1)
5' TTGTCGACTCAATCATGAAGACAACCATTATTTTGATACT 3'
CCL018 (34-mer) (SEQ ID Nr. 2)
5' TTGGATCCTTACTCAAATGCAAATGTTGCACCTG 3',
um das Gen, das das Glycoprotein HA des Virus der Pferdegrippe (Stamm Newmarket 2/93) (Figur Nr. 1, SEQ ID Nr. 3) codiert, in der Form eines PCR-Fragments von etwa 1750 bp zu isolieren. Dieses Fragment wurde gereinigt, dann mit dem Vektor pCRII (Kat.-Nr. K2000-01, InVitrogen Corp. Carlsbad, CA) ligiert, um das Plasmid pCCL026 zu erhalten. Das Plasmid pCCL026 wurde dann mit den Restriktionsenzymen salI und NotI verdaut, um ein salI/NotI-Fragment von 1751 bp zu isolieren, das das Gen EIV HA Newmarket 2/93 enthält. Dieses Fragment wurde anschließend mit dem Plasmid pVR1012 (siehe Beispiel 7), das zuvor mit salI und NotI verdaut wurde, ligiert, um das Plasmid pCCL027 (6642 bp) zu erhalten.
Beispiel 9: Konstruktion des Plasmids pPB242 (Gen EIV HA Kentucky 1/94)
Eine RT-PCR-Reaktion nach dem in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren wurde mit der genomischen RNA des Virus der Pferdegrippe (Equine Influenza Virus oder EIV) (Stamm Kentucky 1/94) (Daly et al., J. Gen. Virol. 1996, 77, 661-671), die nach dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, und mit den folgenden Oligonucleotiden durchgeführt:
CCL007 (40-mer) (SEQ ID Nr. 1)
5' TTGTCGACTCAATCATGAAGACAACCATTATTTTGATACT 3'
CCL020 (34-mer) (SEQ ID Nr. 4)
5' TTGGATCCTTACTCAAATGCAAATGTTGCATCTG 3',
um das Gen, das das Glycoprotein HA des Virus der Pferdegrippe (Stamm Kentucky 1/94) (Figur Nr. 2, SEQ ID Nr. 5) codiert, in der Form eines PCR-Fragments von etwa 1750 bp zu isolieren. Dieses Fragment wurde gereinigt, dann mit dem Vektor pCRII (Kat.-Nr. K2000-01, InVitrogen Corp. Carlsbad, CA) ligiert, um das Plasmid pCCL028 zu erhalten. Das Plasmid pCCL028 wurde anschließend mit den Restriktionsenzymen SacI und BamHI verdaut, um ein SacI/BamHI-Fragment von 1153 bp (Fragment A) zu isolieren, das den 3'-Teil des Gens EIV HA Kentucky 1/94 enthält. Das Plasmid pCCL028 wurde mit den Restriktionsenzymen SacI und EcoRV verdaut, um ein SacI/EcoRV-Fragment von 621 bp (Fragment B) zu isolieren, das den 5'-Teil des Gens EIV HA Kentucky 1/94 enthält. Die Fragmente A und B wurden anschließend zusammen mit dem Plasmid pVR1012 (siehe Beispiel 7), das zuvor mit EcoRV und BamHI verdaut wurde, ligiert, um das Plasmid pPB242 (6688 bp) zu erhalten.
Beispiel 10: Konstruktion des Plasmids pAB142 (Gen EIV NA Newmarket 2/93)
Eine RT-PCR-Reaktion nach dem in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren wurde mit der genomischen RNA des Virus der Pferdegrippe (Equine Influenza Virus oder EIV) (Stamm Newmarket 2/93) (Daly et al., J. Gen. Virol. 1996, 77, 661-671), die nach dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, und mit den folgenden Oligonucleotiden durchgeführt:
AB260 (35-mer) (SEQ ID Nr. 6)
5'TTTGTCGACATGAAYCCAAATCAAAARATAATAAC 3'
AB262 (32-mer) (SEQ ID Nr. 7)
5' TTTGGATCCYTACATCTTRTCGATGTCAAAGG 3',
um das Gen, das das Glycoprotein Neuraminidase (NA) des Virus der Pferdegrippe (Stamm Newmarket 2/93) (Figur Nr. 3, SEQ ID Nr. 8) codiert, in der Form eines PCR-Fragments von etwa 1430 bp zu isolieren. Dieses Fragment wurde gereinigt, anschließende mit den Restriktionsenzymen salI und BamHI verdaut, um ein SalI/BamHI-Fragment von 1418 bp zu isolieren, das das Gen EIV NA Newmarket 2/93 enthält. Dieses Fragment wurde anschließend mit dem Plasmid pVR1012 (siehe Beispiel 7), das zuvor mit SalI und BamHI verdaut wurde, ligiert, um das Plasmid pAB142 (6287 bp) zu erhalten.
Beispiel 11: Konstruktion des Plasmids pPB246 (Gen EIV NA Kentucky 1/94)
Eine RT-PCR-Reaktion nach dem in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren wurde mit der genomischen RNA des Virus der Pferdegrippe (Equine Influenza Virus oder EIV) (Stamm Kentucky 1/94) (Daly et al., J. Gen. Virol. 1996, 77, 661-671), die nach dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, und mit den folgenden Oligonucleotiden durchgeführt: AB260 und AB262 (Beispiel 10), um das Gen, das das Glycoprotein Neuraminidase (NA) des Virus der Pferdegrippe (Stamm Kentucky 1/94) (Figur Nr. 4, SEQ ID Nr. 9) codiert, in der Form eines PCR-Fragments von etwa 1430 bp zu isolieren. Dieses Fragment wurde gereinigt und dann mit den Restriktionsenzymen SalI und BamHI verdaut, um ein SalI/BamHI-Fragment von 1418 bp zu isolieren, das das Gen EIV NA Kentucky 1/94 enthält. Dieses Fragment wurde anschließend mit dem Plasmid pVR1012 (siehe Beispiel 7), das zuvor mit SalI und BamHI verdaut wurde, ligiert, um das Plasmid pAB116 (6287 bp) zu ergeben.
Beispiel 12: Konstruktion des Plasmids pPB245 (Gen EIV NP Newmarket 2/93)
Eine RT-PCR-Reaktion nach dem in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren wurde mit der genomischen RNA des Virus der Pferdegrippe (Equine Influenza Virus oder EIV) (Stamm Newmarket 2/93) (Daly et al., J. Gen. Virol. 1996, 77, 661-671), die nach dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, und mit den folgenden Oligonucleotiden durchgeführt:
CCL019 (25-mer) (SEQ ID Nr. 10)
5' TTGTCGACCATGGCGTCTCAAGGCAC 3'
CCL021 (28-mer) (SEQ ID Nr. 11)
5' TTTCTAGACTTTAAYTGTCAWACTCYTC 3',
um das Gen, das das Nucleoprotein (NP) des Virus der Pferdegrippe (Stamm Newmarket 2/93) (Figur Nr. 5, SEQ ID Nr. 12) codiert, in der Form eines PCR-Fragments von etwa 1520 bp zu isolieren. Dieses Fragment wurde gereinigt, dann mit den Restriktionsenzymen SalI und XbaI verdaut, um ein SalI/XbaI-Fragment von 1506 bp zu isolieren, das das Gen EIV NP Newmarket 2/93 enthält. Dieses Fragment wurde anschließend mit dem Plasmid pVR1012 (siehe Beispiel 7), das zuvor mit SalI und XbaI verdaut wurde, ligiert, um das Plasmid pPB245 (6389 bp) zu erhalten.
Beispiel 13: Konstruktion des Plasmids pPB246 (Gen EIV NP Kentucky 1/94)
Eine RT-PCR-Reaktion nach dem in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren wurde mit der genomischen RNA des Virus der Pferdegrippe (Equine Influenza Virus oder EIV) (Stamm Kentucky 1/94) (Daly et al., J. Gen. Virol. 1996, 77, 661-671), die nach dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, und mit den folgenden Oligonucleotiden durchgeführt: CCL019 und CCL021 (Beispiel 12), um das Gen, das das Nucleoprotein (NP) des Virus der Pferdegrippe (Stamm Kentucky 1/94) (Figur Nr. 6, SEQ ID Nr. 13) codiert, in der Form eines PCR-Fragments von etwa 1520 bp zu isolieren. Dieses Fragment wurde gereinigt, anschließend mit den Restriktionsenzymen salI und XbaI verdaut, um ein salI/XbaI-Fragment von 1506 bp zu isolieren, das das Gen EIV NP Kentucky 1/94 enthält. Dieses Fragment wurde anschließend mit dem Plasmid pVR1012 (siehe Beispiel 7), das zuvor mit salI und XbaI verdaut wurde, ligiert, um das Plasmid pPB246 (6389 bp) zu erhalten.
Beispiel 14: Konstruktion des Plasmids pPB156 (Gen BHV-1 gB)
Seine Konstruktion ist in WO-A-98 03200 beschrieben.
Beispiel 15: Konstruktion des Plasmids pAB087 (Gen BHV-1 gD)
Seine Konstruktion ist in WO-A-98 03200 beschrieben.
Beispiel 16: Konstruktion des Plasmids pAB090 (Gen PRV gB)
Seine Konstruktion ist in WO-A-98 03658 beschrieben.
Beispiel 17: Konstruktion des Plasmids pPB098 (Gen PRV gD)
Seine Konstruktion ist in WO-A-98 03658 beschrieben.
Beispiel 18: Konstruktion des Plasmids pAB044 (Gen CDV HA)
Seine Konstruktion ist in WO-A-98 03199 beschrieben.
Beispiel 19: Konstruktion des Plasmids pAB036 (Gen CDV F)
Seine Konstruktion ist in WO-A-98 03199 beschrieben.
Beispiel 20: Konstruktion des Plasmids pAB041 (Gen G des Virus der Tollwut)
Seine Konstruktion ist in WO-A-98 03199 beschrieben.
Beispiel 21: Anwendung beim Pferd
Der getestete Impfstoff ist eine Mischung der 3 Plasmide pCCL027 (Beispiel 8), pAB142 (Beispiel 10) und pPB245 (Beispiel 12), die die Gene HA, beziehungsweise NA und P des Virus EIV Stamm Newmarket 2/93 enthalten und exprimieren. Diese Mischung wird mit dem Carbomer kombiniert oder nicht, wie in der vorliegenden Erfindung beschrieben.
Das Impf-/Provokationsprotokoll war das folgende:
7 bis 8 Monate alte Ponys (Welsh Mountain ponies), die keine nachweisbaren Antikörper gegen die H3N8- und H7N7-Viren aufwiesen, durch den SRH-Test (für Single Radial Hemolysis) gemessen, wurden für diese Studie verwendet. Die Ponys wurden nach dem Zufallsprinzip auf die 4 Gruppen verteilt.
Die Pferde wurden am Tag 0 und 35 intramuskulär geimpft. Der verwendete kommerzielle Impfstoff für die Gruppe C wurde den Pferden mit einem Dosisvolumen von 1 ml verabreicht.
Jedes der Ponys der Gruppe A und B erhielt 2 Dosen von 5 ml am Tag 0 und 35 durch tiefe intramuskuläre Injektion in den Hals.
Am Tag 56, drei Wochen nach der zweiten Impfung, wurde jedes Pony durch Exposition gegenüber einem Aerosol, das aus etwa 1 ml einer allantoiden Flüssigkeit entstand, die eine Gesamtzahl von 10^7,3 EID50 des Influenzavirus A-equi-2/Sussex/89 enthielt, infiziert, wobei ein Vernebler des Modells ULTRA 2000 (De Vilbiss, Somerset PA) verwendet wurde, wie von Mumford et al. Equine Vet. J. 1990, 22, 93-98 beschrieben.
Nach der Provokation wurden die Ponys beobachtet, um die klinischen Anzeichen (Erstellung eines klinischen Standards) und die Temperatur festzustellen. Proben aus den Nüstern wurden täglich ab dem Tag der Provokation bis zum Tag 10 nach der Provokation genommen, um die Menge an pro provoziertem Pferd ausgeschiedenem Virus zu messen. Schließlich wurden während des gesamten Protokolls Blutproben vor und nach der Provokation (am Tag 0, 7, 14, 35, 49, 56, 63 und 70 Tag) genommen, um die Kinetik des Auftretens und den Gehalt der SRH-Antikörper und der IHA-Antikörper (hämagglutinierende Antikörper) für jede geimpfte Gruppe zu messen.
Beispiel 22: Anwendung beim Schwein
Die Wirksamkeit eines Plasmid-Impfstoffs, der mit dem Carbomer kombiniert ist oder nicht, wurde beim Schwein in einem Impf-/Provokationsmodell für die Aujeszky'sche Krankheit untersucht. Der getestete Impfstoff ist eine Mischung der 2 Plasmide pAB090 (Beispiel 16) und pPB098 (Beispiel 17), die die Gene gB bzw. gD des PRV-Virus enthalten und exprimieren. Die Mischung wurde entsprechend der vorliegenden Erfindung mit dem Carbomer kombiniert oder nicht. Das verwendete Impf-/Provokationsprotokoll war das folgende:
Am Tag 0 wurden die Schweine der Gruppe A und B mit der Mischung der Plasmide pPB098 und pAB090 (200 μg von jedem Plasmid), kombiniert mit dem Carbomer oder nicht, intramuskulär und mit einem Volumen von 2 ml geimpft.
Die Schweine der Gruppe C erhielten intramuskulär mit einem Volumen von 2 ml eine Injektion des handelsüblichen Impfstoffs Geskypur (Untereinheiten-Impfstoff MERIAL, Lyon, Frankreich).
Die Schweine der Gruppe D wurden nicht geimpft.
Am Tag 21 wurden alle Schweine mit 2 ml (1 ml pro Nasenloch) einer Virussuspension des Provokationsstammes Aujeszky, Stamm NIA3, (Verdünnung 1:5 einer Stammlösung, die 10^8,25 ZKID50/ml titriert) provoziert.
Nach der Provokation wurden die Schweine auf Mortalität verfolgt, und das Delta G7-Kriterium (individuelles Wiegen am Tag 0 und 7 der Provokation) beobachtet. Proben der Nasenlöcher wurden täglich ab Tag 0 bis Tag 14 der Provokation genommen, um die Menge an nach der Provokation ausgeschiedenem Virus zu messen.
Schließlich wurden Blutproben am Tag 0, 7, 14, 21 und 28 des Protokolls genommen, um die Kinetik und den Gehalt an Antikörpern, die das Virus der Aujeszky'schen Krankheit (PRV) neutralisieren, zu messen. Die ELISA-anti-PRV-Antikörper von Isotyp IgG1 und IgG2 wurden auch in den Seren, die von geimpften und nicht geimpften Schweinen geerntet wurden, gemessen.
Beispiel 23: Anwendung beim Rind
Die Wirksamkeit eines Plasmid-Impfstoffs, kombiniert mit dem Carbomer oder nicht, wurde beim Rind an einem Impf-/Provokationsmodell der infektiösen Rinder-Rhinotracheitis (IBR) oder BHV-1 untersucht. Der getestete Impfstoff ist eine Mischung der 2 Plasmide pPB156 (Beispiel 14) und pAB087 (Beispiel 15), die die Gene gB bzw. gD des BHV-1-Virus enthalten und exprimieren. Die Mischung wurde, entsprechend der vorliegenden Erfindung, mit dem Carbomer kombiniert oder nicht. Das verwendete Impf-/Provokationsprotokoll war das folgende:
Am Tag 0 wurden die Kälber der Gruppe A und B mit der Mischung der Plasmide pAB087 und pPB156 (300 μg von jedem Plasmid), kombiniert mit dem Carbomer oder nicht, intramuskulär und mit einem Volumen von 5 ml geimpft.
Die Kälber der Gruppe C erhielten eine Injektion des handelsüblichen Impfstoffes Ibepur (Untereinheiten-Impfstoff MERIAL, Lyon, Frankreich) intramuskulär mit einem Volumen von 2 ml.
Die Kälber der Gruppe D wurden nicht geimpft.
Am Tag 21 erhielten die Gruppe A, B und C eine zweite Injektion des Impfstoffs nach den gleichen Modalitäten wie am Tag 0.
Am Tag 35 wurden die Kälber mit 2,5 ml (1,25 ml pro Nasenloch) einer Virussuspension des Provokationsstammes BHV-1, Stamm B901, (Verdünnung 1:5 einer Stammlösung, die 10^8,15 ZKID50/ml titriert) provoziert.
Nach der Provokation wurden die Kälber auf klinischen Anzeichen beobachtet (Erstellung eines klinischen Standards). Proben aus den Nasenlöchern wurden täglich von Tag 0 bis zum Tag 14 der Provokation genommen, um die Menge an nach der Provokation ausgeschiedenem Virus zu messen.
Schließlich wurden Blutproben am Tag 0, 7, 14, 21, 35 und 49 des Protokolls genommen, um die Kinetik und den Gehalt an Antikörpern, die das Virus der infektiösen Rinder-Rhinotracheitis neutralisieren, zu messen. Die ELISA-anti-BHV-1-Antikörper vom Isotyp IgG1 und IgG2 wurden auch in den Seren, die bei den geimpften und nicht geimpften Kälbern geerntet wurden, gemessen.
Beispiel 24: Anwendung beim Hund
Die Wirksamkeit eines Plasmid-Impfstoffs, kombiniert mit dem Carbomer oder nicht, wurde beim Hund in einem Impf-/Provokationsmodell für die Carré-Krankheit (CDV) untersucht. Der getestete Impfstoff ist eine Mischung der 2 Plasmide pAB044 (Beispiel 18) und pAB036 (Beispiel 19), die die Gene HA bzw. F des CDV-Virus enthalten und exprimieren. Das verwendete Impf-/Provokationsprotokoll war das folgende:
Die Hunde der Gruppe A, B, C wurden am Tag 0 und 28 intramuskulär geimpft. Die Hunde der Gruppe A und B erhielten für jede Impfung eine Injektion einer Plasmidlösung von insgesamt 400 μg (2 × 200 μg) mit einem Volumen von 1 ml.
Die Hunde der Gruppe C wurden mit dem Impfstoff EURICAN (CHPPI2), der von Mérial, Lyon, Frankreich im Handel ist, geimpft. Eine kommerzielle Dosis enthält etwa 10⁴ pfu des Impfstammes CDV Onderstepoort sowie die Valenzen zur Impfung gegen Rubarth-Hepatitis, Hunde-Parvovirose und Parainfluenza Typ 2-Virus.
Die Provokation wurde am Tag 49 durch intrazerebrale Verabreichung einer 1:10-Verdünnung des Provokationsstammes CDV "Synder-Hill" (Charge hergestellt und geliefert von USDA, USA) durchgeführt.
Eine klinische Beobachtung wurde täglich während 21 Tagen nach der Provokation durchgeführt, um die Anzeichen (allgemeiner Zustand, oculo-nasale Symptome, Verdauungssymptome, nervöse Symptome, Temperatur) (Aufzeichnung nach den Regeln der Europäischen Arzneimittellehre) festzustellen. Die provozierten Hunde wurden dazu einmal pro Woche gewogen.
Der Schutz wurde nach den folgenden Kriterien abgeschätzt:

– durchschnittliche klinische Standards von jeder Gruppe.
– Niveau der CDV-Viremie nach der Provokation (Messung der Virus-Belastung in den Lymphozyten am Tag 56, 61, 66, 70).
– Zählung/Bewertung der am Tag 48, 54, 56, 59, 63 und 70 (d. h. 1, 5, 7, 10, 14 und 21 Tage nach der Provokation) entnommenen Blutproben.
– Gewichtsentwicklung nach der Provokation.

Für alle diese Kriterien wurden die durchschnittlichen Werte jeder Gruppe miteinander und mit dem durchschnittlichen Wert der Kontrolle-Gruppe verglichen.
Blutproben wurden am Tag 0, 14, 28, 56 und 70 zur Titration der ELISA-Antikörper und der Antikörper, die das Virus der Carré-Krankheit neutralisieren, entnommen.

Claims

Pferdeimpfstoff, eine nackte DNA umfassend, die mindestens eine Nucleinsäure enthält, die ein antigenes Polypeptid eines Erregers einer Pferdekrankheit codiert und das antigene Polypeptid in vivo exprimiert, sowie mindestens ein Adjuvans umfassend, das ausgewählt ist aus der Gruppe der Acrylsäure- oder Methacrylsäurepolymere und der Maleinsäureanhydrid-Ethylen-Copolymere.
Impfstoff nach Anspruch 1, der ein vernetztes Polymer der Acrylsäure oder Methacrylsäure umfasst.
Impfstoff nach Anspruch 2, wobei das Polymer mittels eines Polyalkenylethers von Zucker oder Polyalkohol vernetzt ist.
Impfstoff nach Anspruch 3, wobei das Polymer mittels einer Allylsaccharose oder mit Hilfe von Allylpentaerythrit vernetzt ist.
Impfstoff nach Anspruch 1, der ein Carbomer umfasst.
Impfstoff nach Anspruch 1, der ein lineares oder vernetztes Maleinsäureanhydrid-Ethylen-Copolymer umfasst.
Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Adjuvans in einem Verhältnis von 0,01 % bis 2% G/V im Impfstoff vorhanden ist.
Impfstoff nach Anspruch 7, wobei die Konzentration des Adjuvans 0,06 bis 1 % G/V beträgt.
Impfstoff nach Anspruch 8, wobei die Konzentration des Adjuvans 0,1 bis 0,6% G/V beträgt.
Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die nackte DNA ein zirkuläres Plasmid ist.
Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der Erreger der Pferdekrankheit eines der folgenden Viren ist: – Virus der equinen Rhinopneumonitis – Virus der Pferdegrippe – Clostridium tetani – Virus der Eastern-Equine-Encephalitis – Virus der Western-Equine-Encephalitis – Virus der Venezuelan-Equine-Encephalitis