CN109475615B - 包含直链或支链聚丙烯酸聚合物佐剂的新免疫原性制剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了新的免疫和疫苗制剂，其包含新应用的非交联聚丙烯酸聚合物佐剂。所述佐剂可以与各种免疫原组合，以便在施用于广泛目标动物时产生安全和有效的疫苗。所述免疫原可以包括、但不限于：灭活病原体、减毒病原体、亚单元、重组表达载体、质粒或其组合。所述动物可以包括、但不限于：人、鼠科动物、犬科动物、猫科动物、马科动物、猪科动物、绵羊、山羊和牛科动物。

Description

包含直链或支链聚丙烯酸聚合物佐剂的新免疫原性制剂

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年6月17日提交的美国临时申请No.62/351,492的优先权，并且其作为引用完整地并入本文。

作为引用并入

任何前述申请及其中或在其起诉期间引用的所有文件(“申请引用的文件”)和申请引用的文件中引用或参考的所有文件，以及本文引用或参考的所有文件(“本文引用的文件”)，以及本文引用的文件中引用或参考的所有文件，连同本文或通过引用并入本文的任何文件中提及的任何产品的任何制造商的说明，描述，产品规格和产品说明书，在此引入作为参考，并且可以用于实施本发明。本申请中任何此类文件的引用或标识不是承认该文件可用作本发明的现有技术，并不反映这些引用的专利文件的有效性，可专利性和/或可执行性的任何观点。本文中通过GenBank登录号引用的所有序列均通过引用整体并入本文，并且所述序列如GenBank中在本申请的提交日期所述。

发明领域

本发明属于疫苗领域。特别地，本发明涉及特定的佐剂和佐剂组合物，以及制备这种佐剂和佐剂化组合物的方法。

发明背景

已经提出使用包括丙烯酸单元的聚合物作为疫苗组合物中的佐剂。在大多数情况下，推荐作为佐剂的聚丙烯酸聚合物是交联聚合物。例如，US3,790,665和US3,919,411描述了使用与聚烯丙基糖交联的丙烯酸聚合物作为佐剂。对应于交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物的佐剂也描述于US7,163,926中，它们特别地与糖或多元醇的聚烯基醚交联。这类聚合物在

的名称下销售。US7,163,926、EP1058558和WO2009/118523中描述了CARBOPOL974P、934P和971P的应用，它们是具有高Mw的交联聚合物(即对于974P，约300万，根据生产者提供的数据)。

一些研究努力集中在使用具有低重量的线性聚丙烯酸聚合物或丙烯酸/丙烯酸酯共聚物：

WO2005/065712提出了一种包含窄分子量分布聚合物的复合物，该聚合物包括衍生自丙烯酸或其盐的单元，以及具有抗病原生物或癌症或一种或多种抗原或免疫原的药理活性的物质。该聚合物可以是丙烯酸或甲基丙烯酸或其盐的均聚物或共聚物。提倡分子量为100000或更低。

US6,610,310和EP0804234描述了具有阴离子组成型重复单体单元和疏水性组成型重复单体单元的聚合物的用途。特别地，EP0804234公开了部分由丙烯酸单元(阴离子组成重复单元)和丙烯酸酯单元(组成型疏水重复单元)作为疫苗佐剂在水溶液中组成的聚合物的用途。在这些文件中将聚丙烯酸聚合物

907与其提倡的同源部分酯化的聚丙烯酸聚合物进行比较，并提供较差的免疫应答。类似地，L.Hilgers等人的出版物Vaccine，2000，18，3319-3325和Vaccine1998第16卷，第16期，1575-1581也公开了这种酯化聚合物的用途，并且教导了在大多数情况下使用聚丙烯酸的烷基酯提供了更好的免疫应答。

907是聚丙烯酸聚合物，现在不再供货，其特性无法可靠地确定。它属于CARBOPOL家族，被称为交联聚合物。该聚合物具有与文件彼此不的重均分子量Mw的方面在于：出版物Vaccine，1998第16卷，第16期，1575-1581页对于用于其测定的方法提供的重均分子量Mw为450kDa，没有精确度。它没有提到其多分散性指数。相反，“LiquidDetergents”，表面活性剂系列Science，第67卷，147页(1996，CRC Press，Publisher：Kuo-Yann Lai)，通过凝胶渗透色谱技术(GPC)测定的相同聚合物的重均分子量Mw为603.3kDa且多分散性指数IP为4.124。关于

907的特性存在疑问。此外，大多数情况下，生产者给出的Mw数据与可通过标准化方法确定的Mw不同，如本专利申请的实施例中所示。

除了关于现有聚合物佐剂的精确特征的不确定性之外，一直需要开发具有改进的安全性和功效性质的新佐剂。本公开通过提供包含非交联丙烯酸聚合物佐剂的安全有效的免疫和疫苗制剂来满足这些需要。

发明概述

在第一方面，本公开提供了包含一类新聚合物作为疫苗佐剂的制剂。如本文所公开的，这类聚合物已证明在多种抗原的佐剂制剂中具有安全性和功效，可用于多种动物物种的施用。与现有技术中使用的其它聚丙烯酸聚合物家族相比，这类聚合物产生有利的佐剂性质。

在第一方面的一个实施方案中，本发明提供了一族聚合物，其作为佐剂特别有效。在一个具体实施方案中，本发明提供了一类除Th-2应答外还意外地促进强Th-1应答的聚合物。

另外，根据本发明选择的一些聚合物产生佐剂组合物，并因此产生疫苗组合物。在一个具体实施方案中，本发明的疫苗组合物更安全，特别是通常与疫苗储存稳定性不相容的污染物的再现性和减少。在一个更具体的实施方案中，所选择的聚合物也是稳定的并且可通过高压灭菌来灭菌。

在本文上下文中，本发明涉及直链或支链聚丙烯酸聚合物的药学上可接受的盐，其用作疫苗组合物中的佐剂，其特征在于所述聚丙烯酸聚合物盐具有在350-650kDa范围内的重均分子量Mw。

特别地，所述聚丙烯酸聚合物盐完全由对应于丙烯酸盐的单元组成，或完全由对应于丙烯酸游离酸形式的单元和对应于丙烯酸盐的单元组成。

有利地，所述聚丙烯酸聚合物盐包含小于0.005％，优选小于0.001％w/w的氧化剂，以所述聚丙烯酸聚合物盐的总干重为基准；和/或包含小于0.005％，优选小于0.001％w/w的过硫酸盐，以所述聚丙烯酸聚合物盐的总干重为基准。

在一个更具体的实施方案中，所述聚丙烯酸聚合物是与Na⁺的盐。

在具体的实施方案中，所述聚丙烯酸聚合物盐具有小于或等于约4、优选小于或等于约2.5的多分散性指数。

在具体的实施方案中，所述聚丙烯酸聚合物盐具有在380至620kDa范围内的重均分子量Mw和小于或等于4的多分散性指数；或具有在400至600kDa范围内的重均分子量Mw和小于或等于4的多分散性指数；或具有在380至620kDa范围内的重均分子量Mw和小于或等于2.5的多分散性指数；或具有在400至600kDa范围内的重均分子量Mw和小于或等于2的多分散性指数。

有利地，所述聚丙烯酸聚合物盐包含小于0.005％w/w的游离酸形式或盐形式的丙烯酸单体，以所述聚丙烯酸聚合物盐的总干重为基准。

根据有利的实施方案，将所述聚丙烯酸聚合物盐渗滤并灭菌。

有利地，本发明中描述的聚丙烯酸聚合物盐用于增强使用疫苗组合物获得的Th1免疫应答。所述Th1免疫应答高于使用较低分子量Mw的聚丙烯酸聚合物盐作为佐剂时获得的Th1免疫应答。

本发明的另一方面还涉及制备本发明所述的聚丙烯酸聚合物的药物上可接受的盐的方法，该方法包括下列连续步骤：

a)得到聚丙烯酸聚合物的溶液，

b)纯化聚丙烯酸聚合物的溶液，以便消除杂质，和

c)将纯化的聚丙烯酸聚合物的溶液灭菌。

本发明还涉及一种储存本发明所述的聚丙烯酸聚合物溶液的方法，该方法包括这样的制备方法，然后是得到的溶液形式的聚丙烯酸聚合物的药学上可接受的盐的储存步骤。

在第三方面，本发明还涉及疫苗组合物，其包含至少一种疫苗试剂(例如免疫原或编码免疫原的核酸)和本发明中描述的聚丙烯酸聚合物的药学上可接受的盐。在一个具体实施方案中，免疫原可以选自：灭活病原体，减毒病原体，亚单位抗原，纯化抗原，未纯化抗原，或使用细菌，酵母，植物，昆虫或动物细胞重组产生的抗原，包括质粒的表达载体等。抗原可以通过本领域熟知的方法纯化，包括但不限于超滤，超速离心，尺寸排阻凝胶过滤，离子交换色谱和PEG纯化。病原体可以来源于细菌，病毒，原生动物或真菌，或免疫原可以构成抗毒素。

在另一个方面，本发明提供了在抗病原体的接种疫苗中诱导免疫应答的方法，该方法包括施用本发明的疫苗组合物以便进行疫苗接种。

应注意，在本公开中，特别是在权利要求中，术语例如“包括”，“包含”，“含有”等可以具有归因于美国专利法中的这些术语的含义；例如它们可以表示“包括”，“包括的”，“包含”等；并且术语例如“基本上由...组成”和“主要由......组成”具有美国专利法赋予它们的含义，例如它们允许未明确引用的要素，但排除在现有技术中发现的要素或影响本发明的基本特征或新颖性的那些要素。

如本文所用，术语“约”是指大约在大致上或周围的区域。当术语“约”与数值范围结合使用时，它通过扩展上述数值的上下边界来修改该范围。通常，术语“约”在本文中用于将所述值之上和之下的数值改变10％的变动。在一个方面，术语“约”是指其使用数的数值的加或减20％。因此，约50％意味着在45％-55％的范围内。本文通过端点列举的数值范围包括该范围内包含的所有数字和分数(例如1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.90、4和5)。还应理解，推测其所有数字和分数均由术语“约”修饰。

这些和其它实施方案是公开的，或者从以下详细描述中显而易见并包含在其中。

附图简述

本领域普通技术人员完整且能够公开本发明，包括其最佳方式，更具体地在说明书的其余部分中阐述，包括参考附图，其中：

图1是显示在D0，D21和D35免疫接种的OF1小鼠的抗体滴度(IgG1和IgG2a)的示意图，每只小鼠每次注射2.5μg PS5-rEPA，单独注射或与200μg CARBOPOL、PAA20或PAA225000共注射；

图2是显示如对MRC5成纤维细胞所测定的，用2μg hCMV-gB和角鲨烯乳剂、PAA3000、PAA6000、PAA50000、PAA60000、PAA20或PAA225000免疫接种的C57BL/6小鼠组的血清的几何平均中和抗体滴度(GMT)的示意图；

图3是显示通过对ARPE-19细胞(人上皮细胞)的血清中和作用确定的图2组的GMT的示意图；

图4是显示如通过ELISA测定的，对图2组的针对hCMV-gB抗原的血清IgG1抗体的示意图；

图5是显示如通过ELISA测定的，对图2组的针对hCMV-gB抗原的血清IgG2c抗体的示意图；

图6是显示如使用CBA灵活组合试剂盒测定的图2组的IL5细胞因子水平的示意图；

图7是显示如使用CBA灵活组合试剂盒测定的图2组的IFNγ细胞因子水平的示意图；

图8是显示用灭活狂犬病+PAA225000；AF03；PAA60000；或角鲨烯乳剂接种疫苗的犬科动物组的狂犬病血清学的示意图；

图9是显示用金丝雀痘为介体的重组流感+(1)PBS；(2)CARBOMER(4mg/ml)；(3)PAA60000(4mg/ml)；或(4)PAA225000(4mg/ml)接种疫苗的犬科动物组的CIV血清学的示意图。第5组仅接受PBS(即，既无重组流感抗原也无佐剂)；

图10是显示图9中所示的第41天血清学数据的扩展的示意图；

图11是显示用vCP1533+vCP2242(每个含有来自流感病毒的HA基因)和如下破伤风毒素之一接种的马科动物组的平均SRH测定的流感抗体滴度的示意图：(A)CARBOMER(4mg/mL)；(B)PAA60000(4mg/mL)；(C)PAA225000(4mg/mL)；(D)ADVAX1(20mg/mL)；(E)ADVAX2(20mg/mL)。组(F)仅接受PBS(即，既无抗原也无佐剂)；

图12是显示至D35的每个马科动物组的破伤风血清学的示意图。组：与图11中描述的相同；

图13是显示至D63产生出的马科动物组破伤风血清学结果的示意图；

图14是显示每个猪科动物组的平均SpaA血清学(至D59)的示意图。组：(G1)SpaA+TS6；(G2)SpaA+PAA60000；(G3)SpaA+PAA225000；SpaA-FlaB-His+PBS；(G5)SpaA-FlaB-His+PAA225000；(G6)PBS。

发明详述

本发明的其它目的，特征和方面在以下详细描述中公开或显而易见。本领域普通技术人员应理解，本讨论仅是示例性实施方案的描述，并不意图限制本发明的更广泛的方面，本发明的更广泛的方面体现在示例性构造中。事实上，对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的范围或精神的情况下，可以在本发明中进行各种修改和变化。例如，作为一个实施方案例的一部分示例或描述的特征可以用在另一个实施方案中以产生又一个实施方案。本发明旨在覆盖落入所附权利要求及其等同方案的范围内的这些修改和变化。在本申请中引用的所有参考文献，公开的专利和专利的内容通过引用整体并入本文。

聚丙烯酸聚合物的特征

用于本发明的聚合物是直链或支链聚丙烯酸聚合物，但它不是交联聚合物。所谓“聚丙烯酸聚合物”我们是指完全由丙烯酸单元组成的聚合物。因此，以盐的形式，所述聚丙烯酸聚合物盐完全由对应于丙烯酸盐的单元组成，或者完全由对应于游离酸形式的丙烯酸和对应于丙烯酸盐的单元的单元组成。

通过仅丙烯酸作为单体的聚合获得直链或支链聚丙烯酸聚合物。大多数情况下，使用氧化剂作为引发剂或催化剂，通过自由基聚合进行聚合。最常用的氧化剂是过硫酸盐(过二硫酸盐)，例如过硫酸钠或过硫酸钾。支化聚丙烯酸聚合物例如描述于Macromolecules 2011，44，5928-5936中。当本发明的聚合物是线性时，其马克-豪温克(Mark Houwink)斜率大于或等于0.7(Yan J.K.，Pei J.J.，Ma H.L.，WangZ.B.2015.Effects of ultrasound on molecular properties，structure，chainconformation and degradation kinetics of carboxyliccurdlan.Carb.Polymers.121，64-70)。

聚丙烯酸聚合物的“药学上可接受的盐”是指聚合物的阴离子形式与阳离子的盐，特别是与药学上可接受的一价阳离子的盐。一价阳离子的实例是碱金属阳离子，例如Na⁺或K⁺或铵阳离子，例如NH₄ ⁺。在pH为5.5至8，例如接近7的水溶液中，聚丙烯酸聚合物的酸性基团将呈阴离子形式，与也存在于水溶液中的阳离子形成盐。在聚合物中，我们可以具有丙烯酸单元，其中酸基团为游离酸性形式，而其它具有酸基团的单元为成盐的阴离子形式。根据pH的不同，聚合物的酸基团可以完全为游离酸形式，或者在盐的情况下，聚合物的酸基团可以完全为盐形式，或者一些酸基团可以为酸性形式，而其它酸基团可以为盐的形式。本发明优选的聚丙烯酸聚合物的盐是与Na⁺的盐。因此，无论是否在本发明中描述的实施方案中，聚丙烯酸聚合物都优选为钠盐形式，并且在这种情况下，所有特征(Mw，IP，单体和过硫酸盐含量......)将涉及聚丙烯酸聚合物的盐(即钠盐)。

在本专利申请的说明书中，该“聚丙烯酸聚合物的药学上可接受的盐”简称为“聚丙烯酸聚合物盐”，优选聚丙烯酸聚合物钠盐。

聚丙烯酸聚合物盐可以为固体形式(沉淀物或粉末)或优选为液体制剂形式。液体制剂包括聚丙烯酸聚合物盐和水溶液。优选地，这样的制剂具有在5.5至8.0范围内的pH。该pH可以通过在水溶液中加入碱如NaOH来获得。水溶液可以是缓冲水溶液，使用缓冲剂例如磷酸盐缓冲液，TRIS(2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇)，Hepes(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)，组氨酸或柠檬酸盐缓冲液获得。液体制剂还可包含一种或几种另外的盐，例如NaCl。

根据本发明，建议使用具有下列特征之一和这些特征的任意组合乃至所有以下特征的聚丙烯酸聚合物盐或聚丙烯酸聚合物盐的液体制剂作为佐剂，只要它们不相互排斥：

-聚丙烯酸聚合物盐具有在350-650kDa范围内的重均分子量Mw；

-聚丙烯酸聚合物盐或聚丙烯酸聚合物盐的液体制剂包含小于0.005％，优选小于0.001％w/w的氧化剂，以所述聚丙烯酸聚合物盐的总干重为基准；和/或小于0.005％，优选小于0.001％w/w的过硫酸盐，以所述聚丙烯酸聚合物盐的总干重为基准；

-聚丙烯酸聚合物盐具有小于或等于4、优选小于或等于2.5的多分散性指数；

-聚丙烯酸聚合物盐具有在380至620kDa范围内的重均分子量Mw和小于或等于4的多分散性指数或具有在400至600kDa范围内的重均分子量Mw和小于或等于4的多分散性指数；

-聚丙烯酸聚合物盐具有在380至620kDa范围内的重均分子量Mw和小于或等于2.5的多分散性指数或具有在400至600kDa范围内的重均分子量Mw和小于或等于2的多分散性指数；

-聚丙烯酸聚合物盐具有大于或等于0.7的马克-豪温克斜率；

-聚丙烯酸聚合物盐或聚丙烯酸聚合物盐的液体制剂包含小于0.005％w/w的游离丙烯酸形式或盐形式的酸单体，以所述聚丙烯酸聚合物盐的总干重为基准。

特别地，提出使用聚丙烯酸聚合物盐或聚丙烯酸聚合物盐的液体制剂作为佐剂，其特征在于：

-重均分子量Mw在380至620kDa范围内和多分散性指数小于或等于4，聚丙烯酸聚合物盐中或聚丙烯酸聚合物盐的液体制剂中的过硫酸盐含量小于0.005％，优选小于0.001％w/w，以所述聚丙烯酸聚合物盐的总干重为基准，且聚丙烯酸聚合物盐中或聚丙烯酸聚合物盐的液体制剂中的游离酸形式或盐形式的丙烯酸单体的含量小于0.005％w/w，以所述聚丙烯酸聚合物盐的总干重为基准；有利地，这种聚丙烯酸聚合物盐具有大于或等于0.7的马克-豪温克斜率，或

-重均分子量Mw在380至620kDa范围内和多分散性指数小于或等于2.5，聚丙烯酸聚合物盐中或聚丙烯酸聚合物盐的液体制剂中的过硫酸盐含量小于0.005％，优选小于0.001％w/w，以所述聚丙烯酸聚合物盐的总干重为基准，且聚丙烯酸聚合物盐中或聚丙烯酸聚合物盐的液体制剂中的游离酸形式或盐形式的丙烯酸单体的含量小于0.005％w/w，以所述聚丙烯酸聚合物盐的总干重为基准；有利地，这种聚丙烯酸聚合物盐具有大于或等于0.7的马克-豪温克斜率，或

-重均分子量Mw在400至600kDa范围内和多分散性指数小于或等于4，聚丙烯酸聚合物盐中或聚丙烯酸聚合物盐的液体制剂中的过硫酸盐含量小于0.005％，优选小于0.001％w/w，以所述聚丙烯酸聚合物盐的总干重为基准，且聚丙烯酸聚合物盐中或聚丙烯酸聚合物盐的液体制剂中的游离酸形式或盐形式的丙烯酸单体的含量小于0.005％w/w，以所述聚丙烯酸聚合物盐的总干重为基准；有利地，这种聚丙烯酸聚合物盐具有大于或等于0.7的马克-豪温克斜率，或

-重均分子量Mw在400至600kDa范围内和多分散性指数小于或等于2，聚丙烯酸聚合物盐中或聚丙烯酸聚合物盐的液体制剂中的过硫酸盐含量小于0.005％，优选小于0.001％w/w，以所述聚丙烯酸聚合物盐的总干重为基准，且聚丙烯酸聚合物盐中或聚丙烯酸聚合物盐的液体制剂中的游离酸形式或盐形式的丙烯酸单体的含量小于0.005％w/w，以所述聚丙烯酸聚合物盐的总干重为基准；有利地，这种聚丙烯酸聚合物盐具有大于或等于0.7的马克-豪温克斜率。

有利地，将液体制剂中的聚丙烯酸聚合物盐渗滤。

有利地，将聚丙烯酸聚合物盐或聚丙烯酸聚合物盐的液体制剂灭菌。当将聚丙烯酸聚合物盐或聚丙烯酸聚合物盐的液体制剂渗滤时，灭菌在渗滤之后进行。

根据本发明，重均分子量Mw通过尺寸排阻色谱法获得。有利地，在尺寸排阻色谱柱后将使用三个检测器：直角光散射检测器，折光率检测器和四-毛细管差示粘度计。实施例中提供的详细步骤优选根据本发明用于测定Mw，IP(多分散性指数)，聚合物浓度和马克-豪温克斜率。优选使用折光率检测器和一组已知浓度的聚丙烯酸聚合物测定用于确定Mw的dn/dc。

过硫酸盐的含量和游离酸形式或盐形式的丙烯酸单体的含量可通过高效阴离子交换色谱法和电导检测法测定。优选地，可以使用在实施例中详述的方案，特别是在“I.2过硫酸盐和丙烯酸酯单体的测定”的段落B中。

聚丙烯酸聚合物的制备和储存

在聚丙烯酸聚合物原料中，存在残余单体含量，其对应于不聚合的丙烯酸或丙烯酸盐含量。在聚丙烯酸聚合物的聚合中，聚合引发剂、大多数情况下是氧化剂例如过硫酸盐用作引发聚合的催化剂。在聚丙烯酸聚合物原料中，可能保留聚合引发剂的残余含量(大多数情况下为氧化剂，例如过硫酸盐)，其没有被聚合过程消耗。

市场上的聚丙烯酸聚合物通常缺乏有关残余单体和氧化剂含量以及它们的精确Mw及其低聚体含量方面的规格。

根据本发明的一个优选实施方案，提出系统地纯化所购买的用于制备佐剂组合物的聚丙烯酸聚合物原料，以避免具有这些可能是有害的化合物的残余含量的风险，从而考虑到含有佐剂的佐剂组合物和疫苗组合物的稳定性和/或疫苗组合物的毒性。另外，根据本发明，已经确定氧化剂例如过硫酸盐的重要含量对热处理下聚合物的稳定性是有害的，并且禁止通过高压灭菌来灭菌。

本发明涉及用于制备聚丙烯酸聚合物的药学上可接受的盐、特别是如段落“聚丙烯酸聚合物的特征”中所定义的聚丙烯酸聚合物的药学上可接受的盐的方法，该方法包括下列连续步骤：

a)得到聚丙烯酸聚合物的溶液，

b)纯化聚丙烯酸聚合物的溶液，以便消除杂质，和

c)将纯化的聚丙烯酸聚合物的溶液灭菌。

在步骤a)、b)和c)中，该溶液可以是聚丙烯酸聚合物的溶液，其直接以所需的药学上可接受的盐的形式或至少部分地以其游离酸形式存在。如果在步骤a)中，溶液是聚丙烯酸聚合物的游离酸形式的溶液，则可以在步骤b)的纯化后进行成盐，并且对期望的药学上可接受的盐的溶液进行步骤c)的灭菌。也可以对聚丙烯酸聚合物的游离酸形式的溶液进行步骤c)的灭菌，并在灭菌后进行成盐。

在任何阶段，如果需要成盐，可以通过在溶液中引入碱如NaOH或KOH来获得，这取决于期望的盐。

例如，对聚丙烯酸聚合物的药学上可接受的盐的溶液进行纯化和/或灭菌。该溶液例如是缓冲水溶液，特别是使用磷酸盐缓冲液或使用TRIS，Hepes，组氨酸或柠檬酸盐缓冲液。聚丙烯酸聚合物的药学上可接受的盐的水溶液也可包含一种或几种另外的盐，例如NaCl。在这种情况下，根据本发明的方法，对于制备聚丙烯酸聚合物的药物上可接受的盐，特别是如段落“聚丙烯酸聚合物的特征”中所定义的聚丙烯酸聚合物的药学上可接受的盐，该方法包括下列连续步骤：

a)得到所选择的聚丙烯酸聚合物的药学上可接受的盐的溶液，

b)纯化聚丙烯酸聚合物盐的溶液，以便消除杂质，和

c)将得到的纯化的聚丙烯酸聚合物盐的溶液灭菌。

有利地，步骤a)的溶液的聚丙烯酸聚合物具有大于或等于0.7的马克-豪温克斜率。当在溶液中时，聚丙烯酸聚合物为盐的形式，这种马克-豪温克斜率涉及聚丙烯酸聚合物盐。

纯化将除去小分子。可以通过渗析，渗滤，超滤或尺寸排阻色谱进行纯化。渗滤和超滤使用在多孔膜上的交叉流过滤(也称为切向流过滤)。含有聚丙烯酸聚合物的溶液在膜上循环：包括小分子的一部分溶液在将通过膜的渗透物中被消除。溶液的另一部分，称为渗余物，其包含纯化的聚丙烯酸聚合物，将在膜的表面上循环。渗余物可以在循环回路中循环并被渗滤或超滤几次。将溶剂(通常为含水缓冲液或盐水溶液)加入渗余物中，以与渗透物流速相同的速率循环，以代替渗透物体积，使得渗余物的体积保持恒定。消除的分子的大小由膜的截留值(cut-off)决定。有利地，可以使用截留值为1-80kDa，优选2-50kDa的膜。这种膜例如可在Merck Millipore获得。根据其标称分子量限值(NMWL)或其分子量截留值(MWCO)评定膜的截留值。例如，额定为30kD的UF膜将排除分子量为30千道尔顿的测试蛋白质。百分之九十的测试蛋白质将保留在渗余物中，10％将通过到渗透物中，如果在该过程中没有向渗余物中添加缓冲液或盐水溶液，则导致蛋白质浓缩。

通常，渗余物循环的流速为50-80L/H/m²。跨膜压力(TMP)例如为0.9+/-0.1bar。

因此，步骤b)中的纯化可以通过渗析，渗滤，超滤或尺寸排阻色谱法进行。纯化可以对含有2-50mg/ml、优选10-30mg/ml的聚丙烯酸聚合物的溶液进行。当在溶液中聚合物为盐的形式时，该浓度涉及聚合物盐。

有利地，纯化通过使用截留值为1-80kDa，优选2-50kDa的膜的渗滤来进行。

优选地，纯化在允许回收溶液中的聚丙烯酸聚合物的条件下进行，该溶液具有：

-小于0.005％，优选小于0.001％w/w的过硫酸盐，以(特别是通过渗滤)纯化后得到的溶液的总干物质为基准，或更通常地小于0.005％，优选小于0.001％w/w的氧化剂，以(特别是通过渗滤)纯化后得到的溶液的总干物质为基准，和/或

-小于0.005％w/w的游离酸形式或盐形式的丙烯酸单体，以(特别是通过渗滤)纯化后得到的溶液的总干物质为基准。

回收的聚丙烯酸聚合物的重均分子量Mw可以在350-650kDa范围内，且其多分散性指数小于或等于4。

选择纯化装置以消除期望的杂质。例如，当使用超滤或渗滤进行纯化时，将根据要消除的杂质选择膜的截留值。截留值至少为20kDa，基本上，过硫酸盐和单体等小分子通过交叉过滤消除。截留值高于20kDa时，更大的分子如低聚物也被消除，结果是，纯化导致IP降低和Mw增加。

-优选地，渗滤或超滤使用所用膜的截留值进行，或更通常地纯化在允许回收溶液中的聚丙烯酸聚合物的条件下进行，所述溶液具有：在380至620kDa范围内的重均分子量Mw和小于或等于2.5的多分散性指数；或在400至600kDa范围内的重均分子量Mw和小于或等于2的多分散性指数，和

-小于0.005％，优选小于0.001％w/w的过硫酸盐，以(特别是通过渗滤)纯化后得到的溶液的总干物质为基准，或更通常地小于0.005％，优选小于0.001％w/w的氧化剂，以(特别是通过渗滤)纯化后得到的溶液的总干物质为基准，和/或

-小于0.005％w/w的游离酸形式或盐形式的丙烯酸单体，以(特别是通过渗滤)纯化后得到的溶液的总干物质为基准。

有利地，纯化步骤后得到的溶液包含2-50mg/mL的聚丙烯酸聚合物盐，特别是至少10mg/ml的聚丙烯酸聚合物盐。

纯化过程的主要结果在于消除小分子，例如氧化剂(即过硫酸盐)和丙烯酸盐单体。

通过系统地进行这样的纯化步骤，可以更好地确定用作佐剂的聚合物组合物的特性，并且组合物更安全和更稳定。怀疑具有胚胎毒性和致畸性的丙烯酸单体的含量显著降低。

如上所述，根据装置的使用(特别是膜的截留值)的不同，渗滤，渗析、超滤或尺寸排阻色谱也导致所得聚丙烯酸聚合物的重均分子量增加和它的多分散性指数(IP)降低。实际上，根据所使用的技术，特别是所用膜的截留值的不同，在渗滤，渗析和超滤中或在尺寸排阻色谱中使用的凝胶的渗透特性，低聚物也被消除，因此，Mw将增加，IP也会降低。在这些情况下，聚合物盐的组成甚至更受控制。

灭菌可以通过灭菌过滤或优选地通过高压灭菌来进行。在0.2μm孔膜上进行灭菌过滤。消除氧化剂允许使用药典推荐的高压灭菌来灭菌。高压灭菌可以在100至150℃的温度下进行，并且在5分钟至1小时的时间内进行。通过纯化步骤，所得聚合物随时间更稳定并且更耐热处理。

本发明还涉及一种储存聚丙烯酸聚合物的药物上可接受的盐、特别是如“聚丙烯酸聚合物的特征”段落中所定义的聚丙烯酸聚合物的药物上可接受的盐的溶液的方法，该方法包括根据本发明定义的制备方法，然后是得到的溶液形式的聚丙烯酸聚合物的药学上可接受的盐的储存步骤。存储步骤可持续1天至2年。在大多数情况下，储存温度在0至30℃的范围内，特别是在2-8℃或室温下，通常在约22℃。可以在灭菌步骤c)之后直接进行储存。

与必需要聚合物再悬浮/稀释来制备疫苗组合物的干燥形式的储存相比，这种佐剂以液体形式储存是非常有利的并且避免了额外的操作。

特别地，当聚丙烯酸聚合物盐的液体溶液包含小于0.005％、优选小于0.001％w/w的氧化剂时，以所述聚丙烯酸聚合物盐的总干重为基准，和/或小于0.005％、优选小于0.001％w/w的过硫酸盐时，以所述聚丙烯酸聚合物盐的总干重为基准，该溶液特别稳定。

通过将聚丙烯酸聚合物盐的溶液置于容器中并储存来进行储存步骤。在储存期间，储存的溶液例如含有2-50mg/mL的聚丙烯酸聚合物盐。可以进行稀释或浓缩步骤以获得所需浓度，例如在制备方法的步骤b)之后。在储存期间，聚丙烯酸聚合物盐可以为，例如，水溶液形式或缓冲水溶液形式。储存的溶液的pH通常在5.5和8之间，并且更优选在6.5和7.5之间(例如约7)。可以通过使用缓冲剂例如Tris缓冲液，柠檬酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液，Hepes缓冲液或组氨酸缓冲液来维持稳定的pH。

水溶液还可以包含一种或几种另外的盐，例如NaCl。

储存可以通过将聚丙烯酸聚合物盐的溶液保持避光来进行。为了这一目的，可以采用暗黑或不透明的容器。

聚丙烯酸聚合物作为佐剂的用途

本发明还涉及如本发明所定义的聚丙烯酸聚合物盐，无论所述实施方案与上述“聚丙烯酸聚合物的特征”段落是否有关，其用作疫苗组合物中的佐剂或在个体中、特别是在人中引发免疫应答的疫苗试剂中的佐剂。

用于疫苗的佐剂组合物也是本发明的目的，所述佐剂组合物包含如本发明所定义的聚丙烯酸聚合物的药物上可接受的盐的水溶液，无论所述实施方案与上述段落“聚丙烯酸聚合物的特征”是否有关。

如本文所用，“佐剂”是指调节疫苗组合物的免疫原性的化合物。疫苗组合物通常包括疫苗试剂，其可以是抗原或编码抗原的载体(活重组病毒载体或核酸)。更确切地说，佐剂调节由组合物中存在的核酸呈现或编码的抗原的免疫原性。“调节免疫原性”包括增强由抗原诱导的免疫应答的量级和/或持续时间，并且特别包括抗体应答的增强(尤其是病毒中和抗体或杀菌抗体)和/或细胞免疫应答的增强(CD4+和/或CD8+T细胞应答的增强)。

根据本发明选择的聚合物具有不同的优点，如实施例所示。例如，与较低Mw的类似线性或分枝聚合物相比，它们导致增强的免疫应答。

CD4+淋巴细胞，也称为“辅助性”T细胞，是免疫应答介体。传统上，两种类型的效应CD4+T辅助性细胞应答，称为Th1和Th2，其特征在于细胞因子谱和抗体亚型分型。除通常由现有技术的人佐剂(铝盐，水包油型乳剂)诱导的Th-2应答外(获得了小鼠中IL-4，IL-5和IgG1抗体的结果)，如本发明所定义的聚丙烯酸聚合物的应用具有促进强Th-1应答的优点(获得了小鼠中IFN-γ，TNF-α和IgG2a抗体的结果)。诱导强烈的Th-1免疫性对于抵抗病毒和细胞内细菌感染以及癌症非常重要，因为Th-1免疫应答支持巨噬细胞和其它杀伤细胞(例如CD8+T淋巴细胞或细胞毒性T淋巴细胞)的激活，从而杀伤细胞内病原体、感染的细胞和肿瘤细胞。

本发明的聚丙烯酸聚合物盐和疫苗试剂可以配制在相同的组合物中，特别是在含水组合物中，或在两种不同的组合物中，并在即将施用前混合。

还可以以套装试剂盒的形式获得疫苗组合物。疫苗组合物可包括两个小瓶：一个含有疫苗试剂，而另一个含有聚丙烯酸聚合物盐。特别地，液体制剂中的聚丙烯酸聚合物盐包含在第一个小瓶中，并且冷冻干燥或冻干形式的疫苗试剂、特别是冷冻干燥或冻干形式的选定抗原包含在第二个小瓶中。聚丙烯酸聚合物盐的制剂将用于再水化疫苗试剂，特别是选定的抗原。

本发明还涉及如本发明所定义的聚丙烯酸聚合物盐，无论所述实施方案与上述段落“聚丙烯酸聚合物的特征”是否有关，其用作疫苗组合物中的佐剂，其增强获得的Th1免疫应答和/或平衡获得的Th1和Th2免疫应答。特别地，如本发明所定义的聚丙烯酸聚合物盐用作疫苗试剂的佐剂，用于提高个体，特别是人的免疫应答，并增强获得的Th1免疫应答和/或平衡获得的Th1和Th2免疫应答。

疫苗组合物和疫苗试剂

本发明的疫苗组合物可以包含可用于疫苗的任何疫苗试剂，例如抗原或编码抗原的载体(活病毒载体或核酸，包括DNA和RNA)。

出于本发明的目的，术语“抗原”旨在表示含有一个或多个表位(线性，构象或两者)的任何分子，其引发免疫应答。可用于本发明的疫苗组合物的抗原可以是活的，减毒，杀死的，灭活的或无感染性的完整微生物，微生物的提取物或分裂物，天然抗原的亚单位形式，重组形式或杂合形式。当它是亚单位形式时，抗原的性质几乎不重要。抗原可以是肽，蛋白质，糖蛋白，多糖，糖脂，脂蛋白，脂肽，VLP(病毒样颗粒)......等。

组合物中存在的疫苗试剂是抗原或编码抗原的载体(重组病毒或核酸)，其用于或适用于治疗或预防可能影响人或人以外动物的各种疾病，特别包括：白喉，破伤风，脊髓灰质炎，狂犬病，百日咳，甲型肝炎，乙型肝炎，丙型肝炎，黄热病，伤寒，水痘，麻疹，腮腺炎，风疹，日本脑炎，流感，脑膜炎，霍乱，轮状病毒、诺罗病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒、单纯疱疹病毒、乳头状瘤病毒、巨细胞病毒、西尼罗河病毒、登革热病毒、基孔肯雅病毒、HIV(AIDS)引起的感染，链球菌属(streptococci)、砂眼和肺炎衣原体(Chlamydia trachomatis andpneumoniae)、淋病奈瑟氏球菌和脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae andmeningitidis)、粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或B型流感嗜血菌(Haemophilus influenzae type B)引起的细菌性疾病，李斯特菌病，志贺菌病，沙门氏菌病，肺结核，莱姆病，癌症，寄生虫病例如疟疾，利什曼病，美洲锥虫病，血吸虫病......等。

所述抗原可以具有细菌、病毒或寄生虫性质。在适合于本发明受试者的抗原中，所提及的由如下构成：细菌抗原，其来源于破伤风梭菌(Clostridium tetani)，白喉梭菌(Clostridium diphtheriae)，百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)，B型流感嗜血菌(Haemophilus influenzae type B)，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)，志贺氏菌属(Shigella sp)，伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)，金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)，砂眼衣原体和肺炎衣原体(Chlamydiatrachomatis and pneumoniae)或链球菌属(Streptococcus sp)；病毒抗原，其来源于甲型、乙型或丙型肝炎病毒，流感病毒，鼻病毒，呼吸道合胞病毒，西尼罗河病毒，狂犬病病毒，脊髓灰质炎病毒，HIV病毒，登革热病毒，日本脑炎病毒，黄热病病毒，巨细胞病毒或疱疹病毒；寄生虫抗原，特别来源于疟原虫属(Plasmodium sp.)、利什曼原虫属(leishmania sp.)或血吸虫属(schistosoma sp.)；和肿瘤抗原。可以使用遗传重组方法或使用本领域技术人员众所周知的提取方法获得这些抗原。

特别地，存在于组合物中的疫苗试剂是抗原或编码抗原的载体(重组病毒或核酸)，其来源于金黄色葡萄球菌或来自巨细胞病毒。

本发明的疫苗组合物可以是预期用于针对单一病原体或癌症进行免疫接种的组合物，也就是说它包含单一病原体或癌症的一种或多种疫苗试剂，特别是一种或多种抗原，或者可以是预期用于针对几种病原体或癌症进行免疫接种的组合物。

本发明的疫苗组合物还可以包含一种或几种特定的疫苗试剂，特别是单一疾病的一种或几种抗原，但它们属于该疾病的不同类别(多种血清型或菌株或进化枝，这取决于试剂的性质)。

本发明的聚丙烯酸聚合物盐和疫苗试剂可以与任何药学上可接受的媒介物一起配制成组合物。在本发明的上下文中，表述“药学上可接受的媒介物”是指对哺乳动物、特别是对人施用是生理学上可接受的，同时保留本发明组合物的生理活性、即它诱导免疫应答的能力的媒介物。一种示例性药学上可接受的媒介物是生理盐水缓冲液。其它生理上可接受的媒介物是本领域技术人员已知的并且例如描述于Remington′s PharmaceuticalSciences(第18版)，ed.A.Gennaro，1990，Mack Publishing Company，Easton，Pa中。

组合物的pH通常在5.5和8之间，并且更优选在6.5和7.5之间(例如约7)。可以通过使用缓冲剂例如Tris缓冲液，柠檬酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液，Hepes缓冲液或组氨酸缓冲液来维持稳定的pH。因此，组合物通常包含缓冲剂。该组合物可以是无菌的和/或无热原的。组合物可以相对于人类是等渗的。

所述组合物还可以包含一种或几种另外的盐，例如NaCl。

本发明的组合物包含免疫有效量的疫苗试剂。“免疫有效量”是当施用于受试者时，有效引发针对所使用的抗原或在载体和/或核酸表达时产生的抗原的免疫应答的量。该量可以根据受试者的健康和身体状况，他们的年龄，受试者免疫系统产生抗体的能力，期望的保护程度，疫苗的配方，治疗医生的医疗情况评估的不同而变化。

本发明的疫苗组合物还可以包含过敏原，特别是在变态反应治疗中用于脱敏的过敏原。

本发明的疫苗组合物可以通过常用于施用疫苗的任何途径施用。将使用导致诱导预期免疫应答的方案。通常，免疫接种计划包括几个主管部门。施用的组合物的量足以产生期望的免疫应答。

优选地，考虑到聚丙烯酸聚合物的良好稳定性，疫苗组合物为液体形式，从而允许使用生产成本较低的液体形式。

肠胃外注射(肌肉内，皮下，皮内和静脉内)也是优选的。聚丙烯酸聚合物在皮内注射后不会引起局部明显的副作用。这可能优于大多数其它佐剂(包括铝盐)，其有时出现通过皮内途径的反应。

本发明的优选的疫苗组合物如下文所述：

本发明的疫苗组合物包含至少一种疫苗试剂和聚丙烯酸聚合物的药学上可接受的盐，所述聚丙烯酸聚合物盐具有在350-650kDa范围内的重均分子量Mw。

有利地，本发明的疫苗组合物每剂量包含0.1-8mg，优选0.1-4mg，且更优选0.1-2mg的聚丙烯酸聚合物的药学上可接受的盐。

优选地，至少一种疫苗试剂是抗原或编码抗原的载体(病毒载体或核酸)，所述抗原是来源于破伤风梭菌，白喉梭菌，百日咳博德特氏菌，B型流感嗜血菌，肺炎链球菌，脑膜炎奈瑟氏球菌，志贺氏菌属，伤寒沙门氏菌，金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌，结核分枝杆菌，砂眼衣原体或肺炎衣原体或链球菌属的细菌抗原；来源于甲型、乙型或丙型肝炎病毒，流感病毒，鼻病毒，呼吸道合胞病毒，西尼罗河病毒，狂犬病病毒，脊髓灰质炎病毒，HIV病毒，登革热病毒，日本脑炎病毒，黄热病病毒，巨细胞病毒或疱疹病毒的病毒抗原；特别地来源于疟原虫属，利什曼原虫属或血吸虫属的寄生虫抗原，或肿瘤抗原。特别地，组合物中存在的疫苗试剂是抗原或编码抗原的载体(重组病毒或核酸)，其来源于金黄色葡萄球菌或来自巨细胞病毒。

在一个优选的实施方案中，本发明的疫苗组合物为液体形式，其具有在5.5-8.0范围内的pH。例如，它们包括磷酸盐缓冲液或TRIS，Hepes，组氨酸或柠檬酸盐缓冲液。

存在于疫苗组合物中的聚丙烯酸聚合物盐具有如下特征之一、这类特征的任意组合乃至所有如下特征，只要它们不相互排斥：

-聚丙烯酸聚合物盐或聚丙烯酸聚合物盐的液体制剂包含小于0.005％，优选小于0.001％w/w的氧化剂，以所述聚丙烯酸聚合物盐的总干重为基准，和/或小于0.005％，优选小于0.001％w/w的过硫酸盐，以所述聚丙烯酸聚合物盐的总干重为基准；

-聚丙烯酸聚合物盐具有小于或等于4，优选小于或等于2.5的多分散性指数；

-聚丙烯酸聚合物盐具有在380至620kDa范围内的重均分子量Mw和小于或等于4的多分散性指数或具有在400至600kDa范围内的重均分子量Mw和小于或等于4的多分散性指数；

-聚丙烯酸聚合物盐具有在380至620kDa范围内的重均分子量Mw和小于或等于2.5的多分散性指数或具有在400至600kDa范围内的重均分子量Mw和小于或等于2的多分散性指数；

-聚丙烯酸聚合物盐具有大于或等于0.7的马克-豪温克斜率；

-聚丙烯酸聚合物盐或聚丙烯酸聚合物盐的液体制剂包含小于0.005％w/w的游离酸形式或盐形式的丙烯酸单体，以所述聚丙烯酸聚合物盐的总干重为基准，

-将直链或支链聚丙烯酸聚合物的药学上可接受的盐渗滤和/或灭菌。

特别地，存在于疫苗组合物中的聚丙烯酸聚合物盐的特征在于：

-重均分子量Mw在380至620kDa范围内和多分散性指数小于或等于4，聚丙烯酸聚合物盐中或聚丙烯酸聚合物盐的液体制剂中的过硫酸盐含量小于0.005％，优选小于0.001％w/w，以所述聚丙烯酸聚合物盐的总干重为基准，且聚丙烯酸聚合物盐中或聚丙烯酸聚合物盐的液体制剂中的游离酸形式或盐形式的丙烯酸单体的含量小于0.005％w/w，以所述聚丙烯酸聚合物盐的总干重为基准；有利地，这种聚丙烯酸聚合物盐具有大于或等于0.7的马克-豪温克斜率，或

-重均分子量Mw在380至620kDa范围内和多分散性指数小于或等于2.5，聚丙烯酸聚合物盐中或聚丙烯酸聚合物盐的液体制剂中的过硫酸盐含量小于0.005％，优选小于0.001％w/w，以所述聚丙烯酸聚合物盐的总干重为基准，且聚丙烯酸聚合物盐中或聚丙烯酸聚合物盐的液体制剂中的游离酸形式或盐形式的丙烯酸单体的含量小于0.005％w/w，以所述聚丙烯酸聚合物盐的总干重为基准；有利地，这种聚丙烯酸聚合物盐具有大于或等于0.7的马克-豪温克斜率，或

-重均分子量Mw在400至600kDa范围内和多分散性指数小于或等于4，聚丙烯酸聚合物盐中或聚丙烯酸聚合物盐的液体制剂中的过硫酸盐含量小于0.005％，优选小于0.001％w/w，以所述聚丙烯酸聚合物盐的总干重为基准，且聚丙烯酸聚合物盐中或聚丙烯酸聚合物盐的液体制剂中的游离酸形式或盐形式的丙烯酸单体的含量小于0.005％w/w，以所述聚丙烯酸聚合物盐的总干重为基准；有利地，这种聚丙烯酸聚合物盐具有大于或等于0.7的马克-豪温克斜率，或

-重均分子量Mw在400至600kDa范围内和多分散性指数小于或等于2，聚丙烯酸聚合物盐中或聚丙烯酸聚合物盐的液体制剂中的过硫酸盐含量小于0.005％，优选小于0.001％w/w，以所述聚丙烯酸聚合物盐的总干重为基准，且聚丙烯酸聚合物盐中或聚丙烯酸聚合物盐的液体制剂中的游离酸形式或盐形式的丙烯酸单体的含量小于0.005％w/w，以所述聚丙烯酸聚合物盐的总干重为基准；有利地，这种聚丙烯酸聚合物盐具有大于或等于0.7的马克-豪温克斜率。

本发明还涉及本发明的疫苗组合物，其用于在个体，特别是人中产生免疫应答。本发明的主题还包括提高个体、特别是人中免疫应答的方法，该方法包括向有此需要的个体施用免疫有效量的本发明组合物的步骤。所述个体可以是人或选自犬科动物，猫科动物，牛科动物，猪科动物，马科动物或绵羊物种以及鼬类和禽类物种的动物。

本发明还涉及本发明的疫苗组合物，其用于在个体、特别是在人中产生免疫应答，同时增强获得的Th1免疫应答。本发明的主题还包括提高在个体、特别是在人中免疫应答的方法，其中增强获得的Th1免疫应答，所述方法包括向有此需要的个体施用免疫有效量的本发明组合物的步骤。

疫苗组合物的制备

有利地，聚丙烯酸聚合物或聚丙烯酸聚合物盐在加入疫苗组合物之前，将其进行纯化，例如渗滤。更确切地说，在将其引入疫苗组合物之前，对其进行纯化，例如渗滤，然后进行灭菌。灭菌可以通过对过滤进行灭菌或优选通过高压灭菌来进行。

根据本发明，疫苗组合物可以通过简单地混合聚丙烯酸聚合物盐、特别是以液体形式在水溶液中或在缓冲水溶液中，以及疫苗试剂和可以存在于组合物中的其它成分的悬浮液来制备。这可以通过如下方式进行：在聚丙烯酸聚合物盐上，特别是在水溶液中或在缓冲水溶液中的液体制剂形式的聚丙烯酸聚合物盐上，添加一种或多种选定的疫苗试剂，或在已经包含所选疫苗试剂的悬浮液上添加聚丙烯酸聚合物，特别是在水溶液中或在缓冲水溶液中的液体制剂形式的聚丙烯酸聚合物。另一方面，在需要配制包含多种疫苗试剂的疫苗组合物的情况下，优选首先将聚丙烯酸聚合物盐与一种或多种疫苗试剂混合，并在此后掺入其它成分。

或者，如果将疫苗试剂配制成冷冻干燥或冻干产品，则可以通过用含有聚丙烯酸聚合物盐的制剂(水溶液或缓冲水溶液)直接再水化冻干剂来获得疫苗组合物。

本发明还涉及本发明所定义的聚丙烯酸聚合物盐在制备包含至少一种疫苗试剂的疫苗组合物中的用途，无论所述实施方案与上述段落“聚丙烯酸聚合物的特征”是否相关。

实施混合本发明所定义的聚丙烯酸聚合物盐与至少一种疫苗试剂的疫苗组合物的方法也是本发明的一个目的，无论所述实施方案与上述段落“聚丙烯酸聚合物的特征”是否相关。

为方便起见，在此处汇集了说明书，实施例和待批权利要求中使用的某些术语。

如本文所用，术语“动物”包括所有脊椎动物，包括人。它还包括处于各个发育阶段的个体动物，包括胚胎和胎儿阶段。特别地，术语“脊椎动物”包括但不限于人，犬科动物(例如狗)，猫科动物(例如猫)；马科动物(例如马)，牛科动物(例如母牛(cow)，牛(cattle)，猪科动物(例如猪)，以及禽类。如本文所用，术语“母牛”或“牛”通常用于指任何年龄的牛来源的动物。可互换的术语包括“牛”，“小牛”，“阉牛”，“公牛”，“小母牛”，“母牛”等。可互换的术语包括“仔猪”，“母猪”等。如本文所用，术语“禽类”是指分类类ava的任何种或亚种，例如但不限于鸡(育种者，肉鸡和蛋鸡)，火鸡，鸭，鹅，鹌鹑，雉鸡，鹦鹉，雀，隼，乌鸦和平胸鸟，包括鸵鸟，食火鸟和鹤鸵。术语“猪”或“仔猪”是指猪科动物来源的动物，而“母猪”是指育龄和生殖能力的雌性。

如本文所用，术语“毒力”是指保留其在动物宿主中具有感染性的能力的分离物。

如本文所用，术语“灭活疫苗”是指含有不再能够复制或生长的传染性生物或病原体的疫苗组合物。病原体可以是细菌，病毒，原生动物或真菌来源。灭活可以通过多种方法完成，包括冻融，化学处理(例如，用福尔马林处理)，超声处理，辐射，加热或足以防止生物体复制或生长同时保持其免疫原性的任何其它常规手段。

如本文所用，术语“免疫原性”是指能够在宿主动物中产生针对抗原的免疫应答。这种免疫应答形成了针对特定传染性生物体的疫苗引发的保护性免疫的基础。

如本文所用，术语“免疫应答”是指在动物中引发的应答。免疫应答可以指细胞免疫(CMI)；体液免疫或可能涉及两者。本发明还考虑了限于免疫系统的一部分的反应。例如，本发明的疫苗组合物可以特异性地诱导增加的γ干扰素应答。

如本文所用，术语“抗原”或“免疫原”是指在宿主动物中诱导特异性免疫应答的物质。抗原可以包括整个生物体，杀死，减毒或活的；生物体的亚单位或部分；含有具有免疫原性特性的插入物的重组载体；能够在呈递给宿主动物时诱导免疫应答的DNA碎片或片段；蛋白质，多肽，肽，表位，半抗原，毒素，抗毒素；或其任意组合。

如本文所用，术语“多价体”是指包含一种以上抗原的疫苗，无论其来自同一种类(即FMD病毒血清型的不同分离物)，来自不同种类(即来自溶血巴斯德菌(Pasteurellahaemolytica)和多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)的分离物)，或包含来自不同属的抗原的组合的疫苗(例如，包含来自多杀巴斯德菌、沙门菌属(Salmonella)、大肠杆菌(Escherichia coli)、睡眠嗜血菌(Haemophilus somnus)和梭菌属(Clostridium)的疫苗)。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”和“药学上可接受的媒介物”是可互换的，并且是指含有疫苗抗原的流体媒介物，其可以注射到宿主中而没有副作用。本领域已知的适合的药学上可接受的载体包括但不限于无菌水，盐水，葡萄糖，右旋糖或缓冲溶液。载体可包括助剂，包括但不限于稀释剂，稳定剂(即糖和氨基酸)，防腐剂，润湿剂，乳化剂，pH缓冲剂，粘度增强添加剂，着色剂等。

如本文所用，术语“疫苗组合物”包括在药学上可接受的媒介物中的至少一种抗原或免疫原，其可用于在宿主中诱导免疫应答。疫苗组合物可以通过医学或兽医领域技术人员众所周知的剂量和技术施用，同时考虑诸如受体动物的年龄，性别，体重，种类和状况以及施用途径等因素。施用途径可以是经皮，通过粘膜施用(例如口服，鼻腔，肛门，阴道)或通过肠胃外途径(皮内，肌肉内，皮下，静脉内或腹膜内)。疫苗组合物可以单独施用，或者可以与其它治疗或疗法共同施用或顺序施用。施用形式可包括悬浮液，糖浆或酏剂，以及肠胃外，皮下，皮内，肌肉内或静脉内施用的制剂(例如注射施用)，例如无菌悬浮液或乳液。疫苗组合物可以作为喷雾剂施用或在食物和/或水中混合或与适合的载体，稀释剂或赋形剂(例如无菌水，生理盐水，葡萄糖等)混合递送。组合物可含有辅助物质，例如润湿剂或乳化剂，pH缓冲剂，佐剂，胶凝或粘度增强添加剂，防腐剂，矫味剂，着色剂等，这取决于施用途径和期望的制剂。可以参考标准药学教科书，例如“Remington's Pharmaceutical Sciences”，1990来制备适合的制剂，而无需过多的实验。

适用于本发明的免疫原或抗原可以选自灭活病原体，减毒病原体，免疫原性亚单位(例如蛋白质，多肽，肽，表位，半抗原)或重组表达载体，包括具有免疫原性插入物的质粒。在本发明的一个实施方案中，免疫原是灭活或杀死的微生物。在本发明的另一个实施方案中，疫苗组合物包含选自禽病原体的免疫原，包括但不限于鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)，肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis)，传染性支气管炎病毒(IBV)，新城疫病毒(NDV)，蛋滴综合征病毒(EDS)或传染性腔上囊病病毒(IBDV)，禽流感病毒及其组合。

或者，疫苗组合物包含选自猫科动物病原体的免疫原，例如猫疱疹病毒(FHV)，猫嵌杯样病毒(FCV)，猫白血病病毒(FeLV)，猫免疫缺陷病毒(FIV)，狂犬病病毒及其组合。

在另一个实施方案中，本发明的疫苗组合物包含选自犬科动物病原体的免疫原，所述犬科动物病原体包括但不限于狂犬病病毒，犬疱疹病毒(CHV)，犬细小病毒(CPV)，犬冠状病毒，犬钩端螺旋体(Leptospira canicola)，钩端螺旋体病毒(Leptospiraicterohaemorragiae)，感冒伤寒型钩端螺旋体(Leptospira grippotyphosa)，支气管炎博德特氏菌(Borrelia burgdorferi)，支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)等及其组合。

在本发明的另一个实施方案中，所述组合物包含选自马科动物病原体的免疫原，例如马疱疹病毒(1型或4型)，马流感病毒，破伤风，西尼罗河病毒等或其组合。

在本发明的另一个实施方案中，所述组合物包含选择牛科动物病原体的免疫原，例如口蹄疫病毒(FMDV)，狂犬病病毒，牛轮状病毒，牛副流感病毒3型(bPIV-3)，牛冠状病毒，牛病毒性腹泻病毒(BVDV)，牛呼吸道合胞病毒(BRSV)，传染性牛鼻气管炎病毒(IBR)，大肠杆菌，多杀巴斯德菌(P.multocida)，溶血巴斯德菌(P.haemolytica)及其组合。

在本发明的另一个实施方案中，所述组合物包含疫苗试剂，包括免疫原和编码免疫原的核酸，所述免疫原选自猪科动物病原体，例如但不限于猪流感病毒(SIV)，猪环状病毒2型(PCV-2)，猪生殖呼吸综合征病毒(PRRS)，假性狂犬病病毒(PRV)，猪细小病毒(PPV)，FMDV，猪肺炎支原体(M.hyopneumoniae)，猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)，多杀巴斯德菌(Pasteurellamultocida)，支气管败血性博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)，大肠杆菌等及其组合。

包含病毒，细菌，真菌等的疫苗试剂可以通过体外培养方法使用适当的培养基或宿主细胞系和本领域普通技术人员众所周知的常规方法产生。例如，PRRS可以在适合的细胞系中培养，例如MA-104细胞系(参见美国专利5,587,164；5,866,401；5,840,563；6,251,404)。以类似的方式，可以使用PK-15细胞系培养PCV-2(参见US6,391,314)；可以在卵上培养SIV(US6,048,537)；并且可以在适合的培养基中培养猪肺炎支原体(US5,968,525；US5,338,543)。

为了获得灭活的免疫或疫苗组合物，在收获后病原体优选灭活，并且任选地，通过使用例如福尔马林或甲醛，β-丙内酯，乙烯亚胺，二元乙烯亚胺(BEI)的化学处理进行澄清，和/或物理处理(例如热处理或超声处理)。灭活方法是本领域技术人员众所周知的。例如，FMD病毒可被乙烯亚胺(Cunliffe，HR，Applied Microbiology，1973，p.747-750)或通过高压(Ishimaru等人，Vaccine 22(2004)2334-2339)灭活，PRRS病毒可以通过β-丙内酯处理灭活(Plana-Duran等人，Vet.Microbiol.，1997，55：361-370)或通过BEI处理(US5,587,164)；可以使用乙烯亚胺处理或通过β-丙内酯处理(美国专利序列号6,391,314)来灭活PCV-2病毒；猪流感病毒可以使用诸如Triton的洗涤剂或用甲醛处理(US6,048,537)灭活；M.hyopneumoniae可通过甲醛处理(RossR.F.上文)，乙烯亚胺或BEI处理灭活。

灭活病原体可以通过常规浓缩技术浓缩，特别是通过超滤，和/或通过常规纯化方法纯化，特别是使用色谱技术，包括但不限于凝胶过滤，使用蔗糖梯度的超速离心或选择性沉淀，特别是在PEG存在下。

可用于本发明的疫苗组合物的免疫原还包括表达载体。此类载体包括但不限于体内重组表达载体，例如多核苷酸载体或质粒(EP-A2-1001025；Chaudhuri P，Res.Vet.Sci.2001，70：255-6)，病毒载体，例如，但不限于，腺病毒载体，痘病毒载体，例如鸡痘(US5,174,993；US5,505,941；和US5,766,599)或金丝雀痘载体(US5,756,103)或细菌载体(大肠杆菌或沙门菌属)。

本发明还包括多价免疫组合物或组合疫苗组合物的制剂。例如，可用于根据本发明制备的组合牛科动物细菌的抗原包括但不限于牛支原体(Mycoplasma bovis)，巴斯德菌属(Pasteurella sp.)，特别是多杀巴斯德氏菌和溶血性巴斯德氏菌，嗜血菌，特别是睡眠嗜血菌，梭菌属，沙门菌属，棒杆菌属(Corynebacterium)，链球菌属，葡萄球菌属(Staphylococcus)，莫拉菌属(Moraxella)，大肠杆菌等。

本发明进一步提供了在宿主(例如动物)中诱导免疫应答的方法，该方法包括向宿主施用本发明的免疫组合物或疫苗组合物。以这种方式引发的免疫应答特别是抗体和/或细胞免疫应答，以及特别地，γ-干扰素应答。

特别地，本发明提供免疫抵抗或预防或减轻由病原生物感染动物(例如，病毒，细菌，真菌或原生动物寄生虫的感染)引起的症状的方法。本发明的方法可用于脊椎动物，包括但不限于人，犬科动物(例如狗)，猫科动物(例如猫)；马科动物(例如马)，牛科动物(例如牛)和猪科动物(例如猪)；以及禽类，包括但不限于小鸡，火鸡，鸭，鹅，鹌鹑，雉鸡，鹦鹉，雀，鹰，乌鸦和平胸鸟(鸵鸟，食火鸟，鹤鸵等)。

在本发明的一个特定方面，这些方法由通过施用根据本发明制备的疫苗组合物在分娩前疫苗接种妊娠雌性组成。这些方法还包括诱导由疫苗接种方案引发的保护性抗体以及将这些保护性抗体从接种疫苗的妊娠雌性转移至其后代，以保护后代免于感染和疾病。

根据本发明制备的疫苗组合物的剂量将取决于待接种动物的种类，品种，年龄，大小，接种史和健康状况。其它因素如抗原浓度，其它疫苗成分和施用途径(即皮下，皮内，口服，肌肉内或静脉内施用)也会影响有效剂量。基于疫苗的抗原浓度，施用途径以及待接种动物的年龄和状况，可以容易地确定施用疫苗的剂量。每批抗原可以单独校准。或者，可以使用不同剂量的系统性免疫原性试验，以及LD₅₀研究和其它筛选程序来确定本发明的疫苗组合物的有效剂量而无需过多的实验。从下面给出的实施例中显而易见，使用本文所述的疫苗组合物的适当的近似剂量和大致体积是多少。关键因素是剂量对自然感染提供至少部分保护作用，如通过降低与自然感染相关的死亡率和发病率所证明的。适当的体积同样可由本领域普通技术人员容易地确定。例如，在禽类物种中，剂量的体积可以是约0.1ml至约0.5ml，并且有利地，约0.3ml至约0.5ml。对于猫科动物，犬科动物和马科动物物种，剂量的体积可以是约0.2ml至约3.0ml，有利地约0.3ml至约2.0ml，更有利地，约0.5ml至约1.0ml。对于牛科动物和猪科动物物种，剂量可以是约0.2ml至约5.0ml，有利地约0.3ml至约3.0ml，更有利地是0.5ml至约2.0ml。

可以优选以周期性的时间间隔重复接种以最初增强免疫应答，或者当自最后一次给药以来已经过去很长一段时间。在本发明的一个实施方案中，疫苗组合物以肠胃外注射(即皮下，皮内或肌肉内)施用。所述组合物可以作为一个剂量施用，或者在替代实施方案中，以约两至约六周的间隔，优选约两周至五周的间隔以约2至约5个剂量的重复剂量施用。然而，本领域技术人员将认识到，疫苗接种之间的剂量数量和时间间隔取决于许多因素，包括但不限于接种动物的年龄；动物的状况；免疫接种途径；每剂量可获得的抗原量等。对于初次接种疫苗，该期限通常长于一周，优选将在约两周至五周之间。对于先前接种疫苗的动物，可以在每年约一年的间隔在妊娠前或妊娠期间进行加强免疫接种。

本发明进一步涉及治疗宿主例如动物的方法，该方法包括向宿主施用根据本发明制备的药物组合物，所述药物组合物包含至少一种免疫原，所述免疫原选自蛋白质或肽，灭活或减毒病毒，抗体，过敏原，CpG ODN，生长因子，细胞因子或抗生素，且特别是CpG ODN或细胞因子。这些药物组合物可用于改善动物(例如小鸡，猪，母牛或牛)的生长性能。

在一个实施方案中，本公开提供了免疫学或疫苗组合物，其包含佐剂制剂，治疗有效量的抗原成分和药学上或兽医学上接受的载体，其中所述佐剂制剂包含非交联聚丙烯酸(PAA)聚合物，其具有为约350kDa至约650kDa的重均分子量(AMw)。在一些实施方案中，抗原成分可包含减毒重组病毒载体，天然或基因工程减毒活病毒或微生物，灭活病毒或微生物，球虫微生物，早熟球虫微生物，蛋白质亚单元，单细胞寄生虫，多细胞寄生虫或上述的任何组合。

在一个具体实施方案中，抗原成分可以包含：犬冠状病毒(CCV)抗原，犬瘟热病毒(CDV)抗原，犬细小病毒抗原(CPV)，犬副流感病毒(CPI)抗原，猫嵌杯样病毒(FCV)抗原，猫免疫缺陷病毒(FIV)抗原，猫疱疹病毒(FHV)抗原，猫白血病病毒(FeLV)抗原，癌抗原(例如Her2-neu，酪氨酸酶，IL-2等)，艾美球虫属(Eimeria sp.)或其抗原，大肠杆菌或其抗原，猪肺炎支原体(M.hyo)，牛腹泻病毒(BDV)抗原，含有并能够在体内表达至少一种保护性免疫原的重组金丝雀痘载体，灭活全长狂犬病糖蛋白，丹毒丝菌属(Erysipelothrix sp.)，猪红斑丹毒丝菌，来自猪红斑丹毒丝菌的表面保护性抗原(SpaA)，包含至少一部分至少一种另外的免疫原的SpaA融合蛋白，SpaA-FlaB融合蛋白，SpaA—FlaB—His融合蛋白，产气荚膜梭菌B/C毒素，产气荚膜梭菌D毒素，败毒梭菌(C.septicum)毒素，诺氏梭菌(C.novyi)毒素，破伤风梭菌(C.tetani)毒素或上述的任意组合。

在另一个实施方案中，所述抗原成分包含灭活全长狂犬病糖蛋白或由其组成。抗原成分还可以包含产气荚膜梭菌B/C毒素，产气荚膜梭菌D毒素，败毒梭菌毒素，诺氏梭菌毒素，破伤风梭菌毒素或其组合。在一个具体的实施方案中，所述免疫或疫苗组合物可以包含抗原成分，其包含产气荚膜梭菌B/C毒素，产气荚膜梭菌D毒素，败毒梭菌毒素，诺氏梭菌毒素和破伤风梭菌毒素。本文公开的PAA佐剂提供“剂量保留”。

在另一个实施方案中，所述抗原成分包含SpaA抗原或融合蛋白，所述融合蛋白包含SpaA抗原。

在另一个实施方案中，所述抗原成分包含减毒禽痘病毒或含有并能够在体内表达流感病毒基因的DNA质粒。抗原成分还可以包含减毒禽痘病毒或含有并能够在体内表达狂犬病糖蛋白基因的DNA质粒。

在另一方面，提供了各种治疗方法。例如，本公开提供了一种治疗牛科动物抗由细菌引起的感染的方法，该方法包括给牛科动物施用包含具有约350kD至约650kDa范围的Mw的PAA聚合物的疫苗组合物。在具体的实施方案中，具有约450kDa的Mw的PAA特别适用于在动物包括牛科动物中引发保护性免疫应答。

在一个实施方案中，本公开内容提供了治疗犬科动物或马科动物抗由流感引起的感染的方法，该方法包括向犬科动物或马科动物施用包含禽痘病毒或含有并能够在体内表达流感抗原的DNA质粒的疫苗。在具体的实施方案中，流感抗原是HA基因。

在另一个实施方案中，本公开提供了治疗犬科动物抗狂犬病病毒引起的感染的方法，该方法包括向犬科动物施用包含灭活狂犬病糖蛋白和具有约350kDa至650kDa的Mw的PAA的疫苗组合物。

本发明还提供了禽类疫苗，包括禽球虫病疫苗，其用于在卵内施用，其可以包含：

佐剂，其包含非交联PAA，所述非交联PAA具有约350kDa至约650kDa的平均Mw；和

原生动物抗原，其选自(1)一种或多种重组表达的蛋白质；(2)一种或多种通过常规方法从所述原生动物中分离的蛋白质或其它大分子；(3)来自所述原生动物的全细胞提取物或制剂；和(4)灭活的，活的或活的早熟球虫，所述球虫选自：堆形艾美球虫(Eimeria(E.)acervulina)，腺样艾美球虫(E.adenoeides)，布氏艾美球虫(E.brunetti)，秋水仙艾美球虫(E.colchici)，弯曲艾美球虫(E.curvata)，分散艾美球虫(E.dispersa)，十二指肠艾美球虫(E.duodenalis)，费特库拉艾美球虫(E.fraterculae)，加洛帕沃尼艾美球虫(E.gallopavonis)，无毒艾美球虫(E.innocua)，早熟艾美球虫(E.praecox)，巨型艾美球虫(E.maxima)，珠鸡艾美球虫(E.meleagridis)，珠鸡和缓米堤艾美球虫(E.meleagrimitis)，和缓艾美球虫(E.mitis)，毒害艾美球虫(E.necatrix)，法思艾美球虫(E.phasiani)，原尾艾美球虫(E.procera)，禽艾美球虫(E.tenella)及其组合。

在具体的实施方案中，PAA具有约450kDa的平均Mw。

本发明进一步提供了一种治疗牛科动物抗由大肠杆菌或猪肺炎支原体引起的感染的方法，该方法包括给牛科动物施用包含PAA和大肠杆菌或猪肺炎支原体的疫苗组合物。本发明必然包括一种治疗猪抗由猪肺炎支原体引起的感染的方法，该方法包括给猪喂食包含猪肺炎支原体的疫苗。

在另一个实施方案中，免疫学或疫苗组合物包含对应于负责猫科动物感染和/或疾病状态的试剂的抗原。抗原可包含猫免疫缺陷病毒(FIV)。本发明还提供了治疗猫科动物对由FIV引起的感染的方法，该方法包括给猫科动物施用包含FIV抗原和PAA的疫苗。

在另一个实施方案中，本公开提供了包含癌抗原的疫苗组合物。在相关实施方案中，本公开提供了治疗受试者抗癌的方法，该方法包括向受试者施用包含癌抗原和PAA的疫苗组合物。

下文参考附图的实施例突出了本发明中使用的聚合物的性质和优点。在这些实施例中，NaPAA表示聚合物钠盐，无论其是否为本发明。

未指定时，“分子量”是指“重均分子量”。

实施例1-用于表征聚合物的材料和方法

Mw、马克-豪温克斜率、IP、单体和过硫酸盐含量的所有测定均根据下文的方法进行。

I.1-Mw、马克-豪温克斜率和IP的测定

1.化学品和试剂

用Milli-Q-UF系统(Millipore，Milford，MA，USA)纯化水。室内制备磷酸盐缓冲盐水(PBS 1C；6.5mMol.L^-1Na₂HPO₄，2H₂O；1.5mMol.L^-1KH₂PO₄；2.7mMol.L^-1KCl；137mMol.L^{- 1}NaCl；pH6.8)。用来自Sigma Aldrich(Saint Quentin Fallavier，France)的DNA(CAS编号73049-39-5)和来自VWR(Darmstadt，Germany)的蔗糖(CAS编号57-50-1)测定凝胶渗透特性。用作系统校准的标准品得自Malvern(Malvern，UK)的Pullulan 100KDa和得自Agilent(SantaClara，CA)的Pullulan 400KDa。

2.使用三重检测的尺寸排阻色谱法(SEC)

使用Viscotek GPCmax VE2501系统(Malvern Instrument，Malvern，UK)，其包含具有内置脱气装置的HPLC泵和具有100μL注射环的自动进样器，该系统用于进行HP-SEC分析。Viscotek TDA302检测器系统具有折光率，直角光散射和四-毛细管差分粘度计检测器，该检测器用于在线SEC信号检测。检测器的顺序如下：LS(直角光散射)-RI(折光率)-VIS(四-毛细管差示粘度计)。在柱和检测器之间放置0.22μm尼龙预过滤器。OmniSEC 4.7软件程序用于获取和分析SEC数据。所有检测器均在PBS 1C的流动相中用100KDa支链淀粉标准物校准。将PBS 1C流动相通过0.22μm微孔硝酸纤维素过滤器过滤并在使用前脱气。通过串联连接的两个A6000M(8mm ID×30cm L)柱(Malvern)实现NaPAA样品的分离。在0.6mL.min^-1的流速下洗脱是等度的。对于Mw、IP和马克-豪温克斜率测量，以约0.4mg.mL^-1的目标NaPAA浓度注射100μL样品。普鲁兰400kDa标准品用作所有分析的“对照”样品。柱的空隙体积(V₀)和总渗透体积(V_t)分别通过注射高分子量DNA和蔗糖来测定。

3.标准品和样品的制备

通过将原料溶解在PBS 1C中至终浓度分别为1、0.1和2mg.mL^-1来制备普鲁兰、DNA和蔗糖标准品。配制NaPAA并在PBS 1C中以目标浓度稀释。

4.NaPAA dn/dc值和Mw、马克-豪温克斜率和IP测量值的测定

根据下列关系式使dn/dc系数关联摩尔质量(Zimm，1948，J.chem.Phys.，16，1099-1116)：

其中K是光学常数，其包括下面等式中描述的特定散射系统的dn/dc，C是样品中NaPAA的浓度，R_θ是以角度θ散射的光的过量强度，Mw是重均分子量，且A₂是第二维里系数(Virial coefficient)，由于各个样品级分的浓度极低，所以可以将其视为零。P(θ)是表示光散射强度的角度依赖性的粒子散射函数，并且与聚合物分子的回转半径(Rg)相关联。

其中n₀是样品中溶剂的屈光指数；N_A为阿伏加德罗常数；λ₀为真空中激光束的波长。

对于尺寸小于λ₀/20的小分子，推定散射光的强度与散射角无关，因此对于所有角度，P(θ)＝1。

现在得到的表达式：

R_θ＝KCM_W

NaPAA的dn/dc通过OmniSEC软件，使用增加已知浓度的NaPAA与SEC-三重检测系统从0.4-1mg.mL^-1自动计算。每种浓度一式两份注射。该实验在相同条件下用已知浓度的不同代表性NaPAA批次重复进行。最终的dn/dc系数对应于这些测定的平均值，并确定为0.172mL.g^-1。该dn/dc值用于进一步的分子量测定。

用聚丙烯酸聚合物盐在PBS 1C中的溶液进行Mw、IP和马克-豪温克斜率的测定，所述溶液具有已知浓度的聚丙烯酸聚合物盐，例如0.4mg.mL^-1。由于聚丙烯酸盐占聚丙烯酸聚合物盐干重的95％以上，所以干物质的重量被认为是聚丙烯酸聚合物盐的干重。

NaPAA的特性粘度(IV)与其分子量和构象有关；并用马克-豪温克图表示：

IV＝K·MW^a

其中“a”和“K”是指定溶质-溶剂系统的常数，并且“a”指数在0(实心球体)至2(棒形)之间改变。

马克-豪温克斜率“a”根据该公式IV＝K·MW^a确定。

斜率“a”大于或等于0.7是指NaPAA可以被视为线性的。

将多分散性指数(IP)定义为Mw/M_n，Mn是数均分子量。NaPAA的Mn由OmniSEC软件自动计算。

I.2过硫酸盐和丙烯酸盐单体的测定

A.在原料中

1.化学品和试剂

用Milli-Q-UF系统(Millipore，Milford，MA)纯化水。用来自Fisher Scientific(Illkirch，France)的46-51％浓氢氧化钠制备25mM(A相)和200mM(B相)氢氧化钠溶液。0.1N氢氧化钠来自VWR(Darmstadt，Germany)。用于校准的标准品来自Fisher Scientific(Illkirch，France)的过硫酸钠和来自Sigma Aldrich(Saint Quentin Fallavier，France)的丙烯酸钠。用于校正样品制备偏差的内标是来自Sigma Aldrich(Saint QuentinFallavier，France)的草酸钠。

2.使用电导检测的高效阴离子交换色谱法

通过使用电导检测的高效阴离子交换色谱(HPAEC)同时检测NaPAA样品中的丙烯酸盐和过硫酸盐杂质。使用ICS-3000(Dionex，Thermo Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)离子色谱系统。它配备了SP-1泵，恒温自动进样器(5℃)，恒温柱(40℃)和电导检测器隔室(30℃)。将ATC3RFIC(9x24mm)碳酸盐捕集柱(Thermo FisherScientific)置于色谱柱前，以捕获水碳酸根阴离子并改善整体分析灵敏度。在来自Dionex(Thermo FisherScientific)的阴离子交换AS-11HC柱(250x4mm)上实现分析分离，梯度洗脱为25mM(A相)-200mM(B相)氢氧化钠溶液。梯度程序为：0％B(12min)，0-40％B(5min)，40-100％B(8min)，100％B(25min)，100-0％B(1min)，0％B(9min)。流动相的流速为1mL/min，注射体积为50μL。使用来自Dionex(Thermo Fisher Scientific)的AG-11HC预柱(50x4mm)来保护分析柱。将Dionex电导率抑制器(AERS 082540，Thermo Fisher Scientific)放置在检测器隔室的前面以改善信号。在这些色谱条件下，丙烯酸盐，草酸盐和过硫酸盐的保留时间分别为4、11和45分钟。

3.样品的制备

在色谱分析之前，从样品中除去高分子量物质。简言之，将NaPAA样品用水稀释10倍(导致NaPAA中浓度为10mg/mL)并加入草酸钠内标以达到50μg/mL的浓度。然后将500μl样品以14000g离心30分钟，依次通过得自Merck Millipore(Darmstadt，Germany)的AmiconUltracel 0.5ml-100k和Amicon ultracel 0.5ml-3k离心过滤器。使用前，依次用水和0.1NNaOH洗涤Amicon离心过滤器以除去甘油。

4.校准和结果

过硫酸盐和丙烯酸盐杂质的定量通过用商业标准制备的外部校准进行。将1-100μg/mL丙烯酸钠和过硫酸钠的六种浓度在水中混合，并向每种浓度中加入200μL 500μg/mL草酸钠内标。校准曲线遵循过硫酸盐的线性模型和丙烯酸盐的二次模型。杂质含量以％w/w(丙烯酸盐或过硫酸盐杂质相对于干NaPAA重量的重量％)或每克原料NaPAA的过硫酸盐或丙烯酸盐杂质的μg表示。

B.在纯化后得到的NaPAA聚合物中

如上所述测定纯化步骤(通过渗析、超滤或凝胶过滤)后NaPAA样品中的过硫酸盐和残余丙烯酸杂质，用于在NaPAA原料样品中测定。然而，在纯化的样品中，样品制备程序中省略了10倍稀释步骤。对于过硫酸盐，色谱条件与原料NaPAA相同，并且分析作为极限测试进行管理，检测限为100ng/mL。对于丙烯酸酯，使用相同的HPAEC系统，但是在来自Dionex(Thermo Fisher Scientific)的阴离子交换CarboPacTM SA10柱(250x4mm)上实现分析分离，梯度洗脱为30mM(A相)至200mM(B相)氢氧化钠溶液。梯度程序为：0％B(14分钟)，0-100％B(6分钟)，100％B(15分钟)，100-0％B(1分钟)，0％B(9分钟)。流动相的流速为1mL/min，注射体积为50μL。使用来自Dionex(Thermo Fisher Scientific)的CarboPacTM SA10G柱(50×4mm)来保护分析柱。将Dionex电导率抑制器(AERS 082540，ThermoFisherScientific)放置在检测器室前面以改善信号。在这些色谱条件下，丙烯酸酯的保留时间为约11分钟。从在PBS 1C中使用20-500ng/ml的外部丙烯酸标准物构建的线性校准曲线测定残留的丙烯酸杂质。结果如上表示为％w/w(丙烯酸酯或过硫酸盐杂质相对于干燥NaPAA重量的重量％)或每mL NaPAA佐剂溶液的过硫酸盐或丙烯酸盐杂质的μg。

实施例2-对佐剂活性的测试

1)本发明的PAA与现有技术的2种PAA相比与金黄色葡萄球菌抗原的相关性的佐剂 作用评估

使用来自缀合至铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(rEPA)的重组外毒素A的金黄色葡萄球菌(PS5)的5型多糖作为模型抗原，在远亲杂交的OF1小鼠中测试基于聚合物的制剂的佐剂活性。

按照如下方式制备抗原：

使金黄色葡萄球菌(Reynolds菌株)在SATA-1肉汤培养基中在搅拌(100rpm)下生长72小时，然后通过加入1/1(v/v)苯酚/乙醇溶液灭活至终浓度为2％w/v。将细菌细胞以16000g沉淀75分钟。将细胞糊以0.5g(湿重)悬浮于50mM Tris-2mM MgSO₄，pH 7.6/ml。加入溶葡萄球菌素(100μg/ml)并将悬浮液在37℃下在搅拌下温育4小时。随后，以5U/ml的浓度加入benzonase并继续温育2小时。通过切向流过滤(截留分子量为30000Da)浓缩反应混合物。将得到的浓缩物质用benzonase(5U/ml)在37℃消化6小时，然后用链霉蛋白酶(4U/ml)在适当的缓冲液(Tris 50mM，pH 8.0，含有1mM MgCl₂和1mM CaCl₂)中于37℃消化15小时。在5000g离心30分钟后，通过切向流过滤(30,000Da MWCO)浓缩上清液。然后将该溶液调节至终浓度为50mMTris HCl，pH 7.5。将等分试样上样到用50mM Tris HCl，pH 7.5平衡的QSepharose(20mL)柱上。以2ml/min的流速洗脱柱，收集5ml的级分。用5倍体积的起始缓冲液洗涤柱子。然后用250ml线性梯度的0至0.5M NaCl在50mM Tris HCl，pH 7.5中洗脱多糖。将通过210nm光学吸收和高效阴离子交换色谱(HPAEC-PAD)检测的含有多糖和无磷壁酸的级分渗析，并冷冻干燥。

然后通过己二酸二酰肼(ADH)在NaCl中活化纯化的多糖。将pH调节至4.9并加入乙基二甲基氨基丙基碳二亚胺(EDAC)。随着在环境温度下持续90分钟的活化进行，用0.1NHCl将pH恒定地调节至4.9。通过加入NaOH直至中和(pH 7.0)终止反应。然后将活化的多糖用500mM NaCl水溶液渗析，然后用水渗析。然后将活化和渗析的多糖冻干。官能化百分比估计为约5.9％(w/w)。

将活化的多糖溶液与载体蛋白(rEPA)在NaCl和EDAC中混合。缀合在4℃下进行，通过加入0.1N HCl将pH维持在5.7。90分钟后，通过加入0.2N NaOH直至pH 7终止反应。然后将缀合的抗原对NaCl水溶液渗析，然后通过在200mM平衡的琼脂糖凝胶Cl-4B柱上进行尺寸排阻色谱法纯化。在pH 7.2的10mM磷酸盐缓冲液中的NaCl。合并含有缀合物的级分(通过在206nm和278nm处的光学吸收检测)并且主要用柱的死体积洗脱。

按照如下方式制备聚合物制剂：

名为PAA225000(Ref.18613，钠盐)的产品以浓缩溶液的形式从PolysciencesEurope(Eppelheim，Germany)获得。将其用水稀释至浓度为20mg/ml，并在室温下搅拌12小时。用HCl将pH值调节至7.55，并通过使用2kDa截留值渗析盒(Thermo FischerScientific，Courtaboeuf，France)将溶液在室温下对150mM NaCl水溶液(3次连续浴)渗析。然后将溶液通过0.22μmPVDF膜过滤，用于灭菌。然后测量聚合物盐的分子量，结果为488550Da。其Mn为129 070Da，IP为3.8。

然后将聚合物在+4℃下储存，作为在150mM NaCl水溶液中包含20mg/ml聚合物的溶液。然后将该溶液与PBS 1C混合，用无菌水浓缩10次，以得到含有2mg/ml聚合物盐的盐水溶液。

名为PAA20的产品以Polymer Expert(Pessac，France)以干粉形式作为钠盐获得。将其在水中再水合至20mg/ml的浓度，并在室温下搅拌12小时。然后将溶液通过0.22μmPVDF膜过滤，用于灭菌。在100 700Da下测量聚合物盐的分子量。其Mn为46 700Da，IP为2.2。然后将聚合物在+4℃下储存，作为在150mM NaCl水溶液中包含20mg/ml聚合物盐的溶液。然后将该溶液与PBS 10C和无菌水混合，以得到含有2mg/ml聚合物盐的盐水溶液。

974P(称作

)，其为网状PAA聚合物，具有几百万Da的分子量，将其用PBS稀释，得到包含2mg/ml聚合物的溶液。

通过vol/vol混合抗原溶液和聚合物溶液制备待注射给动物的佐剂制剂。每个注射剂量在PBS 1C溶液中具有200μg聚合物和2.5μg多糖。

免疫接种：

用PAA20、PAA225000或

单独(这些用作阴性对照)或用包含抗原和佐剂的制剂免疫接种7至9周龄的5至10只OF1小鼠的组。一组小鼠单独注射PS5-rEPA。在D0，D21和D35的肩胛区域通过皮下(SC)途径给予剂量。在D42上收集血样用于免疫应答分析。

将血液样品收集在含有凝固活化剂和血清分离凝胶(Becton Dickinson，Meylan，France)的真空管中。将管以2600g离心20分钟以从细胞中分离血清。将血清转移到深孔板中并在56℃下热灭活30分钟，然后在-20℃下储存，直到它们用于随后的测定。

该测试包括以下不同的组：

PBS

PAA20

PAA225000

PS5-rEPA

PS5-rEPA+PAA20

PS5-rEPA+PAA225000

血样用于测试由免疫接种的小鼠产生的特异性IgG1和IgG2a抗体。

ELISA测试使用活化的多糖PS5(与ADH缀合的PS5：PS5-AH)作为包被的抗原。简言之，ELISA板用每孔100μL的1μg/mL PBS1C中的活化多糖溶液包被。将平板在4℃温育12小时，并通过平板倒置倒空。通过加入150μL饱和缓冲液1(PBS 1C/吐温0.05％w/v/牛白蛋白1％w/v)封闭孔并在37℃温育1小时。通过倒置清空ELISA板。使用缓冲液1作为稀释缓冲液，在ELISA板中直接进行每种血清的两倍连续稀释(12次)，每孔最终体积为100μL。将板在37℃温育90分钟，然后用缓冲液2(PBS 1C/吐温0.05％w/v)洗涤3次(每孔250μL)。将抗小鼠IgG1或抗小鼠IgG2a过氧化物酶缀合物在缓冲液1(1/8000)中稀释，并用作第二抗体(每孔100μL)。在37℃温育90分钟后，用缓冲液2(每孔250μL)洗涤ELISA板3次。通过向每个孔中加入100μL四甲基联苯胺底物溶液来显色反应，并在室温下用100μL/孔的1NHCl在30分钟后停止反应。在450-650nm处测量吸光度。使用SoftmaxPro软件，以对应于OD450nm＝1的倒数血清稀释度的任意单位表达抗体滴度。

将得到的结果概括在图1中并且显示：

1)在用来自PBS 1C或单独注射基于聚合物的制剂免疫接种的小鼠的阴性对照血清(<1.3Log)中未测量背景(数据未显示)。

2)仅用PS5-rEPA缀合物进行第三次免疫接种后，获得抗PS5多糖的特异性免疫应答，主要是抗PS5IgG1(4.8Log)。单独注射的PS5-rEPA缀合物引发的抗PS5抗体应答主要是Th2驱动的，IgG1/IgG2a比率接近126。

3)当PS5-rEPA缀合物与

PAA20或PAA225000一起配制时，抗PS5IgG1滴度没有增加，抗-PS5滴度的平均值接近4.8Log。

或PAA20的共注射引起抗PS5IgG2a滴度的增加，但这些抗PS5抗体反应仍然主要是Th2驱动的，IgG1/IgG2a比率分别接近50和63。当PS5-rEPA缀合物与PAA225000共注射时，观察到抗PS5IgG2a滴度(4.5Log)的强烈增加。共注射PAA225000引发Th1偏向抗PS5抗体应答，IgG1/IgG2a比率接近2。

总之，该试验证明，虽然单独的抗原主要诱导Th2应答，但是与其它测试的聚合物相比，本发明的佐剂能够在不影响Th-2应答的情况下诱导更明显的Th-1免疫应答。

还测试了血样在人外周单核细胞(hPMN)中诱导调理活性的能力。对于该测试，使用Lowenstein菌株(ATCC 49521)在37℃下在单独的TSB培养基中培养20小时或补充(固定相)，以连续10倍稀释度测试来自每组的合并血清。

将来自健康人志愿者的人外周血收集在肝素钠真空采血管中。每个捐赠者需要10毫升。通过在氯化铵裂解缓冲液中裂解红细胞来分离白细胞。将细胞在PBS 1C中洗涤两次，最后悬浮于5mL OPA培养基(补充有0.5％BSA和2mM谷氨酰胺的RPMI-Hepes)中。然后在Multisizer Coulter计数器上计数大的白细胞(主要是hPMN(95％))，并在OPA培养基中调节至0.25x 10⁶/mL的浓度。

生长20h后，用PBS 1C将细菌洗涤2次并且重新混悬于5mLPBS 1C。在OPA培养基中将细菌浓度调整至10⁸CFUs/mL。

在96孔聚丙烯Deepwell板中进行氧化爆发测定。在连续加入试剂后将板保持在冰上。按以下顺序将试剂加入孔中：50μL热灭活的特异性血清，测定稀释度为1/10至1/640,250μL细菌，50μL幼兔补体，1/10,100μL白细胞和50μLDHR(分子探针，D632)以1mg/mL计。最终反应体积为500μL。然后将板在+37℃温和摇动下在黑暗中温育25分钟。最终细菌/大白细胞比率为100:1，血清和补体的最终稀释度为1/100至1/6400，DHR的最终浓度为0.1mg/mL。在温育期结束时，将板置于冰上以停止反应。在Cytomics FC500上进行分析。DHR的氧化形式罗丹明123在488nm激发后发出明亮的荧光。在(FSC/SSC)点图上，在大颗粒白细胞群上定义门以区分PMN群。在该门上从每个孔中获得了三千个事件。结果表示为整个PMN群体中荧光激活的PMN(罗丹明123阳性PMN)的百分比。

结果展示在下文的表1中：

表1

¹％活化PMN/整个PMN群体：+++(在1/1000血清吸湿度下80％-100％)

++(在1/100血清吸湿度下80％-100％)；+(在1/100血清吸湿度下30％-70％)

表1中的这些结果表明：

1)用来自PBS免疫接种的小鼠或单独注射基于聚合物的制剂的阴性对照血清未检测到活化的PMN(数据未显示)。

2)PS5-rEPA缀合物引发抗PS5血清抗体，其能够在细菌存在下弱活化hPMN。对于1/100血清稀释度，产生氧化爆发的活化hPMN的百分比估计为30％至70％。

3)PS5-rEPA与卡波姆或PAA20的共注射适度增加了抗PS5血清抗体识别金黄色葡萄球菌Lowenstein菌株表面的能力。对于1/100血清稀释度，产生氧化爆发的活化hPMN的百分比估计为80％至100％。

4)PS5-rEPA与PAA225000的共注射明显改善(增加10倍)抗PS5血清抗体识别金黄色葡萄球菌Lowenstein菌株表面的能力。对于1/1000血清稀释度，产生氧化爆发的活化hPMN的百分比估计为80％至100％。

还用PAA225000和PAA20获得的血清或用仅用抗原免疫接种的小鼠获得的血清测试了它们在人PMN存在下杀死金黄色葡萄球菌Lowenstein细菌的能力。

对于该测试，通过EFS(Etablissement 

du Sang)从健康人供体的柠檬酸钠袋中收集全血，并根据以下程序分离新鲜的人多形核白细胞(PMN)。通过在+20℃下温育5mL血液和45mL裂解缓冲液10分钟来裂解红细胞。将PMN在HEPES盐水缓冲液(HBSS，无CaMg，ref pH7.4)中洗涤两次。如锥虫蓝排除所示，PMN的存活率超过90％。将PMN悬浮液稀释至10⁷个细胞/mL。

将Lowenstein金黄色葡萄球菌菌株在TSB培养基中培养12小时。沉淀细菌细胞，用OPA培养基(RPMI+5％SVF+0.05％Tween 20)洗涤，并在生理盐水中悬浮至5x10⁷个细胞/mL。将下列物质加入每个试管中：0.25mL PMN，50μL稀释的试验血清，50μL同源金黄色葡萄球菌细胞(比例1细胞/1细菌)，50μL0.5％w/v兔补体和OPA培养基至完成体积为500μL/孔。在PMN，测试血清或补体单独存在下用金黄色葡萄球菌的对照管包括在测定中。将测定管在+37℃下振荡温育1小时。稀释液以3步(3*1/15稀释度)进行，50μL不同稀释液在TSA凝胶中滴加6次，并在12小时内温育。如果可能，在每个稀释点定义细菌存活百分比，使用下式：(活细菌/原始接种物的数量)×100。

2次独立分析中得到的数据展示在下表2中(ONS＝非特异性调理吞噬)：

表2

展示在表2中的这些结果表明：

1)来自用PBS免疫接种的小鼠或单独注射基于聚合物的制剂的阴性对照血清未检测到细菌杀伤(数据未显示)。

2)PS5-rEPA缀合物引发抗-PS5血清抗体，其在hPMN存在下显示弱杀伤活性，在1/100血清稀释度下细菌杀灭百分比为39％。当血清汇集物稀释至1/500时，没有更多地测定到细菌杀伤活性。

3)PS5-rEPA与PAA20的共注射不能提高抗PS5血清抗体杀死金黄色葡萄球菌Lowenstein菌株的能力。

4)在测试1中观察到PAA225000对细菌杀灭的佐剂效应，在1/100血清稀释度下，无佐剂化PS5-rEPA的细菌杀灭率为50％对39％，对于1/500血清稀释度的无佐剂的PS5-rEPA，细菌杀灭率为23％对9％。

与葡萄球菌抗原相关的本测试的一般结论是，与具有较低分子量的佐剂相比，本发明的佐剂显示出优异的功效。

2)不同聚合物对hCMV-gB诱导的免疫应答的佐剂作用测试

本研究的目的是评估聚丙烯酸(PAA)聚合物的分子量对佐剂效应的影响。该装置通过使用衍生自人巨细胞病毒的gB糖蛋白的重组蛋白(hCMV-gB)作为模型抗原来完成。

该重组蛋白质用称为0708985pEE14.4的质粒转染的重组CHO系产生，该质粒含有修饰的gB基因。为了便于通过CHO系产生这种重组蛋白，通过缺失编码对应于缬氨酸677和精氨酸752之间的氨基酸序列的gB蛋白的跨膜区的基因部分并在切割位点导入3个点突变，预先改变了美国专利号5,834,307中所述序列的gB基因。由CHO系产生的蛋白质，称为gBdTM对应于缺失切割位点和跨膜区的截短的gB蛋白质。

随后通过色谱法纯化培养基中产生的gBdTM蛋白，并以含有>0.2mg/ml gBdTM的磷酸盐缓冲液的储备液的形式储存。

具有不同分子量的PAA如下：

如段落“1)本发明的PAA与现有技术的2种PAA相比与金黄色葡萄球菌抗原的相关性的佐剂作用评估”中所述和制备的PAA20和PAA225000。

PAA3000(参比06568)，PAA6000(参比06567)，PAA50000(参比00627)和PAA60000(参比18611)是NaPAA，并且由Polysciences以干粉(PAA6000)或其它浓缩溶液的形式提供。

将PAA20与水混合至20mg/ml的浓度，并在室温下搅拌12小时。然后将溶液通过0.22μmPVDF膜过滤并保持在+4℃下储存，作为在150mM NaCl水溶液中包含20mg/ml聚合物的溶液。然后将该溶液与PBS 10C和无菌水混合，以得到包含2mg/ml聚合物的盐水溶液。

来自Polysciences的PAA用无菌水稀释至浓度为20mg/ml，通过使用2kDa截留值渗析盒(Thermo Fischer Scientific，Courtaboeuf，France)用NaOH或HCl调节至pH约7.4(除了未调节pH的PAA60000)并对150mM NaCl渗析(连续3次浴)。然后将溶液通过0.22μmPVDF膜过滤，用于灭菌。测定Mw，Mn和IP，并将聚合物在+4℃下储存，作为在150mM NaCl水溶液中包含20mg/ml聚合物盐的溶液。

聚合物的分子量(Mw和Mn)和PI如下表3中所示：

表3

	以Da计的Mw	以Da计的Mn	多分散性指数
				PAA3000	未测定	未测定	未测定
PAA6000	9 050	2 940	3.1
				PAA50000	133 460	56 360	2.4
PAA60000	133 760	44 500	3.0
				PAA20	100 700	46 700	2.2
PAA225000	488 550	129 070	3.8

通过微流化制备含有与Novartis的

角鲨烯乳剂相同成分的角鲨烯乳剂，以比较不同聚合物的佐剂活性与用作参比的现有技术佐剂的佐剂活性。

通过将抗原溶液与佐剂溶液进行vol/vol混合来制备佐剂化制剂。

佐剂量为每次注射剂量200μg聚合物，或者在乳剂的情况下，最终疫苗试剂量包含2.5％v/v角鲨烯。

测试的不同制剂如下(gB对应于hCMV-gB：每种制剂中2μg)。

-单独的gB

-gB+角鲨烯乳剂

-gB+PAA3000

-gB+PAA6000

-gB+PAA50000

-gB+PAA60000

-gB+PAA20(PBS)

-gB+PAA225000

在第0天和第28天，将C57BL/6小鼠(每组8-10只)免疫接种两次，其中重组hCMV-gB抗原(2μg/注射)通过IM途径结合或不与佐剂结合(最终体积50μl下的左股四头肌)。该试验包括仅用hCMV-gB抗原免疫的组作为对照。

在D28(中间出血)下从颌下静脉麻醉下采集血样，并在D41从所有动物中通过颈动脉切开放血。通过腹膜内途径(IP)以150μL的体积施用Imalgène(1.6mg氯胺酮)和甲苯噻嗪(0.32mg赛拉嗪)进行麻醉。

对于D28的体液应答测定，在含有凝块活化剂和血清分离器(Becton DickinsonMicrotainer SST，参比365951)的小瓶中收集200μL血液。在+4℃下过夜后，将血液以10000rpm离心5分钟，收集血清并储存在-20℃直至分析。在D41，在含有凝块活化剂和血清分离器(BD Vacutainer SST参比367783)的小瓶中收集1mL血液。在+4℃下12小时后，将血液以3000rpm离心20分钟，收集血清并储存在-20℃直至分析。

对于D41的细胞应答测定，在无菌条件下从每组5只小鼠收集脾脏。如下分离脾细胞：用Gentlemax解离器(Miltenyi Biotec)解离新鲜收集的脾脏，使细胞悬浮液通过细胞滤网并用RPMI培养基洗涤。使用红细胞裂解液(Red Blood Cell Lysing Buffer)(Sigma)裂解红细胞。洗涤后，计数脾细胞并立即用于细胞试验。

血清中和测定：

该技术用于滴定hCMV-gB免疫动物血清中存在的功能性中和抗体。基于巨细胞病毒感染MRC5成纤维细胞和ARPE-19细胞(人上皮细胞)的能力，含有抗HCMV-gB的特异性功能性抗体的血清可以抑制细胞的病毒感染。

a.SN50对MRC5

简言之，将1x10⁴MRC-5成纤维细胞在DMEM 1％FBS中的96孔平底板中在5％CO₂细胞培养箱中于37℃培养1天。将来自免疫接种动物的热灭活血清用1％FBS(胎牛血清)在补充有10％幼小家兔补体的DMEM(Dulbecco改进Eagle培养基)中连续稀释，并以3.3logCCID50(细胞培养物感染剂量50％)/ml hCMV Towne菌株在细胞培养箱中温育vol/vol 1小时。然后将血清/病毒混合物转移到MRC-5细胞单层上。温育7天后，除去培养上清液，用PBS 1C洗涤细胞4次，然后在-20℃下用100μl 85％丙酮水溶液固定15分钟。将板用PBS 1C洗涤三次并空气干燥。用比色反应检测感染的细胞。将两种特异性hCMV生物素化抗体(抗IE1CH160和抗gB CH177HCMV蛋白)的混合物以0.5μg/ml加入孔中，室温下1小时。将板在PBS 1C/0.05％吐温20(PBST)中洗涤，然后在室温(22℃)下加入磷酸酶碱性链霉抗生物素蛋白1小时。将板在PBST中洗涤并在室温下在黑暗中用100μl色原NBT/BCIP染色30分钟。洗涤后，将板空气干燥并使用比色ELISPOT读板仪(Microvision Instruments，Evry，France)扫描。在每个孔中观察到代表细胞病变效应的深染核。如果在相应的孔中没有观察到暗焦点，则认为血清稀释度是中和的。每种稀释度的血清重复测试4次。对于每种稀释度，通过最后的平方回归计算50％中和(SN50)。SN50值(以log10表示)定义为最高血清稀释度的倒数，其将感染孔的数量减少50％。计算每组小鼠的平均中和抗体滴度。

b.μPRNT50对ARPE-19

简言之，ARPE-19在微量中和(MN)测定前一天，将2,5x10⁴个ARPE-19细胞分配到96孔暗板中。在D0，将血清在56℃下热灭活30分钟。将血清样品在DMEM/F12 1％FBS中连续两倍稀释，在96深孔板中从1/10至1/10240开始，并与4.2log FFU/ml的BADrUL131-Y4HCMV病毒株一起在37℃，5％CO₂细胞培养箱中进行60分钟温育。然后将血清/病毒混合物转移到ARPE-19细胞上，并在37℃，5％CO₂细胞培养箱中温育4天。

在D4，除去培养上清液后，将细胞用100μl含1％甲醛的PBS1C在室温下固定1小时。然后将板用PBS 1C洗涤三次并在室温下风干，然后在Microvision荧光板读数器上分析以计数每个孔中的感染的细胞。

作为对照，在每个平板上存在两个细胞对照孔(无病毒)和六个孔，其中细胞用含有4,2log FFU/mL的一半病毒稀释液感染。这六个孔的平均值定义了血清中和的阈值，确定为特定信号值的50％。

中和终点滴度定义为最后稀释度的倒数低于计算的50％特定信号值。中和效价(μPRNT50)被定义为每个单独的血清，作为诱导感染的细胞减少50％的最后稀释，即最终稀释诱导较少的细胞感染而不是计算的50％特异性信号值。计算每组的几何平均中和抗体滴度。

对免疫接种小鼠的每个组得到的GMT(中和抗体滴度几何平均值)结果展示在图2和3中：

无论所分析的组如何，对MRC5成纤维细胞和ARPE上皮细胞的血清中和试验均观察到相似的特性。在用无佐剂的hCMV-gB(GMT＝6)免疫接种的小鼠中未检测到或检测到低中和抗体滴度。

迄今为止，本发明的聚丙烯酸聚合物得到了最佳应答。

IgG1和IgG2c抗体应答

根据以下方法通过机器人ELISA测定滴定抗hCMV-gB抗原的血清IgG1和IgG2c抗体。

将Dynex 96孔微量培养板在4℃下用1μg/孔的hCMV-gB在0.05M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)(Sigma)中包被12小时。然后将板在37℃下用150μL/孔的PBS吐温-乳(PBSpH7.1，0.05％Tween20，1％(w/v)粉末脱脂乳(DIFCO))封闭1小时。所有接下来的温育均在100μL的最终体积中进行，然后用PBS pH 7.1，0.05％吐温20进行3次洗涤。在PBS-吐温-乳中进行血清样品的连续两倍稀释(从1/100开始)将1/1000)加入孔中。将板在37℃下温育90分钟。洗涤后，将以1/2000稀释于PBS-吐温-乳中的抗小鼠IgG1或IgG2c过氧化物酶缀合物(Southern Biotech)加入孔中，并将板在37℃下温育90分钟。将板进一步洗涤并在黑暗中在20℃下与100μL/孔的即用型四甲基联苯胺(TMB)底物溶液(TEBU)一起温育30分钟。用100μL/孔的HCl 1M(Prolabo)终止反应。用平板读数器(Spectra Max-MolecularDevices)在450nm-650nm下测量光密度(OD)。使用CodUnit软件计算IgG抗体滴度，滴定曲线的OD值范围为0.2至3.0(放在每个平板上的参比小鼠超免疫血清)。以任意ELISA单位(EU)表示的该参照的IgG滴度对应于给出OD为1.0的倒数稀释的log10。抗体检测的阈值是10个ELISA单位(1.0log10)。所有最终滴度均以log10(Log)表示。

结果如图4和5中所示：

这些结果表明，对于IgG1和IgG2c滴度，与无佐剂化抗原相比，佐剂化的hCMV-gB抗原诱导增强的免疫应答，除外具有最低分子量的PAA3000和PAA6000。

值得注意的是，本发明的PAA在增加T辅助细胞1型(Th1)的免疫应答方面特别有效，因为在用hCMV-gB与本发明的PAA组合免疫接种的小鼠中IgG2c滴度特别强。

细胞因子测定：

在第41天处死后立即分离来自免疫小鼠的脾细胞，以每孔2.5x10⁵个细胞接种于96孔板中，并与hCMV-gB(5μg/孔)，伴刀豆球蛋白A(0.25μg/孔；阳性对照)或培养基一起温育。单独使用(RPMI-GSPβ-10％FCS；背景)。温育6天后，使用CBA Flex set Kit测量IL5和IFNγ细胞因子的分泌。结果表示为细胞因子浓度，单位为pg/ml(每组几何平均值)。IL-5的阳性细胞因子检测阈值为5pg/ml，IFNγ的阈值为2.5pg/ml。

结果展示在图6和7中：

这些结果表明，使用乳剂佐剂，IL5的水平高，而IFNγ的水平低。有意义的是，本发明的聚丙烯酸佐剂诱导低水平的IL5，但高水平的IFNγ，这是偏向Th1型的免疫应答的指示。该结果与免疫球蛋白亚型分型结果一致。

3)本发明渗滤的PAA与其渗滤前的原料的比较

在本测试中，证实渗滤不影响聚合物的佐剂特性。

测试如段落“2)不同聚合物对hCMV-gB诱导的免疫应答的佐剂作用测试”中所述得到的包含0.08mg/mL的hCMV-gB抗原的不同制剂。

从Polysciences提供的聚丙烯酸聚合物的钠盐，施加两种不同方法(未渗滤制备和渗滤制备)。

对于未渗滤制剂，用PBS简单稀释得自Polysciences的产品，并且通过0.2μm截留值的膜无菌过滤。PAA盐的浓度为17.4mg/mL。测定Mw、IP和马克-豪温克斜率。

对于渗滤制剂，根据如下方案处理得自Polysciences的产品：

a)在15分钟期间搅拌下混合由Polysciences提供的水溶液与PBS1C pH 7.4，以得到包含14mg/ml聚合物的PBS溶液，

b)对5个体积的PBS渗滤步骤a)中得到的溶液，其中膜具有50kDa的截留值，

c)用0.2μm灭菌过滤器过滤步骤b)中得到的产物。

得到的溶液包含15.9mg/mL PAA盐，其中pH为7.3。测定Mw、IP和马克-豪温克斜率。

得到的渗滤前后得到的Mw、IP和马克-豪温克斜率如表4中所示

表4

NaPAA	Mw(Da)	IP	马克-豪温克斜率
				渗滤	522,030	1.6	0.9
未渗滤	433,417	2.6	0.9

在渗滤之前和之后的分子量Mw和聚合物的IP与以下事实一致：单体和小的低聚体，特别是那些小于2000道尔顿的那些已经通过渗滤步骤消除。

同样重要的是要注意Polysciences公布的由GPC(凝胶渗透色谱法)测定的Mw为887,000Da，这与渗滤前测量的Mw相差很远。

从这两种不同的制剂中，通过将聚合物制剂之一与gB溶液以适当的比例混合来制备免疫制剂，以获得50μl的剂量，每种剂量含有2μg的gB，和：

-来自渗滤制剂的25、50、100或200μg聚合物盐，

-或来自未渗滤制剂的25、50、100或200μg的聚合物盐。

在第0天和第21天，通过肌肉内途径，用制备的制剂之一给7周龄的C57BL/6J小鼠免疫接种两次。在5只小鼠的组中测试每种制剂。作为对照，一组5只小鼠接受单独的抗原。

在最后一次免疫接种后2周(第35天)，以与段落“2)不同聚合物对hCMV-gB诱导的免疫应答的佐剂作用测试”中所述相同的方式监测免疫小鼠的细胞(IFNγ和IL5)和体液应答(IgG抗体亚类，血清中和抗体)。

结果显示，如在前面的试验中，本发明的佐剂诱导强烈的Th-1免疫应答，同时诱导强烈的病毒中和抗体滴度，并且用渗滤的制剂免疫接种的小鼠与用未渗滤制剂免疫接种的小鼠之间没有显著性差异。

4)渗滤的PAA与PAA原料的比较的稳定性研究

为了检查本发明的PAA佐剂的稳定性，进行了一项研究，该研究分析了加速老化试验中聚合物盐的分子量的变化。

对于该测试，使用未渗滤的制剂和渗滤制剂。纯化通过使用截留值为50kDa的膜的渗滤进行，得到的渗滤制剂含有8mg/mL的PBS1C中分子量为443553Da的PAA聚合物盐。

其在过硫酸钠中的含量小于0.0007％(w/w)干聚合物；将丙烯酸钠含量测定为0.0011％的干聚合物。

将该制剂装入玻璃小瓶中并维持在+5℃、+25℃或+37℃。

分析在5℃下进行24个月，在25℃下进行9个月，在37℃下进行3个月。在该稳定性研究期间获得的结果显示在下面的表5中：

表5

这些结果表明，在5℃下储存24个月后，在25℃储存9个月后和37℃储存3个月后Mw没有显著降低，且聚合物的多分散性指数保持不变。

这与使用对应于含有10％w/w的未渗析的相差无几的PAA盐的水溶液的组合物所获得的结果形成对比，所述PAA盐含有相对于干燥的重量组成浓度为0.42％w/w的过硫酸钠。将聚合物盐的初始Mw测定为470,269Da，而由GPC测定的供应商公布的Mw为351,100Da。

在该非渗析聚合物溶液的稳定性研究期间获得的结果显示在下表6中，并且显示分子量随时间降低，特别是在25℃和37℃储存后。

表6

5)显示过硫酸盐含量的有害作用的测试

将聚丙烯酸聚合物的钠盐(Polysciences提供)在高压灭菌器中在121℃的温度下灭菌15分钟。溶液中PAA盐的浓度为101.8mg/g。下面的表7显示了高压灭菌之前和之后PAA盐的Mw，IV(特性粘度)和马克-豪温克斜率。

表7

NaPAA	Mw(Da)	IV(dl/g)	马克-豪温克斜率
				高压灭菌前	404784	3.5	0.9
高压灭菌后	188782	1.9	0.9

显然高压灭菌器中的处理导致Mw和IV的急剧下降。随后的研究用于研究可能导致聚合物在加热下降解的参数。该研究表明，聚合物盐的纯化，特别是通过渗滤，能够在通过高压灭菌进行灭菌时稳定聚合物。

将NaPAA聚合物和过硫酸盐的混合物暴露于热，以再现高压灭菌的条件：在120℃温育15分钟之前和之后，对组合物的NaPAAMw和过硫酸盐含量进行表征。表8详述了NaPAAMw和过硫酸盐含量方面的组成特征。

表8

这些结果表明，在热处理后，过硫酸盐的存在导致Mw降低。相反，过硫酸盐含量非常弱的PAA具有非常稳定的Mw。

总之，PAA溶液的热稳定性可能与其过硫酸盐含量直接相关。在本发明的方法中引入的渗滤步骤，从PAA溶液中除去过硫酸盐杂质，并提供与通过高压灭菌来灭菌相容的热稳定的PAA溶液。

实施例3-PAA支持强应答并且降低抗原有效载荷

对家畜病原体的更广泛保护的需求需要向现有疫苗制剂中添加抗原(例如

产品，其通常包含灭活的毒素和/或菌苗加上氢氧化铝佐剂)或单独的单抗原疫苗的制剂。由于提供组合疫苗在商业上是更理想的，申请人推断他们可以添加新抗原，同时仍保持现有剂量体积，条件是它们可以鉴定具有良好安全性的更有效的佐剂。

重要的是，由于疫苗和免疫学领域的技术人员熟知，人们不能提前预测分子种类是否起安全有效的免疫原性佐剂的作用。此外，即使在已经建立新分子的佐剂性质之后，由于这些技术的不可预测的性质，技术人员不能合理地期望将新佐剂应用于不同情况的成功。影响是否新配方作为安全和保护性疫苗起作用的变量包括但不限于：1)佐剂类型/存在；2)抗原类型/性质(肽，核酸，杀死病毒，死菌苗等)；3)施用途径；4)靶病原体类型/菌株；和5)接种疫苗的目标物种。因此，必须在这些变量的至少几种组合中证明新疫苗佐剂的安全性和有效性，然后才能得出关于其一般适用性的任何有意义的结论。

对于本发明的情况，其中抗原类型主要包含灭活细菌，申请人推断最终新的，更有效和剂量保留的佐剂必须是脂肪酶抗性的。不幸的是，使制剂具有脂肪酶抗性的化合物通常会导致不希望的施用部位反应。因此，需要在疫苗安全性，功效和稳定性之间取得良好的平衡。

制备实验

疫苗(Merial Brazil-产气荚膜梭菌B/C，产气荚膜梭菌D，败毒梭菌，诺氏梭菌，破伤风梭菌)，并且对小鼠、豚鼠、猪和家兔测试。作为实例，豚鼠研究设计和结果分别如表9和10中所示。

表9.使用PAA225000聚丙烯酸佐剂的剂量降低方案

	(％标准疫苗)	抗原预吸附在氢氧化铝上	剂量PAA(mg/剂量)
				基础疫苗	1	是	0
A	0.2	是	1
				B	0.2	是	2
C	0.2	是	3
				D	0.2	是	4
E	0.2	否	4

豚鼠，小鼠和家兔的安全性良好，并且如表10所示，功效良好，特别是对于缺乏氢氧化铝的制剂(参见例如Novyi，Septicum和Sordellii柱；比较E与D)。这些结果非常令人惊讶，因为可以合理地预期氢氧化铝和新聚合物助剂(E组)的组合将优于新的仅聚合物制剂(D组)。

实施例4-当使用传统灭活或重组疫苗配制时PAA支持保护性反应

灭活狂犬病研究.根据表11制备疫苗，结果如图8所示。所有测试的佐剂显然对于在狗中使用是安全的，并且所有佐剂在第7天诱导血清转化，在接种疫苗后保持阳性滴度长达70天。PAA 225000是改善灭活狂犬病短期免疫原性的最有效佐剂。

表11.灭活狂犬病疫苗制剂(Merial的

+不同佐剂)

*AF03是使用相转化生产的基于角鲨烯乳剂的可替代选择佐剂(参见J.Pharm.Sciences，第101卷，12期，2012，并且通过引用整体并入本文)。

**使用高压匀化制备角鲨烯乳剂，形成水包油型乳剂。

金丝雀痘为载体的流感研究.制备金丝雀痘为载体的流感疫苗制剂，并在5组中进行测试，每组包含7只狗(表12)，结果显示在图10中。在D14，D27和D41的所有组中检测到高水平的产生IFNγ的细胞。与上述经典灭活疫苗制剂观察到的趋势类似，金丝雀痘载体流感抗原显然被更高MW PAA(即PAA225000)更好地佐剂化。vCP2242由US7,425,336)(Merial)完整描述和实现，并且其全部内容通过引用并入本文。但简言之，vCP2242是含有来自H3N8马流感病毒(EIV)的密码子优化的HA基因的重组ALVAC，其中HA基因插入ALVAC C5基因座。申请人断言，本文公开的结果支持一般结论，即重组金丝雀痘载体与本公开的非交联PAA相容并且被其良好地佐剂化(参见例如图9)。

表12.金丝雀痘为载体的犬科动物流感疫苗制剂

实施例5-非交联PAA是用于马科动物疫苗的有效佐剂

金丝雀痘为载体的马科动物流感+破伤风毒素研究.根据表13给马科动物施用制剂。如下所示，并且在图11-13中，PAA强力辅助两种无关抗原以引发马科动物中的保护性免疫应答。

表13.金丝雀痘为载体的马科动物流感+破伤风制剂

ADVAX^TM佐剂来源于胰岛素(疫苗.2012年8月3日；30(36):5373-81；另外参见US2014/0314739，Vaxine Pty Ltd.)。ADVAX1是在碳酸氢盐缓冲液中20mg/ml的δ胰岛素微粒的无防腐剂的无菌混悬液，而ADVAX2还包括10μg CpG二核苷酸/1mgδ胰岛素。

结果.截止到D14，所有PAA225000动物的保护效价≥0.05IU/ml。在D14，来自卡波姆佐剂化疫苗组的8只动物中的6只仍然<0.05IU/ml。因此，与卡波姆佐剂化的免疫制剂相比，PAA225000佐剂化的疫苗制剂产生明显更好的血清转化。截止到D49(在第二次疫苗接种后)，PAA225000组中的滴度在所有动物中显著且有效地高。

实施例6-PAA是猪科动物疫苗的有效佐剂

“SpaA”抗原猪科动物研究.预期“SpaA”是指猪红斑丹毒丝菌的“表面保护性抗原，其为感染猪科动物和其它动物包括犬科动物的病原体。猪红斑丹毒丝菌是革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、棒形无孢子形成、非抗酸性、非运动性细菌。在猪科动物中，猪红斑丹毒丝菌导致“轻型猪丹毒”。“TS6”是指水包油型乳剂，例如描述在US7,371,395中(Merial)。TS6通过下列步骤配制：添加约一(1)份包含抗原的水性成分至约两(2)份的油性成分中，且然后乳化两种成分，形成最终乳剂。

表14.组合治疗定义

组	数量	治疗
			G1	7	<![CDATA[SpaA抗原(150<sup>1</sup>μg/剂量)+TS6]]>
G2	7	SpaA抗原(100μg/剂量)+PAA60000
			G3	7	SpaA抗原(100μg/剂量)+PAA225000
G4	7	<![CDATA[SpaA-FlaB-His抗原(196<sup>2</sup>μg/剂量)+PBS]]>
			G5	7	<![CDATA[SpaA-FlaB-His抗原(196<sup>2</sup>μg/剂量)+PAA225000<!-- 38 -->]]>
G6	7	PBS

¹2/3治疗体积(tt)中的150μg SpaA是指按1/1体积tt计100μg SpaA。

¹ 196μg SpaA融合蛋白对应于100μg孤独SpaA蛋白。

因此，递送至每个组的SpaA的有效量是100μg。

虽然G1产生了最佳结果，但是值得注意的是，非抗原成分占据了水包油型乳剂的大部分剂量体积(如上所述，油性成分与水性抗原成分的比例为2:1)。

现在将本发明概括在如下编号的段落中：

1.直链或支链聚丙烯酸聚合物的药学上可接受的盐，其用作疫苗组合物中的佐剂，其特征在于所述聚丙烯酸聚合物盐具有在350-650kDa范围内的重均分子量Mw。

2.根据段落1的用于其用途的直链或支链聚丙烯酸聚合物的药学上可接受的盐，其特征在于所述聚丙烯酸聚合物盐完全由对应于丙烯酸盐的单元组成或完全由对应于丙烯酸的游离酸形式的单元和对应于丙烯酸盐的单元组成。

3.根据段落1或2的用于其用途的直链或支链聚丙烯酸聚合物的药学上可接受的盐，其特征在于它包含小于0.005％w/w的氧化剂，以所述聚丙烯酸聚合物盐的总干重为基准。

4.根据上述段落中任一个的用于其用途的直链或支链聚丙烯酸聚合物的药学上可接受的盐，其特征在于它包含小于0.001％w/w的氧化剂，以所述聚丙烯酸聚合物盐的总干重为基准。

5.根据段落1-3中任一个的用于其用途的直链或支链聚丙烯酸聚合物的药学上可接受的盐，其特征在于它包含小于0.005％w/w的过硫酸盐，以所述聚丙烯酸聚合物盐的总干重为基准。

6.根据上述段落中任一个的用于其用途的直链或支链聚丙烯酸聚合物的药学上可接受的盐，其特征在于它包含小于0.001％w/w的过硫酸盐，以所述聚丙烯酸聚合物盐的总干重为基准。

7.根据上述段落中任一个的用于其用途的直链或支链聚丙烯酸聚合物的药学上可接受的盐，其特征在于所述聚丙烯酸聚合物是与Na⁺的盐。

8.根据上述段落中任一个的用于其用途的直链或支链聚丙烯酸聚合物的药学上可接受的盐，其特征在于所述聚丙烯酸聚合物盐具有小于或等于4、优选小于或等于2.5的多分散性指数。

9.根据上述段落中任一个的用于其用途的直链或支链聚丙烯酸聚合物的药学上可接受的盐，其特征在于所述聚丙烯酸聚合物盐具有在380至620kDa范围内的重均分子量Mw和小于或等于4的多分散性指数；或具有在400至600kDa范围内的重均分子量Mw和小于或等于4的多分散性指数；或具有在380至620kDa范围内的重均分子量Mw和小于或等于2.5的多分散性指数；或具有在400至600kDa范围内的重均分子量Mw和小于或等于2的多分散性指数。

10.根据上述段落中任一个的用于其用途的直链或支链聚丙烯酸聚合物的药学上可接受的盐，其特征在于所述聚丙烯酸聚合物盐具有大于或等于0.7的马克-豪温克斜率。

11.根据上述段落中任一个的用于其用途的直链或支链聚丙烯酸聚合物的药学上可接受的盐，其特征在于它包含小于0.005％w/w的游离酸形式或盐形式的丙烯酸单体，以所述聚丙烯酸聚合物盐的总干重为基准。

12.根据上述段落中任一个的用于其用途的直链或支链聚丙烯酸聚合物的药学上可接受的盐，其特征在于它为液体制剂形式，其具有在5.5-8.0范围内的pH。

13.根据段落10的用于其用途的盐形式的直链或支链聚丙烯酸聚合物的药学上可接受的盐，其特征在于它为缓冲水溶液形式，特别是使用磷酸盐缓冲液或TRIS，Hepes，组氨酸或柠檬酸盐缓冲液。

14.根据上述段落中任一个的用于其用途的直链或支链聚丙烯酸聚合物的药学上可接受的盐，其特征在于将其渗滤。

15.根据上述段落中任一个的用于其用途的直链或支链聚丙烯酸聚合物的药学上可接受的盐，其特征在于将其灭菌。

16.根据上述段落中任一个的用于其用途的直链或支链聚丙烯酸聚合物的药学上可接受的盐，其特征在于它用于增强用所述疫苗组合物获得的Th1免疫应答。

17.疫苗组合物，包含至少一种疫苗试剂和作为佐剂的根据段落1-16中任一个的聚丙烯酸聚合物的药学上可接受的盐。

18.根据段落17的疫苗组合物，其特征在于它每剂量包含0.1-8mg的聚丙烯酸聚合物的药学上可接受的盐，优选0.1-4mg，且更优选0.1-2mg。

19.根据段落17或18的疫苗组合物，其特征在于所述至少一种疫苗试剂是抗原或表达抗原的载体，例如病毒载体或核酸。

20.根据段落18的疫苗组合物，其特征在于抗原是来源于破伤风梭菌(Clostridium tetani)，白喉梭菌(Clostridium diphtheriae)，百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)，B型流感嗜血菌(Haemophilus influenzae type B)，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)，志贺氏菌属(Shigella sp)，伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)，砂眼衣原体或肺炎衣原体(Chlamydia trachomatis orpneumoniae)或链球菌属(Streptococcus sp)的细菌抗原；或是来源于甲型、乙型或丙型肝炎病毒(hepatitis A,B or Cvirus)，流感病毒(influenza virus)，呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus)，鼻病毒(rhinovirus)，西尼罗河病毒(West Nilevirus)，狂犬病病毒(rabies virus)，脊髓灰质炎病毒(poliovirus)，HIV病毒(HIVvirus)，登革热病毒(dengue virus)，日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus)，黄热病病毒(yellow fever virus)，巨细胞病毒(cytomegalovirus)或疱疹病毒(herpesvirus)的病毒抗原；或是来源于疟原虫属(Plasmodium sp.)，利什曼原虫属(leishmaniasp.)或血吸虫属(schistosoma sp.)的寄生虫抗原；或是肿瘤抗原。

21.根据段落17-19中任一个的疫苗组合物，其特征在于所述至少一种疫苗试剂是抗原或编码抗原的载体如重组病毒或核酸，所述抗原来源于金黄色葡萄球菌或巨细胞病毒。

22.根据段落17-21中任一个的疫苗组合物，其特征在于它是具有在6.0-8.0范围内的pH的液体形式。

23.根据段落21的疫苗组合物，其特征在于它为缓冲水溶液形式，特别是使用磷酸盐缓冲液或TRIS，Hepes，组氨酸或柠檬酸盐缓冲液。

24.根据段落17-23中任一个的疫苗组合物，其用于提高在个体中，特别是人中的免疫应答，增强了获得的Th1免疫应答和/或在获得的Th1与Th2免疫应答之间取得了平衡。

25.用于制备根据段落1-16中任一个的聚丙烯酸聚合物的药学上可接受的盐的方法，该方法包括下列连续步骤：

a)得到聚丙烯酸聚合物的溶液，

b)纯化聚丙烯酸聚合物的溶液，以便消除杂质，和

c)将纯化的聚丙烯酸聚合物的溶液灭菌。

26.根据段落25的制备方法，其特征在于步骤a)的溶液的聚丙烯酸聚合物具有在300-550kDa范围内的重均分子量Mw。

27.根据段落25或26的制备方法，其特征在于纯化通过渗析、渗滤、超滤或尺寸排阻色谱法来进行。

28.根据段落27的制备方法，其特征在于纯化通过使用截留值为1-80kDa，优选2-50kDa的膜的渗滤来进行。

29.根据段落25-28中任一个的制备方法，其特征在于纯化在允许得到溶液形式的聚丙烯酸聚合物的条件下进行，所述溶液具有：

-小于0.005％，优选小于0.001％w/w的氧化剂，以纯化后得到的所述聚丙烯酸聚合物的总干重为基准；和/或小于0.005％，优选小于0.001％w/w的过硫酸盐，以纯化后得到的所述聚丙烯酸聚合物的总干重为基准，

-小于0.005％w/w的游离酸形式或盐形式的丙烯酸单体，以纯化后得到的所述聚丙烯酸聚合物的总干重为基准，

-对于聚丙烯酸聚合物盐：在380至620kDa范围内的重均分子量Mw和小于或等于4的多分散性指数；或在400至600kDa范围内的重均分子量Mw和小于或等于4的多分散性指数；或在380至620kDa范围内的重均分子量Mw和小于或等于2.5的多分散性指数；或在400至600kDa范围内的重均分子量Mw和小于或等于2的多分散性指数。

30.根据段落25-29中任一个的制备方法，其特征在于灭菌在高压灭菌器中进行。

31.根据段落25-30中任一个的制备方法，其特征在于纯化和灭菌是对聚丙烯酸聚合物的药学上可接受的盐的溶液进行的。

32.根据段落25-31中任一个的制备方法，其特征在于纯化是对包含2-50mg/mL的聚丙烯酸聚合物的药学上可接受的盐的溶液进行的。

33.用于储存根据段落1-16中任一个的聚丙烯酸聚合物盐的溶液的方法，该方法包括根据段落25-32中任一个的制备方法，然后是得到的溶液形式的聚丙烯酸聚合物的药学上可接受的盐的储存步骤。

34.根据段落33的储存方法，其特征在于储存步骤持续至少1天且至多2年。

35.根据段落33或34的储存方法，其特征在于储存步骤通过在0-30℃，优选2-8℃的温度下将聚丙烯酸聚合物盐的溶液放入容器中来进行。

36.根据段落33-35中任一个的储存方法，其特征在于在储存期间，将聚丙烯酸聚合物盐的溶液保持避光。

37.免疫或疫苗组合物，包含治疗有效量的抗原成分、药学上或兽医学上可接受的载体、和佐剂，所述佐剂包含非交联聚丙烯酸(PAA)聚合物或基本上由其组成，所述非交联聚丙烯酸(PAA)聚合物具有约350kDa至约650kDa的Mw和小于约4或小于约2的多分散性指数。

38.根据段落35的组合物，其中PAA具有约400kDa至约600kDa的Mw。

39.根据段落36的组合物，其中PAA具有约400kDa至约500kDa的Mw。

40.根据段落35的免疫或疫苗组合物，其中所述抗原成分包含减毒重组病毒载体，天然或基因工程减毒活病毒或微生物，灭活病毒或微生物，球虫微生物，早熟球虫微生物，蛋白质亚单元，单细胞寄生虫，多细胞寄生虫或前述的任意组合。

41.根据段落35的免疫或疫苗组合物，其中所述抗原成分包含：艾美球虫属(Eimeria sp.)或其抗原，大肠杆菌(Escherichia coli)(E.coli)或其抗原，猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)(M.hyo)，牛腹泻病毒(BDV)抗原，含有并能够在体内表达至少一种保护性免疫原的重组金丝雀痘载体，灭活全长狂犬病糖蛋白，丹毒丝菌属(Erysipelothrix sp.)，猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)，来自猪红斑丹毒丝菌的表面保护性抗原(SpaA)，包含至少一部分至少一种另外的免疫原的SpaA融合蛋白，SpaA-FlaB融合蛋白，SpaA-FlaB-His融合蛋白，产气荚膜梭菌(Clostridium(C.)perfringens)B/C毒素，产气荚膜梭菌D毒素，败毒梭菌(C.septicum)毒素，诺氏梭菌(C.novyi)毒素，破伤风(C.tetani)梭菌毒素或上述的任意组合。

42.根据段落39的免疫或疫苗组合物，其中所述抗原成分包含灭活全长狂犬病糖蛋白或由其组成。

43.根据段落39的免疫或疫苗组合物，其中所述抗原成分包含产气荚膜梭菌B/C毒素，产气荚膜梭菌D毒素，败毒梭菌毒素，诺氏梭菌毒素，破伤风梭菌毒素或其组合或由其组成。

44.根据段落39的免疫或疫苗组合物，其中所述抗原成分包含产气荚膜梭菌B/C毒素，产气荚膜梭菌D毒素，败毒梭菌毒素，诺氏梭菌毒素和破伤风梭菌毒素。

45.根据段落39的免疫或疫苗组合物，其中所述抗原成分包含SpaA抗原或融合蛋白，所述融合蛋白包含SpaA抗原。

46.根据段落39的免疫或疫苗组合物，其中所述抗原成分包含减毒禽痘病毒或DNA质粒，所述DNA质粒含有且能够在体内表达流感基因。

47.根据段落39的免疫或疫苗组合物，其中所述抗原成分包含减毒禽痘病毒或DNA质粒，所述DNA质粒含有且能够在体内表达狂犬病糖蛋白基因。

48.治疗牛科动物抗细菌引起的感染的方法，该方法包括对牛科动物动物施用根据段落41的疫苗组合物。

49.治疗犬科动物或马科动物抗流感引起的感染的方法，该方法包括对犬科动物或马科动物施用根据段落44的疫苗组合物。

50.治疗犬科动物抗狂犬病病毒引起的感染的方法，该方法包括对犬科动物施用根据段落44的疫苗组合物。

51.禽球虫病疫苗，用于在卵内施用，所述疫苗包含：

(a)佐剂，其包含非交联PAA，所述非交联PAA具有约350kDa至约650kDa的平均Mw；和

(b)原生动物抗原，其选自：(1)一种或多种重组表达的蛋白质；(2)一种或多种通过常规方法从所述原生动物中分离的蛋白质或其它大分子；(3)来自所述原生动物的全细胞提取物或制剂；和(4)灭活的，活的或活的早熟球虫，其选自：堆形艾美球虫(Eimeria(E.)acervulina)，腺样艾美球虫(E.adenoeides)，布氏艾美球虫(E.brunetti)，秋水仙艾美球虫(E.colchici)，弯曲艾美球虫(E.curvata)，分散艾美球虫(E.dispersa)，十二指肠艾美球虫(E.duodenalis)，费特库拉艾美球虫(E.fraterculae)，加洛帕沃尼艾美球虫(E.gallopavonis)，无毒艾美球虫(E.innocua)，早熟艾美球虫(E.praecox)，巨型艾美球虫(E.maxima)，珠鸡艾美球虫(E.meleagridis)，珠鸡和缓米堤艾美球虫(E.meleagrimitis)，和缓艾美球虫(E.mitis)，毒害艾美球虫(E.necatrix)，法思艾美球虫(E.phasiani)，原尾艾美球虫(E.procera)，禽艾美球虫(E.tenella)及其组合。

52.治疗牛科动物抗大肠杆菌或猪肺炎支原体导致的感染的方法，该方法包括对牛科动物施用根据段落39的疫苗组合物，其中所述抗原成分包含大肠杆菌或猪肺炎支原体。

53.根据段落39的免疫或疫苗组合物，其中所述抗原成分包含猪肺炎支原体。

54.治疗猪科动物抗猪肺炎支原体导致的感染的方法，该方法包括对猪科动物施用根据段落51的疫苗组合物。

55.根据段落39的免疫或疫苗组合物，其中所述抗原成分包含FIV。

56.治疗猫科动物抗FIV导致的感染的方法，该方法包括对猫科动物施用根据段落53的疫苗组合物。

57.根据段落39的疫苗组合物，其中所述抗原成分包含癌抗原。

58.治疗受试者抗癌症的方法，该方法包括对受试者施用根据段落55的疫苗组合物。

59.根据段落39的免疫或疫苗组合物，其中所述抗原成分包含犬冠状病毒(CCV)。

60.治疗犬科动物抗CCV导致的感染的方法，该方法包括对犬科动物施用根据段落57的疫苗组合物。

61.根据段落39的免疫或疫苗组合物，其中所述抗原成分包含牛轮状病毒。

62.治疗牛科动物抗牛轮状病毒导致的感染的方法，该方法包括对牛科动物施用根据段落59的疫苗组合物。

63.根据段落39的免疫或疫苗组合物，其中所述抗原成分包含犬流感病毒(CIV)。

64.治疗犬科动物抗CIV导致的感染的方法，该方法包括对犬科动物施用根据段落61的疫苗组合物。

***

如本文所公开的，申请人首次发现某些分子量范围的非交联(即直链和支链)聚丙烯酸(PAA)聚合物特别适合辅助免疫原性抗原的作用，以及引发独立于抗原的免疫应答。重要的是，申请人惊奇地发现这些非交联PAA佐剂广泛用于许多不同的抗原类型：减毒重组病毒载体；经典灭活狂犬病糖蛋白；SpaA肽亚单位；和细菌毒素。此外，所公开的PAA佐剂在多种动物类型中发挥良好作用。因此，申请人认为所公开的非交联PAA代表具有新颖性和创造性的“通用佐剂”。

Claims (67)

1.疫苗佐剂，其为直链或支链聚丙烯酸聚合物的药学上可接受的盐，其特征在于所述聚丙烯酸聚合物盐具有在350-650kDa范围内的重均分子量Mw和小于或等于4的多分散性指数；并包含小于0.005％w/w的氧化剂，以所述聚丙烯酸聚合物盐的总干重为基准，并且其中所述聚丙烯酸聚合物完全由丙烯酸单元组成。

2.根据权利要求1的疫苗佐剂，其特征在于所述聚丙烯酸聚合物盐完全由为丙烯酸盐的丙烯酸单元组成或完全由为丙烯酸的游离酸形式的丙烯酸单元和为丙烯酸盐的丙烯酸单元组成。

3.根据权利要求1或2的疫苗佐剂，其特征在于它包含小于0.001％w/w的氧化剂，以所述聚丙烯酸聚合物盐的总干重为基准。

4.根据权利要求1或2的疫苗佐剂，其特征在于它包含小于0.005％w/w的过硫酸盐，以所述聚丙烯酸聚合物盐的总干重为基准。

5.根据权利要求1或2的疫苗佐剂，其特征在于它包含小于0.001％w/w的过硫酸盐，以所述聚丙烯酸聚合物盐的总干重为基准。

6.根据权利要求1或2的疫苗佐剂，其特征在于所述聚丙烯酸聚合物是与Na⁺的盐。

7.根据权利要求1或2的疫苗佐剂，其特征在于所述聚丙烯酸聚合物盐具有小于或等于2.5的多分散性指数。

8.根据权利要求1或2的疫苗佐剂，其特征在于所述聚丙烯酸聚合物盐具有在380至620kDa范围内的重均分子量Mw和小于或等于4的多分散性指数；或具有在400至600kDa范围内的重均分子量Mw和小于或等于4的多分散性指数；或具有在380至620kDa范围内的重均分子量Mw和小于或等于2.5的多分散性指数；或具有在400至600kDa范围内的重均分子量Mw和小于或等于2的多分散性指数。

9.根据权利要求1或2的疫苗佐剂，其特征在于所述聚丙烯酸聚合物盐具有大于或等于0.7的马克-豪温克斜率。

10.根据权利要求1或2的疫苗佐剂，其特征在于它包含小于0.005％w/w的游离酸形式或盐形式的丙烯酸单体，以所述聚丙烯酸聚合物盐的总干重为基准。

11.根据权利要求1或2的疫苗佐剂，其特征在于它为液体制剂形式，其具有在5.5-8.0范围内的pH。

12.根据权利要求11的疫苗佐剂，其特征在于它为缓冲水溶液形式。

13.根据权利要求12的疫苗佐剂，其特征在于所述缓冲水溶液形式是磷酸盐缓冲液或TRIS，Hepes，组氨酸或柠檬酸盐缓冲液。

14.根据权利要求1或2的疫苗佐剂，其特征在于将其渗滤。

15.根据权利要求1或2的疫苗佐剂，其特征在于将其灭菌。

16.根据权利要求1或2的疫苗佐剂，其特征在于它用于增强用所述疫苗组合物获得的Th1免疫应答。

17.疫苗组合物，包含至少一种疫苗试剂和根据权利要求1-16中任一项的疫苗佐剂。

18.根据权利要求17的疫苗组合物，其特征在于它每剂量包含0.1-8mg，或0.1-4mg，或0.1-2mg的聚丙烯酸聚合物的药学上可接受的盐。

19.根据权利要求17或18的疫苗组合物，其特征在于所述至少一种疫苗试剂是抗原或表达抗原的载体。

20.根据权利要求19的疫苗组合物，其特征在于所述抗原是来源于破伤风梭菌(Clostridium tetani)，白喉梭菌(Clostridium diphtheriae)，百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)，B型流感嗜血菌(Haemophilus influenzae type B)，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)，志贺氏菌属(Shigella sp)，伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)，砂眼衣原体或肺炎衣原体(Chlamydia trachomatis orpneumoniae)或链球菌属(Streptococcus sp)的细菌抗原；或是来源于甲型、乙型或丙型肝炎病毒(hepatitis A,B or C virus)，流感病毒(influenza virus)，呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus)，鼻病毒(rhinovirus)，西尼罗河病毒(West Nilevirus)，狂犬病病毒(rabies virus)，脊髓灰质炎病毒(poliovirus)，HIV病毒(HIVvirus)，登革热病毒(dengue virus)，日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus)，黄热病病毒(yellow fever virus)，巨细胞病毒(cytomegalovirus)或疱疹病毒(herpesvirus)的病毒抗原；或是来源于疟原虫属(Plasmodium sp.)，利什曼原虫属(leishmaniasp.)或血吸虫属(schistosoma sp.)的寄生虫抗原；或是肿瘤抗原。

21.根据权利要求17或18的疫苗组合物，其特征在于所述至少一种疫苗试剂是抗原或编码抗原的载体，所述抗原来源于金黄色葡萄球菌或巨细胞病毒。

22.根据权利要求17或18的疫苗组合物，其特征在于它是具有在6.0-8.0范围内的pH的液体形式。

23.根据权利要求22的疫苗组合物，其特征在于它为缓冲水溶液形式。

24.根据权利要求23的疫苗组合物，其特征在于所述缓冲水溶液形式是磷酸盐缓冲液或TRIS，Hepes，组氨酸或柠檬酸盐缓冲液。

25.用于制备根据权利要求1-16中任一项的疫苗佐剂的方法，该方法包括下列连续步骤：

a)得到聚丙烯酸聚合物的溶液，

b)纯化聚丙烯酸聚合物的溶液，以便消除杂质，和

c)将纯化的聚丙烯酸聚合物的溶液灭菌。

26.根据权利要求25的制备方法，其特征在于步骤a)的溶液的聚丙烯酸聚合物具有在300-550kDa范围内的重均分子量Mw。

27.根据权利要求25或26的制备方法，其特征在于纯化通过渗析、渗滤、超滤或尺寸排阻色谱法来进行。

28.根据权利要求27的制备方法，其特征在于纯化通过使用截留值为1-80kDa或2-50kDa的膜的渗滤来进行。

29.根据权利要求25或26的制备方法，其特征在于纯化在允许得到溶液形式的聚丙烯酸聚合物的条件下进行，所述溶液具有：

-小于0.005％，或小于0.001％w/w的氧化剂，以纯化后得到的所述聚丙烯酸聚合物的总干重为基准；和/或小于0.005％，或小于0.001％w/w的过硫酸盐，以纯化后得到的所述聚丙烯酸聚合物的总干重为基准，

-小于0.005％w/w的游离酸形式或盐形式的丙烯酸单体，以纯化后得到的所述聚丙烯酸聚合物的总干重为基准，

-对于聚丙烯酸聚合物盐：在380至620kDa范围内的重均分子量Mw和小于或等于4的多分散性指数；或在400至600kDa范围内的重均分子量Mw和小于或等于4的多分散性指数；或在380至620kDa范围内的重均分子量Mw和小于或等于2.5的多分散性指数；或在400至600kDa范围内的重均分子量Mw和小于或等于2的多分散性指数。

30.根据权利要求25或26的制备方法，其特征在于灭菌在高压灭菌器中进行。

31.根据权利要求25或26的制备方法，其特征在于纯化和灭菌是对聚丙烯酸聚合物的药学上可接受的盐的溶液进行的。

32.根据权利要求25或26的制备方法，其特征在于纯化是对包含2-50mg/mL的聚丙烯酸聚合物的药学上可接受的盐的溶液进行的。

33.用于储存根据权利要求1-16中任一项的疫苗佐剂的溶液的方法，该方法包括根据权利要求25-32中任一项的制备方法，然后是得到的溶液形式的聚丙烯酸聚合物的药学上可接受的盐的储存步骤。

34.根据权利要求33的储存方法，其特征在于储存步骤持续至少1天且至多2年。

35.根据权利要求33或34的储存方法，其特征在于储存步骤通过在0-30℃，或2-8℃的温度下将聚丙烯酸聚合物盐的溶液放入容器中来进行。

36.根据权利要求33或34的储存方法，其特征在于在储存期间，将聚丙烯酸聚合物盐的溶液保持避光。

37.免疫或疫苗组合物，包含治疗有效量的抗原成分、药学上或兽医学上可接受的载体、和佐剂，所述佐剂包含非交联聚丙烯酸(PAA)聚合物盐或由其组成，所述非交联聚丙烯酸(PAA)聚合物盐具有350kDa至650kDa的Mw和小于4或小于2的多分散性指数；并包含小于0.005％w/w的氧化剂，以所述聚丙烯酸聚合物盐的总干重为基准，并且其中所述聚丙烯酸聚合物完全由丙烯酸单元组成。

38.根据权利要求37的组合物，其中聚丙烯酸(PAA)聚合物盐具有400kDa至600kDa的Mw。

39.根据权利要求38的组合物，其中聚丙烯酸(PAA)聚合物盐具有400kDa至500kDa的Mw。

40.根据权利要求37的免疫或疫苗组合物，其中所述抗原成分包含减毒重组病毒载体，天然或基因工程减毒活病毒或微生物，灭活病毒或微生物，球虫微生物，蛋白质亚单元，单细胞寄生虫，多细胞寄生虫或前述的任意组合。

41.根据权利要求40的免疫或疫苗组合物，其中所述球虫微生物为早熟球虫微生物。

42.根据权利要求37的免疫或疫苗组合物，其中所述抗原成分包含：艾美球虫属(Eimeria sp.)或其抗原，大肠杆菌(Escherichia coli)(E.coli)或其抗原，猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)(M.hyo)，牛腹泻病毒(BDV)抗原，含有并能够在体内表达至少一种保护性免疫原的重组金丝雀痘载体，灭活全长狂犬病糖蛋白，丹毒丝菌属(Erysipelothrix sp.)，猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)，来自猪红斑丹毒丝菌的表面保护性抗原(SpaA)，包含至少一部分至少一种另外的免疫原的表面保护性抗原(SpaA)融合蛋白，产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)B/C毒素，产气荚膜梭菌D毒素，败毒梭菌(Clostridium septicum)毒素，诺氏梭菌(Clostridium novyi)毒素，破伤风梭菌(Clostridium tetani)毒素或上述的任意组合。

43.根据权利要求42的免疫或疫苗组合物，其中所述包含至少一部分至少一种另外的免疫原的表面保护性抗原(SpaA)融合蛋白为SpaA-FlaB融合蛋白或SpaA-FlaB-His融合蛋白。

44.根据权利要求42的免疫或疫苗组合物，其中所述抗原成分包含灭活全长狂犬病糖蛋白或由其组成。

45.根据权利要求42的免疫或疫苗组合物，其中所述抗原成分包含产气荚膜梭菌B/C毒素，产气荚膜梭菌D毒素，败毒梭菌毒素，诺氏梭菌毒素，破伤风梭菌毒素或其组合或由产气荚膜梭菌B/C毒素，产气荚膜梭菌D毒素，败毒梭菌毒素，诺氏梭菌毒素，破伤风梭菌毒素或其组合组成。

46.根据权利要求42的免疫或疫苗组合物，其中所述抗原成分包含产气荚膜梭菌B/C毒素，产气荚膜梭菌D毒素，败毒梭菌毒素，诺氏梭菌毒素和破伤风梭菌毒素。

47.根据权利要求42的免疫或疫苗组合物，其中所述抗原成分包含表面保护性抗原(SpaA)。

48.根据权利要求42的免疫或疫苗组合物，其中所述抗原成分包含融合蛋白，所述融合蛋白包含表面保护性抗原(SpaA)。

49.根据权利要求42的免疫或疫苗组合物，其中所述抗原成分包含减毒禽痘病毒或DNA质粒，所述DNA质粒含有且能够在体内表达流感基因。

50.根据权利要求42的免疫或疫苗组合物，其中所述抗原成分包含减毒禽痘病毒或DNA质粒，所述DNA质粒含有且能够在体内表达狂犬病糖蛋白基因。

51.根据权利要求42的疫苗组合物在制备用于治疗牛科动物抗细菌引起的感染的药物中的用途。

52.根据权利要求46的疫苗组合物在制备用于治疗犬科动物或马犬科动物抗流感引起的感染的药物中的用途。

53.根据权利要求46的疫苗组合物在制备用于治疗犬科动物抗狂犬病病毒引起的感染的药物中的用途。

54.禽球虫病疫苗，用于在卵内施用，所述疫苗包含：

(a)疫苗佐剂，其为直链或支链聚丙烯酸聚合物的药学上可接受的盐，其特征在于所述聚丙烯酸聚合物盐具有在350-650kDa范围内的重均分子量Mw和小于或等于4的多分散性指数；并包含小于0.005％w/w的氧化剂，以所述聚丙烯酸聚合物盐的总干重为基准，并且其中所述聚丙烯酸聚合物完全由丙烯酸单元组成；和

(b)原生动物抗原，其选自：(1)一种或多种重组表达的蛋白质；(2)一种或多种通过常规方法从所述原生动物中分离的蛋白质或其它大分子；(3)来自所述原生动物的全细胞提取物或制剂；和(4)灭活的，活的或活的早熟球虫，其选自：堆形艾美球虫(Eimeriaacervulina)，腺样艾美球虫(Eimeria adenoeides)，布氏艾美球虫(Eimeria brunetti)，秋水仙艾美球虫(Eimeria colchici)，弯曲艾美球虫(Eimeria curvata)，分散艾美球虫(Eimeria dispersa)，十二指肠艾美球虫(Eimeria duodenalis)，费特库拉艾美球虫(Eimeria fraterculae)，加洛帕沃尼艾美球虫(Eimeria gallopavonis)，无毒艾美球虫(Eimeria innocua)，早熟艾美球虫(Eimeria praecox)，巨型艾美球虫(Eimeria maxima)，珠鸡艾美球虫(Eimeria meleagridis)，珠鸡和缓米堤艾美球虫(Eimeriameleagrimitis)，和缓艾美球虫(Eimeria mitis)，毒害艾美球虫(Eimeria necatrix)，法思艾美球虫(Eimeria phasiani)，原尾艾美球虫(Eimeria procera)，禽艾美球虫(Eimeriatenella)及其组合。

55.根据权利要求42的疫苗组合物在制备用于治疗牛科动物抗大肠杆菌或猪肺炎支原体导致的感染的药物中的用途，其中所述抗原成分包含大肠杆菌或猪肺炎支原体。

56.根据权利要求42的免疫或疫苗组合物，其中所述抗原成分包含猪肺炎支原体。

57.根据权利要求56的疫苗组合物在制备用于治疗猪科动物抗猪肺炎支原体导致的感染的药物中的用途。

58.根据权利要求42的免疫或疫苗组合物，其中所述抗原成分包含FIV。

59.根据权利要求58的疫苗组合物在制备用于治疗猫科动物抗FIV导致的感染的药物中的用途。

60.根据权利要求42的疫苗组合物，其中所述抗原成分包含癌抗原。

61.根据权利要求60的疫苗组合物在制备用于治疗受试者抗癌症的药物中的用途。

62.根据权利要求42的免疫或疫苗组合物，其中所述抗原成分包含犬冠状病毒(CCV)。

63.根据权利要求62的疫苗组合物在制备用于治疗犬科动物抗犬冠状病毒(CCV)导致的感染的药物中的用途。

64.根据权利要求42的免疫或疫苗组合物，其中所述抗原成分包含牛轮状病毒。

65.根据权利要求64的疫苗组合物在制备用于治疗牛科动物抗牛轮状病毒导致的感染的药物中的用途。

66.根据权利要求42的免疫或疫苗组合物，其中所述抗原成分包含犬流感病毒(CIV)。

67.根据权利要求66的疫苗组合物在制备用于治疗犬科动物抗犬流感病毒(CIV)导致的感染的药物中的用途。

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