CN111447946A - 用于针对猪链球菌进行保护的疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含免疫有效量的猪链球菌的IgM蛋白酶抗原的疫苗，其用于通过仅施用一次所述疫苗来针对猪链球菌的致病性感染保护猪的方法中，其中所述疫苗每剂包含最多120μg抗原。

Description

用于针对猪链球菌进行保护的疫苗

总体发明领域

本发明涉及针对猪链球菌的致病性感染保护猪。

发明背景

猪链球菌是猪的共生和机会病原体。尤其是在应激下，细菌可以引发致病性感染并诱导疾病。在现代产猪条件下，例如，小猪的断奶和幼龄小猪的运输诱导主要应激。这已经使得猪链球菌变为主要的猪病原体。它也是一种新出现的人脑膜炎和链球菌中毒性休克样综合征的人畜共患病病原体。猪链球菌是一种包膜良好的病原体，并且已经基于荚膜多糖抗原多样性描述了多种血清型。猪链球菌使用毒力因子的武器库(arsenal)来逃避宿主免疫系统。这些特征已经一起为对抗这种重要病原体的有效疫苗的开发带来挑战。近来，已经出版了关于针对猪链球菌的疫苗的综述文章(Mariela Segura: “Streptococcus suisvaccines: candidate antigens and progress, in Expert Review of Vaccines，第14卷，2015年，第12期，第1587-1608页)。在该综述中，已经汇编并比较了临床现场信息和实验数据，以提供针对猪链球菌的疫苗开发的现状的概览，如下所概述。

目前使用的疫苗主要是全细胞菌苗。然而，现场报告描述了疾病控制和管控中的困难，并且特别地，“疫苗失败”是常见的。携带者猪是主要的感染源，并且垂直传播和水平传播两者均参与疾病在畜群内的散播。在应激条件(诸如断奶和运输)下，携带者动物与易感动物的混合通常导致临床疾病。早期用药的断奶和隔离的早期断奶实践并不消除猪链球菌感染。因此，用于预防疾病的有效控制措施将取决于预防/补救性预防(metaphylactic)程序(在允许的情况下)和接种疫苗。目前，现场免疫尝试已经集中于商业或自体菌苗的使用。这些疫苗策略已应用于小猪或母猪。从断奶开始以及其后，小猪由于与断奶以及常见的后续运输相关的应激，更容易受到猪链球菌感染。因此，母猪中的产前免疫经常被用来尝试和传递被动免疫到小猪，并在生命早期提供在这些应激情况下的针对猪链球菌的保护。此外，母猪接种疫苗成本较低且劳动强度较低，因此代表了对小猪接种疫苗的经济替代方案。然而，可得的结果似乎表明用菌苗进行母猪接种疫苗也是一个有争议的问题。在许多情况下，甚至当分娩前接种疫苗两次时，接种疫苗的母猪对接种疫苗应答也不佳或根本没有应答，这导致转移至幼崽的母体免疫低下。而且即使母体免疫以足够的水平转移，在许多情况下，母体抗体仍然太低，从而无法在4-7周龄的最关键时段中提供保护。

在猪中，自体菌苗经常在现场使用，特别是在欧洲。它们从在具有临床问题的农场分离的毒性菌株制备，并应用于同一农场。自体菌苗的缺点之一是缺乏疫苗安全性数据并且可能发生严重的不良反应。采样误差(由于仅使用一只或两只小猪或样品)可能导致鉴别与近来暴发相关的菌株或血清型的失败。这种失败在地方性畜群中可能尤其成问题。最后，自体菌苗的最重要的困境是对它们的实际效力研究不足。由于自体疫苗的应用是经验性的，因此用这些疫苗获得的结果不一致也就不令人惊讶了。

本领域中还描述了其他实验疫苗。Kai-Jen Hsueh等人显示(“Immunization withStreptococcus suis bacterin plus recombinant Sao protein in sows conveyspassive immunity to their piglets”, 于: BMC Veterinary Research, BMC series – open, inclusive and trusted, 13:15, 2017年1月7日)菌苗+亚基可能是给母猪成功接种疫苗以给它们的小猪赋予保护性免疫的基础。

本领域中也已考虑活减毒疫苗。猪链球菌血清型2的无包膜的同基因突变体已被明确显示是无毒的。然而，基于无包膜的血清型2突变体的活疫苗制剂仅诱导针对死亡的部分保护，并且不能阻止用野生型菌株攻击的猪中的临床体征的发展(Wisselink HJ,Stockhofe-Zurwieden N, Hilgers LA, 等人 “Assessment of protective efficacy oflive and killed vaccines based on a non-encapsulated mutant of Streptococcus suis serotype 2.” 于: Vet Microbiol. 2002, 84:155–168.)。

在过去的几年中，已报道了抗原性或免疫原性猪链球菌分子的广泛列表，并且这些中的大多数已通过使用来自受感染猪或人的恢复期血清和/或实验室产生的免疫血清的免疫蛋白质组学发现。WO2015/181356(IDT Biologika GmbH)已显示，IgM蛋白酶抗原(整个蛋白或仅代表完整蛋白的约35%的高度保守的Mac-1结构域)可以在一种接种疫苗方案中在小猪中引发保护性免疫应答，所述接种疫苗方案是施用两剂IgM蛋白酶抗原，其任选地与含有菌苗的引发接种疫苗组合。注意到WO2017/005913(Intervacc AB)也描述了使用IgM蛋白酶抗原(特别是与核苷酸酶融合的IgM蛋白酶多肽)，但是仅已显示能够引发血清应答的特性。在该国际专利申请中未显示IgM蛋白酶抗原的保护作用。

发明目的

本发明的一个目的是找到一种改进的接种疫苗策略，以针对猪链球菌的致病性感染保护猪。

发明概述

为了满足本发明的目的，已经设计了一种包含免疫有效量的猪链球菌的IgM蛋白酶抗原的疫苗，其用于通过仅施用一次疫苗来保护猪的方法中，其中所述疫苗每剂包含最多120μg抗原。

该疫苗的抗原尤其从WO2015/181356和WO2017/005913是已知的。然而，如上文所示，从这些参考文献中的任一者不清楚IgM蛋白酶抗原是否原样能够以单次注射的方法引发保护性免疫应答。在WO2015/181356中，两次注射接种疫苗方法与菌苗组合使用，其中使用约250μg的IgM蛋白酶。因此，令人惊讶的是，IgM蛋白酶抗原自身，剂量少于从WO2015/181356已知剂量的一半，并且通过仅施用抗原的一次注射，能够引发保护性免疫应答，其针对猪链球菌的致病性感染保护猪。在这方面，重要的是承认，在本领域中，非活猪链球菌疫苗已经总是在引发-加强方案中施用。同样，在本领域中(参见WO2015/181356和WO2017/005913)，用于本发明中使用的抗原已经一致地提出以两次注射施用的方法使用该抗原，任选地甚至使用多路疫苗(即比仅单独的IgM蛋白酶抗原更多)。因此，高度令人惊讶地看到，单剂量的IgM蛋白酶抗原原样，使用少于本领域中使用的量的一半的量，能够诱导保护性免疫。

新的接种疫苗策略具有多个优势。除了使用显著更少的抗原从经济角度来看是有利的事实之外，包含更少抗原的疫苗的安全性通常得到提高。太多的抗原可以导致不想要的免疫学效应，诸如过敏性休克。此外，通过需要仅施用一次抗原，接种疫苗过程对动物的应激更少。

对于本发明，确定在疫苗中每剂使用120μg，仍可以获得有效的保护性免疫应答。按照定义，每剂120 µg因此是抗原的免疫学有效量。免疫有效量的下限可以通过进行常见的剂量应答研究并评价在何种剂量仍可以达到期望的保护(例如小猪的死亡率降低)来确定。因此，下限也通过期望的保护水平来确定。基于如下发现，即在低至4.4 µg的剂量仍可以获得与使用120-250μg相比时相同的保护水平且因此尚未看到保护性应答的降低，预期在1 µg或甚至仅0.1 µg抗原的剂量，仍可以观察到实用的相关保护作用。因此，对于目前的疫苗，实用最小免疫有效量被认为是每剂0.1 µg抗原，但可以根据本发明使用每剂任何更高的剂量，诸如0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60 µg或范围61-119 µg直至120 µg中的任何更高的整数。

本发明还涉及猪链球菌的IgM蛋白酶抗原用于制备疫苗的用途，所述疫苗用于通过仅施用一次所述疫苗而针对猪链球菌的致病性感染保护猪，其中所述疫苗每剂包含最多120μg的免疫有效量的IgM蛋白酶抗原，以及涉及用于通过仅施用一次包含免疫有效量的猪链球菌的IgM蛋白酶抗原的疫苗来针对猪链球菌的致病性感染保护猪的方法，其中所述疫苗每剂包含最多120μg抗原。

应注意，在根据本发明的疫苗中，抗原通常与药学上可接受的载体、即生物相容性介质、即在施用后在受试者动物中不诱导显著的不良反应的介质(其能够在施用疫苗后将抗原呈递给宿主动物的免疫系统)组合。这种药学上可接受的载体可以是例如含有水和/或任何其他生物相容性溶剂的液体或固体载体，诸如通常用于获得冷冻干燥的疫苗(基于糖和/或蛋白)的固体载体，其任选地包含免疫刺激剂(佐剂)。任选地，根据疫苗的预期用途或所需特性，添加其他物质，诸如稳定剂、粘度调节剂或其他组分。

定义

疫苗是一种药物组合物，其对于施用于受试者动物是安全的，并且能够在该动物中诱导针对致病性微生物的保护性免疫，即诱导针对微生物的成功保护。

猪链球菌的IgM蛋白酶抗原是一种特异性降解猪IgM(而不是猪IgG或猪IgA；Seele等人，在Journal of Bacteriology, 2013, 195 930-940中；和在Vaccine 33:2207-2212；2015年5月5日中)的酶，表示为IdeSsuis的蛋白，或其免疫原性部分(通常具有全长酶的至少约30-35%的长度)。完整酶具有约100-125kDa的重量，对应于约1000-1150个氨基酸，大小取决于猪链球菌的血清型。在WO 2015/181356中，给出代表猪链球菌的IgM蛋白酶抗原的几种序列，即，SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:5，后者是全长酶的免疫原性部分(表示为Mac-1结构域，即SEQ ID NO:7的氨基酸80-414)。全长酶的免疫原性部分的其他实例在WO2017/005913中给出。具体而言，IgM蛋白酶可以是根据WO2015/1818356的SEQ ID NO:1的蛋白酶或在重叠区域中具有至少90%或甚至91、92、93、94、95、96、97、98、99%直至100%序列同一性的蛋白。可以使用具有默认参数的blastp算法用BLAST程序建立氨基酸序列同一性。预期各种血清型的猪链球菌的IgM蛋白酶具有高于90%的序列同一性，特别是预期为91、92、93、94、95、96、97、98、99%直至100%的序列同一性。例如，为了优化抗原的重组生产系统中的产量而制成的人工蛋白，可能导致与完整酶相比较低的氨基酸序列同一性，诸如85%、80%、75%、70%或甚至60%，同时维持所需的免疫原性功能，并且在本发明的意义上被理解为猪链球菌的IgM蛋白酶抗原。

针对微生物的致病性感染的保护有助于预防、改善或治愈该微生物的致病性感染或由该感染产生的病症，例如，预防或减少由病原体的感染导致的一种或多种临床体征。

其中仅施用一次疫苗的接种疫苗方法意味着在疫苗的仅一次单次注射后赋予保护性免疫，且因此省略加强接种疫苗以达到所述保护性免疫。在两次注射方案中，第一次(引发)接种疫苗通常在第一次施用起6周内、通常在第一次施用起3周或者甚至2周内加强，并且仅在第二次(加强)施用后，理解为获得保护性免疫，即如上文所定义的成功保护。

抗原的免疫学有效量是能够在受试者动物中引发保护性免疫的量。

发明的实施方案

在根据本发明所用的疫苗的一个实施方案中，所述方法包括将疫苗施用于最多28日龄的猪。在本领域中，普遍关注的是，猪，尤其是在当接种疫苗时小于28天时，不具有成熟的适应性免疫系统，且因此，保护性免疫的达到可能受损。然而，发现当根据新的接种疫苗策略(低剂量，一次注射)使用IgM蛋白酶抗原时，能够引发足够的保护性免疫。用IgM蛋白酶抗原接种疫苗的日龄可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28日的任何日龄。如本领域已知，尤其是从WO2017/005913已知，从出生当天起并在其后，可以在幼猪中获得针对IgM蛋白酶抗原的阳性免疫应答。这意味着，根据本文显示的在3周龄猪中的实际保护，应理解的是，甚至在较幼龄时也可以获得保护。

在另一个实施方案中，所述方法包括在猪断奶的日龄之前施用疫苗。换句话说，在小猪实际断奶之前施用所述疫苗。已经显示，在该早期日龄的接种疫苗可以针对由刚好在断奶后2-3周的短窗口内的应激诱导的猪链球菌的致病性感染进行保护。这是事先意料之外的，因为原样的IgM蛋白酶抗原的潜在保护作用仅对于已经经过断奶后2-3周的关键阶段(即在接种疫苗时为5-7周龄，远在动物由于断奶而受应激的时段之后)的动物，是已知的(参见WO2015/181356)。已知的是，得到猪链球菌的致病性感染的关键时段是刚好在断奶后。因此，在断奶过程完成且不再涉及应激后，健康动物中的任何成功接种疫苗策略不提供动物断奶前针对猪链球菌的成功接种疫苗的任何证据。

在又另一个实施方案中，所述方法包括将疫苗施用于具有母体来源的抗猪链球菌抗体的猪。非常幼龄的猪的主动接种疫苗具有可能干扰母体抗体的担忧，所述母体抗体通过自然感染产生或通过母猪的主动免疫产生(Baums CG, Bruggemann C, Kock C, 等人”Immunogenicity of an autogenous Streptococcus suis bacterin in preparturientsows and their piglets in relation to protection after weaning”, 于: Clin Vaccine Immunol. 2010;17:1589–1597)。的确，来自免疫母猪的哺乳小猪和断奶小猪的接种疫苗均与在8周龄时显著的主动免疫应答和保护无关。该失败与母体抗体或其他初乳组分的强抑制作用相关。在这方面，母体抗体和针对猪链球菌的抗体的活跃产生之间的干扰也可以在用自体猪链球菌荚膜1/2型疫苗制剂接种疫苗后的现场研究中得到证明(Lapointe L, D’Allaire S, Lebrun A, 等人: “Antibody response to an autogenousvaccine and serologic profile for Streptococcus suis capsular type 1/2.”于:Can J Vet Res. 2002; 66:8–14)。目的在于确定4日龄哺乳小猪中的单剂量猪链球菌血清型14菌苗方案的效力的现场研究，也未能针对同源攻击保护小猪(Amass SF, StevensonGW, Knox KE, 等人 “Efficacy of an autogenous vaccine for preventingstreptococcosis in piglets” 于: Vet Med. 1999, 94, 480–484)。令人惊讶地，已发现通过使用低剂量的IgM蛋白酶抗原并仅施用该抗原的一次注射，母体抗猪链球菌抗体的干扰不是达到针对猪链球菌的致病性感染的保护的问题。这为给小猪自身接种疫苗并诱导主动保护(而不是依赖于可以经由免疫的母体动物的初乳获得的短期的被动保护)提供了独特的选项。已经显示，甚至可以在小猪断奶之前进行接种疫苗，以针对由猪链球菌导致的疾病对它们进行保护，所述疾病由断奶或刚好在断奶程序之后或在断奶程序之后不久幼龄动物的运输的应激所诱导。目前首次，在老年动物(在所述动物中，干扰MDA通常不是问题)中具有潜在的保护作用的抗原已被显示可用于对MDA阳性动物接种疫苗以达到在早龄、通常在断奶后2-3周的窗口中由应激诱导的明显的保护作用。应注意到，WO2015/181356中的数据仅显示在具有5-7周龄并在9周龄接受攻击感染的小猪中成功的接种疫苗，因此远在断奶后2-3周的危险时段(即，致病性猪链球菌感染的峰值发生率的时段)之后，即5-7周龄。没有迹象表明IgM蛋白酶抗原是否能够克服干扰母体免疫的普遍问题。相反，在5-7周龄接种疫苗的动物的选择，清楚地表明，意在避免干扰MDA(如果存在的话)。

在又另一个实施方案中，所述疫苗用于赋予针对与猪链球菌的致病性感染相关的死亡的保护。

在又另一个实施方案中，所述疫苗用于赋予针对与猪链球菌的致病性感染相关的临床体征的保护。典型的与猪链球菌的致病性感染相关的临床体征是直肠温度升高，运动受损(跛行，关节肿胀)，呼吸频率增加和神经系统体征(例如震颤、抽搐、斜颈(torticollosis)、共济失调)。预防、改善或治愈这些体征中的一种或多种对猪将是有益的，不仅因为这是致病性感染正在被抑制的指标。

现在将基于以下非限制性实施例进一步解释本发明。

实施例

实施例1

本实验的目的是测试一次注射低剂量(每剂120 µg或更少；如通过使用牛血清白蛋白作为标准品的Bradford蛋白测定法所测定) IgM蛋白酶疫苗针对猪链球菌攻击的剂量-应答效力。

研究设计

对于该研究，使用50只3周龄小猪。将小猪分配至五组(不同窝的幼崽均匀分布在各组)，每组10只小猪。第1组至第4组在3周龄时用任一不同疫苗剂量、即每剂分别为120 µg、40 µg、13.3 µg和4.4 µg的重组rIdeSsuis IgM蛋白酶抗原(对于使用的抗原，参见Seele的Vaccine 33:2207-2212的部分2.2)(在油包水佐剂中配制)肌肉内接种疫苗一次。第5组留作未接种疫苗的攻击对照。在4周龄时，将小猪断奶。在6周龄时，将小猪运输至攻击室并立即攻击。在运输和攻击之间没有适应期以模拟自然应激。攻击后，每天观察猪的猪链球菌感染的临床体征(诸如抑郁、运动问题和/或神经系统体征)，并使用0(无体征)至3(严重病例)的常规评分系统进行评分。将严重受影响的动物安乐死并进行验尸检查。在研究结束时(攻击后7天)，将所有存活的猪安乐死并进行验尸检查。在临接种疫苗和攻击前，收集血清用于抗体测定。在攻击之前和之后的定期时间，收集肝素血液用于重新分离攻击菌株。

结果

所述疫苗无一诱导任何不可接受的部位或全身反应，且因此可以被认为是安全的。在接种疫苗当天(3周龄)，大多数猪血清阴性或具有低母体来源的抗体滴度。接种疫苗后，所有疫苗组都显示抗体应答，并观察到明显的血清学剂量-应答作用，其中平均组滴度分别为6.5、6.0、4.9、4.4和3.5 log₂。攻击后不同参数的结果显示于下表1中。

表1：攻击后数据研究1

组	平均存活时间(天)	平均临床评分	平均血液重新分离评分	#阳性血液	攻击后死亡
						1	6.7	9.2	0.7	3/10	2/10
2	6.5	8.6	0.2	1/10	1/10
						3	6.6	7.7	0.8	2/10	1/10
4	6.6	7.4	0.3	1/10	1/10
						5	5.1	30.9	1.7	6/10	6/10

结论

结果表明，一次注射IgM蛋白酶疫苗的所有四种疫苗剂量都在接种疫苗后3周，在3周龄小猪(部分(平均约20%) MDA阳性)中诱导针对致病性猪链球菌的攻击的保护。保护水平看起来对应于当使用两次注射方法(每次注射250 µg IgM蛋白酶，每只动物总计500 µg；如WO2015/181356中所使用)时可获得的保护水平。没有观察到剂量-应答作用，并且低至4.4µg的疫苗剂量显示与当使用120 µg抗原时相比时至少相同水平(或者甚至更好)的有说服力的保护。基于此，据信最低的实用剂量可以低至1.0μg或甚至0.1μg的IgM蛋白酶。

实施例2

由于甚至当动物具有针对猪链球菌的母体来源的抗体时也优选获得对于猪的针对猪链球菌的保护，因此在3周龄的母体来源的抗猪链球菌阳性猪中，评价含有IgM蛋白酶的疫苗作为一次注射疫苗是否有效。

研究设计

对于该研究，使用2组，每组10只猪。第1组由3周龄的抗猪链球菌MDA阳性小猪(10只动物中只有1只看起来具有低于检测限值的MDA水平)组成。这些动物用水包油佐剂中配制的IgM蛋白酶抗原肌肉内接种疫苗一次。第2组充当阴性攻击对照组。在4周龄时，将小猪断奶。在6周龄时，将小猪运输至攻击室并立即攻击。将小猪用猪链球菌血清型2的毒性培养物进行攻击。在攻击之前和之后的定期时间，收集肝素血液用于重新分离攻击菌株。攻击后，每天观察猪的猪链球菌感染的临床体征。将严重受影响的动物安乐死并进行验尸检查。在研究结束时(攻击后7天)，将所有存活的猪安乐死并进行验尸检查。

结果

疫苗没有诱导任何不可接受的部位或全身反应。表2中指示安乐死(第7天)之前的时段的攻击后数据。在攻击当天，第2组中的一只猪似乎是侏儒猪，并且决定不攻击该动物。由于接种疫苗，平均临床评分、攻击后死亡动物的数目以及允许从血液重新分离病原体的动物的数目得到显著改进。

表2：攻击后数据研究2

组	平均临床评分	攻击后死亡	阳性血液分离
				1	18	3/10	3/10
2	43	7/9	7/9

结论

总之，结果证明，通过仅施用一次IgM蛋白酶抗原，甚至当在接种疫苗后3周、断奶后2周和运输后立即攻击动物时，在25日龄的MDA阳性小猪中也可以诱导针对猪链球菌的致病性感染的足够的保护。尽管已经用250 µg的剂量证明这一点，但由于实施例1显示该抗原能够在低至4.4 µg的抗原剂量下，诱导相同或更强水平的保护，甚至最佳水平的保护，因此理解，当目的在于用120 µg或以下的剂量在MDA阳性小猪中进行保护时，获得相当的结果。

Claims (8)

1.疫苗，其包含免疫有效量的猪链球菌的IgM蛋白酶抗原，所述疫苗用于通过仅施用一次所述疫苗来针对猪链球菌的致病性感染保护猪的方法中，其中所述疫苗每剂包含最多120μg所述抗原。

2.根据权利要求1所用的疫苗，其特征在于，所述方法包括将所述疫苗施用于最多28日龄的猪。

3.根据前述权利要求中任一项所用的疫苗，其特征在于，所述方法包括在所述猪断奶的日龄之前施用所述疫苗。

4.根据前述权利要求中任一项所用的疫苗，其特征在于，所述方法包括将所述疫苗施用于具有母体来源的抗猪链球菌抗体的猪。

5.根据前述权利要求中任一项所用的疫苗，其特征在于，所述方法用于赋予针对与猪链球菌的致病性感染相关的死亡的保护。

6.根据前述权利要求中任一项所用的疫苗，其特征在于，所述方法用于赋予针对与猪链球菌的致病性感染相关的临床体征的保护。

7.猪链球菌的IgM蛋白酶抗原用于制备疫苗的用途，所述疫苗用于通过仅施用一次所述疫苗而针对猪链球菌的致病性感染保护猪，其中所述疫苗每剂包含最多120μg的免疫有效量的所述IgM蛋白酶抗原。

8.用于通过仅施用一次包含免疫有效量的猪链球菌的IgM蛋白酶抗原的疫苗来针对猪链球菌的致病性感染保护猪的方法，其中所述疫苗每剂包含最多120μg所述抗原。