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Die vorliegende Erfindung betrifft eine Impfstoffformel, die die Impfung von Hunden gegen zahlreiche Infektionskrankheiten, insbesondere gegen das Tollwutvirus zulässt. Sie betrifft auch ein entsprechendes Impfverfahren.
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Die Infektionspathologie der Hunde ist äußerst unterschiedlich und aufgrund der jeweiligen Umstände in dem Bereich häufig schwer zu kontrollieren.
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Es gibt bereits eine gewisse Anzahl von Impfstoffen, insbesondere gegen die Carré'sche Krankheit (CDV-Virus), die Parvovirose (CPV-Virus), die Coronavirose (CCV-Virus), Erkrankungen des Respirationstrakts oder den Zwingerhusten (PI2-Virus) und die Tollwut (Rhabdovirus). Diese Impfstoffe sind ganz allgemein Lebendimpfstoffe, die aus abgeschwächten Stämmen bestehen. Dies ist insbesondere für die Impfstoffe der Carré'schen Krankheit, die Impfstoffe gegen die Hunde-Adenovirosen, die Impfstoffe gegen die Parvovirose und die Impfstoffe gegen das Hunde-Coronavirus der Fall.
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In bestimmten Fällen wurden auch inaktivierte Impfstoffe vorgeschlagen, wie für die Tollwut und die Coronavirose.
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Diese unterschiedlichen Impfstoffe werden entweder getrennt, d. h. entweder in Form monovalenter Impfstoffe, oder in Form kombinierter Impfstoffe, d. h. polyvalenter Impfstoffe, vertrieben.
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Bei den bis heute entwickelten polyvalenten Kombinationen gab es immer Kompatibilitätsprobleme bei den Valenzen und der Stabilität. Man muss nämlich die Kompatibilität zwischen den verschiedenen Valenzen des Impfstoffes, in Bezug auf die verschiedenen verwendeten Antigene und in Bezug auf die Formulierungen selbst, gleichzeitig sicherstellen, insbesondere im dem Fall, in dem man gleichzeitig inaktivierte Impfstoffe und Lebendimpfstoffe kombiniert. Es stellt sich auch das Problem der Konservierung solcher kombinierten Impfstoffe und insbesondere auch ihrer Unbedenklichkeit in Gegenwart eines Adjuvans. Diese Impfstoffe sind im Allgemeinen sehr teuer.
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Ferner können das Ausmaß der Schutzwirkung und die Dauer dieses Schutzes sehr unterschiedlich und auch sehr empfindlich gegenüber Umgebungsbedingungen sein. Dies trifft insbesondere auf die Impfung der Welpen zu, bei denen sich die Antikörper mütterlichen Ursprungs gegen die Immunisierung durch inaktivierte Impfstoffe und sogar gegen Lebendimpfstoffe richten.
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Es kann daher wünschenswert sein, die Impfung von Canidae und insbesondere von Hunden weiter zu entwickeln, wobei man insgesamt auf die ökonomischen Zwänge achten muss, die der Verwendung von teuren Impfstoffen oder einer komplexen Umsetzung entgegenstehen.
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Impfversuche gegen die Carré'sche Krankheit mit gereinigten Fusion-F-Antigenzubereitungen und Hämagglutinin-H-Äquivalenten in komplettem Freud'schen Adjuvans legten nahe, dass das Antigen F zum Schutz gegen das CDV-Virus (E. Norrby et al., J. of Virol. Mai 1986: 536–541) ein Immunogen von Interesse für einen Untereinheiten-Impfstoff sein könnte.
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Ein anderer Artikel (P. de Vries et al., J. Gen. Virol. 1988, 69: 2071–2083) legt dagegen nahe, dass die Proteine F und HA von CDV in einem Impfstoff nach dem Verfahren der immunstimulierenden Komplexe (ISCOMS) interessant sein könnten.
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Mäuse, die mit einem rekombinanten Impfstoff immunisiert wurden, bei dem das Gen von Protein F von CDV exprimiert wird, waren gegen den Challenge mit diesem Virus geschützt.
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Es handelt sich dabei jedoch um Laborergebnisse, die schwer zu interpretieren sind, vor allem im Hinblick auf die Umgebungsbedingungen.
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Was die Parvoviren anbelangt, konnten die Versuche mit Untereinheiten-Impfstoffen, die das Hauptprotein des Capsids VP2 des CPV-Virus umfassen, das durch genetische Rekombination im Baculovirus erhalten wurde, einen Schutz der Hunde zeigen, die so gegen einen Challenge durch das CPV-Virus immunisiert wurden.
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Was das CHV-Hundeherpesvirus anbelangt, wurden Studien unter Verwendung von Glycoproteinen als Komponente von Untereinheit-Impfstoffen durchgeführt. Diese Studien zeigten die Induktion von Kreuzreaktionen mit anderen Herpesviren wie FHV, aber sie lassen keinen Schluss auf die Möglichkeiten zu, einen schützenden Impfstoff herzustellen.
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Bei der Lyme-Erkrankung induzieren kombiniertes OspA und OspB einen Schutz bei der Maus und dem Hund und OspA alleine bei der Maus, dem Hamster und dem Hund. Die Patentanmeldungen
WO-A-90 11092 ,
WO-A-93 19183 ,
WO-A-94 21797 und
WO-A-95 20660 machten Gebrauch von der kürzlich entwickelten Technik der Polynucleotidimpfstoffe. Man weiß, dass diese Impfstoffe ein Plasmid nutzen, um das in das Plasmid eingebaute Antigen in den Wirtszellen zu exprimieren. Alle Verabreichungswege wurden vorgeschlagen (intraperitoneal, intravenös, intramuskulär, transcutan, intradermal, über die Schleimhaut, usw.). Es können auch verschiedene Impfmittel wie DNA verwendet werden, die auf der Oberfläche von Goldpartikeln aufgebracht ist, in die Haut des Tieres geschossen wird und dort eindringt, (Tang et al., Nature 356, 152–154, 1992), und die Injektoren mit einem Flüssigkeitsstrahl ermöglichen die gleichzeitige Transfektion in der Haut, im Muskel, im Fettgewebe und im Mammagewebe (Furth et al., Analytical Biochemistry, 205, 365–368, 1992).
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Bei den Polynucleotidimpfstoffen kann sowohl nackte DNA als auch DNA verwendet werden, die beispielsweise in Liposomen oder kationischen Lipiden formuliert ist.
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Der Stand der Technik liefert dagegen keine Befunde, dass Hunde gegen diese Erkrankungen durch das Verfahren der Polynucleotidimpfung geschützt werden. Es ist auch viel weniger über den Hunde-Coronavirus CCV und die verantwortlichen Krankheitserreger des Respirationstraktes bekannt.
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Was die Tollwut anbelangt, wurde ein Schutz von Mäusen gegen eine Virusprobe nach einer Behandlung mit einem Polynucleotidimpfstoff gezeigt, der das Gen für das Protein G unter der Kontrolle des frühen Promotors des SV-40-Virus exprimiert (Xiang et al., Virology 199, 1994: 132–140), wobei ein ähnliches Ergebnis unter Verwendung des IE-Promotors von CMV erhalten wurde.
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Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Plasmids, das das Gen G des Tollwutvirus enthält und exprimiert, und eines geeigneten Trägers zur Herstellung eines Impfstoffs für die Impfung der Hundespezies gegen Tollwut.
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Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines Plasmids, das das Antigen G des Tollwutvirus enthält und exprimiert, und eines geeigneten Trägers zur Herstellung eines Impstoffs, der eine schützende Anwort bei den Canidae induziert, um die Hundespezies gegen das Tollwutvirus in Kombination mit einem Lebend-Vollimspfstoff oder einem inaktivierten Vollimpfstoff, einem rekombinanten Impfstoff oder einem Untereinheit-Impfstoff zu impfen, der gegen eine andere Hundekrankheit gerichtet ist.
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Beschrieben wird eine Impfformel für einen monovalenten oder multivalenten Impfstoff, mit dem eine Impfung von Hunden gegen eine bestimmte Anzahl von Krankheitserregern sichergestellt werden kann.
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Es wird eine derartige Impfformel beschrieben, die mit verschiedenen Valenzen assoziiert ist, wobei alle die erforderlichen Kompatibilitäts- und Stabilitätskriterien der Valenzen aufweisen.
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Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe besteht darin, eine derartige Impfformel bereitzustellen, mit der verschiedene Valenzen in demselben Vehikel kombiniert werden können.
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Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe besteht darin, eine derartige Impfformel bereitzustellen, die sowohl einfach umzusetzen ist, als auch wenig kostet.
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Ebenfalls beschrieben wird ein Impfverfahren, das die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Impfstoffes beträchtlich erhöhen oder die erforderliche Impfmenge stark verringern kann und eine gute Verträglichkeit aufweist.
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Das vorliegende Dokument beschreibt auch eine Impfformel gegen Hundekrankheitserreger, umfassend mindestens zwei Valenzen des Impfstoffes, umfassend jeweils ein eingebautes Plasmid, so dass in den Hundezellen ein Gen einer Valenz des Hundekrankheitserregers in vivo exprimiert wird, und zwar eine Virusvalenz der Carré'schen Krankheit CDV und eine Valenz des Hunde-Parvovirus CPV, wobei die Plasmide für jede Valenz ein oder mehrere Gene umfassen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus HA und F für den Virus der Carré'schen Krankheit und das Gen VP2 für das Hunde-Parvovirus.
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Vorzugsweise werden für die Valenz der Carré'schen Krankheit das oder die Plasmide, die die Gene HA und F tragen, entweder in dasselbe Plasmid oder in unterschiedliche Plasmide eingebaut.
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Es wird auch ein multivalenter Impfstoff beschrieben, der auch eine Valenz des Hunde-Coronavirus CCV mit einem Plasmid oder Plasmiden umfassen kann, umfassend ein oder mehrere Gene, ausgewählt aus der Gruppe der Gene S und M und vorzugsweise das Gen S oder die Gene S und M. Dort können die Gene auch in verschiedene Plasmide eingebaut werden oder in demselben Plasmid neu angeordnet werden in einem Rahmen, der ihre Expression zulässt. Der vorstehend erwähnte di- oder trivalente Impfstoff kann ferner auch eine Valenz umfassen, die für den Schutz des Respirationstraktes wirksam ist, und zwar eine Valenz von PI2, umfassend ein Plasmid oder Plasmide, die mindestens eines der Gene HA und F umfassen. Bevorzugt ist die Verwendung beider Gene HA und F.
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Im Falle der vorliegenden Erfindung können daher weitere interessante Valenzen mit erfindungsgemäßen Impfstoffen kombiniert werden, und zwar eine oder mehrere Valenzen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus der CHV-Herpesvirose, der Lyme-Erkrankung und der Tollwut, wobei die Plasmide für jede Valenz ein oder mehrere der Gene umfassen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Genen gB, gD für den Virus CHV, den Genen OspA, OspB und p100 für B. Burgdorferi (Lyme-Erkrankung) und dem Gen G für die Tollwut.
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Vorzugsweise kombiniert man bei der Herpesvirose die beiden Gene gB und gD entweder in zwei getrennten Plasmiden oder in einem einzigen Plasmid. Bei der Lyme-Erkrankung bevorzugt man das Gen OspA.
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Ebenfalls beschrieben wird ein Impfstoff, der die Valenzen der Carré'schen-Krankheit und der Parvovirose umfasst und der als andere Valenz die Coronavirose-Valenz oder weniger bevorzugt die Valenz für die Erkrankung des Respirationstrakts oder diese beiden Valenzen umfasst, wobei jede Kombination, die eine, mehrere oder alle Valenzen der Coronavirose, der Erkrankung des Respirationstrakts, der Herpesvirose, der Lyme-Erkrankung und Tollwut umfasst, selbstverständlich mit den beiden Valenzen der Carré'schen-Krankheit und Parvovirose kombiniert sein kann.
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In der vorliegenden Erfindung versteht man unter Valenz mindestens ein Antigen, das einen Schutz gegen das Virus des in Frage kommenden Krankheitserregers sicherstellt, wobei die Valenz als Untervalenz ein oder mehrere natürliche oder modifizierte Gene eines oder mehrerer Stämme des in Frage kommenden Krankheitserregers enthalten kann.
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Unter dem Gen des Krankheitserregers versteht man nicht nur das vollständige Gen, sondern auch verschiedene Nucleotidsequenzen, darin umfasst Fragmente, die die Fähigkeit, eine Schutzreaktion zu induzieren, bewahren. Der Begriff des Gens umfasst die Nucleotidsequenzen, die denjenigen entsprechen, die genau in den Beispielen beschrieben werden, d. h. verschiedene Sequenzen, die jedoch dasselbe Protein codieren. Er umfasst auch die Nucleotidsequenzen anderer Stämme der in Frage kommenden Krankheitserreger, die einen Kreuzschutz oder einen für den Stamm oder die Stammgruppe spezifischen Schutz sicherstellen. Er umfasst auch Nucleotidsequenzen, die modifiziert wurden, um die in-vivo-Expression durch das Wirtstier zu erleichtern, die jedoch dasselbe Protein codieren.
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Die verschiedenen Valenzen sind in der erfindungsgemäßen Impfformel in therapeutisch wirksamer Menge enthalten.
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Vorzugsweise kann die erfindungsgemäße Impfformel in einem geeigneten Vehikel zur Verabreichung über den vorzugsweise intramuskulären Weg in einem Dosisvolumen, das zwischen 0,1 und 5 ml vorzugsweise zwischen 0,5 und 2 ml liegt, vorliegen.
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Die Dosis liegt im Allgemeinen zwischen 10 ng und 1 mg, vorzugsweise zwischen 100 ng und 500 μg und stärker bevorzugt zwischen 1 μg und 250 μg pro Plasmidtyp.
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Es werden vorzugsweise nackte Plasmide verwendet, die einfach in das Impfvehikel eingebracht werden, das im Allgemeinen als physiologische Kochsalzlösung (0,9% NaCl), ultrareines Wasser, TE-Puffer etc. vorliegt. Man kann selbstverständlich alle im Fachgebiet beschriebenen Polynucleotidimpfstoffformen verwenden.
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Jedes Plasmid umfasst einen Promotor, der die Expression des eingebauten Gens unter seiner Abhängigkeit in den Wirtszellen sicherstellen kann. Es handelt sich dabei im Allgemeinen um einen starken eukaryontischen Promotor und insbesondere um einen frühen Promotor des Cytomegalievirus CMV-IE mit menschlichem oder Maus-Ursprung oder auch gegebenenfalls mit einem anderen Ursprung wie der Ratte, dem Schwein und dem Meerschweinchen.
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Ganz allgemein kann der Promotor entweder viralen Ursprungs oder zellulären Ursprungs sein. Als Viruspromotor, der ein anderer als CMV-IE ist, kann man den frühen oder späten Promotor des SV40-Virus oder den LTR-Promotor des Rous-Sarkom-Virus nennen. Es kann sich dabei auch um einen Viruspromotor handeln, der vom Gen stammt, beispielsweise der dem Gen eigene Promotor.
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Als zellulären Promotor kann man den Promotor eines Zytoskelett-Gens nennen, wie beispielsweise den Desmin-Promotor (Bolmont et al., Journal of Submicroscopic Cytology and Pathology, 1990, 22, 117–122 und ZHENLIN et al., Gene, 1989, 78, 243–254) oder auch den Actin-Promotor.
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Wenn mehrere Gene in demselben Plasmid vorliegen, können diese in derselben Transkriptionseinheit oder in zwei verschiedenen Einheiten vorliegen.
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Die Kombination der verschiedenen erfindungsgemäßen Impfvalenzen kann beispielsweise durch Mischen der Polynucleotidplasmide erfolgen, die das Antigen oder die Antigene jeder Valenz exprimieren, aber man kann auch Antigene mehrerer Valenzen durch dasselbe Plasmid exprimieren lassen.
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Es wird auch ein Impfverfahren für Hunde beschrieben, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Dosis einer Impfstoffformel wie diejenige, die vorstehend beschrieben wurde. Dieses Impfverfahren umfasst die Verabreichung einer oder mehrere Dosen der Impfstoffformel, wobei diese Dosen nacheinander in einer kurzen Zeitspanne und/oder nacheinander in größeren Abständen eine nach der anderen verabreicht werden können.
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Die erfindungsgemäßen Impfstoffformeln können im Rahmen dieses Impfverfahrens über verschiedene im Fachgebiet vorgeschlagene Verabreichungswege im Falle der Polynucleotidimpfung und mittels bekannter Verabreichungsverfahren verabreicht werden, wobei der bevorzugte Weg der intramuskuläre Weg ist.
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Die Wirksamkeit der Antigenpräsentation im Immunsystem variiert mit der Gewebefunktion. Insbesondere die Schleimhäute des Respirationstraktes dienen als Eintrittsbarriere für die Krankheitserreger und sind mit dem Lymphgewebe assoziiert, das eine örtliche Immunität unterstützt. Die Verabreichung eines Impfstoffes durch den Kontakt mit den Schleimhäuten, insbesondere der Mundschleimhaut, der Pharynxschleimhaut und dem Bronchialbereich stellt ein bestimmtes Interesse für die Impfung gegen Krankheitserreger des Respirations- und Verdauungstraktes dar.
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Folglich sind die Verabreichungswege über die Schleimhäute Teil eines der erfindungsgemäßen Verabreichungswege, der insbesondere die Vernebelung mit einem Spray oder das Trinkwasser nutzt. Die erfindungsgemäßen Impfstoffformeln und Impfverfahren können in diesem Rahmen angewandt werden.
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Beschrieben werden auch monovalente Impfstoffformeln, umfassend ein oder mehrere Plasmide, die ein oder mehrere Gene der nachstehenden Viren codieren, wobei die Gene diejenigen sind, die vorstehend beschrieben wurden. Abgesehen von ihrem monovalenten Charakter, können diese Formeln im Hinblick auf die Wahl der Gene, deren Kombinationen, die Zusammensetzung der Plasmide, die Dosisvolumina, die Dosen etc. die vorstehenden dargelegten Merkmale aufweisen.
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Die monovalenten Impfstoffformeln können verwendet werden (i) für die Zubereitung einer polyvalenten Impfstoffformel, wie diejenige, die vorstehend beschrieben wurde, (ii) als Einzelimpfstoff gegen die spezifische Pathologie, (iii) kombiniert mit einem anderen Impfstofftyp (Lebend-Vollimpfstoff oder inaktivierter Impfstoff, rekombinanter Impfstoff oder Untereinheiten-Impfstoff) gegen eine andere Pathologie oder (iv) als Auffrischungsimpfstoff, wie nachstehend beschrieben.
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Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung eines oder mehrerer erfindungsgemäßer Plasmide zur Herstellung eines Hunde-Impfstoffes der zur Impfung von erstgeimpften Tieren mittels eines ersten klassischen Impfstoffes (monovalent oder multivalent), wie diejenigen aus dem Stand der Technik, bestimmt ist, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Lebend-Vollimpfstoff, inaktiviertem Vollimpfstoff, Untereinheiten-Impfstoff, rekombinantem Impfstoff, wobei in diesem ersten Impfstoff das Antigen oder die Antigene vorliegt/vorliegen (d. h., enthalten ist/sind oder exprimiert werden kann/können), das/die von dem Plasmid oder den Plasmiden codiert wird/werden, oder das Antigen oder Antigene vorliegt/vorliegen, das/die einen Kreuzschutz sicherstellt/sicherstellen.
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Bemerkenswerterweise hat der Polynucleotidimpfstoff einen Auffrischungseffekt, der sich durch eine Verstärkung der Immunreaktion und der Bildung einer lang andauernden Immunität auswirken kann.
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Die Erstimpfstoffe können allgemein aus den im Handel bei verschiedenen Herstellern von Veterinärimpfstoffen erhältlichen Impfstoffen ausgewählt werden.
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Beschrieben wird auch das Impfverfahren, bestehend aus der Durchführung einer Erstimpfung wie diejenige, die vorstehend beschrieben wird, und einer Auffrischungsimpfung mit einer erfindungsgemäßen Impfstoffformel.
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In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens verabreicht man einem Tier das erste Mal eine wirksame Dosis eines Impfstoffs des klassischen Typs, insbesondere einen inaktivierten Impfstoff, einen Lebendimpfstoff, einen abgeschwächten oder rekombinanten Impfstoff oder auch einen Untereinheiten-Impfstoff, um eine Erstimpfung sicherzustellen und nach einer Zeitspanne von vorzugsweise 2 bis 6 Wochen stellt man die Impfung mit dem erfindungsgemäßen polyvalenten oder monovalenten Impfstoff sicher.
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Es wird auch ein Kit für die Impfungen beschrieben, der einen Impfstoff für die Erstimpfung, wie denjenigen, der nachstehend beschrieben wird, und eine erfindungsgemäße Impfformel für die Auffrischungsimpfung umfasst. Auch eine erfindungsgemäße Impfformel wird beschrieben, und zwar mit einer Anmerkung, die besagt, dass diese Formel als Auffrischung einer Erstimpfung, wie diejenige, die vorstehend beschrieben wurde, verwendet werden kann.
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Das vorliegende Dokument offenbart auch das Verfahren zur Herstellung der Impfstoffformeln, und zwar die Herstellung der Valenzen und ihrer Gemische, wie diejenige, die aus dieser Beschreibung hervorgeht.
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Die Erfindung kann nun detaillierter mit Hilfe von erfindungsgemäßen Ausführungsformen beschrieben werden, auf die in den Zeichnungen im Anhang Bezug genommen werden kann.
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Liste der Figuren
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1: Plasmid pVR1012
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2: Plasmid pAB044
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3: Plasmid pAB036
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4: Plasmid pAB024
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5: Plasmid pAB021
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6: Plasmid pAB022
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7: Plasmid pAB037
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8: Plasmid pAB038
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9: Plasmid pAB017
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10: Plasmid pAB041
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Sequenzliste SEQ ID NR
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- SEQ ID NR 1: Oligonucleotid AB017
- SEQ ID NR 2: Oligonucleotid AB018
- SEQ ID NR 3: Oligonucleotid AB085
- SEQ ID NR 4: Oligonucleotid AB086
- SEQ ID NR 5: Oligonucleotid AB053
- SEQ ID NR 6: Oligonucleotid AB054
- SEQ ID NR 7: Oligonucleotid AB045
- SEQ ID NR 8: Oligonucleotid AB048
- SEQ ID NR 9: Oligonucleotid AB049
- SEQ ID NR 10: Oligonucleotid AB050
- SEQ ID NR 11: Oligonucleotid AB087
- SEQ ID NR 12: Oligonucleotid AB088
- SEQ ID NR 13: Oligonucleotid AB089
- SEQ ID NR 14: Oligonucleotid AB090
- SEQ ID NR 15: Oligonucleotid AB038
- SEQ ID NR 16: Oligonucleotid AB039
- SEQ ID NR 17: Oligonucleotid AB011
- SEQ ID NR 18: Oligonucleotid AB012
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BEISPIELE
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Beispiel 1: Züchtung der Viren
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Die Viren werden in einem geeigneten Zellkultursystem gezüchtet, bis eine cytopathogene Wirkung auftritt. Die Zellkultursysteme, die für jedes Virus verwendet werden, sind dem Fachmann gut bekannt. Kurz gesagt, werden die geeigneten Zellen für den verwendeten Virus, die im essentiellen Eagle-Minimalmedium (MEM-Medium) oder einem anderen geeigneten Medium gezüchtet werden, mit dem untersuchten Virusstamm unter Verwendung der Infektionsmultiplizität von 1 beimpft. Die infizierten Zellen werden dann bei 37°C so lange inkubiert, bis eine vollständige cytopathogene Wirkung auftritt (durchschnittlich 36 Stunden).
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Beispiel 2: Züchtung der Bakterien
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Die Borrelia burgdorferi-Stämme werden in den geeigneten Medien und unter Bedingungen gezüchtet, die dem Fachmann gut bekannt sind. Diese Bedingungen und Medien werden insbesondere von A. Barbour (J. Biol. Med. 1984. 57. 71–75) beschrieben. Die Extraktion der bakteriellen DNA erfolgte nach den von W. Simpson et al. (Infect. Immun. 1990. 58. 847–853) beschriebenen Bedingungen. Die von J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor, New York) beschriebenen Verfahrenstechniken, können ebenfalls verwendet werden.
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Beispiel 3: Extraktion der genomischen Virus-DNA:
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Nach der Züchtung werden der Überstand und die lysierten Zellen geerntet und die gesamte Virussuspension wird 10 Minuten bei 1000 g und +4°C zentrifugiert, um die Zelltrümmer zu beseitigen. Die Viruspartikel werden dann durch 1-stündige Ultrazentrifugation bei 400.000 g und +4°C geerntet. Das Pellet wird in einem Minimalvolumen in Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA) wieder aufgenommen. Diese konzentrierte Virussuspension wird mit Proteinase K (Endkonzentration 100 μg/ml) in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (SDS) (0,5% Endkonzentration) 2 Stunden bei 37°C behandelt. Die Virus-DNA wird anschließend mit einem Phenol/Chloroformgemisch extrahiert, dann mit 2 Volumina absolutem Ethanol präzipitiert. Nach einer Nacht bei –20°C wird die DNA 15 Minuten bei 10.000 g und +4°C zentrifugiert. Das DNA-Pellet wird getrocknet, dann in einem Minimalvolumen ultrareinem, sterilem Wasser wieder aufgenommen. Sie kann dann mit Restriktionsenzymen gespalten werden.
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Beispiel 4: Isolierung der genomischen Virus-RNA
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Die RNA-Viren wurden nach den Verfahren gereinigt, die dem Fachmann bekannt sind. Die genomische Virus-RNA jedes Virus wurde anschließend unter Verwendung des von P. Chomczynski et N. Sacchi (Anal. Biochem. 1987. 162. 156–159) beschriebenen „Guanidium-Thiocyanat/Phenol-Chloroform”-Extraktionsverfahrens isoliert.
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Beispiel 5: Molekularbiologische Verfahren
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Die gesamte Plasmidkonstruktion erfolgte unter Verwendung molekularbiologischer Standardverfahren, die bei J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989) beschrieben werden. Alle bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Restriktionsfragmente werden unter Verwendung des ”Geneclean”-Kits (BiO1O1 Inc. La Jolla, CA) isoliert.
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Beispiel 6: RT-PCR Verfahren
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Die spezifischen Oligonucleotide (die an ihren 5'-Enden Restriktionsschnittstellen tragen, um die Clonierung der amplifizierten Fragmente zu erleichtern) wurden so synthetisiert, dass sie die gesamten codierenden Bereiche der Gene enthalten, bevor sie amplifiziert werden (vgl. spezifische Beispiele). Die reverse Transkriptionsreaktion (RT) und die Polymerasekettenreaktion (PCR) erfolgten nach den Standardverfahren (J. Sambrook et al. 1989). Jede RT-PCR-Reaktion erfolgte mit einem Paar spezifischer Amplimere und unter Verwendung der extrahierten genomischen Virus-RNA als Matrize. Die komplementäre amplifizierte DNA wurde vor der Spaltung mit Restriktionsenzymen mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) extrahiert.
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Beispiel 7: Plasmid pVR1012
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Das Plasmid pVR1012 (1) wurde von Vical Inc. San Diego, CA, USA erhalten. Seine Konstruktion wurde bei J. Hartikka et al. (Human Gene Therapy. 1996. 7. 1205–1217) beschrieben.
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Beispiel 8: Konstruktion des Plasmids pAB044 (CDV HA-Gen)
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Eine RT-PCR-Reaktion nach dem Verfahren von Beispiel 6 erfolgte mit genomischer DNA des Virus der Carré'schen-Krankheit (CDV) (Stamm: Onderstepoort) (M. Sidhu et al. Virology. 1993. 193. 66–72), hergestellt nach dem Verfahren von Beispiel 4 und mit folgenden Oligonucleotiden:
zur Isolierung des Gens, das das Glycoprotein HA von CDV in Form des PstI-BamHI-Fragments codiert. Nach der Reinigung wurde das RT-PCR-Produkt mit 1835 bp mit PstI und BamHI gespalten, um ein PstI-BamHI-Fragment mit 1817 bp zu isolieren. Dieses Fragment wurde mit dem Vektor pVR1012 (Beispiel 7) ligiert, der zuvor mit PstI und BamHI gespalten wurde, so dass sich das Plasmid pAB044 (6676 bp) (
2) ergibt.
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Beispiel 9: Konstruktion von Plasmid pAB036 (Gen CDV F)
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Eine RT-PCR-Reaktion nach dem Verfahren von Beispiel 6 erfolgte mit genomischer RNA des Virus der Carré'schen-Krankheit (CDV) (Stamm: Onderstepoort) (R. Driellen Hinterlegungsnummer der Sequenz in der Genbank = X65509), hergestellt nach dem Verfahren von Beispiel 4 und mit folgenden Oligonucleotiden:
zur Isolierung des Gens, das das Glycoprotein F von CDV in Form des NotI-BamHI-Fragments codiert. Nach der Reinigung wurde das RT-PCR-Produkt mit 2018 bp mit NotI und BamHI gespalten, um ein NotI-BamHI-Fragment mit 2000 bp zu isolieren. Dieses Fragment wurde mit dem Vektor pVR1012 (Beispiel 7) ligiert, der zuvor mit NotI und BamHI gespalten wurde, so dass sich das Plasmid pAB036 (6893 bp) (
3) ergibt.
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Beispiel 10: Konstruktion von Plasmid pAB024 (Hunde-Parvovirus-Gen VP2)
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Eine PCR-Reaktion erfolgte mit genomischer DNA des Hunde-Parvo-Virus (CVP) (Stamm CVP-b) (C. Parrish Hinterlegungsnummer der Sequenz in der Genbank = M19296), hergestellt nach dem Verfahren von Beispiel 3 und mit folgenden Oligonucleotiden:
zur Isolierung des Gens, das das Capsidprotein VP2 (CPV VP2) in Form des SalI-BamHI-Fragments codiert. Nach der Reinigung wurde das PCR-Produkt mit 1773 bp mit SalI und BamHI gespalten, um ein SalI-BamHI-Fragment mit 1760 bp zu isolieren. Dieses Fragment wurde mit dem Vektor pVR1012 (Beispiel 7) ligiert, der zuvor mit SalI und BamHI gespalten wurde, so dass sich das Plasmid pAB024 (6629 bp) (
4) ergibt.
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Beispiel 11: Konstruktion von Plasmid pAB021 (Gen CCV S)
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Eine RT-PCR-Reaktion nach dem Verfahren von Beispiel 6 erfolgte mit genomischer RNA des Hunde-Cornonavirus (CCV) (B. Horsburgh et al. J. Gen. Virol. 1992. 73. 2849–2862), hergestellt nach dem Verfahren von Beispiel 4 und mit folgenden Oligonucleotiden:
zur Amplifikation eines 4374 bp-Fragments, das das Glycoprotein S von CCV in Form eines SalI-BamHI-Fragments codiert. Nach der Reinigung wurde das RT-PCR-Produkt mit SalI und BamHI gespalten, so dass sich ein SalI-BamHI-Fragment mit 4361 bp ergibt.
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Dieses Fragment wurde mit dem Vektor pVR1012 (Beispiel 7) ligiert, der zuvor mit SalI und BamHI gespalten wurde, so dass sich das Plasmid pAH021 (9230 bp) (5) ergibt.
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Beispiel 12: Konstruktion von Plasmid pAB022 (Gen CCV M)
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Eine RT-PCR-Reaktion nach dem Verfahren von Beispiel 6 erfolgte mit genomischer RNA des Hunde-Cornonavirus (CCV) (B. Horsburgh et al. J. Gen. Virol. 1992. 73. 2849–2862), hergestellt nach dem Verfahren von Beispiel 4 und mit folgenden Oligonucleotiden:
zur Isolierung des Gens, das das Glycoprotein M (CCV M) in Form eines PstI-BamHI-Fragments codiert. Nach der Reinigung wurde das RT-PCR-Produkt mit 809 bp mit PstI und BamHI gespalten, um ein PstI-BamHI-Fragment mit 792 bp zu isolieren. Dieses Fragment wurde mit dem Vektor pVR1012 (Beispiel 7) ligiert, der zuvor mit PstI und BamHI gespalten wurde, so dass sich das Plasmid pAH022 (5651 bp) (
6) ergibt.
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Beispiel 13: Konstruktion von Plasmid pAB037 (Gen CHV gB)
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Eine PCR-Reaktion erfolgte mit genomischer DNA des Hunde-Herpesvirus (CHV) (Stamm Carmichael) (K. Limbach et al. J. Gen. Virol. 1994. 75. 2029–2039), hergestellt nach dem Verfahren von Beispiel 3 und mit folgenden Oligonucleotiden:
zur Isolierung des Gens, das das Glycoprotein gB des CHV-Virus in Form eines PstI-XbaI-Fragments codiert. Nach der Reinigung wurde das PCR-Produkt mit 2667 bp mit PstI und XbaI gespalten, um ein PstI-XbaI-Fragment mit 2648 bp zu isolieren. Dieses Fragment wurde mit dem Vektor pVR1012 (Beispiel 7) ligiert, der zuvor mit PstI und XbaI gespalten wurde, so dass sich das Plasmid pAB037 (7523 bp) (
7) ergibt.
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Beispiel 14: Konstruktion von Plasmid pAB038 (Gen CHV gD)
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Eine PCR-Reaktion erfolgte mit genomischer DNA des Hunde-Herpesvirus (CHV) (Stamm Carmichael) (K. Limbach et al. J. Gen. Virol. 1994. 75. 2029–2039), hergestellt nach dem Verfahren von Beispiel 3 und mit folgenden Oligonucleotiden:
zur Isolierung des Gens durchgeführt, das das Glycoprotein gD des CHV-Virus in Form eines PstI-NotI-Fragments codiert. Nach der Reinigung wurde das PCR-Produkt mit 1072 bp mit PstI und NotI gespalten, um ein PstI-NotI-Fragment mit 1049 bp zu isolieren. Dieses Fragment wurde mit dem Vektor pVR1012 (Beispiel 7) ligiert, der zuvor mit PstI und NotI gespalten wurde, so dass sich das Plasmid pAB037 (5930 bp) (
8) ergibt.
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Beispiel 15: Konstruktion von Plasmid pAB017 (Borrelia burgdorferi ospA-Gen)
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Eine PCR-Reaktion erfolgte mit genomischer DNA von Borrelia burgdorferi (Stamm B31) (S. Bergstrom et al. Mol. Microbiol. 1989. 3. 479–486), hergestellt nach dem Verfahren von Beispiel 2 und mit folgenden Oligonucleotiden:
zur Isolierung des Gens, das das Membranprotein OspA in Form eines SalI-BamHI-Fragments codiert. Nach der Reinigung wurde das PCR-Produkt mit 842 bp mit SalI und BamHI gespalten, um ein SalI-BamHI-Fragment mit 829 bp zu isolieren. Dieses Fragment wurde mit dem Vektor pVR1012 (Beispiel 7) ligiert, der zuvor mit SalI und BamHI gespalten wurde, so dass sich das Plasmid pAB017 (5698 bp) (
9) ergibt.
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Beispiel 16: Konstruktion von Plasmid pAB041 (Gen G des Tollwutvirus)
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Eine RT-PCR-Reaktion nach dem Verfahren von Beispiel 6 erfolgte mit genomischer RNA des Tollwutvirus (Stamm ERA) (A. Anilionis et al. Nature. 1981. 294. 275–278), hergestellt nach dem Verfahren von Beispiel 4 und mit folgenden Oligonucleotiden:
zur Amplifikation eines Fragments von 1589 bp, das das Gen enthält, das das Glycoprotein G des Tollwutvirus codiert. Nach der Reinigung wurde das RT-PCR-Produkt mit PstI und BamHI gespalten, so dass sich ein PstI-BamHI-Fragment mit 1578 bp ergibt. Dieses Fragment wurde mit dem Vektor pVR1012 (Beispiel 7) ligiert, der zuvor mit PstI und BamHI gespalten wurde, so dass sich das Plasmid pAB041 (6437 bp) (
10) ergibt.
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Beispiel 17: Herstellung und Reinigung der Plasmide
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Zur Herstellung der für die Impfung von Tieren bestimmten Plasmide kann man jedes Verfahren verwenden, mit dem man eine gereinigte Plasmidsuspension erhalten kann, die hauptsächlich in Supercoil-Form vorliegt. Diese Verfahren sind dem Fachmann gut bekannt. Man kann insbesondere das Verfahren der alkalischen Lyse nennen, auf das zwei Ultrazentrifugationsschritte im Cäsiumchloridgradienten in Gegenwart von Ethidiumbromid folgen, wie bei J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989) beschrieben. Man kann auch auf die Patenanmeldungen PCT
WO 95/21250 und PCT
WO 96/02658 Bezug nehmen, die Verfahren zur Herstellung der verwendbaren Plasmide für die Impfung im industriellen Maßstab beschreiben. Für die Anforderungen der Herstellung der Impfstoffe (vgl. Beispiel 17) werden die gereinigten Plasmide so resuspendiert, dass man hochkonzentrierte Lösungen erhält (> 2 mg/ml), die vereinbar sind mit ihrer Lagerung. Zur Durchführung werden die Plasmide entweder in ultrareinem Wasser oder in TE-Puffer (10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH 8,0) resuspendiert.
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Beispiel 18: Herstellung von kombinierten Impfstoffen
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Die verschiedenen Plasmide, die zur Herstellung von kombinierten Impfstoffen erforderlich sind, werden aus ihren konzentrierten Lösungen (Beispiel 16) gemischt. Das Mischen erfolgt so, dass die Endkonzentration jedes Plasmids der wirksamen Dosis jedes Plasmids entspricht. Die verwendbaren Lösungen zur Einstellung der Endkonzentration des Impfstoffes können entweder eine 0,9%-ige NaCl-Lösung oder ein PBS-Puffer sein.
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Besondere Formulierungen wie Liposomen und kationische Lipide können ebenfalls zur Herstellung der Impfstoffe verwendet werden.
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Beispiel 19: Impfung der Hunde
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Die Hunde werden mit 10 μg-, 50 μg- oder 250 μg-Dosen pro Plasmid geimpft.
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Die Injektionen können mit der Injektionsnadel über den intramuskulären Weg erfolgen. In diesem Fall werden die Impfdosen in 1 ml- oder 2 ml-Volumen verabreicht. Die Injektionen können mit der Injektionsnadel über den intradermalen Weg erfolgen. In diesem Fall werden die Impfdosen in 1 ml Gesamtvolumen in 10-er Schritten zu 0,1 ml oder in 20-er Schritten zu 0,05 ml verabreicht. Die intradermalen Injektionen erfolgen, nachdem die Haut rasiert wurde (im Allgemeinen der Thoraxflanke) oder in einem anatomischen Bereich, der relativ fellfrei ist, beispielsweise im inneren Schenkelbereich. Man kann für die intradermalen Injektionen auch einen Injektor mit einem Flüssigkeitsstrahl verwenden.