DE60315858T2 - Ihnv g fusionsprotein für die immunstimulation - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer neuen Klasse von Impfstoffen zur Verhinderung von Infektionskrankheiten, insbesondere bei Fischen. Die Erfindung betrifft auch einen Impfstoff, der einen Teil der Nucleinsäuresequenz einschließt, die das G-Protein von IHNV (Infectious Haematopoietic Necrosis Virus) codiert, und einen Teil der Nucleinsäuresequenz, die ein zweites Peptid codiert, wobei das zweite Peptid aus einem Pathogen stammt.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Rekombinante Impfstoffe werden gelegentlich in der Human- und Veterinärmedizin als Alternative zu traditionelleren Ansätzen auf der Grundlage von abgetöteten oder abgeschwächten Pathogenen eingesetzt. Viele Fremdantigene, die auf diese Weise systemisch an den Körper abgegeben werden, sind in der Lage, nur einen Zweig des Immunsystems zu aktivieren, durch Stimulierung der humoralen Immunantwort, um Antikörper durch den Haupthistokompatibilitätskomplex-(MHC)-Klasse-II-Weg zu erzeugen. Ein idealer Impfstoff sollte auch eine Zellantwort durch Zerstörung von infizierten Zellen über eine Aktivierung des MHC-Klasse-I-Weges induzieren. Letztere Antwort wird durch den zytosolischen Abbau von Fremdprotein in infizierten Zellen erreicht, derart, dass Fragmente des Fremdmaterials mit MHC-Klasse-I-Molekülen assoziiert und zur Zelloberfläche zur Präsentation gegenüber CD8+ zytotoxischen T-Zellen (CTL) transportiert werden.
  • Nucleinsäureimpfstoffe (NAVs) sind eine relativ neue Form der Technik, die zur Abgabe von pathogenen Antigenen, insbesondere viralen Antigenen, geeignet sind. Da die viralen Proteine, die von den Impfstoffen codiert werden, in situ durch den Zellapparat des Wirtes exprimiert werden, legt die Theorie nahe, dass sie eine zellvermittelte Immunantwort auslösen sollten, die in der Lage ist, Tiere bei Provokation zu schützen. Allerdings waren die Ergebnisse durchwachsen: Bei Fischen sind NAVs, die das Infectious Haematopoietic Necrosis Virus (IHNV)-G-Protein (Oberflächenglycoprotein) und das Viral Haemorrhagic Septicaemia Virus-G-Protein exprimieren, gegen IHNV- bzw. VHSV-Infektionen wirksam. Es war allerdings bisher schwierig, einen überzeugenden Schutz von Fischen unter Verwendung von NAVs auf der Grundlage von anderen viralen Antigenen zu zeigen.
  • Beispielsweise führten Boudinot et al. (1998), Virology 249, 297–306, Doppelimmunisierungen durch Coexpression von G-Proteinen von IHNV und VHSV auf getrennten Plasmiden durch. Die Kinetik und Intensität der Antwort auf die Kombination von G-Proteinen war denjenigen ähnlich, die durch Expression eines einzigen G-Proteins induziert wurden.
  • Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, verbesserte Impfstoffe bereitzustellen, die gegen eine Vielzahl von Krankheiten in Fischen und anderen Tieren wirksam sind, die durch Infektion mit Pathogenen hervorgerufen werden.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Bei einem ersten Aspekt stellt die Erfindung einen Expressionsvektor, der einen Teil der IHNV-G-Protein-codierenden Nucleinsäuresequenz einschließt, die im Raster mit einem Teil einer zweiten Protein-codierenden Sequenz fusioniert ist, aus einem pathogenen Organismus, der anders ist als IHNV, bereit. Der Teil des IHNV-G-Proteins ist gegebenenfalls die isolierte Leadersequenz des IHNV-G-Proteins. Das zweite Protein ist vorzugsweise ein Antigen aus einem Pathogen oder Fisch, gegebenenfalls ein Virus. Der Teil der IHNV-G-Protein-codierenden Sequenz ist mit der zweiten Protein-codierenden Sequenz fusioniert.
  • Die Erfindung stellt auch eine Impfstoffzusammensetzung bereit, die einen ersten Expressionsvektor, der einen Teil der IHNV-G-Protein-codierenden Nucleinsäuresequenz, die im Raster mit einem Teil der codierenden Nucleinsäuresequenz eines zweiten Antigens fusioniert ist, das anders ist als ein Antigen von IHNV, die auf dem ersten Expressionsvektor getragen wird, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger einschließt. Bei einer Ausführungsform schließt die Impfstoffzusammensetzung ein Adjuvans ein.
  • Bei einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung einer Zusammensetzung bei der Herstellung eines Medikaments zur Prävention oder Behandlung einer Infektionskrankheit in einem Tier bereit, wobei die Zusammensetzung einen ersten Expressionsvektor einschließt, der einen Teil der THG-IHNV-Protein-codierenden Sequenz einschließt, die im Raster mit einem Teil einer zweiten Protein-codierenden Sequenz aus einem pathogenen Organismus fusioniert ist, der für die Infektionskrankheit verantwortlich ist, wobei IHNV kein kausatives Mittel der Infektionskrankheit ist.
  • Bei einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung einer Zusammensetzung bei der Herstellung eines Medikaments zur Prävention oder Behandlung einer Infektionskrankheit bei Fischen bereit, die anders ist als IHNV, wobei die Zusammensetzung einen Teil der IHNV-G-Protein-codierenden Sequenz und weiterhin einen Teil einer zweiten Protein-codierenden Sequenz aus einem für die Infektionskrankheit verantwortlichen pathogenen Organismus, die auf den gleichen Expressionsvektor getragen wird. einschließt.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Die Erfindung beruht auf der Feststellung, dass die Gegenwart des IHNV-G-Proteins oder seiner Leadersequenz (auch als Signalsequenz bezeichnet), die aus einem Nucleinsäureimpfstoff im Raster mit einem zweiten Antigen exprimiert wird, die Immunantwort verstärken kann, und dadurch den Schutz gegen das Pathogen, aus dem das zweite Antigen stammt, verbessert. Die Erklärung für diese Wirkung wurde bisher noch nicht gefunden, allerdings kann sie die Existenz von immunstimulatorischen Einheiten auf dem G-Protein betreffen. Es ist auch plausibel, dass die Fusion des antigenischen Proteins mit dem G-Protein oder seiner Leadersequenz zur Translokation des Antigens an die Zelloberfläche frührt, was somit die Exposition des Peptids gegenüber dem Immunsystem des Wirts verstärkt. Alternativ kann eine Zunahme im Schutz auf der Synergie durch eine Kombination dieser Wirkungen beruhen.
  • Das IHNV-G-Protein wurde bisher in rekombinanter Form als Grundlage zur Impfung von Fischen gegen IHNV ( US 5,534,555 ) verwendet. Die Aminosäure- und Nucleinsäuresequenzen des G-Proteins sind bekannt, beispielsweise aus Koener et al. (1987) J. Virol. 61: 1342–1349, hier durch Bezugnahme mit eingeschlossen.
  • IHNV ist ein Mitglied aus der Familie der Rhabdoviren, denen das "G"-Glycoprotein gemeinsam ist. Rhabdoviren schließen die Vesiculoviren (z. B. Vesicular stomatitis virus (VSV)), die Lyssaviren (z. B. Tollwutvirus), die Ephemoviren (z. B. bovine ephemeral fever virus) und die Novirhabdoviren ein.
  • Der Immun-Booster-Effekt der Rhabdovirus-G-Proteinsequenzen kann auf die Behandlung oder Prävention einer Erkrankung in jedem Tier mit sowohl einem humoralen als auch einem zellulären Zweig des Immunsystems angewandt werden. Solche Tiere schließen Säuger sämtlicher Varietäten (einschließlich Menschen), Fische, Vögel und Reptilien ein.
  • Wir berichten über ein Experiment (Beispiel 1), wobei das IHNV-G-Protein und das VP2-Antigen aus IPNV (infektiöses pankreatisches Nekrosevirus) zusammen als ein Fusionsprotein oder als ein einzelnes DNA-Plasmid in vivo in Fischen exprimiert werden. Bisher wurde die Expression von rekombinanten IPNV-VP2 in Organismen, wie E. coli, festgestellt und, mit einem gewissen Maß an Erfolg, zur Impfung von Fischen gegen IPNV verwendet. Die US 5,165,925 betrifft einen Impfstoff gegen IPNV, der das VP2-Polypeptid einschließt.
  • Dieser Nucleinsäure-Kombinationsimpfstoff (NAV) wurde Fischen injiziert, die anschließend mit IPNV provoziert wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben. Wir stellten eine deutliche Verbesserung im Überleben fest, im Vergleich mit der Immunisierung unter Verwendung einer herkömmlichen viralen Präparation, nämlich eines Öl-adjuvierten abgetöteten Virus. In der Tat betrug das relative prozentuale Überleben (RPS) mit dem fusionierten G-Protein-VP2-Protein-NAV über 50 % im Vergleich zu der PBS-Negativkontrolle, während das abgetötete Virus ein RPS von etwa 25 % aufwies.
  • Das Konstrukt, das das IPNV-VP2-Protein ohne das IHNV-G-Protein trägt, führte zu einem durchschnittlichen RPS von gerade 31 %, relativ zur PBS-Negativkontrolle. Darum hat der Einschluss des IHNV-G-Proteins in das Konstrukt die Wirkung, die Immunantwort auf das IPNV-VP-Protein zu verstärken, um ein Schutzniveau zu generieren, das 67 % stärker ist als mit dem VP2-Protein allein.
  • Die immunstimulierende Wirkung des IHNV-G-Proteins wurde in einem zweiten Experiment (Beispiel 2) verifiziert, wobei die Leadersequenz des IHNV-G-Proteins 5' zu dem ISAV-Hämagglutinin-(HA)-Gen auf einem DNA-Expressionsvektor fusioniert und der Vektor bei einem Provokationsversuch zur Impfung von Fischen gegen ISAV-Infektion verwendet wurde. Die Gegenwart der IHNV-G-Protein-Leadersequenz verstärkt die Schutzwirkung des ISAV-HA-Antigens in einem DNA-Impfstoff signifikant.
  • Die Erfindung umfasst sowohl Nucleinsäureimpfstoffe als auch Impfstoffe auf der Grundlage von rekombinanten Antigenen. Ein rekombinanter Antigen-Impfstoff schließt isoliertes oder gereinigtes IHNV-G-Protein (oder einen Teil davon) und einen isolierten oder gereinigten Teil eines zweiten Antigens aus einem Fischpathogen, das anders als IHNV ist, ein. Der Teil des IHNV-G-Proteins und der Teil des zweiten Antigens werden zusammen in der Form eines Fusionsproteins bereitgestellt.
  • Ein "isoliertes" oder "gereinigtes" Protein ist definiert als im Wesentlichen frei von Zellmaterial oder anderen verunreinigenden Proteinen aus der Zelle oder Gewebequelle, aus der das Protein stammt, oder als im Wesentlichen frei von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien, sofern es chemisch synthetisiert wurde.
  • Ein bevorzugter Impfstoff ist ein Nucleinsäureimpfstoff, der einen Teil des IHNV-G-Protein-Gens trägt, das auf dem gleichen DNA-Expressionsvektor im Raster mit einem Teil eines zweiten Gens aus einem Pathogen fusioniert ist, das anders als IHNV ist. Die Nucleinsäuresequenz, die den Teil des G-Proteins codiert, oder ein Fragment davon, und das zweite Antigen, oder ein Fragment davon, sind im Raster fusioniert.
  • Wenn Gene im Raster fusioniert sind, ist gemeint, dass die Auflistung des Triplettcodes in den Nucleinsäuresequenzen, die von den tRNA-Molekülen erkannt werden, identisch ist mit der Auflistung in den natürlich vorkommenden Genen, so dass die resultierende translatierte Aminosäuresequenz ein Peptid ist, das einen Teil des IHNV-G-Proteins und einen Teil des zweiten Peptids einschließt. Vorzugsweise sind diese beiden Gene oder Genfragmente direkt, ohne eine dazwischenliegende Sequenz, fusioniert. Wenn das IHNV-G-Protein und zweite Protein-Gensequenzen oder Teile davon im Tandem fusioniert werden, kann die IHNV-G-Proteinsequenz oder ein Teil davon 5' von der zweiten Proteinsequenz, 3' von der zweiten Proteinsequenz oder innerhalb dieser Sequenz eingebettet vorliegen.
  • Für die vorliegenden Zwecke wird ein "Teil" eines Proteins so verstanden, dass jedes Peptidmolekül mit mindestens 7, gegebenenfalls mit mindestens 15 oder mit mindestens 25 oder mit mindestens 50 oder mit mindestens 100 zusammenhängenden Aminosäuren des Referenzproteins gemeint ist. Ein "Teil" eines Gens oder einer Nucleinsäuresequenz ist jeder Teil dieser Gensequenz, die mindestens 20, gegebenenfalls mindestens 50 oder mindestens 100 oder mindestens 200 aufeinanderfolgende Nucleotide der vollständigen codierenden Sequenz einschließt. Ein "Teil" eines Gens oder Proteins kann die Vollängen-Gensequenz oder -Aminosäuresequenz sein. Bei einer bevorzugten Ausführungsform schließt der Teil des IHNV-G-Proteins, der bei der Erfindung verwendet wird, die auf die Außenmembran gerichtete Leadersequenz des G-Proteins oder seine codierende Nucleotidsequenz ein. Gegebenenfalls schließt dieser Teil die Leadersequenz unter Ausschluss des Restes des G-Proteins ein. Die vollstandige Leadersequenz (gelesen vom N-Terminus) lautet: MDTMITTPLILILITCGANS (SEQ ID NO: 1). Eine verkürzte, allerdings funktionelle Version der Leadersequenz kann anstelle der vollständigen Leadersequenz eingesetzt werden.
  • Wird auf das IHNV-G-Protein oder das zweite Protein oder auf ihre jeweiligen codierenden Sequenzen Bezug genommen, so sollte es selbstverständlich sein, dass dieser Begriff Proteine oder codierende Sequenzen mit einer wesentlichen Homologie einschließt. "Im Wesentlichen homolog" bedeutet in diesem Zusammenhang, dass eine Sequenz bei Vergleich mit einer Referenzsequenz eine mindestens 60%ige Homologie, vorzugsweise eine mindestens 70%ige Homologie, stärker bevorzugt eine mindestens 80%ige Homologie, stärker bevorzugt eine mindestens 90%ige Homologie, und besonders bevorzugt eine mindestens 95%ige Homologie zu der Referenzsequenz aufweist.
  • Um die prozentuale Homologie von zwei Aminosäuresequenzen oder von zwei Nucleinsäuresequenzen zu bestimmen, werden die Sequenzen zu optimalen Vergleichszwecken ausgerichtet (z. B. können Lücken in die Sequenz einer ersten Aminosäure- oder Nucleinsäuresequenz zum optimalen Alignment mit einer zweiten Aminosäure- oder Nucleinsäuresequenz eingebracht werden, und die dazwischenliegende nicht-homologe Sequenz in der Lücke kann zu Vergleichszwecken vernachlässigt werden).
  • Wenn eine Position in der ersten (Referenz-)Sequenz von dem Aminosäurerest oder Nucleotid als die korrespondierende Position in der Sequenz eingenommen wird, sind die Moleküle an dieser Position homolog (d. h. es besteht an dieser Position Identität). Im Falle eines Nucleinsäure-Sequenzvergleichs besteht ebenfalls Homologie an einer bestimmten Position, wo das Triplett-Codon, das das Nucleotid einschließt, aufgrund der Degenerität des genetischen Codes die gleiche Aminosäure in beiden Molekülen, die verglichen werden, codiert.
  • Die prozentuale Homologie zwischen zwei Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl homologer Positionen, die den Sequenzen gemeinsam ist (d. h. % Homologie = Anzahl von homologen Positionen/Gesamtanzahl von Positionen). Gegebenenfalls können der Vergleich von Sequenzen und die Bestimmung der prozentualen Homologie unter Anwendung eines mathematischen Algorithmus vorgenommen werden. Geeignete Algorithmen sind in den NBLAST- und XBLAST-Programmen von Altschul et al. (1990), J. Mol., Biol. 215: 430–10 eingeschlossen.
  • Außerdem können Aminosäuren mit identischen Ladungen gegenseitig ersetzt werden. Beispielsweise können Lysin und Arginin gegenseitig ersetzt werden. Glutaminsäure und Asparaginsäure können gegenseitig ersetzt werden. Glutamat und Aspartat können ebenfalls gegenseitig ersetzt werden. Solche ladungsneutralen Änderungen an den Aminosäuren eines Proteins sind auf dem Fachgebiet anerkannt, und das resultierende Protein würde immer noch von der Erfindung abgedeckt werden.
  • Es existieren viele verschiedene geographische Isolate von IHNV und anderen Pathogenen. In der Nucleinsäuresequenz dieser Pathogene und in den Aminosäuresequenzen der Proteine, die sie exprimiert, besteht ein bestimmter Variationsgrad. Das IHNV-G-Protein und das zweite bei der Erfindung verwendete Protein sind nicht auf eine bestimmte Isolatquelle beschränkt. Es kann vorteilhaft sein, die zweite Proteinvariante den in einer bestimmten geographischen Zone vorherrschenden Isolaten anzugleichen, wenn für diesen Bereich ein Impfstoff konzipiert wird.
  • Bei einer Ausführungsform der Erfindung werden ein DNA-Expressionsvektor, in dem Nucleinsäuresequenzen für IHNV-G-Protein und ein zweites Protein operabel mit transkriptionalen regulatorischen Sequenzen verknüpft sind, und ein Nucleinsäureimpfstoff, der den DNA-Expressionsvektor und einen pharmazeutisch verträglichen Träger einschließt, bereitgestellt. Die Nucleinsäuresequenzen für das IHNV-G-Protein und das zweite Protein können verknüpft werden, um unter der Kontrolle der gleichen transkriptionalen regulatorischen Sequenz(en) exprimiert zu werden, oder sie können unabhängig voneinander unter der Kontrolle von separaten transkriptionalen regulatorischen Sequenzen exprimiert werden. Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "DNA-Expressionsvektor" auf ein Nucleinsäuremolekül, das in der Lage ist, ein anderes Nucleinsäuremolekül zu transportieren, an das es gebunden wurde. Vorzugsweise ist der DNA-Expressionsvektor ein eukaryotischer Expressionsvektor. Ein Typ eines Vektors ist ein "Plasmid", das einen zirkulären doppelsträngigen DNA-Ring bezeichnet, in den zusätzliche DNA-Segmente ligiert werden können. Ein weiterer Typ von Vektor ist ein viraler Vektor, in dem zusätzliche DNA-Segmente in das virale Genom ligiert werden können. Innerhalb eines rekombinanten Expressionsvektors soll "operabel verknüpft" bedeuten, dass die Nucleotidsequenz von Interesse an die regulatorische Sequenz(en) auf eine Weise gebunden ist, die die Expression der Nucleotidsequenz erlaubt.
  • Die transkriptionalen regulatorischen Sequenzen schließen Promotoren und Polyadenylierungssequenzen ein. Die Immunantwort kann unter Verwendung von anderen Nucleotidsequenzen, wie immunstimulierenden Oligonucleotiden mit unmethylierten CpG-Dinucleotiden oder Nucleotidsequenzen, die andere antigenische Proteine codieren, oder adjuvierende Zytokine, verstärkt werden. Regulatorische Sequenzen schließen diejenigen ein, die die konstitutive oder induzierbare Expression einer Nucleotidsequenz in vielen Arten von Wirtszellen steuern, und diejenigen, die die Expression der Nucleotidsequenz nur in bestimmten Wirtszellen (z. B. gewebespezifische regulatorische Sequenzen) steuern. Die DNA kann in nackter Form vorhanden sein, oder sie kann zusammen mit einem Mittel verabreicht werden, das die Zellaufnahme erleichtert (z. B. Liposomen oder kationische Lipide). Ein Überblick über die Technik der DNA-Impfung findet sich beispielsweise in WO 90/11092 , hier durch Bezugnahme mit eingeschlossen.
  • Zur optimalen in vivo Expression in Fischen kann es bevorzugt sein, transkriptionale regulatorische Sequenzen zu wählen, die für den zu impfenden Fisch endogen sind. Beispielsweise können endogenen Zytokin- oder Actin-Genpromotoren in Erwägung gezogen werden, oder andere regulatorische Sequenzen können aus Fisch-DNA-Viren abgeleitet werden. Die DNA-Impfung, wie auf Fische angewandt, ist ausführlicher in der US 5,780,448 erklärt.
  • Rekombinante IHNV- und andere pathogene Proteine wurden bereits erfolgreich in einer Vielzahl von Organismen exprimiert, einschließlich E. coli und Pichia pastoris, unter Verwendung von Vektoren, die konstitutive oder induzierbare Promotoren enthalten. In einem rekombinanten Impfstoff können gereinigtes IHNV-G-Protein und ein Zweitprotein zur gemeinsamen Verabreichung vermischt sein. Alternativ kann ein Expressionsvektor, der eine Fusion von Teilen dieser beiden Gene einschließt, durch Standardtechniken konstruiert und innerhalb einer Wirtszelle exprimiert werden, um ein gereinigtes rekombinantes Fusionsprotein herzustellen. Herkömmliche Verfahren der Proteinaufreinigung können eingesetzt werden, um das rekombinante Protein zur Verwendung in einem Impfstoff herzustellen. Gegebenenfalls können Lysate von Wirtszellen, die rekombinantes Protein exprimieren, anstelle von rekombinantem Protein, welches weitere Aufreinigungsverfahren durchlaufen hat, verwendet werden.
  • Auf der Grundlage der hiermit gezeigten Ergebnisse beschreiben wir ein Verfahren zur Behandlung oder Prävention von Infektionskrankheit in einem Tier, wie einem Fisch, das die Verabreichung an das Tier in einer Zusammensetzung einschließt, die einen Teil der Nucleotidsequenz des G-Proteins von IHNV (oder die codierte Proteinsequenz) und einen Teil der Nucleotidsequenz eines zweiten Antigens aus dem Pathogen, das die Infektionskrankheit verursacht, (oder die codierte Proteinsequenz) einschließt. Wir beanspruchen auch die Verwendung einer Zusammensetzung, die einen Teil des G-Proteins von IHNV oder seine codierende Nucleotidsequenz und einen Teil eines zweiten Proteins aus einem pathogenen Organismus oder seine codierende Nucleotidsequenz einschließt, zur Herstellung eines Medikaments (Impfstoff) zur Behandlung oder Prävention einer Infektionskrankheit in einem Tier (z. B. ein Fisch), die durch den pathogenen Organismus hervorgerufen wird, und/oder zur Behandlung oder Prävention der Infektion mit dem pathogenen Organismus.
  • Das erfindungsgemäße "zweite" (heterologe) Protein kann ein Protein (oder Peptid oder Antigen) aus einem Fischpathogen, das anders als IHNV ist, sein. Das zweite Protein kann aus einem Pilz-, viralen Pathogen, Protozoen- oder bakteriellen Fisch-Pathogen stammen, welches Infektionskrankheitssyndrome hervorruft. Das zweite Protein stammt gegebenenfalls aus einem Virus, das anders als Rhabdovirus oder anders als VHSV ist. Beispielsweise kann das zweite Protein aus dem Infectious Salmon Anaemia Virus (ISAV), dem Infectious Pancreatic Necrosis Virus (IPNV), Iridovirus, Nervous Necrosis Virus (NNV), Salmon Pancreas Disease Virus (SPDV), Spring Viremia of Carp Virus (SVCV), Viral Hemorrhagic Septicemia Virus (VHSV); Renibacterium salmoninarum (das kausative Mittel von bakterieller Nierenkrankheit), (Piscirickettsia salmonis (das kausative Mittel von Salmonid Rickettsial Septicemia), Vibrio spp., Aeromonas spp., Yersinia ruckerii, Nocardia spp., Pseudomonas spp., Photobacterium damselae etc. stammen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das zweite Protein viralen Ursprungs. Eine große und wachsende Anzahl von Polypeptiden aus diesen und anderen pathogenen Organismen wurde bereits gereinigt und/oder kloniert und exprimiert und steht als solche oder bereitgestellt in Konjugation mit IHNV-G-Protein oder seiner codierenden Sequenz in einer Impfstoffzusammensetzung zur Verfügung. Bevorzugte Beispiele umfassen die IPNV-Proteine VP1, VP2, VP3 und NS und ihre codierenden Nucleotidsequenzen; ISAV-Proteine, die in WO 01/10469 offenbart sind, einschließlich Hämagglutinin, Nucleocapsid. Polymerase und Segment-7 P4- und P5-Proteinen, und ihre codierenden Nucleotidsequenzen; P.-salmonis-Proteine, die in WO 01/68865 offenbart sind, einschließlich OspA und IcmE und ihre codierenden Nucleotidsequenzen; Nodavirusproteine, wie das Nucleocapsid; und strukturelle Polypeptide aus SPDV und ihre codierenden Sequenzen (offenbart in WO 99/58639 ). Eine bevorzugte erfindungsgemäße Impfstoffzusammensetzung schließt einen DNA-Expressionsvektor ein, der einen Teil der IHNV-G-Protein-Nucleotidsequenz, fusioniert im Raster mit einem Teil der IPNV-VP2-Sequenz, oder einen Teil der IHNV-G-Protein-Leadersequenz, die im Raster mit einem Teil der ISAV-Hämagglutinin-Sequenz fusioniert ist, trägt.
  • Die Hauptkandidaten-Fischarten zum Erhalt des erfindungsgemäßen Impfstoffes sind lachsartige Fische, einschließlich Lachs- und Forellenarten, insbesondere Silberlachs (Oncorhynchus kisutch), Bachsaibling (Salvelinus fontinalis), Bachforelle (Salmo trutta), Königslachs (Oncorhynchus tshawytscha), Masu-Lachs (Oncorhynchus masou), Buckellachs (Oncorhynchus gorbuscha), Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss), Seesaibling (Salvenlinus alpinus) und Atlantischer Lachs (Salmo solar). Allerdings kann jede andere Fischart, die gegenüber einer Infektionskrankheit empfindlich ist, vorteilhaft sein, wie Zierfischspezies, Koi, Goldfisch, Karpfen, Wels, Yellowtail, Seebrasse, Seebarsch, Hecht, Heilbutt, Schellfisch, Tilapia, Steinbutt, Seewolf usw.
  • Das "zweite" (heterologe) erfindungsgemäße Protein kann ebenfalls ein Antigen aus einem Pathogen aus Tieren, die anders als Fische sind, insbesondere Säuger, wie Menschen, sein. Das zweite Protein kann aus einem Pilzpathogen, viralen Pathogen, Protozoen- oder Bakterienpathogen stammen, das Infektionskrankheitssyndrome in Tieren hervorruft. Eine nicht-einschränkende Liste von möglichen Pathogenen umfasst: Hepatitisviren (z. B. HBV, HCV), HIV und andere Immundefizienzvirusgene, Influenzaviren, Masernvirus, Coronaviren, Herpesviren, Poliovirus, Rhinoviren, Rotaviren, Adenviren, Papillomaviren, Hantaviren, Parvoviren und die speziellen Viren Bovine Viral Diarrhea Virus (BVDV), Bovine Herpesvirus (BHV), Maul- und Klauenseuche-Virus, Bovine Respiratory Syncytial Virus (BRSV), Parainfluenza-Typ-3-Virus (P13), Infectious Bovine Rhinotracheitis (IBR), Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome Virus (PRRSV); Arten von Giardia, Yersinia, Leishmania, Amoeba, Entamoeba, Trypanosoma, Toxoplasma, Plasmodium, Cryptosporidia, Candida, Cryptococcus, Histoplasma, Coccidioides, Blastomyces, Staphylococcus, Streptococcus, Pneumococcus, Neisseria, Listeria, Campylobacter, Chlamydia, Eimeria, Clostridia, Pasteurella, Brachyspira, Salmonella, Legionella, Mycobacteria, Mycoplasma (z. B. M. bovis, M. hypopneumoniae), Treponema, Borrelia, Leptospira, Ehrlichia, Rickettsia, Brucella, Neospora, Fusobacterium, E. coli, Mannheimia haemolytica, Haemophilus somnus, Actinobacillus pleuropneumoniae, Anaplasma etc.
  • Mit den erfindungsgemäßen Impfstoffen kann jedes Wirbeltier immunisiert werden. Besonders erwähnt werden können Menschen, die Hauptarten von landwirtschaftlichen Nutztieren, nämlich Rinder, Pferde, Schafe, Schweine und Geflügel und Haustiere.
  • Zweikomponenten-Impfstoffe können zusammen in einer einzigen Impfstoffzusammensetzung hergestellt werden, oder sie können getrennt zur getrennten Verabreichung oder zur gemeinsamen Verabreichung hergestellt werden. Gegebenenfalls werden die einzelnen Komponenten zur sequentiellen, separaten oder gleichzeitigen Verabreichung in Form eines Kits bereitgestellt. Die beiden Komponenten können unmittelbar vor der Verabreichung miteinander vermischt werden.
  • Für Fische besteht der bevorzugte Verabreichungsweg der erfindungsgemäßen Impfstoffe in der Injektion in den Muskel (insbesondere in den epaxialen Muskel). Alternativen sind die Injektion in die Bauchhöhle (für größere Fische), oral im Futter oder durch Immersion in Meer- oder Süßwasser. Es wird empfohlen, dass der Fisch zur Verabreichung des erfindungsgemäßen Impfstoffes durch Injektion hinsichtlich des Körpergewichts 2 g oder mehr, vorzugsweise 10 g oder mehr wiegt. Zur Immersion oder oralen Verabreichung ist es bevorzugt, dass Fische ein Körpergewicht von mindestens 0,1 g, gegebenenfalls von mindestens 0,5 g, in der Regel von mindestens 2 g, aufweisen.
  • Bei Tieren, die anders als Fische sind, werden Impfstoffe, insbesondere Nucleinsäureimpfstoffe, oft durch intramuskuläre Injektion oder durch Abgabe an die Schleimhautmembranen abgegeben; Abgabetechniken umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf: Elektroporation, subkutane oder transdermale Injektion, Mikroinjektion, Jet-Injektion, Calciumphospat-DNA-Copräzipitation, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Polybren-vermittelte Transfektion, Liposomenfusion, Lipofektion, Protoplastenfusion, virale Infektion, Mikropartikel, bakterielle Träger und Biolistica (Teilchenbombardierung, z. B. unter Verwendung einer Genpistole).
  • Der erfindungsgemäße Impfstoff kann Tieren zu prophylaktischen oder therapeutischen Zwecken verabreicht werden. Der Impfstoff ist in der Lage, einen Langzeitschutz gegen die Ziel-Infektionskrankheit auszulösen. "Langzeit"-Schutz bedeutet im Falle von Fischen eine protektive Immunantwort für länger als 7 Tage, stärker bevorzugt für länger als 20 Tage, und besonders bevorzugt für länger als 70 Tage nach Impfung.
  • Die wirksame Impfstoffdosierung kann in Abhängigkeit von der Größe und Art des Individuums und des Verabreichungsverfahrens variieren. Die optimale Dosierung kann über Versuch und Irrtum durch einen Arzt, Tierarzt oder einen Aquakultur-Fachmann bestimmt werden. Für Fische können Impfstoffe zwischen 0,01 bis 0,5 g, vorzugsweise etwa 0,05 bis 0,2 g rekombinantes Protein in einer einzigen Dosierung einschließen. Ein geeigneter Dosierungsbereich für Nucleinsäureimpfstoffe kann so niedrig sein wie Picogramm- oder so hoch sein wie Milligramm-Mengen, allerdings beträgt er normalerweise etwa 0,01 bis 100 μg, vorzugsweise 0,1 μg bis 50 μg pro Dosiseinheit, stärker bevorzugt etwa 1 μg bis etwa 20 μg, und besonders bevorzugt etwa 5 μg bis etwa 10 μg pro Dosiseinheit. Aufgrund des Stresses, dem der Fisch als Reaktion auf die Impfung ausgesetzt ist, ist es bevorzugt, dass der Impfstoff als single shot Impfstoff in einer einzigen Dosierungsform bereitgestellt wird. Für injizierbare Impfstoffe beträgt eine Einzeldosierungseinheit zweckmäßigerweise 0,025 bis 0,5 ml, vorzugsweise 0,05 bis 0,2 ml, gegebenenfalls etwa 0,1 ml pro Volumen.
  • Typischerweise werden Impfstoffe als flüssige Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen zur Injektion oder Abgabe in Wasser hergestellt. Feste Formen (z. B. Pulver), die zur Auflösung in oder Suspension in flüssigen Vehikeln oder zum Mischen mit festen Lebensmitteln vor der Verabreichung geeignet sind, können ebenfalls hergestellt werden. Der Impfstoff kann lyophilisiert, gegebenenfalls gefriergetrocknet, in einer gebrauchsfertigen Form zur Rekonstruktion mit einem sterilen Verdünnungsmittel vorliegen. Beispielsweise kann der lyophilisierte Impfstoff in 0,9 % Kochsalzlösung (gegebenenfalls bereitgestellt als Teil des abgepackten Impfstoffproduktes) rekonstituiert werden. Nucleinsäureimpfstoffe sind besonders zur Lyophilisation aufgrund der Stabilität und langen Lagerungsdauer der Moleküle geeignet. Alternativ kann der Impfstoff in einer Kochsalzlösung bereitgestellt werden. Flüssige oder rekonstituierte Formen des Impfstoffes können weiterhin in einem kleinen Volumen Wasser (z. B. 1 bis 10 Volumina) verdünnt werden, vor der Zugabe zu einem Stift, Tank oder Bad zur Verabreichung an Fische durch Immersion. Die erfindungsgemäße pharmazeutische Impfstoffzusammensetzung kann in einer Form zur sofortigen Freisetzung oder zur Langzeitfreisetzung verabreicht werden.
  • Pharmazeutisch verträgliche Träger oder Vehikel umfassen herkömmliche Exzipienten und können beispielsweise Lösungsmittel, wie Wasser, Öl oder Kochsalzlösung, Dextrose, Glycerin, Saccharose, Tricain, Netz- oder Emulgiermittel, Füllmittel, Beschichtungsmittel, Bindemittel, Füllstoffe, Sprengmittel, Verdünnungsmittel, Gleitmittel, pH-Puffermittel oder herkömmliche Adjuvantien, wie Muramyldipeptid, Avridin, Aluminiumhydroxid, Öle, Saponine, Blockcopolymere und andere aus der Technik bekannte Substanzen sein. Im Falle von Nucleinsäureimpfstoffen kann der DNA-Expressionsvektor nackt abgegeben werden oder kann in Form von kationischen Lipid-DNA-Komplexen, Liposomen, Calciumphosphat-Copräzipitaten, adsorbiert auf Mikropartikel usw. bereitgestellt werden.
  • In einigen Fällen kann es erwünscht sein, den erfindungsgemäßen Impfstoff mit einem herkömmlichen Impfstoff gegen ein infektiöses Pathogen (Impfstoff aus abgetötetem Pathogen oder Impfstoff aus rekombinantem Pathogen-Antigen oder Pathogen-Nucleinsäure-Impfstoff) in einem Kombinationsimpfstoff oder in einem Kit zu kombinieren, das beide Komponenten zur separaten sequentiellen oder gleichzeitigen Verabreichung einschließt, zur Behandlung oder Prävention von durch das Pathogen verursachten Infektionskrankheiten.
  • Beispiel 1
  • Evaluierung von Nucleinsäureimpfstoffen gegen das Infectious Pancreatic Necrosis Virus in Atlantischem Lachs, Salmo salar.
  • Impfung
  • Atlantischer Lachs-Parr (Körpergewicht 9–26 g) wird in zwei kreisförmigen Tankbecken mit 1 m Durchmesser mit Süßwasser bei 8° C gehalten und wird 24 h vor der Impfung hungern gelassen. Zur Impfung werden die Fische in 3-Aminobenzoesäureethylester (MS222, Sigma, Pooie, UK) in einer Konzentration von ungefähr 0,5 g/l anästhesiert. Die Nucleinsäureimpfstoffe (10 μg DMA/50 μl Dosis) werden durch intramuskuläre Injektion in die linke Dorsalflanke in den Bereich unmittelbar unterhalb der Rückenflosse verabreicht. Öl-adjuvierter, abgetöteter IPNV-Impfstoff und PBS-Kontrolle werden durch intraperitoneale Injektion (100 μl) verabreicht. Jede Behandlungsgruppe hat 40 Fische, und pro Impfstoff gibt es zwei Replikate für jeden der 6 Impfstoffe.
  • Die Testgruppen erhalten die folgenden Zusammensetzungen:
    • (1) Der pUK-Vektor: Ein Klonierungsvektor, der das Kanamycin-Resistenzgen, den CMV unmittelbar-frühen Promotor, eine multiple Klonierungsstelle und das Rinderwachstumshormon-Polyadenylierungssignal (BGH polyA) trägt.
    • (2) pUK + VP2: der pUK-Vektor, der die gesamte codierende Sequenz von IPNV VP2 innerhalb der multiplen Vektorklonierungsstelle einschließt.
    • (3) pUK + IHNG: der pUK-Vektor, der die gesamte codierende Sequenz des IHNV-G-Proteins innerhalb der multiplen Vektorklonierungsstelle einschließt.
    • (4) pUK + IHNG + VP2: der pUK-Vektor, der die gesamte codierende Sequenz des IPNV-VP2-Proteins, im Raster fusioniert mit dem Glycoprotein (G) des IHN-Virus, innerhalb der multiplen Klonierungsstelle einschließt, derart dass sich das G-Protein 5' von VP2 befindet.
    • (5) IPNV + Öl: eine inaktivierte Präparation des IPN-Virus, adjuviert mit Öl.
    • (6) PBS (negative Kontrolle).
  • Nahezu 6 Wochen nach der Impfung werden die Fische über einen Zeitraum von 5 Tagen als Smolt gehalten. Der Meerwasserstrom in die Fischtanks wird nach und nach verstärkt, während der Süßwasserstrom reduziert wird, derart, dass sich die Fische nach 5 Tagen in Meerwasser voller Stärke befinden.
  • Cohabitations-Provokation
  • 807 Gradtage nach der Impfung wird ein gefrorener Pass-2-Überstand des IPN-Virus "Cole-Deep"-Stamm fünffach in sterilem PBS verdünnt, um eine Endkonzentration von 1 × 107 TClD50/ml zu ergeben. Die Fische werden in MS222 anästhesiert und in Chargen durch intraperitoneale Injektion von 100 μl Virussuspension so provoziert, dass jeder Fisch eine Dosis von 106 TCID50 erhält. Die Meerwassertemperatur bei der Provokation beträgt etwa 11° C, und die Wasserströmungsgeschwindigkeit beträgt etwa 5 1 pro Minute in jedem Tank.
  • Die Mortalitäten werden zweimal täglich während der ersten Beobachtung entfernt. Der Versuch wird 8 Wochen nach der Provokation beendet. Schlussfolgerungen
    Impfstoff durchschnittliche Mortalität % SD durchschnittliches RPS relativ zu PBS
    PBS 42,6 10,4 n/a
    pUK 39,7 10,4 6,90
    pUK + IHNG 35,3 8,3 17,24
    pUK + VP2 29,4 4,2 31,03
    pUK + IHNG + VP2 20,6 4,2 51,72
    IPNV + Öl 31,7 5,1 25,65
  • Das Provokationsmodell, das auf Cohabitation mit intraperitoneal injizierten Atlantischen Lachs-Smolts beruhte, ist erfolgreich: Die kumulativen Mortalitäten bei intraperitoneal injizierten Cohabitanten erreichen einen Durchschnitt von 41,25 %, und dieser wird in allen 4 Provokationstanks mit einer Standardabweichung von 3,95 % nahezu repliziert.
  • Die Leistung des abgetöteten IPNV-Impfstoffes, verabreicht mit Öl, wird in Relation zu den PBS-geimpften Kontrollen bewertet. Der abgetötete Impfstoff ergibt einen gewissen Schutz, mit einem relativen prozentualen Überleben (RPS), verglichen mit den PBS-geimpften Kontrollen von mehr als 25 %.
  • Die Leistung der Nucleinsäureimpfstoffe wird entweder mit dem leeren Plasmid oder dem Plasmid verglichen, das das Gen für das II-INV-G-Protein enthält. Die Kontrollplasmide werden mit den scheingeimpften PBS-Kontrollen verglichen, um zu bestimmen, ob das leere Plasmid oder das Plasmid, das das IHNV-G-Protein enthält, eine Schutzwirkung besitzt. Der Plasmidvektor pUK ergibt eine insignifikante Schutzwirkung. Wenn das IPNV-VP2-Protein in den Vektor eingeschlossen wird, ergibt sich ein signifikanter Schutz (31 % RPS), verglichen mit PBS-geimpften Kontrollen. Wenn das IHNV-G-Protein-Gen in den Vektor, ohne IPNV-Gene, eingeschlossen wird, beträgt die Schutzwirkung, verglichen mit PBS, 17 % RPS.
  • Der Impfstoff mit der besonders herausragenden Leistung ist der NAV, der das Gen für das IHNV-G-Protein im Tandem mit dem IPNV VP2 enthält. Fische, die mit diesem Impfstoff geimpft wurden, zeigen, verglichen mit den PBS-geimpften Kontrollen, ein relatives prozentuales Überleben von 52 % RPS.
  • Schlussfolgernd verhält sich die abgetötete virale Standardpräparation mit Öladjuvans bei diesem Versuch entsprechend, allerdings ist die Leistung der NAVs, die VP2 enthalten, viel größer. Insbesondere ist der NAV, der VP2 enthält, im Doppelstrang mit dem IHNV-G-Protein besonders wirksam.
  • Beispiel 2: Evaluierung von Nucleinsäureimpfstoffen gegen ISAV
  • Atlantischer Lachs-Parr mit einem durchschnittlichen Gewicht von 10 g (< 6 Monate alt) wird mindestens 7 Tage in Wasser bei 12 ± 1° C, das mit einer Geschwindigkeit von 2,5 l/min fließt, akklimatisiert. Der Fisch wird mit einem handelsüblichen pelletisierten Futter mit einer Tagesration von 1,5 % Körpergewicht gefüttert.
  • Vor der Impfung werden die Fische in 30 mg/l Benzocain anästhesiert. Die Nucleinsäureimpfstoffe (10 μg DNA/50 μl Dosis) werden durch intramuskuläre Injektion in den Epaxialmuskel unmittelbar vor der Rückenflosse verabreicht. Der Ölemulsionsimpfstoff wird durch intraperitoneale Injektion (150 μl) verabreicht. Jede Impfstoff-Replikatgruppe besitzt 55 Fische, und es existieren pro Impfstoff für jeden der 5 Impfstoffe 2 Replikate.
  • Die Testgruppen erhalten die folgenden Zusammensetzungen:
    • (1) Der pUK-Vektor: Ein Klonierungsvektor, der das Kanamycin-Resistenzgen, den CMV ummittelbar-frühen Promotor, eine multiple Klonierungsstelle und das Rinderwachstumshormon-Polyadenylierungssignal (BGH polyA) trägt.
    • (2) pUK-HA: der pUK-Vektor, der die gesamte codierende Sequenz des ISAV-Hämagglutininproteins in der multiplen Klonierungsstelle einschließt.
    • (3) pUK-IHNg: der pUK-Vektor, der die gesamte Sequenz des IHNV-G-Proteins in der multiplen Klonierungsstelle einschließt.
    • (4) pUK-HA-IHNg: der pUK-Vektor, der die gesamte codierende Sequenz des ISAV-Hämagglutininproteins in der multiplen Klonierungsstelle einschließt und an seinem 5'-Ende mit der IHNV-G-Protein-Leadersequenz fusioniert ist.
    • (5) ISAV + Öl: eine inaktivierte Präparation von ISA-Virus, adjuviert mit Öl.
  • Die Fische werden an 850,5 Gradtagen provoziert. Eine Cohabitations-Provokation wird eingesetzt, wobei der Lachs derselben Abstammung an der Fettflosse beschnitten, ihm eine i. p. Injektion mit 0,1 ml kultiviertem ISAV (etwa 104 TCID50 pro Fisch) verabreicht und er jeweils in den Tank mit behandeltem Fisch verbracht wird.
  • Die Fische in jedem Tank werden zweimal täglich 31 Tage lang auf Mortalität überwacht. Das relative prozentuale Überleben (RPS) wird wie folgt berechnet: RPS = 1 – (% Mortalität der Impfstoffe/% Mortalität der pUK-Kontrolle) × 100
  • Ergebnisse:
  • Die kumulative Mortalität der negativen Kontrollgruppe (pUK-Plasmid) beträgt 94 %. Der beste Schutz wird durch Injektion des monovalenten inaktivierten positiven ISAV-Kontrollimpfstoffes (94 % RPS) induziert. Die Injektion des pUK-IHNg-Plasmids als eine negative Kontrolle löst etwas nicht-spezifischen Schutz (RPS 26 %) aus. pUK-HA überträgt ein hohes Schutzniveau (RPS 49 %). Dieser Schutz erhöht sich signifikant durch die Addition der IHNV-G-Protein-Leadersequenz an das 3'-Ende (pUK-HA-IHNg) (RPS 60 %). Dieses Ergebnisse stellen eine weitere Unterstützung für die Vorteile des Einschlusses der IHNV-G-Proteinsequenz (oder zumindest der Leadersequenz davon) in einen Nucleinsäureimpfstoff bereit, um die Immunität gegenüber einer Infektionskrankheit, die anders als IHNV ist, zu verstärken. Die Leadersequenz des G-Proteins kann für das Ausrichten des heterologen Antigens auf die Zelloberfläche im Fisch verantwortlich sein, oder es können bestimmte spezielle Gruppierungen im Protein vorhanden sein, die das Immunsystem des Fisches unspezifisch stimulieren.
    Testgruppe durchschnittliche Mortalität % Standardfehler RPS (relativ zu pUK)
    pUK 94 2 –
    ISAV-Öl 6 6 94
    pUK-HA 48 4 49
    pUK-IHNg 70 6 26
    pUK-HA-IHNg 38 6 60
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00190001

Claims (16)

  1. DNA-Expressionsvektor, umfassend eine Sequenz, die einen Teil der Infectious Hematopoietic Necrosis Virus IHNV-Glycoprotein-G-Protein-codierenden Sequenz umfasst und weiterhin einen Teil einer zweiten Protein-codierenden Sequenz aus einem pathogenen Organismus, der anders ist als IHNV, umfasst, wobei der Teil der IHNV-G-Protein-codierenden Sequenz und der Teil der zweiten Protein-codierenden Sequenz im Raster auf dem gleichen DNA-Expressionsvektor fusioniert sind.
  2. DNA-Expressionsvektor nach Anspruch 1, wobei die zweite Protein-codierende Sequenz aus einem Fischpathogen stammt.
  3. DNA-Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 2, der die Leadersequenz des IHNV-G-Proteins einschließt.
  4. DNA-Expressionsvektor nach Anspruch 3, wobei die Leadersequenz des IHNV-G-Proteins SEQ ID NO: 1 ist.
  5. DNA-Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, der die vollständige IHNV-G-Protein-codierende Sequenz einschließt.
  6. DNA-Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das zweite Protein aus einem Pathogen stammt, ausgewählt aus: ISAV, VHSV, IPNV, NNV, Iridovirus, SVCV, SPDV, Renibacterium salmoninarum, Piscirickettsia salmonis, Vibrio spp., Aeromonas spp., Yersinia ruckerii, Pseudomonas spp., Nocardia spp. und Photobacterium damselae subsp. piscicida.
  7. DNA-Expressionsvektor nach Anspruch 6, wobei das zweite Protein das VP2-Protein aus IPNV oder das Hämagglutininprotein aus ISAV ist.
  8. Nucleinsäureimpfstoff, der einen DNA-Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 7 mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger einschließt.
  9. Fusionsprotein, das einen Teil des IHNV-G-Proteins und einen Teil eines zweiten Proteins, das aus einem Fisch-Pathogenorganismus, der anders ist als IHNV, stammt, einschließt.
  10. Fusionsprotein nach Anspruch 9, wobei das zweite Protein ein Pathogen ist, ausgewählt aus ISAV, IPNV, NNV, Iridovirus, SVCV, SPDV, Renibacterium salmoninarum, Piscirickettsia salmonis, Vibrio spp., Aeromonas spp., Yersinia ruckerii, Pseudomonas spp., Nocardia spp. und Photobacterium damselae subsp. piscicida.
  11. Fusionsprotein nach Anspruch 10, wobei das zweite Protein VP2 aus IPNV ist.
  12. Fusionsprotein nach Anspruch 11, wobei das zweite Protein Hämagglutinin aus ISAV ist.
  13. Nucleinsäureimpfstoff, der eine Sequenz, die ein Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 10 bis 12 codiert, mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger einschließt.
  14. Verwendung eines DNA-Expressionsvektors nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder eines Fusionsproteins nach einem der Ansprüche 9 bis 12 bei der Herstellung eines Medikaments zur Prävention oder Behandlung von pathogenen Infektionen bei Fischen.
  15. Verwendung nach Anspruch 14 bei der Herstellung eines Medikaments zur Prävention oder Behandlung von bakteriellen, viralen, fungalen oder protozoischen Infektionen bei Fischen.
  16. Verwendung nach Anspruch 14 oder Anspruch 15 bei der Herstellung eines Medikaments zur Verstärkung der Immunantwort, um dadurch den Schutz gegen das Pathogen zu verbessern, aus dem das zweite Protein stammt.
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