ES2288627T3

ES2288627T3 - Proteina de fusion g de ihnv para estimulacion inmunitaria.

Info

Publication number: ES2288627T3
Application number: ES03769280T
Authority: ES
Inventors: Nathalie C. Simard; Linda M. Bootland
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2002-09-17
Filing date: 2003-09-16
Publication date: 2008-01-16
Anticipated expiration: 2023-09-16
Also published as: AU2003277863B2; WO2004026338A1; DE60315858T2; CA2498896A1; EP1553979B1; DK1553979T3; ATE370746T1; HK1082666A1; CY1107784T1; EP1553979A1; AU2003277863A1; HK1080712A1; JP2006504414A; JP4578973B2; CA2498896C; CN100339131C; CN1681530A; NO20051840L; NO337372B1; DE60315858D1

Abstract

Un vector de expresión de DNA que comprende una secuencia codificante de una porción de la secuencia de codificación de la proteína glicoproteína G de virus de necrosis hematopoyética infecciosa IHNV y que además comprende una porción de una secuencia de codificación de una segunda proteína procedente de un organismo patógeno distinto de IHNV, en donde la secuencia codificante de la proteína G de IHNV y la porción de la secuencia de codificación de la segunda proteína están fusionadas en el marco sobre el mismo vector de expresión de DNA.

Description

Proteína de fusión G de IHNV para estimulación inmunitaria.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al uso de una nueva clase de vacunas para prevenir enfermedades infecciosas, particularmente en peces. La invención también se refiere a una vacuna que comprende una porción de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína G de IHNV (Virus de Necrosis Hematopoyética Infecciosa) y una porción de la secuencia de ácido nucleico que codifica un segundo péptido, derivándose el segundo péptido de un patógeno.

Antecedentes de la invención

Las vacunas recombinantes se emplean ocasionalmente en medicina humana y veterinaria como una alternativa a sistemas más tradicionales basados en patógenos muertos o atenuados. Muchos antígenos extraños aportados sistémicamente al cuerpo de este modo son capaces de activar solo una rama del sistema inmunitario, estimulando la respuesta inmunitaria humoral para generar anticuerpos mediante la ruta del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) clase II. Sin embargo, una vacuna ideal también debe inducir una respuesta celular mediante destrucción de células infectadas a través de la ruta del MCH clase I. La última respuesta se alcanza a través de degradación citosólica de proteína extraña en células infectadas, de modo que fragmentos del material extraño se asocian con moléculas del MHC clase I y son lanzados a la superficie celular para la presentación a células T citotóxicas (CTL) CD8^{+}.

Las vacunas de ácido nucleico (NAVs) son una forma relativamente nueva de tecnología que son útiles para el aporte de antígenos de patógeno, especialmente antígenos virales. Como las proteínas virales codificadas por las vacunas son expresadas in situ por el aparato celular del huésped, la teoría sugiere que deben provocar una respuesta inmunitaria mediada por células capaz de proteger a los animales cuando se estimulan. Los resultados, sin embargo, han sido heterogéneos: en peces, las NAVs que expresan la proteína G (glicoproteína superficial) del virus de necrosis hematopoyética infecciosa (IHNV) y la proteína G del virus de septicemia hemorrágica viral son eficaces contra infecciones por IHNV y VHSV, respectivamente. Sin embargo, ha sido difícil demostrar una protección convincente de los peces usando NAVs basadas en otros antígenos virales.

Por ejemplo, Boudinot y otros (1998), Virology, 249, 297-306 se inmunizaron doblemente mediante coexpresión de proteínas G de IHNV y VHSV sobre plásmidos separados. La cinética y la intensidad de la respuesta a la combinación de proteínas G eran similares a las inducidas por la expresión de una sola proteína G.

Un objetivo de la presente invención es proporcionar vacunas mejoradas eficaces contra una variedad de enfermedades en peces y otros animales, provocadas por infección con patógenos.

Sumario de la invención

En un primer aspecto, la invención proporciona un vector de expresión que comprende una porción de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína G de IHNV, fusionada en el marco con una porción de una secuencia de codificación de una segunda proteína procedente de un organismo patógeno distinto de IHNV. La porción de la proteína G de IHNV es opcionalmente la secuencia líder aislada de proteína G de IHNV. La segunda proteína es preferiblemente un antígeno procedente de un patógeno de peces, opcionalmente un virus. La porción de la secuencia codificante de proteína G de IHNV está fusionada con la secuencia codificante de la segunda proteína.

La invención también proporciona una composición de vacuna que comprende un primer vector de expresión que tiene una porción de la secuencia de ácido nucleico que codifica proteína G de IHNV fusionada en el marco con una porción de la secuencia de ácido nucleico codificante de un segundo antígeno distinto de un antígeno de IHNV soportado sobre dicho primer vector de expresión junto con un portador farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, la composición de vacuna comprende un adyuvante.

En otro aspecto, la invención proporciona el uso de una composición en la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de una enfermedad infecciosa en un animal, en donde dicha composición comprende un primer vector de expresión que comprende una porción de la secuencia codificante de proteína G de IHNV, fusionada en el marco con una porción de una secuencia codificante de una segunda proteína procedente de un organismo patógeno responsable de dicha enfermedad infecciosa, en donde el IHNV no es un agente causal de la enfermedad infecciosa.

En un aspecto adicional, la invención proporciona el uso de una composición en la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de una enfermedad infecciosa en peces distinta de IHNV, en donde dicha composición comprende una porción de la secuencia codificante de proteína G de IHNV y además comprende una porción de una secuencia codificante de una segunda proteína procedente de un organismo patógeno responsable de dicha enfermedad infecciosa soportada en el mismo vector de expresión.

Descripción detallada de la invención

La invención se basa en la observación de que la presencia de proteína G de IHNV o su secuencia líder (también denominada secuencia de señal) expresada a partir de una vacuna de ácido nucleico en el marco con un segundo antígeno puede desatar la respuesta inmunitaria, potenciando de ese modo la protección contra el patógeno del que se deriva el segundo antígeno. La explicación para este efecto no se ha elucidado todavía, pero puede referirse a la existencia de motivos inmunoestimulantes en la proteína G. También es plausible que la fusión de la proteína antigénica a la proteína G o su secuencia líder dé como resultado la traslocación el antígeno a la superficie celular, incrementado así la exposición del péptido al sistema inmunitario del huésped. Alternativamente, un incremento en la protección puede deberse a sinergia a través de una combinación de estos efectos.

La proteína G de IHNV se ha usado en forma recombinante como la base para la vacunación de peces contra IHNV (US 5.534.555). Las secuencias de aminoácidos y ácido nucleico de la proteína G son conocidas, por ejemplo, de Koener y otros (1987) J. Virol. 61: 1342-1349, que se incorpora aquí mediante referencia.

El IHNV es un miembro de la familia los rhabdovirus, que comparten la glicoproteína "G". Los rhabdovirus incluyen los vesiculovirus (por ejemplo, virus de estomatitis vesicular (VSV)), los lisavirus (por ejemplo, virus de la rabia), los efemovirus (por ejemplo, virus de la fiebre efímera bovina) y los novirhabdovirus.

El efecto de refuerzo inmunitario de secuencias de proteína G de rhabdovirus puede aplicarse al tratamiento o la prevención de la enfermedad en cualquier animal que tenga ramas tanto humorales como celulares para el sistema inmunitario. Tales animales incluyen mamíferos de todas las variedades (incluyendo seres humanos), peces, aves y reptiles.

Se presenta un experimento (Ejemplo 1) en el que la proteína G de IHNV y el antígeno VP2 de IPNV (virus de necrosis pancreática infecciosa) se expresan conjuntamente como una proteína de fusión sobre un solo plásmido de DNA in vivo en peces. VP2 de IPNV recombinante se ha expresado previamente en organismos tales como E. coli y se ha usado para la vacunación de peces contra IPNV, con cierto grado de éxito. US 5.165.925 se refiere a una vacuna contra IPNV que comprende el polipéptido de VP2.

Esta vacuna de ácido nucleico (NAV) de combinación se inyectó en peces, que subsiguientemente se estimularon con IPNV, según se describe en el Ejemplo 1. Se observó una mejora notable en la supervivencia en comparación con inmunización usando una preparación viral convencional, a saber un virus muerto con adyuvante de aceite. De hecho, el porcentaje relativo de supervivencia (RPS) con la NAV de fusión de proteína G-proteína de VP2 estaba por encima de 50% en comparación con el control negativo de PBS, mientras que el virus muerto tenía un RPS de aproximadamente 25%.

El constructo que tiene la proteína VP2 de IPNV sin la proteína G de IHNV daba como resultado un RPS medio de solo 31% con relación al control negativo de PBS. Por lo tanto, la inclusión de la proteína G de IHNV en el constructo tiene el efecto de reforzar la respuesta inmunitaria a la proteína VP2 de IPNV para generar un nivel de protección 67% más fuerte que con la proteína VP2 sola.

El efecto estimulante inmunitario de la proteína G de IHNV se verificó en un segundo experimento (Ejemplo 2) en el que la secuencia líder de proteína G de IHNV se fusionaba 5' del gen de hemaglutinina (HA) de ISAV en un vector de expresión de DNA y el vector se usaba para vacunar peces contra infección por ISAV en un experimento de estimulación. La presencia de la secuencia líder de la proteína G de IHNV refuerza significativamente el efecto protector del antígeno HA de ISAV en una vacuna de DNA.

La invención abarca tanto vacunas de ácido nucleico como vacunas basadas en antígenos recombinantes. Una vacuna de antígeno recombinante comprende proteína G de IHNV (o una porción de la misma) aislada o purificada y una porción aislada o purificada de un segundo antígeno procedente de un patógeno de peces distinto de IHNV. La porción de la proteína G de IHNV y la porción del segundo antígeno se proporcionan conjuntamente en la forma de una proteína de fusión.

Una proteína "aislada" o "purificada" se define como substancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes procedentes de la fuente celular o tisular de la que se deriva la proteína, o substancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente.

Una vacuna preferida es una vacuna de ácido nucleico que tiene una porción del gen de proteína G de IHNV fusionada en el marco con una porción de un segundo gen procedente de un patógeno distinto de IHNV en el mismo vector de expresión de DNA. La secuencia de ácido nucleico codificante de la porción de la proteína G, o un fragmento de la misma, y el segundo antígeno, o un fragmento del mismo, están fusionados en el marco.

Cuando los genes se fusionan en el marco se entiende que el registro del código de tripletes en las secuencias de ácido nucleico reconocidas por moléculas de tRNA es idéntico al registro en los genes presentes en la naturaleza, de modo que la secuencia de aminoácidos traducida resultante es un péptido que comprende una porción de la proteína G de IHNV y una porción del segundo péptido. Preferiblemente, estos dos genes o fragmentos génicos se fusionan directamente, sin ninguna secuencia intermedia. Cuando las secuencias génicas o porciones de las mismas de la proteína G de IHNV y la segunda proteína se fusionan en tándem, la secuencia de la proteína G de IHNV o una porción de la misma puede estar 5' de la segunda secuencia proteínica, 3' de la segunda secuencia proteínica o embebida dentro de esa secuencia.

Para los presentes propósitos, se entiende que una "porción" de una proteína significa cualquier molécula peptídica que tenga al menos 7, opcionalmente al menos 15, o al menos 25, o al menos 50, o al menos 100 aminoácidos contiguos de la proteína de referencia. Una "porción" de una secuencia génica o de ácido nucleico es cualquier parte de esa secuencia génica que comprenda al menos 20, opcionalmente al menos 50, o al menos 100, o al menos 200 nucleótidos consecutivos de la secuencia codificante completa. Una "porción" de un gen o proteína puede ser la secuencia génica o la secuencia de aminoácidos de longitud completa. En una modalidad preferida la porción de la proteína G de IHNV usada en la invención comprende la secuencia líder que se orienta a la membrana externa de la proteína G, o su secuencia de nucleótidos codificante. Opcionalmente, esta porción comprende la secuencia líder con exclusión del resto de la proteína G. La secuencia líder completa (leyendo desde el extremo N) es: MDTMITTPLILILITCGANS (Nº ID SEC: 1). Una versión truncada pero funcional de la secuencia líder puede emplearse en lugar de la secuencia líder completa.

Cuando se hace referencia a la proteína G de IHNV o la segunda proteína, o sus secuencias codificantes respectivas, debe entenderse que este término incorpora proteínas o secuencias codificantes con homología substancial. "Substancialmente homóloga", en este contexto, significa que una secuencia, cuando se compara con una secuencia de referencia, tiene al menos 60% de homología, preferiblemente al menos 70% de homología, más preferiblemente al menos 80% de homología, más preferiblemente al menos 90% de homología y lo más preferiblemente al menos 95% de homología con la secuencia de referencia.

Para determinar el porcentaje de homología de dos secuencias de aminoácidos o dos secuencias de ácido nucleico, las secuencias se alinean con propósitos de comparación óptimos (por ejemplo, pueden introducirse huecos en las secuencias de una primera secuencia de aminoácidos o ácido nucleico para el alineamiento óptimo con una segunda secuencia de aminoácidos o ácido nucleico y la secuencia no homóloga intermedia en el hueco puede pasarse por alto con propósitos de comparación).

Cuando una posición de la primera secuencia (de referencia) está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la secuencia, las moléculas son homólogas en esa posición (es decir, existe identidad en esa posición). En el caso de comparación de secuencias de ácido nucleico, también existe homología en una cierta posición cuando el triplete codónico que incluye el nucleótido codifica el mismo aminoácido en ambas moléculas que se comparan, debido a la degeneración del código genético.

El porcentaje de homología entre dos secuencias es una función del número de posiciones homólogas compartidas por las secuencias (es decir, % de homología = Nº de posiciones homólogas/Nº total de posiciones). Opcionalmente, la comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de homología pueden efectuarse usando un algoritmo matemático. Algoritmos adecuados se incorporan en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul y otros (1990) J. Mol. Biol. 215:430-10.

Por otra parte, aminoácidos con cargas idénticas pueden substituirse entre sí. Por ejemplo, la lisina y la arginina pueden substituirse entre sí. El ácido glutámico y el ácido aspártico pueden substituirse entre sí. El glutamato y el aspartato también pueden substituirse entre sí. Tales cambios neutros de carga para los aminoácidos de una proteína son reconocidos en la especialidad y la proteína resultante estaría cubierta por esta invención.

Existen muchos aislados geográficos diferentes de IHNV y otros patógenos. Existe un cierto grado de variación en la secuencia de ácido nucleico de estos patógenos y en las secuencias de aminoácidos de las proteínas que expresan. La proteína G de IHNV y la segunda proteína usadas en la invención no se restringen a ninguna fuente de aislado específica. Puede haber una ventaja en contrastar la variante de la segunda proteína con los aislados pertinentes en una zona geográfica particular cuando se diseña una vacuna para ese área.

En una modalidad de la invención se proporciona un vector de expresión de DNA en el que secuencias de ácido nucleico para proteína G de IHNV y una segunda proteína se conectan operablemente a secuencias reguladoras de la transcripción, y una vacuna de ácido nucleico que comprende el vector de expresión de DNA y un portador farmacéuticamente aceptable. Las secuencias de ácido nucleico para la proteína G de IHNV y la segunda proteína pueden estar conectadas para expresarse bajo el control de la misma secuencia o secuencias reguladoras de la transcripción, o pueden expresarse independientemente entre sí bajo el control de secuencias reguladoras de la transcripción separadas. Según se usa aquí, el término "vector de expresión de DNA" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha conectado. Preferiblemente, el vector de expresión de DNA es un vector de expresión eucariótico. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de DNA circular de doble hebra en el que pueden ligarse segmentos de DNA adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que segmentos de DNA adicionales pueden ligarse al genoma viral. Dentro de un vector de expresión recombinante, "conectado operablemente" pretende significar que la secuencia de nucleótidos de interés está conectada a la secuencia o secuencias reguladoras de una manera que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos.

Secuencias reguladoras de la transcripción incluyen promotores y secuencias de poliadenilación. La respuesta inmunitaria puede potenciarse usando otras secuencias de nucleótidos tales como oligonucleótidos estimulantes inmunitarios que tienen dinucleótidos CpG no metilados, o secuencias de nucleótidos que codifican para otras proteínas antigénicas o citoquinas adyuvantes. Secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva o inducible de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de célula huésped y aquellas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos solo en ciertas células huésped (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas para tejidos). El DNA puede estar presente en forma desnuda o puede administrarse junto con un agente que facilita la captación celular (por ejemplo, liposomas o lípidos catiónicos). La tecnología de la vacunación con DNA se revisa, por ejemplo, en WO 90/11092, incorporada aquí mediante referencia.

Para la expresión in vivo óptima en peces, puede preferirse seleccionar secuencias reguladoras de la transcripción endógenas para el pez que ha de vacunarse. Por ejemplo, pueden considerarse promotores de gen de citoquina o actina endógenos, u otras secuencias reguladoras pueden aportarse a partir de virus de DNA de pez. La vacunación con DNA que se aplica a peces se explica con más detalle en US 5.780.448.

IHNV recombinante y otras proteínas de patógeno se han expresado satisfactoriamente en una variedad de organismos, incluyendo E. coli y Pichia pastoris, usando vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles. En una vacuna recombinante, proteína G de IHNV y segunda proteína purificadas pueden mezclarse conjuntamente para la coadministración. Alternativamente, un vector de expresión que comprende una fusión de porciones de estos dos genes puede construirse mediante técnicas estándar y expresarse dentro de una célula huésped, para preparar una proteína de fusión recombinante purificada. Métodos convencionales de purificación de proteínas pueden emplearse para preparar la proteína recombinante para el uso en una vacuna. Opcionalmente, un lisado de células huésped que expresan proteína recombinante puede usarse en lugar de proteína recombinante que ha sufrido procedimientos de purificación adicionales.

Sobre la base de los resultados demostrados con la presente, se describe un método para tratar o prevenir una enfermedad infecciosa en un animal tal como un pez, que comprende administrar al animal una composición que comprende una porción de la secuencia de nucleótidos de la proteína G de IHNV (o la secuencia proteínica codificada) y una porción de la secuencia de nucleótidos de un segundo antígeno procedente del patógeno que provoca la enfermedad infecciosa (o la secuencia proteínica codificada). También se reivindica el uso de una composición que comprende una porción de la proteína G de IHNV, o su secuencia de nucleótidos codificante, y una porción de una segunda proteína procedente de un organismo patógeno, o su secuencia de nucleótidos codificante, en la fabricación de un medicamento (vacuna) para el tratamiento o la prevención de una enfermedad infecciosa en un animal (por ejemplo, un pez) provocada por dicho organismo patógeno, y/o para el tratamiento o la prevención de una infección con dicho organismo patógeno.

La "segunda" proteína (heteróloga) de la invención puede ser una proteína (o péptido o antígeno) procedente de un patógeno de peces distinto de IHNV. La segunda proteína puede ser de un patógeno de peces fúngico, viral, protozoario o bacteriano que provoca síndromes de enfermedad infecciosa. La segunda proteína es opcionalmente de un virus distinto de un rhabdovirus, o distinto de VHSV. Por ejemplo, la segunda proteína puede derivarse de virus de anemia infecciosa de salmón (ISAV), virus de necrosis pancreática infecciosa (IPNV), iridovirus, virus de necrosis nerviosa (NNV), virus de la enfermedad del páncreas del salmón (SPDV), virus de epidemia primaveral de la carpa (SVCV), virus de septicemia hemorrágica viral (VHSV), Renibacterium salmoninarum (agente causal de la enfermedad renal bacteriana), Piscirickettsia salmonis (agente causal de la septicemia por ricketsia en salmonoides), especies de Vibrio, especies de Aeromonas, Yersinia ruckerii, especies de Nocardia, especies de Pseudomonas, Photobacterium damselae, etc. En una modalidad preferida la segunda proteína es de origen viral. Un número grande y creciente de polipéptidos de estos y otros organismos patógenos se ha purificado y/o clonado y expresado y están disponibles o se proporcionan junto con proteína G de IHNV o su secuencia codificante en una composición de vacuna. Ejemplos preferidos incluyen proteínas de IPNV VP1, VP2, VP3 y NS y sus secuencias de nucleótidos codificantes; proteínas de ISAV descritas en WO 01/10469, incluyendo hemaglutinina, nucleocápsida, polimerasa y proteínas P4 y P5 del segmento 7, y sus secuencias de nucleótidos codificantes; proteínas de P. salmonis descritas en WO 01/688865, incluyendo OspA e IcmE y sus secuencias de nucleótidos codificantes; proteínas de nodavirus tales como la nucleocápsida; y polipéptidos estructurales procedentes de SPDV y sus secuencias de nucleótidos codificantes (descritos en WO 99/58639). Una composición de vacuna preferida de acuerdo con la invención comprende un vector de expresión de DNA que tiene una porción de la secuencia de nucleótidos de la proteína G de IHNV fusionada en el marco con una porción de la secuencia VP2 de IPNV o una porción de la secuencia líder de la proteína G de IHNV fusionada en el marco con una porción de la secuencia de hemaglutinina de ISAV.

Las posibles especies de peces principales para recibir la vacuna de la invención son peces salmónidos, incluyendo especies de salmón y trucha, particularmente salmón coho (Oncorhynchus kisutch), trucha de arroyo (Salvelinus fontinalis), trucha parda (Salmo trutta), salmón rey (Oncorhynchus tshawytscha), salmón masou (Oncorhyncus masou), salmón rosa (Oncorhynchus gorbuscha), trucha arcoiris (Oncorhynchus mykiss), salvelino (Salvelinus alpinus) y salmón del Atlántico (Salmo salar). Sin embargo, cualquier otra especie de pez susceptible de una enfermedad infecciosa puede beneficiarse, tales como especies de peces ornamentales, koi, peces de colores, carpa, pez gato, pez de cola amarilla, besugo, corvina, lucio, hipogloso, merlango, tilapia, rodaballo, pez lobo, etc.

La "segunda" proteína (heteróloga) de la invención también puede ser un antígeno procedente de un patógeno de animales distintos de peces, especialmente mamíferos tales como seres humanos. La segunda proteína puede ser de un patógeno fúngico, viral, protozoario o bacteriano que provoca síndromes de enfermedad infecciosa en animales. Una lista no limitativa de posibles patógenos incluye: virus de la hepatitis (por ejemplo, HBV, HCV), HIV
y otros genes de virus de inmunodeficiencia, virus de influenza, virus del sarampión, coronavirus, herpesvirus, poliovirus, rinovirus, rotavirus, adenovirus, papilomavirus, hantavirus, parvovirus y los virus específicos virus de diarrea viral bovina (BVDV), herpesvirus bovino (BHV), virus de la enfermedad de las patas y la boca, virus sincitial respiratorio bovino (BRSV), virus de parainfluenza tipo 3 (P13), rinotraqueitis bovina infecciosa (IBR), virus del síndrome respiratorio y reproductor porcino (PRRSV); especies de Giardia, Yersinia, Leishmania, Amoeba, Entamoeba, Trypanosoma, Toxoplasma, Plasmodium, Cryptosporidia, Candida, Cryptococcus, Histoplasma, Coccidioides, Blastomyces,
Staphylococcus, Streptococcus, Pneumococcus, Neisseria, Listeria, Campylobacter, Chlamydia, Eimeria, Clostridia, Pasteurella, Brachyspira, Salmonella, Legionella, Mycobacteria, Mycoplasma (por ejemplo, M. bovis, M. hyopneu-moniae), Treponema, Borrelia, Leptospira, Ehrlichia, Rickettsia, Brucella, Neospora, Fusobacterium, E. coli,
Mannheimia haemolytica, Haemophilus somnus, Actinobacillus pleuropneumoniae, Anaplasma, etc.

Cualquier animal vertebrado puede inmunizarse con las vacunas de la invención. Puede hacerse mención particular a seres humanos, las principales especies de animales terrestres de granja, a saber vacas, caballos, ovejas, cerdos y aves de corral, y animales de compañía.

Las vacunas de dos componentes pueden prepararse conjuntamente en una sola composición de vacuna, o pueden prepararse separadamente para la administración separada o para la coadministración. Opcionalmente, los componentes individuales se proporcionan en forma de un estuche, para administración secuencial, separada o simultánea. Los dos componentes pueden mezclarse conjuntamente inmediatamente antes de la administración.

Para peces, la ruta de administración preferida de las vacunas de la invención es mediante inyección en el músculo (en particular, en el músculo epaxial). Opciones alternativas son la inyección en la cavidad peritoneal (para peces más grandes), oralmente en el alimento o mediante inmersión en agua marina o en agua dulce. Se recomienda que el pez tenga dos gramos o más de peso corporal para la administración de la vacuna de la invención mediante inyección, preferiblemente 10 gramos o más. Para la inmersión o la administración oral, se prefiere que los peces tengan un peso corporal de al menos 0,1 g, opcionalmente al menos 0,5 g, habitualmente al menos 2 gramos.

En animales distintos de peces, las vacunas, en particular las vacunas de ácido nucleico, se aportan a menudo mediante inyección intramuscular o mediante aporte a las membranas mucosales; las técnicas de aporte incluyen, pero no se limitan a: electroporación, inyección subcutánea o transdérmica, microinyección, inyección en chorro, coprecipitación de fosfato cálcico-DNA, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por polibreno, fusión de liposomas, lipofección, fusión de protoplastos, infección viral, micropartículas, portadores bacterianos o biolística (bombardeo de partículas, por ejemplo, usando una pistola génica).

La vacuna de la invención puede administrarse a animales con propósitos profilácticos o terapéuticos. La vacuna es capaz de inducir protección a largo plazo contra la enfermedad infecciosa elegida. Protección "a largo plazo" en el caso de peces significa una respuesta inmunitaria protectora durante más de 7 días, más preferiblemente más de 20 días y lo más preferiblemente más de 70 días después de la vacunación.

La dosificación eficaz de vacuna puede variar dependiendo del tamaño y la especie del sujeto y de acuerdo con el modo de administración. La dosificación óptima puede ser determinada a través de un método de tanteos por un doctor, veterinario o especialista en acuacultura. Para peces, las vacunas pueden comprender entre 0,01 y
0,5 g, preferiblemente entre aproximadamente 0,05 y 0,2 g de proteína recombinante en una dosificación simple. Un intervalo de dosificación adecuado para vacunas de ácido nucleico puede ser tan bajo como picogramos o tan alto como cantidades de mg, pero normalmente es de aproximadamente 0,01 a 100 \mug, preferiblemente de 0,1 \mug a 50 \mug por dosis unitaria, más preferiblemente de aproximadamente 1 \mug a 20 \mug y lo más preferiblemente de aproximadamente 5 \mug a 10 \mug por dosis unitaria. Debido al estrés sufrido por los peces en respuesta a la vacunación, se prefiere que la vacuna se proporcione como una vacuna de una sola aplicación, en una sola forma de dosificación. Para vacunas inyectables, una unidad de dosificación simple es adecuadamente de 0,025 a 0,5 ml, preferiblemente de 0,05 a 0,2 ml, opcionalmente aproximadamente 0,1 ml, en volumen.

Típicamente, las vacunas se preparan como soluciones, emulsiones o suspensiones líquidas para inyección o aporte en agua. También pueden prepararse formas sólidas (por ejemplo, polvo) para disolución en, o suspensión en, vehículos líquidos o para mezclar con alimento sólido, antes de la administración. La vacuna puede liofilizarse, opcionalmente secarse por congelación, en una forma fácil de usar para la reconstitución con un diluyente estéril, por ejemplo, la vacuna liofilizada puede reconstituirse en solución salina al 0,9% (opcionalmente proporcionada como parte del producto de vacuna envasado). Las vacunas de ácido nucleico son particularmente adecuadas para la liofilización debido a la estabilidad y la vida útil prolongada de las moléculas. Alternativamente, la vacuna puede proporcionarse en una solución salina. Las formas líquidas o reconstituidas de la vacuna pueden diluirse adicionalmente en un pequeño volumen de agua (por ejemplo, de 1 a 10 volúmenes) antes de la adición a un depósito, tanque o baño para la administración a los peces mediante inmersión. Las composiciones farmacéuticas de vacuna de la invención pueden administrarse en una forma para liberación inmediata o liberación prolongada.

Portadores o vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen excipientes convencionales, y pueden ser, por ejemplo, disolventes tales como agua, aceite o solución salina, dextrosa, glicerol, sacarosa, tricaína, agentes humectantes o emulsionantes, agentes de aumento de volumen, revestimientos, aglutinantes, cargas, desintegrantes, diluyentes, lubricantes, agentes tamponadores del pH o adyuvantes convencionales tales como dipéptidos muramílicos, avridina, hidróxido de aluminio, aceites, saponinas, copolímeros de bloques y otras substancias conocidas en la técnica. En el caso de vacunas de ácido nucleico, el vector de expresión de DNA puede aportarse desnudo o puede proporcionarse en forma de complejos de lípido catiónico-DNA, liposomas, coprecipitados con fosfato cálcico, adsorbido sobre micropartículas, etc.

En algunos casos, puede ser deseable combinar la vacuna de la invención con una vacuna convencional contra un patógeno infeccioso (vacuna de antígenos de patógeno muerto o patógeno recombinante o vacuna de ácido nucleico de patógeno) en una vacuna de combinación, o en un estuche que comprende ambos componentes para la administración separada, secuencial o simultánea, para el tratamiento o la prevención de una enfermedad infecciosa provocada por el patógeno.

Ejemplo 1 Evaluación de vacunas de ácido nucleico contra virus de necrosis pancreática infecciosa en salmón del Atlántico, Salmo salar Vacunación

Salmones del Atlántico jóvenes (peso corporal 9-26 g) se mantienen en dos depósitos circulares de 1 metro de diámetro con agua dulce a 8ºC y se mantienen en ayunas 24 horas antes de la vacunación. Para la vacunación, los peces se anestesian en éster etílico de ácido 3-aminobenzoico (MS222, Sigma, Poole, Reino Unido) a una concentración de aproximadamente 0,5 g/litro. Las vacunas de ácido nucleico (10 \mug de DNA/50 \mul de dosis) se administran mediante inyección intramuscular en el costado dorsal izquierdo, en el área justo por debajo de la aleta dorsal. Vacuna de IPNV muerta con adyuvante de aceite y control de PBS se administran mediante inyección intraperitoneal (100 \mul). Cada grupo de tratamiento tiene 40 peces y hay dos réplicas por vacuna para cada una de 6 vacunas.

Los grupos de prueba reciben las siguientes composiciones:

(1): el vector pUK: un vector de clonación que tiene el gen de resistencia a la kanamicina, el promotor inmediato-temprano de CMV, un sitio de clonación múltiple y la señal de poliadenilación de hormona de crecimiento bovino (poliA de BGH).

(2): pUK + VP2: el vector pUK que incorpora la secuencia de codificación completa de VP2 de IPNV dentro del sitio de clonación múltiple del vector.

(3): pUK + IHNG: el vector pUK que incorpora la secuencia de codificación completa de la proteína G de IHNV dentro del sitio de clonación múltiple del vector.

(4): pUK + IHNG + VP2: el vector pUK que incorpora la secuencia de codificación completa de proteína VPS de IPNV fusionada en el marco a la glicoproteína (G) del virus IHN dentro del sitio de clonación múltiple, de modo que la proteína G es 5' de la VP2.

(5): IPNV + aceite: una preparación inactivada de virus de IPN, con adyuvante de aceite.

(6): PBS (control negativo).

Casi 6 meses después de la vacunación, los peces se adaptan durante un período de 5 días. El flujo de agua marina a los depósitos de los peces se incrementa gradualmente, mientras que el flujo de agua dulce se reduce, de modo que al final de los 5 días los peces están en agua marina de concentración total.

Estimulación de Cohabitación

807 grados-día después de la vacunación, un sobrenadante de paso 2 congelado de cepa "Cole-Deep" de virus de IPN se diluye cinco veces en PBS estéril para dar una concentración final de 1 x 10^{7} TCID_{50}/ml. Los peces se anestesian en MS222 y se estimulan en partidas mediante inyección intraperitoneal de 100 \mul de suspensión de virus, de modo que cada pez recibe una dosis de 10^{6} TCID_{50}. La temperatura del agua marina en la estimulación es aproximadamente 11ºC y el caudal de agua es aproximadamente 5 litros por minuto en cada tanque.

Los cadáveres se retiran dos veces al día en la primera observación. El experimento se termina 8 semanas después de la estimulación.

Conclusiones

1

El modelo de estimulación basado en la cohabitación con salmones del Atlántico jóvenes inyectados intraperitonealmente es satisfactorio: las mortalidades acumulativas en cohabitantes inyectados intraperitonealmene alcanzan un promedio de 41,25%, y esto se repite estrechamente a través de los 4 tanques de estimulación con una desviación estándar de 3,95%.

El comportamiento de la vacuna de IPNV muerta administrada con aceite se determina con relación a los controles vacunados con PBS. La vacuna muerta da alguna protección, con un porcentaje de supervivencia relativo (RPS) en comparación con los controles vacunados con PBS de más de 25%.

El comportamiento de las vacunas de ácido nucleico se compara bien con el plásmido vacío o bien con el plásmido que contiene el gen para la proteína G de IHNV. Los plásmidos de control se comparan con los controles de PBS vacunados simuladamente para determinar si el plásmido vacío o el plásmido que contiene la proteína G de IHNV tiene algún efecto protector. El vector plasmídico pUK da un efecto protector insignificante. Cuando la proteína VP2 de IPNV se incluye en el vector, se da una protección significativa (31% de RPS) en comparación con controles vacunados con PBS. Cuando el gen de la proteína G de IHNV se incluye en el vector, sin genes de IPNV, el efecto protector asciende hasta 17% de RPS en comparación con PBS.

La vacuna con el comportamiento más sobresaliente es la NAV que contiene el gen para proteína G de IHNV en tándem con la VP2 de IPNV. Los peces vacunados con esta vacuna muestran un porcentaje de supervivencia relativo de 52% de RPS en comparación con los controles vacunados con PBS.

En conclusión, la preparación viral muerta estándar con adyuvante de aceite se comporta adecuadamente en este experimento, pero el comportamiento de las NAVs que contienen VP2 es mucho mejor. En particular, la NAV que contiene VP2 en tándem con proteína G de IHNV es la más eficaz.

Ejemplo 2 Evaluación de vacunas de ácido nucleico contra ISAV

Salmones del Atlántico jóvenes de peso medio 10 g (< 6 meses de edad) se aclimatan durante un número de 7 días a agua a 12 \pm 1ºC que fluye a una velocidad de 2,5 l/min. Los peces se alimentan con una dieta en pellas comercial a una dosis diaria de 1,5% de peso corporal.

Antes de la vacunación los peces se anestesian en 30 mg/l de benzocaína. Vacunas de ácido nucleico (10 \mug de DNA/50 \mul de dosis) se administran mediante inyección intramuscular en el músculo epaxial inmediatamente anterior a la aleta dorsal. Vacuna en emulsión de aceite se administra mediante inyección intraperitoneal (150 \mul). Cada grupo de vacuna de réplica tiene 55 peces y hay dos réplicas por vacuna para cada una de 5 vacunas.

Los grupos de prueba reciben las siguientes composiciones:

(2): pUK-HA: el vector pUK que incorpora la secuencia de codificación completa de proteína de hemaglutinina de ISAV en el sitio de clonación múltiple.

(3): pUK-IHNg: el vector pUK que incorpora la secuencia completa de la proteína G de IHNV en el sitio de clonación múltiple.

(4): pUK-HA-IHNg: el vector pUK que incorpora la secuencia de codificación completa de proteína de hemaglutinina de ISAV en el sitio de clonación múltiple y fusionado en su extremo 5' a la secuencia líder de la proteína G de IHNV.

(5): ISAV + aceite: una preparación inactivada de virus de ISA, con adyuvante de aceite.

Los peces se estimulan en 850,5 grados-día. Se usa una estimulación de cohabitación en la que salmones de la misma reserva se sumergen hasta la aleta adiposa, se les administra una inyección i.v. con 0,1 ml de ISAV cultivado (aproximadamente 10^{4} TCID_{50} por pez) y se añaden a cada tanque de peces tratados.

Los peces de cada tanque se verifican dos veces al día con respecto a la mortalidad durante 31 días. El porcentaje de supervivencia relativo (RPS) se calcula como sigue:

RPS = 1-(% de mortalidad de vacunas/% de mortalidad de control de pUK) x 100

Resultados

La mortalidad acumulativa para el grupo de control negativo (plásmido pUK) es 94%. La mejor protección es inducida mediante inyección de la vacuna de ISAV inactivada monovalente de control positivo (94% de RPS). La inyección del plásmido pUK-IHNg como un control negativo induce alguna protección no específica (26% de RPS). pUK-HA confiere un alto nivel de protección (49% de RPS). Esta protección se aumenta significativamente mediante la adición de la secuencia líder de la proteína G de IHNV en el extremo 3' (pUK-HA-IHNg) (RPS 60%). Estos resultados proporcionan un apoyo adicional de los beneficios de incluir la secuencia de la proteína G de IHNV (o mínimamente, la secuencia líder de la misma) en una vacuna de ácido nucleico para reforzar la inmunidad hacia una enfermedad infecciosa distinta de IHNV. La secuencia líder de la proteína G puede ser responsable y orientar el antígeno heterólogo a la superficie celular dentro del pez, o pueden existir motivos especiales dentro de la proteína que estimulan no específicamente el sistema inmunitario del pez.

2

<110> Novartis AG

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<120> Proteína G de IHNV para la Estimulación Inmunitaria

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<130> 32647

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<140> PCT/EP2003/10305

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<141> 2003-09-16

\vskip0.400000\baselineskip

<150> GB 0221552.3

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<151> 2002-09-16

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<150> GB 0221553.1

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<151> 2002-09-16

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<160> 1

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<170> PatentIn versión 3.3

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<210> 1

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<211> 20

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<212> PRT

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<213> Virus de necrosis hematopoyética infecciosa

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<400> 1

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\sa{Met Asp Thr Met Ile Thr Thr Pro Leu Ile Leu Ile Leu Ile Thr Cys}

\sac{Gly Ala Asn Ser}

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Claims

1. Un vector de expresión de DNA que comprende una secuencia codificante de una porción de la secuencia de codificación de la proteína glicoproteína G de virus de necrosis hematopoyética infecciosa IHNV y que además comprende una porción de una secuencia de codificación de una segunda proteína procedente de un organismo patógeno distinto de IHNV, en donde la secuencia codificante de la proteína G de IHNV y la porción de la secuencia de codificación de la segunda proteína están fusionadas en el marco sobre el mismo vector de expresión de DNA.

2. Un vector de expresión de DNA de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de codificación de la segunda proteína es de un patógeno de pescado.

3. Un vector de expresión de DNA de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que comprende la secuencia líder de la proteína G de IHNV.

4. Un vector de expresión de DNA de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la secuencia líder de la proteína G de IHNV es el Nº ID SEC: 1.

5. Un vector de expresión de DNA de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende la secuencia de codificación de la proteína G de IHNV completa.

6. Un vector de expresión de DNA de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que dicha segunda proteína es de un patógeno seleccionado de: ISAV, VHSV, IPNV, NNV, iridovirus, SVCV, SPDV, Renibacterium salmoninarum, Piscirickettsia salmonis, especies de Vibrio, especies de Aeromonas, Yersinia ruckerii, especies de Pseudomonas, especies de Nocardia y Photobacterium damselae subespecie piscicida.

7. Un vector de expresión de DNA de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la segunda proteína es la proteína VP2 procedente de IPNV o la proteína de hemaglutinina procedente de ISAV.

8. Un vacuna de ácido nucleico que comprende un vector de expresión de DNA de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 con un portador farmacéuticamente aceptable.

9. Una proteína de fusión que comprende una porción de la proteína G de IHNV y una porción de una segunda proteína derivada de un organismo patógeno de peces distinto de IHNV.

10. Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 9, en la que dicha segunda proteína es un patógeno seleccionado de ISAV, IPNV, NNV, iridovirus, SVCV, SPDV, Renibacterium salmoninarum, Piscirickettsia salmonis, especies de Vibrio, especies de Aeromonas, Yersinia ruckerii, especies de Pseudomonas, especies de Nocardia y Photobacterium damselae subespecie piscicida.

11. Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 10, en la que la segunda proteína es VP2 de IPNV.

12. Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 11, en la que la segunda proteína es hemaglutinina procedente de ISAV.

13. Una vacuna de ácido nucleico que comprende una secuencia codificante de una proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10-12 con un portador farmacéuticamente aceptable.

14. Uso de un vector de expresión de DNA de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o una proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9-12 en la preparación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de infecciones patógenas en peces.

15. Uso de acuerdo con la reivindicación 14 en la preparación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de infecciones bacterianas, virales, fúngicas o protozoarias en peces.

16. Uso de acuerdo con la reivindicación 14 o la reivindicación 15, en la preparación de un medicamento para reforzar la respuesta inmunitaria potenciando de ese modo la protección contra el patógeno del que se deriva la segunda proteína.