DE69715879T2 - Intradermaler polynukleotid-impfstoff aus rind - Google Patents

Intradermaler polynukleotid-impfstoff aus rind

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Description

  • Die Erfindung betrifft eine Verbesserung für das Impfen von Rindern.
  • Das Immunisieren und Impfen durch direkte Verabreichung von Nucleotidsequenzen, die für ein immunogenes Protein kodieren (als Polynucleotid- oder DNA-Impfen bezeichnet) ist in der Patentanmeldung WO-A-90/11092 beschrieben worden. Das Protein, das für die insertierte Polynucleotidsequenz kodiert, ist in der Lage, in den Zellen exprimiert zu werden und die Entwicklung einer Immunantwort herbeizuführen. In jener Patentanmeldung ist die Verwendung von reiner DNA sowie von DNA vorgesehen, die in Liposomen enthalten ist. Vorzugsweise wird die DNA in den Muskel eingeführt. Die DNA kann auch in die Haut, in bestimmte Organe oder in das Blut eingeführt werden, wobei die Injektion auf verschiedene Arten und Weisen wie auf intradermalem, transkutanem oder intravenösem Wege durchgeführt werden kann.
  • Die Arbeiten, die den ersten Beschreibungen dieses Verfahrens gefolgt sind, haben das Interesse daran gezeigt, entweder den intramuskulären Weg durch Injektion von DNA oder die "Gene-gun"-Methode anzuwenden, die darin besteht, metallische Mikroteilchen wie mit DNA beschichtete Goldmikroteilchen direkt in die an der Oberfläche befindlichen Zellschichten der Haut zu schießen.
  • J. B. Ulmer et al., Science, Bd. 259, 19. März 1993, 1745-1749, G. J. M. Cox et al., J. of Virology, Bd. 67, Nr. 9, September 1993, 5664-5667 und Z. Q. Xiang in Virology, 199, 132-140 (1994) haben Impfversuche mit DNA auf intrasmuskulärem Wege beschrieben.
  • Weiterhin ist in großem Umfang demonstriert worden, dass der intramuskuläre Weg bessere Ergebnisse als der intradermale Weg ergibt, wobei sich aber am Ende die Verwendung der "gene gun" als der viel versprechendere Weg erwiesen hat, da mit dieser Technik die verabreichten Dosen sehr viel kleiner sind, als die Dosen, die beim intramuskulären Weg erforderlich sind. Hierüber kann man sich aus F. Fynan et al., in P.N.A.S., USA, Bd. 90, 11478-11482, Dezember 1993, WO-A-95/20660, unterrichten.
  • Weiterhin haben D. Tang et al., Nature, 356, 152-154, 12. März 1992, das Fehlen einer Immunantwort nach intradermaler Verabreichung von humanem Wachstumshormon mittels einer in die Unterhaut gehenden Spritze gezeigt. Dafür haben die Autoren das Erhalten einer Immunantwort mittels der "Gene-Gun"-Technik demonstriert.
  • Allein E. Raz et al., P.N.A.S., USA, Bd. 91, 9519-9523, September 1994, haben berichtet, dass die intradermale Verabreichung erhöhte Antikörpergehalte induzieren konnte.
  • Andererseits hat die "Gene-Gun"-Technik den Nachteil, dass sie schwierig und teuer in der Durchführung ist, da sie die Herstellung und Verwendung mit DNA beschichteter Goldteilchen und deren Verabreichung mittels eines speziellen Treibmittels erfordert.
  • Es ist daher ein alternatives Verfahren entwickelt worden, für welches die Verwendung einer Vorrichtung zur Verabreichung durch einen Flüssigkeitsstrahl vorgesehen ist. Dazu sind P. A. Furth et al. in Analytical Biochemistry, 205, 365-368 (1992) zu nennen, worin die Verwendung eines als Ped-o-jet bezeichneten Gerätes beschrieben ist, das ein Injektor ist, der zur Abgabe von menschlichen Impfstoffen in Muskelgewebe für die Verabreichung eines DNA-Impfstoffs verwendet wird. Von den Autoren ist mitgeteilt worden, dass der Injektor die DNA durch die Haut passieren und die Muskeln, das Fettgewebe und das Brustgewebe lebender Tiere erreichen lassen kann.
  • H. L. Vahlsing et al. beschreiben im Journal of Immunological Methods, 75, 11-22 (1994) die Verwendung eines als Med-E-Jet bezeichneten Gerätes für eine transkutane und intramuskuläre Verabreichung.
  • Weiterhin sind noch M. Jenkins et al. in Vaccine, Bd. 13, Nr. 17, 1658-1664 (1995) zu nennen, welche die Anwendung der Impfung durch einen Strahl in den Muskel beschreiben.
  • Das Bovine Respiratorische Synzytialvirus BRSV ist in der ganzen Welt verbreitet und kann schwere Erkrankungen der unteren Atemwege bei Rindern verursachen, wobei diese Krankheit ähnlich derjenigen ist, die vom Respiratorischen Synzytialvirus HRSV bei Kindern ausgelöst wird. Im Laufe einer Untersuchung ist festgestellt worden, dass mehr als 95% der zwei Jahre alten Rinder mit dem Virus BRSV infiziert waren (Van der Poel et al., Archives of Virology, 133, 309-321 (1993)).
  • Es besteht Bedarf an einem Impfstoff gegen das Virus BRSV, wobei jedoch keine Entwicklung wirksamer Impfstoffe stattgefunden hat. Die ersten Versuche des Impfens von Kindern haben zur Milderung der Krankheit nach einer natürlichen Infektion geführt, was nahelegt, dass die Impfung gefährlich sein könnte (Anderson et al., Journal of Infectious Diseases, 171, 1-7 (1995)). Es ist jedoch bekannt, dass Antikörper gegen die zwei großen Oberflächenglykoproteine F (Fusionsprotein) und G (Anheftungsprotein) eine Rolle beim Schutz spielen könnten (Kimman und Westenbrink, Archives of Virology, 112, 1-25 (1990)). Weiterhin sind zahlreiche Arbeiten mit Tierversuchen an Mäusen, Hunden und Frettchen durchgeführt worden. Dagegen haben Impfversuche an Rindern mit dem gereinigten F-Protein noch keine schlüssigen Ergebnisse wie bei den mit HRSV geimpften Kindern gezeigt, wobei die Kälber neutralisierende Antikörper und nicht neutralisierende Antikörper entwickelten, welche die Immunantwort bei einer auf den Virus folgenden Infektion stören können (L. D. Nelson et al., Am. J. Vet. Res., Bd. 53, Nr. 8, August 1992, 1315- 1321).
  • Deshalb liegt der Erfindung als Aufgabe zugrunde, eine Perfektionierung für die Impfung von Rindern mit DNA bereitzustellen, welche es erlaubt, für eine Impfung zu sorgen, die wenigstens so effizient wie die intramuskuläre Impfung oder die Impfung mit einer "gene gun" ist, aber leichter durchzuführen und weniger teuer ist.
  • Weiterhin liegt der Erfindung als Aufgabe zugrunde, eine solche Perfektionierung bereitzustellen, die weniger aggressiv ist, im Wesentlichen, was die in den Geweben zurückbleibenden Impfrückstände betrifft.
  • Des Weiteren liegt der Erfindung als Aufgabe zugrunde, was die Impfung von für den Verzehr bestimmter Tiere betrifft, eine derart geringe Schädlichkeit sicherzustellen, dass die Impfung für den Verkauf des Fleisches keine nachteiligen Wirkungen verursacht.
  • Darüber hinaus liegt der Erfindung als Aufgabe zugrunde, ein Mittel für ein massenhaftes Impfen bereitzustellen.
  • Der Erfindung liegt insbesondere als Aufgabe zugrunde, einen solchen Impfstoff bereitzustellen, der den Schutz der Rinder vor dem Virus BRSV, IBR, BVD oder PI-3 ermöglicht.
  • Von den Erfindern ist festgestellt worden, dass es möglich ist, diese Aufgaben zu lösen, indem der Impfstoff spritzenfrei mittels eines Flüssigkeitsinjektors intradermal verabreicht wird, wobei, im Wesentlichen in der Oberhaut, Lederhaut und Unterhaut, fünf Verteilungspunkte für den Impfstoff sichergestellt werden. Die Versuche, die von den Erfindern auf dem Gebiet des Impfens von Rindern gegen das Bovine Respiratorische Synzytialvirus BRSV durchgeführt worden sind, haben es erlaubt, auf diesem Wege Immunisierungsergebnisse zu erhalten, die besser als diejenigen sind, die auf intramuskulärem Wege erhalten werden.
  • Erfindungsgemäß wird erstmalig das Impfen von Rindern mit Polynucleotidimpfstoffen (oder DNA- bzw. auch Plasmidimpfstoffen) vorgeschlagen, die entwickelt sind, um intradermal mittels eines spritzenfreien Injektors durch einen Flüssigkeitsstrahl verabreicht zu werden.
  • Die Erfindung hat deshalb eine Polynucleotidimpfstoffformulierung zum Gegenstand, die eine intradermal wirksame Menge eines Plasmids umfasst, das eine für ein Immunogen kodierende DNA-Sequenz und einen die in-vivo-Expression dieses Immunogens in den Hautzellen ermöglichenden Promoter verknüpft, wobei diese Impfstoffformulierung für die intradermale Verabreichung (sie ist insbesondere auf die Oberhaut-, Lederhaut- und Unterhautzellen gerichtet, wobei die Verabreichung speziell darauf abzielt, Antigene zu erzeugen, die in den Langerhans-Dendritenzellen der Haut, die sich im Wesentlichen in der Oberhaut befinden, exprimiert werden) durch eine Vorrichtung zur intradermalen Verabreichung durch Flüssigkeitsstrahlen, insbesondere das als Pigjet bezeichnete Gerät (hergestellt und vertrieben von Endoscoptic, Laons, Frankreich), oder eine gleichwertige Vorrichtung, die den Impfstoff durch einen Kopf mit fünf Düsen unter den denen des Pigjet gleichwertigen Bedingungen abgibt, geeignet ist. Ganz allgemein sind die erfindungsgemäßen Impfstoffformulierungen für eine Verabreichung durch eine Vorrichtung zur Verabreichung mittels Flüssigkeitsstrahlen, die 1 bis 10, vorzugsweise 4 bis 6, und besonders bevorzugt 5 oder 6 Düsen besitzt, geeignet.
  • Dies geschieht durch einen Träger, der für den intradermalen Weg geeignet ist, wie Wasser, ein Puffer, physiologisches Wasser, Liposomen, kationische Lipide und im Allgemeinen einen Träger mit niedriger Viskosität, die insbesondere gleich oder nahe der des Wassers ist, und mit einem Dosisvolumen, das sinnvoll und auf diesem Wege wirkungsvoll ist.
  • Insbesondere, aber nicht ausschließlich, mit einer Vorrichtung, die 5 oder 6 Düsen besitzt, d. h. die Dosis durch 5 oder 6 Öffnungen und in Form von 5 oder 6 Strahlen mit gleichem Volumen abgibt, wobei das Dosisvolumen vorteilhafterweise 0,1 bis 0,9 ml, vorzugsweise 0,2 bis 0,6 ml, und besonders bevorzugt etwa 0,4 bis 0,5 ml betragen kann.
  • Die Impfstoffformulierung umfasst eine intradermal wirksame Plasmidmenge, die im Allgemeinen 10 ng bis 1 mg, vorzugsweise 100 ng bis 500 ug, und besonders bevorzugt 0,5 ug bis 50 ug Plasmid beträgt.
  • Typischerweise wird erfindungsgemäß versucht, die Impfstoffformulierung an mehreren Punkten zu verabreichen, um die Transfektion der Zellen durch die Plasmide zu optimieren. Dies drückt sich vorzugsweise in der Verwendung eines Spritzkopfs mit mehreren Löchern aus. Dies kann auch mit mehrfachen Anwendungen der Vorrichtung kombiniert werden, d. h. dass die Impfstoffdosis, außer dass die Vorrichtung mehr als einmal verwendet wird, auch auf verschiedene Stellen verteilt wird. Besonders bevorzugt kann eine Vorrichtung mit 5 oder 6 Löchern einmal oder mehrfach, vorzugsweise zweimal, verwendet werden.
  • Ein typischer erfindungsgemäßer Fall ist eine DNA- Sequenz, die für ein Immunogen des Virus BRSV und insbesondere für das Gen G und/oder F dieses Virus kodiert (beispielsweise Stamm 391-2, R. Lerch et al., Virology, 181, 118-131 (1991)).
  • Ein weiterer typischer erfindungsgemäßer Fall ist eine DNA-Sequenz, die für ein Immunogen des Virus der Infektiösen Bovinen Rhinotracheitis IBR oder des Virus der Bovinen Herpesvirus 1 Infektion BHV kodiert, insbesondere für das Gen gB und/oder das Gen gD (beispielsweise Stamm ST: Leung-Tack, P. et al., Virology, 199, 409-421 (1994)).
  • Ein anderer typischer erfindungsgemäßer Fall ist eine DNA-Sequenz, die für ein Immunogen des Virus der Bovine Virusdiarrhoe Mucosal Disease BVD kodiert, insbesondere das Gen E2 und/oder E1 (beispielsweise Stamm Osloss: L. De Moerlooze et al., J. Gen. Virol., 74, 1433-1438 (1993)). Es können auch Gene der verschiedenen Unterarten der BVD, beispielsweise von Nordamerika und Europa (A. Dekker et al., Veterinary Microbiol., 47, 317-329 (1995)), miteinander verknüpft werden.
  • Wieder ein anderer typischer erfindungsgemäßer Fall ist eine DNA-Sequenz, die für ein Immunogen des Parainfluenza-Typ-3-Virus PI-3, insbesondere für das Gen HN und/oder das Gen F, vorzugsweise das Gen HN (Gensequenz F und HN, die von H. Shibuta 1987 hinterlegt worden ist, Zugangsnummer der Sequenz in der Genbank = Y00115), kodiert.
  • Bei einer Kombination von zwei Genen, beispielsweise F und G von BRSV, HN und F von PI-3 oder gD und gB von IBR, können die entsprechenden Sequenzen in dasselbe Plasmid oder in unterschiedliche Plasmide insertiert werden.
  • Unter einem Gen eines Pathogens ist nicht nur das vollständige Gen, sondern sind auch die verschiedenen Nucleotidsequenzen zu verstehen, wobei hier Fragmente eingeschlossen sind, die das Vermögen, eine Schutzantwort auszulösen, behalten haben. Der Terminus "Gen" umfasst daher Nucleotidsequenzen, die denen gleichwertig sind, die in den Beispielen genau beschrieben werden, d. h. die Sequenzen sind verschieden, kodieren jedoch für dasselbe Protein. Er umfasst auch die Nucleotidsequenzen anderer Stämme des betrachteten Pathogens, wobei ein Querschutz oder ein spezifischer Schutz vor dem Stamm oder der Stammgruppe sichergestellt wird. Er umfasst weiterhin Nucleotidsequenzen, die, um die in-vivo-Expression durch das Wirtstier zu erleichtern, modifiziert worden sind, aber für dasselbe Protein kodieren.
  • Es ist selbstverständlich, dass die Erfindung in der Anpassung der DNA-Impfstoffe des Standes der Technik an eine intradermale Verabreichung durch eine Vorrichtung zur Verabreichung mittels Flüssigkeitsstrahlen besteht. Falls dies zu Modifizierungen der Impfstoffformulierung und insbesondere von Viskosität, zu verabreichender DNA- Menge und zu verabreichendem Dosisvolumen führt, ist es selbstverständlich, dass die Erfindung weiterhin auf alle im Stand der Technik beschriebenen DNA- Impfstoffkonstruktionen gerichtet ist. Der Fachmann kann sich daher auch auf den Stand der Technik des Gebiets der DNA-Impfung und insbesondere auf die weiter oben diskutierten Dokumente beziehen.
  • Insbesondere umfassen die in den erfindungsgemäßen Impfstoffformulierungen verwendeten Transkriptionseinheiten einen starken eukaryontischen Promotor wie den Promotor hCMV IE.
  • Die erfindungsgemäße Impfstoffformulierung kann in einer Flasche aufbewahrt werden, die mehrere Dosen, beispielsweise 10 bis 100 Dosen, enthält und für ein Gerät zur intradermalen Verabreichung durch Flüssigkeitsstrahlen, vorzugsweise den Pigjet, geeignet ist.
  • Die Erfindung hat auch eine tragbare Vorrichtung für das Impfen von Rindern zum Gegenstand, die ein Gerät zur Verabreichung durch Flüssigkeitsstrahlen und eine Flasche umfasst, die geeignet ist, wie zuvor beschrieben mehrere Dosen einer Impfstoffformulierung zu enthalten, wobei das Verabreichungsgerät für die intradermale Abgabe einer Dosis der Impfstoffformulierung entworfen ist.
  • Vorzugsweise umfasst das Verabreichungsgerät einen Spritzkopf, der mit 1 bis 10, insbesondere 4 bis 6, und vorzugsweise 5 oder 6 Düsen versehen ist.
  • Das Verabreichungsgerät kann die verschiedenen Eigenschaften haben, die in der speziellen Beschreibung genannt werden. Die bevorzugten Verabreichungsgeräte sind diejenigen, welche die Verabreichungsbedingungen reproduzieren, die mit dem Gerät Pigjet erhalten werden.
  • Die Erfindung hat weiterhin die Verwendung eines Plasmids, das eine für ein Immunogen eines Rinderpathogens kodierende DNA-Sequenz und einen die Expression dieses Typs eines Immunogen erlaubenden Promotor verknüpft, für die gemäß den weiter oben beschriebenen verschiedenen Modalitäten durchzuführende Herstellung einer Polynucleotidimpfstoffformulierung, die für die intradermale Verabreichung durch eine Vorrichtung zur Verabreichung mittels Flüssigkeitsstrahlen geeignet ist, zum Gegenstand.
  • Die Erfindung hat auch ein Impfverfahren zum Gegenstand, in welchem intradermal durch eine Vorrichtung zur Verabreichung mittels Flüssigkeitsstrahlen eine Polynucleotidimpfstoffformulierung wie die weiter oben beschriebene verabreicht wird. Dabei kann die Verabreichung des Impfstoffs durch eine oder mehrere Abgaben eines festgelegten Volumens der Formulierung erfolgen. Weiterhin ist es möglich, eine oder mehrere über die Zeit verteilte Impfungen vorzusehen.
  • Für das erfindungsgemäße Impfverfahren können, insbesondere was die zu verwendende Verabreichungsvorrichtung betrifft, die weiter oben genannten Werte übernommen werden.
  • Die Erfindung wird anschließend anhand erfindungsgemäßer Ausführungsformen unter Bezugnahme auf die im Anhang befindlichen Zeichnungen näher erläutert, wobei
  • - Fig. 1 ein Plasmid, welches das Gen G des Virus BRSV unter der Kontrolle des Promotors hCMV umfasst, für das Impfen von Rindern gegen diesen Virus und
  • - Fig. 2 ein Diagramm, in welchem die Wirksamkeit einer Impfung gegen das Virus BRSV auf intramuskulärem IM (Rind 1349) und intradermalem Weg ID (Rinder 1352 und 1353) verglichen wird, wobei die Tage auf der Abszisse und der Infektionsgrad auf der Ordinate aufgetragen sind,
  • zeigt.
    • Herstellung des synthetischen BRSV-Gens G
  • Das Bovine Respiratorische Synzytialvirus ist ein Pneumovirus aus der Familie der Paramyxoviren. Dabei handelt es sich um ein mit einer Hülle versehenes Virus, das sich im Cytoplasma repliziert und eine einsträngige genomische RNA mit negativer Orientierung besitzt. Das BRSV-Genom kodiert für zwei große Transmembranglykoproteine, das Fusionsprotein F und das Anheftungsprotein G.
  • Es wurde eine synthetische Version des Gens G hergestellt, indem aus diesem Gen alle potentiellen Spleißsignale entfernt wurden (G. Keil, Bundesforschungsanstalt für Viruskrankheiten der Tiere, Friedrich Löffler Institut, D-17498 Inselriems).
  • Der für das Gen G kodierende Bereich wurde von Lerch et al., Journal of Virology, 64, 5559-5569 (1990)) bestimmt. Der kodierende Bereich entspricht 257 Aminosäuren und dem Charakteristikum eines Transmembranglykoproteins vom Typ II. Er besitzt eine N-terminale Cytoplasmadomäne aus 40 Aminosäuren, gefolgt von einem Transmembranbereich aus 25 Aminosäuren. Der Rest, nämlich die 192 C-terminalen Aminosäuren, bildrt die extrazelluläre Domäne des Proteins G. Es wurde eine DNA-Sequenz synthetisiert, die ein offenes Leseraster hatte, das für genau dieselben 257 Aminosäuren kodierte, die von Lerch et al. gefunden worden waren, jedoch ohne die potentiellen Spleißsignale. Es wurde die invertierte Transkription der Sequenz aus 257 Aminosäuren in allen möglichen DNA-Sequenzen realisiert, die für eine solche Aminosäuresequenz kodieren. Dies wurde realisiert, indem das invertierte Transkriptionsprogramm einer Proteinsequenz RTRANS von PCGene von A. Bairoch., Universität Genf, Schweiz (IntelliGenetics, Inc.) angewendet wurde. Es wurden die potentiellen Spleißstellen bestimmt, indem das Analyseprogramm für Nucleinsäuren "Signal" angewendet wurde. Dieses Programm basiert auf der Methode der gewichteten Matrix von Staden (Nucleic Acids Research, 12, 505-519 (1984)). Dieses Programm identifiziert die potentiellen Donor-Stellen für eine Spleißung (Intron/Exon-Ränder) und die potentiellen Akzeptorenstellen für eine Spleißung (Exon/Intron- Ränder). Mittels dieser Sequenzdaten konnte die Gesamtheit der potentiellen starken Spleißsignale mutiert werden, ohne das Vermögen für das Protein zu modifizieren. Insbesondere wurden die Dinucleotide GT, die das Ende 5' eines Introns bilden können, und die Dinucleotide AG, die das Ende 3' eines Introns bilden können, entfernt, wenn dies möglich war.
  • Zur Synthese der für G kodierenden geeigneten Nucleotidsequenz wurden Oligonucleotide aus etwa 100 Resten, welche die beiden Stränge der kompletten Sequenz umfassten, mittels eines DNA-Synthetisators (beispielsweise des DNA-Synthetisators Perkin, Elmers/Applied Biosystems 381A, wobei auch die kommerziell zur Verfügung stehenden Oligonucleotide verwendet werden können) synthetisiert. Die komplementären Oligonucleotide wurden hybridisiert, um ein doppelsträngiges Fragment zu bilden, und in prokaryontischen Vektoren wie pUC18 oder pUC19 kloniert. Indem geeignete enzymatische Restriktionsstellen verwendet wurden, wurde das Ganze der klonierten DNA- Fragmente in der richtigen Reihenfolge verknüpft, wobei Standardklonierverfahren angewendet wurden (Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 1989). Die Nucleotidsequenz des DNA-Fragments, das daraus resultierte, wurde durch Standardsequenzierungsverfahren bestimmt (Sambrook et al.), um zu kontrollieren, dass die Sequenz korrekt war.
    • Konstruktion des eukaryontischen Expressionsvektors, der das hintere Gen G des Promotors hCMV enthält
  • Um seine Expression sicherzustellen, wurde das synthetische Gen G in einen Vektor kloniert. In diesem Vorversuch wurde ein sofort im Labor zur Verfügung stehender Vektor verwendet, nämlich der eukaryontische Expressionsvektor 175hCMV. Dieser Plasmidvektor enthält zwei Fragmente, die vom Virus BHV1 stammen, und den Ursprung des Glykoproteins E des holländischen Stamms BHV1, der als Lam bezeichnet wird, flankieren (Van Engelenburg et al., Journal of General Virology, 75, 2311-2318 (1994)). Das linke flankierende Fragment (Cterm gI) beginnt an der Stelle PstI, die sich im offenen Leseraster des Glykoproteins gI befindet und an der Stelle BstBI (oder AsuII) endet, 17 Nucleotide stromaufwärts vom Beginn (Start) des offenen Leserasters des Gens gE. Dieses Fragment wird mit Cterm gI benannt. Das rechte flankierende Fragment beginnt an der Stelle EcoNI, das sich am Stop-Codon des offenen Leserasters gE befindet und an der stromaufwärtigen ersten Stelle SmaI im terminalen Repetierfragment (TR) endet. Dieses Fragment kodiert für das Gen US9. Dieses Fragment wird mit U59 und TR benannt. Beide Fragmente wurden in die Stelle PstI und die Stelle EcoRI (freies Ende) von pUC18 kloniert. Zwischen der Stelle BstBI und der Stelle EcoNI wurde ein Fragment AseI (freies Ende) von 720 pb, das den größten Teil des Promotors Immediate Early des humanen Cytomegalovirus (hCMV-P) enthielt, mit einem Polylinkerbereich kloniert und mit einem Polyadenylierungssignal (Poly A) beendet. Das synthetische Gen G wurde in der Richtung kloniert, die im Inneren der Stelle SmaI dieses Polylinkerbereichs angegeben ist. Das erhaltene Plasmid wurde als PR608 bezeichnet. Siehe Fig. 1.
    • Kontrolle der in-vitro-Expression von G aus dem Plasmid PR608
  • Es wurde ein Übergangsexpressionsversuch durchgeführt, um zu prüfen, ob das Plasmid PR608 das Protein G exprimieren kann. Für diesen Versuch wurden 1,5 ug gereinigte DNA des Plasmids PR608 in eine kultivierte Monoschicht aus embryonalen Rinderluftröhrenzellen (EBTr) transfektiert. Diese EBTr-Zellen wurden in einem Earle-Mindestnährmedium mit 10% fötalem Rinderserumalbumin (Integro) und Antibiotika [125 UI Penicillin (Gist-Brocades), 125 ug Streptomycin (Biochemie), 37,5 UI Nystatin (Sigma) und 37,5 ug Kanamycin (Sigma) pro ml] kultiviert. Die Transfektion wurde entsprechend der Standardpräzipitationsmethode mit Calciumphosphat nach F. L. Graham und A. J. von der Eb (Virology, 52, 456-467 (1973)) durchgeführt. Nach der Transfektion wurde die plasmidische DNA in den Kern der transfektierten Zellen transportiert und die kodierten Proteine durch den Mechanismus der Wirtszelle exprimiert. Normalerweise internalisieren nur 0,01 bis 0,1% der Zellen der transfektierten Monoschicht die DNA und exprimieren die kodierten Gene.
    • Herstellung der DNA für die Polynucleotid-Impfung
  • Die DNA des Plasmids PR608 wurde hergestellt, indem 100 ul eines Vorrats von E. coli K12 in Glyzerin, Zellen DH5alpha F-, die das Plasmid PR608 enthielten, zu 2 Litern des Mediums LB gegeben wurden, das ein Standardmedium für die Bakterienkultivierung ist. Diese 2-Liter-Kultur wurde 20 Stunden lang bei 37ºC inkubiert, und die amplifizierten Zellen wurden geerntet, indem 250-ml-Kolben und eine Zentrifuge IEC Centra-8R mit Höchstgeschwindigkeit verwendet wurden. Die DNA des Plasmids PR608 wurde von den Zellen des Zentrifugenrückstands isoliert, indem die alkalische Standardlysemethode von Birnboim und Doly, wie von Sambrook et al. beschrieben (Molecular Cloning, a Press Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), angewendet wurde. Anschließend wurde die DNA des isolierten Plasmids in 20 ml TE (10 mM Tris und 1 mM EDTA, pH 7,4) gelöst und einer Elektrophorese unterworfen, um die DNA-Konzentration und -Qualität zu ermitteln. Aus einer normalen 2-Liter-Kultur konnten 40 mg Plasmide isoliert werden, wobei sich etwa 60% des Plasmids PR608 im hochverdrillten Zustand und etwa 30% im relaxierten zirkulären Zustand befanden.
  • Das Plasmidpräparat wurde bei -20ºC aufbewahrt. Vor Verwendung der DNA des Plasmids PR608 wurde die DNA- Lösung auf 0,5 mg/ml in 1 · PBS und TE verdünnt. Diese gepufferte DNA-Lösung wurde in 10-ml-Kölbchen pipettiert, die für das Pigjet-Gerät geeignet waren, und bei 4ºC für eine Verwendung innerhalb von ein bis zwei Stunden aufbewahrt.
    • Verabreichungsgerät Pigjet
  • Das tragbare Verabreichungsgerät Pigjet enthält in einem mit einem Griff versehenen Gehäuse eine auf 0,2 ml kalibrierte Kammer und einen Kolben, der normalerweise in der Kammer von einer mit dem Kolben fest verbundenen Feder in zurückgezogener Position gehalten wird.
  • Das Gerät enthält außerdem einen Kopf mit 5 Spritzdüsen oder Düsen, die dazu vorgesehen sind, die Strahlen zu kalibrieren, d. h. einen Kopf mit einer Spritzdüse, und eine Filtrationseinrichtung, um die Injektion möglicher Verunreinigungen zu vermeiden. Die Spritzdüsen sind etwas voneinander beabstandet.
  • Der Strahldruck am Ausgang der Spritzdüse kann für den Pigjet mit einer Spritzdüse auf 100 bar eingestellt werden.
  • Durch ein geeignetes Mittel ausgelöst verursacht das Zusammendrücken der Feder die Bewegung des Kolbens und damit die Ansaugung der Impfstoffdosis aus einem geeigneten Vorratsbehälter oder einer geeigneten Flasche, der/die am Behälter befestigt ist.
  • Die Freigabe der Feder verursacht das Zurückziehen des Kolbens und den Ausstoß der Dosis durch die Düsen.
    • Impf- und Prüfversuche
  • Vier Kälber, die frei von spezifischen pathogenen Organismen waren, wurden durch Kaiserschnitt entbunden, wonach ihnen das Collostrum vorenthalten wurde und sie einzeln aufgezogen wurden. Die Kälber wurden ab dem Alter von sechs Wochen in Abständen von einer Woche sechsmal geimpft. Zwei Tiere wurden intradermal mittels des Pigjets mit einer Spritzdüse (Endoscoptic, Laons, Frankreich) und zwei Tiere intramuskulär mit einer Spritze mit Kaliber 25 geimpft. Der Pigjet wurde derart aufgesetzt, dass sein Injektionskopf sich in Berührung mit der Haut senkrecht zu ihr befand, damit der Impfstoffstrahl eine zur Haut senkrechte Richtung hatte. Eine Impfung bestand aus 500 ug Plasmid-DNA in 1 ml Phosphatpuffer PBS. Die intradermalen Impfungen bestanden aus fünf Injektionen zu 0,2 ml in die Haut eines Hinterhufs, und die intramuskulären Impfungen bestanden aus einer Injektion in den Gesäßmuskel. Das Fell wurde vor dem Impfen rasiert.
  • Es wurden folgende Antikörpergehalte erhalten, die in der Tabelle I aufgeführt sind:
  • - Impfung in der 0., 1., 2., 3., 4. und 5. Woche
  • - Prüfung in der 6. Woche
  • - Verfolgung des Antikörpergehalts in der 0. bis 8. Woche. Tabelle 1
  • a: Diese Kälber wurden getötet, da schwere gesundheitliche Probleme auftraten, die aber nichts mit den Impfungen zu tun hatten.
  • Nach den DNA-Impfungen wurde nach 3 Wochen das Auftreten von Antikörpern und ab der 4. Woche hohe Antikörpergehalte, die sich auf dieser Höhe hielten, bei den intradermal geimpften Tieren festgestellt.
  • Die Kälber wurden anschließend durch den infektiösen Virus BRSV getestet. Die Inokulation mit dem Virus erfolgte sechs Wochen nach der ersten Impfung durch Einträufeln in die Nase von 1 ml Virus des Stamms Odijk (103,8 TCID&sub5;&sub0;/ml) in jede Nase.
  • Zur Ermittlung der Wirksamkeit der Impfung wurde die Ausscheidung des Virus durch den infektiösen Titer TCID&sub5;&sub0;/ml bis 12 Tage nach der Infektion in Abstrichen vom Nasen-Rachen-Raum (sw) und im Waschfluid (Lav) der Lunge (Fig. 2) verfolgt.
  • Es konnte gezeigt werden, dass ein Plasmid, das für das Protein G des BRSV kodiert, das intradermal durch einen Flüssigkeitsstrahl verabreicht worden war, gegen einen virulenten Reiz durch dieses Virus schützte. Durch die intradermale Impfung mittels eines Verabreichungsgeräts mit einem Injektionskopf mit einem Loch wurden schnell hohe Antikörpergehalte gegen das Protein G ausgelöst, was bei der intramuskulären Impfung nicht beobachtet wurde. Außerdem waren die Gehalte an infektiösem Virus BRSV in den Waschfluiden der Lunge und in den Nasen-Rachen-Raum- Abstrichen bei den Kälbern erhöht, die intramuskulär geimpft worden waren, und fehlten scheinbar bei den Kälbern, die intradermal geimpft worden waren. Die klinischen Symptome waren leicht und unterschieden sich zwischen den einzelnen Tieren nicht auf deutliche Weise.
  • Weiterhin ist die Harmlosigkeit der Verwendung des Pigjet festzustellen, wobei dieses Verfahren darüber hinaus keine Auslösung einer vorhergehenden Entzündung des Gewebes erfordert, wie es bei Goldteilchen der Fall ist.
  • Außerdem ist bemerkenswert, dass das Erhalten eines Schutzes mit dem Protein G, das üblicherweise nicht sehr immunogen ist (P. L. Collins in The Paramyxoviruses, Hrsg. D. W. Kingsbury, New York, Plenum Press (1991)) und der hohe Gehalt an Antikörpern, der nach der intradermalen Impfung erhalten wurde, mit denen vergleichbar sind, die nach natürlicher Infektion oder Impfung mit einem lebenden Impfstoff, der außerdem getestet wurde, erhalten werden.
  • Die Erfindung betrifft auch das Verfahren zur Herstellung der Impfstoffformulierungen wie es aus dieser Beschreibung hervorgeht.

Claims (16)

1. Polynucleotidimpfstoff-Formulierung für Rinder, die eine intradermal wirksame Menge eines Plasmids umfasst, das eine für ein Immunogen eines für Rinder pathogenen Organismus kodierende DNA-Sequenz und einen die in-vivo-Expression dieses Immunogens in den Hautzellen ermöglichenden Promotor verknüpft, wobei diese Impfstoffformulierung für die intradermale Verabreichung durch ein Gerät zur Abgabe mittels Flüssigkeitsstrahlen geeignet ist.
2. Impfstoffformulierung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Plasmid in einem für den intradermalen Weg geeigneten Träger, der in der Lage ist, intradermal durch einen Flüssigkeitsstrahl verabreicht zu werden, mit einer Volumendosis von 0,1 bis 0,9 ml, vorzugsweise zwischen 0,2 und 0,6 ml, und besonders bevorzugt zwischen 0,4 und 0,5 ml vorliegt.
3. Impfstoffformulierung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Plasmid in der Impfstoffformulierung in einer intradermal wirksamen Menge von 10 ng bis 1 mg, vorzugsweise von 100 ng bis 500 ug, und besonders bevorzugt von 0,5 bis 50 ug vorliegt.
4. Impfstoffformulierung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz für ein Immunogen eines pathogenen Organismus kodiert, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus dem BRSV- Virus, IBR-Virus, BVD-Virus und PI-3-Virus besteht.
5. Impfstoffformulierung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz für das Gen gB und/oder das Gen gD des IBR-Virus kodiert.
6. Impfstoffformulierung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz für das Gen G und/oder F des BRSV-Virus kodiert.
7. Impfstoffformulierung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz für E2 und/oder E1 des BVD-Virus kodiert.
8. Impfstoffformulierung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz für HN und/oder F des PI-3-Virus kodiert.
9. Impfstoffformulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Promotor ein starker eukaryontischer Promotor wie der Promotor hCMV IE ist.
10. Impfstoffformulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass sie in einer Mehr-Dosen-Flasche aufbewahrt wird, die für ein Gerät zur intradermalen Verabreichung mittels Flüssigkeitsstrahlen, vorzugsweise den Pigjet, geeignet ist.
11. Tragbare Vorrichtung für das Impfen von Rindern, die ein Flüssigkeitsstrahlen erzeugendes Abgabegerät und eine geeignete Flasche, die mehrere Dosen einer Impfstoffformulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 10 enthält, umfasst, wobei das Abgabegerät konstruiert ist, eine Dosis der Impfstoffformulierung intradermal abzugeben.
12. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Gerät einen Injektionskopf enthält, der mit 1 bis 10, insbesondere 4 bis 6, und vorzugsweise 5 oder 6 Düsen versehen ist.
13. Verwendung eines Plasmids, das eine für ein Immunogen eines für Rinder pathogenen Organismus kodierende DNA-Sequenz und einen die Expression dieses Immunogens ermöglichenden Promotor verknüpft, zur Herstellung einer Polynucleotidimpfstoff- Formulierung, die für die intradermale Verabreichung durch ein Gerät zur Abgabe mittels Flüssigkeitsstrahlen geeignet ist.
14. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass sie zwischen 10 ng und 1 mg, vorzugsweise zwischen 100 ng und 500 ug, und besonders bevorzugt zwischen 0,5 und 50 ug DNA in einer Volumendosis von 0,1 bis 0,9 ml, vorzugsweise zwischen 0,2 und 0,6 ml, und besonders bevorzugt zwischen 0,4 und 0,5 ml enthält.
15. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz für ein Immunogen eines pathogenen Organismus kodiert, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus dem BRSV-, IBR-, BVD- und PI-3-Virus besteht.
16. Verwendung nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Impfstoffformulierung an 1 bis 10, insbesondere 4 bis 6, und vorzugsweise 5 oder 6 Stellen gleichzeitig intradermal verabreicht werden soll.
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