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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Impfstoffformulierung, welche
die Impfung von Rindern, insbesondere gegen die Atemwegspathologie,
ermöglicht.
Sie betrifft ebenfalls eine entsprechendes Impfverfahren.
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Alle
Rinder sind Träger
von Viren und Bakterien, die in sehr unterschiedlichen Graden potenziell pathogen
sind.
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Die
Viren könne
sich vermehren, wenn die spezifische Immunität geschwächt ist und wenn Läsionen der
Atemwege vorhanden sind. Sie werden anschließend durch das Tier ausgeschieden
und können
so andere Tiere kontaminieren.
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Unter
den bekannten Viren lassen sich insbesondere das Parainfluenzavirus
Typ 3 (PI-3) mit einer recht moderaten Pathogenität, das respiratorische
Rinder-Synzytialvirus (RSV) und das Rinder-Herpesvirus (BHV), das
auch als bovines infektiöse-Rhinotracheitis-Virus
(IBR) bezeichnet wird, mit recht starker Pathogenität nennen.
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Ein
anderes Virus, das auf Grund seiner immunsuppressiven Rolle und
seiner schädlichen
Wirkungen auf die Reproduktion besonders wichtig ist, ist das Virus
der Schleimhautkrankheit oder Rinder-Pestivirus (BVDV).
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Diese
Viren übertragen
sich gewöhnlich durch
eine primäre
Hyperthermiephase beim Grippesyndrom und Atemwegsproblemen, wobei
im Fall von BVD Verdauungsprobleme (Diarrhöen) auftreten. Diese Phase
kann mit einer sekundären
Phase einhergehen, in der Bronchopneumonien in Verbindung mit Infektionen
mit Bakterien, insbesondere Pasteurella, auftreten, die den Tod
nach sich ziehen können.
Dieses Phänomen
wird insbesondere durch die Immunsuppression infolge einer Infektion
durch BVD oder durch eine Infektion von Makrophagen durch PI-3 verschlimmert.
Auch andere Symptome können
auftreten, wie Aborte bei BVD und BHV.
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Somit
scheint der Versuch notwendig, eine wirksame Vorbeugung gegen die
grundlegenden Viren zu schaffen, die an der Atemwegspathologie bei Rindern
beteiligt sind.
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Es
wurden bereits in der Vergangenheit Vereinigungen von Impfstoffen
gegen bestimmte Viren vorgeschlagen, die für die Rinder-Atemwegserkrankung
verantwortlich sind.
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Die
bisher entwickelten Vereinigungen wurden ausgehend von inaktivierten
Impfstoffen oder Lebendimpfstoffen und gegebenenfalls Gemischen
dieser Impfstoffe hergestellt. Ihre Herstellung bereitet Probleme
mit der Verträglichkeit
zwischen Valenzen und mit der Stabilität. Man muss tatsächlich gleichzeitig
die Verträglichkeit
zwischen den verschiedenen Valenzen des Impfstoffs sicherstellen,
entweder auf Ebene der verschiedenen verwendeten Antigene oder auf
Ebene der Formulierungen selbst, insbesondere, wenn gleichzeitig
inaktivierte Impfstoffe und Lebendimpfstoffe kombiniert werden.
Es stellt sich ebenfalls das Problem der Konservierung dieser kombinierten
Impfstoffe sowie ihrer Unschädlichkeit, insbesondere
in Gegenwart eines Adjuvans. Diese Impfstoffe sind gewöhnlich recht
teuer.
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Die
Patentanmeldungen WO-A-90 11092, WO-A-93 19183, WO-A-94 21797 und WO-A-95 20660
nutzen die vor Kurzem entwickelte Technik der Polynucleotid-Impfstoffe.
Bekanntlich verwenden diese Impfstoffe ein Plasmid, das dazu ausgelegt
ist, in den Wirtszellen das in das Plasmid inserierte Antigen zu
exprimieren. Alle Verabreichungswege wurden vorgeschlagen (intraperitoneal,
intravenös,
intramuskulär,
transkutan, intradermal, mucosal usw.). Verschiedene Mittel zur
Impfung können
ebenfalls eingesetzt werden, wie DNA, die auf der Oberfläche von
Goldteilchen abgelagert ist und so eingespritzt wird, dass sie in
die Haut des Tiers eindringt (Tang et al., Nature 356, 152–154, 992)
sowie Flüssigkeitsstrahlinjektoren,
mit denen gleichzeitig in die Haut, den Muskel, Fettgewebe und Brustgewebe
transfiziert werden können
(Furth et al., Analytical Biochemistry 205, 365–368, 1992).
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Die
Polynucleotid-Impfstoffe können
genauso gut nackte DNAs wie DNAs verwenden, die zum Beispiel im
Inneren von Liposomen oder kationischen Lipiden formuliert sind.
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G.
J. M. COX hat bereits die Polynucleotid-Impfung gegen Rinder-Herpesvirus
des Typs 1 im Journal of Virology Band 67, Nr. 9, September 1993, 5665–5667 vorgeschlagen.
Die Autoren haben insbesondere Plasmide beschrieben, welche die
Gene gI (gB), gIII (gC) und gIV (gD) integrieren.
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In
Vaccine, Band 13, Nr. 4, 415–421,
1995, gibt J. E. CROWE eine allgemeine Übersicht über die verschiedenen Verfahren
zur Impfung gegen das respiratorische Synzitialvirus und gegen das
Parainfluenzavirus Typ 3. Diese Übersicht
bewertet die gesamten Möglichkeiten,
die sich durch die gegenwärtigen
Impftechniken bieten, und schlägt
einfach vor, dass die Technologie der Polynucleotid-Immunisierung
bei der Immunisierungsstrategie gegen RSV und PI-3 geeignet sein
kann. Weder eine Plasmidkonstruktion noch ein Ergebnis einer Impfung
von Rindern gegen diese Viren sind in dem Dokument beschrieben.
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Somit
stellt die Erfindung eine multivalente Impfstoffformulierung bereit,
mit der eine Impfung gegen eine bestimmte Anzahl pathogener Viren,
die insbesondere an der Rinder-Atemwegspathologie beteiligt
sind, und somit eine wirksame Impfung gegen diese Pathologie gewährleistet
werden kann.
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Eine
weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung einer Impfstoffformulierunq,
in der verschiedene Valenzen vereinigt sind, wobei sie alle für Verträglichkeit
und Stabilität
der Valenzen untereinander erforderlichen Kriterien erfüllt.
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Eine
weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung einer Impfstoffformulierung,
bei der verschiedene Valenzen in demselben Vehikel vereinigt werden
können.
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Eine
weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Impfstoffs,
der einfach anzuwenden und kostengünstig ist.
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Noch
eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung einer
Impfstoffformulierung und eines Verfahrens zur Impfung von Rindern,
mit denen sich ein multivalenter Schutz mit erhöhter Wirksamkeit und langer
Dauer sowie mit guter Unschädlichkeit
und Fehlen von Rückständen erhalten
lässt.
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Somit
ist der Gegenstand der vorliegenden Erfindung eine Impfstoffformulierung,
insbesondere gegen die Rinder-Atemwegspathologie,
die mindestens drei Polynucleotid-Impfstoffvalenzen umfasst, die jeweils
ein Plasmid umfassen, das ein Gen einer Valenz des Rinder-Atemwegspathogens
derart umfasst, dass dieses in vivo in den Wirtszellen exprimiert
werden kann, wobei diese Valenzen aus der Gruppe ausgewählt sind,
bestehend aus Rinder-Herpesvirus, respiratorischem Rinder-Synzitialvirus,
Virus der Schleimhautkrankheit und Parainfluenzavirus Typ 3, wobei
die Plasmide für
jede Valenz ein oder mehrere Gene umfassen, ausgewählt aus
der Gruppe, bestehend aus gB und gD für das Rinder-Herpesvirus, F
und G für
das respiratorische Rinder-Synzitialvirus, E2, C + E1 + E2 und E1
+ E2 für
das Virus der Schleimhautkrankheit, HN und F für das Parainfluenzavirus Typ
3.
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Unter
Valenz wird in der vorliegenden Erfindung mindestens ein Antigen
verstanden, das einen Schutz gegen das Virus des betreffenden Pathogens gewährleistet,
wobei die Valenz als Unter-Valenz ein oder mehrere natürliche oder
modifizierte Gene eines oder mehrerer Stämme des betreffenden Pathogens
enthalten kann.
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Mit
Gen eines Erregers ist nicht nur das vollständige Gen, sondern auch die
verschiedenen Nucleotidsequenzen einschließlich Fragmenten gemeint, welche
die Fähigkeit
zur Induktion einer Schutzreaktion beibehalten. Der Begriff Gen
umfasst Nucleotidsequenzen, die zu den in den Beispielen genau beschriebenen äquivalent
sind, d. h. unterschiedliche Sequenzen, die aber für das gleiche
Protein codieren. Er umfasst außerdem
Nucleotidsequenzen anderer Stämme
des betreffenden Pathogens, die einen Kreuzschutz oder einen spezifischen
Schutz für den
Stamm oder die Stammgruppe gewährleisten.
Er umfasst auch Nucleotidsequenzen, die modifiziert sind, um die
Expression in vivo durch das Wirtstier zu erleichtern, aber das
gleiche Protein codieren.
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Vorzugsweise
umfasst die erfindungsgemäße Impfstoffformulierung
die vier Valenzen.
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Bezüglich der
BHV-Valenz ist bevorzugt, die beiden für gB und gD codierenden Gene
in verschiedenen Plasmiden oder in ein und dem gleichen Plasmid
einzusetzen. Gegebenenfalls, aber weniger bevorzugt, kann man das
eine oder das andere dieser Gene verwenden.
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Für die RSV-Valenz
verwendet man vorzugsweise die beiden Gene G und F, die in verschiedene Plasmide
oder in ein und das gleiche Plasmid integriert sind. Gegebenenfalls,
aber weniger bevorzugt, kann man nur das Gen F verwenden.
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Für die BVD-Valenz
ist die Verwendung eines Plasmids bevorzugt, das das Gen E2 integriert. Gegebenenfalls,
aber weniger bevorzugt, kann man ein für E1 und E2 zusammen oder für die Gruppe,
bestehend aus C, E1 und E2, codierendes Gen verwenden.
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Für die Valenz
PI-3 ist die Verwendung der Gruppe der zwei Gene HN und F in zwei
verschiedenen Plasmiden oder in ein und dem gleichen Plasmid bevorzugt.
Man kann auch nur das Gen HN verwenden.
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Eine
erfindungsgemäß bevorzugte
Impfstoffformulierung umfasst und gewährleistet die Expression der
Gene gB und gD von BHV, G und F von RSV, E2 von BVD und HN und F
von PI-3.
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Die
erfindungsgemäßem Impfstoffformulierung
kann in einem Dosisvolumen von 0,1 bis 10 ml und insbesondere von
1 bis 5 ml dargereicht werden.
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Die
Dosis ist gewöhnlich
zwischen 10 ng und 1 mg, vorzugsweise zwischen 100 ng und 500 μg und am
stärksten
bevorzugt zwischen 1 μg
und 250 μg pro
Plasmidtyp.
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Vorzugsweise
werden nackte Plasmide verwendet, die einfach in das Impfvehikel
gegeben werden, das gewöhnlich
physiologische Kochsalzlösung (0,9%
NaCl), ultrareines Wasser, TE-Puffer usw. ist. Natürlich können auch
alle im Stand der Technik beschriebenen Formen von Polynucleotid-Impfstoffen eingesetzt
werden.
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Jedes
Plasmid umfasst einen Promotor, der die Expression des inserierten
Gens in seiner Abhängigkeit
in den Wirtszellen gewährleisten
kann. Es handelt sich gewöhnlich
um einen starken eukaryotischen Promotor und insbesondere um einen
frühen Cytomegalievirus-CMV-IE-Promotor
von menschlichem oder murinem Ursprung oder gegebenenfalls auch
von anderem Ursprung, wie Ratte, Schwein, Meerschweinchen.
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Allgemein
kann der Promotor entweder viralen oder zellulären Ursprungs sein. Als anderen
viralen Promotor als CMV-IE lassen sich der frühe oder späte Promotor des SV40-Virus
oder der LTR-Promotor des Rous-Sarcomavirus nennen. Es kann sich auch
um einen Viruspromotor handeln, von dem das Gen herrührt, beispielsweise
den richtigen Promotor des Gens.
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Als
zellulärer
Promotor lassen sich der Promotor eines Cytoskelettgens, wie beispielsweise
der Promotor von Desmin (Bolmont et al., Journal of Submicroscopic
Cytology and Pathology, 1990, 22, 117–122; und ZHENLIN et al., Gene,
1989, 78, 243–254)
oder auch der Promotor von Actin, nennen.
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Wenn
sich mehrere Gene in demselben Plasmid befinden, können diese
in der gleichen Transkriptionseinheit oder in verschiedenen Einheiten vorliegen.
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Die
erfindungsgemäße Kombination
von unterschiedlichen Valenzen des Impfstoffs kann vorzugsweise
durch Mischen von Polynucleotidplasmiden erfolgen, die das oder
die Antigen (e) jeder Valenz exprimieren, aber man kann auch die
Expression von Antigenen mehrerer Valenzen durch ein und das gleiche
Plasmid vorsehen.
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Gegenstand
der Erfindung sind auch monovalente Impfstoffformulierungen, die
ein oder mehrere Plasmide umfassen, die für ein oder mehrere Gene eines
der Viren codieren, ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus BRSV, BVD und PI-3, wobei die Gene
die oben beschriebenen sind. Abgesehen von ihrem monovalenten Charakter
können
diese Formulierungen hinsichtlich der Auswahl von Genen, deren Kombinationen,
der Zusammensetzung der Plasmide, der Dosisvolumina, der Dosen usw.
stärker
ausgeprägte
Eigenschaften erhalten.
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Die
monovalenten Impfstoffformulierungen können verwendet werden (i) zur
Herstellung einer polyvalenten Impfstoffformulierung, wie vorstehend beschrieben,
(ii) einzeln gegen die entsprechende Erkrankung, (iii) vereinigt
mit einem Impfstoff eines anderen Typs (vollständig lebend- oder inaktiviert,
rekombinant, Untereinheiten-) gegen eine andere Erkrankung oder
(iv) als Nachimpfung für
einen Impfstoff, wie nachstehend beschrieben.
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Tatsächlich ist
ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung auch die Verwendung von
einem oder mehreren erfindungsgemäßen Plasmiden zur Herstellung
eines Impfstoffs, der zur Impfung von Rindern bestimmt ist, die
mithilfe eines ersten klassischen Impfstoffs des Typs derjenigen
des Standes der Technik erstgeimpft sind, wobei der Impfstoff insbesondere
aus der Gruppe ausgewählt
ist, bestehend aus lebendem oder inaktiviertem Gesamtimpfstoff,
Untereinheitenimpfstoff, rekombinantem Impfstoff, wobei dieser erste
Impfstoff das oder die Antigen(e), das/die von dem oder den Plasmid(en)
oder Antigen(en), das/die einen Kreuzschutz gewährleiste (t/en), codiert wird/werden,
aufweist, d.h, enthält
oder exprimieren kann.
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Bemerkenswerterweise
hat der Polynucleotidimpfstoff eine Nachimpfungswirkung, die sich
in einer Verstärkung
der Immunantwort und im Einsetzen einer lang andauernden Immunität äußern kann.
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Allgemein
können
die Impfstoffe für
eine Erstimpfung aus denjenigen Impfstoffen ausgewählt sein,
die von verschiedenen Produzenten von Veterinärimpfstoffen kommerziell erhältlich sind.
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Gegenstand
der Erfindung ist außerdem
ein Impfkit, das einen Impfstoff zur Erstimpfung, wie vorstehend
beschrieben, und eine erfindungsgemäße Impfstoffformulierung zur
Nachimpfung umfasst. Sie betrifft außerdem eine erfindungsgemäße Impfstoffformulierung,
die von einem Hinweis begleitet ist, welcher die Verwendung dieser
Formulierung als Nachimpfung zu einer Erstimpfung, wie vorstehend beschrieben,
angibt.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist außerdem ein Verfahren zur Impfung
von Rindern gegen die Atemwegserkrankung, umfassend die Verabreichung
der wirksamen Impfstoffformulierung, wie vorstehend beschrieben.
Dieses Impfverfahren umfasst die Verabreichung von einer oder mehreren
Dosen der Impfstoffformulierung, wobei die Dosen nacheinander in
einem kurzen Zeitraum und/oder nacheinander an zeitlich voneinander
entfernten Zeitpunkten verabreicht werden können.
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Die
erfindungsgemäßen Impfstoffformulierungen
können
im Rahmen dieses Impfverfahrens auf verschiedenen Verabreichungswegen,
die im Stand der Technik für
die Polynucleotid- Impfung
vorgeschlagen worden sind, und mithilfe bekannter Verabreichungstechniken
verabreicht werden.
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Gegenstand
der Erfindung ist auch das Impfverfahren, das aus der Durchführung einer
Erstimpfung, wie vorstehend beschrieben, und einer Nachimpfung mit
einer erfindungsgemäßen Impfstoffformulierung
besteht.
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Bei
einer bevorzugten Form der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird zu einem ersten Zeitpunkt dem Tier eine wirksame Dosis eines
Impfstoffs des klassischen Typs, insbesondere inaktiviert, lebend,
abgeschwächt
oder rekombinant, oder auch eines Untereinheitenimpfstoffs so verabreicht,
dass eine Erstimpfung gewährleistet
ist, und, vorzugsweise in einem Abstand von 2 bis 6 Wochen, wird
die Verabreichung eines erfindungsgemäßen polyvalenten oder monovalenten
Impfstoffs gewährleistet.
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Die
Erfindung betrifft außerdem
das Herstellungsverfahren von Impfstoffformulierungen, d. h. die Herstellung
von Valenzen und deren Gemischen, wie sie aus dieser Beschreibung
hervorgeht.
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Die
Erfindung wird nachstehend mithilfe von Ausführungsformen der Erfindung
anhand der beigefügten
Zeichnungen eingehender erläutert.
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Liste der
Figuren
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1: Plasmid pVR1012
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2: Sequenz des Gens BHV-1
ST gB
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3: Konstruktion des Plasmids
pPB156
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4: Plasmid pAB087
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5: Plasmid pAB011
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6: Plasmid pAB012
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7: Plasmid pAB058
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8: Plasmid pAB059
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9: Plasmid pAB060
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10: Plasmid pAB071
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11: Plasmid pAB072
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Liste der SEQ ID Nr.-Sequenzen
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- SEQ ID Nr. 1: Sequenz des Gens BHV-1 gB (Stamm ST)
- SEQ ID Nr. 2: Oligonucleotid PB234
- SEQ ID Nr. 3: Oligonucleotid PB235
- SED ID Nr. 4: Oligonucleotid AB162
- SEQ ID Nr. 5: Oligonucleotid AB163
- SEQ ID NR. 6: Oligonucleotid AB026
- SEQ ID Nr. 7: Oligonucleotid AB027
- SEQ ID Nr. 8: Oligonucleotid AB028
- SEQ ID Nr. 9: Oligonucleotid AB029
- SEQ ID Nr. 10: Oligonucleotid AB110
- SEQ ID Nr. 11: Oligonucleotid AB111
- SEQ ID Nr. 12: Oligonucleotid AB114
- SEQ ID Nr. 13: Oligonucleotid AB115
- SEQ ID Nr. 14: Oligonucleotid AB116
- SEQ ID Nr. 15: Oligonucleotid AB117
- SEQ ID Nr. 16: Oligonucleotid AB130
- SEQ ID Nr. 17: Oligonucleotid AB131
- SED ID Nr. 18: Oligonucleotid AB132
- SED ID Nr. 19: Oligonucleotid AB133
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BEISPIELE
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Beispiel 1: Viruskultur
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Die
Viren werden in dem geeigneten zellulären System kultiviert, bis
ein cytopathischer Effekt erhalten wird. Die für jedes Virus zu verwendenden
zellulären
Systeme sind dem Fachmann bekannt. Kurz gesagt, werden Zellen, die
für das
verwendete Virus empfänglich
sind und in essenziellem Eagle-Minimalmedium
(MEM-Medium) oder einem anderen geeigneten Medium kultiviert wurden,
mit dem untersuchten Virenstamm ange impft, indem man eine Infektionsmultiplizität von 1
verwendet. Die infizierten Zellen werden dann bei 37°C für einen
Zeitraum inkubiert, der nötig
ist, damit ein vollständiger
cytopathischer Effekt auftritt (im Durchschnitt 36 Stunden).
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Beispiel 2: Extraktion
der viralen genomischen DNA
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Nach
der Kultur werden der Überstand
und die lysierten Zellen gewonnen, und die gesamte Virussuspension
wird bei 1000 × g
10 Minuten bei + 4°C
zentrifugiert, um Zelldebris zu entfernen. Die Viruspartikel werden
dann mittels Ultrazentrifugation bei 400000 × g für 1 Stunde bei + 4°C gewonnen. Das
Sediment wird in einem minimalen Volumen Puffer (10 mM Tris, 1 mM
EDTA) aufgenommen. Diese konzentrierte Virussuspension wird mit
Proteinase K (100 μg/ml)
in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (SDS) (0,5% Endkonzentration)
für 2 Stunden
bei 37°C
behandelt. Die Virus-DNA wird anschließend mit einem Phenol-Chloroform-Gemisch
extrahiert, dann mit 2 Volumina absolutem Ethanol gefällt. Nach einer
Nacht bei –20°C wird die
DNA bei 10000 × g
15 Minuten bei + 4°C
zentrifugiert. Das DNA-Sediment wird getrocknet, dann in einem minimalen
Volumen sterilem ultrapurem Wasser aufgenommen. Sie kann dann mit
Restriktionsenzymen gespalten werden.
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Beispiel 3: Isolation
von viraler genomischer RNA
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Die
RNA-Viren wurden gemäß dem Fachmann
bekannten Techniken gereinigt. Die virale genomische RNA jedes Virus
wurde anschließend
unter Verwendung der von P. Chomczynski und N. Sacchi (Anal. Biochem.,
1987, 162, 156–159)
beschriebenen Guanidiniumthiocyanat/Phenol/Chloroform-Extraktionstechnik
isoliert.
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Beispiel 4: Molekularbiologische
Techniken
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Alle
Plasmidkonstruktionen wurden unter Verwendung der von J. Sambrook
et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989) beschriebenen
molekularbiologischen Standardtechniken durchgeführt. Alle für die vorliegenden Erfindung
verwendeten Restriktionsfragmente wurden unter Verwendung des "Geneclean"-Kits (BI0101 Inc.,
La Jolla, CA) isoliert.
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Beispiel 5: RT-PCR-Technik
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Spezifische
Oligonucleotide (die an ihren 5'-Enden
Restriktionsstellen trugen, um die Klonierung der amplifizierten
Fragmente zu erleichtern) wurden so synthetisiert, dass sie die
codierenden Regionen der zu amplifizierenden Gene (siehe spezifische
Beispiele) vollständig
abdeckten. Die reverse Transkriptionsreaktion (RT) und die Polymerasekettenamplifikation
(PCR) wurden gemäß Standardtechniken
(J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.
Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New
York, 1989) durchgeführt.
Jede RT-PCR-Reaktion wurden mit einem spezifischen Amplimerenpaar
durchgeführt,
indem die extrahierte virale genomische RNA als Matrize verwendet
wurde. Die amplifizierte komplementäre DNA wurde mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol
(25 : 24 : 1) extrahiert, bevor sie mit den Restriktionsenzymen gespalten
wurde.
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Beispiel 6: Plasmid pVR1012
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Das
Plasmid pVR1012 (1)
wurde von Vical Inc., San Diego, CA, USA, erhalten. Seine Konstruktion
wurde in J. Hartikka et al. (Human Gene Therapy, 1996, 7, 1205–1217) beschrieben.
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Beispiel 7: Konstruktion
des Plasmids pPB156 (BHV-1-gB-Gen)
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Die
genomische DNA des Rinder-Herpesvirus BHV-1 (Stamm ST) (Leung-Tack
P. et al., Virology, 1994, 199, 409–421) wurde gemäß der im
Beispiel 2 beschriebenen Technik präpariert und mit BamHI gespalten.
Nach der Reinigung wurde das 18-kbp-BamHI-BamHI-Fragment in den Vektor pBR322
kloniert, der zuvor mit BamHI gespalten wurde, wobei das Plasmid
pIBR-4-BamHI (22 kbp) erhalten wurde.
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Das
Plasmid pIBR-4-BamHI wurde anschließend mit SalI gespalten, um
ein 6,6-kbp-SalI-SalI-Fragment freizusetzen, welches das für das Glykoprotein
gB von BHV-1 codierende Gen enthielt (2 und
SEQ ID NR: 1). Das Fragment wurde in den zuvor mit SalI gespaltenen
Vektor pBR322 kloniert, sodass das Plasmid pIBR-6,6-SalI (10,9 kbp)
erhalten wurde.
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Das
Plasmid pIBR-6,6-SalI wurde mit NheI und BglII gespalten, um ein
2676-bp-NheI-BglII-Fragment freizusetzen, welches das für das Glykoprotein gB
des Rinder-Herpesvirus (BHV-1) codierende Gen enthielt (Fragment
A).
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Es
wurde eine PCR-Reaktion mit der genomischen DNA des Rinder-Herpesvirus
(Stamm ST) und mit den folgenden Oligonucleotiden durchgeführt:
PB234
(30mer) (SEQ ID NR: 2)
5'-TTGTCGACATGGCCGCTCGCGGCGGTGCTG-3'
PB235 (21mer)
(SEQ ID NR: 3)
5'-GCAGGGCAGCGGCTAGCGCGG-3',
um den 5'-Teil des für das Glykoprotein
gB von BHV-1 codierenden Gens zu isolieren. Nach der Reinigung wurde
das 153-bp-PCR-Produkt
mit SalI und NheI gespalten, um ein 145-bp-SalI-NheI-Fragment zu isolieren (Fragment
B).
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Die
Fragmente A und B wurden zusammen mit dem Vektor pVR1012 (Beispiel
6), der zuvor mit SalI und BamHI gespalten wurde, ligiert, um das Plasmid
pPB156 (7691 bp) (3)
zu erhalten.
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Beispiel 8: Konstruktion
des Plasmids pAB087 (BHV-1-gD-Gen)
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Es
wurde eine PCR-Reaktion mit genomischer DNA des Rinder-Herpesvirus
(BHV-1) (Stamm ST) (P. Leung-Tack et al., Virology, 1994, 199, 409–421), die
gemäß der im
Beispiel 2 beschriebenen Technik präpariert wurde, und mit den
folgenden Oligonucleotiden durchgeführt:
AB162 (31mer) (SEQ
ID NR: 4)
5'-AAACTGCAGATGCAAGGGCCGACATTGGCCG-3'
AB163 (27mer)
(SEQ ID NR: 5)
5'-ATCTTGTACCATATGACCGTGGCGTTG-3',
um den 5'-Teil des für das Glykoprotein
gD des Rinder-Herpesvirus
(BHV-1) (GenBank-Sequenzzugangsnummer = L26360) in Form eines 338-bp-PCR-Fragments
zu isolieren. Nach der Reinigung wurde dieses Fragment mit PstI
und NdeI gespalten, um ein 317-bp-PstI-NdeI-Fragment zu isolieren
(Fragment A).
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Das
Plasmid pBHV001 (P. Leung-Tack et al., Virology, 1994, 199, 409–421) wurde
mit NdeI und StyI gespalten, um ein 942-bp-Fragment freizusetzen,
das den 3'-Teil
des für
das Glykoprotein gD von BHV-1 codierenden Gens enthielt (Fragment
B).
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Die
Fragmente A und B wurden zusammen mit dem Vektor pVR1012 (Beispiel
6); der zuvor mit PstI und XbaI gespalten wurde, ligiert, um das
Plasmid pAB087 (6134 bp) (4)
zu erhalten.
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Beispiel 9: Konstruktion
des Plasmids pAB011 (BRSV-F-Gen)
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Es
wurde eine RT-PCR-Reaktion gemäß der im
Beispiel 5 beschriebenen Technik mit genomischer RNA des respiratorischen
Rinder-Synzitialvirus (BRSV) (Stamm 391–2) (R. Lerch et al., Virology, 1991,
181, 118–131),
die wie im Beispiel 3 angegeben präpariert wurde, und mit den
folgenden Oligonucleotiden durchgeführt:
AB026 (33mer) (SEQ
ID NR: 6)
5'-AAAACTGCAGGGATGGCGGCAACAGCCATGAGG-3'
AB027 (31mer)
(SEQ ID NR: 7)
5'-CGCGGATCCTCATTTACTAAAGGAAAGATTG-3',
um das für das Fusionsglykoprotein
F (BRSV-F) codierende Gen in Form eines 1734-bp-PCR-Fragments zu
isolieren. Nach der Reinigung wurde dieses Fragment mit PstI und
BamHI gespalten, um ein 1717-bp-PstI-BamHI-Fragment zu isolieren.
Dieses Fragment wurde mit dem Vektor pVR1012 (Beispiel 6), der zuvor
mit PstI und BamHI gespalten wurde, ligiert, um das Plasmid pAB011
(6587 bp) (5) zu erhalten.
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Beispiel 10: Konstruktion
des Plasmids pAB012 (BRSV-G-Gen)
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Es
wurde eine RT-PCR-Reaktion gemäß der im
Beispiel 5 beschriebenen Technik mit genomischer RNA des respiratorischen
Rinder-Synzitialvirus (BRSV) (Stamm 391-2) (R. Lerch et al., J.
Virology, 1990, 64, 5559–5569)
und mit den folgenden Oligonucleotiden durchgeführt:
AB028 (32mer) (SEQ
ID NR: 8)
5'-AAAACTGCAGATGTCCAACCATACCCATCATC-3'
AB029 (35mer)
(SEQ ID NR: 9)
5'-CGCGGATCCCTAGATCTGTGTAGTTGATTGATTTG-3',
um das für das G-Protein
(BRSV-G) codierende Gen in Form eines 780-bp-PCR-Fragments zu isolieren. Nach
der Reinigung wurde dieses Fragment mit PstI und BamHI gespalten,
um ein 763-bp-PstI-BamHI-Fragment zu isolieren. Dieses Fragment
wurde mit dem Vektor pVR1012 (Beispiel 6), der zuvor mit PstI und
BamHI gespalten wurde, ligiert, um das Plasmid pAB012 (5634 bp)
(6) zu erhalten.
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Beispiel 11: Konstruktion
des Plasmids pAB058 (BVDV-C-Gen)
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Es
wurde eine RT-PCR-Reaktion gemäß der im
Beispiel 5 beschriebenen Technik mit genomischer RNA des Virus der
vira len Rinder-Diarrhöe (BVDV)
(Stamm Osloss) (L. De Moerlooze et al., J. Gen. Virol., 1993, 74,
1433–1438),
die gemäß der im Beispiel
3 beschrieben Technik präpariert
wurde, und mit den folgenden Oligonucleotiden durchgeführt:
AB110
(35mer) (SEQ ID NR: 10)
5'-AAAACTGCAGATGTCCGACACAAAAGCAGAAGGGG-3'
AB111 (47mer)
(SEQ ID NR: 11)
5'-CGCGGATCCTCAATAAAAATCATTCCCACTGCGACTTGAAACAAAAC-3',
um ein 342-bp-Fragment
zu amplifizieren, welches das für
das Capsidprotein C des BVDV-Virus codierende Gen enthielt. Nach
der Reinigung wurde das RT-PCR-Produkt mit PstI und BamHI gespalten,
um ein 324-bp-PstI-BamHI-Fragment zu erhalten.
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Dieses
Fragment wurde mit dem Vektor pVR1012 (Beispiel 6), der zuvor mit
PstI und BamHI gespalten wurde, ligiert, um das Plasmid pAB058 (5183
bp) (7) zu erhalten.
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Beispiel 12: Konstruktion
des Plasmids pAB059 (BVDV-E1-"Gen")
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Es
wurde eine RT-PCR-Reaktion gemäß der im
Beispiel 5 beschriebenen Technik mit genomischer RNA des Virus der
viralen Rinder-Diarrhöe (BVDV)
(Stamm Osloss) (L. De Moerlooze et al., J. Gen. Virol., 1993, 74,
1433–1438)
und mit den folgenden Oligonucleotiden durchgeführt:
AB114 (32mer) (SEQ
ID NR; 12)
5'-ACGCGTCGACATGAAGAAACTAGAGAAAGCCC-3'
AB115 (33mer)
(SEQ ID NR: 13)
5'-CGCGGATCCTCAGCCGGGTTTGCAAACTGGGAG-3',
um die für das Protein
E1 des BVDV-Virus codierende Sequenz in Form eines 1381-bp-PCR-Fragments zu
isolieren. Nach der Reinigung wurde dieses Fragment mit SalI und
BamHI gespalten, um ein 1367-bp-SalI-BamHI-Fragment zu erhalten.
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Dieses
Fragment wurde mit dem Vektor pVR1012 (Beispiel 6), der zuvor mit
SalI und BamHI gespalten wurde, ligiert, um das Plasmid pAB059 (6236
bp) (8) zu erhalten.
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Beispiel 13: Konstruktion
des Plasmids pAB060 (BVDV-E2-"Gen")
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Es
wurde eine RT-PCR-Reaktion gemäß der im
Beispiel 5 beschriebenen Technik mit genomischer RNA des Virus der
viralen Rinder-Diarrhöe (BVDV)
(Stamm Osloss) (L. De Moerlooze et al., J. Gen. Virol., 1993, 74,
1433–1438)
und mit den folgenden Oligonucleotiden durchgeführt:
AB116 (36mer) (SEQ
ID NR: 14)
5'-ACGCGTCGACATGACGACTACTGCATTCCTGGTATG-3'
AB117 (33mer)
(SEQ ID NR: 15)
5'-CGCGGATCCTCATTGACGTCCCGAGGTCATTTG-3',
um die für das Protein
E2 des BVDV-Virus codierende Sequenz in Form eines 1252-bp-PCR-Fragments zu
isolieren. Nach der Reinigung wurde dieses Fragment mit SalI und
BamHI gespalten, um ein 1238-bp-SalI-BamHI-Fragment zu erhalten.
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Dieses
Fragment wurde mit dem Vektor pVR1012 (Beispiel 6), der zuvor mit
SalI und BamHI gespalten wurde, ligiert, um das Plasmid pAB060 (6107
bp) (9) zu erhalten.
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Beispiel 14: Konstruktion
des Plasmids pAB071 (BPIV-HN-Gen)
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Es
wurde eine RT-PCR-Reaktion gemäß der im
Beispiel 5 beschriebenen Technik mit genomischer RNA des Rinder-Parainfluenzavirus
Typ 3 (PI-3 = BPIV) und mit den folgenden Oligonucleotiden durchgeführt:
AB130
(33mer) (SEQ ID NR: 16)
5'-TTTGTCGACATGGAATATTGGAAACACACAAAC-3'
AB131 (33mer)
(SEQ ID NR: 17)
5'-TTTGGATCCTTAGCTGCAGTTTTTCGGAACTTA-3', um das für das Glykoprotein
HN von BPIV codierende Gen (HN-Gensequenz
1987 von H. Shibuta hinterlegt; GenBank-Sequenzzugangsnummer = Y00115) in Form
eines 1737-bp-PCR-Fragments
zu isolieren. Nach der Reinigung wurde dieses Fragment mit SalI
und BamHI gespalten, um ein 1725-bp-SalI-BamHI- Fragment zu erhalten. Dieses Fragment
wurde mit dem Vektor pVR1012 (Beispiel 6), der zuvor mit SalI und
BamHI gespalten wurde, ligiert, um das Plasmid pAB071 (6593 bp)
(10) zu erhalten.
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Beispiel 15: Konstruktion
des Plasmids pAB072 (BPIV-F-Gen)
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Es
wurde eine RT-PCR-Reaktion gemäß der im
Beispiel 5 beschriebenen Technik mit genomischer RNA des Rinder-Parainfluenzavirus
Typ 3 (PI-3 = BPIV) und mit den folgenden Oligonucleotiden durchgeführt:
AB132
(30mer) (SEQ ID NR: 18)
5'-TTTGTCGACATGATCATCACAAACACAATC-3'
AB133 (30mer)
(SEQ ID NR: 19)
5'-TTTGGATCCTCATTGTCTACTTGTTAGTAC-3',
um das für das Protein
F von BPIV codierende Gen (F-Gensequenz
1987 von H. Shibuta hinterlegt; GenBank-Sequenzzugangsnummer = Y00115) in Form eines
1641-bp-PCR-Fragments
zu isolieren. Nach der Reinigung wurde dieses Fragment mit SalI
und BamHI gespalten, um ein 1629-bp-SalI-BamHI-Fragment zu erhalten. Dieses Fragment
wurde mit dem Vektor pVR1012 (Beispiel 6), der zuvor mit SalI und BamHI
gespalten wurde, ligiert, um das Plasmid pAB072 (6497 bp) (11) zu erhalten.
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Beispiel 16: Präparation
und Reinigung der Plasmide
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Zur
Präparation
der Plasmide, die für
die Impfung von Tieren bestimmt waren, kann jede Technik eingesetzt
werden, mit der sich eine Suspension von gereinigten Plasmiden,
hauptsächlich
in der superhelikalen Form, erhalten lässt. Diese Techniken sind dem
Fachmann bekannt. Insbesondere lässt sich
die alkalische Lyse-Technik, gefolgt von zwei aufeinander folgenden
Cäsiumchloridgradienten-Ultrazentrifugationen
in Gegenwart von Ethidiumbromid, nennen, wie in J. Sambrook et al.
(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989) beschrieben.
Es wird auch auf die Patentanmeldungen PCT WO 95/21250 und PCT WO 96/02658
verweisen, welche Verfahren zur Herstellung von Plasmiden, die zur
Impfung geeignet sind, im industriellen Maßstab beschreiben. Für den Bedarf
der Herstellung von Impfstoffen (siehe Beispiel 17) werden die gereinigten
Plasmide so resuspendiert, dass hochkonzentrierte Lösungen (> 2 mg/ml) erhalten
werden, die lagerungsbeständig
sind. Dazu werden die Plasmide in ultrareinem Wasser oder in TE-Puffer
(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) resuspendiert.
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Beispiel 17: Herstellung
von vereinigten Impfstoffen
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Die
verschiedenen Plasmide, die zur Herstellung eines vereinigten Impfstoffs
benötigt
werden, werden ausgehend von ihren konzentrierten Lösungen (Beispiel
16) gemischt. Die Gemische werden so hergestellt, dass die Endkonzentration
jedes Plasmids der wirksamen Dosis jedes Plasmids entspricht. Die
zur Einstellung der Endkonzentration des Impfstoffs verwendbaren
Lösungen
können
eine 0,9%ige NaCl-Lösung
oder PBS-Puffer
sein.
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Beispiel 18: Impfung von
Rindern
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Rinder
werden mit Dosen von 100 μg,
250 μg oder
500 μg pro
Plasmid geimpft. Die Injektionen erfolgen mit einer Kanüle auf intramuskulärem Weg entweder
in Höhe
des Musculus gluteus oder in Höhe der
Nackenmuskeln. Die Impfdosen werden in Volumina von 1 bis 5 ml verabreicht.