DE69725988T2 - Polynukleotid-impfstoff, vorzugsweise zur behandlung der atemkrankheit bei rindern - Google Patents

Polynukleotid-impfstoff, vorzugsweise zur behandlung der atemkrankheit bei rindern Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Impfstoffformulierung, welche die Impfung von Rindern, insbesondere gegen die Atemwegspathologie, ermöglicht. Sie betrifft ebenfalls eine entsprechendes Impfverfahren.
  • Alle Rinder sind Träger von Viren und Bakterien, die in sehr unterschiedlichen Graden potenziell pathogen sind.
  • Die Viren könne sich vermehren, wenn die spezifische Immunität geschwächt ist und wenn Läsionen der Atemwege vorhanden sind. Sie werden anschließend durch das Tier ausgeschieden und können so andere Tiere kontaminieren.
  • Unter den bekannten Viren lassen sich insbesondere das Parainfluenzavirus Typ 3 (PI-3) mit einer recht moderaten Pathogenität, das respiratorische Rinder-Synzytialvirus (RSV) und das Rinder-Herpesvirus (BHV), das auch als bovines infektiöse-Rhinotracheitis-Virus (IBR) bezeichnet wird, mit recht starker Pathogenität nennen.
  • Ein anderes Virus, das auf Grund seiner immunsuppressiven Rolle und seiner schädlichen Wirkungen auf die Reproduktion besonders wichtig ist, ist das Virus der Schleimhautkrankheit oder Rinder-Pestivirus (BVDV).
  • Diese Viren übertragen sich gewöhnlich durch eine primäre Hyperthermiephase beim Grippesyndrom und Atemwegsproblemen, wobei im Fall von BVD Verdauungsprobleme (Diarrhöen) auftreten. Diese Phase kann mit einer sekundären Phase einhergehen, in der Bronchopneumonien in Verbindung mit Infektionen mit Bakterien, insbesondere Pasteurella, auftreten, die den Tod nach sich ziehen können. Dieses Phänomen wird insbesondere durch die Immunsuppression infolge einer Infektion durch BVD oder durch eine Infektion von Makrophagen durch PI-3 verschlimmert. Auch andere Symptome können auftreten, wie Aborte bei BVD und BHV.
  • Somit scheint der Versuch notwendig, eine wirksame Vorbeugung gegen die grundlegenden Viren zu schaffen, die an der Atemwegspathologie bei Rindern beteiligt sind.
  • Es wurden bereits in der Vergangenheit Vereinigungen von Impfstoffen gegen bestimmte Viren vorgeschlagen, die für die Rinder-Atemwegserkrankung verantwortlich sind.
  • Die bisher entwickelten Vereinigungen wurden ausgehend von inaktivierten Impfstoffen oder Lebendimpfstoffen und gegebenenfalls Gemischen dieser Impfstoffe hergestellt. Ihre Herstellung bereitet Probleme mit der Verträglichkeit zwischen Valenzen und mit der Stabilität. Man muss tatsächlich gleichzeitig die Verträglichkeit zwischen den verschiedenen Valenzen des Impfstoffs sicherstellen, entweder auf Ebene der verschiedenen verwendeten Antigene oder auf Ebene der Formulierungen selbst, insbesondere, wenn gleichzeitig inaktivierte Impfstoffe und Lebendimpfstoffe kombiniert werden. Es stellt sich ebenfalls das Problem der Konservierung dieser kombinierten Impfstoffe sowie ihrer Unschädlichkeit, insbesondere in Gegenwart eines Adjuvans. Diese Impfstoffe sind gewöhnlich recht teuer.
  • Die Patentanmeldungen WO-A-90 11092, WO-A-93 19183, WO-A-94 21797 und WO-A-95 20660 nutzen die vor Kurzem entwickelte Technik der Polynucleotid-Impfstoffe. Bekanntlich verwenden diese Impfstoffe ein Plasmid, das dazu ausgelegt ist, in den Wirtszellen das in das Plasmid inserierte Antigen zu exprimieren. Alle Verabreichungswege wurden vorgeschlagen (intraperitoneal, intravenös, intramuskulär, transkutan, intradermal, mucosal usw.). Verschiedene Mittel zur Impfung können ebenfalls eingesetzt werden, wie DNA, die auf der Oberfläche von Goldteilchen abgelagert ist und so eingespritzt wird, dass sie in die Haut des Tiers eindringt (Tang et al., Nature 356, 152–154, 992) sowie Flüssigkeitsstrahlinjektoren, mit denen gleichzeitig in die Haut, den Muskel, Fettgewebe und Brustgewebe transfiziert werden können (Furth et al., Analytical Biochemistry 205, 365–368, 1992).
  • Die Polynucleotid-Impfstoffe können genauso gut nackte DNAs wie DNAs verwenden, die zum Beispiel im Inneren von Liposomen oder kationischen Lipiden formuliert sind.
  • G. J. M. COX hat bereits die Polynucleotid-Impfung gegen Rinder-Herpesvirus des Typs 1 im Journal of Virology Band 67, Nr. 9, September 1993, 5665–5667 vorgeschlagen. Die Autoren haben insbesondere Plasmide beschrieben, welche die Gene gI (gB), gIII (gC) und gIV (gD) integrieren.
  • In Vaccine, Band 13, Nr. 4, 415–421, 1995, gibt J. E. CROWE eine allgemeine Übersicht über die verschiedenen Verfahren zur Impfung gegen das respiratorische Synzitialvirus und gegen das Parainfluenzavirus Typ 3. Diese Übersicht bewertet die gesamten Möglichkeiten, die sich durch die gegenwärtigen Impftechniken bieten, und schlägt einfach vor, dass die Technologie der Polynucleotid-Immunisierung bei der Immunisierungsstrategie gegen RSV und PI-3 geeignet sein kann. Weder eine Plasmidkonstruktion noch ein Ergebnis einer Impfung von Rindern gegen diese Viren sind in dem Dokument beschrieben.
  • Somit stellt die Erfindung eine multivalente Impfstoffformulierung bereit, mit der eine Impfung gegen eine bestimmte Anzahl pathogener Viren, die insbesondere an der Rinder-Atemwegspathologie beteiligt sind, und somit eine wirksame Impfung gegen diese Pathologie gewährleistet werden kann.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung einer Impfstoffformulierunq, in der verschiedene Valenzen vereinigt sind, wobei sie alle für Verträglichkeit und Stabilität der Valenzen untereinander erforderlichen Kriterien erfüllt.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung einer Impfstoffformulierung, bei der verschiedene Valenzen in demselben Vehikel vereinigt werden können.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Impfstoffs, der einfach anzuwenden und kostengünstig ist.
  • Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung einer Impfstoffformulierung und eines Verfahrens zur Impfung von Rindern, mit denen sich ein multivalenter Schutz mit erhöhter Wirksamkeit und langer Dauer sowie mit guter Unschädlichkeit und Fehlen von Rückständen erhalten lässt.
  • Somit ist der Gegenstand der vorliegenden Erfindung eine Impfstoffformulierung, insbesondere gegen die Rinder-Atemwegspathologie, die mindestens drei Polynucleotid-Impfstoffvalenzen umfasst, die jeweils ein Plasmid umfassen, das ein Gen einer Valenz des Rinder-Atemwegspathogens derart umfasst, dass dieses in vivo in den Wirtszellen exprimiert werden kann, wobei diese Valenzen aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus Rinder-Herpesvirus, respiratorischem Rinder-Synzitialvirus, Virus der Schleimhautkrankheit und Parainfluenzavirus Typ 3, wobei die Plasmide für jede Valenz ein oder mehrere Gene umfassen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus gB und gD für das Rinder-Herpesvirus, F und G für das respiratorische Rinder-Synzitialvirus, E2, C + E1 + E2 und E1 + E2 für das Virus der Schleimhautkrankheit, HN und F für das Parainfluenzavirus Typ 3.
  • Unter Valenz wird in der vorliegenden Erfindung mindestens ein Antigen verstanden, das einen Schutz gegen das Virus des betreffenden Pathogens gewährleistet, wobei die Valenz als Unter-Valenz ein oder mehrere natürliche oder modifizierte Gene eines oder mehrerer Stämme des betreffenden Pathogens enthalten kann.
  • Mit Gen eines Erregers ist nicht nur das vollständige Gen, sondern auch die verschiedenen Nucleotidsequenzen einschließlich Fragmenten gemeint, welche die Fähigkeit zur Induktion einer Schutzreaktion beibehalten. Der Begriff Gen umfasst Nucleotidsequenzen, die zu den in den Beispielen genau beschriebenen äquivalent sind, d. h. unterschiedliche Sequenzen, die aber für das gleiche Protein codieren. Er umfasst außerdem Nucleotidsequenzen anderer Stämme des betreffenden Pathogens, die einen Kreuzschutz oder einen spezifischen Schutz für den Stamm oder die Stammgruppe gewährleisten. Er umfasst auch Nucleotidsequenzen, die modifiziert sind, um die Expression in vivo durch das Wirtstier zu erleichtern, aber das gleiche Protein codieren.
  • Vorzugsweise umfasst die erfindungsgemäße Impfstoffformulierung die vier Valenzen.
  • Bezüglich der BHV-Valenz ist bevorzugt, die beiden für gB und gD codierenden Gene in verschiedenen Plasmiden oder in ein und dem gleichen Plasmid einzusetzen. Gegebenenfalls, aber weniger bevorzugt, kann man das eine oder das andere dieser Gene verwenden.
  • Für die RSV-Valenz verwendet man vorzugsweise die beiden Gene G und F, die in verschiedene Plasmide oder in ein und das gleiche Plasmid integriert sind. Gegebenenfalls, aber weniger bevorzugt, kann man nur das Gen F verwenden.
  • Für die BVD-Valenz ist die Verwendung eines Plasmids bevorzugt, das das Gen E2 integriert. Gegebenenfalls, aber weniger bevorzugt, kann man ein für E1 und E2 zusammen oder für die Gruppe, bestehend aus C, E1 und E2, codierendes Gen verwenden.
  • Für die Valenz PI-3 ist die Verwendung der Gruppe der zwei Gene HN und F in zwei verschiedenen Plasmiden oder in ein und dem gleichen Plasmid bevorzugt. Man kann auch nur das Gen HN verwenden.
  • Eine erfindungsgemäß bevorzugte Impfstoffformulierung umfasst und gewährleistet die Expression der Gene gB und gD von BHV, G und F von RSV, E2 von BVD und HN und F von PI-3.
  • Die erfindungsgemäßem Impfstoffformulierung kann in einem Dosisvolumen von 0,1 bis 10 ml und insbesondere von 1 bis 5 ml dargereicht werden.
  • Die Dosis ist gewöhnlich zwischen 10 ng und 1 mg, vorzugsweise zwischen 100 ng und 500 μg und am stärksten bevorzugt zwischen 1 μg und 250 μg pro Plasmidtyp.
  • Vorzugsweise werden nackte Plasmide verwendet, die einfach in das Impfvehikel gegeben werden, das gewöhnlich physiologische Kochsalzlösung (0,9% NaCl), ultrareines Wasser, TE-Puffer usw. ist. Natürlich können auch alle im Stand der Technik beschriebenen Formen von Polynucleotid-Impfstoffen eingesetzt werden.
  • Jedes Plasmid umfasst einen Promotor, der die Expression des inserierten Gens in seiner Abhängigkeit in den Wirtszellen gewährleisten kann. Es handelt sich gewöhnlich um einen starken eukaryotischen Promotor und insbesondere um einen frühen Cytomegalievirus-CMV-IE-Promotor von menschlichem oder murinem Ursprung oder gegebenenfalls auch von anderem Ursprung, wie Ratte, Schwein, Meerschweinchen.
  • Allgemein kann der Promotor entweder viralen oder zellulären Ursprungs sein. Als anderen viralen Promotor als CMV-IE lassen sich der frühe oder späte Promotor des SV40-Virus oder der LTR-Promotor des Rous-Sarcomavirus nennen. Es kann sich auch um einen Viruspromotor handeln, von dem das Gen herrührt, beispielsweise den richtigen Promotor des Gens.
  • Als zellulärer Promotor lassen sich der Promotor eines Cytoskelettgens, wie beispielsweise der Promotor von Desmin (Bolmont et al., Journal of Submicroscopic Cytology and Pathology, 1990, 22, 117–122; und ZHENLIN et al., Gene, 1989, 78, 243–254) oder auch der Promotor von Actin, nennen.
  • Wenn sich mehrere Gene in demselben Plasmid befinden, können diese in der gleichen Transkriptionseinheit oder in verschiedenen Einheiten vorliegen.
  • Die erfindungsgemäße Kombination von unterschiedlichen Valenzen des Impfstoffs kann vorzugsweise durch Mischen von Polynucleotidplasmiden erfolgen, die das oder die Antigen (e) jeder Valenz exprimieren, aber man kann auch die Expression von Antigenen mehrerer Valenzen durch ein und das gleiche Plasmid vorsehen.
  • Gegenstand der Erfindung sind auch monovalente Impfstoffformulierungen, die ein oder mehrere Plasmide umfassen, die für ein oder mehrere Gene eines der Viren codieren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus BRSV, BVD und PI-3, wobei die Gene die oben beschriebenen sind. Abgesehen von ihrem monovalenten Charakter können diese Formulierungen hinsichtlich der Auswahl von Genen, deren Kombinationen, der Zusammensetzung der Plasmide, der Dosisvolumina, der Dosen usw. stärker ausgeprägte Eigenschaften erhalten.
  • Die monovalenten Impfstoffformulierungen können verwendet werden (i) zur Herstellung einer polyvalenten Impfstoffformulierung, wie vorstehend beschrieben, (ii) einzeln gegen die entsprechende Erkrankung, (iii) vereinigt mit einem Impfstoff eines anderen Typs (vollständig lebend- oder inaktiviert, rekombinant, Untereinheiten-) gegen eine andere Erkrankung oder (iv) als Nachimpfung für einen Impfstoff, wie nachstehend beschrieben.
  • Tatsächlich ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung auch die Verwendung von einem oder mehreren erfindungsgemäßen Plasmiden zur Herstellung eines Impfstoffs, der zur Impfung von Rindern bestimmt ist, die mithilfe eines ersten klassischen Impfstoffs des Typs derjenigen des Standes der Technik erstgeimpft sind, wobei der Impfstoff insbesondere aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus lebendem oder inaktiviertem Gesamtimpfstoff, Untereinheitenimpfstoff, rekombinantem Impfstoff, wobei dieser erste Impfstoff das oder die Antigen(e), das/die von dem oder den Plasmid(en) oder Antigen(en), das/die einen Kreuzschutz gewährleiste (t/en), codiert wird/werden, aufweist, d.h, enthält oder exprimieren kann.
  • Bemerkenswerterweise hat der Polynucleotidimpfstoff eine Nachimpfungswirkung, die sich in einer Verstärkung der Immunantwort und im Einsetzen einer lang andauernden Immunität äußern kann.
  • Allgemein können die Impfstoffe für eine Erstimpfung aus denjenigen Impfstoffen ausgewählt sein, die von verschiedenen Produzenten von Veterinärimpfstoffen kommerziell erhältlich sind.
  • Gegenstand der Erfindung ist außerdem ein Impfkit, das einen Impfstoff zur Erstimpfung, wie vorstehend beschrieben, und eine erfindungsgemäße Impfstoffformulierung zur Nachimpfung umfasst. Sie betrifft außerdem eine erfindungsgemäße Impfstoffformulierung, die von einem Hinweis begleitet ist, welcher die Verwendung dieser Formulierung als Nachimpfung zu einer Erstimpfung, wie vorstehend beschrieben, angibt.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist außerdem ein Verfahren zur Impfung von Rindern gegen die Atemwegserkrankung, umfassend die Verabreichung der wirksamen Impfstoffformulierung, wie vorstehend beschrieben. Dieses Impfverfahren umfasst die Verabreichung von einer oder mehreren Dosen der Impfstoffformulierung, wobei die Dosen nacheinander in einem kurzen Zeitraum und/oder nacheinander an zeitlich voneinander entfernten Zeitpunkten verabreicht werden können.
  • Die erfindungsgemäßen Impfstoffformulierungen können im Rahmen dieses Impfverfahrens auf verschiedenen Verabreichungswegen, die im Stand der Technik für die Polynucleotid- Impfung vorgeschlagen worden sind, und mithilfe bekannter Verabreichungstechniken verabreicht werden.
  • Gegenstand der Erfindung ist auch das Impfverfahren, das aus der Durchführung einer Erstimpfung, wie vorstehend beschrieben, und einer Nachimpfung mit einer erfindungsgemäßen Impfstoffformulierung besteht.
  • Bei einer bevorzugten Form der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zu einem ersten Zeitpunkt dem Tier eine wirksame Dosis eines Impfstoffs des klassischen Typs, insbesondere inaktiviert, lebend, abgeschwächt oder rekombinant, oder auch eines Untereinheitenimpfstoffs so verabreicht, dass eine Erstimpfung gewährleistet ist, und, vorzugsweise in einem Abstand von 2 bis 6 Wochen, wird die Verabreichung eines erfindungsgemäßen polyvalenten oder monovalenten Impfstoffs gewährleistet.
  • Die Erfindung betrifft außerdem das Herstellungsverfahren von Impfstoffformulierungen, d. h. die Herstellung von Valenzen und deren Gemischen, wie sie aus dieser Beschreibung hervorgeht.
  • Die Erfindung wird nachstehend mithilfe von Ausführungsformen der Erfindung anhand der beigefügten Zeichnungen eingehender erläutert.
  • Liste der Figuren
  • 1: Plasmid pVR1012
  • 2: Sequenz des Gens BHV-1 ST gB
  • 3: Konstruktion des Plasmids pPB156
  • 4: Plasmid pAB087
  • 5: Plasmid pAB011
  • 6: Plasmid pAB012
  • 7: Plasmid pAB058
  • 8: Plasmid pAB059
  • 9: Plasmid pAB060
  • 10: Plasmid pAB071
  • 11: Plasmid pAB072
  • Liste der SEQ ID Nr.-Sequenzen
    • SEQ ID Nr. 1: Sequenz des Gens BHV-1 gB (Stamm ST)
    • SEQ ID Nr. 2: Oligonucleotid PB234
    • SEQ ID Nr. 3: Oligonucleotid PB235
    • SED ID Nr. 4: Oligonucleotid AB162
    • SEQ ID Nr. 5: Oligonucleotid AB163
    • SEQ ID NR. 6: Oligonucleotid AB026
    • SEQ ID Nr. 7: Oligonucleotid AB027
    • SEQ ID Nr. 8: Oligonucleotid AB028
    • SEQ ID Nr. 9: Oligonucleotid AB029
    • SEQ ID Nr. 10: Oligonucleotid AB110
    • SEQ ID Nr. 11: Oligonucleotid AB111
    • SEQ ID Nr. 12: Oligonucleotid AB114
    • SEQ ID Nr. 13: Oligonucleotid AB115
    • SEQ ID Nr. 14: Oligonucleotid AB116
    • SEQ ID Nr. 15: Oligonucleotid AB117
    • SEQ ID Nr. 16: Oligonucleotid AB130
    • SEQ ID Nr. 17: Oligonucleotid AB131
    • SED ID Nr. 18: Oligonucleotid AB132
    • SED ID Nr. 19: Oligonucleotid AB133
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1: Viruskultur
  • Die Viren werden in dem geeigneten zellulären System kultiviert, bis ein cytopathischer Effekt erhalten wird. Die für jedes Virus zu verwendenden zellulären Systeme sind dem Fachmann bekannt. Kurz gesagt, werden Zellen, die für das verwendete Virus empfänglich sind und in essenziellem Eagle-Minimalmedium (MEM-Medium) oder einem anderen geeigneten Medium kultiviert wurden, mit dem untersuchten Virenstamm ange impft, indem man eine Infektionsmultiplizität von 1 verwendet. Die infizierten Zellen werden dann bei 37°C für einen Zeitraum inkubiert, der nötig ist, damit ein vollständiger cytopathischer Effekt auftritt (im Durchschnitt 36 Stunden).
  • Beispiel 2: Extraktion der viralen genomischen DNA
  • Nach der Kultur werden der Überstand und die lysierten Zellen gewonnen, und die gesamte Virussuspension wird bei 1000 × g 10 Minuten bei + 4°C zentrifugiert, um Zelldebris zu entfernen. Die Viruspartikel werden dann mittels Ultrazentrifugation bei 400000 × g für 1 Stunde bei + 4°C gewonnen. Das Sediment wird in einem minimalen Volumen Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA) aufgenommen. Diese konzentrierte Virussuspension wird mit Proteinase K (100 μg/ml) in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (SDS) (0,5% Endkonzentration) für 2 Stunden bei 37°C behandelt. Die Virus-DNA wird anschließend mit einem Phenol-Chloroform-Gemisch extrahiert, dann mit 2 Volumina absolutem Ethanol gefällt. Nach einer Nacht bei –20°C wird die DNA bei 10000 × g 15 Minuten bei + 4°C zentrifugiert. Das DNA-Sediment wird getrocknet, dann in einem minimalen Volumen sterilem ultrapurem Wasser aufgenommen. Sie kann dann mit Restriktionsenzymen gespalten werden.
  • Beispiel 3: Isolation von viraler genomischer RNA
  • Die RNA-Viren wurden gemäß dem Fachmann bekannten Techniken gereinigt. Die virale genomische RNA jedes Virus wurde anschließend unter Verwendung der von P. Chomczynski und N. Sacchi (Anal. Biochem., 1987, 162, 156–159) beschriebenen Guanidiniumthiocyanat/Phenol/Chloroform-Extraktionstechnik isoliert.
  • Beispiel 4: Molekularbiologische Techniken
  • Alle Plasmidkonstruktionen wurden unter Verwendung der von J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989) beschriebenen molekularbiologischen Standardtechniken durchgeführt. Alle für die vorliegenden Erfindung verwendeten Restriktionsfragmente wurden unter Verwendung des "Geneclean"-Kits (BI0101 Inc., La Jolla, CA) isoliert.
  • Beispiel 5: RT-PCR-Technik
  • Spezifische Oligonucleotide (die an ihren 5'-Enden Restriktionsstellen trugen, um die Klonierung der amplifizierten Fragmente zu erleichtern) wurden so synthetisiert, dass sie die codierenden Regionen der zu amplifizierenden Gene (siehe spezifische Beispiele) vollständig abdeckten. Die reverse Transkriptionsreaktion (RT) und die Polymerasekettenamplifikation (PCR) wurden gemäß Standardtechniken (J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989) durchgeführt. Jede RT-PCR-Reaktion wurden mit einem spezifischen Amplimerenpaar durchgeführt, indem die extrahierte virale genomische RNA als Matrize verwendet wurde. Die amplifizierte komplementäre DNA wurde mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25 : 24 : 1) extrahiert, bevor sie mit den Restriktionsenzymen gespalten wurde.
  • Beispiel 6: Plasmid pVR1012
  • Das Plasmid pVR1012 (1) wurde von Vical Inc., San Diego, CA, USA, erhalten. Seine Konstruktion wurde in J. Hartikka et al. (Human Gene Therapy, 1996, 7, 1205–1217) beschrieben.
  • Beispiel 7: Konstruktion des Plasmids pPB156 (BHV-1-gB-Gen)
  • Die genomische DNA des Rinder-Herpesvirus BHV-1 (Stamm ST) (Leung-Tack P. et al., Virology, 1994, 199, 409–421) wurde gemäß der im Beispiel 2 beschriebenen Technik präpariert und mit BamHI gespalten. Nach der Reinigung wurde das 18-kbp-BamHI-BamHI-Fragment in den Vektor pBR322 kloniert, der zuvor mit BamHI gespalten wurde, wobei das Plasmid pIBR-4-BamHI (22 kbp) erhalten wurde.
  • Das Plasmid pIBR-4-BamHI wurde anschließend mit SalI gespalten, um ein 6,6-kbp-SalI-SalI-Fragment freizusetzen, welches das für das Glykoprotein gB von BHV-1 codierende Gen enthielt (2 und SEQ ID NR: 1). Das Fragment wurde in den zuvor mit SalI gespaltenen Vektor pBR322 kloniert, sodass das Plasmid pIBR-6,6-SalI (10,9 kbp) erhalten wurde.
  • Das Plasmid pIBR-6,6-SalI wurde mit NheI und BglII gespalten, um ein 2676-bp-NheI-BglII-Fragment freizusetzen, welches das für das Glykoprotein gB des Rinder-Herpesvirus (BHV-1) codierende Gen enthielt (Fragment A).
  • Es wurde eine PCR-Reaktion mit der genomischen DNA des Rinder-Herpesvirus (Stamm ST) und mit den folgenden Oligonucleotiden durchgeführt:
    PB234 (30mer) (SEQ ID NR: 2)
    5'-TTGTCGACATGGCCGCTCGCGGCGGTGCTG-3'
    PB235 (21mer) (SEQ ID NR: 3)
    5'-GCAGGGCAGCGGCTAGCGCGG-3',
    um den 5'-Teil des für das Glykoprotein gB von BHV-1 codierenden Gens zu isolieren. Nach der Reinigung wurde das 153-bp-PCR-Produkt mit SalI und NheI gespalten, um ein 145-bp-SalI-NheI-Fragment zu isolieren (Fragment B).
  • Die Fragmente A und B wurden zusammen mit dem Vektor pVR1012 (Beispiel 6), der zuvor mit SalI und BamHI gespalten wurde, ligiert, um das Plasmid pPB156 (7691 bp) (3) zu erhalten.
  • Beispiel 8: Konstruktion des Plasmids pAB087 (BHV-1-gD-Gen)
  • Es wurde eine PCR-Reaktion mit genomischer DNA des Rinder-Herpesvirus (BHV-1) (Stamm ST) (P. Leung-Tack et al., Virology, 1994, 199, 409–421), die gemäß der im Beispiel 2 beschriebenen Technik präpariert wurde, und mit den folgenden Oligonucleotiden durchgeführt:
    AB162 (31mer) (SEQ ID NR: 4)
    5'-AAACTGCAGATGCAAGGGCCGACATTGGCCG-3'
    AB163 (27mer) (SEQ ID NR: 5)
    5'-ATCTTGTACCATATGACCGTGGCGTTG-3',
    um den 5'-Teil des für das Glykoprotein gD des Rinder-Herpesvirus (BHV-1) (GenBank-Sequenzzugangsnummer = L26360) in Form eines 338-bp-PCR-Fragments zu isolieren. Nach der Reinigung wurde dieses Fragment mit PstI und NdeI gespalten, um ein 317-bp-PstI-NdeI-Fragment zu isolieren (Fragment A).
  • Das Plasmid pBHV001 (P. Leung-Tack et al., Virology, 1994, 199, 409–421) wurde mit NdeI und StyI gespalten, um ein 942-bp-Fragment freizusetzen, das den 3'-Teil des für das Glykoprotein gD von BHV-1 codierenden Gens enthielt (Fragment B).
  • Die Fragmente A und B wurden zusammen mit dem Vektor pVR1012 (Beispiel 6); der zuvor mit PstI und XbaI gespalten wurde, ligiert, um das Plasmid pAB087 (6134 bp) (4) zu erhalten.
  • Beispiel 9: Konstruktion des Plasmids pAB011 (BRSV-F-Gen)
  • Es wurde eine RT-PCR-Reaktion gemäß der im Beispiel 5 beschriebenen Technik mit genomischer RNA des respiratorischen Rinder-Synzitialvirus (BRSV) (Stamm 391–2) (R. Lerch et al., Virology, 1991, 181, 118–131), die wie im Beispiel 3 angegeben präpariert wurde, und mit den folgenden Oligonucleotiden durchgeführt:
    AB026 (33mer) (SEQ ID NR: 6)
    5'-AAAACTGCAGGGATGGCGGCAACAGCCATGAGG-3'
    AB027 (31mer) (SEQ ID NR: 7)
    5'-CGCGGATCCTCATTTACTAAAGGAAAGATTG-3',
    um das für das Fusionsglykoprotein F (BRSV-F) codierende Gen in Form eines 1734-bp-PCR-Fragments zu isolieren. Nach der Reinigung wurde dieses Fragment mit PstI und BamHI gespalten, um ein 1717-bp-PstI-BamHI-Fragment zu isolieren. Dieses Fragment wurde mit dem Vektor pVR1012 (Beispiel 6), der zuvor mit PstI und BamHI gespalten wurde, ligiert, um das Plasmid pAB011 (6587 bp) (5) zu erhalten.
  • Beispiel 10: Konstruktion des Plasmids pAB012 (BRSV-G-Gen)
  • Es wurde eine RT-PCR-Reaktion gemäß der im Beispiel 5 beschriebenen Technik mit genomischer RNA des respiratorischen Rinder-Synzitialvirus (BRSV) (Stamm 391-2) (R. Lerch et al., J. Virology, 1990, 64, 5559–5569) und mit den folgenden Oligonucleotiden durchgeführt:
    AB028 (32mer) (SEQ ID NR: 8)
    5'-AAAACTGCAGATGTCCAACCATACCCATCATC-3'
    AB029 (35mer) (SEQ ID NR: 9)
    5'-CGCGGATCCCTAGATCTGTGTAGTTGATTGATTTG-3',
    um das für das G-Protein (BRSV-G) codierende Gen in Form eines 780-bp-PCR-Fragments zu isolieren. Nach der Reinigung wurde dieses Fragment mit PstI und BamHI gespalten, um ein 763-bp-PstI-BamHI-Fragment zu isolieren. Dieses Fragment wurde mit dem Vektor pVR1012 (Beispiel 6), der zuvor mit PstI und BamHI gespalten wurde, ligiert, um das Plasmid pAB012 (5634 bp) (6) zu erhalten.
  • Beispiel 11: Konstruktion des Plasmids pAB058 (BVDV-C-Gen)
  • Es wurde eine RT-PCR-Reaktion gemäß der im Beispiel 5 beschriebenen Technik mit genomischer RNA des Virus der vira len Rinder-Diarrhöe (BVDV) (Stamm Osloss) (L. De Moerlooze et al., J. Gen. Virol., 1993, 74, 1433–1438), die gemäß der im Beispiel 3 beschrieben Technik präpariert wurde, und mit den folgenden Oligonucleotiden durchgeführt:
    AB110 (35mer) (SEQ ID NR: 10)
    5'-AAAACTGCAGATGTCCGACACAAAAGCAGAAGGGG-3'
    AB111 (47mer) (SEQ ID NR: 11)
    5'-CGCGGATCCTCAATAAAAATCATTCCCACTGCGACTTGAAACAAAAC-3',
    um ein 342-bp-Fragment zu amplifizieren, welches das für das Capsidprotein C des BVDV-Virus codierende Gen enthielt. Nach der Reinigung wurde das RT-PCR-Produkt mit PstI und BamHI gespalten, um ein 324-bp-PstI-BamHI-Fragment zu erhalten.
  • Dieses Fragment wurde mit dem Vektor pVR1012 (Beispiel 6), der zuvor mit PstI und BamHI gespalten wurde, ligiert, um das Plasmid pAB058 (5183 bp) (7) zu erhalten.
  • Beispiel 12: Konstruktion des Plasmids pAB059 (BVDV-E1-"Gen")
  • Es wurde eine RT-PCR-Reaktion gemäß der im Beispiel 5 beschriebenen Technik mit genomischer RNA des Virus der viralen Rinder-Diarrhöe (BVDV) (Stamm Osloss) (L. De Moerlooze et al., J. Gen. Virol., 1993, 74, 1433–1438) und mit den folgenden Oligonucleotiden durchgeführt:
    AB114 (32mer) (SEQ ID NR; 12)
    5'-ACGCGTCGACATGAAGAAACTAGAGAAAGCCC-3'
    AB115 (33mer) (SEQ ID NR: 13)
    5'-CGCGGATCCTCAGCCGGGTTTGCAAACTGGGAG-3',
    um die für das Protein E1 des BVDV-Virus codierende Sequenz in Form eines 1381-bp-PCR-Fragments zu isolieren. Nach der Reinigung wurde dieses Fragment mit SalI und BamHI gespalten, um ein 1367-bp-SalI-BamHI-Fragment zu erhalten.
  • Dieses Fragment wurde mit dem Vektor pVR1012 (Beispiel 6), der zuvor mit SalI und BamHI gespalten wurde, ligiert, um das Plasmid pAB059 (6236 bp) (8) zu erhalten.
  • Beispiel 13: Konstruktion des Plasmids pAB060 (BVDV-E2-"Gen")
  • Es wurde eine RT-PCR-Reaktion gemäß der im Beispiel 5 beschriebenen Technik mit genomischer RNA des Virus der viralen Rinder-Diarrhöe (BVDV) (Stamm Osloss) (L. De Moerlooze et al., J. Gen. Virol., 1993, 74, 1433–1438) und mit den folgenden Oligonucleotiden durchgeführt:
    AB116 (36mer) (SEQ ID NR: 14)
    5'-ACGCGTCGACATGACGACTACTGCATTCCTGGTATG-3'
    AB117 (33mer) (SEQ ID NR: 15)
    5'-CGCGGATCCTCATTGACGTCCCGAGGTCATTTG-3',
    um die für das Protein E2 des BVDV-Virus codierende Sequenz in Form eines 1252-bp-PCR-Fragments zu isolieren. Nach der Reinigung wurde dieses Fragment mit SalI und BamHI gespalten, um ein 1238-bp-SalI-BamHI-Fragment zu erhalten.
  • Dieses Fragment wurde mit dem Vektor pVR1012 (Beispiel 6), der zuvor mit SalI und BamHI gespalten wurde, ligiert, um das Plasmid pAB060 (6107 bp) (9) zu erhalten.
  • Beispiel 14: Konstruktion des Plasmids pAB071 (BPIV-HN-Gen)
  • Es wurde eine RT-PCR-Reaktion gemäß der im Beispiel 5 beschriebenen Technik mit genomischer RNA des Rinder-Parainfluenzavirus Typ 3 (PI-3 = BPIV) und mit den folgenden Oligonucleotiden durchgeführt:
    AB130 (33mer) (SEQ ID NR: 16)
    5'-TTTGTCGACATGGAATATTGGAAACACACAAAC-3'
    AB131 (33mer) (SEQ ID NR: 17)
    5'-TTTGGATCCTTAGCTGCAGTTTTTCGGAACTTA-3', um das für das Glykoprotein HN von BPIV codierende Gen (HN-Gensequenz 1987 von H. Shibuta hinterlegt; GenBank-Sequenzzugangsnummer = Y00115) in Form eines 1737-bp-PCR-Fragments zu isolieren. Nach der Reinigung wurde dieses Fragment mit SalI und BamHI gespalten, um ein 1725-bp-SalI-BamHI- Fragment zu erhalten. Dieses Fragment wurde mit dem Vektor pVR1012 (Beispiel 6), der zuvor mit SalI und BamHI gespalten wurde, ligiert, um das Plasmid pAB071 (6593 bp) (10) zu erhalten.
  • Beispiel 15: Konstruktion des Plasmids pAB072 (BPIV-F-Gen)
  • Es wurde eine RT-PCR-Reaktion gemäß der im Beispiel 5 beschriebenen Technik mit genomischer RNA des Rinder-Parainfluenzavirus Typ 3 (PI-3 = BPIV) und mit den folgenden Oligonucleotiden durchgeführt:
    AB132 (30mer) (SEQ ID NR: 18)
    5'-TTTGTCGACATGATCATCACAAACACAATC-3'
    AB133 (30mer) (SEQ ID NR: 19)
    5'-TTTGGATCCTCATTGTCTACTTGTTAGTAC-3',
    um das für das Protein F von BPIV codierende Gen (F-Gensequenz 1987 von H. Shibuta hinterlegt; GenBank-Sequenzzugangsnummer = Y00115) in Form eines 1641-bp-PCR-Fragments zu isolieren. Nach der Reinigung wurde dieses Fragment mit SalI und BamHI gespalten, um ein 1629-bp-SalI-BamHI-Fragment zu erhalten. Dieses Fragment wurde mit dem Vektor pVR1012 (Beispiel 6), der zuvor mit SalI und BamHI gespalten wurde, ligiert, um das Plasmid pAB072 (6497 bp) (11) zu erhalten.
  • Beispiel 16: Präparation und Reinigung der Plasmide
  • Zur Präparation der Plasmide, die für die Impfung von Tieren bestimmt waren, kann jede Technik eingesetzt werden, mit der sich eine Suspension von gereinigten Plasmiden, hauptsächlich in der superhelikalen Form, erhalten lässt. Diese Techniken sind dem Fachmann bekannt. Insbesondere lässt sich die alkalische Lyse-Technik, gefolgt von zwei aufeinander folgenden Cäsiumchloridgradienten-Ultrazentrifugationen in Gegenwart von Ethidiumbromid, nennen, wie in J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989) beschrieben. Es wird auch auf die Patentanmeldungen PCT WO 95/21250 und PCT WO 96/02658 verweisen, welche Verfahren zur Herstellung von Plasmiden, die zur Impfung geeignet sind, im industriellen Maßstab beschreiben. Für den Bedarf der Herstellung von Impfstoffen (siehe Beispiel 17) werden die gereinigten Plasmide so resuspendiert, dass hochkonzentrierte Lösungen (> 2 mg/ml) erhalten werden, die lagerungsbeständig sind. Dazu werden die Plasmide in ultrareinem Wasser oder in TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) resuspendiert.
  • Beispiel 17: Herstellung von vereinigten Impfstoffen
  • Die verschiedenen Plasmide, die zur Herstellung eines vereinigten Impfstoffs benötigt werden, werden ausgehend von ihren konzentrierten Lösungen (Beispiel 16) gemischt. Die Gemische werden so hergestellt, dass die Endkonzentration jedes Plasmids der wirksamen Dosis jedes Plasmids entspricht. Die zur Einstellung der Endkonzentration des Impfstoffs verwendbaren Lösungen können eine 0,9%ige NaCl-Lösung oder PBS-Puffer sein.
  • Beispiel 18: Impfung von Rindern
  • Rinder werden mit Dosen von 100 μg, 250 μg oder 500 μg pro Plasmid geimpft. Die Injektionen erfolgen mit einer Kanüle auf intramuskulärem Weg entweder in Höhe des Musculus gluteus oder in Höhe der Nackenmuskeln. Die Impfdosen werden in Volumina von 1 bis 5 ml verabreicht.

Claims (14)

  1. Rinderimpfstoff, umfassend ein Plasmid, das ein Gen des respiratorischen Rinder-Synzitialvirus (BRSV), wobei das Gen aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus F und G besteht, sowie ein geeignetes Vehikel enthält.
  2. Impfstoff nach Anspruch 1, wobei das Plasmid die beiden Gene F und G umfasst.
  3. Impfstoff nach Anspruch 1, umfassend ein Plasmid, das F enthält, und ein Plasmid, das G enthält.
  4. Impfstoff nach Anspruch 1, wobei das Plasmid das Gen F enthält.
  5. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Plasmid einen Promotor umfasst, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus dem CMV-IE-Promotor, dem frühen SV40-Promotor, dem späten SV40-Promotor, dem LTR-Promotor des Rous-Sarkoma-Virus und dem Promotor eines Cytoskelettgens besteht.
  6. Impfstoff nach Anspruch 5, wobei der Promotor ein CMV-IE-Promotor ist.
  7. Impfstoff nach Anspruch 5, wobei der Promotor eines Cytoskelettgens der Promotor von Desmin oder der Promotor von Aktin ist.
  8. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass er außerdem ein Plasmid umfasst, das ein Gen eines anderen Rinder-Atemwegspathogens enthält und exprimiert.
  9. Impfstoff nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass er zwei Plasmide umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus einem Plasmid, das das Gen gB oder gD des Rinder-Herpesvirus enthält, einem Plasmid, das das Gen E2, C + E1 + E2 und E1 + E2 des Virus der Schleimhautkrankheit enthält, und einem Plasmid, das das Gen HN oder F des Parainfluenzavirus Typ 3 enthält.
  10. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass er 10 ng bis 1 mg, vorzugsweise 100 ng bis 500 μg, stärker bevorzugt 1 μg bis 250 μg jedes Plasmids umfasst.
  11. Verwendung eines oder mehrerer Plasmide, wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 beschrieben, zur Herstellung eines Impfstoffs gegen das Rinder-Synzitialvirus, der zur Impfung von Rindern bestimmt ist, die mit einem ersten Impfstoff vorgeimpft sind, der ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus lebendem Gesamtimpfstoff, inaktiviertem Gesamtimpfstoff, Untereinheitenimpfstoff, rekombinantem Impfstoff, wobei der erste Impfstoff das oder die Antigene) besitzt, das/die von dem oder den Plasmid(en) codiert wird/werden, oder (ein) Antigen(e), das/die einen Kreuzschutz gewährleiste (t/n).
  12. Impfkit, umfassend eine Impfstoffformulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 10 und einen Impfstoff, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus lebendem Gesamtimpfstoff, inaktiviertem Gesamtimpfstoff, Untereinheitenimpfstoff, rekombinantem Impfstoff, wobei der erste Impfstoff das Antigen besitzt, das von dem Polynucleotid-Impfstoff codiert wird, oder ein Antigen, das einen Kreuzschutz gewährleistet, für die Verabreichung des Letzteren zur Vorimpfung und für die Nachimpfung mit der Impfstoffformulierung.
  13. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 10, begleitet von einem Hinweis, dass diese Formulierung als Nachimpfung zu einem ersten Impfstoff verwendbar ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus lebendem Gesamtimpfstoff, inaktiviertem Gesamtimpfstoff, Untereinheitenimpfstoff, rekombinantem Impfstoff, wobei der erste Impfstoff das Antigen besitzt, das von dem Polynucleotid-Impfstoff codiert wird, oder ein Antigen, das einen Kreuzschutz gewährleistet.
  14. Verwendung eines Plasmids, wie in einem der Ansprüche 1 bis 7 beschrieben, zur Herstellung eines Impfstoffs, der zur Impfung von Rindern gegen des respiratorische Rinder-Synzitialvirus bestimmt ist, in Verbindung mit einem lebenden oder inaktivierten Gesamtimpfstoff, rekombinanten Impfstoff oder Untereinheitenimpfstoff, der gegen eine andere Rindererkrankung gerichtet ist.
DE69725988T 1996-07-19 1997-07-16 Polynukleotid-impfstoff, vorzugsweise zur behandlung der atemkrankheit bei rindern Expired - Lifetime DE69725988T2 (de)

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