ES2210548T3 - Formula de vacuna polinucleotidica, particularmente para el tratamiento de la patologia respiratoria en los bovinos. - Google Patents
Formula de vacuna polinucleotidica, particularmente para el tratamiento de la patologia respiratoria en los bovinos.Info
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Abstract
LA FORMULA DE VACUNA BOVINA CONTRA LA PATOLOGIA RESPIRATORIA DE LOS BOVINOS, COMPRENDE AL MENOS TRES VALENCIAS DE VACUNA POLINUCLEOTIDICA QUE COMPRENDEN CADA UNA UN PLASMIDO QUE COMPRENDE UN GEN DE UNA VALENCIA DE PATOGENO RESPIRATORIO BOVINO SUSCEPTIBLE DE EXPRESARLO EN VIVO EN LAS CELULAS MADRE, SIENDO ELEGIDAS ESTAS VALENCIAS ENTRE EL GRUPO QUE CONSISTE EN UN VIRUS DE HERPES BOVINO, VIRUS RESPIRATORIO SINCITIAL BOVINO, VIRUS DE LA ENFERMEDAD DE LAS MUCOSAS Y VIRUS PARAINFLUENZA DE TIPO 3, TENIENDO LOS PLASMIDOS POR CADA VALENCIA, UNO O VARIOS DE LOS GENES ELEGIDOS EN EL GRUPO QUE CONSISTE EN GB Y GD PARA LE VIRUS DE HERPES BOVINO, F Y G PARA EL VIRUS RESPIRATORIO SINCITIAL BOVINO, E2, C + E1 + E2 Y E1 + E2 PARA EL VIRUS DE LA ENFERMEDAD DE LAS MUCOSAS, HN Y F PARA EL VIRUS PARAINFLUENZA DE TIPO 3.
Description
Fórmula de vacuna polinucleotídica,
particularmente para el tratamiento de la patología respiratoria en
los bovinos.
La presente invención se refiere a una fórmula de
vacuna que permite la vacunación de los bovinos principalmente
contra la patología respiratoria. Se refiere asimismo a un método de
vacunación correspondiente.
Todos los bovinos son portadores de virus y de
bacterias potencialmente patógenas a unos grados muy variables.
Los virus pueden multiplicarse cuando la
inmunidad específica se encuentra debilitada y cuando existen unas
lesiones en las vías respiratorias. A continuación se excretan por
el animal y pueden por lo tanto contaminar otros animales.
De entre los virus que se encuentran, se pueden
citar principalmente el virus parainfluenza del tipo 3
(PI-3), de patogenicidad propia moderada, el virus
respiratorio sincitial bovino (RSV) y el herpes virus bovino (BHV)
todavía denominado de la rinotraqueidad infecciosa bovina (IBR), de
patogenecidades propias elevadas.
Otro virus particularmente importante debido a su
papel inmunosupresor y sus efectos nefastos sobre la reproducción es
el virus de la enfermedad de las mucosas o pestivirus bovino
(BDVD).
Dichos virus se traducen en general mediante una
fase primaria de hipertermia, de síndrome gripal y de trastornos
respiratorios, con unos trastornos digestivos (diarreas) en el caso
de BVD. Dicha fase puede acompañarse de una fase secundaria con la
aparición de bronconeumonias ligadas a unas infecciones bacterianas,
en particular a Pasteurella, pudiendo ocasionar la muerte.
Dicho fenómeno se exacerba particularmente debido a la
inmunodepresión consecuencia de la infección por BVD o mediante la
infección de los macrófagos por PI-3. Pueden
aparecer además otros síntomas, como unos abortos por BVD y BHV.
Parece, por lo tanto, necesario intentar poner a
punto una prevención eficaz contra los principales virus que
intervienen en la patología respiratoria de los bovinos.
Se han propuesto con anterioridad en el pasado
unas asociaciones de vacunas contra determinados virus responsables
de la patología respiratoria de los bovinos.
Las asociaciones desarrolladas hasta el momento
se habían llevado a cabo a partir de unas vacunas inactivadas o de
vacunas vivas y eventualmente de mezclas de tales vacunas. Su
utilización presenta problemas de compatibilidad entre valencias y
de estabilidad. En efecto hay que asegurar a la vez la
compatibilidad entre las diferentes valencias de la vacuna, ya sea
en el plano de los diferentes antígenos utilizados o en el plano de
las formulaciones por sí mismas, principalmente en el caso en el
que se combinan a la vez unas vacunas inactivadas y unas vacunas
vivas. Se presenta asimismo el problema de la conservación de dichas
vacunas combinadas y también su inocuidad principalmente en
presencia de un adyuvante. Dichas vacunas son en general bastante
caras.
Las solicitudes de patente WO-A-
90 11092, WO-A- 93 19183, WO-A- 94
21797 y WO-A-95 20660 han utilizado
la técnica recientemente desarrollado de unas vacunas
polinueclotídicas. Se sabe que dichas vacunas utilizan un plásmido
apto para expresar en las células del huésped el antígeno insertado
en el plásmido. Se han propuesto todas las vías de administración
(intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, transcutánea,
intradérmica, mucosa, etc..). Se pueden asimismo utilizar diferentes
medios de vacunación, tales como ADN depositado en la superficie de
partículas de oro y proyectado de forma que penetra en la piel del
animal (Tang et al., Nature 356, 152-154, 1992) y
los inyectores de chorro líquido que permiten transfectar a la vez
en la piel, el músculo, los tejidos adiposos y los tejidos mamarios
(Furth et al., Analytical Biochemistry, 205,
365-368, 1992).
Las vacunas polinucloetídicas pueden utilizar
tanto unos ADN desnudos como unos ADN formulados por ejemplo en el
núcleo de liposomas o de lípidos catiónicos.
G.J.M COX ha propuesto con anterioridad la
vacunación polinucleotídica contra el herpes virus bovino de tipo I
en J. of Virology, volumen 67, nº 9, septiembre 1993,
5664-5667. Los autores han descrito principalmente
unos plásmidos que integran los genes gI (gB), gIII (gC) y gIV
(gD).
En la revista Vaccine, Volumen 13, nº 4,
415-421, 1995, J.E. CROWE presenta una revisión
general de los diferentes métodos de vacunación contra el virus
respiratorio sincitial y contra el virus parainfluenza de tipo 3.
Dicha revisión recoge el conjunto de las posibilidades ofrecidas
mediante las técnicas actuales de vacunación y sugiere simplemente
que la tecnología de la inmunización polinucloetídica podría ser
útil en la estrategia de inmunización contra RSV y
PI-3. No se ha descrito ninguna construcción de
plásmido ni resultado de vacunación de los bovinos contra dichos
virus en dicho documento.
La invención se propone por lo tanto proporcionar
una fórmula de vacuna multivalente que permite asegurar una
vacunación contra un determinado número de virus patógenos que
intervienen principalmente en la patología respiratoria de los
bovinos y de este modo asegurar una vacunación eficaz contra dicha
patología.
Otro objetivo de la invención es proporcionar
dicha fórmula de vacuna que asocie diferentes valencias al mismo
tiempo que presenta todos los criterios requeridos de compatibilidad
y de estabilidad de las valencias entre ellas.
Otro objetivo de la invención es proporcionar
dicha fórmula de vacuna que permita asociar diferentes valencias en
un mismo vehículo.
Otro objetivo de la invención es proporcionar
dicha vacuna que se utilice de forma sencilla y poco costosa.
Otro objetivo adicional de la invención es
proporcionar dicha fórmula de vacuna y un método de vacunación de
los bovinos que permita obtener una protección multivalente con un
nivel elevado de eficacia y de larga duración, así como una buena
inocuidad y ausencia de residuos.
La presente invención tiene por lo tanto como
objetivo una fórmula de vacuna principalmente contra la patología
respiratoria de los bovinos, que comprende por lo menos tres
valencias de vacuna polinucleotídica, comprendiendo cada una un
plásmido integrador, de forma que lo expresa in vivo en las
células huésped, un gen de valencia del patógeno respiratorio
bovino, dichas valencias se seleccionan de entre el grupo que
consiste en un virus herpes bovino, virus respiratorio sincitial
bovino, virus de la enfermedad de las mucosas y virus parainfluenza
de tipo 3, los plásmidos que comprenden, para cada valencia, uno o
diversos de los genes seleccionados de entre el grupo consistente en
gB y gD para el virus herpes bovino, F y G para el virus
respiratorio sincitial bovino, E2, C + E1 + E2 y E1 + E2 para el
virus de la enfermedad de las mucosas, HN y F para el virus
parainfluenza de tipo 3.
Por valencia, en la presente invención, se
entiende por lo menos un antígeno que asegura una protección contra
el virus del patógeno considerado, la valencia puede contener, a
título de sub-valencia, uno o diversos genes
naturales o modificados de una o diversas cepas del patógeno
considerado.
Por gen de agente patógeno, se entiende no
solamente el gen completo, sino asimismo las secuencias
nucleotídicas diferentes, comprendiendo los fragmentos, que
conservan la capacidad de inducir una respuesta protectora. La
noción de gen incluye, las secuencias nucleotídicas equivalentes a
las descritas precisamente en los ejemplos, es decir las secuencias
diferentes pero que codifican para la misma proteína. Incluye
asimismo las secuencias nucleotídicas de otras cepas del patógeno
considerado, asegurando una protección cruzada o una protección
específica de la cepa o del grupo de cepas. Incluye además las
secuencias nucleotídicas que se han modificado para facilitar la
expresión in vivo por parte del animal huésped pero que
codifica para la misma proteína.
Preferentemente, la fórmula de la vacuna según la
invención comprende las cuatro valencias.
En lo que se refiere a la valencia BHV, se
preferible utilizar los dos genes que codifican para gB y gD, en
unos plásmidos diferentes o en uno sólo y el mismo plásmido.
Eventualmente, pero de una forma menos preferida, se puede utilizar
uno u otro de dichos genes.
Para la valencia RSV, se utilizan preferentemente
los dos genes G y F integrados en dos plásmidos diferentes o en uno
sólo y el mismo plásmido. Eventualmente, pero de forma menos
preferida, se puede utilizar el gen F solo.
Para la valencia BVD, se preferirá utilizar un
plásmido que integra el gen E2. Eventualmente, pero de forma menos
preferida, se puede utilizar un plásmido que codifica para E1 y E2
juntos o para el conjunto constituido por C, E1 y E2.
Para la valencia PI-3, se
preferirá utilizar el conjunto de los dos genes HN y F en dos
plásmidos diferentes o en uno solo y el mismo plásmido. Se puede
utilizar únicamente el gen HN.
Una fórmula de vacuna preferida según la
invención comprende y asegura la expresión de los genes gB y gD de
BHV, G y F de RSV, E2 de BVD y HN y F de PI-3.
La fórmula de vacuna según la invención podrá
presentarse bajo un volumen de dosis comprendido entre 0,1 y 10 ml y
en particular entre 1 y 5 ml.
La dosis estará generalmente comprendida entre 10
ng y 1 mg, preferentemente entre 100 ng y 500 ng y más
preferentemente entre 1 \mug y 250 \mug por tipo de
plásmido.
Se utilizarán preferentemente unos plásmidos
desnudos, simplemente colocados en el vehículo de vacunación que en
general será suero fisiológico (NaCl 0,9%), agua ultrapura, tampón
TE, etc. Por supuesto, se pueden utilizar todas las formas de vacuna
polinucleotídica descritas en la técnica anterior.
Cada plásmido comprende un promotor apto para
asegurar la expresión del gen insertado bajo su dependencia en las
células huésped. Se tratará en general de un promotor eucariota
fuerte y en particular de un promotor precoz del
citomegalovirus CMV-IE, de origen humano o murino, o
incluso eventualmente de otro origen tal como la rata, el cerdo, o
el cobaya.
De forma más general, el promotor podrá ser o
bien de origen viral, o bien de origen celular. Como promotor viral
diferente de CMV-IE, se puede citar el promotor
precoz o tardío del virus SV40 o el promotor LTR del virus del
sarcoma de Rous. Se puede asimismo tratar de un promotor del virus
del que proviene el gen, por ejemplo el promotor propio del gen.
Como promotor celular, se puede citar el
promotor de un gen del citoesqueleto, tal como por ejemplo el
promotor de la desmina (Bolmont et al., Journal of Submicroscopic
Cytology and Pathology, 1990, 22, 117-122; y ZHENLIN
et al., Gene, 1989, 78, 243-254), o incluso el
promotor de la actina.
Cuando diversos genes están presentes en el mismo
plásmido, dichos genes se pueden presentar en la misma unidad de
transcripción o en dos unidades diferentes.
La combinación de las diferentes valencias de la
vacuna según la invención se puede llevar a cabo, preferentemente,
mediante la mezcla de plásmidos polinucleotídicos que expresan el o
los antígenos de cada valencia, pero se puede asimismo prever hacer
que se expresen unos antígenos de diversas valencias para un mismo
plásmido.
La invención tiene además como objeto unas
fórmulas de vacuna monovalente que comprenden uno o diversos
plásmidos que codifican para uno o diversos genes de uno de los
virus seleccionados de entre el grupo consistente en BRSV, BVD y
PI-3, los genes son los descritos anteriormente.
Además de su carácter monovalente, dichas fórmulas pueden presentar
las características descritas anteriormente en lo que se refiere a
la selección de los genes, sus combinaciones, la composición de los
plásmidos, los volúmenes de las dosis, las dosis, etc..
Las fórmulas de vacuna monovalente se pueden
utilizar (i) para la preparación de una fórmula de vacuna
polivalente tal como se ha descrito anteriormente, (ii) a título
individual contra la patología propia, (iii) asociadas a una
vacuna de otro tipo (entera viva o inactivada, recombinante,
sub-unidad) contra otra patología, o (iv) como
recordatorio de una vacuna tal como se describe a continuación.
En efecto, la presente invención tiene además por
objeto la utilización de uno o diversos plásmidos según la invención
para la preparación de una vacuna destinada a vacunar los bovinos
primo-vacunados mediante una primera vacuna clásica
del tipo de las de la técnica anterior seleccionada principalmente
de entre el grupo que consiste en vacuna entera viva, vacuna entera
inactivada, vacuna de sub-unidad, vacuna
recombinante, dicha primera vacuna presentando, es decir conteniendo
o pudiendo expresar, el o los antígenos codificado(s) para el
o los plásmidos o antígeno(s) asegurando una protección
cruzada.
De forma destacable, la vacuna polinucleotídica
presenta un efecto recordatorio pudiendo traducirse mediante una
amplificación de la respuesta inmunitaria y la instauración de una
inmunidad de larga duración.
De forma general, las vacunas de
primo-vacunación se podrían seleccionar de entre las
vacunas comerciales disponibles en los diferentes productores de
vacunas veterinarias.
La invención tiene asimismo por objeto un equipo
de vacunación que reagrupa una vacuna de
primo-vacunación tal como se ha descrito
anteriormente y una fórmula de vacuna según la invención para el
recordatorio. Se refiere asimismo a una fórmula de vacuna según la
invención acompañada de una nota indicando la utilización de dicha
fórmula como recordatorio de una primo vacunación tal como se
describe a continuación.
La presente invención tiene asimismo por objeto
un método de vacunación de los bovinos contra la patología
respiratoria, que comprende la administración de la fórmula de
vacuna eficaz tal como se ha descrito anteriormente. Dicho método de
vacunación comprende la administración de una o diversas dosis de la
fórmula de la vacuna, dichas dosis se pueden administrar
sucesivamente en un plazo de tiempo corto y/o sucesivamente a unos
tiempos distanciados los unos de los otros.
Las fórmulas de la vacuna según la invención se
puede administrar, en el marco de dicho método de vacunación,
mediante las diferentes vías de administración propuestas en la
técnica anterior para la vacunación polinucleotídica y mediante unas
técnicas de administración conocidas.
La invención tiene asimismo como objeto el método
de vacunación consistente en llevar a cabo una
primo-vacunación tal como se ha descrito
anteriormente y un recordatorio con una fórmula de vacuna según la
invención.
En una forma de utilización preferida del
procedimiento según la invención, se administra en un primer
momento, al animal, una dosis eficaz de una vacuna del tipo clásico,
principalmente inactivada, viva, atenuada o recombinante, o incluso
una vacuna de sub-unidad de forma que se asegura una
primo-vacunación, y, preferentemente en un plazo de
2 a 6 semanas, se asegura la administración de una vacuna
polivalente o monovalente según la invención.
La invención se refiere asimismo al método de
preparación de las fórmulas de la vacuna, es decir la preparación
de las valencias y sus mezclas, tal como destaca de dicha
descripción.
La invención se describe a continuación con mayor
detalle, con la ayuda de las formas de realización de la invención,
haciendo referencia a los dibujos adjuntos.
Figura Nº 1: Plásmido pVR1012
Figura Nº 2: Secuencia del gen
BHV-1 ST gB
Figura Nº 3: Construcción del plásmido pPB156
Figura Nº 4: Plásmido pAB087
Figura Nº 5: Plásmido pAB011
Figura Nº 6: Plásmido pAB012
Figura Nº 7: Plásmido pAB058
Figura Nº 8: Plásmido pAB059
Figura Nº 9: Plásmido pAB060
Figura Nº 10: Plásmido pAB071
Figura Nº 11: Plásmido pAB072
SEC ID Nº 1: Secuencia del gen
BHV-1 gB (cepa ST)
SEC ID Nº 2: Oligonucleótido PB234
SEC ID Nº 3: Oligonucleótido PB235
SEC ID Nº 4: Oligonucleótido AB162
SEC ID Nº 5: Oligonucleótido AB163
SEC ID Nº 6: Oligonucleótido AB026
SEC ID Nº 7: Oligonucleótido AB027
SEC ID Nº 8: Oligonucleótido AB028
SEC ID Nº 9: Oligonucleótido AB029
SEC ID Nº 10: Oligonucleótido AB110
SEC ID Nº 11: Oligonucleótido AB111
SEC ID Nº 12: Oligonucleótido AB114
SEC ID Nº 13: Oligonucleótido AB115
SEC ID Nº 14: Oligonucleótido AB116
SEC ID Nº 15: Oligonucleótido AB117
SEC ID Nº 16: Oligonucleótido AB130
SEC ID Nº 17: Oligonucleótido AB131
SEC ID Nº 18: Oligonucleótido AB132
SEC ID Nº 19: Oligonucleótido AB133
Los virus se cultivan sobre el sistema celular
adecuado hasta la obtención de un efecto citopático. Los sistemas
celulares a utilizar para cada virus son bien conocidos por la
persona experta en la técnica. Brevemente, unas células sensibles al
virus utilizado, cultivadas en un medio esencial Eagle (medio MEM) o
cualquier otro medio adecuado, se inoculan con la cepa viral
estudiada utilizando una multiplicidad de infección de 1. Las
células infectadas se incuban entonces a una temperatura de 37ºC
durante el tiempo necesario para la aparición de un efecto
citopático completo (una media de 36 horas).
Después del cultivo, se recogen el sobrenadante y
las células lisadas y la totalidad de la suspensión viral se
centrifuga a 1000 g durante 10 minutos a una temperatura de +4ºC
para eliminar los restos celulares. Entonces se recogen las
partículas virales por ultracentrifugación a 400000 g durante 1 hora
a una temperatura de +4ºC. Se recoge el pellet en un volumen mínimo
de tampón (Tris 10 mM, EDTA 1 mM). Dicha suspensión viral
concentrada se trata con la proteínasa K (100 \mug/ml final) en
presencia de sulfato dodecil sodio (SDS) (0,5 % final) durante 2
horas a una temperatura de 37ºC. El ADN viral se extrae a
continuación con una mezcla de fenol/cloroformo, después se
precipita con 2 volúmenes de etanol absoluto. Después de una noche a
- 20ºC, el ADN se centrifuga a 10000 g durante 15 minutos a una
temperatura de + 4ºC. El pellet de ADN se seca, después se
resuspende en un volumen mínimo de agua ultrapura estéril. Entonces
se puede digerir utilizando unos enzimas de restricción.
Los virus de ARN se han purificado mediante las
técnicas bien conocidas por la persona experta en la técnica. El ARN
viral genómico de cada virus se ha aislado a continuación utilizando
la técnica de extracción "tiocianato de
guanidio/fenol/cloroformo" descrita por P. Chomczynski y N.
Sacchi (Anal. Biochem. 1987, 162, 156-159).
Todas las construcciones de plásmidos se han
realizado utilizando las técnicas estándar de biología molecular
descritas por J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A
Laboratory Manual. 2^{nd} Edition. Cold Spring Harbor
Laboratory. Cold Spring Harbor. New York. 1989). Todos los
fragmentos de restricción utilizados para la presente invención se
han aislado utilizando el equipo "Geneclean" (BIO101 Inc. La
Jolla, CA).
Se sintetizaron unos oligonucleótidos específicos
(que presentan en sus extremidades 5' unos lugares de restricción
para facilitar el clonaje de los fragmentos amplificados) de tal
forma que cubren completamente las regiones codificantes de los
genes que se deben amplificar (ver los ejemplos específicos). La
reacción de transcripción inversa (RT ) y la amplificación en cadena
por polimerasa (PCR) se llevaron a cabo según la técnicas estándar
(J. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual. 2^{nd} Edition. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold
Spring Harbor. New York. 1989). Cada reacción de
RT-PCR se ha llevado a cabo con un par de amplímeros
específicos y tomando como matriz el ARN genómico viral extraído. EL
ADN complementario se ha extraído con fenol/cloroformo/alcohol
isoamílico (25:24:1) antes de digerirse con los enzimas de
restricción.
El plásmido pVR1012 (Figura Nº 1) se ha obtenido
de Vical Inc. San Diego, CA, USA. Su construcción se ha descrito en
J. Hartikka et al. (Human Gene Therapy. 1996.
1205-1217).
El ADN genómico del herpes virus bovino
BHV-1 (cepa ST) (Leung-Tack P. et
al., Virology. 1994. 199. 409-421) se ha
preparado según la técnica descrita en el ejemplo 2, se ha digerido
con BamHI. Después de la purificación, el fragmento
BamHI-BamHI de 18 kpb se ha clonado en el vector
pBR322 previamente digerido con BamHI, para proporcionar el plásmido
pIBR-4-BamHI (22 kpb).
El plásmido
pIBR-4-BamHI se digiere a
continuación con SalI para liberar el fragmento SalI - SalI
de 6,6 kpb que contiene el gen codificante para la glicoproteína gB
del BHV-1 (Figura Nº 2 y SEC ID Nº 1). Dicho
fragmento se ha clonado en el vector pBR322, previamente digerido
con SalI, para proporcionar el plásmido
pIBR-6,6-SalI (10,9 kpb).
El plásmido
pIBR-6,6-SalI se ha digerido con
NheI y BglII para liberar el fragmento
NheI-Bgl II de 2676 kpb que contiene el gen
codificante para la glicoproteína gB del herpes virus bovino
(BHV-1) (fragmento A).
Se ha llevado a cabo una reacción de PCR con el
ADN genómico del herpes virus bovino (BHV-1) (cepa
ST) y con los oligonucleótidos siguientes:
PB234 (30 mer) (SEC ID Nº 2)
5' TTGTCGACATGGCCGCTCGCGGCGGTGCTG 3'
PB235 (21 mer) (SEC ID Nº 3)
5' GCAGGGCAGCGGCTAGCGCGG 3'
para aislar la parte 5' del gen codificante para
la glicoproteína gB del BHV-1. Después de la
purificación, el producto de PCR de 153 pb se ha digerido con
SalI y NheI para aislar el fragmento
SalI-NheI de 145 pb (fragmento B).
Los fragmentos A y B se han ligado conjuntamente
con el vector pVR1012 (ejemplo 6), previamente digerido con
SalI y BamHI para proporcionar el plásmido pPB156
(7691 pb) (Figura Nº 3).
Se ha realizado una reacción de PCR con el ADN
genómico del herpes virus bovino (BHV- 1) (Cepa ST) (P.
Leung-Tack et al. Virology. 1994. 199.
409-421), preparado según la técnica descrita en el
ejemplo 2 y con los oligonucleótidos siguientes:
AB162 (31 mer) (SEC ID Nº 4)
5' AAACTGCAGATGCAAGGGCCGACATTGGCCG 3'
AB163 (27 mer) (SEC ID Nº 5)
5' ATCTTGTACCATATGACCGTGGCGTTG 3'
para amplificar la parte 5' del gen codificante
para la glicoproteína gD del herpes virus bovino (BHV - 1) (Nº de
acceso a la secuencia GenBank = L 26360) bajo la forma de un
fragmento de PCR de 338 pb. Después de la purificación, dicho
producto se ha digerido con PstI y NdeI para aislar un
fragmento PstI y NdeI de 317 pb (fragmento A).
El plásmido pBHV001 (P. Leung -Tack et al.
Virology. 1994. 199. 409-421) se ha digerido con
NdeI y StyI para liberar un fragmento de 942 pb que
contiene la parte 3' del gen codificante para la glicoproteína gD
del BHV-1 (fragmento B).
Los fragmentos A y B se han ligado conjuntamente
con el vector pVR1012 (ejemplo 6), previamente digerido con
PstI y XbaI para proporcionar el plásmido pAB087 (6134
pb) (Figura Nº 4).
Se ha realizado una reacción de
RT-PCR según la técnica descrita en el ejemplo 5,
con el ARN genómico del virus respiratorio sincitial bovino (BRSV)
(Cepa 391 - 2) (R. Lerch et al. Virology. 1991. 181.
118-131), preparado tal como se indica en el ejemplo
3 y con los oligonucleótidos siguientes:
AB026 (33 mer) (SEC ID Nº 6)
5' AAAACTGCAGGGATGGCGGCAACAGCCATGAGG 3'
AB027 (31 mer) (SEC ID Nº 7)
5' CGCGGATCCTCATTTACTAAAGGAAAGATTG 3'
para aislar el gen codificante para la
glicoproteína de fusión F (BRSV F) en forma de un fragmento de PCR
de 1734 pb. Después de la purificación, dicho producto se ha
digerido con PstI y BamHI para aislar un fragmento
PstI-BamHI de 1717 pb. Dicho fragmento se ha ligado
con el vector pVR1012 (ejemplo 6), previamente digerido con
PstI y BamHI para proporcionar el plásmido pAB011
(6587 pb) (Figura Nº 5).
Se ha realizado una reacción de
RT-PCR según la técnica descrita en el ejemplo 5,
con el ARN genómico del virus respiratorio sincitial bovino
(BRSV) (Cepa 391 - 2) (R. Lerch et al. Virology. 1990. 64.
5559-5569), y con los oligonucleótidos
siguientes:
AB028 (32 mer) (SEC ID Nº 8)
5' AAAACTGCAGATGTCCAACCATACCCATCATC 3'
AB029 (35 mer) (SEC ID Nº 9)
5' CGCGGATCCCTAGATCTGTGTAGTTGATTGATTTG 3'
para aislar el gen codificante para la proteína G
(BRSV F) en forma de un fragmento de PCR de 780 pb. Después de la
purificación, dicho producto se ha digerido con PstI y
BamHI para aislar un fragmento PstI - BamHI de 763 pb. Dicho
fragmento se ha ligado con el vector pVR1012 (ejemplo 6),
previamente digerido con PstI y BamHI para
proporcionar el plásmido pAB012 (5634 pb) (Figura Nº 6).
Se ha realizado una reacción de
RT-PCR según la técnica descrita en el ejemplo 5,
con el ARN genómico del virus de la diarrea viral bovina (BVDV)
(Cepa Osloss) (L. De Moerlooze et al. J. Gen. Virol. 1993.
74. 1433- 1438 ), preparado según la técnica descrita en el ejemplo
3 y con los oligonucleótidos siguientes:
AB110 (35 mer) (SEC ID Nº 10)
5' AAAACTGCAGATGTCCGACACAAAAGCAGAAGGGG 3'
AB111 (47 mer) (SEC ID Nº 11)
5'
CGCGGATCCTCAATAAAAATCATTCCCACTGCGACTTGAAACAAAAC 3'
para amplificar un fragmento de 342 pb
conteniendo el gen codificante para la proteína de la cápsida C del
virus BVDV. Después de la purificación, el producto de
RT-PCR se ha digerido con PstI y BamHI
para proporcionar un fragmento PstI - BamHI de 324 pb.
Dicho fragmento se ha ligado con el vector
pVR1012 (ejemplo 6), previamente digerido con PstI y
BamHI para proporcionar el plásmido pAB058 (5183 pb) (Figura
Nº 7).
Se ha realizado una reacción de
RT-PCR según la técnica descrita en el ejemplo 5,
con el ARN genómico del virus de la diarrea viral bovina (BVDV)
(Cepa Osloss) (L. De Moerlooze et al. J. Gen. Virol. 1993.
74. 1433-1438 ) y con los oligonucleótidos
siguientes:
AB114 (32 mer) (SEC ID Nº 12)
5' ACGCGTCGACATGAAGAAACTAGAGAAAGCCC 3'
AB115 (33 mer) (SEC ID Nº 13)
5' CGCGGATCCTCAGCCGGGTTTGCAAACTGGGAG 3'
para aislar la secuencia codificante para la
proteína E1 del virus BVDV en forma de un fragmento PCR de 1381 pb.
Después de la purificación, dicho fragmento se ha digerido con
SalI y BamHI para proporcionar un fragmento SalI -
BamHI de 1367 pb.
Dicho fragmento se ha ligado con el vector
pVR1012 (ejemplo 6), previamente digerido con SalI y
BamHI, para proporcionar el plásmido pAB059 (6236 pb)
(Figura nº 8).
Se ha realizado una reacción de
RT-PCR según la técnica descrita en el ejemplo 5,
con el ARN genómico del virus de la diarrea viral bovina (BVDV)
(Cepa Osloss) (L. De Moerlooze et al. J. Gen. Virol. 1993.
74. 1433-1438 ) y con los nucleótidos
siguientes:
AB116 (36 mer) (SEC ID Nº 14)
5' ACGCGTCGACATGACGACTACTGCATTCCTGGTATG 3'
AB117 (33 mer) (SEC ID Nº 15)
5' CGCGGATCCTCATTGACGTCCCGAGGTCATTTG 3'
para aislar la secuencia codificante para la
proteína E2 del virus BVDV en forma de un fragmento PCR de 1252 pb.
Después de la purificación, dicho fragmento se ha digerido con
SalI y BamHI para proporcionar un fragmento SalI -
BamHI de 1238 pb.
Dicho fragmento se ha ligado con el vector
pVR1012 (ejemplo 6), previamente digerido con SalI y
BamHI, para proporcionar el plásmido pAB060 (6107 pb)
(Figura nº 9).
Se ha realizado una reacción de
RT-PCR según la técnica descrita en el ejemplo 5,
con el ARN genómico del virus parainfluenza bovino del tipo 3 (PI3 =
BPIV) y con los oligonucleótidos siguientes:
AB130 (36 mer) (SEC ID Nº 16)
5' TTTGTCGACATGGAATATTGGAAACACACAAAC 3'
AB131 (33 mer) (SEC ID Nº 17)
5' TTTGGATCCTTAGCTGCAGTTTTTCGGAACTTC 3'
para aislar el gen codificante para la
glicoproteína HN del BPIV (secuencia del gen HN depositado por H.
Shibuta en 1987. Nº de acceso de la secuencia en GenBank =
Y00115) en forma de un fragmento PCR de 1737 pb. Después de la
purificación, dicho fragmento se ha digerido con SalI y
BamHI para aislar un fragmento SalI - BamHI de 1725 pb. Dicho
fragmento se ha ligado con el vector pVR1012 (ejemplo 6),
previamente digerido con SalI y BamHI, para
proporcionar el plásmido pAB071 (6593 pb) (Figura Nº 10).
Se ha realizado una reacción de
RT-PCR según la técnica descrita en el ejemplo 5,
con el ARN genómico del virus parainfluenza bovino del tipo 3 (PI3 =
BPIV) y con los oligonucleótidos siguientes:
AB132 (30 mer) (SEC ID Nº 18)
5' TTTGTCGACATGATCATCACAAACACAATC 3'
AB133 (30 mer) (SEC ID Nº 19)
5' TTTGGATCCTCATTGTCTACTTGTTAGTAC 3'
para aislar el gen codificante para la proteína F
del BPIV (secuencia del gen F depositado por H. Shibuta en 1987. Nº
de acceso a la secuencia en GenBank = Y00115) en forma de un
fragmento PCR de 1641 pb. Después de la purificación, dicho
fragmento se ha digerido con SalI y BamHI para aislar
un fragmento SalI y BamHI de 1629 pb. Dicho fragmento se ha ligado
con el vector pVR1012 (ejemplo 6), previamente digerido con
SalI y BamHI, para proporcionar el plásmido pAB072
(6497 pb) (Figura Nº 11).
Para la preparación de los plásmidos destinados a
la vacunación de los animales, se puede utilizar cualquier ténica
que permite obtener una suspensión de plásmidos purificados
mayoritariamente en forma superenrollada. Dichas técnicas son bien
conocidas por la persona experta en la técnica. Se puede citar en
particular la técnica de lisis alcalina seguida de dos
ultracentrifugaciones sucesivas sobre un gradiente de cloruro de
cesio en presencia de bromuro de etidio tal como se ha descrito en
J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory
Manual. 2^{nd} Edition. Cold Spring Harbor Laboratory. New
York. 1989). Se puede asimismo referir a las solicitudes de patente
PCT WO 95/21250 y PCT WO 96/02658 que describen unos métodos para
producir a escala industrial unos plásmidos utilizables para la
vacunación. Para las necesidades de la preparación de las vacunas
(ver ejemplo 17), los plásmidos purificados se resuspenden de forma
que se obtengan unas soluciones a alta concentración (> 2 mg/ml)
compatibles con el almacenaje. Para ello, los plásmidos se
resuspenden o bien en agua ultrapura, o bien en tampón TE ( Tris HCl
10 mM; EDTA 1 mM, pH 8,0).
Los diversos plásmidos necesarios para la
preparación de una vacuna asociada se mezclan a partir de sus
soluciones concentradas (ejemplo 16). Las mezclas se realizan de
manera tal que la concentración final de cada plásmido corresponda a
la dosis eficaz de cada plásmido. Las soluciones utilizables para
ajustar la concentración final de la vacuna pueden ser o bien una
solución NaCl al 0,9%,o bien tampón PBS.
Se pueden asimismo utilizar unas formulaciones
especiales tales como los liposomas, los lípidos catiónicos, para la
preparación de las vacunas.
Los bovinos se vacunan con unas dosis de 100
\mug, 250 \mug o 500 \mug por plásmido. Las inyecciones se
llevan a cabo con una inyección por vía intramuscular o bien a nivel
del músculo gluteus, o bien a nivel de los músculos del
cuello. Las dosis de vacuna se administran en unos volúmenes
comprendidos entre 1 y 5 ml.
Claims (14)
1. Vacuna bovina que comprende un plásmido que
contiene un gen del virus respiratorio sincitial bovino, estando
dicho gen seleccionado de entre el grupo consistente en F y G, y un
vehículo apropiado.
2. Vacuna según la reivindicación 1, en la que el
plásmido comprende los dos genes F y G.
3. Vacuna según la reivindicación 1, que
comprende un plásmido que contiene F y un plásmido que contiene
G.
4. Vacuna según la reivindicación 1, en la que el
plásmido comprende el gen F.
5. Vacuna según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en la que el plásmido comprende un promotor
seleccionado de entre el grupo consistente en promotor
CMV-IE, promotor precoz SV40, promotor tardío SV40,
promotor LTR del virus del sarcoma de Rous y promotor de un gen del
citoesqueleto.
6. Vacuna según la reivindicación 5, en
la que el promotor es un promotor CMV-IE.
7. Vacuna según la reivindicación 5, en la que el
promotor de un gen del citoesqueleto es el promotor de la desmina o
el promotor de la actina.
8. Vacuna según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque comprende además
un plásmido que contiene y expresa un gen de otro patógeno
respiratorio bovino.
9. Vacuna según la reivindicación 8,
caracterizada porque comprende dos plásmidos seleccionados de
entre el grupo consistente en un plásmido que contiene el gen gB o
gD del virus herpes bovino, un plásmido que contiene el gen E2, C +
E1 + E2 y E1 + E2 del virus de la enfermedad de las mucosas y un
plásmido que contiene el gen HN o F del virus parainfluenza de tipo
3.
10. Vacuna según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque comprende de 10
ng a 1 mg, preferentemente de 100 ng a 500 \mug más
preferentemente de 1 \mug a 250 \mug de cada plásmido.
11. Utilización de uno o de diversos plásmidos
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para la preparación
de una vacuna contra el virus sincitial bovino destinado a vacunar
los bovinos primo-vacunados mediante una primera
vacuna seleccionada de entre el grupo consistente en vacuna entera
viva, vacuna entera inactivada, vacuna de
sub-unidad, vacuna recombinante, presentando dicha
primera vacuna el o los antígeno(s) codificado(s) para
el o los plásmido(s) o antígeno(s) asegurando una
protección cruzada.
12. Equipo de vacunación que reagrupa una fórmula
de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y una
vacuna seleccionada de entre el grupo consistente en vacuna entera
viva, vacuna entera inactivada, vacuna de
sub-unidad, vacuna recombinante, dicha primera
vacuna presentando el antígeno codificado por la vacuna
polinucleotídica o un antígeno asegurando una protección cruzada,
para una administración de dicho último en
primo-vacunación y para un recordatorio con la
fórmula de la vacuna.
13. Vacuna según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, acompañada de una información indicativa de
que dicha fórmula es utilizable como recordatorio de una primera
vacuna seleccionada de entre el grupo consistente en vacuna entera
viva, vacuna entera inactivada, vacuna de
sub-unidad, vacuna recombinante, dicha primera
vacuna presentando el antígeno codificado por la vacuna
polinueclotídica o un antígeno asegurando una protección
cruzada.
14. Utilización de un plásmido según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 7, para la preparación de una vacuna
destinada a vacunar los bovinos contra el virus respiratorio
sincitial bovino en asociación con una vacuna entera viva o
inactivada, recombinante o de sub-unidad dirigida
contra otra patología bovina.
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