JP2002530349A - Ｎｆ−ａｔ媒介の心臓肥大、それに関係する方法及び試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 この発明は、ＮＦ−ＡＴアンタゴニストの利用により、心臓肥大を治療する方法であり、又は他の心臓及び血管組織の増殖を防止する方法である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明はＮＦ−ＡＴ媒介の心臓肥大に関連した方法及び薬剤に関する。

【０００２】 従来の技術 心不全は米国でほぼ３００万人に影響があり、年々約４０万人の割合で発症し
ている。心不全に対する現在の療法は主としてアンギオテンシン変換酵素（ＡＣ
Ｅ）インヒビターと利尿剤が使用されている。ＡＣＥインヒビターは患者の心不
全の終期の進行を遅延するようであるが、心不全患者の６０％以上の症状を緩和
できず、心不全の死亡率を約０５−２０％程度減少するに過ぎない。心臓移植は
ドナーの心臓が容易に得られないために制限されている。ジゴキシンを除いて、
副作用（不整脈、突然死、その他の生死に拘わる有害な副作用）を伴わない陽性
変力剤の長期投与からは有用な薬剤が得られていない。これらの現在の治療法の
欠陥は更なる治療手段の必要性を示している。

【０００３】 心筋肥大は心筋層の最も重要な生理的反応の一つである。心臓に対する増大し
た動作要求に応答し、或いは心臓の損傷に導くような病理的な各種の刺激に続い
て、筋細胞の増加、個々の心臓細胞中の収縮タンパク質の蓄積、胚遺伝子マーカ
ーの発現の活性化、或いは筋細胞増殖に対する共存的効果の欠落等、により特徴
づけられる各心筋細胞の肥大応答の活性化を通じて心臓は適応する。肥大過程は
初期には補償的であるが、心筋層は機能不全となるような病理的転移があり得る
（Braunwald（１９９４）in Pathophysiologv of Heart Failure,（Braunwald,
ed.）；Saunders, Philadelphia；Vol.１４, pp３９３−４０２）。

【０００４】 心室筋細胞肥大のインビトロモデルでの研究では、多数の機構的、ホルモン的
な成長因子、及び肥大の独立した数種の特徴を活性化できる病理的刺激が特定さ
れている（Chien et al.（１９９１）FASEB J.５：３０３７−３０４６；Knowlt
on et al.（１９９１） J. Biol. Chem. ２６６：７７５９-７７６８； Shubeit
a et al. （１９９０） J. Biol. Chem.２６５ ：２０５５５-２０５６２； Tho
rburn et al. （１９９３） J. Biol. Chem. ２６８：２２４４−２２４９； La
Morte et al. （１９９４）, J.Biol. Chem. ２６９：１３４９０−１３４９６
； Knowlton et al. （１９９３） J. Biol. Chem. ２６８：１５３７４−１５
３８０）. 現在では、少なくとも２種の信号伝達路が存在し、ras−型 （Thorbu
m et al. （１９９３） 上掲）と、Gqタンパク質依存性下流エフェクター（LaMo
rte et al. （１９９４） 上掲） とを含み、これらはインビトロモデル系での
肥大反応の特徴の活性化に関連している。心室筋細胞の肥大反応を活性化する信
号伝達路を探すためのたくさんの方法が提案されたが、非致死的な方法で肥大応
答を抑制する機構に関しては殆ど報告がない。

【０００５】 発明が解決しようとする課題 心臓病の処置、例えば充血性心不全、肥大性心筋症などの心不全療法を改善す
る新規な薬剤に対する明らかな要求がある。したがって、これらの薬剤を同定す
る方法が必要となる。

【０００６】 課題を解決するための手段 本発明は被験者の心臓肥大を抑制または軽減する方法を提供するもので、この
方法は、被験者に、心筋内のＮＦ−ＡＴの生物学的活性を減少するに充分な薬学
的に有効量のＮＦ−ＡＴアンタゴニストを投与して、被験者の心臓肥大を抑制ま
たは減少する。 例えば、本発明の方法はＮＦ−ＡＴアンタゴニストを使用してＮＦ−ＡＴの転
写活性、核転座、及び／又は脱燐酸化を抑制する。 ある例では、本発明のアンタゴニストは例えばタンパク質−タンパク質又はタ
ンパク質−ＤＮＡ相互作用によるＮＦ−ＡＴを含む複合体の形成を抑制する。例
えば、このアンタゴニストはタンパク質とＮＦ−ＡＴ反応性要素を含む遺伝子と
の相互作用を抑制することによりＮＦ−ＡＴ活性を阻害し、或いはＮＦ−ＡＴタ
ンパク質の脱燐酸化を阻害し、或いはＮＦ−ＡＴタンパク質の核転座を抑制する
。アンタゴニストは局所的に又は系統的に投与できる。前者の場合にはアンタゴ
ニストはカテーテルを使用し、及び／又は心筋内空所に灌流できる。 本発明の方法は充血性心臓病等の処置の一部として使用できる。好ましい実施
例では、アンタゴニストはＮＦ−ＡＴｃ３及び／又はＮＦ−ＡＴｃ４を選択的に
抑制できる。

【０００７】 アンタゴニストは次の方法により確認できる。 （ｉ）単離したＮＦ−ＡＴポリペプチド又は分子と相互作用するに充分なその
一部を、該分子及び又は化合物と、当該化合物が存在しなければＮＦ−ＡＴポリ
ペプチド又はその一部と前記分子が相互作用したであろうような条件下で接触さ
せること、 （ii）前記化合物の存在時の、前記ＮＦ−ＡＴポリペプチド又はその一部と前
記分子の間の相互作用の大きさを、前記化合物の不存在時と比較して決定し、そ
れにより、ＮＦ−ＡＴポリペプチド又はその一部と前記分子との、前記化合物の
不存在に比した存在時の弱い相互作用が、ＮＦ−ＡＴポリペプチドの活性のアン
タゴニストであることを示す。 他の形態では、本発明は心臓肥大を治療し又は抑制するための薬剤組成物を提
供するものであり、この薬剤は心臓を標的としてＮＦ−ＡＴアンタゴニストを送
るための製薬上許容できる媒体に担持したＮＦ−ＡＴポリペプチドを含む。 本発明は又、免疫反応を調節し、或いは免疫反応調節剤のスクリーニングをす
るための方法及び組成物を提供する。これらの方法はＮＦ−ＡＴｃ組み替えタン
パク質をコードするポリヌクレオチド配列体と、実質的にＮＦ−ＡＴｃポリヌク
レオチド配列体と実質同一の相補的なポリヌクレオチドを利用する。

【０００８】 本発明はその一形態において、ＮＦ−ＡＴｃポリペプチドとその組成物を提供
する。ＮＦ−ＡＴｃポリペプチドは図１に示した配列に実質的に等しいポリペプ
チド、或いはそれと相同の遺伝子配列を有する。ＮＦ−ＡＴｃをコードする核酸
配列体も提供される。図１におけるヌクレオチド配列及びそれから予想されるア
ミノ酸配列を含むクローンされた配列体も提供される。これらの配列を有するポ
リヌクレオチドは、ヒトＮＦ−ＡＴｃ及びマウスＮＦ−ＡＴｃポリペプチドのよ
うな多量のＮＦ−ＡＴｃポリペプチドの組み換え発現のためのテンプレートとし
て役立つ。これらのポリヌクレオチドはまた核酸ハイブリダイズに対するプロー
ブとして役立ち、例えば各個のリンパ細胞（または他の細胞型）でのインサイテ
ューハイブリダイズによる、ＮＦ−ＡＴｃｍＲＮＡの転写及びｍＲＮＡ存在比を
検出し、ノーザンブロット分析及び／又はインサイテューハイブリダイズよるイ
ンサイテューリンパ細胞増殖を検出し（Aiwine et al. （１９７７） Proc. Nat
l. Acad. Sci. U.S.A. ７４： ５３５０）、ＰＣＲ増幅及び／又はＬＣＲ検出を
行う。かかる組み換えポリペプチド及び核酸ハイブリダイズプローブは、免疫調
節剤のインビトロスクリーニング法に使用でき、またＮＦ−ＡＴ活性が病気の過
程、自己免疫、関節炎等に関与するような移植拒絶反応、Ｔ細胞媒介免疫反応、
リンパ細胞白血病（例えばＴ細胞白血病又はリンパ腫）等の病理学的症状の診断
及び治療に使用できる。

【０００９】 一実施例では、免疫調節剤が、ＮＦ−ＡＴｃポリペプチドが他のＮＦ−ＡＴ（
例えばＡＰ−１）他の要素への結合を阻害し、或いはＮＦ−ＡＴのＮＦ−ＡＴ認
識部位を有するＤＮＡへの結合を阻害する能力を利用して、候補となる免疫調節
剤が同定される。ＤＮＡは好ましくはＮＦ−ＡＴ蛋白質複合体が結合する１以上
のＮＦ−ＡＴ部位を含んでいる。 ＮＦ−ＡＴｃからＤＮＡへの結合を含むＮＦ−ＡＴ蛋白質の結合の一つの検出
手段は、固体基質への共有又は非共有化学結合によるなどしてＤＮＡを不動化し
、この不動化したＤＮＡを、検出マーカ（例えば放射性標識アミノ酸）により標
識したＮＦ−ＡＴｃポリペプチドを含むＮＦ−ＡＴ蛋白質複合体と接触させるこ
とである。このような接触は典型的にはＮＦ−ＡＴ蛋白質を、ＮＦ−ＡＴ結合配
列を含んでいる標的ＤＮＡに結合させることを可能にする水性条件下に行われる
。不動化ＤＮＡへの標識されたＮＦ−ＡＴの結合は、標識されたＮＦ−ＡＴｃポ
リペプチドが特異的結合相互作用の結果として不動化される度合いを決定するこ
とにより測定される。かかる特異的結合は可逆性であるか、又はもしも交差結合
剤が適当な条件下に添加されれば選択的に非可逆性であり得る。

【００１０】 一形態では、候補の免疫調節剤はＮＦ−ＡＴｃと他のＮＦ−ＡＴ複合体（ＡＰ
−１, JunB等）の間の分子間結合を抑制（又は増進）することができる剤として
同定される。本発明はＮＦ−ＡＴｃの他のＮＦ−ＡＴポリペプチドへの結合に干
渉する能力のある剤のライブラリーを、水性条件下にスクリーニングするための
方法と組成物を提供する。典型的には少なくともＮＦ−ＡＴｃ及び／又は他のＮ
Ｆ−ＡＴポリペプチドが検出可能標識によりラベルされ、そして、ＮＦ−ＡＴｃ
とＮＦ−ＡＴポリペプチドとの間の分子間結合がＮＦ−ＡＴ蛋白質複合体等に捕
捉された標識物質の量により検出される。

【００１１】 ＮＦ−ＡＴポリペプチドが核移行配列（ＮＦ−ＡＴポリペプチドが細胞内カル
シウムの存在下に核へ移動するが、カルシウムの不在下にはＮＦ−ＡＴポリペプ
チド中の他の領域と分子内会合を形成することにより遮蔽される配列）を含んで
いるという知見に少なくとも基づいて、本発明は、ＮＦ−ＡＴの移動（transloc
ation）を調節すること、例えば分子内会合を調節して核移行配列（ＮＬＳ）の
遮蔽を行うこと、によりＮＦ−ＡＴの活性を調節する方法を提供する。加えるに
、ＮＦ−ＡＴのＮＬＳはＮＦ−ＡＴのホスホリル化領域と分子内会合を形成する
ので、本発明はＮＦ−ＡＴホスホリル化を調節することよりなるＮＦ−ＡＴ活性
の調節方法を提供する。さらに、ここに記述するようにＮＦ−ＡＴは、蛋白質キ
ナーゼＡ（ＰＫＡ） 及びグリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ−３）（
によりホスホリル化され、カルシニューリンにより脱ホスホリル化されるので、
ホスホリル化の状態及びＮＦ−ＡＴの活性化は、これらのキナーゼ及び／又はホ
スホターゼの活性を調節することにより調整できる。また、本発明の範囲内には
ＮＦ−ＡＴの核移動を調節する化合物及び追加の化合物を同定するためのスクリ
ーニング試験法も含まれる。

【００１２】 本発明の一形態では、ＮＦ−ＡＴのホスホリル化を調節する物質を同定するた
めの方法も提供される。この方法では、試験剤を、ＮＦ−ＡＴポリペプチド（又
はその一部であってＧＳＫ−３キナーゼ活性の基質であるもの）のＧＳＫ−３キ
ナーゼ活性を有する混合物と接触させ、ＧＳＫ−３キナーゼ活性とＮＦ−ＡＴポ
リペプチドの相互作用及び／又はＮＦ−ＡＴポリペプチドのＧＳＫ−３キナーゼ
活性によるホスホリル化の調節を行う能力を決定する。

【００１３】 この試験法は例えば精製した又は半精製したＧＳＫ−３及びＮＦ−ＡＴ基質の
調製物等の組み換えＧＳＫ−３キナーゼ、ＮＦ−ＡＴ基質及び／又はレポータ遺
伝子を使用した細胞に基づいたアッセイ、或いは細胞のない形態でのアッセイで
実施できる。このアッセイは、単純な競合結合アッセイでも良いし、基質のホス
ホリル化の速度を検出するキナーゼ活性アッセイでも良いし、或いは基質の核移
行の速度を検出する核移動アッセイでも良い。好ましい実施例では、このアッセ
イで同定される１以上の化合物を含む薬剤組成物の形成段階をさらに含む。

【００１４】 本発明の他の形態では、ＮＦ−ＡＴを発現する細胞をＧＳＫ−３によるホスホ
リル化を調節する剤（例えばＧＳＫ−３インヒビター特にＮＦ−ＡＴの核移動を
抑制するインヒビター）と接触させることを含むＮＦ−ＡＴホスホリル化を調節
する方法が提供される。

【００１５】 本発明のさらに他の形態は、ＮＦ−ＡＴ蛋白質の核移動を調節するためのペプ
チド又は擬似ペプチド剤に関する。この剤は、核移行シグナルの分子内会合に関
与するＮＦ−ＡＴ蛋白質の部分に対応している。本発明はまた、試験剤をＮＦ−
ＡＴポリペプチド又はその核移行シグナルを含む部分に接触させ、次いで試験剤
が核移行配列に結合し及び／又は核移行配列のホスホリル化形態の三次構造を変
える能力を決定することを含む、ＮＦ−ＡＴの核移動を調節する化合物を同定す
る方法を提供する。上記のように、かかるアッセイは競合結合又は核移動アッセ
イとして、制帽に基づく又は細胞のない形態で実施できる。ある実施形態では、
ＮＬＳ配列のホスホリル化に依存する蛋白質の配座の変化が、CD／ORDその他の
三次構造を決定する手段等により測光的に検出できる。

【００１６】 本発明はまた、同族ｍＲＮＡ種の転写及び／又は翻訳の抑制に使用されるＮＦ
−ＡＴｃ配列に挿補的なアンチセンスポリヌクレオチドを提供し、それにより細
胞（例えば患者のリンパ細胞）中のそれぞれのＮＦ−ＡＴｃの量を減少を行う。
このようなアンチセンスポリヌクレオチドはＴ細胞の活性化に必要なＮＦ−ＡＴ
蛋白質の形成を抑制することにより免疫調節剤として作用する。

【００１７】 本発明の変形例において、本発明のポリヌクレオチドはＴ細胞腫瘍、Ｔ細胞機
能昂進及び機能低下、その他ＮＦ−ＡＴｃポリペプチド、ＮＦ−ＡＴｃポリヌク
レオチド配列、又はＮＦ−ＡＴｃ遺伝子又は脇部領域の構造又は存在度の変化を
含む状態又は症状等の病理学的状態又は遺伝病の診断に使用される。

【００１８】 本発明はまたＮＦ−ＡＴｃに対して約１×１０⁷Ｍ^-1の親和度で結合するとと
もに、Ｔ細胞中に存在する他の蛋白質に対する高い結合親和性を欠いている抗体
を提供する。これらの抗体は、活性化Ｔ細胞の診断の標準的なアッセイにより決
定される増大した量のＮＦ−ＡＴｃ蛋白質を含有している細胞のような、患者の
細胞試料（例えばリンパ細胞又は固体組織検体）中のＴ細胞を同定する診断試薬
として使用できる。しばしば、アンチＮＦ−ＡＴｃ抗体はインサイテューでの細
胞試料の免疫組織的な染色に対する診断剤として含まれる。従って、アンチＮＦ
−ＡＴｃ抗体はＴ細胞に標識投与による治療に使用できる（例えばリポソーム／
免疫リポソームの投与）。

【００１９】 本発明はまた、患者から移植した細胞中のＮＦ−ＡＴｃｍＲＮＡの検出又は病
徴的なＮＦ−ＡＴｃ対立遺伝子の検出による（例えば、RFLP又は対立遺伝子特異
性のPCR分析による） 腫瘍又は免疫状態診断用のＮＦ−ＡＴｃポリヌクレオチド
プローブを提供する。病徴的なＮＦ−ＡＴｃ対立遺伝子は、所定の病気又は病気
を進行させる傾向と統計的に関連している対立遺伝子である。典型的には、検出
は標識（³²P, ³⁵S, ¹⁴C, ³H，蛍光剤、ビオチニル化、又はヂゴキシゲニニル化
）を付したＮＦ−ＡＴｃポリヌクレオチドポリペプチドを使用してインサイテュ
ーハイブリダイズによることができる。もっともノーザンブロット、ドットブロ
ット、又は細胞サンプルから単離したバルクＲＮＡ又はポリA⁺ ＲＮＡ上の溶液
ハイブリダイズ等も使用でき、また、ＮＦ−ＡＴｃ特異性のプライマーを使用し
ＰＣ増幅も使用できる。活性化したＴ細胞又は活性化可能なＴ細胞以外の細胞又
は細胞が谷対する標準的な対照値に対して、増大した量のＮＦ−ＡＴｃｍＲＮＡ
を含有する細胞は、それにおり活性化されたＴ細胞又は活性化可能なＴ細胞とし
て同定される。同様に、細胞試料中のＮＦ−ＡＴｃ個所又はそれに密接に結合し
た個所の病徴的な再配置又は増幅の検出は、病状又はかかる病状（例えばガン、
遺伝病）を生じる傾向の存在を同定する。

【００２０】 本発明はまた、ヒト患者のＴ細胞昂進又は低下を診断するための方法において
、診断アッセイ（例えば固定したリンパ細胞の、ヒトＮＦ−ＡＴｃに特異的に結
合する抗体による免疫組織化学的な染色）が使用されて、所定の病徴濃度のＮＦ
−ＡＴｃ蛋白質又はＮＦ−ＡＴｃｍＲＮＡがヒト患者からの生検試料に存在する
かを決定し、もしもアッセイがかかる所定の病徴濃度又はそれ以上でＮＦ−ＡＴ
ｃ蛋白質又はＮＦ−ＡＴｃｍＲＮＡの存在を示すならば、その患者はＴ細胞機能
昂進又は機能低下症状、移植拒絶反応、等を有するものと診断される。別法とし
て、Ｔ細胞機能昂進又は免疫抑制は、患者の核の及び／又は細胞質のＮＦ−ＡＴ
のレベルを決定し、次いでこのレベルを健常者のそれと比較することにより診断
される。一つの例では核の及び／又は細胞質のＮＦ−ＡＴのレベルは、Ｔ細胞ア
クチベータによる患者のリンパ細胞の培養後に決定される。健常者に比較した核
ＮＦ−ＡＴが低ければ、患者は免疫抑制されていることが示される。同様な方法
は、免疫抑制薬例えばシクロスポリンＡで処置された患者の免疫抑制状態を監視
することができる。この方法では、患者に対してより適正な量の免疫抑制剤の投
与が可能となる。 全ての公知文献及び特許出願はここに引用して本書の一部とする。

【００２１】 課題を解決するための手段 （ｉ）概要 細胞レベルにおいて、心臓は筋細胞と周囲の支持細胞（非筋細胞）とのシンシ
チウム（細胞融合体）として作用する。非筋細胞は主として繊維芽／間充織細胞
であるが、それらは又内皮及び平滑筋細胞を含む。実際、筋細胞は成人の心筋塊
のほとんどを構成しているが、それらは心臓に存在する全細胞数の３０％を構成
するに過ぎない。生体の心筋細胞との密接した関連のため、非筋細胞は筋細胞の
成長及び発達に影響を有しうる。この相互作用は細胞間接触を通じて直接に、又
はパラクリン因子の生成を通じて間接に媒介される。かかる生体内会合は非筋細
胞数とそれらが相互作用する細胞外基質の両者が心筋昂進時や傷害及び梗塞時に
増加するので重要である。これらの変化は異常な心筋機能に関連している。

【００２２】 心筋は誕生後短期に分割できない。更なる成長が個々の細胞の肥大を通じて起
きる。心筋肥大の細胞培養モデルが心筋肥大機構のより良い理解のために開発さ
れている（Simpson et al., Circ. Res., ５１： ７８７-８０１ （１９８２）
； Chien et al., FASEB J., ５： ３０３７-３０４６ （１９９１）。 培地で
の心筋のほとんどの研究は非筋細胞による汚染を最小にするように設計されてい
る（例えば Simpson and Savion, Cir. Cres., ５０： １０１-１１６ （１９８
２）； Libby, J. Mol. Cell. Cardiol., １６： ８０３-８１１ （１９８４）
； Iwaki et al., J. Biol. Chem., ２６５：１３８０９-１３８１７ （１９９
０））。 成人の心室筋細胞の肥大は長期の過負荷を導く各種の条件に対する応答である
。この応答は心筋細胞の寸法の増大、細胞分割を伴わない収縮蛋白質含量、及び
胚遺伝子（心室ナトリウム排泄昂進ペプチド（ANP）に対する遺伝子を含む）の
活性化の増加により特徴づけられる（上記Chien et al.）。成人の心筋肥大は、
個々の筋繊維に対する負荷の減少を可能にすることにより、傷害のある心機能に
対する短期応答としては初期に有益である。しかし重い長期負荷に対しては肥大
した細胞が劣化と死滅を始める（ Katz, "Heart failure," in Katz AM, ed., P
hysiology of the Heart （New York： Raven Press； １９９２） pp. ６３８-
６６８）。内皮細胞、平滑筋細胞、及び繊維芽／間充織細胞は心臓の筋細胞に密
接に接触して存在する （Nag, Cytobios., ２８： ４ １-６１ （１９８０））
。

【００２３】 本発明の一形態は、心筋その他の血管組織の所望されない成長を抑制又は阻止
する方法の一部としてインヒビターＮＦ−ＡＴ活性（特にＮＦ−ＡＴc₃ or ＮＦ
−ＡＴC₄）に対する薬剤の使用に関する。薬剤開発の目標としての蛋白質の可能
性を考慮すると、蛋白質の機能喪失が、治療投与期間中に、処置患者に対して致
命的（例えば組織の死滅又はであるかどうかを考慮しなければならない。従来、
ＮＦ−ＡＴ対立遺伝子の対する機能喪失変異体を有する形質転換動物は、ある種
のＮＦ−ＡＴ機能の抑制が致死結果を含むことを示した。同様にカルシニューリ
ンの機能喪失は致死的表現型を生じうる。しかし、本書に記載するように（例え
ば実施例２０）、ＮＦ−ＡＴｃ４やＮＦ−ＡＴｃ３の機能喪失は動物に死を招か
ないし、これらの変異体は正常心筋の病理に対して悪影響を及ぼさない。従って
、本発明者の観察によると、ＮＦ−ＡＴｃ４やＮＦ−ＡＴｃ３は薬剤開発の適当
な目標であることが示唆される。

【００２４】 本発明によると、心臓や血管組織における筋細胞及び／又は非筋細胞の成長を
抑制するなどの心臓や血管組織の抑制方法を提供する。例えば以下に述べるよう
に本発明の方法は、血管平滑筋肥大又は心臓肥大の治療の一部とするなど、心臓
肥大及び小動脈平滑筋増殖の過程を遅延するのに使用できる。例えば慢性心臓肥
大は充血性心不全及び心拍動停止の重大な病的前駆症状である。ＮＦ−ＡＴ及び
特にＮＦ−ＡＴｃ３又はＮＦ−ＡＴｃ４のアンタゴニストは充血性心不全に対す
る治療の一部として有用である。

【００２５】 さらに、ＤＮＡ認識要素に対する特異性の差異に基づいて、又各種のＮＦ−Ａ
Ｔパラローグ（擬似体）が有する蛋白質−蛋白質相互作用における差異に基づい
て、本発明は特にある種のＮＦ−ＡＴ蛋白質の活性を選択的に抑制するＮＦ−Ａ
Ｔアンタゴニストの同定と使用を意図している。好ましい実施例においては、本
発明は心臓肥大、或いはその他心臓及び血管組織の成長を、ＮＦ−ＡＴc３及び
／又は ＮＦ−ＡＴc４に対して選択である（ＮＦ−ＡＴc１ or ＮＦ−ＡＴc２に
対しては選択的でない）ＮＦ−ＡＴアンタゴニストの使用により治療又は抑制す
る方法を提供する。例えばＮＦ−ＡＴアンタゴニストは、ＮＦ−ＡＴc１又は Ｎ
Ｆ−ＡＴc２活性の抑制に対するED５O値よりも少なくとも１桁、好ましくは２、
３、４、或いは５桁少ない生体内ＮＦ−ＡＴc３又は ＮＦ−ＡＴc４活性を抑制
するED５O値を有するように選択できる。 他の実施例では、ＮＦ−ＡＴのアンタゴニストは、腫瘍の成長及び他の筋肉起
源の細胞を含む過大増殖症（例えば横紋筋腫や平滑筋腫）の抑制に使用すること
ができる。

【００２６】 （ii）定義 特に断らない限り、全ての技術用語及び化学用語は通常理解されている意味有
する。 一般に以下で使用する用語及び培養の実験手法等はこうちであり、例えば次の文
献を参照されたい。 Sambrook et al. Molecular Cloning： A Laboratory Manu
al, ２d ed. （１９８９） Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Sprin
g Harbor, N.Y.。 オリゴヌクレオチドはApplied Bio Systems社のオリゴヌクレオチド合成器と
提供された手順書を使用した。 ＰＣＲ増幅法は従来公知である（PCR Technology： Principles and Applicat
ions for DNA Amplification ed. HA Erlich, Freeman Press, New York, NY （
１９９２）； Protocols： A Guide to Methods and Applications, eds. Innis
, Gelfiand, Snisky, and White, Academic Press, San Diego, CA （１９９０
）； Mattila et al. （１９９１） Nucleic Acids Res. １９： ４９６７； Ec
kert, K.A. and Kunkel, T.A. （１９９１） PCR Methods and Applications １
： １７； PCR, eds. McPherson, Quirkes, and Taylor, IRL Press, Oxford；
and U.S. Patent ４,６８３,２０２, which are incorporated herein by refer
ence）. ここに使用した用語「例示のＮＦ−ＡＴ核酸」及び「例示のＮＦ−ＡＴ蛋白質
」は如何に記載する実施例及び次の文献Northrop et al. （１９９４） Nature
３６９：４９７； Park et a!. （１９９６） J. Biol. Chem. ２７１：２０９
１４； Luo et al. （１９９６） MCB１６：３９５５； Hoey et al.（１９９５
） Immunity ２：４６１； Masuda et al. （１９９５） Mol. Cell. Biol. １
５：２６９７； US Patent ５,７０８,１５８及び同 ５,６１２,４５５ に記載
されたそれぞれのＮＦ−ＡＴ遺伝子のヌクレオチド及びアミノ酸配列をそれぞれ
意味する。これ等の文献は特にヒトＮＦ−ＡＴ３（ヒトＮＦ−ＡＴｃ４）の配列
、ヒトＮＦ−ＡＴ４（ヒトＮＦ−ＡＴｃ３）の３つの接合（スプライス）変種の
配列を記載している。ＮＦ−ＡＴ４はＮＦ−ＡＴ４a、 ＮＦ−ＡＴ４b 及び Ｎ
Ｆ−ＡＴ４cと指定されており、コード領域のスプライス結合の位置はＮＦ−Ａ
Ｔ４ａではプロリン６９９の後、ＮＦ−ＡＴ４ｂとＮＦ−ＡＴ４ｃではバリン７
００及びプロリン７１６の後にある。これらのＮＦ−ＡＴ蛋白質のＲｅｌ領域の
整列はある領域が特に良く保存されることを示す。特に次のアミノ酸配列は全て
のＮＦ−ＡＴポリペプチドのＲＥＬ領域に見いだされる。アミノ酸配列HHRAHYET
EGSRGAVKA （配列番号 ）、アミノ酸配列PHAFYQVHRITGK（配列番号 ）、アミ
ノ酸配列DIELRXGETDIGRKNTRVRLVFRVHX１P （配列番号 ）、 及び配列番号PX２
ECSQRSAX３ELP （配列番号 ）。ここにＸ１、Ｘ２はバリン又はイソロイシン
のような疎水性基であり、Ｘ３は任意の残基（好ましくはグルタミン又はヒスチ
ジン）である。

【００２７】 例示のヒトＮＦ−ＡＴ核酸及びポリペプチドのGenBankアクセス番号は次の表
に示す。

【表１】 NF-AT GenBank No. NF-ATc１ NF-Atc Ｕ０８０１５ NF-ATc.b Ｕ５９７３６ NF-ATc２ NF-AT１ Ｉ３８１５２ NF-ATp１ Ｕ４３３４１ isoform B Ｕ４３３４２ isoform C NF-ATc３ NF-AT４a Ｉ３８１５５ NF-AT４b Ｉ３８１５６ NF-AT４c Ｌ４１０６７ NF-ATc４ NF-AT３ Ｌ４１０６６ Ｉ３８１５４ NF-Atx Ｕ１４５１０ NF-ATx２ Ｕ８５４２８ NF-ATx３ Ｕ８５４２９ NF-ATx４ Ｕ８５４３０ NF-ATc２は又NFIL２E及びNFII-aとも呼ばれる。

【００２８】 ＮＦ−ＡＴ遺伝子及びその産生物はGenBankにあり、特にアクセス番号Ｉ８０
８３６、Ｕ３６５７６、Ｕ３６５７５、Ｉ６０７２２、Ｕ０２０７９、ＡＦ０４
９６０６、ＡＦ０８７４３４、ＰＲＦ３０ locus ２０１３３４３Ａ、ＰＩＲ lo
cus Ｓ４５２６２及びＡ４８７５３である。

【００２９】 「処置」の語は治療及び予防処置を指し、目的は肥大を抑制し或いは遅延（軽
減）することである。処置の必要性がある者には、既に疾患を有する者及びその
性向を有する者、及び疾患の阻止が必要な者が含まれる。肥大は、先天性、ウイ
ルス性又は突発性の、或いは筋肥大、心筋梗塞のような虚血又は虚血性傷害を含
む任意の原因によるものを含む。典型的には処置は特に虚血等の心臓損傷後に肥
大の進行を停止させ或いは減速させるために行われる。好ましくは、心筋傷害の
処置には薬剤を係る心筋傷害の直後に投与して肥大を防ぐか又は軽減する。

【００３０】 用語「心不全」は心臓が血液を組織代謝を満足させるに必要な速度で血液を輸
送しない心機能の以上を意味する。心不全には充血性心不全、心筋梗塞、頻脈性
不整脈、家族性肥大心筋疾患、虚血性心臓病、突発性膨張心筋疾患、及び心筋炎
が含まれる。心不全は多数の因子が原因となるもので、例えば虚血性、先天性、
リューマチ性、又は突発性の原因がある。慢性心肥大は充血性心不全或いは心拍
動停止の前駆症状である実質的な病気状態である。さらに具体的に言うと、処置
又は処置するとは、阻止、軽減又は抑制を指す。この点に関して本発明の方法は
処置の一部として（但しこれに限らないが）（１）α１アドレナリンアゴニスト
及び／又はエンドセリン（血管収縮ペプチド）により什器される心室筋細胞肥大
、（２）心肥大を促進する副作用を有する薬剤により誘起される心室筋細胞肥大
、（３）例えば心室筋細胞の肥大が媒介する心不全等の症状、および（４）ウイ
ルス性心筋疾患、長期の高血圧、病理的刺激による心臓疾患、及びポスト心筋梗
塞等により媒介される心室筋細胞肥大の処置に適用できる。 「長期（chronic）」投与とは急性モードとは異なり連続して薬剤を投与し、
長期にわたり初期の肥満抑制効果を維持することである。

【００３１】 「ＮＦ−ＡＴアンタゴニスト」とはＮＦ−ＡＴ依存性の転写を遮断又は阻止す
る任意の分子を指す。このようなアンタゴニストはかかる効果を色々な形で達成
する。例えばアンタゴニストの一つのクラスは充分な親和性と特異性をもってＮ
Ｆ−ＡＴ蛋白質に結合し、ＮＦ−ＡＴの、ＡＰ１のようなＤＮＡまたは蛋白質因
子中の同族応答要素との相互作用を抑制する。他のアンタゴニストのクラスはＮ
Ｆ−ＡＴに結合し、そしてＮＬＳ部位のホスホリル化を阻止したり、ホスホリル
化から生じる配座変化を阻止したりすることなどにより、その核移行を抑制する
。さらに他のアンタゴニストのクラスは、ＧＳＫ−３又はＰＫＡのようなキナー
ゼが、ＮＦ−ＡＴ蛋白質のＮＬＳ部位をホスホリル化するのを抑制することによ
り、ＮＦ−ＡＴ活性を阻止することができる。他のアンタゴニストのクラスはこ
のに記載され或いは当業者には明らかであろう。

【００３２】 「心室筋細胞肥大」とは個々の心室筋細胞における寸法の増加により特徴づけ
られる状態を指し、細胞寸法の増大は患者の診療的な診断を結果するに充分であ
り、或いは細胞が大きい（例えば非肥大細胞の２倍以上）と決定するに充分であ
る。これにはそれぞれの心筋細胞内の収縮蛋白質の蓄積と胚遺伝子発現の活性化
を伴い得る。

【００３３】 心室筋細胞肥大の「抑制」とは、肥大状体に関して肥大を表示するパラメータ
の一つが減少すること、又は正常状態に対して相対的に肥大を示すパラメータの
一つの増大が阻止されることを指す。好ましくは心室筋細胞肥大の抑制は肥大状
態で観察される細胞に対して相対的に１０％以上の肥大細胞寸法の減少である。
より好ましくは肥大の抑制は細胞寸法の５０％以上の減少である。フェニルフリ
ンが指示剤として使用される場合の肥大評価アッセイに対して、これらの減少は
肥大評点約６．５以下、５．０〜５．５及び４．５〜５．０にそれぞれ関連づけ
られる。異なった指示剤が使用される場合には、抑制は誘起剤の存在下に測定さ
れる最大細胞寸法（肥大評点）に対して相対的に測定される。

【００３４】 「心室筋細胞肥大の阻止」は完全に肥大を誘起するに充分な濃度の誘起剤の存
在下に、正常細胞に対して相対的に細胞寸法の増加を阻止することにより決定さ
れる。例えば肥大の阻止は最大刺激濃度の誘起剤の存在下に、非誘起細胞よりも
２００％以下までの細胞寸法の増大を意味する。より好ましくは肥大の阻止は非
誘起細胞よりも１３５％以下までの細胞寸法の増大を意味し、さらに好ましくは
非誘起細胞よりも９０％以下までの細胞寸法の増大を意味する。フェニルエフリ
ンが誘起剤として使用される場合の肥大評点アッセイに関しては、最大刺激濃度
のフェニルエフリンの存在下に肥大の阻止は、肥大評点でそれぞれ約６.０-６.
５、 ５.０-５.５、及び ４.０-４.５である。 ＮＦ−ＡＴ治療剤例えばアンタゴニストの「有効量」又は「薬剤的有効量」と
は、所望の生理学的効果、例えば心室筋細胞肥大の抑制を得るに充分なＮＦ−Ａ
Ｔ治療剤を意味する。ＮＦ−ＡＴ治療剤の有効量は、当業者が適正投与量を決定
するのに通常考慮する、患者の年齢、性別、体重等、処置条件、及び処置される
症状の重度等の因子に基づいてケース毎に処置をする者により決定される。

【００３５】 ここで使用される２０個の在来のアミノ酸及びそれらの略号は従来の用法を用
いる（Immunology - A Synthesis, ２nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren,
Eds., Smauer Associates, Sunderland, Massachusetts （１９９１）。これら
２０個の在来のアミノ酸の立体異性体（例 D-アミノ酸）、α，α二置換アミノ
酸、Ｎアルキルアミノ酸、乳酸、その他の合成アミノ酸も本発明のポリペプチド
のための適当な成分であり得る。合成アミノ酸の例には、４−ヒドロキシプロリ
ン、γ−グルタミン酸カルボキシル、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎトリメチルリジン、ε−Ｎ
−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチ
オニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキジリジン、ω−Ｎ−メチルアルギ
ニン、その他の同様なアミノ酸、及びイミノ酸（４−ヒドロキシプロリン等）が
ある。本書のポリペプチドの表記では左がアミノ末端方向であり、右がカルボキ
シ末端方向である。単一鎖ポリヌクレオチド配列の左端は５’末端であり、二重
鎖ポリペプチド配列の左端方向は５’方向である。発生期のＲＮＡ転写の５’か
ら３’付加の方向は転写方向と称される。ＲＮＡと同一の配列を有するＤＮＡ鎖
の配列領域であって、ＲＮＡ転写の５’から５’端である領域は上流配列と称さ
れ、ＲＮＡと同一の配列を有するＤＮＡ鎖上の領域であって、ＲＮＡ転写の３’
から３’端の領域は下流領域と呼ばれる。

【００３６】 「天然に産する」の語が物に対して使用されるときはその物が自然に存在する
物であることを示す。例えば天然源から単離でき人工的に改変されていない有機
体（ウイルスを含む）に存在するポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は天然
に産する。

【００３７】 「に相当する」の語は、ポリヌクレオチド配列が参照ポリヌクレオチド配列の
全て又は一部に対して相同（すなわち同一。厳密に進化的に関連していることを
意味しない）であること、又はポリペプチド配列が参照ポリペプチド配列と同一
であることを意味する。これに対して、「に相補的である」の語は相補配列が参
照ポリヌクレオチド配列の全て又配列の前部又は一部に対して相同であることを
意味する。例えばヌクレオチド配列TATACは基準配列TATACに相当しており、基準
配列GTATAに相補的である。

【００３８】 次の用語は２以上のポリヌクレオチドの間の配列関係を記述するために使用さ
れる。「基準配列」、「比較ウインドー」、「配列同一性」、「配列同一性の百
分率」、及び「実質的同一性」。「基準配列」は配列の比較の基準として使用さ
れる配列である。基準配列は例えば全長ｃＤＮＡのセグメントのような長い配列
のサブセットであっても良いし、図１のポリヌクレオチド配列のような配列リス
ト中に与えられた遺伝子配列でも良いし、ｃＤＮＡや遺伝子配列を含んでいて良
い。一般に少なくとも２０個のヌクレオチド長を有し、しばしば少なくとも２５
個のヌクレオチド長を有し、しばしば、少なくとも５０個のヌクレオチド長を有
する。２つのポリヌクレオチドは各々（１）２つのポリヌクレオチドの間で類似
している配列（すなわち完全なポリヌクレオチド配列の一部）を含み、そして（
２）さらに２つのポリヌクレオチド間で異なった配列を含むので、２つ以上のポ
リヌクレオチドの配列の比較は典型的には比較ウインドーで２つのポリヌクレオ
チド間の比較を行って、配列類似性を持つ局所領域の確定と比較をおこなう。「
比較ウインドー」は、ポリヌクレオチド配列が少なくとも２０個の隣接した基準
ヌクレオチドと比較でき、２つの配列の最適な整列のために比較ウインドー内の
ポリヌクレオチド配列の部分が基準配列（付加や欠失を含まないもの）に比して
２０％以下の付加又は欠失（ギャップ）を含みうるような少なくとも２０個の隣
接したヌクレオチド位置のセグメントを指す。比較ウインドーを整列するための
配列の最適の整列は、局所相同アルゴリズム（Smith and Waterman （１９８１
） Adv.１９，App. Math. ２： ４８２）、相同整列アルゴリズム（Needleman a
nd Wunsch （１９７０） LMol. Biol. ４８： ４４３）、 類似性検索法（Pears
on and Lipman （１９８８） Proc. Nati. Acad. Sci. （U.S.A.） ８５： ２４
４４）、これらの電算機による実行（GAP,BESIFIT, FASTA及びTFASTA 。Wiscons
in Genetics Software Package Release ７.０, ５ Genetics Computer Group,
５７５ Science Dr., Madison, WI）、又は各種の方法により開発された検査と
最良整列（すなわち、比較ウインドーで最高の相同率を得るような方法）から選
択できる。「配列同一性」とは比較ウインドーで２つのポリヌクレオチド配列が
同一である（ヌクレオチド毎に比較して同一）ことを意味する。「配列同一性の
百分率」とは比較ウインドーにおいて２つの最適に整列したポリヌクレオチド配
列を比較し、同一核酸塩基（例えばA, T, C, G, U,又はI）が両配列中に生じる
位置の数を決定し、この一致数を比較ウインドー内の前位置の数で割り、それに
１００を掛けることにより算出される。「実質的同一性」とはポリヌクレオチド
が、少なくとも２０個のポリヌクレオチド位置、しばしば少なくとも２５−５０
個のポリヌクレオチドの比較ウインドーで、基準配列に対して、少なくとも８５
％の配列同一性を有し、好ましくは少なくとも９０−９５％の配列同一性を有し
、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有することを意味する。こ
こに配列同一性の百分率は基準配列を、比較ウインドーで基準配列の２０％以下
の付加又は欠失を含みうるポリヌクレオチド配列と比較することにより計算され
る。基準配列は例えば図１に示した全長ヒトＮＦ−ＡＴｃポリヌクレオチド配列
、全長マウス又はウシＮＦ−ＡＴｃｃＤＮＡ配列のセグメントとして、大きい配
列のサブセットであり得る。

【００３９】 ポリペプチドに適用する場合、アミノ酸配列の同一性の度合いは２つのアミノ
酸配列に共通の位置の同一アミノ酸の数の関数である。アミノ酸配列の相同性又
は類似性の度合いは、２つのアミノ酸配列に共通の位置に構造的に関連したアミ
ノ酸の数の関数である。「関連のない」又は「非相同」配列は本発明のＮＦ−Ａ
Ｔｃ配列の一つと４０％以下の同一性を有し、好ましくは２０％以下の同一性を
有する。「実質的同一性」とは、２つのペプチド配列が、例えばデフォルトギャ
ップ重みを使用するプログラムGAP又はBESTFITによるなどで最適整列したとき、
少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、よ
り好ましくは少なくとも９５％（例えば９９％以上）の配列同一性を有すること
である。好ましくは同一でない残基位置は保存的アミノ酸置換だけ相違する。保
存的アミノ酸置換とは類似の側鎖を有する残基の交換可能性を意味する。例えば
脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、
及びイソロイシンである。脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群はセリ
ン及びトレオニンである。アミドを含有する側鎖を有するアミノ酸の群はアスパ
ラギン、及びグルタミンである。芳香族側鎖を有するアミノ酸の群はフェニルア
ラニン、チロシン、及びトリプトファンである。塩基性側鎖を有するアミノ酸の
群はリジン、アルギニン、及びヒスチジンである。イオウを含有する側鎖を有す
るアミノ酸の群はシステイン及びメチオニンである。好ましい保存性のアミノ酸
置換基はバリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジ
ン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンである。

【００４０】 用語「ＮＦ−ＡＴｃ天然蛋白質」及び「全長ＮＦ−ＡＴｃ蛋白質」は、図１に
示した導出アミノ酸配列に相当するか、又は同族全長ｃＤＮＡの導出アミノ酸配
列に相当する天然に産するＮＦ−ＡＴｃポリペプチドを指す。例えばＮＦ−ＡＴ
ｃ遺伝子を発現する天然のリンパ細胞中に存在するＮＦ−ＡＴｃ天然蛋白質は全
長ＮＦ−ＡＴｃ蛋白質と考えられる。

【００４１】 用語「ＮＦ−ＡＴｃ断片」とは、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端が欠け
ているが、残りのアミノ酸配列が全長ｃＤＮＡ配列（例えば図１のｃＤＮＡ）か
ら導出したＮＦ−ＡＴｃ配列中の相当した位置が同一であるようなポリペプチド
を指す。ＮＦ−ＡＴｃ断片は典型的には少なくとも１４アミノ酸の長さを有し、
好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸長、通常は少なくとも５０個以上ののア
ミノ酸長を有する。

【００４２】 用語「ＮＦ−ＡＴｃ類似体」は、図１の導出されたアミノ酸配列の一部に実質
同一である少なくとも２５個のアミノ酸のセグメントよりなるポリペプチドであ
って、次の特性の少なくとも一つを有するものをいう。（１）（ａ）他のＮＦ−
ＡＴ蛋白質（たとえばＡＰ−１）、（ｂ）ＧＳＫ−３及びＰＫＡのようなキナー
ゼ、（ｃ）カルシニューリンのようなホスホターゼ、（ｄ）ＮＬＳ, SRR, SP１,
SP２, 及び／又はSP３のようなＮＦ−ＡＴポリペプチド特にその一部を含む他
のポリペプチドに適当な条件下に結合する。（２）核酸に結合する。（３）Ｔ細
胞活性化で核への移行の能力を有する。及び（４）刺激信号の終了後に核から細
胞質に移動する能力を有する。典型的にはＮＦ−ＡＴｃ類似体は天然配列に関し
て保存性アミノ酸置換（又は付加又は欠失）を含む。ＮＦ−ＡＴｃ類似体は典型
的には少なくとも２０個、好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸長、最も普通
には全長天然産のＮＦ−ＡＴｃ（例えば図１に示されたもの）と同等の長さを有
する。ある種のＮＦ−ＡＴｃ類似体は生活性を欠くが、抗体をＮＦ−ＡＴｃエピ
トープに上げたり、αＮＦ−ＡＴｃ抗体を親和クロマトグラフにより検出及び／
又は精製したり、或いは競合又は非競合アゴニスト、アンタゴニスト、又は天然
ＮＦ−ＡＴｃ蛋白質機能の部分的なアゴニストとして使用することができる。

【００４３】 「ＮＦ−ＡＴｃポリペプチド」はＮＦ−ＡＴポリペプチドと同義であり、ＮＦ
−ＡＴｃポリペプチド属の天然蛋白質、断片又は類似体を意味する一般語である
。したがって、天然ＮＦ−ＡＴｃ、ＮＦ−ＡＴｃの断片、ＮＦ−ＡＴｃの類似体
はＮＦ−ＡＴｃポリペプチド属である。好ましいＮＦ−ＡＴｃポリペプチドには
、図１のヒト全長ＮＦ−ＡＴｃ蛋白質（ＮＦ−ＡＴｃ１とも呼ばれる）、又は実
質的に表ＩＩに示された配列よりなるポリペプチドを含む。従ってＮＦ−ＡＴｃ
属は、同定されているものはもちろん、同定されていないもの、及び例えば低緊
縮ハイブリダイゼーションにより同定できる全てのＮＦ−ＡＴｃポリペプチドを
含む。ＮＦ−ＡＴｃ１とも呼ばれる配列番号３８を有するＮＦ−ＡＴｃ、及び他
の族の相同体に加えて、ＮＦ−ＡＴｃ属はＮＦ−ＡＴｃ２（ＮＦ−ＡＴｐとも言
う）、ＮＦ−ＡＴｃ３（ＮＦ−ＡＴ４又は ＮＦ−ＡＴxとも言う）、ＮＦ−ＡＴ
ｃ４（ＮＦ−ＡＴ３とも言う）、及びそれらのスプライス変種を含む。

【００４４】 「同族」とは、族間で発生的及び機能的に関連している遺伝子配列を指す。例
えば限定のつもりはないが、ヒトゲノムでは、ヒトＣＤ４遺伝子がマウスＣＤ４
遺伝子都道族である。なぜなら、これら２つの遺伝子の配列と構造は、それらが
高度に相同であり、いずれもＭＨＣクラスII制限抗原認識を通じてＴ細胞活性化
シグナルを出すように作用する蛋白質をコードするからである。かくして、ヒト
ＮＦ−ＡＴｃ遺伝子に対する同族マウス遺伝子は、ヒトＮＦ−ＡＴｃ蛋白質に対
して最大の配列同一性を有する発現された蛋白質をコードするとともに、ヒトＮ
Ｆ−ＡＴｃ（例えばＴリネージ細胞）のそれに類似の発現パターンを示すマウス
遺伝子である。好ましいＮＦ−ＡＴｃ遺伝子同族体は、ラットＮＦ−ＡＴｃ、ラ
ビットＮＦ−ＡＴｃ、イヌＮＦ−ＡＴｃ、非ヒト霊長類ＮＦ−ＡＴｃ、ブタＮＦ
−ＡＴｃ、ウシＮＦ−ＡＴｃ、及びハムスターＮＦ−ＡＴｃである。

【００４５】 「ＮＦ−ＡＴｃ依存性遺伝子」は次の遺伝子を言う。すなわち、（１）ＮＦ−
ＡＴ結合部位（適当な結合条件下にＮＦ−ＡＴにより特異的にフットプリントさ
れうる部位）を当該遺伝子の第１コード配列の約１０キロ塩基内に有し、（２）
当該遺伝子に対するマイナー又はメジャー転写開始部位からの、増大した又は減
少した転写速度を表す（この転写速度の変更は、活性化されたＴ細胞におけるよ
うな、ＮＦ−ＡＴ複合体の存在に関連付けられる）遺伝子を言う。

【００４６】 「変更された調節能力」は例えば遺伝子の転写等の生活性を向上又は抑制する
能力を指す。このような向上又は抑制はＴ細胞刺激のような特定のイベントの発
生に付随して起こりうる。例えば、変更は通常はＴ細胞刺激に続いて起きるＩＬ
−２遺伝子の転写向上の抑制として現れうる。転写の向上又は抑制を調節する変
更された調節能力は、例えばIL-２遺伝子におけるような遺伝子の誘導可能な転
写に影響を与えることができ、或いは遺伝子の基本レベルの転写に影響すること
ができ、或いは両者である。

【００４７】 「剤」とは化合物、化合物の混合物、生物巨大分子、又はバクテリア、植物、
菌類、又は動物（特にヒト）細胞（特にヒト）又は組織等からの抽出物を指す。
剤は以下に述べるスクリーニングアッセイにおいて封入による免疫調節剤（例え
ば免疫抑制剤）としての潜在的な活性に対して評価される。

【００４８】 「候補免疫調節剤」とは本発明の一つ以上のスクリーニング法で推定免疫調節
剤として同定される剤のことを指す。ある候補免疫調節剤はヒト用の薬剤として
潜在的に値旅行かを有しうる。

【００４９】 「標識」又は「標識された」の語は、放射線標識アミノ酸をビオチニル部分の
ポリペプチドへ合体又は付着することにより、標識されたアビジン（例えば蛍光
マーカー又は酵素活性を有し、後に光学的方法又は色測定法により検出できるス
トレプトアビジン）により検出されうるようにすることである。ポリペプチド及
び糖蛋白質を標識する各種の公知の方法が使用できる。ポリペプチドの標識には
、限定するつもりはないが、次のものがある。放射線同位体（ ³Ｈ、¹⁴Ｃ、³⁵Ｓ
、¹²⁵Ｉ，¹³¹Ｉなど）、蛍光標識（FITC、ロダミン、ランタニド蛍光体など）、
酵素標識（生姜ペロキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカ
リ性ホスホターゼなど）、ビオチニル基、二次レポータにより認識される所定の
ポリペプチドエピトープ（ロイシンジッパー対配列、二次区タイに対する結合部
位、金属結合領域、エピトープタッグなど）がある。ある場合には標識は各種の
長さのスペーサアームにより付着されて潜在的な立体障害を減じる。 「実質的に純粋な」とは対象種が存在する支配的な種であること（すなわちモ
ル基準で、それは組成中の他のいかなる種よりも多量に存在すること）、好まし
くは、目的種が存在する全ての巨大分子種の少なくとも約５０％（モル基準で）
を占めているような実質的に純粋な分画が組成物であることを指す。一般に、実
質的に純粋な組成物は、そこに存在する巨大分子の約８０〜９％を含むであろう
。より好ましくは組成物が単一巨大分子種の二から実質的に構成されるように、
目的種が実質的に同質になるまでに精製されたもの（補選手が通常の検出法では
検出できない）である。

【００５０】 「病徴的濃度」、「病徴的量」及び「病徴的染色パターン」の語は試料中のＮ
Ｆ−ＡＴｃ蛋白質又はｍＲＡの濃度、量、及び移行パターンを指し、移植拒絶の
ような病気を発達させる機能昂進又は機能低下Ｔ細胞条件又は性向の存在を指示
する。病徴的量は見込みによる及び／又は遡及的な統計臨床研究により決定され
る通常の診療値の範囲を外れる細胞又は細胞試料中のＮＦ−ＡＴｃ蛋白質又はＮ
Ｆ−ＡＴｃｍＲＮＡの量である。一般に、新生病（例えばリンパ細胞白血病）又
はＴ細胞媒介免疫反応を有する患者は、病気がない健常者を特徴づける濃度範囲
よりも高い細胞又は組織中ＮＦ−ＡＴｃ蛋白質又はｍＲＮＡ量を示すであろう。
典型的には病徴的濃度は平均正常値の上少なくとも約１の標準偏差を有し、もっ
と通常では平均正常値の上少なくとも２の標準偏差を有する。しかし、実質的に
全ての臨床試験はある率の誤った陽性及び陰性を示す。診断アッセイの感度と選
択性は診断目的と関連した調節要件をを満足するに充分でなければならない。一
般に本発明の診断法は個人が病気の候補者であるかどうかを同定し、有能な保険
専門医によりなされる病気の異なった診断に追加のパラメータを提供するもので
ある。

【００５１】 （iii）実施例 Ａ．ＮＦ−ＡＴｃポリヌクレオチド ＮＦ−ＡＴｃをコードするゲノム又はｃＤＮＡは図１に示したヌクレオチド配
列又は他の例示のＮＦ−ＡＴ配列及び従来のハイブリダイゼーションスクリーニ
ング法（例えばBenton WD and Davis RW （１９７７） Science １９６： １８
０； Goodspeed et al. （１９８９） Gene ７６： １； Dunn et al. （１９８
９） J. Biol. Chem. ２６４： １３０５７） に基づいて設計されたハイブリダ
イゼーションプローブを使用しクローンライブラリー（例えば入手先Clontech,
Palo Alto, CA）から単離できる。ｃＤＮＡクローンが望まれる場合には、ヒト
ｍＲＮＡに由来するｃＲＮＡを含むクローンライブラリーが好ましい。別法とし
て、図１に示した配列の全て又は一部に相当する合成ポリヌクレオチド配列また
は他のＮＦ−ＡＴ配列は、オリゴヌクレオチドの化学合成により構成できる。さ
らに、ＮＦ−ＡＴ遺伝子の配列に基づくプライマーを使用したポリメラーゼ反応
（ＰＣＲ）を使用してゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡプール、又はｃＤＮＡクローンラ
イブラリからのＤＮＡ断片を増幅することができる。米国特許第４,６８３,１９
５及び同４,６８３,２０２はＰＣＲ法を記載している。さらに、例えば図１に記
載した配列データに基づく一つのプライマー及びそこに記載されていない第２の
プライマーを使用するＰＣＲ法も使用できる。例えばポリアデニル化セグメント
に相同であるか又は相補的である第２のプライマーが使用できる。ある例では、
図１の２７４２個のヌクレオチド長を含むポリヌクレオチドが遺伝子コードの縮
退を使用して当業者により容易に構成できる。図１のＮＦ−ＡＴｃ配列の核酸４
１８−７１０をコードするポリヌクレオチド配列もまた当業者には構成できる。

【００５２】 ヌクレオチドの置換、欠失及び付加を本発明のポリヌクレオチドに導入できる
ことは明らかである。ヌクレオチド配列の変形は各種のＮＦ−ＡＴｃ対立遺伝子
、小さな配列誤差等の配列多様形から生じる。しかし、このような置換、欠失及
び付加はポリヌクレオチド配列が、特異的なハイブリダイゼーションを生じるに
充分な緊縮条件下に、図１に示したポリヌクレオチド配列の一つにハイブリダイ
ズする能力を実質的に喪失させるべきでない。

【００５３】 特異的ハイブリダイゼーションはプローブポリヌクレオチド配列（例えば置換
、欠失、又は付加を含みうる本発明のポリヌクレオチド）と、特異的標的ポリヌ
クレオチド（例えば図１の配列を有するポリヌクレオチド又は他の例示の配列）
の間の交雑の形成を指す。ここにプローブは、例えばＮＦ−ＡＴｃｍＲＮＡに相
当する単一バンド（又はＮＦ−ＡＴｃ遺伝子の複数の他のスプライス生成物に対
応する複数のバンド）が適当な細胞源（例えばＮＦ−ＡＴｃを発現するＴ細胞）
からの調製されたＲＮＡのノーザンプロット上で同定できるように、特異的標的
に対して優先的にハイブリダイズするものである。本発明のポリヌクレオチド及
び組み換え形成されたＮＦ−ＡＴｃ、その断片、及び類似体は、図１に与えられ
た配列を元にして、又は他の例示のＮＦ−ＡＴ配列を元にして、公知の方法、例
えば文献（Maniatis et al., Molecular Cloning： A Laboratory Manual, ２nd
Ed., （１９８９）, Cold Spring Harbor, N.Y. and Berger and Kimmel, Meth
ods in Enzvmologv. Volume １５２., Guide to Molecular Cloning Techniques
（１９８７）, Academic Press, Inc., San Diego, CA）に記載された方法によ
り調製できる。

【００５４】 ＮＦ−ＡＴｃポリヌクレオチドはハイブリダイゼーションプローブやＰＣＲ（
又はＬＣＲ）プライマーとして使用するなどの短いオリゴヌクレオチド（例えば
２５−１００塩基長）であり得る。ＮＦ−ＡＴｃポリヌクレオチド配列は又長い
ポリヌクレオチドの一部を含み得るし（例えばＮＦ−ＡＴｃクローンを含むクロ
ーニングベクタ）また融合蛋白質の発現をコードするために、異なった蛋白質（
例えばグルタチオンＳ−トランスファーゼ又はβガラクトシダーゼ）をコードす
る他のポリヌクレオチド配列と、ポリヌクレオチド結合により、フレーム内で融
合しうる。典型的にはＮＦ−ＡＴｃポリヌクレオチドは天然に産するＮＦ−ＡＴ
ｃポリヌクレオチド配列（例えば図１の、または他の例示のＮＦ−ＡＴｃ配列）
と実質的に同一である少なくとも２５個の連続したヌクレオチドを含む。より一
般にはＮＦ−ＡＴｃポリヌクレオチドは天然に産するＮＦ−ＡＴｃポリヌクレオ
チド配列と実質的に同一である少なくとも５０−１００個の連続したヌクレオチ
ドを含む。しかし、当業者にはＮＦ−ＡＴｃ標的配列への特異的ハイブリダイゼ
ーションに要するＮＦ−ＡＴｃポリヌクレオチドの最小長さが数種の因子、Ｇ／
Ｃ量、不整合塩基（あるとして）の位置、標的ポリヌクレオチドの集団に比した
その配列の単一性の程度、及びポリヌクレオチドの化学的性質（例えばメチルホ
スホネートのバックボーン、ホスホロチオレート等）に依存する。

【００５５】 例えば、限定するつもりはないが、試料中のＮＦ−ＡＴｃｍＲＮＡの存在を検
出し或いは定量するための適当なハイブリダイゼーションプローブは、一般に下
記の表Ｉに示した１つ、好ましくは２つ、さらに好ましくは全てのヒトＮＦ−Ａ
Ｔｃ配列、または他の相補体を含みうる。

【００５６】

【表２】 表Ｉ 選択されたヒトＮＦ−ＡＴｃポリヌクレオチド配列 ５'-TTC CTC CGG GGC GCG CGG CGT GAG CCC GGG GCG AGG-３'（配列番号：１）
； ５'-CAG CGC GGG GCG GCC ACT TCT CCT GTG CCT CCG CCC GCT GCT-３'（配列番
号：２）； ５'-GCC GCG CGG ATG CCA AGC ACC AGC TT'T CCA GTC CCT TCC AAG-３'（配列番
号：３）； ５'-CCA ACG TCA GCC CCG CCC TGC CGC TCC CCA CGG CGC ACT CCA-３'（配列番
号：４）； ５'-TTC AGA CCT CCA CAC CGG GCA TCA TCC CGC CGG CGG-３'（配列番号：５）
； ５'-GCC ACA CCA GGC CTG ATG GGG CCC CTG CCC TGG AGA GTC CTC-３'（配列番
号：６）； ５'-AGT CTG CCC AGC CTG GAG GCC TAC AGA GAC CCC TCG TGC CTG３'（配列番号
：７）； ５'-GTG TCT CCC AAG ACC ACG GAC CCC GAG GAG GGC TTT CCC-３'（配列番号：
８）； ５'-AGC TGG CTG GGT GCC CGC TCC TCC AGA CCC GCG TCC CCT TGC-３'（配列番
号：９）； ５'-TAC AGC CTC AAC GGC COG CAG CCG CCC TAC TCA CCC CAC CAC-３'（配列番
号：１０）； ５'-GAC CAC CGA CAG CAG CCT GGA CCT GGG AGA TGG CGT CCC TGT-３'（配列番
号：１１）； ５'-CCT GGG CAG CCC CCC GCC CCC GGC CGA CTT CGC GCC CGA AGA-３'（配列番
号：１２）； ５'-GCT CCC CTA CCA GTG GCG AAG CCC AAG CCC CTG TCC CCT ACG-３'（配列番
号：１３）； ５'-CTT CGG ATT GAG GTG CAG CCC AAG TCC CAC CAC CGA GCC CAC-３'（配列番
号：１４）； ５'-CAT GGC TAC TTG GAG AAT GAG CCG CTG ATG CTG CAG CTT TTC-３'（配列番
号：１５）； ５'-AAG ACC GTG TCC ACC ACC AGC CAC GAG GCT ATC CTC TCC AAC-３'（配列番
号：１６）； ５'-TCA GCT CAG GAG CTG CCT CTG GTG GAG AAG CAG AGC ACG GAC-３'（配列番
号：１７）； ５'-AAC GCC ATC TTT CTA ACC GTA AGC CGT GAA CAT GAG CGC G-３'（配列番号
：１８）； ５'-AGA AAC GAC GTC GCC GTA AAG CAG CGT GGC GTG TOG CA-３'（配列番号：１
９）； ５'-GCA TAC TCA GAT AGT CAC GGT TAT TTF GCT TCT TGC GAA TG-３'（配列番号
：２０）.

【００５７】 又例えば次のＰＣＲプライマー（アンプリマー）対はヒト又はマウスＮＦ−Ａ
Ｔｃ配列（例えばＮＦ−ＡＴｃ４細胞からのＲＮＡの逆転写酵素始動ＰＣＲによ
るなど）を増幅するのに使用できる。 （順） ５'-AGGGCGCGGGCACCGGGGCGCGGGCAGGGCTCGGAG-３'（配列番号：２１） （逆） ５'-GCAAGAAGCAAAATAACCGTGACTATCTGAGTATGC-３'（配列番号：２２）

【００５８】 所望により、実質的に全長のｃＤＮＡを増幅するためのＰＣＲアンプリマーは
実務者の裁量により選択できる。同様に単一ＮＦ−ＡＴｃエキソン又はＮＦ−Ａ
Ｔｃ遺伝子（ヒト又はマウス）の部分を増幅するためのアンプリマーも選択でき
る。

【００５９】 これらの配列の各々はＮＦ−ＡＴｃｍＲＮＡの存在を検出して、例えばリンパ
細胞中の増大したＮＦ−ＡＴｃｍＲＮＡレベルの存在により特徴づけられる病気
の診断に使用したり、組織タイピング（すなわちＮＦ−ＡＴｃｍＲＮＡの発現に
より特徴づけられる細胞を同定する）したりするためのハイブリダイゼーション
プローブ又はＰＣＲアンプリマーとして使用できる。配列は又、例えば法医学Ｄ
ＮＡ分析（例えばＲＦＬＰ分析、ＰＣＲ長分布等）のための、又はＮＦ−ＡＴｃ
遺伝子の増幅及び／又は再配列により特徴づけられる病気の診断のための、ＤＮ
Ａ試料中のゲノムＮＦ−ＡＴｃ遺伝子配列の決定に使用できる。

【００６０】 図１に示したヒトＮＦ−ＡＴｃに対する全コーディング配列の開示は、ＮＦ−
ＡＴｃ、その断片、又はその類似体の発現を指令することができる単離したポリ
ヌクレオチドの構成を可能にする。さらに、図１の配列はＮＦ−ＡＴｃをコード
するＲＮＡ及びＤＮＡを検出するのに使用できる核酸ハイブリダイゼーションプ
ローブ及びＰＣＲプライマーを構成することができる。

【００６１】 本発明のＮＦ−ＡＴｃポリヌクレオチドは全長ＮＦ−ＡＴポリヌクレオチド又
はその部分を含む。一つの例では、ＮＦ−ＡＴポリヌクレオチドは、図１に示し
たヌクレオチド配列、又は配列番号４５、又は他の例示のＮＦ−ＡＴ配列、又は
その一部と、少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、
９５％、さらに好ましくは約９８％以上、最も好ましくは少なくとも約９９％同
一である。従って、本発明はここにＮＦ−ＡＴｃ１として参照される配列番号３
８を有するＮＦ−ＡＴｃ以外のＮＦ−ＡＴｃ族メンバーをコードするポリヌクレ
オチドを含む。かかる族メンバーにはＮＦ−ＡＴｃ２（GenBank １３８ １５２,
U４３３４１, U４３３４２；別名ＮＦ−ＡＴp）, ＮＦ−ＡＴc３ （GenBank L
４１０６７, １３８１５５, １３８１５６； 別名ＮＦ−ＡＴ４又はＮＦ−ＡＴx
）及びＮＦ−ＡＴc４ （GenBank L４１０６６, １３８１５４； 別名 ＮＦ−Ａ
Ｔ３）、並びに例えば米国特許 ５,６１２,４５５（Hoeyに March １８, １９９
７発行）及び ５,６５６,４５２（Rao et al.にAugust １２,１９９７発行）、P
CT WO ９５／０２０３５（Arai et al）、同WO ９４／１５９６４ （Rao et al.
）に記載されているように、その異なってスプライス形が含まれる。

【００６２】 好ましいＮＦ−ＡＴｃ蛋白質の部分又は断片には、一つ以上の特異領域を含む
ものがある。少なくとも次のＮＦ−ＡＴｃ領域が確認された。実質的にＲｄ相同
領域（RHD）又はＲｅｌ類似領域（RSD）に相当するＤＮＡ結合領域；例えばＡＰ
−１や、ＰＫＡ又はＧＳＫ−３のターゲット部位等の他の蛋白質と相互作用する
領域；配列番号３８の２６５−２６７アミノ酸（Ｎ末端ＮＬＳ）又は配列番号３
８の６８１−６８５アミノ酸（Ｃ末端ＮＬＳ）等を含む核移行配列（ＮＬＳ）；
又は例えばSRR（配列番号３８の１７２-１９４アミノ酸）、SP１（配列番号３８
の２３３-２５２アミノ酸）、SP２ （配列番号３８の ２３３−２５２アミノ酸
）、及びSP３ （配列番号３８の２７８−３０１アミノ酸）のようなＮＬＳと相
互作用する領域。他の可能な領域はさらに以下に説明するように同定することが
できる。従って、本発明はＮＦ−ＡＴｃの少なくとも一つの生活性（例えばＤＮ
Ａまたは他の蛋白質のような他の分子への結合、又は細胞の核膜を横断する移動
の抑制）を実行することができる（アゴニスト）又は抑制することができる（ア
ンタゴニスト）ＮＦ−ＡＴｃポリペプチドの部分をコードするＮＦ−ＡＴｃポリ
ヌクレオチドを提供する。ＮＦ−ＡＴｃポリペプチドがＮＦ−ＡＴの特異的な生
活性のアゴニスト又はアンタゴニストであることを決定するアッセイは以下に記
載する。

【００６３】 本発明の他の好ましい核酸は、ＮＦ−ＡＴｃポリペプチド又はその部分、例え
ば特定の領域に相当するか、特定の生活活性を有するか、又は配列番号３８のヒ
トＮＦ−ＡＴｃ配列の集合の一部又は他の例示のＮＦ−ＡＴ配列の一部と同一又
は少なくとも約６０％, ７０％, ７５％, ８０％, ８５％, ９０％, ９５％,よ
り好ましくは 少なくとも約９８％、最も好ましくは少なくとも約９９％一致又
は類似する部分をコードする。例えば本発明の好ましい核酸は、核膜を横断する
移動を調節することができるＮＦ−ＡＴポリペプチドをコードする。子のＮＦ−
ＡＴポリペプチドは、SRR、SP１、SP２及びSP３よりなる群から選択した領域の
のような、ＮＬＳまたはそれと相互作用するＮＦ−ＡＴｃポリペプチドの領域を
含む。さらに本発明のポリペプチドは実施例に記載したようなＮＦ−ＡＴｃポリ
ペプチドの変異形態の野生型をコードする。例えば好ましいポリヌクレオチドは
、他のアミノ酸例えばアラニンで置換した１つ以上のセリンを有するＮＦ−ＡＴ
ｃポリペプチドをコードし、それによりそのホスホリル化を阻止する。本発明の
核酸によりコードされる好ましいポリペプチドはＮＦ−ＡＴポリペプチドに関連
する章でさらに説明する。

【００６４】 全長ＮＦ−ＡＴｃポリペプチド、その断片又はその類似体をコードするポリペ
プチドは、コードされたポリペプチド生成物が産生されるように、転写（発現配
列）及びコード配列の翻訳を容易にするポリヌクレオチド配列を含むことができ
る。このようなポリヌクレオチドは当業者には周知であり、さらにManiatis t a
l., Molecular Cloning： A Laboratory Manual, ２nd Ed. （１９８９）, Cold
Spring Harbor, N.Y.記載されている。例えば、かかるポリヌクレオチドは、プ
ロモータ、転写終了部位（真核発現宿主のポリアデニル化部位）、リボソーム結
合部位、任意に真核発現宿主で使用するためのエンハンサー、及び任意にベクタ
ーの複製に必要な配列を含むことができる。典型的な真核発現カセットはプロモ
ータ（例えばHSV tkプロモータ又はpgk（ホスホグリセレートキナーゼ）プロモ
ータ）のＮＦ−ＡＴｃポリペプチド結合下流（すなわち翻訳読み取りフレームに
おけるポリヌクレオチドリンク）をコードするポリヌクレオチドを含み、任意に
エンハンサーと加療ポリアデニル化部位（例えばSV４OラージT AgポリA付加部位
）に結合している。

【００６５】 好ましいＮＦ−ＡＴｃポリヌクレオチドは次のアミノ酸配列の少なくとも１つ
を含むＮＦ−ＡＴｃポリペプチドをコードする。 -NAIFLTVSREHERVGC- （配列番号：２５）； -LHGYLENEPLMLQLFIGT- （配列番号：２６）； -PSTSPRASVTEESWLG-（配列番号：２７）； -GPAPRAGGTMKSAEEEHYG-（配列番号：２８）； -ASAGGHPIVQ-（配列番号：２９）； -NTRVRLVFRV-（配列番号：３０）； -AKTDRDLCKPNSLVVEIPPFRN-（配列番号：３１）； -EVQPKSHHRAHYETEGSR-.（配列番号：３２）； -SPRVSVTDDSWLGNT-（配列番号：３３）； -SHHRAHYETEGSRGAV-（配列番号：３４）； -LRNSDIELRKGETDIGR-（配列番号：３５）； -TLSLQVASNPIEC-（配列番号：３６）.

【００６６】 遺伝コードの縮退はこれらのアミノ酸配列をコードする一定のポリヌクレオチ
ド配列の組をあたえる。この縮退配列の組は手作業で又は市販のコンピュータソ
フト（Wisconsin Genetics Software Package Relaes７.０）で容易に発生させ
ることができる。従って、典型的には約１００００個のヌクレオチド長を有し、
次のアミノ酸配列： -NAIFLTVSREHERVGC-（配列番号：２５）； -LHGYLENEPLMLQLFIGT-（配列番号：２６）； -PSTSPRASVTEESWLG-（配列番号：２７）； -GPAPRAGGTMKSAEEEHYG-（配列番号：２８）； -ASAGGHPIVQ-（配列番号：２９）； -NTRVRLVFRV-（配列番号：３０）； -AKTDRDLCKPNSLVVEIPPFRN-（配列番号：３１）； -EVQPKSHHRAHYETEGSR-（配列番号：３２）； -SPRVSVTDDSWLGNT-（配列番号：３３）； -SHHRAHYETEGSRGAV-（配列番号：３４）； -LRNSDIELRKGETDIGR-（配列番号：３５）； -TLSLQVASNPIEC-（配列番号：３６）. の各々をコードする配列を有する単離ポリヌクレオチドが提供され、そして特に
、免疫原、免疫試薬等として使用できるＮＦ−ＡＴｃポリペプチドの発現のため
に使用して良い。かかるポリヌクレオチドは典型的には適当な原核又は真核宿主
細胞における発現を駆動するための動作可能に結合したプロモータを含む。この
ようなポリヌクレオチドの例は、ほ乳類の発現ベクトルpSRαへの動作結合でク
ローンされる図１のヒトＮＦ−ＡＴｃｃＤＮＡ配列である。多くの別の実施例、
と問えば発現ベクターの使用等を含む多くの多くのこれに代わる実施例は当業者
に明らかであろう。（例えば pBC１２BI及び p９１０２３（B）； Hanahan J （
１９８３） J. Mol. Biol. １６６： ５７７； Cullen et al. （１９８５） J.
Virol.５３： ５１５； Lomedico PT （１９８２） Proc. Nati. Acad. Sci. （
U.S.A.） ７９： ５７９８； Morinaga et al. （１９８４） Bio／Technology
２： ６３６）。

【００６７】 更に、ポリペプチドの発現を望まない場合には、本発明のポリヌクレオチドは
気のせい蛋白質をコードする必要はない。本発明のポリヌクレオチドはＮＦ−Ａ
ＴｃｃＲＮＡ配列を検出するための、ハイブリダイゼーションプローブ、ＰＣＲ
プライマー（アンプリマー）又はＬＣＲオリゴマーとして使用し得る。

【００６８】 別法として、本発明のポリヌクレオチドは、関連した遺伝子のＲＮＡ又はＤＮ
Ａ配列を検出するためのハイブリダイゼーションプローブ又はプライマーとして
使用できる。このような遺伝子は構造的に又は発生的に関連した蛋白質であり得
る。このようなハイブリダイゼーション又はＰＣＲとしての応用に対しては、本
発明のポリヌクレオチドは機能性蛋白質をコードする必要はない。従って、本発
明のポリヌクレオチドは、ＮＦ−ＡＴｃ配列に対する特異的なハイブリダイゼー
ション又は増幅が維持される限り、実質的な欠失、付加又は置換及び／又は転位
を含むことができる。

【００６９】 特異的ハイブリダイゼーションは既に定義したが、簡単にまとめると、本発明
のポリヌクレオチド（置換、欠失、及び／又は付加を有しうる）とヒトＮＦ−Ａ
ＴｃｍＲＮＡのような特定標的ポリヌクレオチドとの間の交雑の形成であり、こ
れにより単一バンドがＴ細胞から調製されたＲＮＡのノーザンブロット上に各Ｎ
Ｆ−ＡＴｃの同型に対応するものとして同定される（すなわち、個々のＮＦ−Ａ
ＴｃｍＲＮＡバンドの検出を可能にするハイブリダイゼーションと洗浄条件が確
立される）。従って、当業者は、図１に示した配列又は他の例示のＮＦ−ＡＴ配
列に比較しての、（実質的な付加、欠失、置換、又は転位を含みうる）本発明の
ポリヌクレオチドを調製し、ＮＦ−ＡＴｃｍＲＮＡを発現するＴリンパ細胞系か
ら調製されたＲＮＡを使用したノーザンブロットを実施することにより及び／又
はＮＦ−ＡＴｃＤＮＡクローン（ｃＤＮＡ又はゲノムクローン）へハイブリダイ
ゼーションすることにより、特異的ハイブリダイゼーションがそのポリヌクレオ
チドの特性であるかどうかを決定することができる。

【００７０】 特異的増幅は、ＮＦ−ＡＴｃポリヌクレオチドとのＰＣＲ反応において一緒に
使用された場合に、ＮＦ−ＡＴｃ遺伝子配列又はｍＲＮＡ配列に相当する実質的
に単一の主要増幅産生物を生成するＰＣＲアンプリマーの能力として定義される
。一般にヒト細胞（例えばJurkat細胞系）を発現するヒトゲノムＤＮＡ又はｍＲ
ＮＡは、ＰＣＲアンプリマー反応に対するテンプレートＤＮＡ試料として使用で
きる。特異的増幅を示すＰＣＲアンプリマーは、定量的なＰＣＲ増幅によりＮＦ
−ＡＴｃｍＲＮＡの定量的な決定を行うのに適当である。ＮＦ−ＡＴｃ対立遺伝
子に特異的な増幅生成物は、配列及び／又は長さ多形性であるが、本発明の目的
に対しては単一増幅生成物を構成すると考えられる。

【００７１】 ハイブリダイゼーションプローブは、一般に図１に示した配列の少なくとも約
２５個の連続したヌクレオチド（それぞれヒトおよびマウスＮＦ−ＡＴｃ検出の
ため）、好ましくは図１の配列の少なくとも５０個の連続したヌクレオチド、よ
り好ましくは少なくとも１００個の連続したヌクレオチドを含む。ＰＣＲアンプ
リマーは図１に示した配列の約２５−５０個の連続したヌクレオチドを含み、通
常は一般にポリメラーゼが介在する鎖延長に干渉しないように５’末端に存在す
る追加のヌクレオチド（もしある場合）を備えた、図１の配列の約２５−５０個
の連続したヌクレオチドより実質的に構成される。ＰＣＲアンプリマーの設計と
ハイブリダイゼーションプローブは充分当業者の裁量の範囲内にある。

【００７２】 Ｂ．アンチセンスポリヌクレオチド ＮＦ−ＡＴ活性の調節に向けられた追加の実施例は、図１に示された配列又は
例示のＮＦ−ＡＴ配列に相補的な特異的なアンチセンスポリヌクレオチドを使用
する方法、及びトリプル構造を形成するリボザイム及び分子を含む。かかる相補
的アンチセンスポリヌクレオチドは、ＮＦ−ＡＴ遺伝子の関連した標的配列への
特異的ハイブリダイゼーションプローブ又がポリヌクレオチドの機能特性として
維持される限り、ヌクレオチドの置換、付加、欠失又は転位を有しても良い。相
補手にアンチセンスポリヌクレオチドは、ＮＦ−ＡＴｃｍＲＮＡ種へ特異的にハ
イブリダイズし、ｍＲＮＡ種の転写及び／又はコードされたポリペプチドの翻訳
を防ぐことができる可溶性のアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡオリゴヌクレオチド
を含む。（Ching et al. （１９８９） Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A.８６：
１０００６； Broder et al. （１９９０） Ann. Int. Med. １１３： ６０４；
Loreau et al. （１９９０） FEBS Letters ２７４： ５３； Holcenberg et a
l., W０９１／１ １５３５； U.S.S.N. ０７／５３０,１６５； W０９１／０９
８６５； W０９１／０４７５３； W０９０／１３６４１； 及び EP ３８６５６
３を引用して記載に代える）。従って、アンチセンスポリヌクレオチドはＮＦ−
ＡＴｃポリペプチドの産生を抑制する。ＮＦ−ＡＴｃ蛋白質の発現はＴリンパ細
胞の活性と関連しているので、ＮＦ−ＡＴｃポリペプチドに相当したｍＲＮＡの
転位及び／又は翻訳を阻止するアンチセンスポリヌクレオチドは、Ｔ細胞の活性
を抑制し及び／又はＴ細胞の活性化された表現型を反転することができる。ＮＦ
−ＡＴｃアンチセンスポリヌクレオチドの治療に有効な量を含む組成物は、リン
パ細胞白血病のような免疫病の治療に投与できるし、所望により移植拒絶反応の
抑制のために投与できる。同様に、ＮＦ−ＡＴアンチセンスは、心臓肥大の治療
の一部として心臓及び／又は血管組織のＮＦ−ＡＴが関与する成長を抑制するた
めに使用できる。色々な長さのアンチセンスポリヌクレオチドが生成できる。も
っとも、これらのアンチセンスポリヌクレオチドは、典型的には、天然に産する
ＮＦ−ＡＴｃポリヌクレオチド、又は図１に示した配列、又は他の例示のＮＦ−
ＡＴ配列に実質的に同一の、少なくとも約２５個の連続したヌクレオチドを含ん
でいる。

【００７３】 アンチセンスポリヌクレオチドは、例えばヒトの造血幹細胞の個体群の全部又
は一部を再構成するのに使用される形質転換多能造血幹細胞のような、トランス
フェクタント細胞又は形質転換細胞中のヘテロ発現カセットから産生できる。別
法として、アンチセンスポリヌクレオチドは、インビトロの培地中か又はインビ
ボの循環系又は間質液中で、外来媒体に投与される可溶性オリゴヌクレオチドを
含みうる。外来媒体中に存在する可溶性アンチセンスポリヌクレオチドは、細胞
質にアクセスし特定のｍＲＮＡ種の翻訳を抑制することが分かった。ある実施例
ではアンチセンスポリヌクレオチドはメチルホスホネート部分を含む。アンチセ
ンスポリヌクレオチドに関する一般的な方法については文献を参照されたい（An
tisense RNA and DNA, （１９８８）, D.A. Melton, Ed., Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, NY）。

【００７４】 Ｃ．同族ヒトＮＦ−ＡＴｃ遺伝子の単離 ＮＦ−ＡＴｃｃＤＮＡのヒト相同体は、イースト合成染色体、コスミド又はバ
クテリオファージA （例えばλ Charon ３５）のようなヒトゲノムクローンライ
ブラリを、図１に示したＤＮＡ配列または他の例示のＮＦ−ＡＴｃ配列の少なく
とも約２４個の連続したヌクレオチドの配列を含むポリヌクレオチドプローブを
使用して、スクリーニングすることにより同定し単離される。典型的にはハイブ
リダイゼーション及び洗浄は慣用のハイブリダイゼーション法に従って高緊縮条
件下に行われる。陽性クローンが分離され配列決定される。例えば図１の配列に
相当する全長ポリヌクレオチドに標識を付け、これをλEMBL４又は XGEM１１（P
romega Corporation, Madison, Wisconsin）におけるヒト又はマウスクローンラ
イブラリからゲノムクローンを単離するハイブリダイゼーションプローブとして
使用することができる。プラークリフトをスクリーニングするための典型的なハ
イブリダイゼーション条件（Benton and Davis （１９７８） Science １９６：
１８０）は、５０％ホルムアミド、 ５×ＳＳＣ又はＳＳＰＥ、１−５×Denhar
dt溶液、０.１−１％ＳＤＳ、１００−２００μｇ切断異質構造 DNA又はtRNA、
０−１０％ 硫化デキストラン、約１×１０⁸ｃｐｍ／μｇの比活性を有する１×
１０⁵から１×１０⁷ ｃｐｍ／ｍｌの変性プローブ、及び４２℃での約６−３６
時間の培養である。予備ハイブリダイゼーションプローブ条件はプローブが含ま
れていない点及び培養時間が普通は減少される点を除いて上記と本質的に同一で
ある。洗浄条件は典型的には洗浄溶液を５〜３０分ごとに変えて１−３×ＳＳＣ
、０.１−１％ＳＤＳ、及び ５０−７０℃の条件である。

【００７５】 非ヒトＮＦ−ＡＴｃｃＤＮＡ及びゲノムクローン（同族非ヒトＮＦ−ＡＴｃ遺
伝子）は、各種の非ヒトｃＤＮＡ及び入手可能なゲノムクローンライブラリ（例
えばClontech, Palo Alto, CA） から、図１に示した配列に基づくプローブを使
用して、典型的にはヒトＮＦ−ＡＴｃクローンの単離の場合よりは弱い緊縮条件
で、同様に単離することができる。

【００７６】 ＮＦ−ＡＴｍＲＮＡに相当する又は相補的な、少なくとも約３０−５０個、好
ましくは少なくとも約１００個のヌクレオチドの配列を含むポリヌクレオチドプ
ローブは、生殖細胞系のＮＦ−ＡＴ遺伝子の同定及び単離のためのＰＣＲプライ
マー及び／又はハイブリダイゼーションプローブとして使用できる。これらの生
殖細胞系遺伝子は人のものでも良いし関連のほ乳類のもの、好ましくはけっし類
又は霊長類からのものである。ある生殖細胞系遺伝子は例えばバクテリオファー
ジλ又はコスミドライブラリのハイブリダイゼーションスクリーニングにより、
又は図１に示した配列に由来するプライマーを使用したゲノム配列のＰＣＲ増幅
によるなどの各種の公知の方法により単離できる。ヒトゲノムファイブラリーは
公然と入手できるし、或いはヒトＤＮＡから新たに構成できる。

【００７７】 特にマウス同族ＮＦ−ＡＴｃ遺伝子のＮＦ−ＡＴｃのゲノムクローンは、少な
くとも一つの機能破壊されたＮＦ−ＡＴｃ対立遺伝子（好ましくはノックアウト
ＮＦ−ＡＴｃ対立遺伝子に対して同型のもの）を有する細胞又は形質転換非ヒト
動物を発生するための相同ターゲッティング構造体を構成するにに使用できる。
相同多げってぃんぐ構造体を構成するための手引きは各種文献に記載されている
（Rahemtulla et al. （１９９１） Nature ３５３：８０； Jasin et al. （１
９９０） Genes Devel. ４： １５７； Koh et al. （１９９２） Science ２５
６： １２１０； Molina et al. （１９９２） Nature ３５７： １６１； Grus
by et al. （１９９１） Science ２５３： １４１７； Bradley et al. （１９
９２） Bio／TechnologyjQ： ５３４,個々に引用して記載に代える）。相同ター
ゲッティングは不活化ＮＦ−ＡＴｃ対立遺伝子に対して異型又は同型のいわゆる
ノックアウトマウスを発生するのに使用できる。このようなマウスは、免疫型の
開発、新生組織形成、Ｔ細胞活性化、信号トランスダクション、等の研究用に実
験動物として市販されている。

【００７８】 キメラ標的マウスは文献に従って生成できる（Hogan, et al., Manipulating
the Mouse Embryo： A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory （
１９８８） 、 Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells： A Practica１ a
pproach, E.J. Robertson, ed., IRL Press, Washington, D.C., （１９８７）
、ここに引用して記載に代える）。胚幹細胞は公知の手順に従って操作できる（
Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells： A Practical Approach, E.J. R
obertson, ed., IRL Press, Washington, D.C. （１９８７）； Zjilstra et al
. （１９８９） Nature ３４２：４３５； and Schwartzberg et al. （１９８
９） Science ２４６： ７９９, ここに引用して記載に代える）。

【００７９】 更に、ＮＦ−ＡＴｃｃＤＮＡ又はゲノム遺伝子コピーは、高いレベルでの及び
／又はＮＦ−ＡＴｃ遺伝子に近接して自然には産しない転写制御配列の転写制御
下での、ＮＦ−ＡＴｃポリペプチド発現のためのトランス遺伝子を構成するため
に使用できる。たとえば、構成プロモータ（例えばHSV-tk又はpgkプロモータ）
又は細胞結合特異性転写調節配列（例えば、CD４又は CD８遺伝子プロモータ／
エンハンサー）は、ＮＦ−ＡＴｃをコードするポリペプチド配列に結合して、（
典型的にはネオ遺伝子表現カセットのような選択可能なマーカーと組み合わせて
）トランス遺伝子を形成できる。かかるトランス遺伝子は細胞（例えばＥＳ細胞
又は造血幹細胞）導入することができ、形質転換細胞又は形質転換非ヒト動物は
公知の方法により得ることができる。ＮＦ−ＡＴｃの過剰発現又は不適当な発現
は高免疫状態を生じ、移植拒絶反応を生じるので、形質転換細胞又は形質転換ヒ
ト動物はアンチ新生組織剤及び／又は潜在的な免疫調節剤に対するスクリーニン
グに使用できる。

【００８０】 Ｄ．ＮＦ−ＡＴポリヌクレオチドの発現 最終的に所望のＮＦ−ＡＴポリヌクレオチドの発現が可能な本発明の核酸配列
は、各種のポリヌクレオチド（ゲノム又はｃＤＮＡ、ＲＮＡ、合成オリゴヌクレ
オチド、等）から各種の異なった技術により形成することができる。既に説明し
たように、ＤＮＡ配列は配列が発現制御配列に結合（すなわち発現の機能を保証
する位置に結合）した後に、宿主内で発現される。これらの発現ベクターは典型
的にはエピソーム又は宿主染色体ＤＮＡの一体的な一部として宿主組織内で複製
される。一般に発現ベクターは選択マーカー（例えばテトラサイクリン抵抗性又
はハイグロマイシン抵抗性のもの）を含むことにより、所望のＤＮＡ配列で転換
された細胞の検出及び／又は選択を許容する（例えばU.S. Patent ４,７０４,３
６２、ここに引用して記載に代える）。

【００８１】 Ｅ.coliは本発明のＤＮＡ配列をクローニングするために特に有用な原核宿主
である。他の使用に適した微生物宿主には、バチルス（Bacillus subtilis等）
、及び他の腸内細菌（例えばSalmonella, Serratia, 各種のPseudomonas種）が
ある。これらの原核宿主内で典型的には宿主細胞と両立する発現制御配列（例え
ば複製開始点）を含む発現ベクターを作ることができる。さらには、ラクトース
プロモータ系、トリプトファン（trp）プロモータ系、βラクタマーゼプロモー
タ系、又はλファージからのプロモータ系のような任意数の各種の周知のプロモ
ータが存在する。プロモータは典型的には制御発現であり、任意にオペレータ配
列を有しうるものであり、転写及び翻訳の開始と完了のためのリボソーム結合部
位配列等を有するであろう。

【００８２】 イースト等の他の微生物も又発現に利用できる。Saccharomycesは、３−ホス
ホグリセレートキナーゼまたは他のグリコール酵素を含むプロモータ及び複製の
好ましい宿主であり、所望により複製開始点、配列終点等の発現制御配列を有す
る適当なベクターを有する。

【００８３】 微生物に加えて、哺乳動物の組織細胞培養体も又本発明のポリペプチドの発現
と産生に使用できる（例えばWinnacker, "From Genes to Clones," VCH Publish
ers, N.Y., N.Y. （１９８７）, ここに引用して説明に代える）。完全なヒト細
胞をスクリーニングできる多数の適当な宿主細胞系が従来開発されているので真
核細胞実際上好ましく、これにはCHO細胞系、COS細胞系、HeLa細胞系、ミエロー
マ細胞系、Jurkat細胞、等が含まれる。これらの細胞の発現ベクターは、複製開
始点、ポロモータ、エンハンサーのような発現制御配列（Queen et al. （１９
８６） Immunol. Rev.８９： ４９、ここに引用して説明に代える）、リボソー
ム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写ターミネー
タ配列のような必要な処理情報部位を含む。好ましい発現制御配列は免疫グロブ
リン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピロマウイルス等に由来するプ
ロモータである。関心のあるＤＮＡセグメントを含むベクター（例えばＮＦ−Ａ
Ｔｃポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）は宿主細胞の型に依存して周
知の方法により宿主細胞に移入できる。例えばCaC１トランスフェクションが原
核細胞に対して広く利用され、CaPO₄処理又は電気穿孔法が他の宿主細胞に対し
て使用できる（Maniatis, et aL, Molecular Cioning： A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Press, （１９８２）参照、ここに引用して記載に代える）
。通常はベクターはエピソームであり、過剰染色体として維持される。

【００８４】 特にリンパ球生成リネージュの細胞のような細胞内の組み換えＮＦ−ＡＴｃ蛋
白質の発現は、ＮＦ−ＡＴｃ蛋白質の存在により積極的に又は消極的に転写調節
される遺伝子を同定し単離するために使用できる。かかる遺伝子は典型的にはサ
ブトラクティブｃＤＮＡライブラリから単離されたｃＤＮＡクローンとして初期
に同定される。ここに、組み換えＮＦ−ＡＴｃを発現する細胞から単離されたＲ
ＮＡ及び制御細胞から単離されたＲＮＡ（すなわち組み換えＮＦ−ＡＴｃを発現
しないもの）は、サブトラクティブライブラリとスクリーニングプローブを生成
するにに使用される。このようにして、ＮＦ−ＡＴｃ依存性遺伝子が単離できる
。ＮＦ−ＡＴ依存性遺伝子（又はレポータ遺伝子に動作可能に結合したそれらの
調節配列）は、ＮＦ−ＡＴｃポリペプチドを能率的な転写のための必要成分とし
て使用するインビトロ転写アッセイの成分として使用できる。このような転写ア
ッセイはＮＦ−ＡＴｃ依存性遺伝子転写を抑制し、それにより候補免疫調節剤と
して同定される剤をスクリーニングするために使用できる。

【００８５】 Ｅ．ＮＦ−ＡＴｃポリペプチド 図１に示したヌクレオチドとアミノ酸配列、及び例示のＮＦ−ＡＴ遺伝子は、
当業者が全長ヒトＮＦ−ＡＴｃポリペプチド配列の一部又は全部に相当したポリ
ペプチドを賛成することを化のにする。これらのポリペプチドはＮＦ−ＡＴｃ又
はその断片又は類似体をコードするポリヌクレオチドの発現により原核又は真核
宿主中で産生し得る。別法として、これらのポリペプチドは化学的方法により合
成でき、或いは翻訳を指示するポリヌクレオチドテンプレートを使用してインビ
トロ翻訳系により生成できる。組み換え宿主中の異質蛋白質の発現方法、ポリペ
プチドの化学合成、及びインビトロ翻訳は当業者には周知であり、文献に記載さ
れている（Maniatis et al., Molecular Cloning： A Laboratory Manual （１
９８９）, ２nd Ed., Cold Spring Harbor, N.Y. and Berger and Kimmel, Meth
ods in Enzymology, Volume １５２. Guide to Molecular Cloning Techniques
（１９８７）, Academic Press, Inc., San Diego, CA.）。ＮＦ−ＡＴｃの断片
又は類似体は当業者により調製することが可能である。

【００８６】 ＮＦ−ＡＴｃの断片又は類似体は当業者により調製することが可能である。Ｎ
Ｆ−ＡＴｃの断片又は類似体の好ましいアミノ酸及びカルボキシ末端は、昨日領
域の境界の近傍に生じる。例えば、かかる昨日領域は（１）他のＮＦ−ＡＴ成分
への結合特性を付与する領域（例えばＡＰ−１）、（２）核移行の特性を付与す
る領域、及び（３）細胞内で充分なレベルで発現したときにＴ細胞の活性を高め
る特性を付与する領域を含む。加えて、これらの機能領域は（１）ＲＮＡポリメ
ラーゼ種への結合特性を付与する領域、（２）触媒活性（例えばトピソメラーゼ
、エンドヌクレアーゼ）を含む及び／又は構造的特徴（例えば亜鉛フィンガー、
ヒストン結合部分）を含む、局部クロマチン構造を直接に変更する能力を有する
領域、及び（３）アクセサリー蛋白質及び／又は転写因子と相互作用し得る領域
を含むことがある。

【００８７】 構造的及び機能的領域が同定できる一つの方法は、図１に示したヌクレオチド
及び／又はアミノ酸配列のデータ又は他の例示のＮＦ−ＡＴ遺伝子を、公的又は
私的配列データベースと比較することである。好ましくは、計算機による比較法
を使用して、既知の構造及び／又は機能（例えば亜鉛フィンガー）の他の蛋白質
に生じる配列モチーフ又は予測される蛋白質配座領域を同定する。例えば、脱ヒ
ドロゲナーゼ（特に乳酸塩脱ヒドロゲナーゼ、及びマレイン酸塩脱ヒドロゲナー
ゼ）のＮＡＤ結合領域は、配座が類似であり、相同であると検出されるアミノ酸
配列を有する（Proteins. Structures and Molecular Principles, （１９８４
） Creighton （ed.）, W.H. Freeman and Company, New York, ここで引用して
記載に代える）。さらに、公知の三次元構造に折り込まれる蛋白質配列を同定す
る方法は公知である（Bowie et al. （１９９１） Science ２５３.： １６４）
。従って、次の実施例は当業者が本発明のＮＦ−ＡＴｃ配列における構造領域又
は機能領域を定義するのに使用できる配列モチーフ又構造配座を認識し得ること
を例示する。領域の例は図１のＮＦ−ＡＴｃポリペプチド配列のアミノ酸４１８
からアミノ酸７１０までのｒｅｌ類似領域である。

【００８８】 又、追加的に、図１の配列の電算機による既存データベースとの比較は、他の
蛋白質又はＮＦ−ＡＴｃ蛋白質の類似領域を示すコード配列に見いだされる配列
モチーフ及び構造配座を同定することができる。例えば、Wisconsin Genetics S
oftware Package内のプログラムGAP, BESTFIT, FASTA 及び TFASTA （Genetics
Computer Group, ５７５ Science Dr., Madison, WI） は、ＮＦ−ＡＴｃ配列と
相同の領域を有するGenBank／EMBLのようなデータベース中の配列を同定するた
めに使用できる。このような相同領域は候補構造又は機能領域である。別法とし
て、他のアルゴリズムを用いて配列データからこれらの領域を同定するために使
用できる。さらに、ニューラルネットワーク法は、ハードウエア又はソフトウェ
アで実行されるどうかは別として、（１）関連した蛋白質配列及びヌクレオチド
配列を同定し、（２）ＮＦ−ＡＴｃポリペプチド中の構造又は機能領域を定義す
る（Brunak et al. （１９９１） J. Mol. Biol. ２２０： ４９, ここに引用し
て説明に代える）。例えば１３個の残基繰り返しモチーフ -SPRASVTEESWLG- （
配列番号２３）及び-SPRVSVTDDSWLG- （配列番号２４） は構造的に関連してい
る領域の例である。

【００８９】 実質的に１個以上の機能領域を含む断片又は類似体は異質ポリペプチド配列に
融合することができる。得られる融合蛋白質はＮＦ−ＡＴｃ断片により付与され
た機能を示す。また、一個以上の機能領域が欠失したＮＦ−ＡＴｃポリペプチド
は欠失断片により通常は付与される特性を喪失する。

【００９０】 例えば、核への移行及び／又はＡＰ−１との相互作用という特性を与える領域
を、βガラクトシダーゼに融合して、核に移行し且つ酵素的に色素性基質を発色
団に変換することのできる融合蛋白質を作製することができる。

【００９１】 好ましい態様の一つは、機能的領域境界に近いアミノ酸位置に相当するアミノ
及び／又はカルボキシル末端を有する断片であるが、別のＮＦ−ＡＴｃ断片を調
製してもよい。どの断片のアミノ又はカルボキシル末端を用いるかは、本発明の
実施者の裁量に任されるところであり、作製の容易さ、蛋白質分解に対する安定
性、熱安定性、免疫学的反応性、アミノ又はカルボキシ末端残基の改変やその他
の条件を考慮に入れた実験的な見地から選択されるものであろう。

【００９２】 断片に加えて、ＮＦ−ＡＴｃの類似体を作製することができる。そのような類
似体としては、アミノ末端又はカルボキシル末端、あるいは内部配列のいずれか
又は両方における、アミノ酸配列の１個以上の欠失又は付加が挙げられる。類似
体は、更に配列転座を有していてもよい。類似体は、一般にアミノ又はカルボキ
シル末端において連結する異種配列を包含することもできる。この異種配列は、
得られる類似体に、天然ＮＦ−ＡＴｃ蛋白質に固有のものではない機能的特性を
賦与する。しかし、ＮＦ−ＡＴｃ類似体はそれぞれ、図１に示すアミノ酸配列の
部分に実質的に類似した２５アミノ酸部分を包含しなくてはならなず、定義（上
述）において数え上げた機能特性要件の少なくとも１個を有さなくてはならない
。好ましいアミノ酸置換は、（１）蛋白質分解性が低く、（２）酸化率が低く、
（３）可能であればリン酸化を含む、類似体の翻訳後修飾を変え、そして（４）
可能であればカルシニューリンとの相互作用又はリン酸化又は脱リン酸化を含む
、そのような類似体の他の物理化学的又は機能的特性を賦与又は改変するもので
ある。ＮＦ−ＡＴｃ類似体は、天然に産するペプチド配列のほかに様々なＮＦ−
ＡＴｃ配列の突然変異を含む。例えば、単数又は複数のアミノ酸置換（好ましく
は保存的アミノ酸置換）を、天然に産するＮＦ−ＡＴｃ配列（好ましくは機能的
領域外のポリペプチド部分）に加えることができる。

【００９３】 保存的アミノ酸置換は、アミノ酸を、類似の特性を有する他のアミノ酸（例え
ば酸性のＡｓｐ及びＧｌｕ）で置換することである。保存性（又は同義）アミノ
酸置換は、元の配列の構造的特性を実質的に変えるものであってはならない（例
えば、置換されるアミノ酸は、元の配列の螺旋構造を破壊したり、元の配列の特
徴である他の二次構造を破壊するものであってはならない）。当分野で認識され
るポリペプチドの二次及び三次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｓｔｒｕｃｔｕ ｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ （１９８４）Ｃｒ
ｅｉｇｈｔｏｎ編、Ｗ．Ｈ．Ｔｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍａｎｙ、ニューヨ
ーク；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ （１９９１）Ｃ．Ｂｒａｎｄｅｎ及びＴ．Ｔｏｏｚｅ、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂ
ｌｉｓｈｉｎｇ、ニューヨーク；Ｔｈｏｒｎｔｏｎ他（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：１０５に記載がある（参照して説明に代える）。

【００９４】 本発明は更に、リン酸化ＮＦ−ＡＴポリペプチドを提供する。好ましいリン酸
化ポリペプチドは、約アミノ酸１７２から約アミノ酸３０１の領域から選択され
る、少なくとも１個のホスホセリンを包含する。より好ましいＮＦ−ＡＴポリペ
プチドは、ＳＲＲ、ＳＰ１、ＳＰ２及び／又はＳＰ３内にリン酸化セリンを包含
する。ＳＲＲ内の好ましいセリンとしては、配列番号３８の残基１７２、１７５
、１７６、１７８、１７９、１８１、１８４、１８７、１８８、１９２及び１９
４のセリンが挙げられる。ＳＰ１内の好ましいセリンとしては、配列番号３８の
残基１９９、２０３、２０７及び２１１のセリンが挙げられる。ＳＰ２内の好ま
しいセリンとしては、配列番号３８の残基２３３、３２７及び２４５のセリンが
挙げられる。ＳＰ３内の好ましいセリンとしては、配列番号３８の残基２７８、
２８２、２８６、２９０及び２９９のセリンが挙げられる。他の好ましいＮＦ−
ＡＴポリペプチドは、位置２６９にホスホセリンを有するものである。

【００９５】 本発明は更に、ペプチド及びペプチド模倣体（mimetics）、例えばＮＦ−ＡＴ
蛋白質の核への移動を変調するのに用いられるものを提供する。好ましい態様に
おいては、剤は、細胞の角膜を通過するＮＦ−ＡＴポリペプチドの移動に関係す
るＮＦ−ＡＴ蛋白質部分、例えば分子内関係を形成するＮＦ−ＡＴポリペプチド
部分を包含する。より好ましい態様にあっては、ＮＦ−ＡＴの部分は核移行シグ
ナル又は配列（ＮＬＳ）を包含する。配列の例としては、ＮＦ−ＡＴｃ１（配列
番号３８）のアミノ酸６８２−６８５に相当するアミノ酸配列KRKK（配列番号５
６）又はKRKR（配列番号６５）（これらをKRKK／R（配列番号６６）と称する）
；又は、配列番号３８のアミノ酸６８１−６８５に相当するアミノ酸配列GKRKK
／R（配列番号６７）、又は他のＮＦ−ＡＴｃ族に相同性を有する配列が挙げら
れる。実際に、このC末端ＮＬＳは、他のＮＦ−ＡＴｃ族内にも見つかっている
（例えばHoey他（１９９５）Immunity２：４６１参照）。ＮＦ−ＡＴｐ（ＮＦ−
ＡＴｃ２）Ｃ末端ＮＬＳは、配列NGKRKRS（配列番号６８）を有し（図４参照）
；ＮＦ−ＡＴｃ３（ＮＦ−ＡＴ４）Ｃ末端ＮＬＳは配列NGKRKKS（配列番号６９
）を有し；そしてＮＦ−ＡＴｃ４（ＮＦ−ＡＴ３）Ｃ末端ＮＬＳは、配列NGRRKR
S（配列番号７０）を有する（Hoey他、上述参照）。すなわち本発明は、これら
のＮＬＳを包含するペプチド又はペプチド模倣体を提供する。他の態様において
は本発明は、ＮＦ−ＡＴｃ１（配列番号３８）のアミノ酸２６５−２６７に相当
するアミノ酸配列ＫＲＫを含む核移行シグナルを包含する、ペプチド又はペプチ
ド模倣体を提供する。あるいは、本ペプチドは、配列番号３８のアミノ酸.２６
３−２７１に相当する、アミノ酸配列CNKRKYSLN（配列番号５３）を包含する。

【００９６】 ＮＦ−ＡＴ ＮＬＳを包含するペプチドがＮＦ−ＡＴを発現する細胞内に存在
すると、内生ＮＦ−ＡＴ ＮＬＳとＮＦ−ＡＴのＳＲＲ、ＳＰ１、ＳＰ２及び／
又はＳＰ３領域との相互作用を競合的に阻害し、ＮＬＳが現われ、ＮＦ−ＡＴが
核内に移動することが可能になる。従って、本発明のＮＦ−ＡＴ ＮＬＳペプチ
ドは、ＮＦ−ＡＴの特異的な活性剤を構成する。ＮＦ−ＡＴｃ族間の配列類似性
から鑑みて、ＮＬＳと本明細書に記載したＮＦ−ＡＴｃ１分子の他の領域との分
子内相互作用が、他のＮＦ−ＡＴc族内で起こり、核膜を通じる移動を調節する
ことが予想される。これらの活性剤が細胞内で与える影響は、例えばＮＦ−ＡＴ
ＮＬＳと相互作用することのできるペプチドを細胞内に導入することによって
、逆転させることができる。例えば、ＮＬＳ ＫＲＫＫ／Ｒ（配列番号６６）を
包含するペプチドが被験者に投与された場合、ＮＬＳに結合することのできるペ
プチドの投与で、活性剤を阻害することができる。

【００９７】 従って本発明は更に、ＮＦ−ＡＴｃ分子中のＮＬＳと相互作用することのでき
るペプチド及びペプチド模倣体を提供する。そのようなペプチドを用いて、例え
ばＮＦ−ＡＴ分子のＮＬＳと相互作用し、よってＮＬＳを遮蔽することによって
、核から細胞質へのＮＦ−ＡＴの移動を誘導することができる。好ましいペプチ
ドは、Ｎ末端ペプチド、例えば配列番号３８のアミノ酸１７２−３０１領域に位
置するペプチドが挙げられる。より好ましいペプチドは、ＳＲＲ、ＳＰ１、ＳＰ
２及びＳＰ３からなる群より選ばれる１個以上の配列を包含するペプチドである
。一つの態様においては、そのようなペプチドは、ＳＲＲ配列のアミノ酸配列、
例えば配列番号３８の約アミノ酸１７２−１９４に相当する配列を包含する。Ｎ
ＬＳと相互作用できる限り、より短いペプチドを用いることもできる。この目的
で用いることのできる他のペプチドとしては、ＳＰ１、ＳＰ２及びＳＰ３からな
る群より選ばれる１個以上の配列を有するペプチド、例えば配列番号３８の約ア
ミノ酸１９９−２１９（ＳＰ１）、配列番号３８の約アミノ酸２３３−２５２（
ＳＰ２）、及び／又は配列番号３８の約アミノ酸２７８−３０１（ＳＰ３）を包
含するペプチドが挙げられる。上記したＳＲＲ、ＳＰ１、ＳＰ２及びＳＰ３の配
列に相同性（少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は好ましくは少なく
とも約９８％又は９９％の同一性又は類似性）を有するアミノ酸配列を包含する
他のペプチドも、本発明の対象とするところである。特に、ＮＬＳと分子内相互
作用することのできるＮＦ−ＡＴｃ２、ＮＦ−ＡＴｃ３及びＮＦ−ＡＴｃ５から
のペプチドは、本発明の対象とするところである。ＳＰ１、ＳＰ２及びＳＰ３配
列は、全てのＮＦ−ＡＴｃ族で相同性を有する（例えばHoey他、上述参照）。

【００９８】 ＳＲＲ、ＳＰ１、ＳＰ２及びＳＰ３からなる群より選ばれる１個以上の配列を
包含するＮＦ−ＡＴペプチドは、好ましくはホスホセリンを包含する。ペプチド
の各セリンをリン酸化することができる。しかし実施例に示すように、ペプチド
がＮＬＳと相互作用するように、セリンを幾つかリン酸化することだけが必要で
ある（図１２参照）。従って、本発明のペプチドで好ましいものは、ＮＦ−ＡＴ
のＮＬＳと相互作用するのに十分な数のホスホセリンを有するＮＦ−ＡＴペプチ
ドである。主題のペプチドは、実施例に記載の方法によって、又は当分野で知ら
れる生体外リン酸化アッセイによって、生体外でリン酸化することができる。

【００９９】 本発明は更に、配列番号３８に記載の配列の相同体、変異体、誘導体又はペプ
チド模倣体である、ＮＬＳ又は１個以上の繰返し単位ＳＲＲ、ＳＰ１、ＳＰ２及
びＳＰ３を包含するＮＦ−ＡＴペプチドを提供する。好ましい相同体、変異体、
誘導体又はペプチド模倣体は、ＮＦ−ＡＴポリペプチドの部分と相互作用するこ
とができるものである。ペプチド又はペプチド模倣体は、結合アッセイ、例えば
本実施例に記載した結合アッセイによって、ＮＦ−ＡＴの部分と相互作用するも
のについてスクリーニングすることができる。

【０１００】 本発明が更に対象とするのは、構成的に活性なＮＦ−ＡＴポリペプチドである
。そのようなＮＦ−ＡＴポリペプチドは、活性化をカルシウムの存在に依存しな
いが、下記に詳述するように一般的な方法で活性化されるので有用である。実施
例に示すように、ＮＦ−ＡＴ内のある種のアミノ酸を突然変異することによって
、構成的な核移行、従って構成的な活性化が起こる。構成的に活性なＮＦ−ＡＴ
ポリペプチドで好ましいものとしては、少なくとも１個のアミノ酸を欠失、付加
又は置換し（一般に「ペプチド改変」と称する）、ＮＦ−ＡＴの分子内相互作用
に干渉するものが挙げられる。より好ましいＮＦ−ＡＴポリペプチドは、ＮＦ−
ＡＴポリペプチドが分子内関係を形成する能力を減少させる又は阻害するように
、ＮＦ−ＡＴ分子のＳＲＲ、ＳＰ１、ＳＰ２又はＳＰ３配列の１個以上において
ペプチド改変を有するものである。ペプチド改変は、１個以上の繰返し単位中に
おける１個以上のセリンの置換であってもよい。例えば、構成的に活性なＮＦ−
ＡＴペプチドは、ＳＲＲ領域（配列番号３８のアミノ酸１７２−アミノ酸１９４
）に位置するセリン全てを置換したものであってもよい。あるいは、構成的に活
性なペプチドは、配列番号３８の位置１８４、１８７及び１８８のセリンを置換
したもの；配列番号３８の位置１７２、１７５及び１７６のセリンを置換したも
の；配列番号３８の位置１７８、１７９及び１８１のセリンを置換したもの；配
列番号３８の位置１８４、１８７及び１８８のセリンを置換したもの；であって
もよい。構成的に活性なＮＦ−ＡＴポリペプチドは、ＳＰ１、ＳＰ２及び／又は
ＳＰ３領域の１個以上のセリンの置換によって得たものであってもよい。特に、
構成的なＮＦ−ＡＴペプチドは、ＳＰ１（配列番号３８のアミノ酸１９９−２１
９に相当）の４個のセリンの置換；ＳＰ２（配列番号３８のアミノ酸２３３−２
５２に相当）の位置２３３及び２３７のセリンの置換；又はＳＰ３（配列番号３
８のアミノ酸２７８−３０１に相当）の位置２７８、２８２、２８６及び２９９
におけるセリンの置換を包含することができる。置換が分子内相互作用を低減さ
せる限りは、１個以上のセリンをどのアミノ酸で置換してもよい。好ましくはリ
ン酸化されないアミノ酸、例えばアラニンである。ＮＦ−ＡＴポリペプチドに構
成的な活性を与える、ＮＦ−ＡＴポリペプチド内に作られる突然変異は、ペプチ
ドのライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができる。例
えば、配列番号３８のアミノ酸１７２−１８８を包含するペプチドで１個以上の
セリン又は他のアミノ酸がランダムに突然変異されたペプチド等の、変性ペプチ
ドのライブラリーを作製することができる。例えば過剰なＮＦ−ＡＴ ＮＬＳペ
プチドを含むカラムに変性ペプチドのライブラリーを通過させることによって、
ＮＦ−ＡＴ ＮＬＳと相互作用しないペプチドについてライブラリーをスクリー
ニングすることができる。次いで、カラムを通過したペプチドのアミノ酸配列を
決定する。あるいは、ライブラリー内の個々のペプチドを標識付けすることもで
きるし、標識を検出及び同定することによって、ここのペプチドを同定すること
ができる。

【０１０１】 構成的に活性なＮＦ−ＡＴポリペプチドは、例えば構成的に活性なＮＦ−ＡＴ
ポリペプチドをコードする遺伝子を、誘導性プロモーターの制御下に提供するこ
とによって調節することができる。あるいは、ＮＦ−ＡＴポリペプチドは、調節
可能な他のペプチドに融合することができる。例えば、構成的に活性なＮＦ−Ａ
Ｔポリペプチドは、リガンド結合領域に融合することができる。このＮＦ−ＡＴ
蛋白質活性の対照標準は、リガンド結合領域及び細胞質保持領域を含有する融合
蛋白質を細胞内でさらに発現することで得られる。それにより、２個の融合蛋白
質間の交雑を可能にする二量化剤（dimerizer）分子の存在下で、ＮＦ−ＡＴ融
合蛋白質が細胞質内に保持される。二量化剤を除去することによって、核への移
動を誘導する。

【０１０２】 あるいは、構成的に活性なＮＦ−ＡＴポリペプチドは、ＮＦ−ＡＴポリペプチ
ドに追加のＮＬＳ、特に異種ＮＬＳ、例えばウィルスＮＬＳ（ＳＶ４０large Ｔ
抗原ＮＬＳ等）を融合することによって得ることができる。ＮＦ−ＡＴポリペプ
チドは、２個以上のＮＬＳに融合することもできる。１個以上のＮＬＳをＮＦ−
ＡＴポリペプチドのＮ末端に融合することができる。実施例１０に示すように、
ＮＦ−ＡＴポリペプチドが１個以上の異種ＮＬＳに電子対を共有して連結してい
ると、構成的な核への移行が起こる。

【０１０３】 ＮＦ−ＡＴのＮＬＳを用いて、蛋白質、特に異種蛋白質を核に向けることがで
きる。実施例１１に示すように、配列番号３８のアミノ酸２６３−２７１（Ｎ末
端ＮＬＳ）のアミノ酸配列を有するペプチド又は配列番号３８のアミノ酸６８１
−６８５（Ｃ末端ＮＬＳ）のアミノ酸配列を有するペプチドを異種ポリペプチド
に添加すると、ポリペプチドの構成的な核移行が起こる。従って、ＮＦ−ＡＴか
らのＮＬＳは、ポリペプチドを核に向けるのに十分である。従って、ＮＦ−ＡＴ
からのＮＬＳを包含するペプチド、特にアミノ酸配列KRK、又は好ましくはCNKRK
YSLN（配列番号５３）（配列番号３８のアミノ酸２６３−２７１）、より好まし
くはSPCNKRKYSLNGR（配列番号７１）（配列番号３８のアミノ酸２６１−２７３
）、及び／又はアミノ酸配列KRKKIR（配列番号６６）、又は好ましくはGKRKK／R
（配列番号６７）（配列番号３８のアミノ酸６８１−６８５）、より好ましくは
CNGKRKK／RSQ（配列番号７２）（配列番号３８のアミノ酸６７９−６８７）を包
含するペプチドも本発明の範囲に含まれる。

【０１０４】 例えば１個の、好ましくは両方のＮＬＳを突然変異させ、細胞質から核へのＮ
Ｆ−ＡＴポリペプチドの移動を不能にすることによって、優性陰性（dominant n
egative）ＮＦ−ＡＴ、又は構成的に不活性なＮＦ−ＡＴを作製することができ
る。 １個以上の突然変異ＮＬＳを有するＮＦ−ＡＴポリペプチドは、優性陰性
突然変異として作用することができる。ポリペプチドは依然としてカルシニュー
リンと相互作用することができ、したがってカルシニューリンと競合し、その結
果カルシニューリンが内生ＮＦ−ＡＴ分子と相互作用して活性化するのを阻害す
るからである。Ｎ末端ＮＬＳは、例えば配列番号３８の残基２６５−２６８（KR
K）を置換することによって突然変異させることができる。例えばこれらの残基
はQILに変えることができる。Ｃ末端ＮＬＳは、例えば配列番号３８の残基６８
２−６８５（KRKK／R（配列番号６６））を置換することによって突然変異させ
ることができる。例えばこれらの残基はTRTG（配列番号５５）に変えることがで
きる。他の突然変異も本発明の範囲に含まれ、例えば実施例に記載するアッセイ
を行うことによって同定することができる。そのようなアッセイを用いて、突然
変異したＮＬＳ配列のライブラリーをスクリーニングすることもできる。

【０１０５】 特に好ましい変異体は、優性陰性ＮＦ−ＡＴｃ突然変異体の構造模倣体、例え
ば本質的に図１のアミノ酸１−４１８からなり、実質的にカルボキシル末端から
残基４１８のアミノ酸を欠失するポリペプチドである。そのような優性陰性突然
変異ポリペプチドの模倣体は、ＮＦ−ＡＴ活性化（従ってＴ細胞活性化）のアン
タゴニスト又は部分的アゴニストとしての実質的な活性を有することができる。

【０１０６】 本発明の他の特徴は、ＮＬＳ配列に由来し、グルカンシンターゼキナーゼ（例
えばＧＳＫ−３）を阻害する、ペプチド及びペプチド模倣体阻害剤に関する。

【０１０７】 天然のＮＦ−ＡＴｃ蛋白質、その断片、又はその類似体は、ＮＦ−ＡＴ機能に
干渉する剤を同定するＤＮＡ結合アッセイ及び／又は生体外転写アッセイにおい
て試薬として用いることができる。そこで同定された剤は、例えばＴ細胞活性化
の阻害又はＴ細胞リンパ球性白血病の治療に用いられる候補薬剤である。通常、
ＮＦ−ＡＴとＤＮＡとの結合を測定する生体外ＤＮＡ結合アッセイでは、（天然
ＮＦ−ＡＴ蛋白質の特異的フットプリント法によって定義される）１個以上のＮ
Ｆ−ＡＴ認識部位列を有する二本鎖ＤＮＡが用いられる。ＤＮＡは一般に、当業
者に知られるあらゆる手段によって、固体基質に連結している。そのような結合
は非共有結合（例えばナイロン６６等の高荷電表面への結合）であってもよいし
、共有結合（例えば一般に、ヌクレオチド塩基における窒素位置に関連する化学
結合、例えばジアゾ化等）であってもよい。ＮＦ−ＡＴｃポリペプチドは一般に
、放射性同位元素標識付けしたアミノ酸の取り込みによって標識付けする。通常
ＮＦ−ＡＴ核成分（例えばＡＰ−１活性）でＮＦ−ＡＴ複合体を形成して再構成
される標識ＮＦ−ＡＴｃポリペプチドは、固定化ＤＮＡに接触される。接触は、
約１×１０⁶Ｍ^-1以上の結合親和性で、一般にＺｎ⁺²及び／又はＭｎ⁺²及び／又
はＭｇ⁺² を、ナノモルからミクロモルの範囲（１ｎＭ〜９９９μＭ）で含む、
対照結合反応における特異的な結合を可能にする水性条件下（例えば１０−２５
０ｍＭ ＮａＣｌ又はＫＣｌ及び５−１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ５−
９、一般にｐＨ６−８）で行う。結合の特異性は、一般に、医者の裁量によって
選択された様々な濃度の非標識付け競合体を添加することによって行う。非標識
蛋白質競合体の例としては、非標識ＮＦ−ＡＴｃポリペプチド、ウシ血清アルブ
ミン及び核蛋白質抽出物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。１
種以上の剤が添加される結合反応は、作用体を含まない対照結合反応と並行して
行われる。対照反応に比較して、ＮＦ−ＡＴｃポリペプチドによるＤＮＡへの特
異的な結合を阻害する作用体は、候補免疫調節剤として同定される。また、生体
外のＮＦ−ＡＴによる転写変調を回避する作用体は、候補免疫調節剤として同定
される。

【０１０８】 上に述べたように、天然に産するアミノ酸のみからなるＮＦ−ＡＴｃポリペプ
チドに加えて、ＮＦ−ＡＴｃペプチド模倣体も提供される。ペプチド類似体は、
鋳型ペプチドに類似した特性を有する非ペプチドの薬剤として、薬産業で一般に
用いられている。これらの非ペプチド化合物種は、「ペプチド模倣体」と称され
ており（Fauchere, J.（１９８６）Adv. Drug Res.１５：２９；Veber及びFreid
inger（１９８５）TINS p.３９２；及びEvans他（１９８７）J. Med. Chem３０
：１２２９、ここに参照して説明に変える）、一般にコンピューターによるモデ
ル作製によって開発されている。治療上有うようなペプチドに類似した構造を有
するペプチド模倣体を用いて、同等の治療効果又は予防効果を得ることができる
。一般に、ペプチド模倣体は、ヒトＮＦ−ＡＴｃ等の典型ポリペプチド（すなわ
ち、生物学的又は薬理学的活性を有するポリペプチド）に構造が類似しているが
、１個以上のペプチド結合が−ＣＨ₂ＮＨ−、−ＣＨ₂Ｓ−、−ＣＨ₂−ＣＨ₂−、
−ＣＨ＝ＣＨ−（シス及びトランス）、−ＣＯＣＨ₂−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ₂−
及び−ＣＨ₂ＳＯ−からなる群より選ばれる結合に任意に置換されうる。置換の
方法は、当分野で公知のものであり、詳細は下記を参照にできる。Spatola, A.F
. "Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins," B
. Weinstein編、Marcel Dekker、ニューヨーク、ｐ２６７（１９８３）；Spatol
a, A.F.、Vega Data（１９８３年３月）Vol. １、Issue３、"Peptide Backbone
Modifications"（general review）；Morley, J.S.、Trends Pharm Sci（１９８
０）pp.４６３−４６８（general review）；Hudson, D.他、Int J Pept Prot R es （１９７９）１４：１７７−１８５（−CH₂NH−、CH₂CH₂−）；Spatola, A.F.
他、Life Sci（１９８６）３８：１２４３−１２４９（−CH₂−S）；Harm, M.M.
、J Chem Soc Perkin Trans I（１９８２）３０７−３１４（−CH−CH−、シス
及びトランス）；Almquist, R.G.他、J Med Chem（１９８０）２３：１３９２−
１３９８（−COCH₂−）；Jennings−White, C.他、Tetrahedron Lett（１９８２
）２３：２５３３（−COCH₂−）； Szelke, M.他、欧州特許出願EP４５６６５（
１９８２）CA：９７：３９４０５（１９８２）（−CH（OH）CH₂−）；Holladay,
M.W.他、Tetrahedron Lett（１９８３）２４：４４０１−４４０４（−C（OH）
CH₂−）；及びHruby, V.J.、Life Sci（１９８２）３１：１８９−１９９（−CH ₂ −S−）；（ここに参照して説明に代える）。特に好ましい非ペプチド結合は−
CH₂NH−である。そのようなペプチド模倣体は、ポリペプチドの態様に対して、
より安価な生産、より高い化学的安定性、増強された薬理学的特性（半減期、吸
収、力価、効力など）、変化した特異性（例えば広域な生物学的活性）、低減し
た抗原性などの重要な利点を有することができる。ペプチド模倣体の標識付けで
は、直接に又はスペーサー（例えばアミノ基）を介して、１個以上の標識を、ペ
プチド模倣体の非干渉位置（定量的構造−活性データ及び／又は分子モデリング
によって予想される）に共有結合するのが一般的である。非干渉の位置は一般に
、ペプチド模倣体が結合して治療効果を生む巨大分子（例えば免疫グロブリン超
科分子）と、直接接触することのない位置である。ペプチド模倣体の派生化（例
えば標識付け）は、ペプチド模倣体の望まれる生物学的又は薬理学的活性に実質
的に干渉するものであってはならない。ＮＦ−ＡＴｃのペプチド模倣体を、ＮＦ
−ＡＴｃ機能の競合的又は非競合的アゴニスト又はアンタゴニストとして用いる
ことができる。例えば、ＮＦ−ＡＴｃを含む誘導Ｔ細胞に投与したＮＦ−ＡＴｃ
ペプチド模倣体は、天然に産するＮＦ−ＡＴｃと競合し、ＮＦ−ＡＴ活性を低減
させる。あるいは、ＮＦ−ＡＴｃを欠くＴ細胞に投与したＮＦ−ＡＴｃペプチド
模倣体は、Ｔ細胞活性化などを誘導することができる。

【０１０９】 コンセンサス配列の１個以上のアミノ酸を同じ型のＤアミノ酸（例えばＬ−リ
ジンの代わりにＤ−リジン）で系統的に置換して、より安定したペプチドを作製
することができる。加えて、コンセンサス配列又は実質的に同一のコンセンサス
配列変種を包含する制約された（constrained）ペプチド（環化ペプチドを含む
）は、公知の方法、例えば分子内ジスルフィド架橋を形成することができ、ペプ
チドを環化する内部システイン残基を添加することによって、作製することがで
きる（Rizo及びGierasch（１９９２）Ann.Rev.Biochem、６１：３８７。参照し
て説明に代える）。

【０１１０】 ここで同定したＮＦ−ＡＴｃポリペプチドのアミノ酸配列を用いれば、ＮＦ−
ＡＴｃペプチド配列及びその配列変異体に相当するポリペプチドの作製が当業者
には可能であろう。そのようなポリペプチドは、ＮＦ−ＡＴｃペプチド配列（多
くの場合にはより大きなポリペプチドの部分）をコードするポリヌクレオチドを
発現することによって、原核又は真核宿主細胞内で作製することができる。ある
いは、そのようなペプチドは、化学的方法によって合成することができる。組換
え宿主中での異種蛋白質の発現、ポリペプチドの化学合成、生体外翻訳の方法は
当業者に知られるものであり、下記文献に詳細を参照できる。Maniatis他、Mole cular Cloning：A Laboratory Manual （１９８９）第２版、Cold Spring Harbor
、ニューヨーク；Berger及びKimmel、Methods in Enzymology. Volume１５２. G uide to Molecular Cloning TechniQues （１９８７）、Academic Press, Inc.、
カリフォルニア州サンディエゴ；Merrifield, J.（１９６９）J.Am.Chem.Soc.９
１：５０１；Chaiken I.M.（１９８１）CRC Crit.Rev.Biochem. １１：２５５；
Kaiser他（１９８９）Science２４３.：１８７；Merrifield, B.（１９８６）Sc ience ２３２：３４２；Kent, S.B.H.（１９８８）Ann.Rev.Biochem.５７：９５
７；及びOfford,R.E.（１９８０）Semisynthetic Proteins、Wiley Publishing
；ここに参照して説明に代える）。

【０１１１】 Ｆ．α−ＮＦ−ＡＴｃ抗体の作製及び適用 天然ＮＦ−ＡＴｃ蛋白質、その断片又はその類似体を用いて、動物を免疫化し
て特異的な抗体を作製することができる。これらの抗体は、ポリクローナル抗血
清を包含してもよいし、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル
抗体を包含してもよい。抗体を調製する一般的な方法については、Antibodies： A Laboratory Manual （１９８８）E. Harlow及びD. Lane、Cold Spring Harbor
Laboratory、Cold Spring Harbor、ニューヨーク参照（ここに参照して説明に代
える）。

【０１１２】 例えば（ただしこの例に限定されるものではない）、組換え技術によって作製
したヒトＮＦ−ＡＴｃ断片を、当業者に知られる免疫化プロトコルに従ってアジ
ュバントと共にラットに注射し、免疫応答を誘導することができる。一般に、ポ
リペプチドの長さに応じて、少なくとも約１−５０μｇのＮＦ−ＡＴｃ断片又は
類似体が最初の免疫化に用いられる。別にあるいは組換え技術によって作製した
ＮＦ−ＡＴｃポリペプチドと組み合わせて、ＮＦ−ＡＴｃ配列を有する化学合成
ペプチド（例えば表ＩＩに例示したペプチド、下記参照）を免疫原として用いて
、ＮＦ−ＡＴｃ蛋白質（本質的に図１に示した配列を有する天然ヒトＮＦ−ＡＴ
ｃポリペプチド又は天然ヒトＮＦ−ＡＴｃポリペプチドアイソホーム等）に結合
する抗体を作製することができる。少なくとも１×１０⁷ Ｍ^-1の結合親和性で組
換え断片結合する免疫グロブリンは、免疫化した動物から抗血清として得ること
ができ、免疫親和性クロマトグラフィー又は他の方法によって更に精製すること
ができる。加えて、脾臓細胞を免疫化動物（一般にラット又はマウス）から得て
、骨髄腫細胞に融合し、抗体分泌ハイブリドーマ細胞の層を得る。組換え技術に
より作製したＮＦ−ＡＴｃポリペプチド（又は化学的に合成されたＮＦ−ＡＴｃ
ポリペプチド）に少なくとも１×１０⁶Ｍ^-1の親和性で結合する免疫グロブリン
を分泌するクローンについて、ハイブリドーマの層をスクリーニングすることが
できる。マウス、ラット以外の動物を抗体の作製に用いることもできる。例えば
ヤギ、ウサギ、ヒツジ及びニワトリを用いて、ＮＦ−ＡＴｃ蛋白質に反応する抗
体を作製することもできる。実質的なヒト抗体を産生することのできるトランス
ジェニックマウスを免疫化して、α−ＮＦ−ＡＴｃ抗血清源として用いる及び／
又はモノクローナル分泌ハイブリドーマの作製に用いることもできる。

【０１１３】 バクテリオファージ抗体呈示ライブラリーを、ＮＦ−ＡＴｃポリペプチド［例
えば全長ヒトＮＦ−ＡＴｃ蛋白質、ＮＦ−ＡＴｃ断片（例えば表ＩＩに示した配
列を有するペプチド、下記参照）、あるいは図１に示したアミノ酸のうち少なく
とも連続する１４個のアミノ酸であるＮＦ−ＡＴｃポリペプチド配列又は表ＩＩ
のポリペプチド配列（下記参照）を包含する融合蛋白質又はポリペプチド］への
結合についてスクリーニングすることもできる。抗体の組み合わせライブラリー
が、バクテリオファージプラークとして又は溶原コロニーとしてスクリーニング
される、バクテリオファージλ発現系内で作製されている（Huse他（１９８９） Science ２４６：１２７５；Caton及びKoprowski（１９９０）Proc.Nati.Acad.Sc i.（U.S.A. ）８７：６４５０；Mullinax他（１９９０）Proc.Nati.Acad.Sci.（U .S.A. ）８７：８０９５；Persson他（１９９１）Proc.Nati.Acad.Sci.（U.S.A.
）８８：２４３２参照）。バクテリオファージ抗体呈示ライブラリーの様々な態
様及びλファージ発現ライブラリーが、これまで記述されている（Kang他（１９
９１）Proc.Natl.Acad.Sci.（U.S.A.）８８：４３６３；Clackson他（１９９１
）Nature３５２：６２４；MeCafferty他（１９９０）Nature３４８：５５２；Bu
rton他（１９９１）Proc.Natl.Acad.Sci.（U.S.A.）８８：１０１３４；Hoogenb
oom他（１９９１）Nucleic Acids Res.１９：４１３３；Chang他（１９９１）J. Immunol １４７：３６１０；Breifling他（１９９１）Gene１０４：１４７；Mar
ks他（１９９１）J.Mol.Biol.２２２：５８１；Barbas他（１９９２）Proc.Nati .Acad.Sci.（U.S.A. ）８９：４４５７；Hawkins及びWinter（１９９２）J.Immun ol .２２：８６７；Marks他（１９９２）Biotechnology１０：７７９；Marks他（
１９９２）J.Biol.Chem.２６７：１６００７；Lowman他（１９９１）Biochemist ry ３０：１０８３２；Lerner他（１９９２）Science２５８：１３１３；参照し
て説明に代える）。一般にバクテリオファージ抗体呈示ライブラリーは、固定化
（例えば、クロマトグラフィー樹脂に共有結合して親和性クロマトグラフィーに
よる反応ファージを増加させた）及び／又は標識付けした（例えば、プラーク又
はコロニーのスクリーニングを目的とする）ＮＦ−ＡＴｃポリペプチドでスクリ
ーニングする。

【０１１４】 試料中のα−ＮＦ−ＡＴｃ抗体の診断的な検出、（例えば標準的な競合イライ
ザによる）試料中のＮＦ−ＡＴｃ蛋白質の診断的な検出及び定量化、バクテリオ
ファージ抗体呈示ライブラリーのスクリーニングに、免疫原として有用なＮＦ−
ＡＴｃポリペプチドは、一般に約５０％（ｗ／ｗ）以上の純度で、実質的に干渉
蛋白質及び不純物を含まない実質的に純粋な形態で好適に得られる。好ましくは
これらのペプチドは、実質的にヒト、マウスの他の蛋白質や他の不純物を含まな
い、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）、より好ましくは少なくとも９５％（ｗ／ｗ）
の純度で単離又は合成される。好ましい免疫原は、表ＩＩに記載のＮＦ−ＡＴｃ
ポリペプチド配列の少なくとも１個を、独立したペプチドとして又は（例えばβ
−ガラクトシダーゼ又はグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ配列との）融合ポ
リペプチドの一部として、包含する。ＮＦ−ＡＴｃ免疫原は、少なくとも１個の
、一般には数個のそのような免疫原性エピトープを包含する。

【０１１５】 例えば免疫交差反応性蛋白質を同定する、これらの抗体の用途として、望まし
い抗血清又は（複数の）モノクローナル抗体は単一特異的ではない。これらの例
において、抗原としては天然全長蛋白質を用いるよりも、合成又は組換えのＮＦ
−ＡＴｃ断片を用いるのが好ましいと思われる。より具体的には、物体が特別な
構造基（ＤＮＡ結合領域など）を包含する免疫交差反応性ポリペプチドの同定に
用いられる場合、ＮＦ−ＡＴｃ蛋白質中の同一基準（commensurate）構造領域の
部分又は全体に相当する断片を、抗原として用いるのが好ましい。そのような確
定したアミノ−カルボキシ末端を有する組替え又は合成断片の作製は、図１に示
すＮＦ−ＡＴｃ配列によって提供される。

【０１１６】 ＮＦ−ＡＴｃ免疫原性エピトープを含有し、β−ガラクトシダーゼ又はグルタ
チオンＳ−トランスフェラーゼに融合したＮＦ−ＡＴｃ融合ポリペプチドに対す
る抗血清を作製する場合、抗血清は好ましくは非ＮＦ−ＡＴｃ融合パートナー（
例えばβ−ガラクトシダーゼ又はグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）で予め
吸収しておき、免疫原として作用する融合蛋白質の非ＮＦ−ＡＴｃ部分に反応す
る（即ち、特異的に結合する）抗体の抗血清を、枯渇させておく。ヒト及び／又
はマウスＮＦ−ＡＴｃ蛋白質に結合するモノクローナル又はポリクローナル抗体
を用いて、試料中のヒト又はマウスＮＦ−ＡＴｃポリペプチドの存在を調べるこ
とができる。例えば患者のリンパ球試料から得た変性蛋白質を用いるウエスタン
ブロット（ＳＤＳ−ＰＡＧＥのニトロセルロースブロットなど）を行う。好まし
くは、濃度スキャニング及びウエスタンブロットのシグナル形成等の定量的検出
を行う。変性したＮＦ−ＡＴｃエピトープに結合したモノクローナル又はポリク
ローナル抗体は、公知の方法で、標識付けした二次抗体又は標識付けした黄色ブ
ドウ球菌蛋白質Ａを用いて、目視又は他の工学的手段によって同定することがで
きる。一般には、変性ＮＦ−ＡＴｃを標的抗原として用いて、より多くのエピト
ープが結合に関与するようにする。

【０１１７】

【表３】 表ＩＩ 選択されたヒトＮＦ−ＡＴｃ抗原ペプチド −NAIFLTVSREHERVGC−（配列番号２５）； −LHGYLENEPLMLQLFIGT−（配列番号２６）； −PSTSPRASVTEESWLG−（配列番号２７）； −GPAPRAGGTMKSAEEEHYG−（配列番号２８）； −ASAGGHPIVQ−（配列番号２９）； −NTRVRLVFRV−（配列番号３０）； −AKTDRDLCKPNSLVVEIPPFRN−（配列番号３１）； −EVQPKSHHRAHYETEGSR−（配列番号３２）； −SPRVSVTDDSWLGNT−（配列番号３３）； −SHHRAHYETEGSRGAV−（配列番号３４）； −LRNSDIELRKGETDIGR−（配列番号３５）；及び −TLSLQVASNPIEC−（配列番号３６）

【０１１８】 表ＩＩに示したようなＮＦ−ＡＴｃ配列は、（例えばバクテリオファージ抗体
呈示ライブラリーをスクリーニングする又はウサギを免疫化することを目的に）
直接、免疫原性ペプチドとして用いてもよいし、担体巨大分子（例えばＢＳＡ）
に連結させてもよいし、免疫原として用いられる融合蛋白質の一部を構成しても
よい。好ましいＮＦ−ＡＴｃポリペプチドは、下記のアミノ酸配列 −NAIFLTVSREHERVGC−（配列番号２５）； −PSTSPRASVTEESWLG−（配列番号２７）； −SPRVSVTDDSWLGNT−（配列番号３３）；及び −SHHRAHYETEGSRGAV−（配列番号３４）； を包含し、さらに他の介在及び／又は末端配列を包含してもよい。一般にそのよ
うなポリペプチドは１０００アミノ酸未満であり、より一般には５００アミノ酸
未満である。他のスペーサーペプチド配列又は末端ペプチド配列が存在する場合
には、それらは天然に産するポリペプチド配列、一般には哺乳類のポリペプチド
配列に相当する。上に挙げた好ましいＮＦ−ＡＴｃポリペプチドの適用例として
は、好適な動物中でα−ＮＦ−ＡＴｃ抗体を作製する市販の免疫原として、及び
／又は本発明により提供される抗ＮＦ−ＡＴｃ抗体とともに用いる、定量的イラ
イザ（例えば競合イライザ）用又は競合ＲＩＡ用の市販の免疫診断試薬として用
いるものである。例えばヒトにおけるＮＦ−ＡＴｃ発現リンパ球性白血病、又は
細胞型の決定、Ｔ細胞（活性化したＴ細胞及び／又は活性化できるＴ細胞等）の
同定を目的とした、そのような免疫学的検定法の標準化の較正に用いるものであ
る。上に挙げた好ましいＮＦ−ＡＴｃポリペプチドには、免疫原又は免疫学的試
薬として用いる他に、多くの用途が考えられる。上に挙げた１個以上の配列は、
ヒト血清アルブミン、ＧＳＴ等の融合パートナーと共に、融合蛋白質内に組み込
むことができる。望ましい場合には、アミノ酸が１０００個を越える融合蛋白質
用に、融合パートナー（アルブミン）における欠失を行って約１０００アミノ酸
未満にすることもできる。

【０１１９】 ある態様においては、少なくとも２個の共有結合（通常ペプチド結合）したＮ
Ｆ−ＡＴｃ免疫原性エピトープを包含する、多価のＮＦ−ＡＴｃ抗原を用いるこ
とが望ましい。そのような多価ＮＦ−ＡＴｃ抗原は、一般に同じ種（例えばヒト
やマウス）由来の複数のＮＦ−ＡＴｃ抗原性ペプチドを包含するが、異なる種の
ＮＦ−ＡＴｃ蛋白質由来の抗原性ペプチド混合物（すなわち異種間ＮＦ−ＡＴｃ
多価抗原）を包含してもよい。一般的に、多価抗原の一次アミノ酸配列において
、抗原性ペプチド配列の空間的順序は、天然に産するＮＦ−ＡＴｃ蛋白質と同じ
方向で現われる。すなわち、天然に産するＮＦ−ＡＴｃ蛋白質中の第二の抗原性
ペプチド配列のアミノ末端側にある第一の抗原性ペプチド配列は、多価抗原中の
該第二の抗原性ペプチド配列のアミノ末端側にくる。一般に、スペーサーペプチ
ド配列は、多価抗原中の抗原性ペプチド配列の連結に用いられる。そのようなス
ペーサー配列は所与のものでも、ランダムでも、擬似ランダムのものであっても
よい。スペーサーペプチド配列は、多価抗原で免疫化される動物に対して非免疫
原であると知られる配列（例えば動物に耐性を与えるのに用いた配列）に相当す
るものであってもよい。そのような多価抗原として多くの例が考えられる。下記
に挙げる態様は例証であって限定するものではない。 −NAIFLTVSREHERVGC−（ａａ１）（配列番号２５）−AKTDRDLCKPNSLVVEIPPFRN−
（ａａ２）（配列番号３１）−GILKLRNSDIELRKGETD−（配列番号３７）

【０１２０】 ここで（ａａ１）及び（ａａ２）は、少なくとも１個、１０００個未満のアミ
ノ酸のペプチドスペーサーであり；ａａ１はａａ２ペプチド配列から独立して選
択されるペプチド配列であり；（複数の異なるアミノ酸で構成されうる）ａａ１
の長さは、（複数の異なるアミノ酸で構成されうる）ａａ２の長さとは独立して
いる。

【０１２１】 免疫原性ＮＦ−ＡＴｃペプチドは、動物を免疫化し、抗ＮＦ−ＡＴｃ抗体を作
製する及び／又はハイブリドーマライブラリー作製用の脾臓細胞源とするのに用
いることができる。このライブラリーからは、１×１０⁷Ｍ^-1以上、好ましくは
少なくとも１×１０⁸Ｍ^-1〜１×１０⁹Ｍ^-1の親和性でＮＦ−ＡＴｃ蛋白質に結合
するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマクローンが選択される。その
ような免疫原性ＮＦ−ＡＴｃペプチドを用いて、バクテリオファージ抗体呈示ラ
イブラリーを直接スクリーニングすることもできる。

【０１２２】 そのような抗体の１つの使用例として、好ましくはヒト又はマウスの様々な組
織ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡを含むｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングす
ることが挙げられる。このスクリーニングによって、構造的に関連した、免疫交
差反応性蛋白質（新規な転写要素候補又はクロマチン蛋白質）をコードするｃＤ
ＮＡ挿入を含むクローンを同定することができる。ｃＤＮＡ発現ライブラリーの
そのようなスクリーニングは、当分野において知られている（Young他、Proc.Na tl.Acad.Sci.U.S.A .８０：１１９４−１１９８（１９８３）や他の文献、参照し
て説明に代える）。そのような抗体の他の用途としては、抗体を作製するのに用
いられる天然ＮＦ−ＡＴｃ蛋白質又は対応するＮＦ−ＡＴｃ断片（例えば機能領
域、ＤＮＡ結合領域）に、構造的又は進化的に関係した免疫交差反応性蛋白質の
同定及び／又は精製が挙げられる。そのような抗体は、市販されている他の抗体
（及び制限酵素やポリメラーゼなどの生物学的試薬）と同じように、研究用の試
薬として市販されること考えられる。

【０１２３】 そのような抗体の他の様々な用途として、白血病又は他の免疫学的疾病状態の
診断及び／又は病期識別、（カチオン化抗体として又は標的化リポソーム運搬に
よる）新形成、過剰免疫機能、移植片拒絶などの治療が挙げられる。 ＮＦ−ＡＴｃポリペプチドの例としては、下記の配列を有するポリペプチドが
挙げられる。 MPSTSFPVPSKFPLGPAAAVFGRGETLGPAPRAGGTMKSAEEEHYGYASSNVSPALPLPTAHSTLPAPCHNL
QTSTPGIIPPADHPSGYGAALDGCPAGYFLSSGHTRPDGAPALESPRIEITSCLGLYHNNNQFFHDVEVEDV
LPSSKRSPSTATLSLPSLEAYRDPSCLSPASSLSSRSCNSEASSYESNYSYPYASPQTSPWQSPCVSPKTTD
PEEGFPRGLGACTLLGSPQHSPSTSPRASVTEESWLGARSSRPASPCNKRKYSLNGRQPPYSPHHSPTPSPH
GSPRVSVTDDSWLGNTTQYTSSAIVAAINALTTDSSLDLGDGVPVKSRKTTLEQPPSVALKVEPVGEDLGSP
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DLCKPNSLVVEIPPFRNQRITSPVHVSFYVCNGKRKRSQYQRFTYLPANGNAIFLTVSREHERVGCFF（配
列番号３８）

【０１２４】 抗体を調製するための他に好ましい抗原としては、リン酸化ＮＦ−ＡＴポリペ
プチド又はその領域が挙げられる。例えば、本発明はリン酸化ＮＦ−ＡＴｃポリ
ペプチドに特異的に結合するが、リン酸化していないＮＦ−ＡＴｃポリペプチド
には結合しない抗体を提供する。ＮＦ−ＡＴｃポリペプチドはセリン（ＳＲＲ、
ＳＰ１、ＳＰ２、ＳＰ３又はこれらの繰返し配列間に位置するセリン）において
リン酸化できる。上記抗体は、これらのリン酸化領域をＮＬＳから遮蔽すること
ができ、よって細胞核内へのＮＦ−ＡＴｃ移行が起こりやすくなる。あるいは、
（例えば診断において）そのような抗体を用いて、リン酸化形態を特異的に検出
することができる。

【０１２５】 Ｇ.ＮＦ−ＡＴｃに結合する蛋白質の同定及び単離 ＮＦ−ＡＴｃ及び／又はＮＦ−ＡＴ−ＤＮＡ複合体に結合する蛋白質は、転写
調節蛋白質として潜在的に重要である。そのような蛋白質は、新規な免疫調節剤
の標的となりうる。これらの蛋白質を、以下副（accessory）蛋白質と称する。
副蛋白質は公知の様々な方法で単離することができる。

【０１２６】 副蛋白質を単離する好ましい方法の一つとして、ＮＦ−ＡＴｃポリペプチドを
ＮＦ−ＡＴｃポリペプチドに結合する抗体に接触させ、得られる免疫複合体を単
離するものが挙げられる。これらの免疫複合体は、ＮＦ−ＡＴｃポリペプチドに
結合した副蛋白質を含みうる。副蛋白質は、免疫複合体を変性剤、好ましくは還
元剤で変性することによって同定及び単離することができる。変性された、好ま
しくは還元された蛋白質は、ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動することがで
きる。推定副蛋白質を、１以上の公知の方法（例えばクーマシー染色、ウエスタ
ンブロット、銀染色）によってポリアクリルアミドゲル上で同定し、該当の同定
ポリペプチドを含むポリアクリルアミドゲルの部分を切除し、ゲル部分からポリ
ペプチドを溶出することによって、単離することができる。

【０１２７】 推定副蛋白質は、ＮＦ−ＡＴC及び／又はＮＦ−ＡＴ−ＤＮＡ複合体との結合
を実証することによって副蛋白質と同定することができる。そのような結合は様
々な方法で、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動法による単離に続いて復元
された推定副蛋白質を用いる結合アッセイなど（但しこの例に限定されるもので
はない）で、 生体外で起こることを示すことができる。或いは、組換え又は化
学合成した推定副蛋白質を用いる結合アッセイを行うこともできる。例えば、推
定副蛋白質を単離し、アミノ酸配列の全て又は部分をエドマン分解法等の化学的
配列決定法によって決定することができる。アミノ酸配列の情報は、推定副蛋白
質の化学合成に用いることができる。さらに、アミノ酸配列は、（１）推定副蛋
白質をコードするｃＤＮＡクローンを、アミノ酸配列データに従った縮重オリゴ
ヌクレオチドプローブでスクリーニングすることによってｃＤＮＡライブラリー
から単離し、（２）宿主細胞内でｃＤＮＡを発現し、そして（３）推定副蛋白質
を単離するという工程で、組換え推定副蛋白質を作製するのに用いることもでき
る。或いは、ＮＦ−ＡＴｃポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをオリゴ
ヌクレオチド合成によって作製し、発現ベクター内に入れ、宿主細胞内で発現さ
せることもできる。

【０１２８】 生体外でＮＦ−ＡＴｃ及び／又はＮＦ−ＡＴ−ＤＮＡ複合体と結合する推定副
蛋白質は、副蛋白質と同定される。副蛋白質は、二機能架橋剤（例えばジメチル
スベルイミド酸塩、グルタルアルデヒド等）による生体内での架橋、及びそれに
続くＮＦ−ＡＴｃポリペプチドを含む架橋産物の単離によって同定することがで
きる（架橋の一般論については、Kunkel他（１９８１）Mol.Cell.Biochem.３４
：３を参照。参照して説明に代える）。好ましくは、二機能架橋剤による架橋は
特殊な条件下で可逆的なものである。それにより、架橋複合体を単離した後、Ｎ
Ｆ−ＡＴｃポリペプチドからの副蛋白質の単離が容易になる。ＮＦ−ＡＴｃポリ
ペプチドを含む架橋複合体の単離は、好ましくはＮＦ−ＡＴｃポリペプチドに少
なくとも１×１０⁷Ｍ^-1の親和性で結合する抗体を架橋複合体の集合体に結合さ
せ、抗体に少なくとも１×１０⁷Ｍ^-1の親和性で結合した複合体のみを回収する
ことによって行う。

【０１２９】 好適な結合条件下で、ＮＦ−ＡＴｃの副蛋白質（例えばＡＰ−１）への結合を
阻害する（下記参照）、候補免疫調節剤のを同定するためのスクリーニングアッ
セイを開発することができる。

【０１３０】 酵母菌複合体検出システムを用いて、哺乳動物（一般にはヒト）ｃＤＮＡ発現
ライブラリーをスクリーニングすることができる。ここではｃＤＮＡがＧＡＬ４
ＤＮＡ結合領域又は活性化領域に融合し、ＮＦ−ＡＴｃポリペプチド配列がそ
れぞれＧＡＬ４活性化領域又はＤＮＡ結合領域に融合する。そのような酵母菌複
合体検出システムは、ＮＦ−ＡＴｃ配列に結合する蛋白質をコードするｃＤＮＡ
についてスクリーニングすることができる。例えば、ｃＤＮＡライブラリーを、
ヒト成熟Ｔ細胞系統又は他の好適な細胞型から得たｍＲＮＡから作製することが
できる。酵母菌複合体検出システムにおいてクローンされるそのようなｃＤＮＡ
ライブラリー（Chien他（１９９１）Proc.Nati.Acad.Sci.（U.S.A.）８８：９５
７８又はCell７２：２３３）を用いて、ＮＦ−ＡＴｃに相互作用する蛋白質をコ
ードするｃＤＮＡを同定し、よってＧＡＬ４依存レポーター遺伝子を発現させる
ことができる。ＮＦ−ＡＴｃに相互作用するポリペプチドは、抗体を用いるＮＦ
−ＡＴｃの免疫沈降と、共沈降する種の確認によっても同定することができる。
さらに、ＮＦ−ＡＴｃに結合するポリペプチドは、ペプチドライブラリー（例え
ばバクテリオファージペプチド呈示ライブラリー、空間的に画定したVLSIPSペプ
チド整列など）を、ＮＦ−ＡＴｃポリペプチドによってスクリーニングすること
によって同定することができる。

【０１３１】 Ｈ．本発明の診断及び予後方法の例証 本発明は、被験者中の免疫抑制状態の決定、免疫抑制剤の適当な用量の決定方
法を含む、診断及び予後方法を提供する。 本発明の一つの好ましい態様にあっては、ＮＦ−ＡＴｃ遺伝子を特異的に同定
するハイブリダイゼーションプローブを、遺伝病の診断に用いることができる。
例えば、診断される遺伝病として、ＮＦ−ＡＴｃ構造又は調節配列に関連した損
傷、並びに関連したＮＦ−ＡＴｃ遺伝子座における制限断片長多型性又はＤＮＡ
配列多型性によって同定される、ＮＦ−ＡＴｃ遺伝子座に密接に関連した遺伝子
座における損傷が挙げられる（ただしこれらに限定されるものではない）。さら
に他の好ましい態様においては、ＮＦ−ＡＴｃ遺伝子プローブを、免疫学的疾病
の素因に関係する遺伝子病の診断又は同定に用いることができる。そこでの内生
ＮＦ−ＡＴｃの量及び機能性は、個人における免疫疾患、特に免疫不全、関節炎
又は自己免疫疾患が進行する可能性が高まったことを示すのに充分である。

【０１３２】 本発明は更に、被験者の免疫抑制状態を決定する方法を提供する。一つの態様
においては、方法は被験者の細胞内（好ましくはリンパ球）の細胞質及び／又は
核ＮＦ−ＡＴポリペプチドレベルを決定することを包含する。方法は、被験者か
ら血液試料を得て、例えばＮＦ−ＡＴに特異的に結合する抗体を用いる免疫組織
化学によって細胞質及び／又は核ＮＦ−ＡＴの量を調べることを包含する（本明
細書に詳述する）。好ましい態様にあっては、本発明は、被験者の赤血球をＴ細
胞活性化化合物及び／又はカルシウムイオノフォアと共に培養し、ＮＦ−ＡＴの
細胞移行を調べることを包含する。実際に、患者が免疫抑制されている場合、患
者のリンパ球を刺激してもＮＦ−ＡＴの核への有意な移動は起こらない。好まし
いＴ細胞活性化剤は、レクチン、コンカナバリン−Ａ（Ｃｏｎ−Ａ）及び植物性
赤血球凝集（ＰＨＡ）などのポリクローナル活性化剤である。他の活性化剤とし
て、Ｔ細胞受容体又はＣＤ３上の不変枠エピトープに結合する抗体が挙げられる
。

【０１３３】 ＮＦ−ＡＴを検出する好ましい方法は、１個以上のＮＦ−ＡＴｃ蛋白質に特異
的に結合する抗体を用いる免疫蛍光法である。好ましいモノクローナル抗体は、
Northrop他（１９９４）Nature３６９：４９７に記載の７Ａ６抗体である。 好ましい態様において、被験者から得た細胞を繁殖させたもの、例えば単核細
胞に富む血液試料について、試験を行う。例えば公知の方法によって細胞を軟膜
上の血液試料から分離することによって、末梢血単核細胞を得ることができる

【０１３４】 次に被験者のリンパ球中の核及び／又は細胞質ＮＦ−ＡＴのレベルを、対照被
検者の核及び／又は細胞質ＮＦ−ＡＴと比較する。「対照」被検者又は「正常」
被検者とは、ＮＦ−ＡＴ活性化に関与する疾病または病状、例えば炎症又は自己
免疫疾患がないことが分かっており、細胞試料を採取した時点で他に治療を受け
ていない被験者のことをいう。正常標準値は、正常被験者からの幾つかの細胞試
料を分析することによって確立することができる。次いで患者からの試料を分析
し、標準との比較を行う。

【０１３５】 好ましい態様においては、この診断法を用いて免疫抑制処置（例えばサイクロ
スポリンＡ）を受けている被験者の免疫抑制状態をモニターすることができる。
一つの態様においては、被験者から細胞を得て、Ｔ細胞活性化剤（例えばＰＨＡ
）と共に細胞を培養する前及び／又は後で、ＮＦ−ＡＴの細胞移行を調べる。分
析の結果、患者に核ＮＦ−ＡＴを有するリンパ球（すなわち活性化リンパ球）の
数が多いと判明した場合、患者に追加の免疫抑制剤を投与する。従って、患者の
病状を追跡して適量の免疫抑制剤を患者に投与することができ、余分な量の免疫
抑制剤を投与することなく、免疫抑制状態を保つのに充分な量だけ投与すること
ができる。

【０１３６】 他の態様においては、本発明は被験者の、ある特定の免疫抑制剤、例えばサイ
クロスポリンＡに対する感受性を調べる方法を提供する。一つの態様においては
、被験者からリンパ球を得て、様々な量の免疫抑制剤の存在下に様々な時間でリ
ンパ球を生体外培養し、ＮＦ−ＡＴの細胞移行を調べる。この分析結果を、１以
上の正常被験者から得たリンパ球を用いた同様の分析結果と比較することで、平
均的な人に比べて被験者の免疫抑制剤に対する感受性が多いか少ないかが示され
る。この分析は、生体内でも行うことができる。例えば、ある用量の免疫抑制剤
を被験者に投与して、被験者のリンパ球中のＮＦ−ＡＴ細胞移行を様々な時点で
調べ、正常被験者のデータと比較する。正常被験者の標準値を予め用意しておき
、分析を行って標準値と比較することもできる。従って、そのような試験の結果
に基づいて、医師は被験者に投与する免疫抑制剤の有効量をより的確に予想する
ことができ、被験者にとって有毒となりうる過剰な免疫抑制剤投与を回避するこ
とができる。

【０１３７】 他の態様においては、本発明は、望ましくない心血管成長を含む疾病の進行の
危機を調べ、さらにそのように診断された場合には、疾病の病因を同定する方法
を提供する。後者の場合、疾病におけるＮＦ−ＡＴ蛋白質の役割など、疾病を分
子レベルで理解することで、正しい治療過程（すなわち、ある特定の治療が効果
的かどうか）を決定し、再発を示す予後マーカーとしてＮＦ−ＡＴを用いる処置
工程の見通しを立てるのに有用である。 主題の方法のそのような態様は、ＮＦ−ＡＴ遺伝子における変化、例えば点突
然変異、欠失、付加、染色体再配列、メチル化パターンにおける変化や、蛋白質
の発現レベルにおける変化、蛋白質回転の速度（ユビキチン依存性又は非依存性
）、リン酸化／脱リン酸化の速度、及び／又は蛋白質の細胞移行を検出すること
を含む。

【０１３８】 Ｉ．薬剤作製及びスクリーニングアッセイの方法 本発明は更に、ＮＦ−ＡＴ蛋白質の活性を変調する化合物を同定するスクリー
ニングアッセイを提供する。スクリーニングアッセイは、生体内又は生体外で行
うことができ、細胞に基づくフォーマットでも細胞を用いないフォーマットでも
行うことができる。これらの剤としては、ＮＦ−ＡＴ蛋白質又はＮＦ−ＡＴ蛋白
質を含む複合体の内因性活性を強化する又は阻害する化合物、ＮＦ−ＡＴ蛋白質
と他の蛋白質又は核酸との相互作用に干渉する化合物、ＮＦ−ＡＴ蛋白質の（例
えばホスファターゼ又はキナーゼなどの酵素による）ある種の翻訳後修飾の速度
を変える化合物、ＮＦ−ＡＴ蛋白質の発現を阻害するアンチセンス構造体、ゲノ
ムＤＮＡの応答要素に対するＮＦ−ＡＴ蛋白質の結合を児湯号的に阻害する核酸
デコイ、並びに改変され（突然変異し）て優性機能減少又は機能獲得活性を提供
するＮＦ−ＡＴ蛋白質形態を包含する化合物が挙げられるが、これらに限定され
るものではない。一つの態様において、本発明のスクリーニング方法は、筋細胞
等の細胞の肥大進行を変調する、特に阻害することのできる、あるいは細胞の肥
大を減少することのできる、剤の同定を企図する。

【０１３９】 好ましい態様においては、主題の薬剤スクリーニングアッセイは、特異なＮＦ
−ＡＴパラログ（paralog）への選択性を検出することを企図するように実施さ
れる。例えば、ある好ましい態様においては、ＮＦ−ＡＴｃ３及び／又はＮＦ−
ＡＴｃ４に対して選択的であるが、ＮＦ−ＡＴｃ１又はＮＦ−ＡＴｃ２に対して
は選択的でないＮＦ−ＡＴ アンタゴニストを検出するようにアッセイが設定さ
れる。例えば、生体内でのＥＤ５０によるＮＦ−ＡＴｃ３又はＮＦ−ＡＴｃ４の
阻害が、ＥＤ５０によるＮＦ−ＡＴｃ１又はＮＦ−ＡＴｃ２活性の阻害より少な
くとも１、より好ましくは２、３、４、５桁小さくなるようにＮＦ−ＡＴアンタ
ゴニストを選択することができる。

【０１４０】 そのような選択性があるので、２個以上のＮＦ−ＡＴパラログ間にある、ＤＮ
Ａ認識要素、蛋白質−蛋白質相互作用、及び／又はＮＦ−ＡＴ蛋白質の翻訳後修
に対する特異性における差異を利用することができる。従って、ここに記載した
アッセイはいずれも、２個以上の異なるＮＦ−ＡＴパラログを用いて並行して行
うことができ、化合物の同定はＮＦ−ＡＴ蛋白質の生物学的活性に影響を与える
能力のみに基づいて行われるのではなく、アッセイに用いるＮＦ−ＡＴパラログ
間と同様に選択的に影響を与える能力にも基づいている。

【０１４１】 この点について、本発明は、主題のＮＦ−ＡＴ蛋白質の正常な細胞機能につい
ての、又は、正常な又は異常な細胞機能（例えば筋細胞肥大及びそれに関連した
疾患）の病因論的なこれら蛋白質の役割についての、アゴニスト又はアンタゴニ
ストのいずれかの剤を同定するアッセイを提供する。一つの態様においては、ア
ッセイは、ＮＦ−ＡＴ蛋白質と他の蛋白質、ＤＮＡ又はＲＮＡとの結合を変調す
る化合物の能力を評価する。他の態様においては、アッセイは、リン酸化及び／
又は蛋白質の折りたたみにおける変化といった、ＮＦ−ＡＴ蛋白質の翻訳後修飾
を阻害又は強化する化合物を検出する。更に他の態様は、ＮＦ−ＡＴ蛋白質の細
胞移行における変化を検出する。本アッセイによって同定された化合物は、例え
ば細胞肥大、特に筋細胞肥大によって起こる疾病又は病状の処置に用いられる。
例えば、本発明の化合物を、鬱血性心臓病の治療に用いることができる。

【０１４２】 ＮＦ−ＡＴ蛋白質のアゴニスト又はアンタゴニストとして作用する能力の有無
を試験される剤には、例えば、バクテリア、酵母菌又は他の生物体によってされ
たもの（例えば天然に存在する産物）、化学的に作製したもの（例えばペプチド
模倣体等の小分子など）、又は組換え技術によって作製したものなどがある。好
ましい態様においては、試験剤は、約２,０００ダルトン未満の分子量を有する
小さな有機分子である。分子調節体に直接結合する剤の高速スクリーニングでは
、固定化又は「標識付け」組み合わせライブラリー（又は容易に解析できるライ
ブラリー）を用いることができる。

【０１４３】 薬剤スクリーニングアッセイで活性を有すると同定された剤は、細胞肥大進行
を阻害する能力及び／又は細胞の肥大を減少させる能力について、試験される候
補である。下に述べるように、これらの剤は、心臓梗塞及び鬱血性心臓病を含む
心臓の病状を治療又は回避するのに有用であろう。

【０１４４】 本発明の開示を鑑みるに、様々なアッセイフォーマットが可能であり、ここに
詳述されなかったものも当業者によって理解されて然るべきである。例えば、ア
ッセイを様々なフォーマットで作製することができ、（精製蛋白質又は細胞溶解
物などの）細胞を用いないシステム、（未反応の細胞などの）細胞を用いるシス
テムなどが含まれる。単純な結合アッセイを用いて、ＮＦ−ＡＴ蛋白質が関与す
る蛋白質−蛋白質又は蛋白質−ＤＮＡ相互作用を強化又は阻害することのできる
化合物を検出するなど、剤を検出することもできる。

【０１４５】 化合物及び天然抽出物のライブラリーを試験する、多くの薬剤スクリーニング
プログラムにおいて、所与の時間内に調べる化合物の数を最大化するために、高
処理量アッセイが望ましい。細胞を用いない（例えば精製又は半精製蛋白質、又
は細胞溶解物を用いる）システムにおいて実施される本発明のアッセイは、試験
化合物によって媒介される分子標的の変化の迅速な発現及び比較的簡単な検出と
いう点から、「一次」スクリーニングとして好まれる。その上更に、試験化合物
の細胞毒性及び／又は生物学的利用能の影響は生体外系では一般に無視できるの
で、アッセイは、他の蛋白質との結合親和性の変化又は分子標的の酵素特性の変
化に現われる、分子標的に与える薬剤の効果に主に焦点を当てることができる。

【０１４６】 従って、本発明の例証的なスクリーニングアッセイにおいては、ＮＦ−ＡＴ蛋
白質、試験化合物及び「標的分子」、例えばＮＦ−ＡＴ蛋白質と相互作用する蛋
白質又は核酸を含む反応混合物を作製する。ＮＦ−ＡＴ蛋白質と標的分子との相
互作用の検出及び定量化によって、ＮＦ−ＡＴ蛋白質と標的分子との相互作用の
阻害又は強化における、化合物の効力を調べる方法が提供される。化合物の効力
は、様々な濃度の試験化合物を用いて得たデータから用量反応曲線を作製するこ
とによって評価することができる。その上更に、対照アッセイを行って比較用の
基線を提供することもできる。対照アッセイにおいて、ＮＦ−ＡＴ蛋白質と標的
分子との相互作用は、試験化合物の非存在下に定量化する。ＮＦ−ＡＴ蛋白質と
ＮＦ−ＡＴ結合パートナーとの相互作用は、様々な技術によって検出することが
できる。複合体形成の変調は、例えば検出可能に標識付けした蛋白質（放射性同
位元素標識付け、蛍光標識付け、又は酵素標識付けしたＮＦ−ＡＴ蛋白質又はＮ
Ｆ−ＡＴ結合パートナー等）を用いて、又はクロマトグラフ検出によって定量化
することができる。

【０１４７】 一般に、ＮＦ−ＡＴ又はその結合パートナーのいずれかを固定化して、片方又
は両方の蛋白質で未複合形態のものから、複合体を分離し、アッセイを自動化す
るのが望ましい。ＮＦ−ＡＴのＮＦ−ＡＴ結合パートナーへの結合は反応物を含
むのに好適な容器であればどのようなものの中でも行うことができる。例として
は、マイクロタイタープレート、試験管、マイクロ遠心分離管が挙げられる。一
つの態様において、蛋白質が基質に結合することを可能にする領域を付加した、
融合蛋白質が提供される。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／Ｎ
Ｆ−ＡＴ（ＧＳＴ／ＮＦ−ＡＴ）融合蛋白質を、グルタチオンセファロースビー
ズ（Sigma Chemical、ミズーリ州セントルイス）又はグルタチオン変性マイクロ
タイタープレート上に吸収させ、ＮＦ−ＡＴ結合パートナー（例えば³⁵Ｓ標識Ｎ
Ｆ−ＡＴ結合パートナー）及び試験化合物と合わせ、複合体形成に誘導する条件
下（例えば塩及びｐＨについて生理的条件、望ましくはやや緊縮な条件）で混合
物を培養することができる。培養に続いて、ビーズを洗浄して未結合の標識を除
去し、基質に固定化し、（例えば発光状態に置いて）直接又は複合体を解離した
のち上澄液中で、放射性同位元素標識を確認する。あるいは、複合体を基質から
解離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ビーズ画分中に見つかったＮＦ−ＡＴ蛋白
質又はＮＦ−ＡＴ結合パートナーのレベルを、標準的な電気泳動法（例えば付属
の実施例に記したもの）を用いてゲルから定量化することができる。

【０１４８】 蛋白質を基質上に固定化する他の方法も、主題のアッセイに用いることができ
る。例えば、ＮＦ−ＡＴ又はその同族結合パートナーのいずれかを、ビオチンと
ストレプトアビジンとの連結体を用いて固定化することができる。例えば、ビオ
チン化ＮＦ−ＡＴ分子を、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド
）から公知の方法（例えばビオチン化キット、Pierce Chemicals、イリノイ州ロ
ックフォード）で調製し、ストレプトアビジンで被覆した９６ウェルプレート（
Pierce Chemical）のウェルに固定化することができる。あるいは、ＮＦ−ＡＴ
に反応する抗体を、プレートのウェルに固着させ、抗体との結合によってＮＦ−
ＡＴをウェルに捕える。上記したように、ＮＦ−ＡＴ結合蛋白質及び試験化合物
調製物を、ＮＦ−ＡＴを呈示するプレートのウェル内で培養し、ウェルに捕えら
れた複合体の量を定量することができる。ＧＳＴ−固定化複合体について上記し
たものの他に、そのような複合体を検出する方法の例として、ＮＦ−ＡＴ結合パ
ートナーに反応する、又はＮＦ−ＡＴ蛋白質に反応して結合パートナーと競合す
る抗体を用いた、複合体の免疫検出；内因性又は外因性の活性いずれかの、結合
パートナーに関連した酵素活性の検出に依存した酵素結合アッセイが挙げられる
。後者の場合、酵素を化学的連結することもできるし、あるいはＮＦ−ＡＴ結合
パートナーとの融合蛋白質として提供することもできる。例証のために、ＮＦ−
ＡＴ結合パートナーを化学的に架橋させるか又はセイヨウワサビペルオキシダー
ゼに遺伝子工学的に融合させ、複合体に捕えられたポリペプチドの量を、酵素の
色素基質（例えば３，３'−ジアミノ−ベンザジンテトラヒドロクロリド又は４
−クロロ−１−ナフトール）を用いて評価することができる。同様に、ポリペプ
チド及びグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを包含する融合蛋白質を提供す
ることができ、１−クロロ−２,４−ジニトロベンゼンを用いてＧＳＴ活性を検
出することによって複合体形成を定量化することができる（Habig他（１９７４
）J Biol Chem２４９：７１３０）。

【０１４９】 複合体に捕えられた１以上の蛋白質の定量化に免疫検出を用いている方法では
、蛋白質に対する抗体（抗ＮＦ−ＡＴ抗体など）を用いることができる。あるい
は、複合体中に検出できる蛋白質は、ＮＦ−ＡＴ配列の他に、抗体を容易に用意
する（例えば市販のものを用いる）ことのできる第二のポリペプチドを含む、融
合蛋白質の形態で「エピトープ標識付け」することができる。例えば，上記した
ＧＳＴ融合蛋白質は、ＧＳＴ基に対する抗体を用いる結合の定量化に用いること
ができる。他に有用なエピトープ標識は、ｃ−ｍｙｃからの１０残基配列を含む
ｍｙｃ−エピトープ（例えばEllison他（１９９１）J Biol Chem２６６：２１１
５０−２１１５７参照）、ｐＦＬＡＧシステム（International Biotechnologie
s, Inc.）、又はｐＥＺＺ−蛋白質Ａシステム（Pharmacia、ニュージャージー州
）が挙げられる。

【０１５０】 分子間、特にＮＦ−ＡＴとＮＦ−ＡＴ結合パートナーとの相互作用は、光学的
現象である表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を検出するリアルタイムＢＩＡ（生体
分子相互作用分析、Pharmacia Biosensor AB）によって同定することができる。
検出は、生物学的に特異な界面における巨大分子の質量濃度における変化に依存
しており、相互作用体の標識を必要としない。一つの態様においては、試験化合
物のライブラリーを、例えば微小流動細胞の壁の一つを形成する、センサー表面
上に固定化することができる。次いで、ＮＦ−ＡＴ蛋白質、その機能的断片、Ｎ
Ｆ−ＡＴ類似体又はＮＦ−ＡＴ結合パートナーを含む溶液を、センサー表面上に
連続的に流す。シグナルを記録する際に共鳴角度に変化があった場合、相互作用
が起きたことを意味する（この技術の更なる記述については、例えばPharmacia
のＢＩＡ技術マニュアル参照）。

【０１５１】 上記したスクリーニングアッセイは、一般に以下のように行うことができる。
構成要素の一つはＮＦ−ＡＴ又はその部分であり、他の構成要素はＮＦ−ＡＴ結
合パートナーと称する、例えばＮＦ−ＡＴ分子又はその部分、キナーゼ、又はカ
ルシニューリンなどのホスファターゼである。従って、本発明の例証的なスクリ
ーニングアッセイは、（ａ）（ｉ）ＮＦ−ＡＴポリペプチド、（ｉｉ）ＮＦ−Ａ
Ｔ結合パートナー、及び（ｉｉｉ）試験化合物を含む反応混合物を作製し；そし
て（ｂ）ＮＦ−ＡＴとＮＦ−ＡＴ結合蛋白質との相互作用を検出する段階を包含
する。反応混合物は、細胞を含まない蛋白質調製物、例えば再構成蛋白質混合物
又は細胞溶解物であってもよいし、組換え技術によってＮＦ−ＡＴ蛋白質を発現
する、異種核酸を含む組換え細胞であってもよい。例えば本明細書に記載したよ
うに、ＮＦ−ＡＴポリペプチド及びＮＦ−ＡＴ結合パートナーを、組換え技術に
よって作製してもよいし、例えば細胞抽出物などから精製してもよいし、化学的
に合成してもよい。試験化合物が存在しない場合のＮＦ−ＡＴとＮＦ−ＡＴ結合
蛋白質との相互作用に比較して、試験化合物の存在下での相互作用における統計
上の有意な変化（増加又は阻害）は、試験化合物にＮＦ−ＡＴ対生物活性のアゴ
ニスト（模倣体又は相乗因子）又はアンタゴニスト（阻害剤）の潜在能力がある
ことを示している。このアッセイの試験化合物は、同時に接触させることができ
る。あるいは、ＮＦ−ＡＴ蛋白質をまず試験化合物に適当な時間接触させ、次い
でＮＦ−ＡＴ結合パートナーを反応混合物に添加することもできる。化合物の効
力は、様々な濃度の試験化合物を用いて得たデータから用量反応曲線を作製する
ことによって評価することができる。その上更に、対照アッセイを行って比較用
の基線を提供することもできる。対照アッセイにおいては、ＮＦ−ＡＴ結合パー
トナー又はＮＦ−ＡＴポリペプチドを含む組成物に、単離及び精製されたＮＦ−
ＡＴポリペプチド又は結合パートナーを添加し、複合体の形成を試験化合物の非
存在下に定量化する。

【０１５２】 本発明は更に、ＮＦ−ＡＴ分子のリン酸化又は脱リン酸化を変調する化合物を
同定するスクリーニングアッセイを提供する。この点において、ＮＦ−ＡＴアン
タゴニストは、少なくとも心臓肥大の処置に関して、ＮＦ−ＡＴ蛋白質の脱リン
酸化を阻害する又はリン酸化を強化する剤である。アッセイのある態様において
は、ＮＦ−ＡＴポリペプチドのリン酸化における変化を直接検出するのが望まし
いこともある。

【０１５３】 一つの態様において、アッセイは生体外アッセイである。一つの態様において
、アッセイは、非リン酸化又は部分リン酸化したＮＦ−ＡＴポリペプチドを、細
胞抽出物あるいは１以上の精製キナーゼ（ＧＳＫ−３、ＰＫＡ等）、及び（リン
酸塩源を含み、試験化合物を含む又は含まない）生体外キナーゼアッセイに必要
な他の構成物質に、ＮＦ−ＡＴのリン酸化が起こる条件下で接触させることを包
含する。試験化合物の存在下又及び非存在下におけるＮＦ−ＡＴのリン酸化状態
を比較することによって、試験化合物がＮＦ−ＡＴのリン酸化を減少させた（阻
害した）か、あるいは増加させた（誘導した）かが示される。キナーゼアッセイ
及び細胞抽出物の調製は、実施例に記載するように行うことができる。キナーゼ
アッセイの前にＮＦ−ＡＴポリペプチドを部分的にリン酸化するには、例えば非
リン酸化ＮＦ−ＡＴをＰＫＡと共に予め培養する。ＰＫＡでリン酸化したＮＦ−
ＡＴは、ＧＳＫ−３によるリン酸化を阻害する化合物を同定するアッセイの構成
物質として用いることができる。というのは、ＧＳＫ−３はＰＫＡによってリン
酸化されたペプチドをリン酸化するからである。非リン酸化又は部分リン酸化Ｎ
Ｆ−ＡＴを、活性化した例えば核ＮＦ−ＡＴを含む細胞から得ることもできる。
従って、本発明に用いるＮＦ−ＡＴ基質は、活性化したＴ細胞の核抽出物から得
る又は核抽出物に存在する。

【０１５４】 他の態様において、キナーゼアッセイは生体内キナーゼアッセイである。アッ
セイは、非リン酸化又は部分リン酸化ＮＦ−ＡＴを発現する細胞（例えば活性化
Ｔ細胞）を、試験化合物と共に培養し、試験化合物の存在下及び非存在下におけ
るＮＦ−ＡＴのリン酸化状態を比較することを包含する。異なったリン酸化状態
が存在することは、試験化合物がＮＦ−ＡＴのリン酸化を変調できることを意味
する。ＮＦ−ＡＴのリン酸化状態は、例えば（放射性同位元素などで）標識付け
したリン酸塩（例えばＡＴＰ）の存在下に細胞を培養し、ＮＦ−ＡＴに特異な抗
体を用いた免疫沈降に存在する標識の量を測定することによって、調べることが
できる。あるいは、リン酸化の状態は、ウェスタンブロット分析で、場合によっ
ては免疫沈降を組み合わせて、調べることができる。

【０１５５】 他の態様において、本発明はＮＦ−ＡＴの脱リン酸化を変調する化合物、例え
ばＮＦ−ＡＴ蛋白質のカルシニューリン媒介脱リン酸化の阻害剤を同定するスク
リーニングアッセイを提供する。一つの態様において、アッセイはリン酸化ＮＦ
−ＡＴポリペプチドを、細胞抽出物又は１以上のホスファターゼ（例えばカルシ
ニューリン）並びに試験化合物と共に、ＮＦ−ＡＴポリペプチドがホスファター
ゼの触媒作用を受ける条件下で培養することを包含する。ＮＦ−ＡＴはＰＫＡ及
び場合によってはさらにＧＳＫ−３で、生体外でリン酸化することができ、ＮＦ
−ＡＴは細胞抽出物でリン酸化することができる。ＮＦ−ＡＴは、細胞抽出物か
ら単離するまたは細胞抽出物中に存在させることもできる。試験化合物の存在下
及び非存在下におけるホスファターゼ反応ののち、ＮＦ−ＡＴのリン酸化状態を
比較することで、試験化合物がＮＦ−ＡＴのリン酸化を変調できるかどうかがわ
かる。試験化合物の非存在下でのリン酸化に比べて、より高いリン酸化ＮＦ−Ａ
Ｔレベルが試験化合物の存在下で示されたということは、化合物がＮＦ−ＡＴ脱
リン酸化の阻害剤であることを意味する。より低いレベルが示された場合には、
試験化合物は脱リン酸化の誘導剤であることを意味する。ＮＦ−ＡＴのリン酸化
状態は、上記したように調べることができる。

【０１５６】 更に他の態様において、薬剤スクリーニングアッセイがＮＦ−ＡＴ蛋白質を発
現する細胞全体を含むように企図することができる。試験剤に、ＮＦ−ＡＴ蛋白
質の活性を変える能力があるかどうかは、組換え細胞の分析によって検出するこ
とができる。例えば、ＮＦ−ＡＴ蛋白質の生物学的活性のアゴニスト及びアンタ
ゴニストは、細胞の肥大における変化を評価することによって検出することがで
きる。そのような変化を検出する一般的な方法は公知のものであり、さらにここ
に詳述する。細胞を用いるアッセイにおいて、組み換え細胞は好ましくは哺乳動
物細胞、例えばヒト細胞である。好ましい態様において、細胞は筋肉細胞、最も
好ましくは筋細胞である。

【０１５７】 形態の研究に加えて、ＮＦ−ＡＴ蛋白質依存性活性に応答する、細胞内の第二
のメッセンジャーレベルにおける変化を、検出することができる。例えば、様々
な態様にあって、ＮＦ−ＡＴのリン酸化パターンにおいて又は転写をＮＦ−ＡＴ
に依存する遺伝子の発現において変化を引き起こす能力が、試験剤にあるかどう
かを、アッセイによって評価することができる。細胞内シグナルにおける変化、
例えば第二のメッセンジャーにおける又は遺伝子発現における変化を検出するこ
とによって、ＮＦ−ＡＴ蛋白質依存性シグナリングのアゴニスト及びアンタゴニ
スト候補を、同定することができる。

【０１５８】 標的遺伝子、例えばＮＦ−ＡＴ依存性転写制御要素を有する遺伝子のアップレ
ギュレーション又はダウンレギュレーションに応答する標的遺伝子から、転写調
節配列を選択し、場合によってはさらにそのようなプロモーターをレポーター遺
伝子に連結することによって、本発明は、ＮＦ−ＡＴ蛋白質に依存するシグナリ
ング回路に影響を与える特異な試験化合物の能力に敏感な、転写に基づくアッセ
イを提供する。

【０１５９】 例証的な態様にあっては、主題のアッセイは、細胞を用いるアッセイで、ＮＦ
−ＡＴ蛋白質によるシグナリングに反応する転写調節配列によって制御される遺
伝子の発現レベルにおける変化を検出することを包含する。本発明の、レポータ
ー遺伝子に基づくアッセイにより、上記した事象（例えば転写調節）のカスケー
ドの最終段階を測定する。従って、アッセイの一つの実施態様において、ＮＦ−
ＡＴ蛋白質によるシグナリングに依存する検出シグナルを得るために、レポータ
ー遺伝子構造体を試薬細胞内に挿入する。従ってレポーター遺伝子の発現は、Ｎ
Ｆ−ＡＴ蛋白質依存性シグナリングのアゴニスト又はアンタゴニストとして作用
する化合物の開発用の、貴重なスクリーニング手段を提供する。

【０１６０】 アッセイの一つの実施態様において、ＮＦ−ＡＴ蛋白質により産生される第二
のメッセンジャーに依存する検出シグナルを得るために、レポーター遺伝子構造
体を試薬細胞内に挿入する。一般に、レポーター遺伝子構造体は、ＮＦ−ＡＴ蛋
白質からのシグナルトランスダクションに応答する１個以上の転写調節要素に、
操作可能に連結したレポーター遺伝子を含む。ここではレポーター遺伝子の発現
レベルが検出シグナルを提供する。レポーター遺伝子からの転写量は、当業者に
好適であるとされるものであればどのような方法を用いても測定することができ
る。例えば、レポーター遺伝子からのｍＲＮＡ発現は、リボヌクレアーゼ保護又
はＲＮＡに基づくＰＣＲを用いて検出することができるし、或いはレポーター遺
伝子の蛋白質産物を、特徴的な染色又は内因性活性によって同定することができ
る。次いでレポーター遺伝子の発現量を、試験化合物の非存在下においた同じ細
胞と比較するか、或いは標的受容体蛋白質を欠く実質的に同一の細胞における転
写量と比較することができる。転写量の統計的な或いは有意な差は、試験化合物
がＮＦ−ＡＴ蛋白質の誘導活性を何らかの方法で変化させたことを意味する。

【０１６１】 下に詳述するように、好ましい態様において、レポーターの遺伝子産物を、産
物に関連した内因性活性によって検出することができる。例えば、レポーター遺
伝子は、酵素活性によって（色、蛍光、発光に基づく）検出シグナルを発生する
遺伝子産物をコードすることができる。他の好ましい態様においては、レポータ
ー又は標識遺伝子は、選択的な成長における利点を提供する。例えばレポーター
遺伝子は細胞の生存力を強化し、細胞の必須栄養条件を緩和し、及び／又は薬剤
への耐性を与える。多くのレポーター遺伝子が当業者に公知であり、他のレポー
ター遺伝子も、当業者に同定及び合成が可能である。レポーター遺伝子は、検出
可能な遺伝子産物（ＲＮＡ又は蛋白質など）を発現する遺伝子であればどのよう
なものでも含まれる。

【０１６２】 好ましいレポーター遺伝子は、容易に検出できるものである。レポーター遺伝
子は、望ましい転写調節配列を含む又は他の望ましい性質を示す遺伝子と融合し
た遺伝子の形態をとる構造体に含まれても良い。レポーター遺伝子の例としては
、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）（Alton及びVap
nek（１９７９）Nature２８２：８６４−８６９）ルシフェラーゼ、及び他の酵
素検出システム、例えばβ−ガラクトシダーゼ；ホタルルシフェラーゼ（deWet
他（１９８７）Mol.Cell.Biol.７：７２５−７３７）；バクテリアルシフェラー
ゼ（Engebrecht及びSilverman（１９８４）PNAS１：４１５４−４１５８；Baldw
in他（１９８４）Biochemistry２３：３６６３−３６６７）；アルカリホスファ
ターゼ（Toh他（１９８９）Eur.J.Biochem.１８２：２３１−２３８、Hall他（
１９８３）J.Mol.Appl.Gen.２：１０１）、ヒト胎盤分泌アルカリホスファター
ゼ（Cullen及びMalim（１９９２）Methods in Enzymol.２１６：３６２−３６８
）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【０１６３】 薬剤スクリーニングの更に他の態様において、複合体アッセイをＮＦ−ＡＴ蛋
白質及び標的分子で作製することができる。薬剤に依存する、相互作用の阻害又
は強化が評価される。当分野で知られる複合体アッセイのフォーマットを、その
ような薬剤スクリーニングの態様に容易に適応させることができる（例えば米国
特許第５,２８３,３１７号、第５,５８０,７３６号及び第５,６９５,９４１号；
Zervos他（１９９３）Cell７２：２２３−２３２；Madura他（１９９３）J Biol
Chem２６８：１２０４６−１２０５４；Bartel他（１９９３）Biotechniques１
４：９２０−９２４；及びIwabuchi他（１９９３）Oncogene８：１６９３−１６
９６参照）。

【０１６４】 ＮＦ−ＡＴの脱リン酸化を変調する化合物は、細胞を用いるアッセイにおいて
も同定することができる。例えば、リン酸化ＮＦ−ＡＴを含む細胞を、試験化合
物の存在下又は非存在下に培養し、ＮＦ−ＡＴのリン酸化を上記したように調べ
る。例えば、化合物の有するＮＦ−ＡＴのリン酸化／脱リン酸化を変調する能力
を、リン酸化した残基に対する抗体を用いるコロニー免疫ブロット法（Lyons及
びNelson（１９８４）PNAS８１：７４２６−７４３０）でスクリーニングするこ
とができる。その様なアッセイに用いる試薬は、本明細書に詳述する。

【０１６５】 更に他の態様において、本発明は、ＮＦ−ＡＴの核への移動を変調する化合物
を同定する、細胞を用いるスクリーニングアッセイにして、試験化合物の存在下
又は非存在下に細胞を培養又は処理し、細胞中のＮＦ−ＡＴの移行、すなわちＮ
Ｆ−ＡＴが細胞の細胞質及び／又は核に存在するかどうかを調べることを包含す
るアッセイを提供する。一つの態様において、細胞質にＮＦ−ＡＴを含む細胞（
例えば静止Ｔ細胞又はJurkat細胞）を、試験化合物と共に培養し、ＮＦ−ＡＴの
細胞移行を調べる。核内にＮＦ−ＡＴが存在する場合、試験化合物が細胞質から
核へのＮＦ−ＡＴの移動を誘導することを意味する。他の態様においては、細胞
質にＮＦ−ＡＴを含む細胞を、試験化合物及び、ＮＦ−ＡＴ活性化剤すなわち核
への移動の誘導剤の存在下に培養し、ＮＦ−ＡＴの細胞移行を調べる。試験化合
物で処理しなかった細胞に比較して試験化合物と培養した細胞の細胞質中により
多くのＮＦ−ＡＴが移行している場合には、試験化合物は細胞質から核へのＮＦ
−ＡＴの移動を阻害し、すなわち試験化合物はＮＦ−ＡＴ阻害剤である。或いは
、試験化合物と培養しなかった細胞に比較して試験化合物と共に培養した細胞の
核内により多くのＮＦ−ＡＴが存在する場合には、試験化合物はＮＦ−ＡＴの誘
導剤又は活性化剤である。

【０１６６】 本発明は更に、ＮＦ−ＡＴの活性を変調する化合物を同定するスクリーニング
アッセイを提供する。スクリーニングアッセイは生体内又は生体外で行うことが
でき、細胞を用いるフォーマット又は細胞を用いないフォーマットのいずれでも
行うことができる。好ましい態様においては、アッセイは核膜を通じるＮＦ−Ａ
Ｔの移動を変調する化合物の同定を可能にする。より好ましい態様においては、
スクリーニングアッセイは、ＮＦ−ＡＴ ＮＬＳを、ＮＦ−ＡＴ分子又はＮＬＳ
の結合に充分なその部分、及び試験化合物又は試験化合物のライブラリーに接触
することを包含する。一つの態様においては、ＮＬＳはアミノ酸配列CNKRKYSLN
（配列番号５３）（Ｎ末端ＮＬＳ）を包含する。他の態様においては、ＮＬＳは
アミノ酸配列GKRKK／R（配列番号６７）（Ｃ末端ＮＬＳ）を包含する。スクリー
ニングアッセイの他の構成要素としては、ＮＦ−ＡＴ分子のＳＲＲ、ＳＰ１、Ｓ
Ｐ２及び／又はＳＰ３を包含するペプチドなどが挙げられる。好ましい態様にお
いては、スクリーニングアッセイは、リン酸化された、Ｎ末端ＮＬＳ及びＳＲＲ
領域を包含するペプチドを包含する。 他の態様においては、スクリーニングアッセイは、リン酸化された、Ｃ末端Ｎ
ＬＳ及びＳＰ１、ＳＰ２及び／又はＳＰ３領域を包含するペプチドを包含する。

【０１６７】 スクリーニングアッセイの他の態様においては、アッセイの一つの構成要素は
、ＮＦ−ＡＴポリペプチド又はカルシニューリンの結合に充分なその部分であり
、他の構成要素はカルシニューリン又はＮＦ−ＡＴの結合に充分なその部分であ
る。ＮＦ−ＡＴの部分は、Ｎ末端部分、例えば配列番号３８のアミノ酸１−４１
８であってもよい。従って、一つの態様にあっては、スクリーニングアッセイは
、試験化合物の存在下でＮＦ−ＡＴポリペプチドが相互作用できる条件下で、Ｎ
Ｆ−ＡＴポリペプチドをカルシニューリン及び試験化合物に接触させることを包
含する。試験化合物の存在下及び非存在下におけるアッセイの２個の構成要素の
結合を比較することで、試験化合物がＮＦ−ＡＴとカルシニューリンとの相互作
用を阻害したか、あるいは誘導したかを調べることができる。

【０１６８】 他の態様においては、スクリーニングアッセイは核ＮＦ−ＡＴを含む細胞（例
えばイオノマイシンで処理したＴ細胞などの、活性化Ｔ細胞）を培養し、試験化
合物に接触させ、ＮＦ−ＡＴ細胞移行を調べることを包含する。試験化合物で処
理しなかった細胞に比較して、試験化合物で処理した細胞の核内により多くのＮ
Ｆ−ＡＴが移行する場合には、試験化合物は、ＮＦ−ＡＴを活性状態すなわち核
内に保持することのできる化合物である。試験化合物で処理しなかった細胞に比
較して、試験化合物で処理した細胞の細胞質内により多くのＮＦ−ＡＴが移行す
る場合には、試験化合物は、ＮＦ−ＡＴを失活させることのできる、すなわち細
胞質への移動を誘導することのできる化合物である。

【０１６９】 ＮＦ−ＡＴ分子の細胞移行を、例えばＮＦ−ＡＴと特異的に相互作用する抗体
又は他の剤を用いて、細胞内への移行を検出することによって調べることができ
る。例えば、実施例に記載するように、ＮＦ−ＡＴは免疫蛍光法によって検出す
ることができる。他の態様においては、検出可能な標識に融合したＮＦ−ＡＴポ
リペプチドをコードする核酸で細胞をトランスフェクトすることができる。例え
ば、ｍｙｃ標識に融合したＮＦ−ＡＴポリペプチドを発現するように細胞を作製
することができ、ｍｙｃ標識に特異的に結合する抗体でＮＦ−ＡＴ融合ポリペプ
チドを検出することができる。

【０１７０】 細胞の肥大状態を変調することのできる他の剤としては、ＮＦ−ＡＴ蛋白質の
ＤＮＡ結合部位の結合に競合する核酸、例えば「デコイ」核酸が挙げられる。好
ましい核酸は、ＮＦ−ＡＴのＤＮＡ結合部位を包含する。これらの剤は、１個の
ＮＦ−ＡＴポリペプチドのみの結合を阻害することもできるし、或いは様々なＮ
Ｆ−ＡＴ族のほとんど又は全てのＤＮＡ結合部位への結合を阻害するように企図
することもできる。

【０１７１】 上記した薬剤スクリーニングアッセイなどによって同定することのできる小分
子に加えて、細胞の肥大を変調することのできる他の剤としては、ＮＦ−ＡＴ蛋
白質のペプチド領域（断片）、分子調節体の突然変異体が挙げられる。ここでい
う「突然変異体」とは、天然に産するペプチド又は蛋白質とは少なくとも１個の
アミノ酸が異なるアミノ酸配列を有するペプチドのことをいう。突然変異体は、
天然に産する蛋白質と同じ生物学的及び免疫学的活性を有していても良い。しか
し、突然変異体の生物学的又は免疫学的活性は、異なる又は欠損していても良い
。例えば、蛋白質突然変異体は、天然に産する蛋白質の機能のアゴニスト、アン
タゴニスト（競合的又は非競合的）、又は部分的アゴニストとして作用すること
ができる。

【０１７２】 例えば、ＮＦ−ＡＴ蛋白質の同族体（アゴニスト及びアンタゴニストの両形態
）を、アラニンスキャニング突然変異誘発（Ruf他（１９９４）Biochemistry３
３：１５６５−１５７２；Wang他（１９９４）J. Biol. Chem.２６９：３０９５
−３０９９；Balint他（１９９３）Gene１３７：１０９−１１８；Grodberg他（
１９９３）Eur.J.Biochem.２１８：５９７−６０１；Nagashima他（１９９３）J
. Biol. Chem.２６８：２８８８−２８９２；Lowman他（１９９１）Biochemistr
y３０：１０８３２−１０８３８；及びCunningham他（１９８９）Science２４４
：１０８１−１０８５）；リンカースキャニング突然変異誘発（Gustin他（１９
９３）Virology１９３：６５３−６６０；Brown他（１９９２）Mol.Cell Biol.
１２：２６４４−２６５２；McKnight他（１９８２）Science２３２：３１６）
；飽和突然変異誘発（Meyers他（１９８６）Science２３２：６１３）；ＰＣＲ
突然変異誘発（Leung他（１９８９）Method Cell Mol Biol１：１１−１９）；
又はランダム突然変異誘発（Miller他（１９９２）A Short Course in Bacteria
l Genetics、CSHL Press、Cold Spring Harbor、ニューヨーク；及びGreener他
（１９９４）Strategies in Mol Biol７：３２−３４）などを用いて作製するこ
とができる。リンカースキャニング突然変異誘発は、特に組み合わせて用いられ
る場合には、末端切断した（例えば構成的に活性な又は優性陰性の）ＮＦ−ＡＴ
蛋白質を同定する、有効な好ましい方法である。

【０１７３】 本発明は更に、主題のＮＦ−ＡＴ蛋白質を変形して、肥大状態の細胞（例えば
筋細胞）で基準のＮＦ−ＡＴ蛋白質の効果に干渉しあるいは模倣する、模倣体（
例えばペプチド又は非ペプチド剤）を作製することを企図する。そのようなペプ
チド模倣体は、細胞肥大を変調する薬剤として作用することができる。

【０１７４】 ペプチド模倣体は一般に製薬業界では、模擬ペプチドに類似した特性を有す得
る非ペプチド薬剤を含むものとして理解されている。ペプチド模倣体の構造の原
理及び使用は、公知のものである（例えばFauchere、Adv.Drug Res.１５：２９
（１９８６）；及びEvans他、J.Med.Chem.３０：１２２９（１９８７）参照）。
治療上有用なペプチドに構造上の類似性を有するペプチド模倣体を用いて、同等
の治療効果又は予防効果を得ることができる。一般に、そのようなペプチド模倣
体は、１個以上のペプチド結合を有するが、その結合は場合によっては望ましい
特性（生体内での化学的切断に対する耐性）を与える結合に置換されても良い。
このような結合の例としては、−ＣＨ₂ＮＨ−、−ＣＨ₂Ｓ−、−ＣＨ₂−ＣＨ₂−
、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＯＣＨ₂−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ₂−及び−ＣＨ₂ＳＯ−
が挙げられる。ペプチド模倣体は、強化した薬理学的特性（生物学的半減期、吸
収速度など）、様々な特異性、増加した安定性、生産コストの低減、抗原性の低
下、などの治療用として特に望ましい利点を有することができる。

【０１７５】 上記したような突然変異誘発方法は、蛋白質−蛋白質相互作用に関与する（例
えばロイシンジッパー含有蛋白質への結合に関与する）ＮＦ−ＡＴ蛋白質の決定
子の地図作製に特に有用である。例えば、他の細胞蛋白質（又は核酸）の分子認
識に不可欠なＮＦ−ＡＴ蛋白質の残基を決定し、結合活性の少なくとも一部を保
持するペプチド模倣体の作製に用いることができる。例えば、結合に関与するア
ミノ酸残基の地図作製にスキャニング突然変異誘発を用いることによって、キナ
ーゼとの結合に際してそれらの残基を模倣するペプチド模倣体化合物（例えばジ
アゼピン又はイソキノリン誘導体）を作製することができる。例えば、そのよう
な残基の、非ハイブリダイズ性ペプチド類似体を、ベンゾジアゼピン（例えばFr
eidinger他、Peptides：Chemistry and Biology、G.R.Marshall編、ESCOM Publi
sher：オランダ国ライデン、１９８８中の記事参照）、アゼピン（例えばHuffma
n他、Peptides：Chemistry and Biology、G.R.Marshall編、ESCOM Publisher：
オランダ国ライデン、１９８８中の記事参照）、置換γラクタム環（Garvey他、 Peptides：Chemistry and Biology 、G.R.Marshall編、ESCOM Publisher：オラン
ダ国ライデン、１９８８中の記事）、ケト−メチレン擬似ペプチド（Ewenson他
（１９８６）J.Med.Chem.２９：２９５；及びEwenson他、Peptides：Structure
and Function中の記事（第９回アメリカペプチドシンポジウムの議事録）Pierce
Chemical Co.、イリノイ州ロックランド、１９８５）、β回転ジペプチドコア
（Nagai他（１９８５）Tetrahedron Lett２６：６４７；及びSato他（１９８６
）J Chem Soc Perkin Trans１：１２３１）、及びβ−アミノアルコール（Gordo
n他（１９８５）Biochem Biophys Res Commun１２６：４１９；及びDann他（１
９８６）Biochem Biophys Res Commun１３４：７１）を用いて作製することがで
きる。

【０１７６】 ＮＦ−ＡＴｃポリペプチド、特にＮＦ−ＡＴ複合体に直接接触する部分を、Ｎ
Ｆ−ＡＴ変調剤（例えば抗新生物剤及び免疫調節剤）候補の合理的な薬剤設計に
用いることができる。実質的に精製されたＮＦ−ＡＴｃ、ＮＦ−ＡＴｃの（例え
ばＡＰ−１及びＤＮＡとの）細胞間関係の形成能の同定、並びに細胞間関係の形
成によって、実質的に純粋なＮＦ−ＡＴポリペプチド複合体及びコンピューター
上のモデルを得て、蛋白質X線結晶学又は例えばＤＯＣＫプログラム（Kuntz他（
１９８２）J.Mol.Biol.１６１：２６９；Kuntz ID（１９９２）Science２５７：
１０７８）及びその変異体といった、他の構造分析法に用いることができる。潜
在的な治療薬剤はそうして提供される構造情報に基づいて合理的に設計すること
ができる。一つの態様においては、その様な薬剤を、ＮＦ−ＡＴｃポリペプチド
：ＡＰ−１ポリペプチド複合体の形成を回避するように設計することができる。
他の態様においては、そのような薬剤を、ＮＦ−ＡＴにおける分子内相互作用を
回避するように設計することができる。従って、本発明はＮＦ−ＡＴｃが結合し
てＮＦ−ＡＴ複合体を形成するのを阻害する能力を有する薬剤を含む薬剤の設計
に用いることができる。

【０１７７】 心臓肥大モデル 上記した方法により同定される化合物を、、心臓肥大などの治療剤として更に
評価することができる。用いる心臓肥大モデルの数に制限はない。心臓肥大誘導
の方法には、様々な体液要因、例えばアンギオテンシンＩＩ、フェニレフリン（
ＰＥ）、及びエンドセリン−１（ＥＴ−１）（Karliner他（１９９０）Experien tia ４６：８１、Sadoshima他（１９９３）Circ.Res.７３：４２４、Leite他（１
９９４）Am.J.Physiol.２６７：H２１９３）を用いる。心臓肥大を誘導すること
のできる化合物又はポリペプチド又はポリペプチドをコードする遺伝子を、それ
ぞれここで「肥大誘導」化合物、ポリペプチド、又は遺伝子と称する。内皮細胞
中で産生されることが知られるエンドセリン−１は、生体外で心筋細胞の肥大を
誘導することが幾つかの研究によって示されている（ Shubeita他（１９９０）J .Biol.Chem. 、２６５：２０５５５−２０５６２；Ito他（１９９１）Circ Res６
９：２０９−２１５；Suzuki他（１９９１）J.Cardiovasc.Pharmacol.１７Suppl
７：Ｓ１８２−Ｓ１８６；及び米国特許第５,３４４,６４４号参照）。さらに他
の肥大誘導因子はＬＩＦである（米国特許第５８３７２４１号）。

【０１７８】 筋細胞肥大、例えば心室筋細胞肥大の存在を検出する、生体外及び生体内の方
法が知られている。筋細胞肥大の生体外アッセイには、心房ナトリウム排泄昂進
因子（ＡＮＦ）における細胞サイズの増加及び発現の増加といった、本発明に開
示の方法が挙げられる。細胞サイズの変化が肥大の程度を決定する評価システム
に用いられている。これらの変化は、逆相顕微鏡によって観察することができ、
肥大の程度を０〜７の任意のスケール（７＝充分に肥大した細胞、３＝非誘導細
胞）で評価できる。３及び７の状態は、Simpson他（１９８２）Circulation Res
.５１：７８７−８０１の図２Ａ及びＢそれぞれにみられる。肥大評価値と細胞
表面積（μｍ²）との関係を、線形になるように決定した（相関係数＝０．９９
）。フェニレフリン誘導肥大において, 接触させなかった（正常）細胞は肥大値
が３、表面積／細胞が５８１ｍｕ ｍ²であり、充分に肥大した細胞は肥大値が
７、表面積／細胞が１８１１ｍｕ ｍ²あるいは正常細胞の約２００％である。
肥大値４の細胞は、表面積／細胞が７７１μｍ²であり、非接触細胞より約３０
％大きい。肥大値５の細胞は、表面積／細胞が１１０９μｍ²あるいは非接触細
胞より約９０％大きい。肥大値６の細胞は、表面積／細胞が１３６６μｍ²又は
非接触細胞より約１３５％大きい。心室筋細胞肥大の存在は、好ましくは約１５
％（肥大値３.５）以上大きさの増加した細胞を含む。上記のアッセイによって
評価される最大肥大応答を誘導する能力は、肥大誘導剤によって異なる。例えば
、エンドセリンによって誘導される細胞の寸法における最大の増加は、肥大値に
して約５である。

【０１７９】 肥大アッセイを、以下のように行うことができる。まず、筋細胞懸濁液を調製
する（Chien他（１９８５）J.Clin.Invest７５：１７７０−１７８０及びIwaki
他、上述参照）。１−２日Sprague−Dawleyラットの心臓から、心室を除去して
三等分する。刻んだ心室を、一連のコラゲナーゼ処理で消化する。得られる単一
細胞懸濁液を、不連続パーコール勾配によって精製した結果、純度９５％の筋細
胞の懸濁液が得られる。

【０１８０】 次いで、筋細胞をLong他、上述の方法で培養する。この方法は、細胞懸濁液を
ＭＥＭ／５％ウシ血清中に３０分、予め培養することを含む。次いで、インシュ
リン、トランスフェリン、ＢｒｄＵ及びウシ血清アルブミンを補った血清非含有
ＭＥＭを含む３５ｍｍ組織培養皿に７.５×１０⁴細胞／ｍＬの密度で、未固着の
筋細胞を培養する。筋細胞の培養は、Ｄ−ＭＥＭ／１９９／５％ウマ血清／５％
胎児ウシ血清を含む１０ｃｍ組織培養皿に３×１０⁵細胞／ｍＬで培養すること
もできる。２４時間培養したのち細胞を洗浄して血清非含有Ｄ−ＭＥＭ／１９９
で培養する。

【０１８１】 筋細胞を培養し、小型化アッセイで試験容量増加させる方法は、以下の通りで
ある。９６ウェル組織培養プレートのウェルをＤ−ＭＥＭ／Ｆ１２／４％胎児ウ
シ血清を用いて３７℃で８時間被覆する。この培養基を除去し、インシュリン、
トランスフェリン及びアプロチニンを補ったＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２中に７.５×
１０⁴細胞／ｍＬの割合で細胞を懸濁した液を内側の６０ウェルに入れる。培養
基は一般に、ペニシリン／ストレプトマイシン等の抗生物質及びグルタミンを含
んでいる。この培養基を用いることによって、この低い培養密度で、血清なしに
細胞が生存することができる。細胞を２４時間培養したのち、例えばＮＦ−ＡＴ
アンタゴニスト等の試験物質を直接ウェルに添加する。

【０１８２】 αアドレナリン性アゴニスト又はエンドセリンで誘導した後、培養基中の新生
ラット心筋細胞は、鬱血生心不全に見られる生体内心筋細胞肥大の幾つかの特徴
（細胞の寸法が増加する、個々の収縮性蛋白質が集合して組織的な収縮ユニット
になる量が増加するなど）を顕わす（Chien他、FASEB J.、上述）。これらの変
化は逆相顕微鏡によって観察することができ、肥大の程度を０〜７の任意のスケ
ール（７＝充分に肥大した細胞、３＝非誘導細胞）で評価できる。３及び７の状
態は、Simpson他（１９８２）Circulation Research５１：７８７−８０１にみ
られる。９６ウェル培養の顕微鏡での読み出しを用意にし、恒久的な記録を作成
するために、筋細胞を固定し、適当な試験期間の後、クリスタルバイオレットを
含むメタノール中で染色する。クリスタルバイオレットは、培養している細胞の
染色に一般的に用いられている蛋白質である。加えて、９６ウェルプレートから
アリコートを得て、ＡＮＦ又はＡＮＰの放出などの応答といった、蛋白質標識の
発現をモニターすることができる（例えば米国特許第５５３４６１５号参照）。

【０１８３】 高い細胞密度において、筋細胞は自己誘導肥大を開始することもある。 従って、一つの態様において、肥大を阻害するＮＦ−ＡＴアンタゴニストをス
クリーニングする方法は、以下の段階を包含する。 （ａ）少なくともインシュリン、トランスフェリン及びアプロチニンを補ったＤ
−めＭ／Ｆ−１２培養基中に、約７.５×１０⁴細胞／ｍＬの細胞密度で筋細胞を
懸濁した液を９６ウェルプレートに入れ； （ｂ）肥大誘導因子（例えばＬＩＦ又はエンドセリン）の存在下で細胞を培養し
； （ｃ）検定する試験物質（ＮＦ−ＡＴアンタゴニスト）を添加し； （ｄ）細胞を試験物質と培養し；そして （ｅ）肥大を測定する。 培養基は、細胞の生存力を強化する、ＥＧＦ等の更なる要素を補うことができ
るが、そのような要素は必須ではない。Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２培養基はGibco BR
L（メリーランド州ゲーサーズバーグ）から入手することができる。

【０１８４】 好ましい肥大アッセイは、 （ａ）９６ウェル組織培養プレートのウェルを、子ウシ血清を含む培養基、好ま
しくは４％胎児ウシ血清を含むＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２培養基で予め被覆し（ここ
で好ましくはウェルは培養基を用いて約３７℃で約８時間培養される）； （ｂ）培養基を除去し； （ｃ）インシュリン、トランスフェリン及びアプロチニンを補ったＤ−ＭＥＭ／
Ｆ−１２培養基中に、約７.５×１０⁴細胞／ｍＬの細胞密度で筋細胞を懸濁した
液を内側の６０ウェルに入れ； （ｄ）肥大誘導因子（例えばＬＩＦ又はエンドセリン）の存在下に筋細胞を少な
くとも２時間培養し； （ｅ）試験物質を添加し； （ｆ）試験物質と共に細胞を（好ましくは約２４−７２時間、より好ましくは約
４８時間）培養し；そして （ｇ）好ましくはクリスタルバイオレット染色の後に、例えば顕微鏡で観察する
ことによって肥大を調べる 段階を包含する。

【０１８５】 段階（ｃ）で用いられる培養基は好ましくは、血清を含まないがペニシリン／
ストレプトマイシン（pen／strep）及びグルタミンを含む培養基である。最も好
ましくは、培養基は１００ｍＬ Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２、１００ｍｕＬトランス
フェリン（１０ｍｇ／ｍＬ）、２０ｍｕＬインシュリン（５ｍｇ／ｍＬ）、５０
ｍｕＬアプロチニン（２ｍｇ／ｍＬ）、１ｍＬ pen／strep（JRH Biosciences
No.５９６０２−７７Ｐ）、及び１ｍＬ Ｌ−グルタミン（２００ｍＭ）を含有
する。

【０１８６】 １週間に１０００個の試料を検定し、かつ１００ｍｕ Ｌ未満の小さな試料量
しか必要としないので、現在実施されている方法をして不可能であった、発現ク
ローニング及び蛋白質精製が可能になった。

【０１８７】 肥大を検定する他の方法は、＜１２５＞Ｉ−ラットＡＮＰのラットＡＮＰ受容
体Ａ−ＩｇＧ融合蛋白質への結合に対する競合を調べるアッセイによって放出さ
れる、筋細胞肥大のマーカーである心房ナトリウム排泄昂進ペプチド（ＡＮＰ）
の測定を含む。使用に好適な方法は、ＣＤ４−ＩｇＧ融合蛋白質を用いてＧＰ１
３０を決定する際に使用されている方法と同様である（Chamow他、Biochemistry
２９：９８８５−９８９１（１９９０）参照）。筋細胞の培養、肥大誘導及びア
ッセイについては米国特許第５８３７２４１号に更なる記載がある。

【０１８８】 あるいは、心臓肥大を阻害する本発明の化合物は、ＮＦ−ＡＴｃ活性を阻害す
る化合物のためのスクリーニングによって同定することができる。好ましくは化
合物は、ＮＦ−ＡＴｃ４活性を阻害するが、ＮＦ−ＡＴ族の１種以上の蛋白質す
なわちＮＦ−ＡＴｃ１、ＮＦ−ＡＴｃ２又はＮＦ−ＡＴｃ３及びそのスプライシ
ング変異体の活性を阻害しない。あるいは、本発明に用いられるアンタゴニスト
は、１個以上のＮＦ−ＡＴポリペプチドの活性を阻害するが、全ての活性を阻害
しない。例えば、本発明に用いられるアンタゴニストは、ＮＦ−ＡＴｃ４及びＮ
Ｆ−ＡＴｃ３アンタゴニストであるが、ＮＦ−ＡＴｃ１又はＮＦ−ＡＴｃ２アン
タゴニストではない。ある種のＮＦ−ＡＴポリペプチドのみのアンタゴニストで
あるが、その他に対してはアンタゴニストではない化合物を、ＮＦ−ＡＴ族間の
違いに基づいて作製することができる。例えば、ある種のＮＦ−ＡＴポリペプチ
ドに対して特異的なアンタゴニストは、ＮＦ−ＡＴポリペプチドと特異なＤＮＡ
結合配列との相互作用を阻害する化合物でありうる。ＮＦ−ＡＴポリペプチドは
全てが同じＮＦ−ＡＴ結合配列に結合するわけではないので、ある種のＮＦ−Ａ
Ｔポリペプチドに特異なアンタゴニストを作製することができる。あるいは、あ
る種のＮＦ−ＡＴポリペプチドに特異なアンタゴニストは、ＮＦ−ＡＴ配列にお
ける差異に基づく化合物でありうる。例えば、他のＮＦ−ＡＴポリペプチドの産
生を阻害せずにある種のＮＦ−ＡＴポリペプチドのみの産生を特異的に阻害する
のにアンチセンス化合物を用いることができる。同様に、他のＮＦ−ＡＴ族に影
響を与えることなくある種のＮＦ−ＡＴ族を選択的に破壊するように、リボザイ
ムを設計することができる。

【０１８９】 あるいは、全てのＮＦ−ＡＴ族を阻害することのできる化合物を、これらの蛋
白質間及びそれらをコードする遺伝子間の有意な相同性に基づいて作製すること
もできる。 心臓肥大の阻止又は治療に用いることのできる剤は、動物モデル内でも同定す
ることができる。動物モデルとしては、心臓肥大を進行させたモデルや、本発明
のＮＦ−ＡＴノックアウトマウスと交雑した動物モデルを用いることができる。

【０１９０】 例証的な態様においては、動物モデルは構成的に活性なＮＦ−ＡＴ経路を有す
るトランスジェニックマウスである。そのようなマウスには、構成性カルシニュ
ーリン又は構成性ＮＦ−ＡＴ、例えばＮＦ−ＡＴｃ４を有するものが挙げられる
（例えばOlsen他、Cell９３：２１５（１９９８）参照）。これらのマウスは、
本発明のＮＦ−ＡＴｃ４ノックアウトマウスと交配させることができる。従って
、構成的に活性なＮＦ−ＡＴｃ４シグナリング回路を有し野生型のＮＦ−ＡＴｃ
４を発現するトランスジェニックマウスとは対照的に、構成的に活性なＮＦ−Ａ
Ｔｃ４回路を有するが、野生型ＮＦ−ＡＴｃ４を発現しないマウスは心臓肥大を
進行させない。

【０１９１】 単独で例えばスクリーニングアッセイに用いることのできる他の動物モデルは
、あるいは他のモデルを得るためにＮＦ−ＡＴｃ４ノックアウトマウスと交雑で
きる動物モデルの例としては、ここに述べるような、肥大誘導遺伝子について遺
伝子を導入したマウスが挙げられる。心臓肥大の他の動物モデルの例としては、
肺動脈が狭窄して右心室不全になった圧負荷マウスモデルが挙げられる。心室機
能不全を有するレトロウィルス性マウスモデルを用いることもできる。他の動物
モデルの例としては、ＭＬＣ−ｒａｓマウス及び大動脈絞扼のヘテロ接合型ＩＧ
Ｆ−Ｉ欠陥マウスが挙げられる。更に、筋アクチンプロモーター−ＩＧＦ−Ｉ融
合遺伝子を有するトランスジェニックマウスは、筋疾患又は心不全の兆候をあら
わさずに心筋及び骨格筋の肥大を呈示する。ＩＧＦ−Ｉ−遺伝子−標的マウスは
、心筋形成（及び骨格筋）の欠陥（例えば心室筋収縮性蛋白質遺伝子の発現の顕
著な低減）を呈示する。たの有用な動物モデルの例としては、ＲＸＲα突然変異
マウスモデル（Sucov他（１９９４）Genes Dev.８：１９９７−１０１８）及び
ＲＸＲα−／−胚モデル（Dyson他（１９９５）Proc.Natl.Acad.Sci.（In Press
））が挙げられる。これらの遺伝子に基づく動物モデルは、心室異常形態発生の
重要な特徴を呈示する。

【０１９２】 ＮＦ−ＡＴアンタゴニストは、後壁心筋梗塞ラットモデルにおいて試験するこ
ともできる。このモデルを用いてＡＮＦを産生するヒト鬱血性心不全を予測でき
る。そのようなラットを作成する手順の詳細については、米国特許第５７６７１
５５号を参照できる。以下簡単に述べると、オスSprague−Dawley（Charles Riv
er Breeding Laboratories, Inc.、生後８週間）の冠動脈を結紮することによっ
て心筋梗塞を作り出す（Greenen他（１９８７）J.Appl.Physiol.９３：９２−９
６及びButtrick他（１９９１）Am.J.Physiol.２６０：１１４７３−１１４７９
参照）。結紮の４〜６週間後、ラットの心筋梗塞は心不全へと進行する。梗塞の
進行は、心電図によってモニターすることができる。このモデルにおける鬱血性
心不全は、殆どのヒト患者における鬱血性心不全と酷似している。

【０１９３】 当業者は、上記したスクリーニングアッセイはいずれも、化合物のスクリーニ
ングライブラリーに用いられるように容易に適応させることが可能であると分か
るであろう。本発明のスクリーニングアッセイによって同定される化合物、それ
を包含する薬学的組成物及びキットも本発明の対象とするところである。

【０１９４】 他の特徴において本発明は、治療上有効量の上記した１種以上の化合物を包含
し、１種以上の薬学的に許容可能な担体（添加剤）及び／又は希釈剤と共に配合
する、薬学的に許容可能な組成物を提供する。下に詳述するように、本発明の薬
剤組成物は、下記に挙げる投与形態に適合した固体又は液体の形態で、特に配合
することができる。（１）経口投与、例えば水薬（水溶液又は非水溶液又は懸濁
液）、錠剤、巨丸剤、粉末、顆粒、舌に塗布するペースト；（２）非経口投与、
例えば無菌溶液又は懸濁液の形状での例えば皮下、筋肉内又は静脈内注射；（３
）局所的投与、例えばクリーム、軟膏又は皮膚に塗布するスプレーの形状；又は
（４）膣内又は直腸内、例えばペッサリー、クリーム又は泡の形状。

【０１９５】 ここでいう「治療上有効量」という表現は、本発明のペプチド又はペプチド模
倣体を包含する化合物、材料又は組成物について、医療処置として適用できる合
理的な利益／危険比で、望ましい治療効果が効果的に得られる量のことをいう。
ここでこの治療効果は、少なくとも動物の細胞の部分母集団においてＮＦ−ＡＴ
依存性シグナリング回路を阻害し、処理をした細胞中でその回路の生物学的結果
を封鎖することによって得られる。

【０１９６】 ここでいう「薬学的に許容できる」という表現は、ヒト及び動物組織に、合理的
な利益／危険比に沿って過度の毒性、刺激、アレルギー応答又は他の問題又は合
併症を与えることなく接触して用いられると薬学上判断される、化合物、材料、
組成物及び／又は用量形態のことを参照していう。

【０１９７】 ここでいう「薬学的に許容可能な担体」とは、主題のペプチド模倣体の臓器又
は体の部分から他の臓器又は体の部分への運搬に関与する、液体又は固体充填剤
、希釈液、補形剤、溶液又はカプセル封入した材料などの、薬学的に許容可能な
材料、組成物又は賦形剤のことをいう。各担体は、配合中の他の成分と融和性を
有し、患者に害を与えないという意味において「許容可能」でなければならない
。薬学的に許容可能な担体として用いることのできる他の材料の例としては、（
１）ラクトース、グルコース及びサクロース等の糖類；（２）コーンスターチ及
びジャガイモでんぷん等のでんぷん；（３）ナトリウムカルボキシメチルセルロ
ース、エチルセルロース及び酢酸セルロース等のセルロース及びその誘導体；（
４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）カ
カオ脂及び座薬蝋等の補形剤；（９）ラッカセイ油、綿実油、サフラワー油、ゴ
マ油、オリーブ油、トウモロコシ油及びダイズ油等の油類；（１０）プロピレン
グリコール等のグリコール類；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトル
及びポリエチレングリコール等のポリオール類；（１２）オレイン酸エチル及び
ラウリン酸エチル等のエステル類；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウム
及び水酸化アルミニウム等の緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）発熱因子を
含まない水；（１７）等張食塩水；（１８）リンガー溶液；（１９）エチルアル
コール；（２０）リン酸緩衝液；及び（２１）薬剤配合に用いられる他に非毒性
で融和性の物質、が挙げられる。

【０１９８】 Ｊ．本発明の例証的な使用 本発明は、細胞内のＮＦ−ＡＴの活性を変調する方法を提供する。一つの態様
においては、ＮＦ−ＡＴの活性を他の分子、例えば蛋白質又は核酸との相互作用
によって変調する。特に、ＮＦ−ＡＴの活性は、ＮＦ−ＡＴｃとＡＰ−１又は他
の基本的領域／ロイシンジッパー蛋白質との相互作用を変調することによって変
調することができる。他の態様においては、ＮＦ−ＡＴｃとＤＮＡとの相互作用
、すなわちＮＦ−ＡＴｃ結合部位を、変調することができる。

【０１９９】 好ましい態様において、本発明は核膜を通じるＮＦ−ＡＴの移動を変調する。
例えば、本発明のある種の方法は、細胞質から核へのＮＦ−ＡＴ蛋白質の移動を
誘導又は阻害する。本発明の他の方法は、核から細胞質へのＮＦ−ＡＴ分子の移
動を誘導又は阻害する。例えば、細胞の細胞質から核へのＮＦ−ＡＴの移動は、
少なくとも１個のＮＬＳとＮＦ−ＡＴ分子の他の部分との相互作用を阻害する化
合物を細胞内に導入し、よって少なくとも１個のＮＦ−ＡＴ ＮＬＳの遮蔽を除
去することで誘導することができる。ＮＬＳと他のＮＦ−ＡＴ蛋白質部分との相
互作用を阻害する化合物はペプチド、ペプチド模倣体、核酸又はその誘導体とい
った、小分子であってもよい。好ましい化合物はＮＦ−ＡＴ分子の他の部分（１
個以上の繰返し単位、例えばＳＲＲ、ＳＰ１、ＳＰ２又はＳＰ３など）と分子内
関係を形成することのできるＮＦ−ＡＴ ＮＬＳ、又はその同族体を包含するペ
プチド又はペプチド模倣体である。その様な化合物を更に、ここに記載する。他
に好ましい化合物は、その様なペプチドをコードする核酸である。従って、核酸
をＮＦ−ＡＴを発現する細胞中に導入し、細胞内で発現させる。他に好ましい態
様においては、化合物は、ここに記載するように小分子用スクリーニングライブ
ラリーによって単離することのできる小分子である。化合物は小さくて細胞質膜
を通過できるものが好ましい。

【０２００】 他の態様において本発明は、核から細胞質へのＮＦ−ＡＴの移動を阻害し、よ
ってＮＦ−ＡＴ依存性生物学的活性を阻害する方法を提供する。これは例えば少
なくとも１個のＮＬＳとＮＦ−ＡＴ分子の他の部分との分子内関係を安定させる
ことによって、達成することができる。本方法は、ＮＬＳと、ＳＲＲ、ＳＰ１、
ＳＰ２及びＳＰ３からなる群より選ばれる少なくとも一つのＮＦ−ＡＴ部分との
相互作用を安定化する化合物を、細胞内に導入することを包含する。化合物はこ
こに記載されるように入手することのできる、小分子が好ましい。

【０２０１】 更に他の態様においては、本発明は細胞の核から細胞質へのＮＦ−ＡＴの移動
を誘導し、よってＮＦ−ＡＴ依存性生物学的活性の活性化を阻害する方法を提供
する。これは、例えばＮＦ−ＡＴ分子中の１個以上のＮＬＳを遮蔽することによ
って、達成することができる。例証的な態様においては、細胞内のＮＦ−ＡＴ分
子のＮＬＳ配列は、ＮＬＳ配列に相互作用する化合物を細胞内に導入することに
よって遮蔽することができる。好ましい化合物は、ペプチド又はペプチド模倣体
、例えばＮＦ−ＡＴのＳＲＲ、ＳＰ１、ＳＰ２又はＳＰ３配列からなる群より選
ばれるアミノ酸配列を包含するペプチドが挙げられる。好ましい態様において、
２個の化合物が１個の細胞内に導入される。すなわち、第一の化合物がＮＬＳ
ＫＲＫ（配列番号３８のアミノ酸２６５−２６７）に相互作用し、第二の化合物
がＮＬＳ ＫＲＫＫ／Ｒ（配列番号６６）（配列番号３８のアミノ酸６８２−６
８５）に相互作用する。例えば、ＳＲＲのアミノ酸配列を包含するペプチド、及
びＳＰ１、ＳＰ２及びＳＰ３のうち少なくとも１個のアミノ酸配列を包含するペ
プチドを細胞に投与することができる。

【０２０２】 その上更に本発明は、細胞の核から細胞質へのＮＦ−ＡＴ分子の移動を阻害し
、よってＮＦ−ＡＴ依存性生物学的活性を保持又は延長させる方法を対象とする
。その様な方法は、核内にＮＦ−ＡＴ分子を包含する細胞に、１個以上のＮＬＳ
が分子内関係を形成するのを妨げる化合物を導入することを包含することができ
る。これは、例えばＮＬＳと相互作用することのできるＮＦ−ＡＴ部分と相互作
用する化合物を細胞内に導入することによって達成することができる。例えば化
合物は、ＮＦ−ＡＴ分子の部分、例えばＳＲＲ、ＳＰ１、ＳＰ２及び／又はＳＰ
３繰返し単位と結合することのできる、ＮＬＳペプチド又はその誘導体であって
もよい。ＮＦ−ＡＴｃ族間の配列相同性に少なくとも基づいて、１個のペプチド
は少なくとも２個のＮＦ−ＡＴｃ族と相互作用することができる。この目的に用
いることのできる他の化合物の例としては、その様なペプチド及び小分子をコー
ドする核酸が挙げられる。

【０２０３】 ＮＦ−ＡＴｃポリペプチドの移動を変調する他の方法は、ＮＦ−ＡＴｃのリン
酸化、例えば配列番号３８の約アミノ酸１から約アミノ酸４１８、より好ましく
は配列番号３８の約アミノ酸１７０から約アミノ酸３０１の領域に位置するセリ
ンのリン酸化を変調することを包含する。より好ましくは本方法は、ＳＲＲ、Ｓ
Ｐ１、ＳＰ２及び／又はＳＰ３、及び／又はこれらの繰返し配列間に位置するセ
リンをリン酸化することを包含する。

【０２０４】 ＮＦ−ＡＴｃポリペプチドのリン酸化は、様々な方法によって変調することが
できる。一つの態様においては、ＮＦ−ＡＴｃをリン酸化するキナーゼ（例えば
ＰＫＡ、ＧＳＫ−３α及びＧＳＫ−３β）の活性を変調することでリン酸化を変
調することができる。活性をリン酸化できる他のキナーゼの例としては、ＪＮＫ
−１又はＪＮＫ−２などのＪＮＫ（ｊｕｎキナーゼ）が挙げられる。キナーゼの
蛋白質レベルを変調することによっても、キナーゼの活性を変調することができ
る。例えば、キナーゼの活性の増加は、例えばキナーゼの転写を増加させて、キ
ナーゼの内生蛋白質レベルを増加させることによって達成することができる。或
いはキナーゼの活性は、例えばキナーゼをコードする核酸を導入して、キナーゼ
を細胞内に導入することによっても増加させることができる。実際に、ここに示
すように、Ｔ細胞内でのＧＳＫ−３の過剰な発現は、ＮＦ−ＡＴの核への移動を
阻害し、ＮＦ−ＡＴｃの核外輸送を増加させた。細胞質から核へのＮＦ−ＡＴの
移動誘導は、例えばアンチセンス法を用いてキナーゼの転写又は翻訳を阻害して
、ＮＦ−ＡＴｃをリン酸化するキナーゼの活性を阻害することによって達成する
ことができる。キナーゼの活性は、キナーゼに結合することのできる、活性を阻
害する剤（例えばＮＦ−ＡＴペプチド）を細胞内に導入することによって阻害す
ることもできる。

【０２０５】 他の態様においては、例えばカルシニューリンなどのホスファターゼの活性化
を変調することによって、リン酸化を変調する。これは例えばカルシニューリン
が相互作用できるＮＦ−ＡＴペプチドに接触させて、リン酸化容量を変調するこ
とによって達成することができる。或いは、例えば発現を変調させることによっ
て、又は外生カルシニューリンを導入することによって、又はカルシニューリン
のｍＲＮＡ翻訳を阻害するアンチセンス核酸を導入することによって、細胞内の
カルシニューリンのレベルを変調することができる。

【０２０６】 更に他の態様において本発明は、ＧＳＫ−３等のグルカンシンターゼキナーゼ
によるＮＦ−ＡＴ蛋白質のリン酸化、又はカルシニューリンなどのホスファター
ゼによるＮＦ−ＡＴの脱リン酸化のいずれかを阻害する化合物を提供する。この
点に関して、本適用法は、例えば特に重要な残基、ＮＦ−ＡＴのＧＳＫ−３によ
るリン酸加速度を、試験化合物の存在下又は非存在下でモニターすることに基づ
く薬剤スクリーニングアッセイを提供する。同様に本適用法は、例えば特に重要
な残基、ＮＦ−ＡＴのカルシニューリンによる脱リン酸加速度を、試験化合物の
存在下又は非存在下でモニターすることに基づく薬剤スクリーニングアッセイを
提供する。

【０２０７】 ＧＳＫ−３がＮＦ−ＡＴ蛋白質に特異的なホスファターゼであるというのが我
々の発見の特筆すべき点であり、特定の残基（例えばＮＬＳ部位）がＧＳＫ−３
の基質であることの説明となっている。本発明はＧＳＫ−３を阻害するペプチド
及びペプチド模倣体を提供する。そのような阻害剤は、ＮＦ−ＡＴの４以上の残
基、あるいは４２５残基、より好ましくは４〜１５残基、更により好ましくは４
〜１０残基に相当しうる。好ましくはＮＦ−ＡＴのＧＳＫ−３リン酸化の阻害に
ついての阻害剤のＫｉは１μＭ未満、より好ましくは１００ｍＭ未満、更により
好ましくは１ｎＭ未満である。

【０２０８】 好ましくは、ＧＳＫ−３のペプチド又はペプチド模倣体は、ホスホセリン残基
、又はより好ましくは、その類似体を包含する。ホスホセリン基は、一般式

【化１】 で表わされる。ここでＲは下記からなる群より選ばれる。

【化２】 ここでｉは０又は１〜６の整数であり；Ｘは存在しない又はＯ、Ｓ又はＮを表わ
し；Ｄ₁はＯ又はＳを表わし；Ｄ₂はＮ₃、ＳＨ₂、ＮＨ₂又はＮＯ₂を表わし；そし
てＲ₁₅及びR₁₆はそれぞれ独立に水素、低級アルキル又は薬学的に許容可能な塩
を表わすか、あるいはＲ₁₅及びＲ₁₆はＯ−Ｐ−Ｏ、Ｏ−Ｂ−Ｏ、Ｏ−Ｖ−Ｏ又は
Ｏ−Ａｓ−Ｏ原子と共に、５〜８原子を環状構造に含む完全な複素環を形成する
。好ましい態様において、ホスホセリンは非加水分解性のホスホセリン類似体で
ある。

【０２０９】 本発明のペプチド類似体は、例えばベンゾジアゼピン、置換γラクタム環（Ga
rvey他、Peptides：Chemistry and Biology、G.R.Marshall編、ESCOM Publisher
：オランダ国ライデン、１９８８、p１２３）、C−７模倣体（Huffman他、Pepti
des：Chemistry and Biology、G.R.Marshall編、ESCOM Publisher：オランダ国
ライデン、１９８８、p１０５）、ケト−メチレン擬似ペプチド（Ewenson他（１
９８６）J Med Chem２９：２９５；及びEwenson他、Peptides：Structure and F
unction（第９回アメリカペプチドシンポジウムの議事録、Pierce Chemical Co.
、イリノイ州ロックランド、１９８５）中の記事参照；ｎ回転ジベプチドコア（
Nagai他（１９８５）Tetrahedron Lett２６：６４７；及びSato他（１９８６）J
Chem Soc Perkin Trans１：１２３１）、β−アミノアルコール（Gordon他（１
９８５）Biochem Biophys Res Commun１２６：４１９；及びDann他（１９８６）
Biochem Biophys Res Commun１３４：７１）、ジアミノケトン（Natarajan他（
１９８４）Biochem Biophys Res Commun１２４：１４１）及びメチレンアミノ改
変体（Roark他、Peptides：Chemistry and Biology、G.R.Marshall編、ESCOM Pu
blisher：オランダ国ライデン、１９８８、p１３４）を用いて作成することがで
きる。さらにSession III：Analytic and synthetic methods、Peptides：Chemi
stry and Biology、G.R.Marshall編、ESCOM Publisher：オランダ国ライデン（
１９８８）も参照できる。

【０２１０】 他の例証的な態様において、ペプチド模倣体は、ペプチド配列のretro−inver
so類似体配列、例えばSisto他、米国特許第４,５２２,７５２号に記載のもの；
ペプチドのretro−enatio類似体；トランス−オレフィン誘導体、例えばY.K.Shu
e他（１９８７）Tetrahedron Letters２８：３２２５の方法に従って合成できる
もの；又はホスホン酸エステル誘導体、例えばLoots他、Peptides：Chemistry a
nd Biology（Escom Science Publishers、ライデン、１９８８、p１１８）；Pet
rillo他、Peptides：Structure and Function（第９回アメリカペプチドシンポ
ジウムの議事録、Pierce Chemical Co.、イリノイ州ロックランド、１９８５）
に記載の合成法を適用して作製できるものとして派生させることができる。

【０２１１】 本発明は更に、構成的に活性なＮＦ−ＡＴ、例えばＮＦ−ＡＴポリペプチドを
細胞内に導入することによって、ＮＦ−ＡＴ依存性生物学的活性を活性化する方
法を提供する。そこではＮＬＳは蛋白質の他の部分と分子内相互作用を形成する
ことができず、よってＮＦ−ＡＴ蛋白質を構成的に核に移動させる。そのような
ＮＦ−ＡＴ蛋白質は、例えばＮＦ−ＡＴ蛋白質のＳＲＲ、ＳＰ１、ＳＰ２及び／
又はＳＰ３領域のセリンを、ＮＦ−ＡＴの少なくとも１個のＮＬＳを「遮蔽しな
い」ように置換する。従って、構成的に活性なＮＦ−ＡＴ蛋白質の活性は、蛋白
質をコードする遺伝子の発現を変調することによって変調することができる。例
えば、構成的に活性なＮＦ−ＡＴをコードする遺伝子を、誘導性調節要素の制御
下、例えば転写制御下に置くことができる。

【０２１２】 本発明の方法に基づいて用いることのできる、構成的に活性な他のＮＦ−ＡＴ
ポリペプチドは、１個以上のＮＬＳを包含する。これらは、ＮＦ−ＡＴ ＮＬＳ
又は異種ＮＬＳ、例えばＳＶ４０ large Ｔ抗原ＮＬＳであってもよい。

【０２１３】 あるいは、ＮＦ−ＡＴ依存性生物学的活性を、以下のように変調することがで
きる。構成的に活性になるように突然変異させたＮＦ−ＡＴポリペプチドをリガ
ンド結合領域に融合させ、リガンド結合領域に融合した細胞質保持領域を更に発
現する細胞内で発現し、それによって二量化剤の存在下に、２個の融合蛋白質が
架橋されてＮＦ−ＡＴ蛋白質が細胞質内に保持される。ＮＦ−ＡＴ蛋白質の核へ
の移動は、二量化剤の非存在下、又は除去によって誘導することができる。

【０２１４】 更に他の態様においては本発明は、ＮＦ−ＡＴの優性陰性突然変異体の発現を
調製することによってＮＦ−ＡＴの発現を調節する方法を提供する。一つの態様
においては優性陰性突然変異体は、少なくとも１個の、好ましくは２個のＮＬＳ
が例えば突然変異によって不活化されている、核への移動ができないＮＦ−ＡＴ
蛋白質、例えばＮＦ−ＡＴポリペプチドである。そのような突然変異ＮＦ−ＡＴ
ポリペプチドは、依然としてカルシニューリンと相互作用することができ、従っ
て内生ＮＦ−ＡＴ分子からのカルシニューリンと競合する。

【０２１５】 更に他の態様においては本発明は、細胞内カルシウムに依存しない角膜を通じ
た異種ポリペプチドの移動を調節する方法を提供する。本発明によると、異種ポ
リペプチドは、ＮＦ−ＡＴのＮＬＳ（例えばＣ末端ＮＬＳ）、及びＳＲＲ、ＳＰ
１、ＳＰ２及びＳＰ３からなる群より選ばれるＮＦ−ＡＴ部分と融合する。好ま
しくは、ＮＦ−ＡＴ部分はＳＲＲである。細胞内でのこれらのＮＦ−ＡＴ部分に
融合した異種ポリペプチドの細胞移行は、カルシウムの存在に依存する。従って
通常の条件下では、蛋白質は細胞の細胞質内に移行し、カルシウムイオノフォア
の存在下で、ポリペプチドが核に移動することが予想される。あるいは、異種ポ
リペプチドをＮＬＳのみに融合させ、例えばＮＬＳに相互作用するペプチドを細
胞に添加することによって、細胞内移行を変調することができる。

【０２１６】 その上更にＧＳＫ−３は、ツメガエルの背−腹パターン形成（He他、Nature３
７４、６１７（１９９５））及びショウジョウバエにおける体節極性決定（zest
white３又はshaggy）（Bourouis他、EMBO,J.９、２８７７（１９９０）；Siegf
ried他、Nature３４５、８２５（１９９０））に関与することが示されている。
ＧＳＫ−３はｗｎｔシグナリング経路の負の調製剤であり、ＧＳＫ−３βにおけ
る機能の喪失及び優性陰性突然変異によって、ショウジョウバエとツメガエルの
ｗｎｔ経路が活性化されることが示されている。その上更に、ＧＳＫ−３へのウ
イングレスシグナリング経路が哺乳動物中に保存され（Cook他、EMBO, J.１５、
４５２６（１９９６）；Stambolic他、Curr.Biol.６、１６６４（１９９６））
、ｗｎｔシグナリング経路が脊椎動物の発達及び脊椎動物において中心的な役割
を果たす。従って、ウイングレスシグナリング経路は、これらの遺伝子が共発現
される組織中で、ＮＦ−ＡＴ族の核外輸送を制御するようである。本発明による
と、ウィングレスシグナリング経路を変調する化合物に細胞を接触させることを
包含する、細胞内へのＮＦ−ＡＴ移動を調節する方法が提供される。例えば、細
胞質から核へのＮＦ−ＡＴの移動は、ｗｎｔシグナリング経路の活性化剤によっ
て誘導することができる。更に他の態様においては本発明は、例えばＧＳＫ−３
の活性を変調することを包含する、ウィングレス経路を変調する方法を提供する
。一つの態様においては、ＧＳＫ−３の活性はＧＳＫ−３に結合することができ
、従ってＷｎｔシグナリング経路を活性化できるＮＦ−ＡＴペプチドで阻害され
る。

【０２１７】 本発明の方法は、異常な又は迷走性のＴ細胞活性化に関連した、被験者の疾病
又は病状の治療又は予防に用いることができる。過剰なＴ細胞活性化により起こ
る疾病又は病状の例としては、白血病などの癌、炎症又は自己免疫疾患などが挙
げられる。あるいは、本発明の方法は、被験者（例えば臓器又は骨髄移植患者の
移植片の受容者）の免疫抑制に用いることができる。異常に低いＴ細胞活性化を
含む疾病又は病状の例としては、ＡＩＤＳ等の免疫抑制状態、又は被験者が感染
している状態が挙げられる。従って、例えばウィルス又はバクテリアに感染して
いる被験者に、ＮＦ−ＡＴｃを活性化することによってＴ細胞を活性化し及び感
染に対抗する被験者の免疫系を誘導する化合物を投与して、治療することができ
る。例えば、核内へのＮＦ−ＡＴｃの移行を増加させる化合物（ＮＦ−ＡＴｃの
ＮＬＳとＮＦ−ＡＴ分子の他の部分との分子内相互作用を阻害する化合物など）
を、薬剤的有効量で、局所的又は全身的に被験者に投与することができる。これ
に対して、自己免疫疾患を有する被験者の場合、Ｔ細胞活性化を阻害又は低減さ
せるのが望ましい。従ってこの場合、細胞質内へのＮＦ−ＡＴｃ移行を増加させ
る化合物（ＮＦ−ＡＴｃのＮＬＳを遮蔽する化合物など）を、薬剤的有効量で、
被験者に投与することができる。あるいは、ＧＳＫ−３及び／又はＰＫＡ活性及
びＮＦ−ＡＴリン酸化を活性化する化合物を、被験者に投与することもできる。

【０２１８】 その上更に、ウイングレスシグナリング経路はＧＳＫ−３に関与するので、本
発明はウイングレスシグナリング回路に関連する疾病又は障害、例えば乳癌など
の癌の治療方法を提供する。例えば、そのような疾病を有する被験者に、ＧＳＫ
−３を阻害することのできる化合物、例えばＧＳＫ−３に結合することのできる
ＮＦ−ＡＴペプチドを投与することによって、疾病の治療又は予防をすることが
できる。

【０２１９】 一つの態様において、ここに記載するＮＦ−ＡＴアンタゴニストを、（例えば
細胞培養における又は生体内における）望ましくない血管組織増殖の阻害に用い
ることができる。例えば、主題のアンタゴニストを、心筋細胞及び／又は非筋細
胞（繊維芽細胞）の成長阻害に用いることができる。他の態様においては、主題
の方法を、小動脈平滑筋増殖の阻害に用いることができる。

【０２２０】 例えば、ＮＦ−ＡＴアンタゴニスト、ＮＦ−ＡＴｃ３及び／又はＮＦ−ＡＴｃ
４のアンタゴニストは、心臓障害の処置又は予防の一部として、心臓及び／又は
血管肥大の阻害に用いることができる。例えば、主題のアンタゴニストは、血管
形成術（例えば心臓血管形成術）に続く肥大状態の治療又は阻止、再狭窄及び大
動脈狭窄の処置、並びに後壁心筋梗塞養生法の一部として用いることができる。

【０２２１】 主題のアンタゴニストは、高血圧、特に高血圧性心疾患の処置の一部として用
いることができる。 一つの態様において、本発明のＮＦＡＴアンタゴニストを、病理学上の刺激に
よる心筋症、例えばウィルス性心筋炎の処置の一部として用いることができる。 更に他の態様において、アンタゴニストを、心臓肥大を促進する負の副作用を
有する薬剤に対抗する処置、例えば甲状腺ホルモン処置の一部として用いること
ができる。

【０２２２】 従って好ましい態様において本発明は、哺乳動物（例えばヒト）における、Ｎ
Ｆ−ＡＴｃ媒介細胞肥大、特に筋細胞肥大に関連する疾病及び病状の予防及び治
療の方法を提供する。特に本発明は、肥大を予防又は低減する、心不全の被験者
を治療する方法を提供する。例証的な態様にあっては本発明は、ＮＦ−ＡＴアン
タゴニスト、好ましくはＮＦ−ＡＴｃ４アンタゴニストを、治療上有効な量で、
そのような処置を必要とする哺乳動物に長期的に投与することを包含する。

【０２２３】 あるいは、有効量のＮＦ−ＡＴｃ４アンタゴニストをエンドセリン又はＬＩＦ
（米国特許第５８３７２４１号参照）と組み合わせて長期に投与してもよい。追
加することのできる構成要素の例としては、ＣＴ−１アンタゴニスト等のカーデ
ィオトロフィン（cardiotrophin）阻害剤、カプトプリル等のＡＣＥ阻害剤、及
び／又はヒト成長ホルモン及び／又はＩＧＦ−Ｉ（鬱血性心不全の場合）、又は
他の心筋（myocardiotrophic）の、抗不整脈の、又は変力的因子（他の心不全又
は心臓疾患の場合）、他の抗肥大又は心筋因子（他の心不全又は心臓疾患の場合
）が挙げられる。剤を用いた心臓肥大の処置については、Ferarra他による米国
特許第５,５７３,７６２号に更に記載がある。

【０２２４】 合同養生療法の一部として用いることのできるＡＣＥ阻害剤は、アンギオテン
シンＩのアンギオテンシンＩＩへの変換を阻害する、アンギオテンシン変換酵素
の阻害剤である。ＡＣＥ阻害剤は、体血管抵抗を低減し、循環鬱血を軽減すると
いうことで、鬱血性心不全に有用である。ＡＣＥ阻害剤の例としては、Accupril
（キナプリル）、Altace（ラミプリル）、Capoten（カプトプリル）、Lotensin
（ベナゼプリル）、Monopril（フォシノプリル）、Prinivil（リジノプリル）、
Vasotec（エナラプリル）及びZestril（リジノプリル）といった登録商標のもの
が挙げられる。

【０２２５】 本発明は、高血圧といった心臓疾患の処置用の薬剤投与と組み合わせて用いる
ことができる。例えばＮＦ−ＡＴアンタゴニストを、エンドセリン受容体に対す
る抗体、及びペプチド又は他の小分子アンタゴニスト；カーベジロル（carvedil
ol）等のβアドレナリン受容体アンタゴニスト；α１アドレナリン受容体アンタ
ゴニスト；酸化防止剤；複数の活性を有する化合物（例えばβ遮断剤／α遮断剤
／酸化防止剤）；カーベジロル様化合物、又はカーベジロルに見られる複数の機
能を有する、それらの化合物の組み合わせ；成長ホルモン等のエンドセリン受容
体アンタゴニストと共に投与することができる。

【０２２６】 Ｋ．キット 本発明の化合物は、Ｔ細胞の活性を変調することが望まれる疾病又は病状の治
療、予防又は診断に用いる、キットの形で提供することができる。例えば本発明
は、ＮＦ−ＡＴ中のＮＬＳの細胞内相互作用を阻害することのできる、又はＧＳ
Ｋ−３及び／又はＰＫＡを阻害することのできる化合物を包含する、被験者中の
ＮＦ−ＡＴｃを活性化するキットを提供する。

【０２２７】 本発明の好ましい態様にあっては、本発明のキットは、被験者（例えば免疫抑
制剤の処置を受けている被験者）の免疫抑制レベルを決定する試薬を提供する。
一つの態様においては、キットはＮＦ−ＡＴの細胞移行を決定する試薬、例えば
ＮＦ−ＡＴに特異的に結合する抗体を包含する。キットに含むことのできる他の
試薬は、試験の結果を比較することのできる対照試薬又は基準物である。ある態
様においては、基準物は、正常な個人（免疫抑制を受けていない個人）における
値を示す表又は曲線である。キットは更に他の試薬、例えばフルオレセイン標識
抗体等の二次試薬や、緩衝液を含んでもよい。本発明は、被験者の免疫抑制レベ
ルのモニターに用いるだけでなく、ある薬剤例えば免疫抑制剤に対する被験者の
感受性を予想するのに用いることもできる。

【０２２８】 Ｌ．法医学的同定方法 本発明のＮＦ−ＡＴｃポリヌクレオチド配列を、ヒト個人の法医学的同定（死
者の身元確認、父親の確認、犯罪者の身元証明など）に用いることができる。例
えばＤＮＡ試料を個人から又は細胞試料（血液、唾液、精液等の犯行現場で得ら
れる証拠物件）から得て、ＰＦＬＰ分析、対立遺伝子特異的ＰＣＲ又はＰＣＲク
ローニングにかけ、増幅産物の配列決定を行ってＮＦ−ＡＴｃ遺伝子領域の構造
を調べることが挙げられる（ただしこれに限定されるものではない）。ＮＦ−Ａ
Ｔｃ遺伝子構造に基づいて、試料を得た個人が、ＮＦ−ＡＴｃ遺伝子型について
同定される。ＮＦ−ＡＴｃ遺伝子型は、容疑者として個人を同定する又は除外す
る目的で、単独でも他の遺伝子標識と組み合わせても用いることができる。

【０２２９】 一つの態様において、集団（一般に様々な人種からなる少なくとも５０人）か
ら得たヒトゲノムＤＮＡ試料を、それぞれ別個に反応容器（例えばマイクロタイ
タープレートのウェル）中に等分する。それぞれのアリコートを、好適な反応条
件下（例えばNew England Biolabs、１９９２カタログ参照）で、１種以上の制
限酵素（例えばEcoRI、HindIII、SmaI、BamHI、SalI、NotI、AccI、ApaI、BglII
、XbaI、PstI）で消化（培養）する。各個人から得た対応する消化産物を、別々
に電気泳動ゲル（一般にアガロース）に乗せ、電気泳動し、サザンブロットによ
って膜上にブロットを得て、標識付けしたＮＦ−ＡＴｃプローブ（例えば図１の
全長ヒトＮＦ−ＡＴｃ ｃＤＮＡ配列）とハイブリダイズする。サンプル集団内
で多様性を示す制限酵素断片（バンド）を、ＮＦ−ＡＴｃ遺伝子型を区別する基
準として用い、ＮＦ−ＡＴｃ遺伝子型に基づいて個人を分類する。

【０２３０】 集団から得たＰＣＲ増幅産物を配列決定し、配列多型性を用いて対立遺伝子（
遺伝子型）を同定し、個人の同定又は分類を行うことによって、類似のＮＦ−Ａ
Ｔｃ遺伝子型の分類を行うことができる。

【０２３１】 下記実施例を用いて本発明をさらに例証するが、それらは発明を限定するもの
と解釈されるべきではない。本明細書を通じて引用した参考文献（論文、特許、
特許出願を含む）の内容は、参照して説明に代える。本発明の実施は、特に述べ
ない限りは、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、形質転換生物学、微生物学、
組換えＤＮＡ及び免疫学で当業者に公知の方法を用いるものとする。そのような
方法は、下記文献に十分な記載が見られる。Molecular Cloning A Laboratory M
anual、第二版、Sambrook、Fritsch及びManiatis編（Cold Spring Harbor Labor
atory Press：１９８９）；ＤＮＡ Cloning, Volumes I and II（D.N.Glover編
、１９８５）；Oligonucleotide Synthesis（M.J.Gait編、１９８４）；Mullis
他、米国特許第４,６８３,１９５号；Nucleic Acid Hybridization（B.D.Hames
及びS.J.Higgins編、１９８４）；Transcription And Translation（B.D.Hames
及びS.J.Higgins編、１９８４）；Culture Of Animal Cells（R.I.Freshney、Al
an R.Liss,Inc.、１９８７）；Immobilized Cells And Enzymes（IRL Press、１
９８６）； B.Perbal、A Practical Guide To Molecular Cloning（１９８４）
；論文Methods In Enzymology（Academic Press, Inc.、ニューヨーク）；Gene
Transfer Vectors For Mammalian Cells（J.H.Miller及びM.P.Calos編、１９８
７、Cold Spring Harbor Laboratory）；Methods In Enzymology、Vols.１５４
及び１５５（Wu他編）、Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biolo
gy（Mayer及びWalker編、Academic Press、ロンドン、１９８７）；Handbook Of
Experimental Immunology、Volumes I−IV（D.M.Weir及びC.C.Blackwell編、１
９８６）；Manipulating the Mouse Embryo（Cold Spring Harbor Laboratory P
ress、Cold Spring Harbor、ニューヨーク、１９８６）。

【０２３２】 実験的実施例 概観 我々は、ＮＦ−ＡＴの先在性又は細胞質性の成分を表す別々の遺伝子によりコ
ードされる２つの関連タンパク質を精製した。これらのタンパク質の一つである
ＮＦ−ＡＴ_cの完全長ｃＤＮＡの発現は、ＩＬ−２プロモーターを非Ｔリンパ球
において活性化するが、ＮＦ−ＡＴ_cの優性ネガティブは、Ｔリンパ球における
ＩＬ−２プロモーターの活性化を特異的にブロックし、これは、ＮＦ−ＡＴ_cが
ＩＬ−２遺伝子発現に必要であり、ＩＬ−２の制限された発現の原因であること
を示している。ＮＦ−ＡＴ_cＲＮＡの発現は、リンパ様組織に大いに制限されて
おり、細胞活性化に際して誘導される。第２のタンパク質ＮＦ−ＡＴ_pは、ＮＦ
−ＡＴ_cと限られたドメインにわたって高度に相同であるが、一層広い組織分布
を示し、Ｃａ＋＋依存性の調節により特徴付けられる組織において高度に発現さ
れる。まとめると、これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合性タンパク質の新しいフ
ァミリーのメンバーであり、それらは、Ｄｏｒｓａｌ／Ｒｅｌファミリーと僅か
に関係している(Nolan及びBaltimore(1992)Current Biology, Ltd.2:211-220)。
細胞内Ｃａ＋＋を増大させる薬剤又はプロテインキナーゼＣを活性化する薬剤は
、独立に、ＮＦ−ＡＴ_cの移動性に変化を生じ、これは、別個のシグナリング経
路がＮＦ−ＡＴ_cに集まってその機能を調節することを示している。

【０２３３】 我々の前の仕事が、ＮＦ−ＡＴの細胞質成分がヒトのリンパ様細胞株において
比較的低濃度で存在することを示したので(Northrop等、(1993)J.Biol.Chem.268
:2917-2923)、我々は、ＮＦ−ＡＴ_cをウシの胸腺から精製することを選択した。
６ペプチドから得られたアミノ酸配列を用いて、２７４２ヌクレオチドに及ぶ２
つの重複するヒトｃＤＮＡクローンを単離した(図１)。このｃＤＮＡは、７１６
アミノ酸のタンパク質(予想分子量７７，８７０)をコードしている。イニシエー
ターメチオニンの上流のイン・フレームの停止コドンは、完全なＮＦ−ＡＴ_cタ
ンパク質がこのｃＤＮＡによりコードされることを示している。ユニークな反復
する１３残基の配列も同定された。ＮＦ−ＡＴ_cのカルボキシ末端側半分は、転
写因子のＤｏｒｓａｌ／ＲｅｌファミリーのＤＮＡ結合及び二量体形成領域に対
する限られた類似性を示している(図４、総説としては、Nolan及びBaltimore(19
92)Current Biology, Ltd.2:211-220)が、ＮＦ−ＡＴ_cは、このグループの最も
僅かに関係するメンバーであるらしい。ＲｅｌファミリーのメンバーとＮＦ−Ａ
Ｔ_cの間に電荷反転を生じる有意の数のアミノ酸変化があり、これは、塩橋を保
持するように電荷がこれらの部位で保存され得ることを示唆している。精製した
ウシのタンパク質から得られる更なる６つのペプチドは、ウシのＮＦ−ＡＴ_p同
族体に由来し、そのｃＤＮＡ断片は、McCaffrey等、(1993)Science 262:750-754
により報告された。ＮＦ−ＡＴｃとＮＦ−ＡＴｐの比較は、それらがＲｅｌ類似
性領域において７３％のアミノ酸同一性を有する別個の遺伝子の産物であること
を示す(図４)が、この領域の外側では、非常に僅かの類似性しかない。ＮＦ−Ａ
ＴｃのマウスｃＤＮＡを単離したところ、その予想タンパク質は、ヒトＮＦ−Ａ
Ｔｃに対して８７％同一でありマウスＮＦ−ＡＴｐとは明らかに異なっているこ
とが見出された。

【０２３４】 実施例１：ヒトＮＦ−ＡＴ_cのｃＤＮＡのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列
の決定 この実施例は、この新規なヒトＮＦ−ＡＴタンパク質のＮＦ−ＡＴｃの単離・
精製、その断片のアミノ酸配列の決定及びこのタンパク質をコードするｃＤＮＡ
クローンの単離と配列決定を表す。

【０２３５】 このタンパク質を、ウシ新生児から得たウシ胸腺から精製した。約２０のウシ
胸腺をホモジェナイズして細胞質抽出物を作成し、次いで、それを順に、１）硫
安沈殿、２）スルホプロピルセファロースクロマトグラフィー、３）ヘパリンア
ガロースクロマトグラフィー、４）セファロースＣＬ４Ｂに結合させた配列５’
−ＡＣＧＣＣＣＡＡＡＧＡＧＧＡＡＡＡＴＴＴＧＴＴＴＣＡＴＡＣＡ−３’(SEQ
ID NO:７３)を有するＮＦ−ＡＴに対するマルチ結合部位を用いるアフィニティ
ークロマトグラフィー及び５）逆相Ｃ４カラム上でのＨＰＬＣにかけた。その結
果の精製されたタンパク質を、ＬｙｓＣ／ＡｒｇＣによる開裂にかけ、断片をＨ
ＰＬＣにより単離した。これらの個々の断片の配列を、次いで、自動化エドマン
分解により決定した。得られた配列は、次を含んだ：ＬＲＮＳＤＩＥＬＲＫＧＥ
ＴＤＩＧＲ(SEQ ID NO:７４)及びＬＲＮＡＤＩＥＬＲ(SEQ ID NO:７５)。ＧＥＴ
ＤＩＧ(SEQ ID NO:７６)(逆方向プライマー)及びＲＮＡＤＩＥ(SEQ ID NO:７７)
(順方向プライマー)に対応する縮重オリゴを作成した。これらの縮重オリゴＰＣ
Ｒプライマーは、下記の配列を有した： 順方向：(Ａ／Ｃ)ＧＩＡＡ(Ｃ／Ｔ)ＧＣＩＧＡ(Ｃ／Ｔ)ＡＴ(Ａ／Ｃ／Ｔ)ＧＡ
(Ａ／Ｇ)(SEQ ID NO:７８) 逆方向：ＩＣＣ(Ａ／Ｇ／Ｔ)ＡＴ(Ａ／Ｇ)ＴＣＩＧＴ(Ｃ／Ｔ)ＴＣＩＣＣ(SEQ
ID NO:７９)

【０２３６】 ｃＤＮＡを単離するために、決定されたアミノ酸配列に対応するオリゴヌクレ
オチドプローブを作成して、ＰＣＲプライマーとして利用して、４５塩基の断片
をウシ胸腺から調製したウシｃＤＮＡから単離した。ウシのＰＣＲ産物は、−Ｌ
−Ｒ−Ｋ−をコードするヌクレオチド配列ＣＴＧＣＧＧＡＡＡを含んだ。同じ４
５ｂｐの断片を、ヒト及びマウス起源から増幅することができる。

【０２３７】 このウシのＰＣＲ産物を、次いで、用いて、ヒトＪｕｒｋａｔＴ細胞株のｃＤ
ＮＡライブラリーをスクリーニングした。クローンは、約１００，０００〜２０
０，０００当たり１の頻度で単離された。２つの重複するクローン(一つは５’
末端を含み、一つは３’末端を含む)を、各クローン中に存在するユニークなＥ
ｃｏＲＩ制限部位を用いて一緒に連結して、長さにおいてノーザンブロッティン
グにより決定されたメッセンジャーＲＮＡに対応する完全長のｃＤＮＡを生成し
た。

【０２３８】 ＮＦ−ＡＴｃｃＤＮＡの配列を、サンガー法により決定し、その完全なヌクレ
オチド配列と予想アミノ酸配列を図１に示す。図１に示したイニシエーターメチ
オニン(太字表示)を、この読み枠をグルタチオントランスフェラーゼ遺伝子に融
合させ、その結果生成したクローンを細菌にトランスフェクトすることにより決
定した。この生成したクローンは、適当な分子量の融合タンパク質を生成し、こ
れは、このイニシエーターメチオニンで示された読み枠が実際正しい読み枠であ
ることを示している。停止コドンの位置を、類似の手順で決定した。加えて、こ
の停止コドンは、決定されたアミノ酸配列の９つの読み枠に対応する。

【０２３９】 全ＮＦ−ＡＴｃタンパク質構造を、個々のＲｅｌタンパク質に対して、ＦＡＳ
ＴＡプログラムのアラインメントパラメーターを利用するＤＯＴＡＬＩＧＮと呼
ばれるマッキントッシュソフトウェアプログラムを用いて整列させた。これらの
タンパク質のＲｅｌドメインに対応する有意の相同性が認められた。増大された
アミノ酸残基アラインメントを、同じプログラムスートのＡＬＩＧＮを用いて行
った。ＮＦ−ＡＴｃとＮＦ−ＡＴｐのＲｅｌ類似性領域のアラインメントを、手
で行った(挿入の必要なし)。Ｍｉｙａｔａ ａｌｐｈａｂｅｔ(Miyata等、(1979
)J.Mol.Evol.12:214-26)を用いて、類似残基を決定した。図４は、かかる配列ア
ラインメントの結果を示している。

【０２４０】 実施例２：Ｔ細胞及び非Ｔ細胞におけるＮＦ−ＡＴｃの発現 図＿に示したｃＤＮＡをヘモフィルス・インフルエンザヘマグルチニン(ＨＡ)
１２アミノ酸エピトープタグに決定した読み枠で融合させて、ベクターｐＢＪ５
(Lin等、1990, Science 249:677-679)中のＳＲαプロモーターに操作可能に結合
した。その結果生成した構築物をエレクトロポレーションによりＪｕｒｋａｔヒ
トＴリンパ球及びＣｏｓ繊維芽細胞中に一時的にトランスフェクトした。このエ
ピトープタグ付きＮＦ−ＡＴｃタンパク質の発現を、トランスフェクトした細胞
から調製した全細胞抽出物の、ＨＡエピトープを検出する抗体(１２ＣＡ５、Ber
keley Antibody Co., CA)を用いるウエスタンブロッティングにより測定した。
図２は、ＮＦ−ＡＴｃｃＤＮＡ構築物が、ＪｕｒｋａｔＴ細胞及びＣｏｓ細胞の
両者において、精製されたタンパク質と大きさにおいて正確に対応する約１２０
ｋＤＡのタンパク質を発現することができることを示している(レーン３及び６
標識ＮＦ−ＡＴ^*参照。レーン２は、対照として、エピトープタグを有さずウエ
スタンブロットにおいて検出され得ないＮＦ−ＡＴを示している)。

【０２４１】 実施例３：ＮＦ−ＡＴｃのトランスフェクションは、Ｃｏｓ及びＪｕｒｋａｔ 細胞の両者において転写を活性化する ＮＦ−ＡＴｃｃＤＮＡを、ｐＢＪベクター中のＳＶ４０初期遺伝子プロモータ
ーとＨＩＶ転写調節領域に操作可能に結合する。この発現ベクターをＪｕｒｋａ
ｔ及びＣｏｓ細胞に、３コピーのＮＦ−ＡＴ結合部位を及びルシフェラーゼの転
写を指示する(結果を図３Ａ及び３Ｂに示す)ルシフェラーゼの転写を指示する完
全なＩＬ−２エンハンサー／プロモーター(結果を図３Ｂに示す)に結合したもの
と同時トランスフェクトする。細胞質抽出物を調製して、ルシフェラーゼアッセ
イを標準的手順により行った(de Wet等、1987, Mol.Cell.Biol.7:724-837)。

【０２４２】 これらの結果は、Ｃｏｓ細胞及びＪｕｒｋａｔ細胞の両者において、ＮＦ−Ａ
Ｔｃタンパク質の過剰発現がＮＦ−ＡＴ依存性転写を劇的に５０〜１０００倍増
大させることを示している(図３Ａ参照)。加えて、ＮＦ−ＡＴｃタンパク質のＣ
ｏｓ細胞における過剰発現は、ＮＦ−ＡＴｃの非存在下では活性化され得ないＩ
Ｌ−２プロモーターを活性化する(図３Ｂ参照)。

【０２４３】 これらの結果は、ｃＤＮＡクローンが機能的なＮＦ−ＡＴｃタンパク質をコー
ドしていること及びＮＦ−ＡＴｃがＴ細胞に対するインターロイキン２の発現を
抑制するタンパク質であることを示している。

【０２４４】 実施例４：ＮＦ−ＡＴｃｍＲＮＡ及びタンパク質の発現 ＮＦ−ＡＴｃｍＲＮＡは、Ｈｅｌａ細胞(図５、パネルａ、レーン７)、ＩＬ−
２又はＮＦ−ＡＴ依存性転写のできない細胞株中に存在しないが、Ｊｕｒｋａｔ
細胞中では誘導可能である(図５、パネルａ)。この誘導は、シクロスポリンＡ(
ＣｓＡ)に感受性であり、これは、ＮＦ−ＡＴｃが、ＣｓＡがその核結合をブロ
ックすることが示されているので、自己刺激ループに参加していることを示して
いる(Flanagan等(1991)Nature 352:803-807)。２つのＢ細胞株、筋肉組織、Ｈｅ
ｐＧ２細胞及び骨髄性白血病細胞は、ＮＦ−ＡＴｃｍＲＮＡを発現しない(図５
、パネルｂ)。これらの観察は、ＩＬ−２転写及びＮＦ−ＡＴ活性の観察された
Ｔ細胞制限されたパターンと一致する。以前の研究(Verweij等(1990)J.Biol.Che m 265 :15788-15795)は、ＮＦ−ＡＴ依存性の転写を主として、ＮＦ−ＡＴ依存性
レポーター遺伝子を発現するトランスジェニックマウスの脾臓、胸腺及び皮膚で
示した。これらの観察と一致して、マウスＮＦ−ＡＴｃｍＲＮＡは、同じ発現パ
ターンを示す(図５、パネルｃ)。少量のＮＦ−ＡＴｃ発現が、肺及び心臓で見ら
れたが、これは、循環Ｔ細胞による汚染のためであろう。マウスＮＦ−ＡＴｐｍ
ＲＮＡ(定量的リボヌクレアーゼ防護によりアッセイ)は、脳、心臓、胸腺及び脾
臓でほぼ等しいレベルで発現されることが見出された(図５、パネルｃ)。ＮＦ−
ＡＴｃと対照的に、ＮＦ−ＡＴｐは、ＰＭＡ及びイオノマイシンにより誘導可能
でなかった(図５、パネルｃ)。

【０２４５】 方法。特定のヒト若しくはマウスのＮＦ−ＡＴｃ又はマウスのＮＦ−ＡＴｐの
ｃＤＮＡ断片を、ＲＮＡ転写物の合成のテンプレートとして用いた。リボヌクレ
アーゼ防護を、Melton等(1984)Nucl.Acids.Res.12:7035-7056に従って１０μｇ
の全ＲＮＡを用いて行った。脾臓細胞及び胸腺細胞を、記載された(Verweij等(1
990)J.Biol.Chem 265:15788-15795)ように単離して処理してからＲＮＡを単離し
、或は全組織を用いた。

【０２４６】 実施例５：ＮＦ−ＡＴｃの機能的発現 ＮＦ−ＡＴルシフェラーゼ及びＩＬ−２ルシフェラーゼは、記載されている(N
orthrop等(1993)J.Biol.Chem.268:2917-2923)。β２８ルシフェラーゼを、三量
体化ＨＮＦ−Ｉ認識部位(β２８)をＮＦ−ＡＴルシフェラーゼ中のＮＦ−ＡＴ認
識部位の位置に挿入することにより構築した。プラスミドｐＳＶ２ＣＡＴ(Gorma
n等(1982)Mol.Cell.Biol.2:1044-1050)をトランスフェクション効率の内部対照
として用いた。細胞を、１．５μｇのルシフェラーゼレポーターと３μｇの記載
した発現用構築物でトランスフェクトした。２０時間の生育の後に、細胞を２０
ｎｇ／ｍｌＰＭＡに２μＭイオノマイシンをプラス又はマイナスしたもので８時
間刺激して、ルシフェラーゼにつき収穫して(de Wet等(1987)Mol.Cell.Biol.7:7
25-737)ＣＡＴアッセイ(Gorman等(1982)Mol.Cell.Biol.2:1044-1050)を行った。

【０２４７】 Ｃｏｓ細胞を、記載したエピトープタグ付きＮＦ−ＡＴｃでトランスフェクト
した。Ｃｏｓ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞及びマウス胸腺細胞を、ＰＭＡとイオノマ
イシンで３時間にわたって刺激した。ＨｅＬａ細胞を、ＰＭＡだけで３時間にわ
たって刺激し、核抽出物を記載されたように調製した(Fiefing等(1990)Genes & Dev.4 :1823-1834)。細胞質を、刺激してないＣｏｓ細胞から調製した。ゲル移動
度シフトを前に記載されたように行った(Flanagan等(1991)Nature 352:803-807
；Northrop等(1993)J.Biol.Chem.268:2917-2923)。抗血清を、ベクターｐＧＥＸ
−３Ｘ(Pharmacia)を用いて細菌で発現させたグルタチオン−Ｓ−トランスフェ
ラーゼ融合タンパク質により免役したマウスで高め、グルタチオンアガロース上
で精製した。融合タンパク質は、ＮＦ−ＡＴｃ残基１２〜１４３(ｉｍｍｕｎｅ
−１)及び１２〜６９９(ｉｍｍｕｎｅ−２)を含んだ。

【０２４８】 非Ｔ細胞株で発現されたＮＦ−ＡＴｃは、特に、ＮＦ−ＡＴ部位及びＩＬ−２
プロモーターからの転写を活性化した(図６パネルａ(左)及び図６パネルｂ)。一
時的にトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞において、ＮＦ−ＡＴｃの過剰発
現は、ＮＦ−ＡＴ依存性プロモーターを活性化したが、ＨＮＦ−１依存性プロモ
ーター(図６パネルａ(右))又はＡＰ−１依存性プロモーターを活性化しなかった
。ＮＦ−ＡＴｃｃＤＮＡのトランスフェクションは、内因性ＮＦ−ＡＴと識別不
能なＤＮＡ結合活性を示している(図６パネルｃ、レーン１〜４)。トランスフェ
クトしたｃＤＮＡによりコードされたＨＡエピトープに対する抗体は、ＮＦ−Ａ
Ｔ複合体のスーパーシフトを誘導し、これは、ＮＦ−ＡＴｃがこの活性に関与し
ていることを示している。トランスフェクトされたＣｏｓ細胞における核ＮＦ−
ＡＴ活性は、Ｔ細胞の天然の核複合体と一緒に移動し、同じ結合特異性を有する
(図６、パネルｃ、レーン４〜１１)。ＮＦ−ＡＴｃトランスフェクトされたＣｏ
ｓ細胞からの細胞質抽出物は、ＨｅＬａ核抽出物と混合したときに、Ｔ細胞由来
の細胞質抽出物(Flanagan等(1991)Nature 352:803-807；Northrop等(1993)J.Bio l.Chem.268 :2917-2923)と同様に、ＮＦ−ＡＴＤＮＡ結合活性を再構成すること
ができる(図６パネルｃ、レーン１２〜１６)。ＮＦ−ＡＴｐに対する類似性を有
しないＮＦ−ＡＴｃの細菌で発現させた断片に対して高めた抗血清は、Ｊｕｒｋ
ａｔ細胞又は胸腺細胞からの内因性ＮＦ−ＡＴ複合体のスーパーシフトを誘導す
ることができるが、ＡＰ−１複合体はできない(それぞれ、ｉｍｍｕｎｅ−Ｉ及
びｉｍｍｕｎｅ−２、図６パネルｄ)。ｉｍｍｕｎｅ−２抗血清は、マウス胸腺
核抽出物を用いて生成したＤＮＡ−タンパク質複合体を有意に減じたが、これは
、ウシ胸腺から精製したタンパク質におけるＮＦ−ＡＴｃ及びＮＦ−ＡＴｐペプ
チドの比較的等しい表示と一致する。

【０２４９】 実施例６：一時的トランスフェクションアッセイにおいてアッセイされるＮＦ −ＡＴｃ優性ネガティブ変異体 ｃＤＮＡの大規模欠失分析後に調製した優性ネガティブＮＦ−ＡＴｃは、アミ
ノ末端ドメインが、ＮＦ−ＡＴ依存性の機能を結合に影響を与えずにブロックす
ることを示した。ｃＤＮＡのこの領域は、ＮＦ−ＡＴｐ中で見出されず、それ故
に、ＩＬ−２遺伝子の活性化に対するＮＦ−ＡＴｃの寄与の評価に利用すること
ができる。利用する優性ネガティブＮＦ−ＡＴｃは、アミノ酸４６３のＰｖｕＩ
Ｉ部位に及ぶエピトープタグ付きＮＦ−ＡＴｃ発現プラスミド(前出)のカルボキ
シ末端を切り詰めたものよりなる。この優性ネガティブのトランスフェクション
は、ＩＬ−２プロモーター機能並びにＮＦ−ＡＴ部位にり指示される転写の９０
％を超える阻害を生じた(図７)。この効果は、ＡＰ−１部位又はＲＳＶプロモー
ター及びエンハンサーにより指示される転写が比較的影響されなかったので、高
度に特異的であった(図７)。これらの結果は、ＮＦ−ＡＴｃがＴ細胞におけるＩ
Ｌ−２遺伝子発現に対して相当寄与していることを強く指示する。

【０２５０】 優性ネガティブＮＦ−ＡＴｃポリペプチド又はそのペプチド模倣物を、Ｔ細胞
のＮＦ−ＡＴ媒介の活性化の薬用アンタゴニストとして利用することができる。
一変法において、かかる薬物は、多くの他の用途(例えば、免疫抑制剤)の内で、
Ｔ細胞活性化等の研究室での試験及び分析のための市販の研究用試薬として利用
することができる。

【０２５１】 実施例７：ＮＦ−ＡＴｃの転写後修飾 ＮＦ−ＡＴｃの転写後修飾を、ＰＫＣを活性化する薬剤又は細胞内Ｃａ＋＋を
増大させる薬剤で処理した細胞において研究した。細胞を、図２に記載したよう
にＮＦ−ＡＴｃでトランスフェクトして、示したように２時間プラス又はマイナ
ス１００ｎｇ／ｍｌＣｓＡで刺激した。全細胞溶解物を図２のようにウエスタン
ブロッティングにより分析した。イオノマイシンで処理した細胞中のＮＦ−ＡＴ
ｃのバルクは、未処理細胞におけるより速く移動し、この移動度シフトは、Ｃｓ
Ａにより阻害される(図８、レーン１、３〜４)。これは、おそらくカルシニュー
リンの直接作用による脱リン酸化事象(Clipstone及びCrabtree(1992)Nature 357 :695-697)と一致するが、多数のプロセスの何れも、この観察された移動度の変
化を生じ得るであろう。ＮＦ−ＡＴｐがカルシニューリンの基質である証拠があ
るが、ＮＦ−ＡＴｐ又はＮＦ−ＡＴｃのリン酸処理により生じる移動度シフトは
、図８で認められるものより遙かに大きい。これらの観察は、ＮＦ−ＡＴｃがカ
ルシニューリンの直接の基質ではないことを示している。ＰＭＡ処理は、一層ゆ
っくり移動するＮＦ−ＡＴｃ(図８、レーン２)を生じ；それ故、ＰＫＣ活性化経
路が、核成分の活性化に加えてＮＦ−ＡＴｃの修飾によるＮＦ−ＡＴ活性に寄与
することはありそうなことである。

【０２５２】 実施例８：カルシニューリンは、ＮＦ−ＡＴｃの核エントリーにつき律速され る 殆どの組織は、ＮＦ−ＡＴファミリーのメンバーの１つを発現する。リンパ球
及び繊維芽細胞を含む様々な細胞型が、トランスフェクトされた及び内因性のＮ
Ｆ−ＡＴｃファミリーメンバーのＣａ²⁺依存性の核局在性を支持する(Shibasaki
等、Nature, 382:370-373)。ＮＦ−ＡＴ移動の正確なアッセイを開発するために
、ＮＦ−ＡＴｃをＣＯＳ細胞中で発現させた(該細胞は、リンパ球と異なり、豊
富な細胞質を有し、それ故、細胞質と核の局在性の一層容易な評価を可能にする
)。

【０２５３】 ＣＯＳ−７細胞を、１０％ウシ胎児血清(ＦＣＳ)、１００μｇ／ｍｌのペニシ
リンＧ、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び１０ｍＭのＨＥＰＳ(ｐＨ
７．４)を有するダルベッコ改変イーグル培地(ＤＭＥＭ；Sigma)中に、３７℃で
ＣＯ₂中に維持した。細胞をエレクトロポレーションにより、ｐＢＪ５ベクター
中のヒトＮＦ−ＡＴｃ１ｃＤＮＡの第２のコドンの直ぐ５’側のＸｂａＩ部位に
挿入されたＦＬＡＧエピトープタグをコードする１μｇのＳＨ１６０ｃHo等(199
5)J.Biol.Chem.270:19898でトランスフェクトし、カバー硝子上にプレートし、
トランスフェクション後１８〜１４時間、新鮮な培地又はイオノマイシン(終濃
度２μＭ)と１０ｍＭ(終濃度)ＣａＣｌ２を補った新鮮な培地中で、様々な時間
にわたって３７℃で刺激した。イオノマイシンは、Calbiochemから入手し、ＤＭ
ＳＯに溶解させた。細胞を、ＦＫ５０６(２ｎｇ／ｍｌ)にイオノマイシンとＣａ
Ｃｌ２を加えたもの又はイオノマイシンに２．５ｍＭ ＥＧＴＡを加えたもので
も６０分間にわたって処理した。ＦＫ５０６は、カルシウム及びイオノマイシン
の添加の１５分前に２ｎｇ／ｍｌで加えた。ＦＫ５０６は、Fukisawa(Chicago,
IL)から入手し、エタノールに溶解させた。ＣＯＳ細胞におけるＮＦ−ＡＴｃの
効率的な核への移動は、イオノマイシンと細胞外カルシウムの上昇を必要とする
。このＣａ²⁺の要求の理由は、ＣＯＳ細胞のイオノマイシン刺激が、刺激された
リンパ球程高い細胞内Ｃａ²⁺レベルを生じないことであろう。次いで、細胞を、
下記のように、抗ＦＬＡＧ抗体で染色した。カバー硝子に付着した細胞を、４％
パラホルムアルデヒド中で固定して、０．１％トリトンＸ−１００中で透過性に
した。ＦＬＡＧエピトープを、１μｇ／ｍｌの抗ＦＬＡＧＭ２抗体(Eastman Kod
ak)とインキュベートすることにより検出した。このモノクローナル抗体を、ビ
オチン結合した抗マウスＩｇＧ(Caltag)と、その後、ストレプトアビジン−ＦＩ
ＴＣ及びＤＡＰＩ(Molecular Probes)とインキュベートすることにより検出した
。蛍光を、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｈｏｔ蛍光顕微鏡により可視化した。核及び
原形質膜を同定することのできる蛍光性の細胞を、主として細胞質染色を含むか
、主として核染色を含むか、又は細胞質と核の両方の染色を含むかで評価した。
少なくとも１００の細胞を、核カバー硝子上で評価した。有糸分裂中の細胞又は
複数の核を有する細胞は、除いた。すべての欠失用構築物に関して、細胞下局在
性を共焦点イメージング蛍光顕微鏡を用いて確認した。

【０２５４】 図９Ｂの図式に示したように、ＮＦ−ＡＴｃ３(４)(Shibasaki等、Nature, 38
2:370-373)と同様に、ＮＦ−ＡＴｃ１のアミノ末端は、Ｃａ²⁺調節される核イン
ポートに十分であった(ＦＫ５０６によりブロックされた)。その上、トランスフ
ェクトされたＮＦ−ＡＴｃ１は、イオノマイシン処理後５〜１５分以内に核内に
移動した。

【０２５５】 ＮＦ−ＡＴｃの核から退出は、トランスフェクトされた細胞をＩ＋Ｃａ⁺⁺で１
時間刺激し、次いで、培地をＦＫ５０６を含む培地と置き換えることにより測定
した。スライドを様々な時点で固定し、細胞質のＮＦ−ＡＴｃを有する細胞のパ
ーセンテージを測定した。細胞質でＮＦ−ＡＴｃを発現している細胞及び細胞質
と核の両方でＮＦ−ＡＴｃを発現しているものを加えて分析した発現細胞の総数
で除した。結果(図９Ｃに示す)は、ＮＦ−ＡＴが、核から細胞質へ、ＦＫ５０６
添加の３０分以内に移動したことを示している。これらの移動は、タンパク質合
成を阻害しても起きた。完全長タンパク質は、アミノ末端４１８アミノ酸とグリ
ーン蛍光蛋白質との融合物(ＮＦ−ＡＴ(ＣΔ４１８)−ＧＦＰ)(図９Ａ)と同様に
振る舞った。ｐＳＨ１６０ｃΔ４１８−ＧＦＰ構築物を、ｐＥＧＦＰ−１(Clone
tech)に由来するＧＦＰをコードするＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ断片をＳＨ１６０ｃ
のコドン４１８のＰｖｕＩＩ部位の後ろに融合することにより作成し、その自己
蛍光を利用して検出した。

【０２５６】 この核局在性のタイムコースは、抗原提示により活性化されたマウスリンパ球
で認められたものと一致し(Timmerman等、Nature, 383:837-840)、ＣＯＳ細胞が
、ＮＦ−ＡＴｃの生理的移動を支持し得ることを示している。ＮＦ−ＡＴｃ３[
４](Shibasaki等、Nature, 382:370-373)と同様に、カルシニューリンの過剰発
現は、ＮＦ−ＡＴのＣＯＳ細胞核への移動を増大させた(図９Ａ)が、これは、カ
ルシニューリンが、ＮＦ−ＡＴｃタンパク質の核への移動を律速していることを
示している。

【０２５７】 実施例９：異種核局在性配列のＮＦ−ＡＴｃへの付加は、Ｃａ²⁺非依存性のＦ Ｋ５０６耐性の核インポートを生じる 過剰発現されたＮＦ−ＡＴｃは、ＪｕｒｋａｔＴリンパ球及びＣＯＳ細胞にお
いて細胞質にあるという観察は、ＮＦ−ＡＴｃを細胞質に保持するのに必要な容
易に飽和される細胞質アンカーリングタンパク質がないことを示唆している。Ｄ
ＮＡ濃度の２００倍の範囲を超えるＮＦ−ＡＴｃ１発現構築物のトランスフェク
ションは、一層高レベルの構成的核局在性を生じなかった。もしＮＦ−ＡＴｃが
細胞質アンカーリングパートナーにより局在化されたならば、十分活性な核局在
性配列(ＮＬＳ)のＮＦ−ＡＴｃへの付加は、細胞質停留ＮＦ−ＡＴｃを克服しな
いであろう。従って、ＦＬＡＧエピトープとＮＦ−ＡＴｃ１の第２のアミノ酸と
の間にコードされるＳＶ４０大型Ｔ抗原ＮＬＳ又はＮＬＳ(ＮＬＳ−Ｔ)の変異型
の１若しくは２コピーの何れかの０、１又は２コピーを有するＮＦ−ＡＴｃ１発
現構築物。ＳＶ４０ＮＬＳ及び変異体(ＮＬＳ−Ｔ)を有する構築物を、合成オリ
ゴヌクレオチドをｐＳＨ１６０ｃのＸｂａＩ部位に挿入することにより造った(H
o等(1995)J.Biol.Chem.270:19898、これは、ｐＢＪ５ベクター中のヒトＮＦ０Ａ
Ｔｃ１ｃＤＮＡの第２のコドンの直ぐ５’側のＸｂａＩ部位に挿入されたＦＬＡ
Ｇエピトープタグをコードする(Northrop等(1994)Nature, 369:497-502))。挿入
されたＮＬＳは、ＣＴＡＧＴＣＣＴＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＧＴＡＴ(S
EQ ID NO:８０)であり；ＮＬＳ−Ｔの配列は、ＣＴＡＧＴＣＣＴＡＡＧＡＣＧＡ
ＡＧＡＧＡＡＡＧＧＴＡＴ(SEQ ID NO:８１)であり、スレオニンをリジンの代わ
りに用いている(Cell, 39:499-509)。すべての置換点を、シーケンシャルオーバ
ーラップイクステンションＰＣＲ(J.Biol.Chem.,270:19898-19900)により造った
。次いで、細胞を抗ＦＬＡＧ抗体で染色し、核蛍光を有する細胞のパーセンテー
ジを測定した。

【０２５８】 図１０に示したように、ＣＯＳ細胞におけるＳＶ４０大型Ｔ抗原ＮＬＳの０、
１又は２コピーを有するＮＦ−ＡＴｃ１の発現は、ＦＫ５０６に反応しない構成
的核局在の漸進的増加を生じた。対照的に、変異型ＮＬＳ配列、ＮＬＳ−Ｔ(Kal
deron等(1984)Cell,39:499-509)のＮＦ−ＡＴｃ１への付加は、実質的に一層少
ない核へのエントリーを生じた。ＮＬＳ−Ｔの取込みの結果の低レベルの核局在
性は、この変異体の僅かな活性に帰せられよう(複数コピーで存在する場合には
野生型配列と同様に増進される)。これらの結果は、優勢の活性な細胞質結合タ
ンパク質に依存する細胞質局在性の機構に反論する。

【０２５９】 実施例１０：２つのＮＬＳは、各々、ＮＦ−ＡＴｃ核移行に十分である ＮＦ−ＡＴｃタンパク質は、おそらくＮＬＳであろうＮＦ−ＡＴｃタンパク質
中に保存されているクラスター化した塩基性残基の４つのグループを含んでいる
(図１１Ａ参照)。これらの配列がＮＬＳ活性を有するか否かを決定するために、
それらの各々を別々に細胞質交換因子ＳＯＳに結合した。

【０２６０】 これらのＳＯＳ発現構築物は、ＨＡエピトープによりカルボキシル末端に付け
られたヒトＳＯＳｃＤＮＡ、ｐＳＯＳ−Ｅ(Proc.Natl.Acad.Sci.92:98109814)に
基づいた。ｐＳＯＳを、配列ＬＥＣＮＫＲＫＹＳＬＮＶＤ(SEQ ID NO:８２)をコ
ードするオリゴヌクレオチドをＳＯＳとＨＡエピトープの間のユニークなＳａｌ
Ｉ部位に挿入することにより造った。ＳＯＳをコードする発現用構築物(ＳＯＳ
−Ｅ)を発現させ、１２ＣＡ５抗体を用いて可視化した。ＮＦ−ＡＴｃの残基２
６３〜２７１に結合した(ＳＯＳ−２６５)又はＮＦ−ＡＴｃの残基６８１〜６８
５に結合したＳＯＳ−Ｅをコードする構築物(ＳＯＳ−６８２)も又、１２ＣＡ５
抗体で検出された。免疫蛍光を上記のように検出したが、ＨＡエピトープは、１
２ＣＡ５腹水の１：２０００希釈物とインキュベートすることにより検出した。

【０２６１】 これらの結果は、ＮＦ−ＡＴｃの残基６８２〜６８５を取り込んだＳＯＳ−６
８２と残基２６５〜２６７を取り込んだＳＯＳ−２６５が核に局在化されること
を示している。従って、ＮＦ−ＡＴＣ中のこれら２つの保存された領域は、ＮＬ
Ｓである。

【０２６２】 これらのＮＬＳがＮＦ−ＡＴｃの核インポートに必要であるか否かを測定する
ために、各配列を完全長ＮＦ−ＡＴｃ１のコンテキスト内で別々に及び組み合わ
せて突然変異させた。野生型ＮＦ−ＡＴｃ配列中のＮＬＳ中に作成した突然変異
の図解を、図１１Ｂに示す。残基２６５〜２６８のＮＬＳは、ＱＩＬに変化させ
た(構築物ｍ２６５)。残基６８２〜６８５のＮＬＳは、ＴＲＴＧに変化させ、こ
の変異とｍ２６５を含む構築物をｍ２６５＋６８２と呼ぶ。この変異型発現用構
築物をＣＯＳ細胞にトランスフェクトし、それらの細胞をＩ＋Ｃａ⁺⁺で６０分間
上記のように刺激した。核、細胞質又は両区画において染色された細胞のパーセ
ンテージを測定した。

【０２６３】 図１１Ｂに示した結果は、２６５〜２６７の配列のＫＲＫからＱＩＬへの変異
がイオノマイシンに応答してのＮＦ−ＡＴＣの核局在性の程度を低下させたが、
最大で６０％の細胞がＮＦ−ＡＴＣの幾らかのＣａ²⁺依存性の核蓄積を示すこと
を示している。６８２〜６８５位の配列ＫＲＫＫ(SEQ ID NO:５６)のＴＲＴＧ(S
EQ ID NO:５５)への変異又はこれら４残基の正確な除去は、Ｃａ²⁺上昇に応答し
てのＮＦ−ＡＴＣの核局座性に影響を与えなかった。しかしながら、両領域内に
変異を含むＮＦ−ＡＴｃは、イオノマイシン処理後に細胞質に留まる。従って、
他の複数のＮＬＳを有する核タンパク質(Richardson等(1986)Cell,44:77-85)と
同様に、２つのＮＬＳは、何れも細胞質ＳＯＳを核に向かわせることができ、核
エントリーを阻止するには両者が変異しなければならないという観察により示唆
されたように、部分的に重複している。これらのデータは又、両ＮＬＳは、Ｃａ ²⁺ 刺激のないときは不活性でなければならないことをも示した。

【０２６４】 実施例１１：アミノ末端のセリンの変異は、ＮＦ−ＡＴｃの構成的な核局在性 を生じる ＮＦ−ＡＴｃのアミノ末端はカルシウム依存性の核エントリーに十分であるの
で、アミノ末端のリン酸化が転写因子の細胞下区画化を指示するかどうかを測定
した。各ＮＦ−ＡＴｃタンパク質のアミノ末端は、ＳＰ反復モチーフと呼ばれる
配列を３コピー含む(Ho等(1995)J.Biol.Chem.,270:19898-19900；Hoey等(1995)I
mmunity,2:461-472；Masuda等(1995)Mol.Cell Biol.,15:2697-2706)。付加的Ｓ
ＲＲ２３アミノ酸長は、最初のＳＰ反復の丁度アミノ末端側にある(Ho等(1995)J
.Biol.Chem.,270:19898-19900)図９Ａ)。ホスホアミノ酸分析は、すべてのリン
酸化がセリン上に位置していることを示した。２次元トリプシンペプチドマップ
は、アミノ末端４１８アミノ酸に由来する多くのホスホペプチドを示す(下記参
照)。これらの特定のセリンのリン酸化がＮＦ−ＡＴｃの局在性を調節すること
ができるのかどうかを測定するために、ＳＲＲ及びＳＰリピート中の保存された
セリンの選択したグループをアラニンに変異させ、これらの変異体の細胞下局在
性をＣＯＳ細胞において測定した。

【０２６５】 ＳＲＲを、残基１７２〜１９４中の１１のセリンをアラニンに変化させること
により変異させてｍＳＲＲを形成した。第１のＳＰ反復を、残基１９９〜２１１
中の４つのセリンをアラニンに変化させることにより変異させてｍＳＰ１を形成
した。第２のＳＰ反復を、２３３〜２３７のセリンをアラニンに変化させること
により変異させてｍＳＰ２を形成した。第３のＳＰ反復を、２７８、２８２，２
８６、２９０及び２９９の５つのセリンにおいて変異させた(ｍＳＰ３)。他の変
異した構築物を、図１２に示す。これらの置換を、ＮＦ−ＡＴカルボキシ末端欠
失構築物(アミノ酸１〜４１８を含む)及びアミノ末端のヘマグルチニン(ＨＡ)エ
ピトープタグをコードする構築物ｐＳＨ１０２ｃΔ４１８(Nature,369:497-502)
中に作成した。

【０２６６】 野生型(ＷＴ)又は変異型のＮＦ−ＡＴｃｃＤＮＡでトランスフェクトした細胞
の細胞質(Ｃ)又は核(Ｎ)抽出物のイムノブロットも行った。従って、トランスフ
ェクトされた細胞を、添加物を含まない培地(ＮＳ)又はイオノマイシンとカルシ
ウム(Ｉ＋ＣＡ⁺⁺)を有する培地で下記のように６０分間処理し、次いで、J.Biol
.Chem.270:19898-19900に従って、細胞質画分と核画分とに分けてＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにかけ、メンブレンにトランスファーして、抗マウスペルオキシダーゼ及び
ケミルミネッセンス(Amersham)により検出されるＭ２又は１２ＣＡ５抗体を用い
てウエスタンブロッティングを行った。

【０２６７】 これらの結果は、ＳＲＲ内のすべてのセリンの変異(ｍＳＲＲ)は、ＦＫ５０６
により影響されない構成的核局在性を発現細胞の１００％において生じることを
示している。ｍＳＲＲは、ＳＤＳ電気泳動において増大された移動度を有し、ウ
エスタンブロッティングにおいて核に存在し、オルトホスフェートでイン・ビボ
での標識後の³²Ｐの減少した取込みを示し、これは、これらのセリンがイン・ビ
ボでタンパク質のリン酸化状態に影響を及ぼすという仮説と一致する。最初のＳ
Ｐ反復中のセリンがアラニンに置換されたＮＦ−ＡＴｃ変異体(ｍＳＰ１)も又、
発現細胞の１００％において構成的に核に局在され、分子量の減少を示す。類似
の結果が、第１及び第３のＳＰ反復にＳ→Ａ変異を有するＮＦ−ＡＴｃ変異体(
ｍＳＰ１３)及び３つすべてのＳＰ反復において変異を生じさせたもの(ｍＳＰ１
２３)又はＳＲＲにおける変異と組み合わせた(ｍＳＲＲ＋ＳＰ１２３)バージョ
ンにおいて得られた。これらの変異体の各々の細胞下局在性は、それらがＪｕｒ
ｋａｔ細胞で発現されるならば、構成的に核内にＮＦ−ＡＴｃを生じ、これは、
これらのホスホセリンが様々な細胞型において細胞下局在性を制御することを示
唆している。Ｓ→Ａ変異の調節されない核エントリーは、変異型ＮＦ−ＡＴｃの
内のこれらの変異型の各々がＮＦ−ＡＴｃ依存性転写に関与するので、タンパク
質の変性により引き起こされることはありそうにない。

【０２６８】 ＳＲＲのＳ→Ａ変異は、見かけ分子量の最小の変化を生じたので、この領域が
細胞質局在性に必要な最小数の臨界的セリンを含むということは、ありそうなこ
とであった。これらの変異体は、更に細胞へのトランスフェクション及びイオノ
マイシン処理後に脱リン酸化され得る(これは、ＳＲＲ変異体が依然ホスファタ
ーゼおそらくはカルシニューリンの基質であることを示している)。従って、Ｓ
ＲＲ中のセリンの一層小さいブロックの変異による更なる分析を行った。残基１
７２〜１７６、１７８〜１８１及び１８４〜１８８におけるアラニン置換は、発
現細胞の１００％においてＣａ²⁺／カルシニューリンシグナリングの非存在下で
ＮＦ−ＡＴｃの核蓄積を生じたが、残基１９１〜１９４では生じなかった(図１
２Ａ参照)。興味深いことに、これらの構成的核局在性の変異体は、ＦＫ５０６
を加えた後も核内に留まり、該処理は、刺激により核に輸送された野生型のＮＦ
−ＡＴｃ、ＮＦ−ＡＴｐ又はＮＦ−ＡＴｃ３の迅速な細胞質蓄積を生じる(Flana
gan等(1991)Nature,352:803-807；Shibazaki等(1996)Nature,382:370-372；Timm
erman等(1996)Nature,383:837-840)。従って、これらの結果は、これらの残基の
リン酸化がＮＦ−ＡＴｃの核からのエキスポートに必要であることを示している
。

【０２６９】 実施例１２：カルシニューリンは、ＮＦ−ＡＴ中のセリンを脱リン酸化する カルシニューリンが核エントリーを指示するホスファターゼたり得るか否かを
決定するために、核エントリーに関係する残基を特異的に脱リン酸化するカルシ
ニューリンの能力を調べた。

【０２７０】 ＮＦ−ＡＴＧＳＴ融合タンパク質を、下記のように調製した。ＮＦ−ＡＴｃ１
(Northrop等(1994)Nature,369:497-502)の残基１９６〜３０４をｐＧＥＸ−３Ｘ
のＳｍａＩ部位にクローン化してｐＧＳＰを生成した。Ｓ→Ａ置換が上記の３つ
のＳＰ反復のすべてにあるＧＳＴ融合タンパク質ｐＧＡＰを同様に構築した(９
Ｓ及び１０Ｔ残基は残した)。このＧＳＴ融合タンパク質を、グルタチオン−セ
ファロース上に固定した１μｇの融合タンパク質を全脳抽出物(５５μｇタンパ
ク質)(下記のように調製)及び１００μｍＡＴＰ及び[γ−³²Ｐ]ＡＴＰ(４００μ
Ｃｉ／μモル)と５０μｌのキナーゼ緩衝液(２０ｍＭ トリス、ｐＨ７．５、１
０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ ＤＴＴ)中で３０分間３０℃でインキュベートする
ことによりリン酸化した。キナーゼ反応を、アガロースビーズを１ｍｌのカルシ
ニューリン緩衝液中で３回洗うことにより停止させた。次いで、これらの融合タ
ンパク質を上記のようにカルシニューリンとインキュベートし、又は２単位のエ
ビジャコホスファターゼ(U.S.Biochemical)又は５単位のプロテインホスファタ
ーゼＩ(Boehringer Mannheim)で製造業者により記載された緩衝液中で３０分間
３０℃で処理した。次いで、試料を電気泳動してオートラジオグラフィーに曝露
した。

【０２７１】 図１２Ｂに与えた結果は、一度リン酸化されると、１９６〜３０４ＷＴ基質は
、カルシニューリン及びカルシニューリンにより活性化されるホスファターゼＩ
(Cohen(1989)Annual Rev.Biochem.58:453)によるイン・ビトロ処理により容易に
脱リン酸化されることを示している。これらの結果は、ＮＦ−ＡＴｃの核局在性
を制御するＳＰ反復中の保存されたセリンが細胞キナーゼ及びカルシニューリン
の基質であることを示している。グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３(ＧＳＫ
−３)は、高度に保存されたプロリン指向のセリンスレオニンキナーゼであり、
これは、ＮＦ−ＡＴをイン・ビボでリン酸化し、Ｃａ²⁺／カルシニューリン誘導
される核エントリーに対抗する(下記参照)。ＧＳＫ−３は、ＳＰ反復中の保存さ
れたセリンをイン・ビトロでリン酸化する。これらのＳＲＲ及びＳＰ反復モチー
フ中のセリンは、ＧＳＫ−３コンセンサス基質配列(Fiol等(1994)J.Biol.Chem.,
269:32187-32197)に従う。まとめると、これらの結果は、これらの２つのモチー
フ中の保存されたセリンは細胞のキナーゼによりイン・ビボでリン酸化され、カ
ルシニューリンにより脱リン酸化されることを示している。

【０２７２】 実施例１３：ＳＲＲ中のホスホセリンは、ＮＦ−ＡＴｃ中の分子内相互作用を 制御する 上記の結果は、両塩基性ＮＬＳが、ＳＰ反復及びセリンリッチ領域内のホスホ
セリンと相互作用して非刺激状態での核エントリーを阻止する可能性を高める。
かかる分子内相互作用は、同じタンパク質の別々の部分を、同じペプチド鎖上の
残基の高い有効濃度に等しい濃度で発現させることの困難さの故に識別するのが
困難である。分子内相互作用の検出に対するバリヤーを克服するために、ＮＦ−
ＡＴｃの一部を固定化し、ＣＯＳ細胞抽出物中では発現されている、ＮＦ−ＡＴ
ｃをＣａ²⁺／カルシニューリン制御下でリン酸化して移動させる他の領域を分析
した。

【０２７３】 空の発現ベクター又はＨＡエピトープタグを付けたＮＦ−ＡＴｃのアミノ末端
４１８残基(２〜４１８)をコードするベクター(Northrop(1994)Nature,369:497-
502)でトランスフェクトしたＣＯＳ細胞の抽出物を、ＧＳＴに結合したグルタチ
オン−アガロースビーズとインキュベートし又はＧＳＴのＮＦ−ＡＴｃのＲＳＤ
との融合物(ＧＳＴ−ＲＳＤ)と結合させたビーズとインキュベートした。ＮＦ−
ＡＴｃ１のＲｅｌドメイン、ＧＳＴ−ＲＳＤ(残基４１５〜７１６)よりなるＧＳ
Ｔ融合タンパク質を細菌中で発現させ、グルタチオン−アガロース(Gene,67:31-
40)上でアフィニティー精製した。アミノ末端にＨＡエピトープを付けたＮＦ−
ＡＴｃ１の残基１〜４１８(Nature,369:497-502)をＣＯＳ細胞で発現させ、抽出
物を緩衝液Ａ(J.Biol.Chem.270:19898-19900)中でプロテアーゼ及びホスファタ
ーゼ阻害剤を用いて溶解させることにより作成した。この抽出物の１００μｇを
ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＲＳＤ又はＧＳＴ−ｍＮＬＳ(−２μｇの融合タンパク質)と結
合させた３０μｌのグルタチオン−アガロースと、３００μｌのインキュベーシ
ョン緩衝液(５０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＰＯ₄、０．５％ＮＰ−４０)中でJ.Biol.Chem.270:19
898-19900におけるようにプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤を伴って２時
間４℃でインキュベートし、インキュベーション緩衝液中で３回洗った。アフィ
ニティー選択したタンパク質を洗ったビーズからＳＤＳ試料緩衝液で溶出させ、
７Ａ６(Nature,369:497-502)又は１２ＣＡ５モノクローナル抗体を用いるイムノ
ブロッティングにより検出した。

【０２７４】 図１３Ａに示したように、Ｒｅｌ類似性ドメインと部分的に重複する２つのＮ
ＬＳの１つを含むタンパク質のカルボキシル末端を固定化した(ＧＳＴ４１５〜
７１６)場合には、それは、ＣＯＳ細胞中で発現させた場合は容易に且つ特異的
にＮＦ−ＡＴｃ１のアミノ末端側半分(１〜４１８)と相互作用し、並びにリンパ
球からの抽出物中の内因性タンパク質と相互作用する。

【０２７５】 複数のホスホセリンを含むアミノ末端は、Ｒｅｌ類似性領域内の塩基性残基と
のみ反応し得るので、ｒｅｌ類似性ドメイン内のＮＬＳを変異させて、この変異
したタンパク質のアミノ末端残基１〜４１８に対する結合を分析した。図１３Ｂ
に示したように、カルボキシ末端ＮＬＳのＫＲＫＫ(SEQ ID NO:５６)からＴＲＴ
Ｇ(SEQ ID NO:５５)への突然変異は、アミノ末端４１８残基への結合を完全に破
壊した。

【０２７６】 この変異は、このＮＬＳの変化が依然イン・ビボでＮＦ−ＡＴｎ及びＮＦ−Ａ
Ｔ依存性の転写との協力を許すので、変性を生じることはありそうにない。この
相互作用がアミノ末端中のホスホセリンの存在に対して感受性であることを示す
ために、ＮＦ−ＡＴｃ(１−４１８ＷＴ)のＨＡエピトープタグ付きアミノ末端側
４１８残基又はＳＲＲ若しくはＳＰ反復中にＳ→Ａ突然変異が存在するバージョ
ンでトランスフェクトしたＣＯＳ細胞の抽出物をＧＳＴ−ＲＳＤとインキュベー
トしてから洗った。図１３Ｃに示したように、ＳＲＲ中にＳ→Ａ突然変異を有す
るアミノ末端４１８残基は、タンパク質のカルボキシル末端との減少した会合を
示すが、３つのＳＰ反復中のＳ→Ａの変化は、この会合を一層弱めるように強く
影響を及ぼす。突然変異の各セットは、ＳＤＳ電気泳動における一層迅速な移動
を生じ、これは、これらのＳ→Ａ突然変異がリン酸化を阻害することを示してい
る。ＳＲＲ中の重複しないＳ→Ａ突然変異(図１３Ｃ)も又、この分子内会合アッ
セイで試験した。残基１７２〜１７６のアラニン置換は、ｒｅｌ類似性ドメイン
(ＲＳＤ)との会合を減じるが、１９１〜１９４のセリンのアラニンでの置換は、
ＲＳＤとの会合を変化させない。興味深いことに、分子内会合アッセイにおける
ＲＳＤへの結合とＣａ²⁺／カルシニューリン依存性核エントリーとの間には、相
関があり、ｍ１７２−１７６は、構成的に核にあり、ｍ１９１−１９４は、調節
された核エントリーを受ける。イン・ビトロ分子内会合アッセイにおけるＮＦ−
ＡＴｃの各Ｓ→Ａ変異間の差異が変性に帰することは、すべての変異体が、ＳＰ
反復内のＮＦ−ＡＴｃの領域に対するモノクローナル抗体により免疫沈降され(N
orthrop等(1994)Nature,369:497-502)、細胞中で発現された際に安定であり且つ
ＮＦ−ＡＴ依存性の転写を指示するので、ありそうにない。この結合活性が、完
全長のＮＦ−ＡＴｃ分子間のヘッドトゥーテイルの二量体形成を指示することは
、このタンパク質が溶液中及びＤＮＡに結合した際に単量体である(Hoey等(1995
)Immunity,2:461-472)のでありそうにない。

【０２７７】 従って、ＮＦ−ＡＴｃ内の相互作用は、ＳＲＲ内の残基並びに完全なカルボキ
シ末端ＮＬＳに依存している。ＳＲＲ中の変異体の細胞下局在性とそれらのイン
・ビトロ結合アッセイにおける振る舞いとの間の相関は、この分子内会合がカル
ボキシル末端ＮＬＳの露出と機能を制御していることを示唆している。３つのＳ
Ｐ反復内のＳ→Ａ変化は、ＲＳＤへの結合を弱く撹乱するだけであり、これらの
ホスホセリンがタンパク質のカルボキシル末端との相互作用に強くは関与し得な
いことを示唆する。ＳＰ反復モチーフの脱リン酸化は、他の機構により、多分第
２第３ＳＰ反復の間にある別のＮＬＳの露出によって核局在性を生じ得る。ＮＦ
−ＡＴ中のＮＬＳとリン酸化残基との間の相互作用を表すモデルを図１４に与え
る。このモデルは、ＮＬＳ、ＳＲＲ及びＳＰ反復領域の保存に基づいて、ＮＦ−
ＡＴｃ遺伝子ファミリーの他のメンバーに拡張されよう。ＮＦ−ＡＴｃ３及びＮ
Ｆ−ＡＴｐ(Proc.Natl.Acad.Sci.,93:8907-8912；Nature,382:370-373)のアミノ
末端は、Ｃａ²⁺感受性の核エントリーを受ける。

【０２７８】 実施例１４：ＮＦ−ＡＴキナーゼ活性はＧＳＫ−３と同時精製される この実施例は、ＮＦ−ＡＴのＮ末端をリン酸化するキナーゼ活性がＧＳＫ−３
と同時精製されることを示す。

【０２７９】 ラットの脳からのタンパク質抽出物を、下記のように、ＮＦ−ＡＴキナーゼ活
性について試験した。抽出物を、２容の２０ｍＭ トリス(ｐＨ７．５)、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＥＧＴＡ、２ｍＭジチオスレイトール(ＤＴＴ)及び５０ｍＭ
β−グリセロール−ホスフェート中でプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤[
０．１ｍＭ Ｎａ₃ＶＯ₄、１ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオリド、ペプ
スタチン(１μｇ／ｍｌ)、アプロチニン(１μｇ／ｍｌ)、ロイペプチン(５μｇ
／ｍｌ)及び１ｍＭベンザミジン]を加えてホモジェナイズしたラットの脳から調
製した。８０，０００ｇ上清の一部をＧ−５０サイジングカラムを通して内因性
アデノシン三リン酸(ＡＴＰ)を除去し、グリセロール中で１０％とし、全脳抽出
物(５．５ｍｇ／ｍｌのタンパク質)として用いた。ＮＦ−ＡＴキナーゼ活性をＮ
Ｈ₄ＳＯ₄分画及びホスホセルロース(Ｐ−１１樹脂)上での分離及び２００ｍＭＮ
ａＣｌでの溶出により追跡した。活性画分をプールし、Ｍｏｎｏ−Ｓカラム(Hug
hes等、Eur.J.Biochem.203,305(1991))上で更に精製した。

【０２８０】 カラム画分を、野生型及び変異型ＮＦ−ＡＴペプチドについて、ＮＦ−ＡＴキ
ナーゼ活性について、[γ−³²Ｐ]ＡＴＰを用いてアッセイしてからオートラジオ
グラフィーにかけた。その上、ＮＦ−ＡＴのＮ末端部分(特に、アミノ酸１９６
〜３０４)の分析が推定の重複するＧＳＫ−３コンセンサス部位(ＳＳＸＸＳ(Ｐ)
)の存在を示したので(図１５参照)、カラム画分を、ＧＳ−２、ＧＳＫ−３の特
異的ペプチド基質(Welsh等、J.Biol.Chem.271,11410(1996))のリン酸化について
もアッセイした。加えて、ＧＳＫ−３(Hughes等、Eur.J.Biochem.203,305(1991)
)は、しばしば、プロテインキナーゼＡ(ＰＫＡ)その他のキナーゼにより前にリ
ン酸化されたセリンに隣接するセリンをリン酸化する(Fiol等、J.Biol.Chem.269
,32187(1994))ので、ＰＫＡ予備リン酸化された野生型ＮＦ−ＡＴペプチドのリ
ン酸化も又、基質として利用した。ＮＦ−ＡＴｃ中の幾つかの部位のＰＫＡによ
るリン酸化は、一連のリン酸化依存性の重複するＧＳＫ−３コンセンサス部位を
生成することができた(Foil等、J.Biol.Chem.269,32187(1994))(図１５)。各画
分中のタンパク質の総量も測定した(２８０ｎｍの吸光度により測定)。

【０２８１】 基質のＮＦ−ＡＴペプチドを、ＮＦ−ＡＴｃ１(Durand等、Mol.Cell.Biol.8,1
715(1988)；Cocerill等、同書、15,2071(1995)；Chuvpilo等、Nucleic Acids Re
s.21,5694(1993)；Rooney等、Immunity 2,473(1995)；Goldfield等、J.Exp.Med.
178,1365(1993))の残基１９６〜３０４をコードするＤＮＡ断片をｐＧＥＸ−３
Ｘ中にクローン化してｐＧＳＰを生成することにより調製した。Ｓ→Ａ置換を有
するＧＳＴ融合タンパク質(図１５)、ｐＧＡＰを同様に構築したが、９個のセリ
ンと１０個のスレオニン残基を保持した。細菌により発現されたタンパク質をグ
ルタチオンアガロース上で精製して、１μｇの融合タンパク質を１０μｌのビー
ズスラリー(D.B.Smith及びK.S.Johnson, Gene 67,31(1988))当たり用いた。融合
タンパク質を直接使用し、又は融合タンパク質１μｇ当たり５単位のＰＫＡ(Sig
ma)の添加によりアガロース上で３０℃でキナーゼ緩衝液[２０ｍＭトリス(ｐＨ
７．５)、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂及び１ｍＭ ＤＴＴ]中で１ｍＭ ＡＴＰを用い
て２時間にわたり予備リン酸化し、次いで、洗ってＰＫＡとＡＴＰを除去した。
１単位のＰＫＡを、毎分移される１ｐモルの³²Ｐとして定義する。キナーゼアッ
セイは、グルタチオンセファロース上の融合タンパク質(１μｇ)、[γ−³²Ｐ]Ａ
ＴＰ(４００μＣｉ／μモル)を伴う１００μＭのＡＴＰを、５０μｌのキナーゼ
緩衝液中で３０分間３０℃でインキュベートした。ビーズを、１０μｌのカラム
画分又は全脳抽出物(５５μｇのタンパク質)、２．５単位の精製ＰＫＡ若しくは
ＧＳＫ−３β(New England Biolabs)又は両者とインキュベートした。粗又は部
分精製脳抽出物を用いる実験は、アプロチニン、ロイペプチン及びペプスタチン
(すべて１μｇ／ｍｌ)、０．１ｍＭ β−グリセロール−ホスフェート及び１ｍ
Ｍ Ｎａ₃ＶＯ₄を含んだ。キナーゼ反応を、アガロースビーズを１ｍｌのＴＥＮ
[５０ｍＭ トリス(ｐＨ７．５)、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及
び０．５％ＮＰ−４０]で２回洗ってリン酸化細胞タンパク質を除去することに
より停止させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分画し、オートラジオグラフィーにかけ、
クーマシーで染色して基質が分解されていないことを確実にした。

【０２８２】 このカラムからの画分を用いるキナーゼアッセイの結果は、図１５(パネルＡ
及びＢ)に示してあるが、ＮＦ−ＡＴキナーゼのクロマトグラフィー上の振る舞
いがＧＳＫ−３のそれと類似していたことを示している。特に、ＮＦ−ＡＴキナ
ーゼ活性は、カラムＰ−１１の約３５〜４０画分(図１５Ｂ参照)及びＭｏｎｏ−
Ｓカラムの約１５〜２５画分(図１５Ｃ参照)で最強であることが示された(これ
らは又、最強のＧＳＫ−３活性を有した画分でもある)。事実、ＮＦ−ＡＴキナ
ーゼ活性及びＧＳＫ−３免疫反応性のピークは、第２１画分にある。その上、Ｐ
ＫＡ予備リン酸化された野生型ＮＦ−ＡＴペプチドも又、同じカラム画分により
リン酸化された。対照的に、活性なカラム画分は、変異型ＮＦ−ＡＴ基質ペプチ
ドを有意にリン酸化しなかった。

【０２８３】 ＧＳＫ−３α及びＧＳＫ−３βに対する抗体を用いるタンパク質イムノブロッ
ティングは、それらがＮＦ−ＡＴキナーゼと同時精製され(図１５Ｃ)、ＰＫＡが
Ｍｏｎｏ−Ｓカラムからの部分的に重複するピーク中に溶出されることを確実に
した。事実、ＰＫＡ免疫反応性のピークは、第２４画分にある。従って、これら
の結果は、ＮＦ−ＡＴｃがＧＳＫ−３及びＰＫＡの基質であることがありそうな
ことであることを示している。

【０２８４】 実施例１５：ＧＳＫ−３と他のキナーゼは、協力してＮＦ−ＡＴをリン酸化す る ＮＦ−ＡＴｃのリン酸化におけるＧＳＫ−３の役割を、ＧＳＫ−３を全脳抽出
物から免疫涸渇させることにより評価した。ＧＳＫ−３α及びＧＳＫ−３βに対
する抗血清又は対照用抗体を用いて、これらのタンパク質を全脳抽出物から除去
した。１１０μｇの全脳抽出物中のＧＳＫ−３活性の免疫涸渇を、２００μｌの
ＴＥＮ、１ｍＭ ＤＴＴ並びにプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤(上記と
同じもの)に、３μｇの抗ＧＳＫ−３α(ヒツジポリクローナル、Upstate Biotec
hnology)、抗ＧＳＫ−３β(免疫グロブリンＧ１(ＩｇＧ１)モノクローナル、Tra
nsduction Labs)又は両者及び２０μｌのプロテインＧ−セファロースを加えて
４℃で４時間行った。ＩｇＧ１マウスモノクローナル抗体(ｍＡｂ)Ｍ２(Kodak)
、ヒツジポリクローナル抗ＨＩＶｐ１７(ＮＩＨ)又は両者を、対照用抗体として
用いた。ＮＦ−ＡＴキナーゼアッセイは、２．５μｌの上清(１．２μｇのタン
パク質)(Cook等、EMBO J.15,4526(1996)；Stambolic等、Curr.Biol.6,1664(1996
))を用いた。

【０２８５】 免疫涸渇させた抽出物を、ＰＫＡ予備リン酸化したＮＦ−ＡＴと、[γ−³²Ｐ]
ＡＴＰを含むイン・ビトロキナーゼ反応物中でインキュベートし、³²Ｐ標識され
た基質をオートラジオグラフィーにより検出した。次の２つの基質を用いた：プ
ライミングキナーゼ活性を検出するためのＮＦ−ＡＴ(ＷＴ)及びＧＳＫ−３活性
を検出するためのリン酸化されたＷＴ−ＰＫＡ。一の反応において、５単位の精
製ＧＳＫ−３をその反応物に加えた。

【０２８６】 図１６に示したように、特異的抗体を用いるＧＳＫ−３α及びＧＳＫ−３βの
抽出物からの涸渇は、ＰＫＡにより予備リン酸化されたＮＦ−ＡＴｃに対するＮ
Ｆ−ＡＴキナーゼ活性を完全に且つ特異的に除去した。しかしながら、この免疫
涸渇させた抽出物は、ＮＦ−ＡＴｃをリン酸化する能力を保持し(図１６Ｂ)、こ
れは、少なくとも２つのＮＦ−ＡＴキナーゼ活性(直接ＮＦ−ＡＴｃに対して作
用し得る活性とＮＦ−ＡＴｃの予備リン酸化を必要とする第２の活性)があるこ
とを示した。第２のキナーゼ活性は、ＧＳＫ−３のものであり(免疫涸渇実験に
より示される)、プライミングキナーゼ活性は、イン・ビトロでＰＫＡにより与
えられ得る。しかしながら、抽出物中のＰＫＡの特異的な阻害は、ＰＫＡが、脳
又はリンパ球抽出物中のプライミングキナーゼ活性のすべてを与えるのではない
ことを示す。ＧＳＫ−３免疫涸渇は、基質過剰の条件下では、少しのパーセンテ
ージの基質しかプライムされずそれ故少しのパーセンテージの基質しかその後の
ＧＳＫ−３によるリン酸化に利用され得ないので、プライムされてないＮＦ−Ａ
Ｔ基質のリン酸化に影響しないということに注意すべきである。酵素がこれらの
アッセイにおける限界であるということは、クーマシー染色において基質の移動
度に検出可能な変化(リン酸化を反映する)がないので、ありそうなことである。

【０２８７】 実施例１６：ＰＫＡ及びＧＳＫ−３は、化学量論的にＮＦ−ＡＴｃをリン酸化 する 野生型ＮＦ−ＡＴ融合タンパク質(「ＷＴ基質」と呼ぶ)を、イン・ビトロで、
精製ＰＫＡ及び／又はＧＳＫ−３キナーゼを用いてリン酸化した。ＷＴ基質を２
つのキナーゼとインキュベートした反応において、第１のキナーゼにＷＴ基質を
非放射性ＡＴＰによるリン酸化を完了させ；次いで、ＷＴ基質ビーズを洗って、
キナーゼを除去し、ＷＴビーズを[γ−³²Ｐ]ＡＴＰの存在下に第２のキナーゼに
よってリン酸化した。

【０２８８】 これらの結果は、図１７Ａに示してあるが、ＧＳＫ−３β単独でのリン酸化は
ＮＦ−ＡＴ１モル当たり０．０１モル未満の³²Ｐを取り込んだが、ＰＫＡ単独で
は、ＮＦ−ＡＴ１モル当たり１〜２モルの³²Ｐを与え、ＧＳＫ−３βとＰＫＡの
組合せは、ＮＦ−ＡＴ１モル当たり３〜７モルの³²Ｐを与えたことを示している
。カゼインキナーゼＩＩ(ＣＫＩＩ)及びＣａ²⁺カルモジュリン依存性プロテイン
キナーゼＩＩ(ＣａＭｋＩＩ)は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タ
ンパク質ＮＦ−ＡＴ−ＧＳＴを化学量論的にはリン酸化しなかった。その上、Ｇ
ＳＫ−３βは、ＮＦ−ＡＴｃを、それが先ずＰＫＡによりリン酸化された場合に
のみリン酸化した。類似の結果が、リンパ球から精製した脱リン酸化ＮＦ−ＡＴ
ｃを基質として用いて得られた。

【０２８９】 次いで、ＰＫＡとＧＳＫ−３βが、ＮＦ−ＡＴｃの細胞性リン酸化に寄与して
いるかどうかを、イン・ビボでリン酸化されたＮＦ−ＡＴｃからのトリプシンホ
スホペプチドをＮＦ−ＡＴ融合タンパク質のイン・ビトロリン酸化に由来するも
のと比較することにより試験した。ＮＦ−ＡＴｃを、ＣＯＳ細胞(可逆的Ｃａ²⁺
依存性核局在性を支持する)中で過剰発現させ、[³²Ｐ]オルトホスフェートで標
識した。３μｇのＰＳＨ１０２(Northrop等、Nature 369,497(1994))でトランス
フェクトしたＣＯＳ細胞を、[³²Ｐ]オルトホスフェート(１ｍＣｉ／ｍｌ)で６時
間標識し、ヘマグルチニン(ＨＡ)ｍＡｂ１２ＣＡ５を用いて免疫沈降させ、ポリ
ビニリデンジフルオリドメンブレンにトランスファーし、トリプシンで消化した
。酸化されたペプチド(１０００ｃｐｍ)をセルロース上の電気泳動(ｐＨ１．９
、１０００Ｖ、３０分間)により分離し、次いで、第２の次元でブタノール−酢
酸−ピリジン溶媒を用いるクロマトグラフィー(Boyle等、Methods Enzymol.201,
110(1991))にかけた。一の反応において、ＰＫＡ＋ＧＳＫ−３βでイン・ビトロ
でリン酸化されたペプチドを、イン・ビボでリン酸化されたペプチドと混合して
から、２次元分離を行って、それらが類似していることを確立した。

【０２９０】 結果は、図１７Ｂに示してあるが、ＮＦ−ＡＴ融合タンパク質のイン・ビトロ
リン酸化に由来するものによりイン・ビボでリン酸化されたＮＦ−ＡＴｃに由来
するトリプシンホスホペプチドが、一つのホスホペプチドを除いて同一であった
ことを示している。これらの結果は、ＧＳＫ−３βと他のキナーゼが共力して、
イン・ビボで、ＮＦ−ＡＴを、Ｃａ²⁺依存性核局在性に関与する部位でリン酸化
することを示唆している。

【０２９１】 実施例１７：ＰＫＡ及びＧＳＫ−３によるＮＦ−ＡＴのリン酸化部位 ＧＳＫ−３及びＰＫＡによるリン酸化部位を、イン・ビトロで³²Ｐ標識したト
リプシン断片のエドマン分解により限定した。野生型ＮＦ−ＡＴｃ−ＧＳＴ融合
タンパク質をイン・ビトロでＰＫＡにより[γ−³²Ｐ]ＡＴＰ(５０μＣｉ／μモ
ル)でリン酸化し、Ｘａ因子で開裂させて融合タンパク質を遊離させた。これを
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＰＡＧＥ)で単離し、トリプシンにより
開裂させて、放射性断片を高性能液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)により精製
した。一つの放射性画分は、第２のエドマン分解サイクルにおいて³²Ｐを放出し
、第２位にＳｅｒ²⁴⁵を有するトリプシンペプチドの配列ＡＳＶＴＥＥＳＷＬＧ
ＡＲ(SEQ ID NO:８３)を有した。第２の放射性画分は、第３のエドマン分解サイ
クルにおいて³²Ｐを放出し、ＮＦ−ＡＴｃ配列中にＳｅｒ²⁶⁹を含むトリプシン
ペプチドＫＹＳＬＮＧＲを示す分子サイズを有した。ＮＦ−ＡＴの残基２２３〜
２７７をコードする第２のＧＳＴ融合タンパク質を精製し、イン・ビトロで非放
射性ＡＴＰ及びＰＫＡによりリン酸化し、洗ってから、[γ−³²Ｐ]ＡＴＰ(５０
μＣｉ／μモル)及びＧＳＫ−３βでリン酸化した。この融合タンパク質をＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ上で単離してトリプシンにより開裂させ、２つの放射性断片をＨＰ
ＬＣにより精製した。一つの放射性断片は、トリプシンペプチドＧＬＧＡＣＴＬ
ＬＧＳＰＱＨＳＰＳＴＳＰＲ(SEQ ID NO:８４)を含んだ。

【０２９２】 従って、これらの結果は、ＰＫＡがＮＦ−ＡＴｃ融合タンパク質を２つのセリ
ンにおいてリン酸化することを示している(図１５Ａ)。Ｓｅｒ²⁴⁵のＰＫＡ部位
は、一連の重複するＧＳＫ−３基質部位を造る。ＰＫＡで予備リン酸化されたＮ
Ｆ−ＡＴｃ融合タンパク質のＧＳＫ−３βによるリン酸化は、ＧＳＫ−３部位の
このアレイを含むペプチドを標識した(図１５Ａ)。

【０２９３】 実施例１８：ＧＳＫ−３の過剰発現は、Ｃａ＋＋ＮＦ−ＡＴ誘導される核移行 をブロックする ＧＳＫ−３βによるＮＦ−ＡＴｃリン酸化の生物学的重要性を、その活性を細
胞内で操作し、ＮＦ−ＡＴｃの細胞下局在性に対する効果を測定することにより
評価した。多くの細胞と同様にＧＳＫ−３を発現するＣＯＳ細胞(Woodgett, Met
hods in Enzymology, T.Hunter及びB.M.Sefton編(Academic Press, San Diego,
CA, 1991)、第200巻、第564頁)を、ＦＬＡＧエピトープタグ付きＮＦ−ＡＴｃ１
をコードする１μｇの構築物及び３μｇのＧＳＫ−３発現ベクター又は空のベク
ターで同時トランスフェクトし、それらの細胞を刺激しないままにおき又は２μ
Ｍ イオノマイシンと１０ｍＭ ＣａＣｌ₂(Ｉ＋Ｃａ²⁺)で処理してＮＦ−ＡＴ
ｃの核局在性を誘導した。ヒトＧＳＫ−３βｃＤＮＡ(He等、Nature 374, 617(1
995))をｐＢＪ−５中にクローン化した。ＮＦ−ＡＴｃをＦＬＡＧｍＡｂＭ２及
び間接免疫蛍光法を用いて可視化した。ＣＯＳ細胞ＮＦ−ＡＴ移行アッセイをNo
rthrop等、Nature 369, 497(1994)に記載されたように行った。

【０２９４】 これらの結果は、トランスフェクトされたＮＦ−ＡＴｃファミリーのメンバー
(Shibasaki等、Nature 382, 370(1996)；Luo等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93,89
07(1996))が、内因性ＮＦ−ＡＴｃと同様に、細胞質性であって、細胞内Ｃａ²⁺
を増加させる因子により刺激された場合に核へ移行することを示している。その
上、ＧＳＫ−３βの過剰発現は、ＣＯＳ細胞内で同時発現されたＮＦ−ＡＴｃの
Ｃａ²⁺カルシニューリン誘導される核移行をブロックする。

【０２９５】 他の例においては、内因性ＮＦ−ＡＴ依存性の転写がＧＳＫ−３βの過剰発現
により阻害されることが示された。Ｊｕｒｋａｔ−Ｔ抗原細胞を、２μｇの転写
レポータープラスミド(ＳＥＡＰをコードする遺伝子に結合された、ＮＦ−ＡＴ
依存性レポーター、ＡＰ−１依存性レポーター又はＨＩＶ−ＬＴＲ含有レポータ
ー)と３μｇのＧＳＫ−３β発現用構築物又は空のベクターでトランスフェクト
した。ＮＦ−ＡＴＳＥＡＰ活性を測定して、イオノマイシン刺激された及びホル
ボール１２−ミリステート１３−アセテート(ＰＭＡ)刺激された対照の活性のパ
ーセンテージとして表し；ＡＰ−１及びＨＩＶ−ＬＴＲＳＥＡＰ活性は、ＰＭＡ
刺激した活性のパーセンテージとして表す(Spencer等、Science 262, 1019(1993
))。これらの結果は、図１８、パネルＡに描いてあるが、ＧＳＫ−３箇条発現が
ＮＦ−ＡＴ依存性のレポーター遺伝子の発現を阻害することを示している。ＡＰ
−１依存性のレポーター遺伝子の発現も又、おそらくｃ−Ｊｕｎに対する阻害的
リン酸化を生成するＧＳＫ−３の能力のために、ＧＳＫ−３の過剰発現によりダ
ウンレギュレートされた(Mikolakaki等、Oncogene 8, 833(1993))。ＧＳＫ−３
は、ＨＩＶ−ＬＴＲ依存性レポーター遺伝子の発現に対する阻害効果を有しなか
った。

【０２９６】 更に別の例においては、様々なセリンスレオニンキナーゼの、ＣＯＳ細胞中の
同時トランスフェクトされたＮＦ−ＡＴｃの核エントリーを阻害する能力を比較
した。従って、ＣＯＳ細胞を、１μｇのＦＬＡＧエピトープタグ付きＮＦ−ＡＴ
ｃ１と１μｇのセリンスレオニンキナーゼＣＫＩＩ、ＣａＭｋδＡ、ＣａＭｋδ
Ｂ、ＰＫＡ若しくはＰＫＣ又は３μｇのＧＳＫ−３β又は０．５μｇのＥＲＫで
同時トランスフェクトした。ＥＲＫｃＤＮＡを、ｐＢＪ−５中にクローン化した
。キイロショウジョウバエのＣＫＩＩｃＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応により
増幅して、ｐＢＪ−５中にクローン化した。マウスのＰＫＡｃＤＮＡとＰＫＣ−
βの活性型を、ｐＳＲα中にクローン化した。カルシニューリンＡ及びＢの発現
用構築物(Clipstone及びCrabtree, Nature 357, 695(1992))、ＣａＭｋＩＩ構築
物(Srinivasan等、J.Cell Biol.126,839(1994))、ＣＯＳ細胞ＮＦ−ＡＴ転写ア
ッセイ、及びＪｕｒｋａｔ−Ｔ抗原細胞転写レポーターアッセイ(Northrop等(19
94)Nature 369:497)は、記載された通りであった。トランスフェクトされた細胞
を、イオノマイシンと１０ｍＭ Ｃａ²⁺で刺激し、核、細胞質又は両区画に局在
化されたＮＦ−ＡＴを発現している細胞のパーセンテージを視覚的に評価して発
現細胞のパーセンテージとして与える。トランスフェクトされたＥＲＫキナーゼ
を、ＰＭＡ(２５ｎｇ／ｍｌ)を加えることにより活性化した。ＨＡエピトープタ
グ付きキナーゼの相対的な発現の比較を、１５μｇの全細胞抽出物のＨＡｍＡｂ
１２ＣＡ５を用いるイムノブロッティングにより行った。

【０２９７】 これらの結果は、図１８Ｂに与えてあるが、ＧＳＫ−３は、一層少量で発現さ
れても、ＮＦ−ＡＴｃの核エントリーの阻止において最も活性であったことを示
している。ＰＫＡの過剰発現は、ＮＦ−ＡＴｃの局在性に殆ど影響を有しなかっ
た。これは、内因性ＰＫＡ活性又は他のキナーゼがＣＯＳ細胞中のＮＦ−ＡＴｃ
をリン酸化するのに十分であること又はかかるリン酸化が核エキスポートに必要
であるが十分ではないことを示すのであろう。従って、これらの結果は、Ｃａ²⁺ カルシニューリンシグナリング経路がＧＳＫ−３により妨害されることを示す。

【０２９８】 実施例１９：ＧＳＫ−３の過剰発現は、ＮＦ−ＡＴの核エキスポートを促進す る この実施例は、ＮＦ−ＡＴの核エキスポートに対するＧＳＫ−３の効果を、先
ずその核への移行を細胞をイオノマイシンで刺激することにより引き起こし、次
いで、Ｃａ²⁺カルシニューリンシグナルを排除し、更なる核インポートをカルシ
ニューリン阻害剤ＦＫ５０６でブロックすることにより記載する(Clipstone及び
G.R.Crabtree, Nature 357, 695(1992))。

【０２９９】 ＣＯＳ細胞を、ＦＬＡＧエピトープタグ付きＮＦ−ＡＴｃ１(１μｇ)、カルシ
ニューリンＡ及びＢ(各０．５μｇ)をコードする発現用構築物(N.A.Clipstone及
びG.R.Crabtree, Nature 357, 695(1992))、及び２μｇのベクターＧＳＫ−３β
又はＧＳＫ−ＫＭ、触媒的に不活性なＧＳＫ−３β(He等、Nature 374, 617(199
5))で同時トランスフェクトした。細胞を、図１５Ａ中の下線を付したセリンが
カルシニューリンとＧＳＫ−３βによりアラニンに変化されたＮＦ−ＡＴｃ１の
バージョンでも同時トランスフェクトした。Ｃａ−カルシニューリンを含むこと
は、ＮＦ−ＡＴｃの核エントリーを促進し(Shibasaki等、Nature 382, 370(1996
)；Luo等、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 93, 8907(1996))、ＧＳＫ−３βの過剰発
現により誘導されるＮＦ−ＡＴｃの細胞質局在性を克服する。野生型ＮＦ−ＡＴ
ｃは、刺激してない発現細胞の９８％においてサイトゾル中に局在し、９０％の
細胞が、Ｉ＋Ｃａ²⁺処理によりＮＦ−ＡＴｃを核に移行させたが、この移行はＦ
Ｋ５０６により完全にブロックされた。ＮＦ−ＡＴｃは、Ｉ＋Ｃａ²⁺で６０分間
処理することにより核に局在し、次いで、培地をＦＫ５０６(２０ｎｇ／ｍｌ)を
含む培地に変えてＣａ²⁺シグナリングを終了させ且つＮＦ−ＡＴｃの核再エント
リーをブロックした。トランスフェクトされたＮＦ−ＡＴｃを、間接免疫蛍光法
によりＦＬＡＧｍＡｂＭ２を用いて検出し、２００の発現細胞を、ＮＦ−ＡＴｃ
の細胞質、核又は両区画での発現につき評価した。

【０３００】 これらの結果は、図１９に示してあるが、ＧＳＫ−３βの過剰発現(ＮＦ−Ａ
Ｔｃの量の約１／１０の量)がＮＦ−ＡＴｃの細胞質への移動を、ベクター又は
触媒的に不活性な型のＧＳＫ−３β(He等、Nature 374, 617(1995))をトランス
フェクトされた細胞と比べて促進したことを示している。ＧＳＫ−３βの過剰発
現は、セリン−プロリン反復中にＳ→Ａ変異を有するＮＦ−ＡＴｃの構成的な核
局在性に影響を与えなかった。これらのデータは、ＧＳＫ−３βが、触媒的に作
用してＮＦ−ＡＴｃの核エキスポート指示すること及び核エキスポートの調節が
ＮＦ−ＡＴｃの保存されたセリンでのリン酸化を含むことを示している。ＮＦ−
ＡＴｃファミリーのメンバーは多くの組織で発現され、核インポート及びエキス
ポートに関与するＮＨ₂末端残基において配列類似性を有するので、ＧＳＫ−３
が４つの異なるＮＦ−ＡＴｃファミリーメンバーの各々の区画化を制御すること
はありそうなことである。

【０３０１】 実施例２０：ＮＦ−ＡＴは、心臓肥大の治療用標的である Ｃａ⁺⁺／カルシニューリン／ＮＦ−ＡＴシグナリング経路。 このＮＦ−ＡＴ転写因子は、最初は、Ｔ細胞において、ヒトＩＬ２プロモータ
ー(１，２)の遠位抗原レセプター応答エレメントＡＲＲＥ−２に結合する迅速に
誘導されるタンパク質複合体として記載された。この活性な転写因子は、細胞質
成分(ＮＦ−ＡＴｃ)及び核成分(ＮＦ−ＡＴｎ)から作られる(３)。この転写因子
のＮＦ−ＡＴｃファミリーは、少なくとも４つの別個の遺伝子ＮＦ−ＡＴｃ１、
ｃ２、ｃ３、ｃ４によりコードされる(Genome Data Base (GBD) Nomenclature C
ommittee)(４−９)。ＮＦ−ＡＴｃファミリーのタンパク質は、組織分布の特異
的なパターンを示す(表１)。

【０３０２】

【表４】

【０３０３】 ＮＦ−ＡＴ依存性転写の活性化は、少なくとも３つの異なるシグナリング経路を
統合する。ＮＦ−ＡＴｃは、細胞質内に隔離され、[Ｃａ⁺⁺]の上昇に応じて迅速
に核に移行する(３、１０−１２)。この細胞質から核への移行は、カルシニュー
リンによるＮＦ−ＡＴｃの脱リン酸化を必要とし、カルシニューリンの活性を選
択的に阻害する免疫抑制剤シクロスポリンＡ(ＣｓＡ)及びＦＫ５０６によりブロ
ックされる(１３−２１)。ＮＦ−ＡＴｎの誘導及び／又は活性化は、Ｒａｓ／Ｍ
ＡＰＫ経路からのシグナル(７，１０，２２)及び細胞骨格のＲａｃ／ＣＤＣ４２
依存性の再編成を必要とする((２３))。各ＮＦ−ＡＴｃファミリーメンバーは、
２つの主要な機能的ドメイン、Ｎ末端調節領域又はＮＦ−ＡＴ相同領域(ＮＨＲ)
及びＣ末端ＤＮＡ結合ドメイン(ＤＢＤ)又はＲｅｌ相同性ドメイン(ＲＨＤ)を含
む。このＮ末端調節ドメインは、ＮＦ−ＡＴｃタンパク質の調節された核インポ
ート及びエキスポートに必要十分である。Ｎ末端領域内には、セリンリッチ領域
(ＳＲＲ)及び３つのセリンプロリン(ＳＰ)反復を含む幾つかの保存されたモチー
フがあり、それらは、プロリン指向性キナーゼ部位である(８，１９，２４)。こ
れらのモチーフは、対抗するキナーゼとホスファターゼによる両方向性ＮＦ−Ａ
Ｔｃ調節の標的である。これらのモチーフ中の保存されたホスホセリンは、カル
シニューリンの基質として働き、セリンスレオニンキナーゼのグリコーゲンシン
ターゼキナーゼ−３(ＧＳＫ−３)は、ＮＦ−ＡＴｃを、これらの保存されたセリ
ン残基でリン酸化してＣａ⁺⁺／カルシニューリン誘導される核エントリーに対抗
する(２４)。高度に保存されたＣ末端のＤＮＡ結合ドメインは、Ｒｅｌファミリ
ータンパク質のＤＮＡ結合ドメインとの中位の配列相同性を示し且つトポロジー
を共有するが、臨界的残基の弛緩のために、単独では生理的濃度でＤＮＡに結合
しない(２５−３０)。従って、すべてのＮＦ−ＡＴｃタンパク質は、ＤＮＡへの
結合のための核内パートナー(ＮＦ−ＡＴｎ)を必要とする。ＡＰ−１ファミリー
メンバー、Ｆｏｓ及びＪｕｎのヘテロ二量体結合は、ＮＦ−ＡＴｎとして機能す
ることが示されてきた(２５，３０，３１)。ＮＦ−ＡＴｃとＡＰ−１は、共同し
て、近接した認識部位に結合し、相乗的に遺伝子発現を活性化する(２５，２８
，３２)。加えて、亜鉛フィンガー転写因子ＧＡＴＡ４は、心筋細胞における転
写の活性化においてＮＦ−ＡＴｃ４と共同することが示されている。

【０３０４】 心臓肥大 米国では、毎年５０万人の新たな心臓病患者が診断され、死亡率は約５０％で
ある。心臓肥大は、心筋の一般的拡大であり、初期には、心臓の出力を増す心筋
の代償性応答である。しかしながら、持続的肥大は、拡張型心筋症、機能不全、
心臓麻痺及び突然死を生じ得る。様々な根底にある病状例えば高血圧、心筋梗塞
、不整脈、内分泌異常及び心臓タンパク質(３３−３５)遺伝子の遺伝的変異は、
肥大型心筋症(ＨＣＭ)を生じ得る。トランスジェニックマウスの心臓における構
成的に活性な／Ｃａ⁺⁺非依存型のカルシニューリンの又は構成的に核型のＮＦ−
ＡＴｃ４の過剰発現は、心臓肥大に典型的な分子的及び病態生理学的変化を引き
起こし、ヒトの心臓病の病理学的な面をすべて真似る(３６)。これらのカルシニ
ューリントランスジェニック動物におけるＨＣＭの進展は、シクロスポリンＡ(
ＣｓＡ)処理によりブロックされ、これは、カルシニューリンのホスファターゼ
活性がＨＣＭの誘発に必須であることを示している。心筋細胞における肥大応答
を誘導するアンギオテンシンＩＩ及びフェニレフリンによる心筋細胞の刺激は、
心筋細胞におけるＮＦ−ＡＴ依存性の転写を活性化する。その上、ＣｓＡとＦＫ
５０６は、アンギオテンシン及びフェニレフリン誘導された肥大応答をイン・ビ
トロでブロックする。ＣｓＡは又、トロポモジュリン、ミオシン軽鎖−２、胎児
β−トロポミオシン等の収縮性心臓タンパク質の突然変異に基づく３種類のマウ
スモデルにおいてＨＣＭの進展をブロックすることが示されている(３３)。加え
て、ＣｓＡ及びＦＫ５０６処理は、ラットの大動脈バンディングにより引き起こ
される圧負荷誘発性肥大を阻止した。これらのデータは、Ｃａ⁺⁺／カルシニュー
リン／ＮＦ−ＡＴｃシグナリング経路がＨＣＭの開始に重大な役割を演じている
ことを示している。すべての肥大刺激は、細胞内Ｃａ⁺⁺レベルを増加させる(３
７−３９)。この細胞内Ｃａ⁺⁺の増加は、直接、カルシニューリンを活性化する
ことができた。カルシニューリンの活性化は、ＮＦ−ＡＴｃタンパク質の脱リン
酸化と核移行によってＨＣＭを開始することができた。ＮＦ−ＡＴｃ依存性の転
写は、肥大応答遺伝子を誘導することができた。

【０３０５】 電圧ゲートＣａ⁺⁺チャンネル(ＶＳＣＣ)は、心筋の発達と収縮性において、中
心的役割を演じる。ＶＳＣＣは、活動電位の急速なアップストローク中の膜脱分
極により開く。遅れた脱分極とＣａ⁺⁺ホメオスタシスの変化を伴う活動電位持続
時間の延長は、ヒトの心臓病及び心臓肥大の動物モデルにおける一般的所見であ
る。心筋細胞は、高電圧活性化Ｌ型ＶＳＣＣと低電圧活性化Ｔ型ＶＳＣＣを発現
する。Ｌ型Ｃａ⁺⁺チャンネルは、心筋における興奮−収縮カップリングにおいて
中心的役割を演じ、従って、イオノトロピーの鍵となるレギュレーターである。
Ｌ型ＶＳＣＣからのＣａ⁺⁺流入は、心収縮期において、筋小胞体(ＳＲ)からのＣ
ａ⁺⁺放出を増大させて、収縮を開始する。心筋において、ＶＳＣＣからのＣａ⁺⁺ 流入は、カテコールアミンの作用と密接に関係している。心筋細胞のβ−アドレ
ナリン様の刺激は、細胞内ｃＡＭＰの増大したレベルにより、Ｌ型ＶＳＣＣが開
く確立を増大させる。加えて、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼＡ経路のβ−
アドレナリン様の刺激は、ＳＲＣａ⁺⁺−ＡＴＰアーゼのＣａ⁺⁺に対する親和性を
、調節タンパク質ホスホランバンのリン酸化により増大させ、そうして、ＳＲの
Ｃａ⁺⁺充填状態を増大させる。ＳＲの充填状態は、次の収縮期の収縮力を決定す
る。加えて、Ｌ型ＶＳＣＣからのＣａ⁺⁺流入は、ニューロン(４０)と骨格筋(４
１)における遺伝子転写の引き金を引くことができる。心臓におけるＴ型チャン
ネルは、Ｌ型チャンネルより一層低密度で存在する。Ｔ型チャンネルの役割は、
十分に限定されていない。Ｔ型チャンネルは、胎児の心臓の発生中及び潜在的に
病理的状態例えば肥大(４２)において、心臓の律動的活動において役割を演じて
いると考えられる。

【０３０６】 研究結果 我々は、相同組換えを利用して、心臓肥大においてEric Olson博士のグループ
が関わってきたＮＦ−ＡＴｃ４タンパク質のアミノ酸１〜４３８をコードするＮ
Ｆ−ＡＴｃ４遺伝子のエキソン１、２及びエキソン３の部分を欠失させた。マウ
ス１２９ライブラリーから得た１５キロベースのゲノムクローンを用いて、ポジ
ティブ／ネガティブ選択により相同組換え用ターゲティングベクターを構築した
。ＰＧＫ−ｎｅｏカセットを、ＮＦ−ＡＴｃ４遺伝子の第１、第２及び第３エキ
ソンに逆向きに挿入して、ＮＦ−ＡＴｃ４の調節領域とＤＮＡ結合ドメインの部
分を欠失させた(図１)。標的のＥＳ細胞クローンを、Ｃ５７Ｂ１／６胚細胞への
マイクロインジェクションのために用い、その後、偽妊娠ＣＤ−１雌の子宮へ移
した。雄のキメラマウスをＣＤ−１、Ｃ５７Ｂ１／６及び１２９Ｓｖ雌と交配さ
せ、その結果生成したヘテロ接合マウスを繁殖させてホモ接合とした。このホモ
接合のＮＦ−ＡＴｃ４ノックアウトマウスは、利用可能であり、それ故、心臓の
機能について試験することができる。

【０３０７】

【０３０８】同等物 当業者は、ここに記載したこの発明の特定の具体例の多くの同等物を認識し、
日常的実験を用いて確かめることができよう。かかる同等物は、後記の請求の範
囲に包含されるものである。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 図１ＡはヒトＮＦ−ＡＴｃｃＤＮＡ（配列番号４５）のヌクレオチド配列と、
それから誘導したアミノ酸配列（配列番号４６）を示す。Ｎは配列に曖昧さが存
在することを示す。

【図１Ｂ】 図１ＢはヒトＮＦ−ＡＴｃｃＤＮＡ（配列番号４５）のヌクレオチド配列と、
それから誘導したアミノ酸配列（配列番号４６）を示す。Ｎは配列に曖昧さが存
在することを示す。

【図２】 図２はＴ細胞（Jurkat）及び非Ｔ細胞（Cos）中のＮＦ−ＡＴｃ蛋白質の発現
を示す。

【図３Ａ】 図３ＡはＮＦ−ＡＴｃｃＤＮＡクローンが、ＮＦ−ＡＴ部位からの転写を活性
化しそして非Ｔ細胞中のＩＬ−２プロモータを活性化できる蛋白質をコードする
ことを示す。

【図３Ｂ】 図３ＢはＮＦ−ＡＴｃｃＤＮＡクローンが、ＮＦ−ＡＴ部位からの転写を活性
化しそして非Ｔ細胞中のＩＬ−２プロモータを活性化できる蛋白質をコードする
ことを示す。

【図４Ａ】 図４ＡはＮＦ−ＡＴｃ、ＮＦ−ＡＴｐ及びＲｅｌ族メンバーの間のＲｅｌ相同
領域における相同性を示す。マウスのＮＦ−ＡＴｐ及びＲｅｌ蛋白質ドーサル（
ショウジョウバエの軸椎決定蛋白質）（配列番号４７）、ヒトｃ−Ｒｅｌ（配列
番号４８）、ＮＦ−κＢｐ５０（配列番号４９）及びＮＦ−κＢｐ６５（配列番
号５０）の蛋白質配列が、ＮＦ−ＡＴｃ（配列番号５１）及びＮＦ−ＡＴｐ（配
列番号５２）の配列に対して並べてある。番号付けはＮＦ−ＡＴｃに対するもの
である。ＮＦ−ＡＴｃへの同一性は白抜きの四角で、また、公知の残基又は構造
は陰領域でしました。星印は１）ＮＦ−ＡＴｃが他のＲｅｌ蛋白質の大多数に対
して反転電荷を有すること、２）ＮＦ−ＡＴｃがヒスチジン又は他のキレート残
基で潜在的な塩ブリッジを置換したことを示す。下側部分はＮＦ−ＡＴｃ及びＮ
Ｆ−ＡＴｐの模式図である。

【図４Ｂ】 図４ＢはＮＦ−ＡＴｃ、ＮＦ−ＡＴｐ及びＲｅｌ族メンバーの間のＲｅｌ相同
領域における相同性を示す。マウスのＮＦ−ＡＴｐ及びＲｅｌ蛋白質ドーサル（
ショウジョウバエの軸椎決定蛋白質）（配列番号４７）、ヒトｃ−Ｒｅｌ（配列
番号４８）、ＮＦ−κＢｐ５０（配列番号４９）及びＮＦ−κＢｐ６５（配列番
号５０）の蛋白質配列が、ＮＦ−ＡＴｃ（配列番号５１）及びＮＦ−ＡＴｐ（配
列番号５２）の配列に対して並べてある。番号付けはＮＦ−ＡＴｃに対するもの
である。ＮＦ−ＡＴｃへの同一性は白抜きの四角で、また、公知の残基又は構造
は陰領域でしました。星印は１）ＮＦ−ＡＴｃが他のＲｅｌ蛋白質の大多数に対
して反転電荷を有すること、２）ＮＦ−ＡＴｃがヒスチジン又は他のキレート残
基で潜在的な塩ブリッジを置換したことを示す。下側部分はＮＦ−ＡＴｃ及びＮ
Ｆ−ＡＴｐの模式図である。

【図５Ａ】 図５Ａは、Ｊｕｒｋａｔ細胞（レーン１−６）又はＨｅｌａ細胞（レーン７）
からのＲＮＡでのヒトＮＦ−ＡＴｃのリボヌクレアーゼ保護を示す。期待される
特定のリボヌクレアーゼ抵抗性の断片は３０４個のヌクレオチド（矢印）である
。Ｈｅｌａ細胞は刺激されなかった。Ｊｕｒｋａｔ細胞は２０ng／ml PMA及び２
ｕＭのイオノマイシン（ionomycin）で刺激されない、又は３時間刺激された後
に表示の時間でプラス又はマイナス１００ng／ml ＣｓＡが添加された。

【図５Ｂ】 図５Ｂは、ヒト細胞ＫＪ（ｐｒｅＢ細胞ＡＬＬ）、ＪＤ−１（Ｂ細胞リネージ
ュＡＬＬ）、Ｋ５６２（赤白血病細胞系統）、ＣＭＬ（骨髄白血病を持つ患者の
骨髄細胞）、ヒト筋細胞、Ｈｅｐ Ｇ２（肝臓細胞系統）、ＨＰＢ ＡＬＬ（２
μｇ／ｍｉ ＰＨＡ及び５０ｎｇ／ｍｌ ＰＭＡで３時間刺激された又は刺激さ
れないＴ細胞系統）、及びリボヌクレアーゼ保護により分解されたＨｅｌａ細胞
からのＲＮＡを示す。このゲルの長い露出はK５６２細胞系統が少量のＮＦ−Ａ
Ｔｃ転写量を有することを示す。

【図５Ｃ】 図５Ｃはマウス組織とＮＦ−ＡＴ−Ｔａｇ形質転換（トランスジェニック）マ
ウスからの皮膚腫瘍 （Verweij et al. （１９９０） J. Biol. Chem １５７８
８-１５７９５）におけるＮＦ−ＡＴｃ（上側図）及びＮＦ−ＡＴｃ（下側図）
ｍＲＮＡ発現を示す。細胞は刺激されないか又は２０ｎg／ml PMA及び２ｕＭで
３時間刺激された。ＲＮＡはマウスｃＤＮＡプローブを使用した定量リボヌクレ
アーゼ保護により測定した。プローブに相同の断片の予想された寸法はなじる子
により示されている。

【図６Ａ】 図６ＡはＮＦ−ＡＴ又はＨＮＦ−１（β２８）に対するリポータ構造体で感染
されたＣｏｓ細胞とＪｕｒｋａｔ細胞を示す。ＮＦ−ＡＴｃ（+ＮＦ−ＡＴ） 又
は HNF-la （+HNF-１） に対する共感染発現ベクトルは、指示されている場合に
含まれ、そうでない場合はpBJ５ベクターが含まれる。細胞は指示のようにPMA、 P + I （PMAとイオノマイシン）で刺激された。

【図６Ｂ】 図６ＢはIL-２ルシフェラーゼで感染されたCos細胞と、図Ａにおけると同様な
発現ベクトルを示す。刺激はＡと同様である。図ＡとＢのデータは空pBJ５ベク
ターを有する非刺激値に対するルシフェラーゼ仮性の誘導倍数として表されてい
る。バーは２〜３の独立した感染の平均と範囲を示す。

【図６Ｃ】 図６ＣはＣｏｓ細胞中のＮＦ−ＡＴｃ発現が、特異的ＤＮＡ結合活性を生じさ
せることを示す。pBJ５（レーン１及び３）及びＮＦ−ＡＴc （レーン２及び４
−７）により感染されたＣｏｓ細胞からの核抽出物、非感染Ｊｕｒｋａｔ細胞（
レーン８−１１）からの核抽出物、pBJ５−又は ＮＦ−ＡＴc感染Cos細胞 （レ
ーン１２−１３、１５−１６） をHela核抽出物（レーン１５−１６）と組み合
わせたものからのサイトソル（液性細胞質）を使用したゲル易動度シフトである
。Ｈｅｌａ核抽出物は単独。標識したＡＰ−１（レーン１−２）又は ＮＦ−Ａ
Ｔ （レーン３−１６）プローブと冷競合オリゴヌクレオチドが示されている。
矢印は特定のＡＰ−１とＮＦ−ＡＴの複合体を示す。

【図６Ｄ】 図６ＤはＮＦ−ＡＴの抗血清誘導のスーパーシフトを示す。刺激したマウスＪ
ｕｒｋａｔ細胞又はマウス胸腺細胞からの核抽出物を用いたのＮＦ−ＡＴ及び
ＡＰ−１のゲル易動度である。抗血清、予備免疫なしか、又は２種の異なった免
疫抗血清かが指示のように含まれていた。矢印は特定のＮＦ−ＡＴ又はＡＰ１複
合体又はスーパーシフトされた複合体（＊）を含んでいた。

【図７】 図７は優性陰性ＮＦ−ＡＴｃを示す。Ｊｕｒｋａｔ Ｔａｇ細胞がベクタープ
ラスミド（対照）又は優性陰性ＮＦ−ＡＴｃプラスミド、並びに指示の分泌アル
カリ性ホスホターゼレポータプラスミドで感染された。感染細胞はその後に新規
な培地で２４時間培養され分泌されたアルカリホスホターゼの活性が、１ｕＭア
イノマイシと ２０ｎｇ／ｍｌ ＰＭＡ（ＮＦ−ＡＴ及びＩＬ−２レポータ）又
は２０ｎｇ／ｍｌ ＰＭＡ単独（ＡＰＩレポータ）で刺激した後又は無刺激（RS
Vレポータ）で１６時間から２４時間後に測定された（Clipstone and Crabtree
（１９９２）Nature ３５７：６９５−６９８）。バーは優性陰性（dominant ne
gative）ＮＦ−ＡＴｃに感染した細胞からの分泌アルカリホスホターゼの活性を
、対照のプラスミドでへ移行して感染した細胞からの活性に対する百分率で示し
、また（ｎ）の独立した感染から得たデータを示す。優性陰性ＮＦ−ＡＴｃはア
ミノ酸４６３のＰｖｕＩＩに延長するエピトープ標識ＮＦ−ＡＴｃのカルボキシ
末端切断よりなる。

【図８】 図８はＪｕｒｋａｔ細胞で発現されるエピトープ標識ＮＦ−ＡＴｃの易動度の
変化を示す。細胞は図２のようにＮＦ−ＡＴｃで感染され、示したように２時間
、プラスマイナス１００ng／ml CsAで刺激された。全ての細胞溶解物は図２のよ
うにしてウエスタンブロットにより分析された。

【図９Ａ】 図９ＡはFLAGエピトープ標識ＮＦ−ＡＴｃ蛋白質の図を示し、Ｒｅｌ類似領域
（ＲＳＤ）、２つの核移行配列（ＮＬＳ）、保存されたセリンリッチ領域（SRR
）のそれぞれの位置を示し、又３繰返しリッチはセリンとプロリンである（SP１
, SP２, SP３）。

【図９Ｂ】 図９Ｂは細胞のイオノマイシンとカルシウム（I + Ca++）で、又はFK５０６pl
us （I+Ca++ + FK５０６） での異なった時間で処理された、又はイオノマイシ
ンと ２.５ mM EGTA （I + EGTA）で６０分処理された後に、核中でＮＦ−ＡＴ
ｃ１を発現するＮＦ−ＡＴｃ（SH１６０c）により移行的に感染されたＣｏｓ細
胞の百分率を示す図である。

【図９Ｃ】 図９Ｃはセリンリッチ領域 （SRR） 及び緑蛍光蛋白質（GFP）に融合した３セ
リンプロリンリッチ領域（SP１, SP２, SP３）を含むＮＦ−ＡＴｃ１のアミノ酸
１〜１４８を含むＮＦ−ＡＴ融合蛋白質 CA４l８-GFPを示す図である。

【図９Ｄ】 図９Ｄは、イオノマイシンとカルシウムで１時間刺激した後、培地をFK５０６
を含有する培地で置換した後の、細胞質ＮＦ−ＡＴを有するＮＦ−ＡＴc１ （□
） 又はＮＦ−ＡＴ（C△４１８）-GFP （Ｏ）をコードする構造体（constructs
）で移行的に感染されたＣｏｓ細胞の百分率を示す。細胞質中でＮＦ−ＡＴｃを
発現する細胞及び細胞質及び核内でＮＦ−ＡＴｃを発現する細胞を添加し、分析
された発現細胞の全数で割った。

【図１０】 図１０はFLAGエピトープとＮＦ−ＡＴｃ１の第２アミノ酸の間に挿入されたSV
４O大型T抗原からの野生型ＮＬＳのゼロ、１つ又は２つのコピー、又はＮＬＳ（
ＮＬＳ-T）の変異体の１つ又は２つのコピー、に融合したＮＦ−ＡＴｃ１をコー
ドする構造体を細胞に移行的に感染させ、続いて核内のＮＦ−ＡＴを発現するＣ
ｏｓ細胞の百分率を示す図である。細胞はアンチFLAG抗体で染色した。

【図１１Ａ】 図１１ＡはＮＦ−ＡＴc１ （配列番号５３及び配列番号５４）における２つの
保存された推定のＮＬＳのアミノ酸配列（配列番号５３及び配列番号５４）と、
それらの配列番号３８における位置を示す。

【図１１Ｂ】 図１１ＢはＮＦ−ＡＴc１と２つのＮＬＳのアミノ酸配列を示し、それらの上
には変異体ＮＬＳのアミノ酸配列（TRTGは配列番号５５を有し、 KRKKは配列番
号５６を有する）を示す。図の下側には、細胞の移行敵艦線に続いたイオノマイ
シンとカルシウムで６０分刺激した後に、核内で野生型ＮＦ−ＡＴ又は変異ＮＦ
−ＡＴを発現するＣｏｓ細胞の百分率を示す（変異Ｎ末端ＮＬＳを有するＮＦ−
ＡＴｃ１蛋白質に対応するｍ２６５、及びｍ２６５変異体とＣ末端ＮＬＳの変異
体を含むｍ２６５＋６８２）。核（薄い陰影領域）、細胞質（実線領域）又は両
区分（濃い陰影部分）における細胞染色の割合を決定した。

【図１２Ａ】 図１２ＡはＮＦ−ＡＴｃ１からのSRRのアミノ酸配列（配列番号３８のアミノ
酸１７０〜１９４、配列番号５７に記述）と、指示されたセリンからアラニンの
置換（配列番号５８〜６３）を有するＮＦ−ＡＴｃ１蛋白質の細胞移行（核Ｎ又
は細胞質Ｃ）を示す。

【図１２Ｂ】 図１２Ｂはウエスタンブロットの写真であり、ＮＦ−ＡＴｃ（ＷＴ）のアミノ
酸１９６〜３０４を含むホスホリル化GST-NF-ATc融合蛋白質、又は３つのＳＰ繰
り返しにおけるセリンからアラニンへに変異体（S−＞A）であって、[γ-³²P]AT
Pでの培養によるホスホリル化、細胞ＮＦ−ＡＴキナーゼ活性（脳抽出物）の部
分精製、次いで上記ホスホターゼでの培養、そして電気泳動による分離、及びオ
ートラジオグラフィー撮像（頂部レーン）したものを示す。底部のレーンはCoom
assie染色により化しかされた各試料中のＮＦ−ＡＴの量を示す。

【図１３】 図１３Ａは空発現ベクター（Vector）又はＮＦ−ＡＴｃのＨＡエピトープ標識
アミノ末端４１８残基（２−４１８）をコードするベクターで感染させたＣｏｓ
細胞の抽出物の、GSTに結合したグルタチオンアガロースビーズによる又はＮＦ
−ＡＴｃのRSDとの融合体GST（GST-RSD）に結合したビーズと共に培養したもの
による、親和精製の結果を示すウエスタンブロットの写真である。親和により選
択した蛋白質はアンチHA １２CA５抗体により免疫ブロットすることにより検出
された。図の左側はアガロースビーズに固着したＮＦ−ＡＴポリペプチド及びビ
ーズ上で親和精製したＮＦ−ＡＴポリペプチドのグラフ表示である。 図１３ＢはGST-RSD又はカルボキシ末端ＮＬＳ （mＮＬＳ）における変異体を
持ち、ＮＦ−ＡＴｃのＨＡエピトープ標識アミノ末端４１８残基（２〜４１８）
をコードする構造体又はベクター単独で感染させたＣｏｓ細胞からの親和生成物
の結果を示すウエスタンブロットの写真である。結合した蛋白質は１２CA５抗体
で検出した。図の左側はこの例で使用されたＮＦ−ＡＴポリペプチドのグラフ表
示である。 図１３ＣはＮＦ−ＡＴｃのＨＡエピトープ標識アミノ末端４１８残基（２〜４
１８Ｗ）又はＳ−＞Ａ変異体がGST-RSDとのSRRまたはＳＰ反復中に存在したもの
により感染させたＣｏｓ細胞からの抽出物の親和生成物の結果を示すウエスタン
ブロットの写真である。関連した蛋白質は７A６抗体で検出した。ブロットの下
側部分は親和精製の前に細胞抽出物中に存在するＮＦ−ＡＴの量を示す。

【図１４】 図１４はＮＦ−ＡＴｃ核エントリの機構モデルを示す。このモデルによると、
細胞質ＮＦ−ＡＴｃはSP反復及びSRR上でホスホリル化され、その２つの部分的
に冗長なＮＬＳ、２６５〜２６７位置の配列KRK、及びＮＦ−ＡＴc１の６８２-
６８５位置での配列KRXX／Rの活性を遮蔽する。カルシニューリンの活性化に応
答する脱ホスホリル化は分子内相互作用の修正おそらくは配座の変化を導き、一
個以上のＮＬＳを核輸入機構に曝す。核内ではカルシウム信号の終了で、おそら
くは核輸出配列（NES）への露出によりサイトソールへの急速な輸出が生じる。

【図１５】 図１５Ａは配列番号６４に記述されたＮＦ−ＡＴｃ１のアミノ酸１９６〜３０
４のアミノ酸配列（配列番号３８）を示す。推定の重畳するＧＳＫ−３一致部位
[SPXXS（P）] （Fiol et al., J. Biol. Chem. ２６９, ３２１８７ （１９９４
）は上線で示す。核移行配列は太字で、インビトロＰＫＡによりホスホリル化さ
れた部位は四角で示した。下線を施したセリンはある例のアラニンと置換されて
いるセリンである。 図１５Ｂは脳抽出物の硫酸アンモニウム分画に続いてＰ−１１カラムから溶出
した各種分画におけるＧＳＫ−３活性のレベルを示すグラフである。この図の下
側には野生型（ＷＴ）ＮＦ−ＡＴｃ又は図Ａの下線部のセリンがアラニンへ変異
されているか、又はインビトロでＰＫＡでホスホリル化（ＷＴ−ＰＫＡ prephos
ph.）されたＮＦ−ＡＴｃ１ 含有するGST-NF-AT融合体をホスホリル化するため
の溶出分画の能力を示すウエスタンブロットのオートラジオグラフを示す。 図１５Ｃは図ＢのＰ−１１プールのMono-Sカラムから溶出した各種分画中の蛋
白質の量を示すグラフである。パネル下側のウエスタンブロットオートラジオグ
ラフは野生型ＮＦ−ＡＴｃ１又は図Ａの下線を施したセリンがアラニンに変異さ
れたＮＦ−ＡＴｃ１、又はインビトロでＰＫＡでホスホリル化されたＮＦ−ＡＴ
ｃ１（ＷＴ−ＰＫＡ prephosph.）を含有するGSTＮＦ−ＡＴ融合蛋白質をホスホ
リル化するための溶出画分の能力を示すウエスタンブロットのオートラジオグラ
フを示す。底部の２つの写真はＧＳＫ−３αとＧＳＫ−３βに対して特異的な抗
血清で培養した溶出画分からの蛋白質を含むウエスタンブロットのオートラジオ
グラフである。

【図１６】 図１６Ａは抗血清でGSK２５- ３α及び／又は ＧＳＫ−３βへ脱免疫した脳抽
出物により培養したＰＫＡ予備ホスホリル化したＮＦ−ＡＴ（ＷＴ−ＰＫＡ pre
phos.）、又は[γ³²Ｐ]ATPとのインビトロキナーゼ反応での対照抗体、及び³²P
標識基質（上側ゲル；下側ゲルはCoomassie染色を示す）におけるのウエスタン
ブロットのオートラジオグラフを示す。 図１６ＢはＰＫＡ予備ホスホリル化したＮＦ−ＡＴ（ＷＴ−ＰＫＡ prephos.
）、又は抗血清でGSK２５- ３α及び／又は ＧＳＫ−３βへ脱免疫した脳抽出物
により培養したＮＦ−ＡＴ（WT）、又は[γ³²Ｐ]ATPとのインビトロキナーゼ反
応での対照抗体（Ｉｇ）のウエスタンブロットのオートラジオグラフを示す。

【図１７】 図１７Ａは表示の精製キナーゼとインビトロでホスホリル化したＮＦ−ＡＴ-G
ST融合蛋白質のウエスタンブロットのオートラジオグラフを示す。最も右のレー
ンでは、第１のキナーゼはＷＴ基質を非放射性のＡＴＰでホスホリル化を完結す
ることが許容され、次いでＷＴ基質ビーズが洗浄されてキナーゼを除去され、そ
してＷＴ基質ビーズが [γ-³²P]ATPの存在下に第２のキナーゼによりホスホリル
化された。 図１７Ｂはインビトロで表示のキナーゼでＮＦ−ＡＴｃ１野生型融合蛋白質の
二次元トリプシンホスホペプチドマップを示すオートラジオグラフである。ＮＦ
−ＡＴｃはＣｏｓ細胞中で過剰発現され（これは可逆Ｃａ²⁺依存性核移行を支持
する）、³²Ｐ正リン酸塩により標識された。右下の図ではインビトロでホスホリ
ル化したペプチド中のＰＫＡ + ＧＳＫ−３βが二次元分離の前にインビトロホ
スホリル化したペプチドと混合されてそれらが類似するようにした。異なった移
動をするホスホペプチドは点線円で示した。

【図１８】 図１８ＡはＮＦ−ＡＴ,ＡＰ−１又は HIV１０ LTR調節要素の制御下にSEAPレ
ポータ遺伝子で感染させたＪｕｒｋａｔ細胞からの抽出物中のアルカリホスホタ
ーゼ（SEAP）の活性を示す。ＧＳＫ−３βは過剰発現されているか又は空ベクタ
ーが過剰発現されていた。ＮＦ−ＡＴ SEAP活性はイオノマイシン刺激及びホル
ボール１２−ミリステート１３−アセテート（PMA）刺激対照の活性の百分率で
表現した。ＡＰ−１及び HIV-LTR SEAP活性はＰＭＡ刺激活性の百分率として表
した（Spencer et al., Science ２６２, １０１９ （１９９３））。 図１８ＢはFLAGエピトープで標識した ＮＦ−ＡＴcl及び表示の各セリン−ト
レオニンキナーゼによりCOS細胞を共感染させた後に細胞質、核又は両者中でＮ
Ｆ−ＡＴｃ１を発現する細胞の百分率を示す。細胞はイオノマイシンと１０ mM
Ca²⁺で刺激されており、核、細胞質又は両者中に移行したＮＦ−ＡＴを発現する
細胞の百分率は視覚的に評価され発現細胞の百分率として表されている。感染し
たERKキナーゼはPMA（２５ng／ml）の添加により活性化された。

【図１９】 図１９はFLAGエピトープで標識したＮＦ−ＡＴｃをコードする発現構造体、カ
ルシニューリンＡとＢ、及びベクター（□）、ＧＳＫ−３β （◇） 又は GSK-K
M （○）、触媒不活性ＧＳＫ−３β （He et al., Nature. ３７４, ６１７ （
１９９５））で共感染させたCOS細胞中のＧＳＫ−３βの過剰発現後の、細胞質
ＮＦ−ＡＴｃを有する細胞の百分率を表す。細胞は又図１Ａの下線を付けたセリ
ンがカルシニューリンでアラニンに変化されたＮＦ−ＡＴｃ１及びＧＳＫ−３β
により共感染した。核内へのＮＦ−ＡＴｃ移行を得るために、感染細胞はイオノ
マイシン及びＣａ²⁺で６０分処理され、次いで培地をFK５０６ （２０ ng／ml）
を有するものに変えてＣａ²⁺信号を終了させ、ＮＦ−ＡＴｃの核再導入をブロッ
クした。感染ＮＦ−ＡＴｃは間接免疫蛍光法によりFLAG mAb M２で検出した。２
００個の発現細胞を細胞質、核又は両者中でＮＦ−ＡＴｃを発現するものとして
評価した。

【図２０Ａ】 図２０Ａは内生ＮＦ−ＡＴｃ遺伝子、ＥＳ細胞を感染させるのに使用した照準
構造体、及び相同組み替えからの標的ＮＦ−ＡＴｃ４の模式図である。

【図２０Ｂ】 図２０Ｂは３’外側プローブによりブロットされた、EcoRVで消化されたマウ
スの尾のＤＮＡのサザンブロットを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｑ 1/42 // Ｃ１２Ｑ 1/02 1/68 Ｚ 1/42 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 ジェフリー ピー．ノースロップ アメリカ合衆国 95008 カリフォルニア、 キャンベル、ノース ミルトン アベニュ ー 313 (72)発明者 ステファン エヌ．ホー アメリカ合衆国 92122 カリフォルニア、 サンディエゴ、アウォード ロウ 3014 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA11 CA04 CA09 CA12 DA02 DA03 GA14 HA01 4B063 QA05 QQ08 QQ22 QQ33 QQ43 QR02 QR13 QR62 QR77 QS03 QS25 QX02 4C084 AA01 AA02 AA13 AA17 AA27 BA01 BA08 BA23 BA35 BA44 CA17 CA18 NA13 NA14 ZA362

Claims (33)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 患者における心臓肥大を防止し又は軽減する方法であって、
   その患者に、医薬として有効な量のＮＦ−ＡＴアンタゴニストを投与して心筋組
   織中のＮＦ−ＡＴの生物学的活性を減じ、それによりその患者における心臓肥大
   を防止し又は軽減することを含む、上記の方法。
2. 【請求項２】 ＮＦ−ＡＴアンタゴニストが、ＮＦ−ＡＴの転写活性を減じ
   る、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 ＮＦ−ＡＴアンタゴニストが、ＮＦ−ＡＴの核移行を阻害す
   る、請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】 ＮＦ−ＡＴアンタゴニストが、ＮＦ−ＡＴの脱リン酸化を阻
   害する、請求項３に記載の方法。
5. 【請求項５】 ＮＦ−ＡＴアンタゴニストが、カルシニューリンのＮＦ−Ａ
   Ｔへの結合を阻害する、請求項４に記載の方法。
6. 【請求項６】 ＮＦ−ＡＴアンタゴニストが、ＮＦ−ＡＴのリン酸化を刺激
   する、請求項３に記載の方法。
7. 【請求項７】 ＮＦ−ＡＴのリン酸化が、ＧＳＫ−３の増加により刺激され
   る、請求項６に記載の方法。
8. 【請求項８】 ＮＦ−ＡＴアンタゴニストが、ＮＦ−ＡＴを含む複合体の形
   成を阻害する、請求項２に記載の方法。
9. 【請求項９】 複合体が、ＮＦ−ＡＴ結合部位を含む核酸を含む、請求項７
   に記載の方法。
10. 【請求項１０】 ＮＦ−ＡＴアンタゴニストが、ＮＦ−ＡＴポリペプチドの
    優性ネガティブ変異体である、請求項９に記載の方法。
11. 【請求項１１】 ＮＦ−ＡＴアンタゴニストが、ＮＦ−ＡＴポリペプチドの
    優性ネガティブ変異体をコードする核酸である、請求項９に記載の方法。
12. 【請求項１２】 ＮＦ−ＡＴアンタゴニストが、ＮＦ−ＡＴポリペプチドの
    生成を阻害する、請求項１に記載の方法。
13. 【請求項１３】 ＮＦ−ＡＴアンタゴニストが、アンチセンスＮＦ−ＡＴ核
    酸又はリボザイムである、請求項１２に記載の方法。
14. 【請求項１４】 ＮＦ−ＡＴアンタゴニストが、ＮＦ−ＡＴポリペプチドを
    コードする遺伝子の転写を阻害する、請求項１２に記載の方法。
15. 【請求項１５】 ＮＦ−ＡＴアンタゴニストを局所的に送達する、請求項１
    に記載の方法。
16. 【請求項１６】 ＮＦ−ＡＴアンタゴニストが、心臓を標的とする製薬上許
    容し得る送達用ビヒクル中にある、請求項１に記載の方法。
17. 【請求項１７】 患者が、鬱血性心臓病を有する、請求項１に記載の方法。
18. 【請求項１８】 ＮＦ−ＡＴが、ＮＦ−ＡＴｃ４である、請求項１に記載の
    方法。
19. 【請求項１９】 ＮＦ−ＡＴアンタゴニストが、ＮＦ−ＡＴｃ４ポリペプチ
    ドのアンタゴニストであって、ＮＦ−ＡＴｃ１、ＮＦ−ＡＴｃ２及びＮＦ−ＡＴ
    ｃ３ポリペプチドのアンタゴニストでない、請求項１８に記載の方法。
20. 【請求項２０】 アンタゴニストを下記の： (ｉ)一の分子と相互作用するのに十分な単離されたＮＦ−ＡＴポリペプチド又は
    その部分を、その分子及び一の化合物と、その化合物が存在しなければＮＦ−Ａ
    Ｔポリペプチド又はその部分とその分子が相互作用する条件下で接触させ；そし
    て (ｉｉ)ＮＦ−ＡＴポリペプチド又はその部分とその分子との間の相互作用のレベ
    ルを、その化合物の存在下で、その化合物の非存在下と比較して測定する ことを含む方法により同定する、請求項１に記載の方法であって、 その化合物の存在下でのＮＦ−ＡＴポリペプチド又はその部分とその分子との間
    の、その化合物の非存在下での相互作用より弱い相互作用が、その化合物がＮＦ
    −ＡＴポリペプチドの活性のアンタゴニストであることを示す、上記の方法。
21. 【請求項２１】 分子が、核酸である、請求項２０に記載の方法。
22. 【請求項２２】 核酸が、ＮＦ−ＡＴ認識配列を含む、請求項２１に記載の
    方法。
23. 【請求項２３】 分子が、ポリペプチドである、請求項２０に記載の方法。
24. 【請求項２４】 ポリペプチドが、ロイシンジッパーを含むポリペプチドで
    ある、請求項２３に記載の方法。
25. 【請求項２５】 ポリペプチドが、ｃ−Ｆｏｓ又はｃ−Ｊｕｎである、請求
    項２４に記載の方法。
26. 【請求項２６】 ポリペプチドが、カルシニューリンである、請求項２３に
    記載の方法。
27. 【請求項２７】 ＮＦ−ＡＴポリペプチドが、ＮＦ−ＡＴｃ４であり、ＮＦ
    −ＡＴｃ４以外のＮＦ−ＡＴポリペプチドを阻害する化合物を選択することを更
    に含む、請求項２０に記載の方法。
28. 【請求項２８】 アンタゴニストを下記： (ｉ)ＮＦ−ＡＴポリペプチドとＮＦ−ＡＴ結合部位を含むプロモーターに操作可
    能に結合されたレポーター遺伝子を含む細胞を試験化合物と接触させ；そして (ｉｉ)試験化合物と接触させた細胞におけるレポーター遺伝子の発現レベルを、
    その試験化合物に接触させてない細胞と比較して測定する ことを含む方法により同定する、請求項１に記載の方法であって、 試験化合物と接触させた細胞におけるレポーター遺伝子の、試験化合物と接触さ
    せてない細胞と比較しての一層低レベルの発現が、その化合物がＮＦ−ＡＴ活性
    のアンタゴニストであることを示す、上記の方法。
29. 【請求項２９】 アンタゴニストを下記の： (ｉ)リン酸化され得るＮＦ−ＡＴポリペプチド又はその部分を、一の混合物及び
    化合物と、その化合物がなければＮＦ−ＡＴのリン酸化がその細胞抽出物により
    調節される条件下で接触させ；そして (ｉｉ)ＮＦ−ＡＴポリペプチド又はその部分のリン酸化レベルを、その化合物の
    存在下で、非存在下と比較して測定する ことを含む方法により同定する、請求項１に記載の方法であって、 その化合物の存在下におけるＮＦ−ＡＴポリペプチド又はその部分の、その化合
    物の非存在下よりも一層高レベルのリン酸化が、その化合物がＮＦ−ＡＴ活性の
    アンタゴニストであることを示す、上記の方法。
30. 【請求項３０】 アンタゴニストを下記の： (ｉ)リン酸化され得るＮＦ−ＡＴポリペプチド又はその部分を含む細胞を、ＮＦ
    −ＡＴのリン酸化を調節する薬剤及び一の化合物と接触させ；そして (ｉｉ)その化合物と接触させた細胞におけるＮＦ−ＡＴポリペプチド又はその部
    分のリン酸化レベルを、その化合物と接触させてない細胞と比較して測定する ことを含む方法により同定する、請求項１に記載の方法であって、 ＮＦ−ＡＴポリペプチド又はその部分の一層低レベルのリン酸化が、その化合物
    がＮＦ−ＡＴ活性のアンタゴニストであることを示す、上記の方法。
31. 【請求項３１】 アンタゴニストを下記の： (ｉ)細胞質から核への移行に十分なＮＦ−ＡＴポリペプチド又はその部分を含む
    細胞を、ＮＦ−ＡＴポリペプチドの細胞質から核への移行を刺激する化合物及び
    試験化合物と接触させ；そして (ｉｉ)ステップ(ｉ)の後に、ＮＦ−ＡＴポリペプチドの細胞内局在性を測定する
    ことを含む方法により同定する、請求項１に記載の方法であって、 試験化合物に接触させた細胞の細胞質内のＮＦ−ＡＴポリペプチドの、試験化合
    物と接触させてない細胞と比較して増大したレベルが、その試験化合物がＮＦ−
    ＡＴ活性のアンタゴニストであることを示す、上記の方法。
32. 【請求項３２】 ＮＦ−ＡＴポリペプチドが、ＮＦ−ＡＴｃ４であり、ＮＦ
    −ＡＴｃ４以外のＮＦ−ＡＴポリペプチドを阻害する化合物を選択することを更
    に含む、請求項２８〜３１の何れか１つに記載の方法。
33. 【請求項３３】 ＮＦ−ＡＴアンタゴニストを、該アンタゴニストを心臓に
    狙いを定めて送るための製薬上許容し得る送達用ビヒクル中に含む、心臓肥大を
    治療し又は防止するための医薬組成物。