DE60113380T2

DE60113380T2 - Methoden zur identifizierung von zusammensetzungen, die für die behandlung von fettleibigkeit nützlich sind, unter verwendung von foxc2

Info

Publication number: DE60113380T2
Application number: DE60113380T
Authority: DE
Inventors: Sven Enerbäck; Peter Carlsson
Original assignee: LeanGene AB
Current assignee: LeanGene AB
Priority date: 2000-02-18
Filing date: 2001-02-16
Publication date: 2006-06-29
Anticipated expiration: 2021-02-17
Also published as: AU3259901A; AU2001232599B2; IL150951A0; ATE304552T1; NO20023709D0; NZ521005A; CA2400342A1; DE60113380D1; EP1255774A1; JP2003523192A; WO2001060853A1; IS6502A; NO20023709L; EP1255774B1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die Erfindung betrifft transgene, nicht menschliche Säugetiere, die das humane FOXC2 Gen in ihrem Fettgewebe exprimieren können. Die Erfindung betrifft ebenfalls Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die für die Behandlung von medizinischen Zuständen nützlich sind, die mit Obesität bzw. Fettleibigkeit oder Diabetes in Bezug stehen, wobei die Verbindungen eine Expression des humanen FOXC2 Gens stimulieren können oder die biologische Aktivität eines Polypeptids stimulieren können, das von dem humanen FOXC2 Gen kodiert wird. Weiterhin betrifft die Erfindung Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die für die bzw. bei der Behandlung von medizinischen Zuständen nützlich sind, die mit Fehlernährung in Bezug stehen, wobei die Verbindungen eine Expression des humanen FOXC2 Gens verringern können oder die biologische Aktivität eines Polypeptids verringern können, das von dem humanen FOXC2 Gen kodiert wird.
STAND DER TECHNIK
Mehr als die Hälfte der Männer und Frauen in den Vereinigten Staaten, die 30 Jahre oder mehr an Alter aufweisen, werden nun als übergewichtig betrachtet und nahezu ein Viertel sind klinisch adipös bzw. fett (obese) (Wickelgren, 1998). Diese weite Verbreitung hat zu einer Zunahme von medizinischen Bedingungen geführt, die häufig Obesität begleiten, insbesondere von Insulin-unabhängigem Diabetes mellitus (NIDDM, non-insulin dependent diabetes mellitus), Bluthochdruck, kardiovaskulären Erkrankungen und bestimmten Krebserkrankungen. Vielleicht am wichtigsten ist, dass Obesität zu einer Mortalitätsrate führt, die verglichen mit jener von Individuen mit normalem Körpergewicht signifikant erhöht ist. Obesität resultiert aus einem chronischen Ungleichgewicht zwischen Energieaufnahme (Ernährung) und Energieverbrauch bzw. Energieabgabe. Die Energieabgabe weist einige Hauptkomponenten auf, einschließlich Basisstoffwechsel, körperlicher Aktivität und adaptiver (zitterfreier, nonshivering) Thermogenese. Dieser letztgenannte Vorgang betrifft Energie, die als Antwort auf sich verändernde Umweltbedingungen, insbesondere Kontakt mit Kälte oder exzessive Kalorienaufnahme (sogenannte Ernährungs-induzierte Thermogenese), abgegeben wird. Für ein besseres Verständnis der Mechanismen, die zu einer Obesität führen und zur Entwicklung von Strategien in bestimmten Patientenpopulationen zur Steuerung von Obesität muss das Grundlagenwissen über die molekularen Ereignissen, welche die Differenzierung von Prä-Adipozyten und Stammzellen zu Adipozyten, der Hauptkomponente von Fettgewebe, regulieren, verbessert werden.
Die Rolle des Fettgewebes
Der Grund für die Existenz des Adipozyts ist die Speicherung von Energie für eine Verwendung während Zeitspannen von Kalorienknappheit. Postprandial wird Nahrungsfett über das Intestinum bzw. den Darm absorbiert und in den Kreislauf als große Triglycerid (TG, triglyceride) – reiche Partikel abgegeben, die als Chylomikronen (chylo) bezeichnet werden. Lipoprotein-Lipase (LPL), obwohl sie von Adipozyten hergestellt wird, ist bei der Endothelzelloberfläche lokalisiert, wo sie TG hydrolysiert, was zu einer Abgabe von freien Fettsäuren (FFA, free fatty acids) führt. Viele hiervon werden entweder passiv oder aktiv via FFA-Transportern durch das Fettgewebe aufgenommen. Die FFAs werden anschließend zu einer Acyl-CoA-Form aktiviert und durch eine enzymatische Kaskade zur Bildung von Speicher-TG wieder-verestert. Gleichzeitig wird Glukose, die ebenfalls im Kreislauf postprandial zunimmt, in das Fettgewebe über spezifische Plasma-Membran-Glukose-Transporter aufgenommen. Diese zwei Substrate (Glukose und FFA) sind die Bausteine zur Bildung von Speicher-TG. Andererseits werden FFAs während eines Fastens aus dem Fettgewebe-TG-Pool durch die Wirkung von Hormon-sensitiver Lipase (HSL, hormone sensitive lipase: 1) abgegeben. Deutlich ist, dass eine effiziente Funktionsweise des Fettgewebes von der koordinierten Steuerung jedes dieser Vorgänge und der beteiligten Proteine abhängig ist.
In den vergangenen Jahren wies eine wachsende Zahl von Beweisstücken auf eine duale Rolle von Adipozyten hin, die auch eine Quelle von zahlreichen Hormonen sind, die sowohl den Adipozyt selbst, als auch viele andere Systeme in dem Körper steuern bzw. regulieren. Adipozyten stellen Leptin in Abhängigkeit von Fettenergiespeichern her. Leptin wirkt durch Rezeptoren im Hypothalamus zur Steuerung von Appetit, einer Aktivität von braunem Fettgewebe (BAT, brown adipose tissue), einer Insulinabgabe über eine Ausgabe des sympathischen Nervensystems und wichtigen neuroendokrinen adaptiven Antworten auf Fasten und Reproduktionssteuerung. Das Gen, das Leptin kodiert, wurde durch Positionsklonierung (positional cloning) identifiziert (Zhang et al., 1994) und ist die Mutation, die zu dem hochgradig adipösen Phänotyp der ob/ob Maus führt, der durch eine ernsthafte Obesität, NIDDM, verminderte Fruchtbarkeit und Hypothermie gekennzeichnet ist. Das db-Gen kodiert einen Hypothalamusrezeptor für Leptin (Chua et al., 1996) und die db/db Mutantenmäuse zeigen einen ähnlichen Phänotyp wie ob/ob Mäuse, wobei hier jedoch der Defekt in dem Leptin-Rezeptorblock, "downstream" bzw. stromabwärts von einem Signaling bzw. einer Signalgabe, liegt. Nach Leptin-Verabreichung war es lediglich möglich den Defekt bei den ob/ob, jedoch nicht bei den db/db Mäusen zu korrigieren, wie es von den Parabiose-Experimenten von Coleman vorhergesagt wird (Coleman, 1973).
Ein anderes Adipozytenprodukt, der Cytokin-Tumor-Nekrose-Faktor α (TNFα, tumor necrosis factor α), hat tief greifende Auswirkungen auf Adipozytendifferenzierung und Energiemetabolismus, und kann sogar Adipozyten-Dedifferenzierung und Apoptose induzieren. Weiterhin weist TNFα weitere systemische Implikationen auf, da gezeigt wurde, dass er eine Rolle bei der Entstehung von Insulinresistenz spielt, die mit Obesität assoziiert ist (Hotamisligil et al., 1993). Bei adipösen Menschen und bei zahlreichen Nagetiermodellen für Obesität-Diabetes-Syndrome gibt es eine deutliche Erhöhung in Muskel- und Fett-TNFα-Produktion, verglichen zu Geweben von schlanken Individuen (Hotamisligil et al., 1995; Hotamisligil et al., 1993). TNFα-Pegel können bei einem Gewichtsverlust (Hotamisligil et al., 1995) oder nach einer Behandlung mit dem insulin-sensibilisierenden Agens Pioglitazon verringert werden (Hofmann et al., 1994).
Ein drittes Adipozytenprodukt, das Acylierung-stimulierende Protein (ASP, acylation stimulating protein), übt eine autokrine Wirkung auf den Adipozyt aus, wobei es wirksame anabole Wirkungen auf menschliches Fettgewebe durch Stimulierung von Glukosetransport und FFA-Veresterung aufweist (Maslowska et al., 1997; Walsh et al.. 1989). ASP wird erzeugt durch die Wechselwirkung von Komplement D (identisch mit Adipsin), Faktor B und Komplement C3, Komponenten des alternativen Komplement-Wegs, die alle von Adipozyten erzeugt werden (Choy und Spiegelman, 1996).
Weißes Fettgewebe versus braunes Fettgewebe
Es gibt zwei unterschiedliche Fettgewebe-Typen in dem Körper, WAT und BAT, die ziemlich entgegengesetzte physiologische Funktionen aufweisen, obgleich sie die gleiche "Maschinerie" für lipogene und lipolytische Aktivität aufweisen. WAT speichert überschüssige Energie als Triglyceride und gibt freie Fettsäuren als Antwort auf Energieerfordernisse an anderen Stellen ab. BAT andererseits ist an der adaptiven (zitterfreien) Thermogenese beteiligt. BAT wird lediglich an bestimmten Stellen in dem Nagetierkörper gefunden, derart wie in interskapulären, perirenalen und retroperitonealen Bereichen. Bei menschlichen Neugeborenen liegt BAT in großen Mengen vor, wobei seine thermogene Aktivität kurz nach der Geburt abnimmt und das Gewebe allmählich in Fettgewebe vom weißen Typ umgewandelt wird (Lean et al., 1986). Bei einer Beurteilung nach einer Expression der für braunes Fett spezifischen Entkopplungsprotein 1 (UCP1, uncoupling protein 1) mRNA liegen wesentliche Mengen an braunen Adipozyten während eines Lebens in menschlichen Fettspeichern vor, die allgemein als weiß klassifiziert werden (Krief et al., 1993).
Braune Adipozyten weisen eine multilokuläre Anordnung von Fetttröpfchen auf, das heißt mehrere einzelne Tröpfchen in jedem Adipozyt, während der weiße Adipozyt ein einzelnes Fetttröpfchen in der Zelle aufweist. Weiterhin weist der braune Adipozyt einen zentralen Nukleus und eine große Anzahl an Mitochondrien im Gegensatz zu dem weißen Adipozyt auf, der sehr wenige Mitochondrien und einen Nukleus hat, der zu der Plasma-Membran durch das Lipid-Tröpfchen versetzt ist. Der einzige bekannte Gen-Marker um BAT von WAT oder irgendwelchen anderen Zelltypen unterscheiden zu können ist die Expression von UCP1 in braunen Adipozyten. Aufgrund des Vorliegens dieses einzigartigen mitochondrialen Proteins haben braune Adipozyten die Fähigkeit zu einer fakultativen Wärme-Produktion, die in hohem Maße durch sympathische Nervenaktivität gesteuert wird. UCP1 ist ein Protonen-Translokator in der inneren mitochondrialen Membran und funktioniert als ein fakultativer Entkoppler der mitochondrialen Atmungskette (Nicholls und Locke, 1984). Kürzlich wurden zwei neue Entkopplungsproteine identifiziert und durch ihre Sequenzhomologie mit UCP1 kloniert. UCP2 wird in den meisten Geweben aufgefunden (Fleury et al., 1997), während UCP3 in BAT und Skelettmuskulatur exprimiert wird (Boss et al., 1997). Die jeweiligen Rollen für UCP2 und UCP3 in Thermogenese und Energiebilanz von intakten Tieren verbleiben bestimmt zu werden. Durch die Tatsachen, dass die Funktion von BAT in adipösen Nagetieren beeinträchtigt ist (Himms-Hagen, 1989) und dass transgene Mäuse mit verringerter brauner Fettmasse Obesität (Lowell et al.. 1993) entwickeln, wird vorhergesagt, dass braunes Fett in hohem Maße in Nagetieren wichtig ist, um eine Ernährungs-Homöostase aufrechtzuerhalten. Da BAT in großen Tieren, wie Menschen, bei weitem weniger offensichtlich ist als in Nagetieren, wird angenommen, dass der Skelettmuskel die Stelle von primärer Wichtigkeit ist, bei der in großen Tieren normalerweise eine adaptive Thermogenese erfolgt.
Sowohl weißes, als auch braunes Fett sind unter der Steuerung des sympathischen Nervenssystems innerviert. Es gibt mindestens drei pharmakologisch unterschiedliche Subtypen von β-adrenergen Rezeptoren (β₁, β₂ und β₃), die in Adipozyten gefunden werden. Der β₃-adrenerge Rezeptor (β₃-AR) ist der prädominante Subtyp im Fettgewebe und vermittelt die Wirkungen von Norepinephrin, das im sympathischen synaptischen Spalt während Lipolyse-Nervenstimulierung in WAT und BAT und einer Thermogenese in BAT (Giacobino, 1995) vorliegt. Eine gesteigerte Lipolyse erfolgt primär durch die Produktion von cAMP und die Aktivierung von Hormon-sensitiver Lipase durch Phosphorylierung ( 1). Eine Thermogenese in BAT wird durch erhöhte UCP1 mRNA Pegel durch eine Transkriptionsstimulierung verwirklicht (Rehnmark et al., 1990; Ricquier et al., 1986). Bei einer ungekoppelten Atmung (uncoupled respiration) wird auch angenommen, dass sie durch gesteigerte Lipolyse und den Anstieg an intrazellulärer Konzentration an FFA (Jezek et al., 1994) stimuliert wird. Eine sympathische Stimulierung von braunem Fett trägt auch zur Steuerung bzw. Regulation der Energieabgabe durch ein Erhöhen von mitochondrialer Biogenese (Wu et al., 1999a) und Hyperplasie von braunen Adipozyten bei. In Nagetieren sind β₃-adrenerge Rezeptoren (β₃-ARs) in WAT und BAT reichlich vorhanden (Granneman et al., 1991; Muzzin et al., 1991; Nahmias et al., 1991), während in Menschen β₃-AR mRNA lediglich in BAT reichlich vorhanden ist, wobei viel weniger oder kein β₃-AR mRNA in WAT gefunden wird (Granneman und Lahners, 1994; Krief et al., 1993). Eine Langzeit-Behandlung von adipösen Nagetieren mit β₃-selektiven Agonisten verringert Fettspeicher und verbessert eine Obesitäts-induzierte Insulinresistenz (Bloom et al., 1992; Cawthorne et al., 1992; Holloway et al., 1992). Folglich sind β₃-selektive Agonisten vielversprechende Anti-Obesitätsverbindungen. β₃-AR-Agonist-Behandlungsversuche, die darauf abzielen BAT in Menschen zu stimulieren, haben sich hinsichtlich eines Gewichtsverlusts als enttäuschend erwiesen (Arch und Wilson, 1996). Das wahre Potential von β₃-AR-Agonisten in Menschen kann nur bewertet werden, wenn eine Verbindung mit guter Selektivität und Wirksamkeit am menschlichen β₃-AR, gekoppelt mit einer langen in vivo Wirkungsdauer identifiziert wurde, wobei jene Verbindungen, die bislang in Menschen bewertet wurden, eine viel geringere Wirksamkeit am menschlichen als am Nagetier-Rezeptor aufweisen. Dies könnte durch die Tatsache erklärt werden, dass Mensch und Maus/Ratte β₃-AR eine Ähnlichkeit von ~ 80% hinsichtlich ihrer Aminosäuresequenz zeigen. Bei einigen der β₃-AR-selektiven Agonisten (beispielsweise BRL 37344 und CL 316.243) wurde gezeigt, dass sie extrem potent gegen Maus und Ratte β₃-AR sind, jedoch eine stark verringerte Aktivität gegenüber dem menschlichen β₃-AR aufweisen. Gegenwärtig werden rekombinante Zelllinien, die menschliche β₃-ARs exprimieren, verwendet, um Verbindungen mit einem erhöhten Potential gegen den menschlichen Rezeptor zu identifizieren (Ito et al., 1998). Mäuse mit gezielter Mutagenese des β₃-AR-Gens zeigen lediglich eine bescheidene Tendenz adipös zu werden und ihre braune Fett-Antwort bei Kontakt mit Kälte arbeitet vollständig normal (Susulic et al., 1995). Defiziente Mäuse zeigten eine Hoch-Regulation von β₁-AR mRNA Pegeln sowohl in weißem, als auch in braunem Fett, was vermutlich der Grund für den milden Phänotyp ist. Diese Ergebnisse implizieren, dass es möglich ist, dass β₁- und ß₂-ARs ebenfalls wichtige Rollen bei der Innervation von Fettgewebe spielen. Darüber hinaus weisen andere Arten, einschließlich Menschen, höhere Pegel an β₁- und β₂-Ars als an β₃-AR, in Fettgewebe auf (Lafontan und Berlan, 1993).
Adiporytendifferenzierung
Während weniger letzter Jahre erfolgte ein großer Fortschritt hinsichtlich des Verständnisses des Adipozytendifferenzierungsprogramms. Der größte Teil der Arbeit, die zu diesem Verständnis führte, wurde unter Verwendung weißer Prä-Adipozyten-Zelllinien in Kultur ausgeführt, insbesondere der C3H 10T½ und NIH 3T3 Fibroblasten-Zelllinien und der 3T3-L1 und 3T3-F442A Prä-Adipozyten-Zelllinien. Eine Behandlung von multipotenten C3H10T½ Zellen mit 5-Azacytidin (einem demethylierenden Agens) führt zur Zellen, die myogenen, adipogenen, osteoplastischen oder chondrogenen Linien gewidmet sind. Dies ist mit der Ansicht vereinbar, dass die adipöse Linie aus der gleichen multipotenten Stammzellpopulation mit mesodermalen Ursprung entsteht, die zur Entstehung der Muskel- und Knorpel-Linien führt (Cornelius et al., 1994). Unter geeigneter hormoneller Steuerung (beispielsweise Glukokortikoid, Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor-1 und zyklisches AMP oder Faktoren, die diese Agenzien nachahmen) oder einer experimentellen Manipulation können weiße Prä-Fettzelllinien zu reifen weißen Adipozyten differenzieren (Ailhaud et al., 1992). Einige Transkriptionsfaktoren wurden identifiziert, die in ko-operativer Weise und sequentiell wirken, um das funktionale Differenzierungsprogramm auszulösen (2).
Transkriptionssteuerung bzw. Transkriptionskontrolle der Adipozytendifferenzierung durch PPARs C/EBPs und ADD 1/SREBP1
Peroxisomproliferator-aktivierte Rezeptoren (PPARs) sind eine Klasse von Kern-Hormonrezeptoren. Hinsichtlich des Mitglieds PPARγ ist mittlerweile weit verbreitet anerkannt, dass es eine wichtige Rolle hinsichtlich der Adipogeneseregulation bzw. Adipogenesesteuerung spielt. Durch die Verwendung von alternativen Promotoren führt das Gen, das für PPARγ kodiert, zu zwei getrennten Produkten, PPARγ1 und PPARγ2, wobei das Letztere zusätzlich 28 N-terminate Aminosäuren enthält, von denen berichtet wurde, dass sie eine Ligandenbindung verstärken (Fajas et al., 1997; Werman et al., 1997). Berichte darüber, dass eine Ligandenaktivierung von retroviral exprimiertem PPARγ2 in nicht-differenzierenden NIH-3T3 Zellen wirksam eine Adipozytendifferenzierung fördert, lieferten den zwingendsten Beweis für die adipogene Natur von PPARγ2 (Tontonoz et al., 1994b). Eine lebend-geborene PPARγ-defiziente Maus wurde hergestellt und sie zeigte eine vollständige Abwesenheit von WAT und BAT (vollständige Lipodystrophie) und Fettleber, sekundär zu Lipodystrophie (Barak et al., 1999).
Mitglieder der PPAR-Familie funktionieren in spezifischer Weise als Heterodimere mit dem Retinoid X Rezeptor (RXR) durch Wechselwirkungen mit Peroxisomproliferator-Response-Elementen (PPREs) auf Zielgenen, einschließlich Lipoproteinlipase (LPL, lipoprotein lipase; Schoonjans et al., 1996), dem Adipozyt-Fettsäurebindungsprotein 422/aP2 (Tontonoz et al., 1994a), Phosphoenolpyruvat-carboxykinase (PEPCK; Tontonoz et al., 1995), und Stearocyl-CoA-Desaturase 1 (Miller und Ntambi, 1996). Eine Transkriptionsaktivität von PPARγ wird induziert, gefolgt von einem Binden von entweder synthetischen oder natürlich vorkommenden Liganden, einschließlich von Prostaglandinen der D2 und J2 Reihen, wobei sich das 15-Deoxy-Δ 12,14-prostaglandin J2 Derivat als eines der wirksamsten hervortat (Forman et al., 1995). Synthetische Liganden, die PPARγ aktivieren, umfassen Carbacyclin und eine neue Klasse antidiabetischer Drogen, die Thiazolidindione (TZDs, thiazolidinediones) (Lehmann et al., 1995). TZDs fördern eine Adipogenese in Kultur und verbessern eine Insulin-Sensitivität in vivo. PPARγ Aktivatoren modifizieren wahrscheinlich die Produktion von Adipozyten-abgeleiteten Insulinresistenz-Mediatoren, derart wie freie Fettsäuren oder TNFα. Eine PPARγ-Aktivierung wird die Produktion von TNFα durch Adipozyten verringern und mit seinem inhibitorischen Effekt auf eine Insulin-Signalgebung interferieren (Peraldi et al., 1997).
Aufgrund seiner Gewebe-selektiven Wirkungen auf Gene, die an einer Fettsäure-Aufnahme beteiligt sind, wird eine PPARγ-Aktivierung eine Repartitionierung von Fettsäuren in dem Körper induzieren, wobei eine verstärkte Ansammlung von Fettsäuren in Fettgewebe auf Kosten einer relativen Verringerung von Muskel-Fettsäuren erfolgt (Martin et al., 1997). Die relative Lipid-Verringerung von Muskelzellen wird ihren Glukosemetabolismus verbessern und zu einer Verbesserung der Insulinsensitivität führen. Weiterhin verringert PPARγ die Expression des Adipozyt-abgeleiteten Signalmoleküls Leptin, was zu einer Zunahme an Energieaufnahme und einer Optimierung einer Energieverwendung führt, was weiter zu der adipogenen Wirkung von PPARγ beiträgt (De Vos et al., 1996). Kürzlich wurde gezeigt, dass eine Wechselwirkung mit einem neuen Co-Faktor PPARγ Co-Aktivator (PGC-1), PPARγ Transkriptionsaktivität in braunem Fettgewebe steigern könnte (Puigserver et al., 1998).
Drei Mitglieder der CCAAT/Enhancer-Bindungsprotein (C/EBP) Familie von Transkriptionsfaktoren, d.h. C/EBPα, C/EBPβ und C/EBPδ sind in der Adipozytendifferenzierungsinduktion impliziert. Die Faktoren sind Proteine der bZIP-Klasse mit einer basischen bzw. grundlegenden Domäne, die eine DNA-Bindung vermittelt, und einer Leucin-Zipper-Dimerisierungs-Domäne. Zyklisches AMP und adipogene Hormone, derart wie Glukokortikoide und Insulin, induzieren eine vorübergehende Zunahme bei der Expression von C/EBPβ und δ früh bei einer Adipozytendifferenzierung (Cao et al., 1991; MacDougald et al., 1994; Yeh et al., 1995). C/EBPβ, synergistisch mit C/EBPδ, induziert dann eine PPARγ Expression in dem Prä-Adipozyt (Wu et al., 1996, Wu et al., 1995). Mäuse, denen das C/EBPβ und C/EBPδ Gen fehlt, weisen eine normale Expression von C/EBPα und PPARγ auf, wobei diese Ko-Expression von C/EBPα und PPARγ jedoch nicht ausreichend für eine vollständige Adipozytendifferenzierung in der Abwesenheit von C/EBPβ und C/EBPδ ist (Tanaka et al., 1997). C/EBPα scheint eine wichtige Rolle bei den späteren Differenzierungsstufen zu spielen, indem der differenzierte Adipozyt-Phänotyp durch Autoaktivierung seines eigenen Gens aufrechterhalten wird (Lin und Lane, 1992; Lin und Lane, 1994). C/EBPα aktiviert einige Adipozyt-spezifische Gene, derart wie den auf Insulin-ansprechenden Glukosetransporter-4 (GLUT4) (Kaestner et al., 1990), 422/aP2 (Christy et al., 1989), UCP1 (Yubero et al., 1994) und auch das Insulin-Rezeptorgen und Insulin-Rezeptor-Substrat 1 (IRS-1) (Wu et al., 1999b). Ein definitiver Beweis, dass C/EBPα für eine Adipozytdifferenzierung erforderlich ist, wurde erhalten, indem gezeigt wurde, dass die Expression von antisense C/EBPα RNA in 3T3-L1 Prä-Adipozyten eine Differenzierung verhinderte (Samuelsson et al., 1991). Mit diesem Ergebnis ist konsistent, dass eine Disruption des C/EBPα Gens zu Mäusen führt, denen es nicht gelingt weißes Fettgewebe zu entwickeln (Wang et al., 1995). Zusammengenommen beweisen diese Ergebnisse, dass C/EBPα sowohl erforderlich, als auch ausreichend zum Induzieren von Adipozyt-Differenzierung ist. Die Expression von C/EBPα, ebenso wie von anderen Adipozyt-Genen, wird auf eine Ligandenaktivierung von PPARγ induziert. Durch eine positive Feedback-Schleife, bewahrt C/EBPα die Expression von PPARγ. C/EBPα und PPARγ kooperieren zur Förderung von Adipozytendifferenzierung, einschließlich einer Adipozyt-Genexpression und Insulin-Sensitivität (Wu et al., 1999b). Es ist möglich, dass C/EBPα schließlich ein wichtiges, indirektes Ziel der antidiabetischen Wirkungen des TZDs ist.
ADD1/SREBP1 (adipozyte determination and differentiation-dependent factor 1/sterol regulatory element binding protein 1) ist ein Mitglied der basischen bzw. grundlegenden Helix-Schleife-Helix (bHLH, basic helix-loop-helix) – Klasse von Transkriptionsfaktoren. In dem inaktiven Zustand ist das Protein an das endoplasmatische Reticulum Membrangebunden. Bei Aktivierung (derart wie bei einem niedrigem Cholesterin- bzw. Cholesterol-Zustand), wird ADD1/SREBP1 proteolytisch gespalten und die lösliche Form wird zu dem Nukleus transloziert, wo sie eines von zwei verschiedenen Response-Elementen, nämlich die E Box und das Sterolregulationselement (SRE, sterol regulatory element; Braun und Goldstein, 1997) bindet. Die Expression von ADD1/SREBP1 wird während einer Differenzierung von Adipozyten induziert, wobei sie eine Transkription von Ziel-Genen aktiviert, die sowohl am Cholesterinmetabolismus, als auch am Fettsäuremetabolismus beteiligt sind (Kim und Spiegelman, 1996). ADD1/SREBP1 potenziert die Transkriptionsaktivität von PPARγ wahrscheinlich über die Produktion von endogenen Liganden für PPARγ (Kim et al., 1998) und auch durch ein Binden an den und ein Induzieren des PPARγ Promotors (Fajas et al., 1999).
Wenn Prä-Adipozyten zu Adipozyten differenzieren, so werden einige Differenzierungsbezügliche Gene aktiviert. Lipoprotein-Lipase (LPL, lipoprotein lipase) ist eines der ersten Gene, die während dieses Vorgangs induziert werden (2). Zwei cis-Regulationselemente, die wichtig für eine graduelle Aktivierung des LPL Gens während einer Adipozyt-Entwicklung in vitro sind, wurden begrenzt bzw. bestimmt (Enerback et al., 1992). Diese Elemente, LP-α und LP-β, enthielten eine bemerkenswerte Ähnlichkeit zu einer Consensus-Sequenz, von der bekannt ist, dass sie Transkriptionsfaktoren der "Winged-Helix"-Familie bindet. Ergebnisse von Gel-Mobilitätsshift-Assays und DNase I und Exonuklease III in vitro Protection-Assays wiesen darauf hin, dass Faktoren mit DNA-bindenden Eigenschaften ähnlich zu jenen der "Winged-Helix"-Familie von Transkriptionsfaktoren in Adipozyten vorliegen und mit LP-α und LP-β wechselwirken. Es besteht der Bedarf nach einer Identifizierung von menschlichen "Winged-Helix"-Genen, die für die Induktion des LPL-Promotors verantwortlich sein könnten und die möglicherweise eine Expression anderer Adipozyt-spezifischer Gene regulieren bzw. steuern.
"Fork-Head " – und "Winged-Helix " – Gene
Die "Fork-Head"-Domäne ist eine evolutionär konservierte DNA-Bindungsdomäne aus 100 Aminosäuren, die aus einem Sequenzvergleich des Transkriptionsfaktors HNF-3α von Ratten und des homeotischen Gens fork-head von Drosophila hervorging. Röngtenkristallographie der "Fork-Head"-Domäne von HNF-3γ zeigte eine drei-dimensionale Struktur, die "Winged-Helix", bei der zwei Loops bzw. Schleifen (Wings bzw. Flügel) auf der C-terminalen Seite der Helix-Loop-Helix verbunden sind (für Reviews, siehe Brennan, R.G. (1993) Cell 74, 773–776; Lai, E. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 10421–10423).
Die Isolierung des Maus-Mesenchym-Forkhead-1 (MFH-1) und des entsprechenden humanen (FKHL14) chromosomalen Gens wird von Miura, N. et al. (1993) FEBS letters 326: 171–176 und (1997) Genomics 41 : 489–492 offenbart. Die Nukleotidsequenzen des Maus MFH-1 Gens und des humanen FKHL 14 Gens wurden bei den EMBL/GenBank Datenbanken mit den Zugangsnummern Y08222 (SEQ ID NO: 5) beziehungsweise Y08223 (SEQ ID NO: 8) hinterlegt. Ein entsprechendes Gen wurde in Gallus gallus (GenBank Zugangsnummern U37273 und U95823) identifiziert.
Die Internationale Patentanmeldung WO 98154216 offenbart ein Gen, das für einen Forkhead-Related Activator (FREAC)-11 (auch als S 12 bekannt) kodiert, der identisch mit dem Polypeptid ist, das durch das humane FKHL14 Gen kodiert wird, das von Miura offenbart wird, supra.
Die Nomenklatur für die "Winged Helix"/"Forkhead"-Transkriptionsfaktoren wurde standardisiert und Fox (Forkhead Box) wurde als das vereinheitlichte Symbol angenommen (Kaestner et al. (2000) Genes & Development 14: 142–146; siehe auch htpp://www.biology.pomona.edu/fox). Es wurde vereinbart, dass die bislang als MFH-1 und FKHL14 bezeichneten Gene (ebenso wie FREAC-11 und S 12) mit FOXC2 bezeichnet werden sollten.
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 Eine schematische Ansicht von lipogenen und lipolytischen Wirkungen im Adipozyt. Triglyceride werden zu Glycerol und freien Fettsäuren durch die Wirkung von Lipoprotein-Lipase hydrolysiert. FFAs werden in den Adipozyt via FATP transportiert. FFAs werden mit Acetyl-CoA kombiniert, um Acyl-CoA herzustellen, das wieder zu Triglyceriden verestert wird. Der Multi-Enzym-Komplex Hormon-sensitive Lipase hydrolysiert Triglyceride zu FFAs und Glycerol. FFAs können entweder wiederum wieder-verestert werden oder können in den Kreislauf abgegeben werden. LPL, Lipoprotein-Lipase; FFA, freie Fettsäure; FATP, Fettsäure-Transport-Protein; aP2, Adipozyt-Fettsäurebindungsprotein 422/aP2; ACS, Acyl-CoA-Synthetase; Glut4, Glukose-Transporter IV; βAR, β-adrenerger Rezeptor; AC, Adenylat-Cyclase; PKA, Proteinkinase A; HSL, Hormon-sensitive Lipase. Die Figur wurde von Sethi und Hotamisligil, 1999 bearbeitet.
2 Zusammenfassung verschiedener Stufen und Ereignisse während einer in vitro Adipozyt-Differenzierung. Unser gegenwärtiges Verständnis einer Adipozyt-Differenzierung zeigt, dass ein pluripotenter Stammzellen-Precursor zu einer mesenchymalen Precursor-Zelle (multipotent) führt, die das Potential aufweist entlang mesodermaler Linien von Myoblast, Chondroblast, Osteoblast und Adipozyt zu differenzieren. Bei gegebenen geeigneten Umwelt- und Gen-Expressions-Zeichen erfahren Prä-Adipozyten eine klonale Expansion und eine anschließende terminale Differenzierung. Ausgewählte molekulare Ereignisse, die diesen Vorgang begleiten, sind vorstehend angegeben. Pref-1, Prä-Adipozyt Faktor 1; pOb24/A2COL6, α2 Kette von Typ VI Collagen; LPL, Lipoprotein-Lipase; aP2, Adipozyt Fettsäure-Bindungsprotein 422/aP2; UCP, Entkopplungsprotein; CUP, C/EBPα undifferenziertes Protein; FAAR, Fettsäure-aktivierter Rezeptor; PPARγ, Peroxisomproliferator-aktivierter Rezeptor γ, C/EBP, CCAAT/Enhancer-Bindungsprotein; RXR, Retinoid X Rezeptor. Die Figur wurde von Klaus, 1997 bearbeitet.
3 Northern-Blot-Analyse. Gewebe von adultem Mensch (a) und Gewebe von wt adulter Maus (b). Die Blots wurden mit Sonden analysiert, die spezifisch (ohne Kreuz-Reaktivität) für FOXC2 (Mensch) beziehungsweise FoxC2 (Maus) sind. Die Experimente wurden mit 20 μg an Gesamt-RNA/Spur unter Verwendung von β-Actin als interner Kontrolle durchgeführt. Maus-Fettgewebe (c) wurde mit Kollagenase behandelt (siehe unter "Verfahren"), RNA von der Adipozyt-Fraktion (Adip F) und der Stromalvaskulären Fraktion (SVF) wurden verwendet und Untersuchungen auf FoxC2, LPL und GAPDH (Kontrolle) wurden durchgeführt. In (d) wurden 3T3-L1 Zellen zu Adipozyten in Kultur differenziert und dann für 6 Stunden inkubiert in Abwesenheit (Basal) oder Gegenwart von Forskolin (Forsk.; 100 μM), 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA; 100 nM), Ca²⁺ Ionophor (A23187; 0,5 μM) allein oder in Kombination wie angegeben. Eine Northern-Blot-Analyse wurde durchgeführt und das FOXC2 mRNA Signal wurde durch β-Szintillationszählung in einer Dot-Matrix-β-Zählvorrichtung beurteilt. Das Bild zeigt Zählungen über den Filter bei Grauskala-Intensitätsaufzeichnung. Balken über dem Northern Blot stellen konkrete bzw. gegenwärtige cpm über mittleren cpm von Kontrollen dar, die von Hintergrund-cpm abgezogen sind, wobei eine Angabe als -fache Induktion vorliegt.
4 Eine schematische Ansicht von FOXC2 Transgen-Konstrukt und Southern-Blot-Erfassung von Integrations-positiven Mäusen. Ein 2,1-kb Fragment, das die FOXC2 cDNA enthält, wurde einer Ligation "downstream" von der 5,4-kb aP2 Enhancer/Promotor-Region (A) unterworfen. Vor einer Pronukleus-Injektion wurde das Transgen-Konstrukt von dem Plasmid als ein 8,9-kb NotI/AgeI Fragment freigesetzt. Ein 1,7-kb Fragment des aP2 Promotors wurde als eine Sonde in einer Southern-Blot-Analyse zur Identifikation von Integrations-positiven Mäusen verwendet. Paneel B zeigt die Identifizierung von drei Gründern bzw. Founders, die weiter untersucht wurden.
5(a): Gewichte von intra-abdominalen WAT- und interskapulären BAT-Depots von tg Mäusen (Founder-Linien bzw. Gründer-Linien Tg-A, Tg-B und Tg-C) wurden mit jenen von wt Mäusen verglichen. (b): Verhältnisse zwischen Gewichten von intra-abdominalem WAT zu interskapulärem BAT für wt und tg Gründer-Linien A, B und C. Werte sind Mittelwerte ±SEM, n=4 in jeder Gruppe. (c): Expressionspegel des FOXC2 Transgens in weißem Fettgewebe (WAT) und braunem Fettgewebe (BAT) von Wild-Typ-Mäusen (WT) und FOXC2 transgenen Mäusen (Gründer A, B und C) wie durch eine Northern-Blot-Analyse (12 μg von Gesamt-RNA/Spur) erfasst. GAPDH wurde als eine Kontrolle verwendet.
6 Ein Wild-Typ-Weibchen im Alter von 5 Monaten und ein weibliches, transgenes FOXC2 Wurfgeschwister. A, C und E zeigen WT: B, D und F zeigen transgenes Wurfgeschwister. (A, B) Eine freigelegte Dorsal-Ansicht der interskapulären braunen Fettpolster, die eine erhöhte Größe des Depots in der transgenen Maus erläutert. (C, D) Eine freigelegte Ventral-Ansicht, die eine Verringerung hinsichtlich der Größe und eine Veränderung der Erscheinung der intrabdominalen weißen Fettpolster in der transgenen Maus erläutert. (E, F) Die interskapulären braunen Fettpolster und die intrabdominalen weißen Fettpolster wurden ausgeschnitten. BAT oben und WAT unten.
7 Histologische Schnitte von braunem Fett (A, B) und weißem Fett (C, D) von einer Wild-Typ-Maus im Alter von 5 Monaten (links) und einem transgenen FOXC2 Wurfgeschwister (Gründer A) (rechts). (A, B) Interskapuläres braunes Fett der transgenen Maus besteht aus deutlich vergrößerten Adipozyten, die große unilokuläre Fetttröpfchen enthalten. (C, D) Adipozyten in weißem Fett der transgenen Maus zeigen eine Heterogenität hinsichtlich der Größe. Dies steht im Gegensatz zu dem WAT von einer Wild-Typ-Maus, das aus Adipozyten mit gleichförmiger Größe besteht, die mit einer großen, unilokulären Vacuole befüllt sind. Bei einem Kälte-Adaptationsexperiment werden Mäuse entweder bei Raumtemperatur (RT) oder bei 4 °C während 24 Stunden gehalten. Während kein ersichtlicher Unterschied zwischen BAT von wt Mäusen (E, G) vorliegt, ist die Anzahl und Größe von Lipidtröpfchen, die in tg BAT bei Raumtemperatur vorliegen, bei einer Exposition bei 4 °C klar verringert (F, H). Der in G gezeigte Skalenbalken ist gleich 100 μm.
8 Größenveränderung von Fettdepots in FOXC2 transgenen Mäusen (Gründer C). (A) Gewichtsvergleich (als Prozentsatz des Gesamtkörpergewichts ausgedrückt) für intrabdominale Fettdepots und interskapuläre braune Fettdepots von 5 Monate alten Wild-Typ-Weibchen und transgenen FOXC2-Wurfgeschwistern. Die Veränderungen sind signifikant, P<0,005. (B) Verhältnis zwischen Gewichten des intrabdominalen Fettdepots und des interskapulären braunen Fettdepots. Die Veränderung ist signifikant, P<0,0005. (C) Kein signifikanter Unterschied im Körpergewicht konnte zwischen den zwei Gruppen erfasst werden. (D) Kein signifikanter Unterschied im Nahrungsmittelverbrauch wurde bei einer Erfassung während einer Zeitspanne von zwei Monaten bemerkt. Die Daten sind Mittelwerte ±SD, n=3 für sowohl WT, als auch Gründer C in A-C, n=4 für sowohl WT, als auch Gründer C in D.
9 Menge von verschiedenen mRNAs in weißem Fettgewebe (WAT) und braunem Fettgewebe (BAT) von Wild-Typ-Mäusen (WT) und FOXC2 transgenen Mäusen (Gründer A, B und C) wie durch Northern-Blot-Analyse erfasst (12 μg an Gesamt RNA/Spur). GAPDH wurde als eine Kontrolle verwendet, um eine gleiche Beladung auf allen Blots sicher zu stellen.
10 Serum-Triglycerid ist in FOXC2 transgenen Mäusen (Gründer A) verringert. Der Serum-Triglycerid-Gehalt wurde für 14-Wochen alte Wild-Typ-Männchen und FOXC2 transgene Wurfgeschwister analysiert, die ad libitum ernährt wurden. Die Veränderung ist signifikant, P<0,005. Die Daten sind Mittelwerte ±SD, n=4 für sowohl WT, als auch Gründer A.
11 Gesamt-Körper-Lipid-Gehalt ist in FOXC2 transgenen Mäusen (Gründer A) verringert. Der Gesamt-Körper-Lipid-Gehalt wurde analysiert für 6Monate alte Wild-Typ-Männchen und FOXC2 transgene Wurfgeschwister, die ad libitum ernährt wurden. Die Veränderung ist signifikant, P<0,0005. Die Daten sind Mittelwerte ±SD; WT, n=3 und Gründer A, n=4.
12 In FOXC2 transgenen Mäusen (Gründer A) ist Blut-Glukose verringert (A) und Glukoseeliminierung effizienter (B). (A) Blut-Glukosepegel wurden für 10-Wochen alte Wild-Typ-Mäuse und FOXC2 transgene Wurfgeschwister analysiert, die ad libitum ernährt wurden. Eine signifikante (P<0,05) Verringerung von Blut-Glukosepegeln war bei FOXC2 transgenen Mäusen ersichtlich. (B) Ein intravenöser Glukosetoleranztest wurde an den in (A) verwendeten Mäusen ausgeführt. Blutproben wurden unmittelbar vor und bei 1, 5, 20 und 50 min nach intravenöser Injektion von Glukose (1 g/kg) entnommen. Die Werte waren in signifikanter Weise bei 0 min (P<0,05), 20 min (P<0,001) und bei 50 min (P<0,05). verändert. Die Daten sind Mittelwerte ±SD; n= 10 für sowohl WT, als auch Gründer A.
13 Plasma-Insulin ist in FOXC2 transgenen Mäusen (A) verringert, wobei die Pegel dennoch höher als im Wild-Typ nach intravenöser (iv) Glukoselast (B, C) (Gründer A) anstiegen. (A) Plasma-Insulinpegel wurden für 10-Wochen alte Wild-Typ-Mäuse und FOXC2 transgene Wurfgeschwister analysiert, die ad libitum ernährt wurden. Eine signifikante (P<0,05) Verringerung der Plasma-Insulinpegel wurde bei FOXC2 transgenen Mäusen gesehen. (B) Ein intravenöser Glukosetoleranztest wurde an den Mäusen ausgeführtt, die in (A) verwendet wurden. Blutproben wurden unmittelbar vor und bei 1, 5, 20 und 50 min nach intravenöser Injektion von Glukose (1 g/kg) entnommen. Die Werte waren in signifikanter Weise bei 0 min (P<0,05), 20 min (P<0,01), und bei 50 min (P<0,05) verändert. (C) -fache Induktion von Plasma-Insulinpegeln eine Minute nach i.v. Glukose-Belastung. Die Veränderung ist signifikant, P<0,005. Die Daten sind Mittelwerte ±SD; n= 10 für sowohl WT, als auch Gründer A.
14 Hypothetische Wirkung von FOXC2 in Adipozyten. Ein gefüllter Pfeil zeigt eine bekannte positive Transkriptionsregulation an. Ein offener bzw. nicht-gefüllter Pfeil stellt eine vorgeschlagene Wirkung von FKHL14 dar. ADD1/SREBP1 aktiviert sowohl eine Transkription von Acetyl-CoA-Carboxylase (Lopez et al., 1996), Fettsäuresynthase (FAS) und Lipoprotein-Lipase (LPL), und erhöht die Transkriptionsaktivität von PPARγ (Fajas et al., 1999). PPARγ aktiviert eine Transkription von Fettsäuretransport-Protein (FATP), Acyl-CoA-Synthetase-Genen (ACS; Martin et al., 1997), Adipozyt-Fettsäure-Bindungsprotein 422/aP2 (aP2; Tontonoz et al., 1994a), LPL (Schoonjans et al., 1996) und Phosphoenolpyruvat-carboxykinase (PEPCK; Tontonoz et al., 1995). C/EBPα aktiviert Insulin-ansprechenden Glukose-Transporter-4 (GLUT4; Kaestner et al., 1990), aP2 (Christy et al., 1989), Entkopplungsprotein 1 (UCP 1; Yubero et al., 1994), den Insulin-Rezeptor (InsR), Insulin-Rezeptor-Substrat-1 (IRS-1; Wu et al., 1999b) und PEPCK (Park et al., 1990). Eine positive Feedback-Schleife zwischen C/EBPα und PPARγ wurde vorgeschlagen (Wu et al., 1999b).
15 Verringerung einer Gewichtszunahme in (transgenen) tg Mäusen. Eine Analyse wurde an tg-A Mäusen mit wt Wurfgeschwistern als Kontrollen durchgeführt, die ad libitum ernährt wurden, wobei die Mäuse ein Alter von etwa 4–6 Monaten hatten. Eine Verringerung bei ernährungsinduzierten Gewichtszunahmen bei FOXC2tg Mäusen liegt vor, sowohl bei Weibchen (p<0,02; a), als auch bei Männchen (p<0,03; b), bei einem Vergleich mit wt Mäusen, Werte sind Mittelwerte ±SEM, n=4 in jeder Gruppe. Die Mäuse erhielten eine fettreiche Ernährung bzw. eine Ernährung mit hohem Fettgehalt (high fat diet) (58,0% auf einer kalorischen Basis) während sieben Wochen (siehe Verfahren).
16 Metabolisches Profil. Eine Analyse wurde an tg-A Mäusen mit wt Wurfgeschwistern als Kontrollen durchgeführt; die Mäuse hatten ein Alter von etwa 4–6 Monaten und wurden ad libitum ernährt; die Werte sind Mittelwerte ±SEM. a, Gesamt-Körper-Lipid-Gehalt wurde als Gesamt-Lipid-Gehalt von Kadavern analysiert (siehe Verfahren), n=4 in jeder Gruppe, p<0,0004. b, Serum-Triglycerid ist in FOXC2tg Mäusen verringert, n=4 in jeder Gruppe, p<0,004. c, Serum-Cholesterol, kein signifikanter Unterschied zwischen wt und tg Mäusen, n=4 in jeder Gruppe. d, Freie Fettsäuren (FFA) des Plasma sind verringert in tg Mäusen im Vergleich zu wt Wurfgeschwistern, n=4 in jeder Gruppe, p<0,02. e, Plasma-Glukose ohne Fasten ist in FOXC2 tg Mäusen verringert, n=20 in jeder Gruppe, p<0,01. f, Plasma Insulin ist in tg Mäusen verringert, die Analyse wurde an den gleichen Tieren wie in e durchgeführt, p<0,001. Eine Verringerung bei ernährungsinduzierten Gewichtszunahmen bei FOXC2tg (n=7) Mäusen im Vergleich zu wt (n=9; p<0,01; g) liegt vor. Während der Körperlipidgehalt nach einer fettreichen Ernährung (h) für sowohl wt, als auch tg Mäuse zunimmt, im Vergleich zu Mäusen mit einer Standardernährung (a), bemerken wir eine Verringerung für tg (n=4) Mäuse im Vergleich zu wt (n=6; p<0,0001) in h. Das Verhältnis Gewichtszunahme zu Gramm an verzehrter Nahrung wurde für wt (n= 10) und tg (n=9) Mäuse mit einer Kontrollernährung (i) berechnet, wobei keine signifikanten Unterschiede erfasst werden konnten. Bei dem entsprechenden Experiment mit Mäusen mit einer fettreichen Ernährung liegt eine Verringerung von 30% (p<0,01) für tg (n=7) vor, verglichen mit wt (n=9) Mäusen (i). Keine geschlechtsbezogenen Unterschiede wurden beobachtet.
17 Intravenöser Glukosetoleranztest. Wt und tg-A Mäuse wurden mit einer Kontrollernährung (a, b) oder einer fettreichen (c, d) Ernährung während 14 Wochen ernährt (für Details siehe unter "Verfahren"). Nach intravenöser (i.v.) Injektion von Glukose (1 g/kg) wurden Blutproben unmittelbar vor und bei 1, 5, 20, 50 und 75 min entnommen. Plasma-Glukosepegel unterscheiden sich in signifikanter Weise zwischen wt und tg Mäusen sowohl bei einer Kontrollernährung (a, tg n=8, wt n=9; p<0,02), als auch bei einer fettreichen Ernährung (c, tg=5, wt=6; p<0,001). Plasma-Insulin-Werte unterscheiden sich auch in signifikanter Weise zwischen wt und tg Mäusen sowohl bei einer Kontrollernährung (b, p<0,001), als auch bei einer fettreichen Ernährung (d, p<0,001). Die Werte sind Mittelwerte ±SEM, keine geschlechtsbezogenen Unterschiede wurden beobachtet.
18 Geänderte β-adrenerge Sensitivität, PKA Isozym-Zusammensetzung und Aktivierungskinetiken in Fettgewebe von FOXC2 tg-A Mäusen. (a) Linkes Paneel: CAT Reporter Aktivität gerichtet von dem RIα Promotor, der zusammen mit FOXC2 Expressionsvektor oder Kontrollvektor in 3T3-L1 Prä-Adipozyten transfiziert ist. Die Daten (n=3 Experimente) sind CAT Werte, die hinsichtlich von Transfektionseffizienz normalisiert sind, ausgedrückt als -fache Induktion. Rechtes Paneel: RIα und GAPDH mRNA Pegel in WAT vom Wild-Typ (wt) und den drei Gründer-Stämmen (A, B, C), die FOXC2 überexprimieren. (b) Pegel an RIα und RIIβ immunoreaktivem Protein in WAT und BAT von transgenen Tieren (n=4), verglichen mit Wild-Typ-Wurfgeschwistern (relativ zu Wild-Typ-Pegeln ausgedrückt). (c) Kinase-Aktivitäten unter Verwendung von Kemptide als Substrat in Gegenwart (Gesamt, offene bzw. nicht-gefüllte Balken) oder Abwesenheit (frei, gefüllte Balken) von 5 μM cAMP. Aktivitäten in transgenem WAT und BAT (n=4) werden in Relation zu jenen in Wild-Typ-Wurfgeschwistern gezeigt. (d) Kinase-Aktivitäten hinsichtlich Kemptide werden in WAT Homogenaten von transgenen und Wild-Typ-Wurfgeschwister-Mäusen erfasst, die mit zunehmenden Konzentrationen an cAMP inkubiert werden. Die Daten sind repräsentativ für 2 Paare von analysierten Tieren. Die gesamte cAMP-induzierbare Aktivität wurde auf 100% gesetzt. Rechtes Paneel, ein ImmunoBlot, der WAT-Pegel von RIα und RIIβ zeigt. Intrazelluläre cAMP Pegel in Adipozytsuspensionen wurden von WAT von transgenen Tieren und Wild-Typ-Wurfgeschwistern (jeweils bei Pool-Bildung mit 3 Tieren) hergestellt und mit entweder (e) einem nicht-selektiven β-Agonist (Isoproterenol, 1 μM) oder (f) einem β3-selektiven Agonist (CGP-12177 A, 1 μM) stimuliert. Gleiche Mengen an Zellen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen (0 bis 10 min), mit Stopp-Puffer gemischt und Flash-gefroren. Mittelwert + Halbbereich (half range) (SEM) von doppelten Bestimmungen werden gezeigt.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde das humane Transkriptionsfaktor-Gen FOXC2 als ein Schlüsselregulator des Adipozytmetabolismus identifiziert. Eine erhöhte FOXC2 Expression, in weißem (WAT) und braunem Fettgewebe (BAT), hat einen pleiotropen Effekt auf Gen-Expression, was zu einer Widerstandsfähigkeit hinsichtlich einer ernährungsinduzierten Gewichtszunahme führt und zu einer Abnahme führt hinsichtlich: Gesamt-Körper-Lipid-Gehalt, Serum-Triglyceride, Plasmapegel an freien Fettsäuren, Glukose und Insulin. Nach unserem Wissen ist FOXC2 das bislang einzige identifizierte Gen, das in einer konzertierten Aktion den meisten, wenn nicht allen Symptomen entgegenwirken kann, die mit Obesität assoziiert sind, einschließlich Hypertriglyceridämie und Insulinresistenz; eine wahrscheinlich Konsequenz hiervon würde ein Schutz gegen Typ 2 Diabetes sein.
Im Erwachsenenalter wird das humane "Winged-Helix"-Gen FOXC2 ausschließlich im Fettgewebe exprimiert. Die LPL mRNA Pegel in den FOXC2 transgenen Mäusen scheinen leicht erhöht zu sein (9), was mit den ursprünglichen Ergebnissen übereinstimmt, dass zwei "Winged-Helix"-cis-Regulationselemente für die Induzierbarkeit des LPL Promotors verantwortlich sind (Enerback et al., 1992). Der höhere Expressionspegel von LPL ist sehr wahrscheinlich für die in signifikanter Weise verringerten Plasma TG Pegel verantwortlich, der in FOXC2 transgenen Mäuse (10) beobachtet wird, zusätzlich zu der Tatsache, dass die tiefgreifende Hochregulation von Adipsin sowohl in WAT, als auch in BAT (9) höchstwahrscheinlich von hoher Wichtigkeit ist. Adipsin ist ein sezerniertes Protein, das für die Bildung von Acylierungs-stimulierendem Protein (ASP, acylation stimulating protein) notwendig ist, welches potente anabole Wirkungen auf menschliches Fettgewebe sowohl für Glukose, als auch für freie Fettsäure- (FFA) Speicherung aufweist (Cianflone et al., 1995).
Diese extensiven Veränderungen, die in den FOXC2 transgenen Mäuse ersichtlich sind, die hier vorgestellt werden, schlagen eine sehr zentrale und wichtige Rolle für dieses "Winged-Helix"-Gen vor, von dem bislang nicht bekannt war, dass es an molekularen Ereignissen im Fettgewebe teilnimmt. Durch Gen-Targeting-Experimente wurde gezeigt, dass das Maus Homologe, Mfh1, eine ausschlaggebende Rolle während einer embryonischen Entwicklung spielt (Iida et al., 1997; Winnier et al., 1997), wobei jedoch bislang nichts über seine Funktion in adulten Mäusen publiziert wurde. In einer kürzlichen Veröffentlichung wurde gezeigt, dass einem Mfh1/Pax1 Doppelmutant BAT bei Tag 15,5 dpc vollständig fehlt (Furumoto et al., 1999).
Die FOXC2 transgenen Mäuse hatten eine klare Verringerung an weißer Fettgewebemasse. Die verringerte Größe der weißen Fettdepots könnte lediglich durch die Größenverringerung der Adipozyten (7) bedingt sein, jedoch kann die Möglichkeit nicht ausgeschlossen werden, dass auch eine Verringerung der Adipozytenanzahl vorliegt. Es gibt eine Anzahl möglicher Gründe, weshalb die FOXC2 transgenen Mäuse eine verringerte Größe von weißen Adipozyten aufweisen. Man könnte eine erhöhte lipolytische Aktivität von ihren Adipozyten im Allgemeinen annehmen, wobei dies gekoppelt mit der größeren Masse von braunem Fett zu einer erhöhten Energieausgabe durch Wärmeproduktion durch BAT führen könnte, was zu dem schlanken Phänotyp führt. Die Hochregulation von β₃-AR, die bei transgenem WAT (9) beobachtet wird, wird zu einer erhöhten Aktivierung von HSL führen, daher wird eine Zunahme an Lipolyse (1) schließlich zu einer verringerten Lipidspeicherung führen.
Weiterhin waren die transgenen Mäuse Insulin-sensitiv (13); dies könnte sowohl durch die Hochregulation von Genen, die an einer Insulin-Wirkung beteiligt sind (InsR, IRS-1, IRS-2, und GLUT4; 9), als auch durch die schlanke Körperzusammensetzung (11) erklärt werden. Insulin weist eine kritische Rolle beim Lipidmetabolismus auf, wobei die Speicherung von Triglyceriden in Adipozyten durch zahlreiche Wirkungen auf diese Zelle gefördert wird. Zu diesen zählen eine Glukose-Aufnahme-Stimulation und Lipolyse-Inhibition, die sehr schnell durch Translokation von Insulin-ansprechendem Glukosetransporter-Protein (GLUT 4) beziehungsweise eine kovalente Modifikation von HSL erfolgen. Insulin stimuliert ebenfalls durch die Induktion von lipogenen Schlüsselenzymen eine Fettsäure- und Triglycerid-Synthese und eine Induktion von Lipoprotein-Lipase. Die hier angegeben Daten sind kompatibel mit einem erhöhten Energie-Turnover in den Adipozyten, die von FOXC2 transgenen Mäuse abgeleitet sind.
Die weißen Fettdepots von FOXC2 transgenen Mäuse hatten eine ektopische Expression des für braunes Fett spezifischen Markers UCP1 (9). Der Ursprung von multilokulären Adipozyten in transgenem WAT (7d) verbleibt ein Rätsel. Es wurde vorgeschlagen, dass ein Pool von intrakonvertierbaren Zellen oder kleinen braunen Prä-Adipozyten in WAT vorliegt. Studien sowohl zu Ratte, als auch zu Mäusen haben ein atypisches Vorkommen von UCP1 in bestimmten WAT-Depots gezeigt, von denen zuvor angenommen wurde, dass sie lediglich weiße Adipozyten enthalten (Cousin et al., 1992; Loncar, 1991). Bei einem Kontakt mit Kälte oder einer Behandlung mit einem β₃-AR-selektiven Agonist wurde eine UCP 1 Expression in WAT, sowie in typischem BAT, erhöht und auf histologischen Schnitten konnte man kleine multilokuläre Zellen identifizieren, die verstreut zwischen den weißen Adipozyten vorliegen, für die durch Immunhistochemie gezeigt wurde, dass sie UCP1 enthalten (Cousin et al., 1992; Ghorbani et al., 1997).
Weiterhin wurden sowohl UCP1, als auch β₃-AR mRNAs in weißen Fettdepots von Menschen erfasst (Krief et al., 1993) und kürzlich wurde gezeigt, dass Kulturen von menschlichen Adipozyten, die von weißen Fettdepots abgeleitet sind, UCP1 nach Behandlung mit β₃-AR Agonisten exprimieren (Champigny und Ricquier, 1996). Darüber hinaus weisen transgene Mäuse, die β₁-AR in WAT und BAT überexprimieren, ein reichliches Vorkommen von braunen Fettzellen in subkutanem WAT auf (Soloveva et al., 1997). Wir würden gerne die Vermutung vorschlagen, dass diese vorgeschlagenen intrakonvertierbaren Zellen oder kleinen braunen Prä-Adipozyten eine Proliferation in unseren transgenen Mäusen erfahren haben, was auf histologischen Schnitten als kleine multilokuläre Zellen einfach erkennbar ist (8d), aufgrund der erhöhten Expression an β₃-AR. Das FOXC2 Transgen aktiviert möglicherweise andere Proteine, die weiter unten im Signaltransduktionsweg sind, was schließlich zur Induktion von UCP1 Expression führt. Zusätzlich erreichen die Pegel von C/EBPα und PPARγ mRNAs in transgenem WAT diejenigen von Wild-Typ-BAT (10) und von beiden dieser Transkriptionsfaktoren ist bekannt, dass sie eine UCP1-Expression induzieren (Digby et al., 1998; Yubero et al., 1994). C/EBPα aktiviert einige Adipozyt-spezifische Gene und ebenfalls Gene, die bei einer Wirkung von Insulin beteiligt sind (15), daher zeigen C/EBPα (-/-) Zellen ein vollständiges Fehlen von Insulin-stimuliertem Glukosetransport, sekundär zu einer verringerten Genexpression und Tyrosin-Phosphorylierung für den Insulin-Rezeptor und IRS-1 (Wu et al., 1999b). Die WAT von FOXC2 transgenen Mäuse weisen eine deutliche Erhöhung der mRNA Pegel sowohl für C/EBPα, als auch für PPARγ auf, wobei diese Transkriptionsfaktoren wiederum für eine Hochregulation von mRNA Pegeln für aP2, LPL, UCP1, GLUT4, Insulin-Rezeptor und IRS-1 verantwortlich sein können (14).
Es ist interessant anzumerken, dass die weißen Adipozyten von FOXC2 transgenen Mäusen sich nicht lediglich in braune Adipozyten umgewandelt haben, in der Bedeutung einer mRNA Expression, da sie beispielsweise höhere Pegel von bestimmten mRNAs aufweisen (d.h. β₂-AR, Insulin-Rezeptor, IRS-1 und IRS-2) als es in irgendeinem Typ von Wild-Typ-Fettgewebe ersichtlich ist.
In den hier untersuchten Mäusen, war die FOXC2 Transgen-Expression unter der Kontrolle des aP2 Promotors, der lediglich in Adipozyten und nicht in Stammzellen und wahrscheinlich auch nicht in den vorstehend diskutierten intrakonvertierbaren Zellen funktioniert (Ailhaud et al., 1992). Angesichts der Tatsache, dass aP2 ein später Marker ist (2), ist es ziemlich überraschend, dass wir eine derart dramatische Veränderung in den Charakteristika von weißen Adipozyten erhalten. Gegenwärtig ist es nicht bekannt, ob eine Adipozyt-Dedifferenzierung in vivo erfolgt, während in vitro gezeigt wurde, dass dieser Vorgang erfolgt und durch TNFα in menschlichen Adipozyten induziert wird (Petruschke und Hauner, 1993). Eine andere Interpretation für das Vorliegen von kleinen multilokulären Zellen in WAT unserer transgenen Mäuse könnte dann eine Dedifferenzierung von ursprünglich weißen Adipozyten, gefolgt von einer Umwandlung in den Adipozyten-Typ sein, der in den FOXC2 transgenen Mäusen beobachtet wird.
Das interskapuläre braune Fett von FOXC2 transgenen Mäuse wog ~7,5 mal soviel wie braunes Fett vom Wild-Typ (8a). Diese extreme Hypertrophie könnte durch die erhöhte Expression von β₃- und β₂-AR mRNA erklärt werden, die in BAT von FOXC2 transgenen Mäuse ersichtlich ist (9). Eine chronische Behandlung mit β₃-AR Agonisten erhöht Körpertemperatur und Energieausgabe und sie verursacht eine Hypertrophie des interskapulären BATs, mit mehrfachen Zunahmen in dem Gehalt an UCP1 und Cytochrom-Oxidase (Himms-Hagen et al., 1994). Die Morphologie von transgenem interskapulärem BAT ist etwas verändert, wobei es größere Fetttröpfchen als Wild-Typ-BAT (7a & b) aufweist. Dies ist nicht ein Merkmal von chronischer β₃-AR Agonist Behandlung, aber eine Möglichkeit besteht, dass die Hochregulation von Markern, die an der Insulinwirkung beteiligt sind (9), und erhöhte Pegel an Adipsin die erhöhte Speicherung von Triglyceriden in braunen Adipozyten von transgenen Mäusen fördern. Es wurde ebenfalls zuvor beobachtet, dass erhöhte Pegel an UCP2 mRNA mit diesem Phänotyp gekoppelt werden können (Enerback et al., 1997; Kozak et al., 1991).
Funktionsgestörtes BAT, das in dem ADD1/nSREBP-1c Transgen beobachtet wird (Shimomura et al., 1998) und einer genetischen Ablation unterworfenes BAT in dem UCP1 – DTA Transgen (UCP1 Promotor – Diphtherietoxin-Kette A) (Lowell et al., 1993) führt zu Insulinresistenz. Transgene Mäuse, die ADD1/nSREBP-1c überexprimieren, zeigen einige Merkmale, die zu denen des FOXC2 Transgens ziemlich entgegengesetzt sind, einschließlich Insulinresistenz und NIDDM. FOXC2 transgene Mäuse zeigen eine etwas entgegengesetzte Expressionsmuster-Veränderung, verglichen mit jener von ADD1/nSREBP-1c transgenen Mäusen, da die mRNAs, die für PPARγ, C/EBPα, aP2, UCP1, Adipsin, InsR, IRS-1, IRS-2 und GLUT4 kodieren, alle herunter-reguliert sind. In unserem Transgen sind stattdessen alle dieser mRNAs hoch-reguliert (9). Faszinierenderweise weisen unsere transgenen Mäuse übrigens erhöhte Pegel an ADD1/SREBP1 mRNA in WAT (9) auf, was etwas in dieser Hinsicht das ADD1/nSREBP-1c Transgen nachahmt.
FOXC2 könnte ein wichtiger Teilnehmer an der Leptin-Expressionsregulation sein, was auf der Tatsache basiert, dass Leptin mRNA Pegel in FOXC2 transgenen Mäuse herunterreguliert sind (am auffälligsten in BAT: 9), und dass die zehn-fache Abnahme an Ob Promotor-Aktivität in Zellkultur-Experimenten ersichtlich ist, die dann mit FOXC2 Expressionsplasmid (4) co-transfiziert werden. Zusätzlich wird eine Leptin-Expression durch β₃-adrenerge Stimuli inhibiert (Mantzoros et al., 1996), von der angenommen wird, dass sie in FOXC2 transgenen Mäusen hoch ist aufgrund der Hoch-Regulation von β₃-AR mRNA Pegeln.
Die Menge an Nahrung, die von transgenen Mäusen konsumiert wird, verglichen mit jener beim Wild-Typ, unterscheidet sich nicht (8d) und kein signifikanter Unterschied hinsichtlich des Körpergewichts wurde beobachtet, was vorhersagt, dass der beobachtete Unterschied hinsichtlich des Gesamt-Körper-Lipid-Gehalts mit einem erhöhten Anabolismus in FOXC2 transgenen Mäuse kompensiert werden muss. Die FOXC2 transgenen Mäuse sind sehr wahrscheinlich ebenfalls gegen eine sich entwickelnde ernährungsinduzierte Obesität geschützt, wobei die beobachtete Insulinsensitivität (13), die niedrigeren Blutglukosepegel und eine effizientere Glukoseeliminierung (12), die in unseren transgenen Mäusen beobachtet werden, in Betrachtung gezogen werden. Insulinsensitivität und/oder -resistenz auf Ernährungs-induzierte Obesität wurde(n) für einige andere transgene Mausmodelle beobachtet: Zielgerichtete Disruption der RIIβ Subeinheit von Proteinkinase A führt zu schlanken Mäusen, die hinsichtlich einer ernährungsinduzierten Obesität widerstandsfähig sind (Cummings et al., 1996), wobei Mäuse, denen das Protein Tyrosinphosphatase-1B Gen (PTP-1B) fehlt, Insulin-sensitiv und widerstandsfähig hinsichtlich Obesität (Elchebly et al., 1999) sind, aP2-UCP1 transgene Mäuse gegen genetische Obesität geschützt sind (Kopecky et al., 1995), und transgene Mäuse, die β₁-AR im Fettgewebe über-exprimieren, widerstandsfähig hinsichtlich von Obesität sind (Soloveva et al., 1997). Darüber hinaus wurden β₃-AR Agonisten gefunden, die anti-diabetische Wirkungen in Tiermodellen zu Obesität und NIDDM aufweisen; eine chronische Dosierung kann eine Glukosetoleranz verbessern, eine Insulin-Sensitivität erhöhen und Fasten-Blut-Glukosepegel verringern (Cawthorne et al., 1992). FOXC2 ist das einzige Adipozytspezifische Gen, das direkt oder indirekt, Triglyceridmetabolismus, adrenerge Regulation und Insulinwirkung in Adipozyten reguliert. Gegenwärtig ist nach unserem Wissen das FKHL14 das einzige bekannte Gen, das in einer konzertierten Aktion den meisten, wenn nicht allen der Symptome entgegenwirken kann, die mit Obesität assoziiert sind: Hypertriglyceridämie, Insulinresistenz und sehr wahrscheinlich das assoziierte klinische Syndrom von NIDDM.
Der in WAT beobachtete, offensichtliche Dosis-ansprechende FOXC2 Transgen Effekt für die Induktion von UCP1, β₃-AR und Adipsin kann eine direkte Wechselwirkung für FOXC2 mit den Promotoren dieser Gene anzeigen. Eine schematische Ansicht der hypothetischen Wirkung von FOXC2 in Adipozyten ist in 14 gezeigt.
Eine angemessene Aktivierung von FOXC2 durch Drogen kann Fettspeicher verringern, während Skelett-Muskelmasse bewahrt wird, indem eine Fettassimilation während eines Verdaus verhindert wird und durch ein Erhöhen von WAT Lipolyse, BAT Thermogenese, und Insulinwirkung. Daher können sich derartige Drogen als nützlich bei einer Behandlung von Obesität und NIDDM und ebenso von assoziierten Erkrankungen erweisen. Es wird daher vorhergesehen, dass eine wirksame Menge an einem Polypeptid, das durch das humane FOXC2-Gen kodiert wird, bei Verfahren für die Behandlung von medizinischen Zuständen, die Obesität betreffen, nützlich sein könnte.
Offenbart wird ein Konstrukt oder spezifischer ein Gen-Konstrukt oder ein rekombinantes Konstrukt, welches umfasst, eine humane FOXC2 Nukleotidsequenz, die in funktionsfähiger Weise bzw. operabel (operably) mit einem Element verbunden ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Promotoren, Response-Elementen, Enhancer-Elementen und Gemischen davon. Der Begriff "in funktionsfähiger Weise bzw. operabel verbunden", wie hier verwendet, bedeutet ein funktionales bzw. funktionsfähiges Verschmelzen eines Elements mit einem Strukturgen bzw. strukturellen Gen (structural gene) in dem gehörigen Rahmen zum Exprimieren des Strukturgens unter Kontrolle bzw. Steuerung des Elements.
Vorzugsweise ist das Element ein Promotor, insbesondere ein Fett- bzw. adipös-spezifischer (adipose-specific) Promotor, derart wie der adipös-spezifische Promotor des murinen Gens, das Adipozyt P2 kodiert (4), der wie von Ross et al. (1990) beschrieben isoliert werden kann.
Vorzugsweise ist die FOXC2 Nukleotidsequenz identisch oder im Wesentlichen ähnlich zur SEQ ID NO: 1 der Sequenzliste. Die FOXC2 Nukleotidsequenz ist jedoch nicht streng auf die Sequenz beschränkt, die als SEQ ID NO: 1 gezeigt ist. Sie umfasst ebenfalls Nukleotidsequenzen, die Modifikationen, wie Substitutionen, kleine Deletionen, Insertionen oder Inversionen, aufweisen, die nichtsdestotrotz für Polypeptide kodieren, die im Wesentlichen die biochemische Aktivität des FOXC2 Polypeptids aufweisen.
Folglich ist die humane FOXC2 Nukleotidsequenz ausgewählt aus:

(a) der Nukleotidsequenz, die als SEQ ID NO: 1 gezeigt ist;
(b) Nukleotidsequenzen, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Nukleotidsequenz hybridisieren können, die komplementär zu der Polypeptid-kodierenden Region einer Nukleotidsequenz, wie in (a) definiert ist und die für ein biologisch aktives FOXC2 Polypeptid oder eine funktional äquivalente modifizierte Form hiervon kodiert bzw. kodieren;
(c) Nukleinsäuresequenzen, die infolge des genetischen Codes zu einer Nukleotidsequenz wie in (a) oder (b) definiert entartet bzw. degeneriert sind und die für ein biologisch aktives FOXC2 Polypeptid oder eine funktional äquivalente modifizierte Form hiervon kodiert bzw. kodieren; und
(d) Nukleotidsequenzen, die eine Homologie von mindestens 90%, vorzugsweise eine Homologie von mindestens 95% zu der Nukleotidsequenz aufweisen, die als SEQ ID NO: 1 in der Sequenzliste gezeigt ist.

Der Begriff "stringente Hybridisierungsbedingungen" ist im Stand der Technik aus Standardprotokollen bekannt (beispielsweise Ausubel et al.) und könnte beispielsweise als eine Hybridisierung an Filter-gebundene DNA in 0,5 M NaHPO₄, 7% Natriumdodecylsulfat (SDS), 1 mM EDTA bei +65°C, und Waschen in 0,1 × SSC / 0,1 % SDS bei +68°C, verstanden werden.
Offenbart ist ein transgenes nicht-menschliches Säugetier, dessen Genom ein Gen-Konstrukt wie vorstehend definiert umfasst, wobei das Tier das humane FOXC2-Gen in seinem Fettgewebe exprimieren kann.
Unter "transgenes Tier" wird ein nicht-menschliches Säugetier verstanden, das eine Nukleinsäuresequenz enthält, die in eine Zelle inseriert ist und zu einem Teil des Genoms des Tiers wird, das sich aus dieser Zelle entwickelt. Ein derartiges Transgen kann teilweise oder vollständig heterolog zu dem transgenen Tier sein. Andere transgene Säugetiere, einschließlich transgene Nagetiere (beispielsweise Hamster, Meerschweinchen, Kaninchen und Ratten) und transgene Schweine, Rinder, Schafe und Ziegen können durch Standardtechniken konstruiert werden.
Ein Mittel, das zur Herstellung eines transgenen Tiers verfügbar ist, beispielsweise mit einer Maus, ist wie folgt: Weibliche Mäuse werden gepaart und die resultierenden befruchteten Eier werden aus ihren Eileitern entnommen. Die Eier werden in einem geeigneten Medium gelagert. DNA oder cDNA, die das FOXC2-Gen kodiert, wird aus einem Vektor durch im Stand der Technik wohlbekannte Verfahren gereinigt. Gewebe-spezifische Regulationselemente, derart wie der vorstehend diskutierte Adipozyt-spezifische aP2 Promotor, können mit der codierenden Region fusioniert sein, um eine Gewebe-spezifische Expression des Transgens zu ermöglichen. Die DNA in einer in geeigneter Weise gepufferten Lösung wird in eine Mikroinjektionsnadel gegeben und das zu injizierende Ei wird in einen Objektträger mit Vertiefung (depression slide) gegeben. Die Nadel wird in den Pronukleus des Eis eingeführt und die DNA Lösung wird injiziert. Das injizierte Ei wird dann in den Eileiter einer pseudo-trächtigen Maus transferiert, worin es zum Uterus gelangt, implantiert und sich bis zum Ende der Schwangerschaftsdauer entwickelt (develops to term).
Eine transgene Maus könnte vorzugsweise von einer genetisch adipösen Maus abgeleitet sein. Genetisch adipöse Mäuse, derart wie ob/ob oder db/db Mäuse, sind im Stand der Technik wohlbekannt.
Offenbart wird eine isolierte Zelllinie, die von dem transgenen, nicht-menschlichen Säugetier abgeleitet ist, sowie ein Verfahren zum Herstellen eines transgenen, nicht-menschlichen Säugetiers, welches das humane FOXC2-Gen überexprimiert, wobei das Verfahren umfasst, chromosomales Aufnehmen eines Gen-Konstrukts, welches das humane FOXC2-Gen zusammen mit geeigneten regulatorischen Sequenzen umfasst, in das Genom des nicht-menschlichen Säugetiers.
Offenbart wird ebenfalls ein Verfahren zum Untersuchen der biologischen Aktivität eines Polypeptids, das durch das humane FOXC2-Gen kodiert wird, wobei das Verfahren die Schritte umfasst (i) Herstellen eines transgenen nicht-menschlichen Säugetiers, welches das humane FOXC2-Gen überexprimiert; und (ii) Vergleichen des Phänotyps des transgenen nicht-menschlichen Säugetiers mit einem Wild-Typ-Tier der gleichen Spezies.
Die Erfindung stellt biologische Durchmusterungsassays bzw. Screening-Assays für die Identifizierung von Verbindungen bereit, die nützlich sein könnten für die Behandlung von medizinischen Zuständen, die in Bezug zu Obesität oder alternativ zu Fehlernährung stehen. Ein "medizinischer Zustand, der in Bezug zu Obesität steht" umfasst beispielsweise Obesität, NIDDM, Bluthochdruck bzw. Hypertension (hypertension) und Hyperlipidämie. Der "medizinische Zustand, der in Bezug zu Fehlernährung steht" umfasst beispielsweise Anorexie, ineffektiver Metabolismus und Krebs.
Die Erfindung stellt folglich ein Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung bereit, die nützlich für die Behandlung eines medizinischen Zustands ist, der in Bezug zu Obesität steht, wobei das Verfahren die Schritte umfasst (i) in Kontakt bringen einer Test-Verbindung mit dem humanen FOXC2-Gen; und (ii) Bestimmen, ob die Test-Verbindung die Expression des humanen FOXC2-Gens aktiviert, wobei eine derartige Aktivierung eine Verbindung anzeigt, die nützlich für die Behandlung eines medizinischen Zustands ist, der in Bezug zu Obesität steht.
Offenbart wird ebenfalls ein Durchmusterungsverfahren für eine Verbindung, die nützlich für die Behandlung eines medizinischen Zustands ist, der in Bezug zu Obesität steht, wobei das Verfahren umfasst, Exponieren eines nicht-menschlichen Säugetiers hinsichtlich einer Test-Verbindung, und Bestimmen der Aktivität des humanen FOXC2-Gens in dem nicht-menschlichen Säugetier, wobei ein Erhöhung der Gen-Aktivität verglichen mit einem unbehandelten nicht-menschlichen Säugetier eine Verbindung anzeigt, die nützlich für die Behandlung eines medizinischen Zustands ist, der in Bezug zu Obesität steht.
Das nicht-menschliche Säugetier ist vorzugsweise eine Maus, beispielsweise eine adipöse Maus. Mäuse können durch Verabreichung einer fettreichen Ernährung adipös gemacht werden. Alternativ kann es sich bei der Maus um eine genetisch adipöse Maus handeln, derart wie eine ob/ob oder db/db Maus.
Bei den vorstehend beschriebenen Verfahren kann die Aktivität des humanen FOXC2-Gens in dem nicht-menschlichen Säugetier in vorteilhafter Weise mit der Aktivität des humanen FOXC2-Gens in einem transgenen, nicht-menschlichen Säugetier verglichen werden, welches das humane FOXC2-Gen exprimiert oder überexprimiert.
Bei einem alternativen Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, die nützlich für die Behandlung eines medizinischen Zustands ist, der in Bezug zu Obesität steht, umfasst das Verfahren die Schritte (i) in Kontakt bringen einer Test-Verbindung mit einem Polypeptid, das durch das humane FOXC2-Gen kodiert wird; und (ii) Bestimmen, ob die Test-Verbindung die biologischen Aktivitäten des Polypeptids stimuliert, wobei eine derartige Stimulation eine Verbindung anzeigt, die nützlich für die Behandlung eines medizinischen Zustands ist, der in Bezug zu Obesität steht. Der Begriff "biologische Aktivitäten", wie er in diesem Kontext verwendet wird, bedeutet beispielsweise ein Verstärken der DNA-Protein Wechselwirkung zwischen dem FOXC2 Polypeptid und Zielsequenzen in Ziel-Gen-Promotoren.
Weiterhin wird ein Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung offenbart, die nützlich für die Behandlung eines medizinischen Zustands ist, der in Bezug zu Fehlernährung steht, wobei das Verfahren die Schritte umfasst (i) in Kontakt bringen einer Test-Verbindung mit dem humanen FOXC2-Gen; und (ii) Bestimmen, ob die Test-Verbindung eine Expression des FOXC2-Gen verringert oder inhibiert, wobei eine derartige Abnahme oder Inhibition eine Verbindung anzeigt, die nützlich für die Behandlung eines medizinischen Zustands ist, der in Bezug zu Fehlernährung steht.
Offenbart wird ebenfalls ein Verfahren zum Durchmustern nach einer Verbindung, die nützlich für die Behandlung eines medizinischen Zustands ist, der in Bezug zu Fehlernährung steht, wobei das Verfahren umfasst, Exponieren eines nicht-menschlichen Säugetiers, vorzugsweise einer Maus, derart wie einer adipösen Maus, hinsichtlich einer Test-Verbindung, und Bestimmen der Aktivität des humanen FOXC2-Gens in dem nicht-menschlichen Säugetier, wobei eine Abnahme in der Gen-Aktivität verglichen mit einem unbehandelten nicht-menschlichen Säugetier eine Verbindung anzeigt, die nützlich für die Behandlung eines medizinischen Zustands ist, der in Bezug zu Fehlernährung steht.
Bei einem alternativen Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, die nützlich für die Behandlung eines medizinischen Zustands ist, der in Bezug zu Fehlernährung steht, umfasst das Verfahren die Schritte (i) in Kontakt bringen einer Test-Verbindung mit einem Polypeptid, das durch das humane FOXC2-Gen kodiert wird; und (ii) Bestimmen, ob die Test-Verbindung die biologischen Aktivitäten des Polypeptids verringert oder inhibiert, wobei eine derartige Abnahme oder Inhibition eine Verbindung anzeigt, die für die Behandlung eines medizinischen Zustands nützlich ist, der in Bezug zu Fehlernährung steht.
Bei den vorstehend diskutierten Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die eine FOXC2 biologische Aktivität verringern oder stimulieren, können andere Gene, die Forkhead-Proteine kodieren in günstiger Weise für einen Vergleich verwendet werden (counter-screening bzw. Gegen-Durchmusterung), um die Spezifität der Test-Verbindung zu bestimmen. Derartige Forkhead-Gene, beispielsweise freac-3 und freac-4, wurden beispielsweise von Pierrou et al. (1994) EMBO Journal 13, 5002-5012 offenbart.
Für einen Fachmann ist klar, dass andere Polypeptide, die über die gleichen biologischen Wege wie das FOXC2 Polypeptid wechselwirken, für Durchmusterungsverfahren für die Identifizierung von Agenzien nützlich sein werden, wobei die Agenzien nützlich für die Behandlung von medizinischen Zuständen sind, die in Bezug zu Obesität oder Fehlernährung stehen. Derartige alternative Ziel-Polypeptide könnten beispielsweise durch einen "yeast twohybrid assay" (vgl. Beispiel 11) oder durch Mikroarray-Technologie (vgl. Beispiel 14). identifiziert werden. Folglich wird ein Verfahren zum Identifizieren eines Agens offenbart, das nützlich für die Behandlung eines medizinischen Zustands ist, der in Bezug zu Obesität steht, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

(i) Identifizieren eines Ziel-Polypeptids, das mit dem FOXC2 Polypeptid wechselwirkt;
(ii) in Kontakt bringen eines Kandidat-Agens bzw. eines möglichen Agens (candidate agent) mit dem Ziel-Polypeptid; und
(iii) Bestimmen, ob das Kandidat-Agens die biologische Aktivitäten des FOXC2 Polypeptids stimuliert, wobei eine derartige Stimulierung eine Verbindung anzeigt, die nützlich für die Behandlung eines medizinischen Zustands ist, der in Bezug zu Obesität steht.

Der Begriff "Bestimmen, ob das Kandidat-Agens die biologischen Aktivitäten des FOXC2 Polypeptids stimuliert" soll beispielsweise umfassen, Bestimmen, ob das Kandidat-Agens eine Expression des FOXC2 Polypeptids erhöhen kann, oder ob das Kandidat-Agens auf andere Weise die biologischen Aktivitäten des FOXC2 Polypeptids modulieren kann. Die biologischen Aktivitäten des FOXC2 Polypeptids werden in den nachstehenden Beispielen detailliert diskutiert und umfassen beispielsweise eine Verringerung des Gesamtlipidgehalts in Test-Tieren.
Für therapeutische Verwendungen können die Zusammensetzungen oder Agenzien, die unter Verwendung der hierin offenbarten Verfahren identifiziert wurden, systemisch verabreicht werden, beispielsweise in einem pharmazeutisch annehmbaren bzw. geeigneten Puffer, derart wie physiologische Salzlösung bzw. Kochsalzlösung, formuliert werden. Bevorzugte Verabreichungsrouten umfassen beispielsweise oral, subkutan, intravenös, intraperitoneal, intramuskuläre oder intradermale Injektionen, die kontinuierliche bzw. ununterbrochene anhaltende Pegel der Droge in dem Patient bereitstellen. Eine Behandlung von menschlichen Patienten oder anderen Tieren wird unter Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge an einer identifizierten Verbindung in einem physiologisch annehmbaren bzw. geeigneten Träger ausgeführt werden. Geeignete Träger und ihre Formulierung werden beispielsweise in Remington's Pharmaceutical Sciences von E. W. Martin beschrieben. Die Menge der zu verabreichenden aktiven Verbindung variiert in Abhängigkeit von der Verabreichungsweise, dem Alter und Körpergewicht des Patienten und dem Typ der Erkankung und dem Ausmaß der Erkrankung. Im Allgemeinen werden die Mengen in dem Bereich von jenen sein, die bei anderen Agenzien verwendet werden, die bei der Behandlung von Obesität und Diabetes verwendet werden.
Das humane FOXC2-Gen könnte bei einer Gentherapie von medizinischen Zuständen verwendet werden, die in Bezug zu Obesität stehen. Offenbart wird folglich ein Verfahren zur Behandlung von Obesität in einem Mensch, welches umfasst, (i) Verabreichen eines Vektors, der umfasst, eine humane FOXC2 DNA Sequenz, die in funktionsfähiger Weise bzw. operabel mit einem Promotor verbunden ist, an den Mensch; und
(ii) Ermöglichen, dass der Mensch eine therapeutisch wirksame Menge an einem Polypeptid exprimiert, das durch das humane FOXC2-Gen kodiert ist. Ein Genzuführungssystem, das den Vektor beinhaltet, umfassend eine humane FOXC2 DNA Sequenz, die in funktionsfähiger Weise mit einem Promotor verbunden ist, ist ebenfalls offenbart.
Das FOXC2-Gen sollte in funktionsfähiger Weise mit mindestens einem Element verbunden sein, das bei Einführung in die Wirtszellenumgebung eine Expression des Gens ermöglicht. Diese Sequenzen enthalten Promotoren, Response-Elemente und Enhancer-Elemente. Bevorzugt ist der adipös-spezifische Promotor/Enhancer des murinen Gens, das Adipozyt P2 kodiert.
Das heterologe Gen kann dem Organismus unter Verwendung eines Vektors oder eines anderen Zufuhrvehikels zugeführt werden. DNA Zufuhrvehikel können umfassen, virale Vektoren, derart wie Adenoviren, adeno-assoziierte Viren und retrovirale Vektoren. Siehe beispielsweise: Chu et al. (1994) Gene Ther 1: 292–299; Couture et al. (1994) Hum Gene Ther 5:667–677; und Eiverhand et al. (1995) Gene Ther 2: 336–343. Nicht-virale Vektoren, die ebenfalls geeignet sind, umfassen DNA-Lipid-Komplexe, beispielsweise Liposomvermittelte oder Ligand/Poly-L-Lysin-Konjugate, derart wie Asialoglyco-protein-vermittelte Zufuhrsysteme. Siehe beispielsweise: Feigner et al. (1994) J. Biol. Chem 269: 2550–2561; Derossi et al. (1995) Restor. Neurol. Neuros. 8: 7–10; und Abcallah et al. (1995) Biol. Cell 85: 1–7.
Wenn ein Vektor als das Zufuhrvehikel für das Gen ausgewählt ist, kann dieser ein beliebiger Vektor sein, der eine Expression des Gens in den Wirtszellen ermöglicht. Bevorzugt ist, dass es sich bei dem Vektor ebenfalls um einen handelt, der in das Wirtsgenom integrieren kann, so dass das Gen in permanenter Weise exprimiert werden kann. Ad (Adenovirus) Vektoren wurden wegen mehrerer Gründe, einschließlich der Tatsache, dass sich Ad Vektoren als hocheffektiv für den Transfer von Genen in eine große Vielfalt von Geweben in vivo erwiesen haben und der Tatsache, dass Ad sowohl teilende, aus auch nicht-teilende Zellen infiziert, für die Zuführung von Fremdgenen in Zellen genutzt. Der Vektor wird dem Wirt im Allgemeinen durch intravenöse Injektion verabreicht. Geeignete Titer werden von mehreren Faktoren abhängen, derart wie dem bestimmten gewählten Vektor, dem Wirt, einer Stärke (strength) eines verwendeten Promotors und der Schwere der behandelten Erkrankung.
Alternativ wird in Betracht gezogen, dass bei einigen menschlichen Erkrankungszuständen ein Verhindern der Expression von dem humanen FOXC2-Gen oder ein Verringern der Aktivität hiervon nützlich zur Behandlung von Erkrankungszuständen sein wird. Es wird in Betracht gezogen, dass eine Antisense-Therapie oder eine Gentherapie angewendet werden könnte, um die Expression des humanen FOXC2-Gens negativ zu regulieren. Antisense-Nukleinsäuren (vorzugsweise 10 bis 20 Basenpaare Oligonukleotide), die an FOXC2 Expressionskontrollsequenzen oder FOXC2 RNA spezifisch binden können, werden in Zellen eingeführt (beispielsweise durch einen viralen Vektor oder ein kolloidales Dispersionssystem, derart wie ein Liposom). Die antisense-Nukleinsäure bindet an die FOXC2 Ziel-Nukleotidsequenz in der Zelle und verhindert eine Transkription und/oder eine Translation der Zielsequenz. Phosphorothioat- und Methylphosphonat-antisense Oligonukleotide werden spezifisch in Betracht gezogen. Die antisense-Oligonukleotide können weiter durch Poly-L-Lysin, Transferrin-polylysin oder Cholesterol-Elemente bei ihrem 5'-Ende modifiziert sein. Eine Suppression einer FOXC2 Expression entweder auf dem transkriptionalen oder translationalen Niveau ist nützlich, um zelluläre oder tierische Modelle für Erkrankungen/Zustände zu erzeugen, die durch eine abweichende bzw. aberrante FOXC2 Expression gekennzeichnet sind.
In dieser Beschreibung sind die Begriffe "Standardprotokolle" und "Standardvorgehensweisen", wenn sie im Kontext von Molekularbiologie-Techniken verwendet werden, als Protokolle und Vorgehensweisen zu verstehen, die in gewöhnlichen Laborhandbüchern aufgefunden werden, derart wie: Current Protocols in Molecular Biology, Herausgeber F. Ausubel et al., John Wiley and Sons, Inc. 1994 oder Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T., Molecular Cloning: A laboratory manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 1989.
EXPERIMENTELLE VERFAHREN
Klonieren und DNA Konstrukt
Eine Bibliothek von menschlicher Fettgewebe λgtl1 cDNA (Clontech) wurde mit einem Sondengemisch durchgemustert, das der konservierten "Fork-Head"-Domäne entspricht, abgeleitet von: FOXC1, FOXD1, FOXL1 und FOXA1. Eine Hybridisierung wurde bei niedriger Stringenz ausgeführt, d.h. 6 × SSC bei +60°C, Post-Hybridisierungswaschvorgänge bei O,5 × SSC bei +60°C. Eine der positiven Rekombinationen, die ein 2,1 kb Insert beherbergt, wurde subkloniert und sequenziert. Ein 5,4-kb EcoRV-SmaI Fragment wurde von einem pBluescript II SK(+) Vektor ausgeschnitten, enthaltend den 5,4-kb Promotor/Enhancer des Maus aP2 Gens, und in die EcoRV-SpeI "Blunt"-Stelle von einem pBluescript II SK(+) Vektor ligiert, der die 2,1 kb FOXC2 cDNA enthält. Ein 7,6 kb XhoI "Blunt Fragment", das enthält, den aP2 Promotor/Enhancer, gefolgt von der FOXC2 cDNA wurde von dem vorstehenden Plasmid ausgeschnitten und in die EcoRV Stelle des pCB6+ Vektors ligiert, welcher ein Polyadenylierungssignal des menschlichen Wachstumshormongens enthält. Nach diesen Vorgängen war das resultierende 8,2-kb Fragment, welches das aP2-FOXC2-Konstrukt mit Polyadenyliserungssignal beherbergt, durch die einmaligen Stellen NotI und AgeI flankiert. Das Plasmid wurde über Ligationsstellen sequenziert.
Transgene Mäuse
Konstrukt-DNA (aP2-FOXC2), die unter Verwendung eines Qiagen-Kits gemäß den Herstellerangaben gereinigt wurde, wurde in den männlichen Pronukleus von (C57BL6 × CBA) F₁ Zygoten injiziert, über Nacht gezüchtet und zu pseudo-trächtigen Weibchen transferiert. Tg Gründer-Linien wurden während bzw. für vier Generationen zu C57BL6/J zurückgekreuzt (back-crossed). Den Mäusen wurde ein Standardfutter mit 4% Fett-Gehalt gefüttert. Bei Experimenten mit fettreicher Ernährung wurden Mäuse entweder mit einem Futter mit 58% Fett oder einer Kontrollernährung mit 11,4% Fett (auf einer kalorischen Basis; Research Diets) während 7 Wochen ernährt. Fett-reiches Futter hat einen Gesamt-Energiegehalt von 23,4 KJ/g, Kontrollernährung von 12,6 KJ/g.
Histologie
Gewebe wurden über Nacht in 4% Paraformaldehyd in PBS bei +4°C fixiert, dehydratisiert, in Paraffin eingebettet, geschnitten (6–8 μm) und mit Haematoxylin und Eosin angefärbt.
Serum und Lipidanalyse
Plasma-Insulin wurde radioimmunochemisch unter Verwendung von einem Meerschweinchen anti-Ratte Insulin-Antikörper, ¹²⁵I-markiertem Schweine-Insulin als Tracer und Ratten-Insulin als Standard (Linco) bestimmt. Freie und gebundene Radioaktivität wurde unter Verwendung eines anti-IgG (Ziege anti-Meerschweinchen) Antikörpers (Linco) getrennt. Die Empfindlichkeit des Assays beträgt 17 pmol/l und der Variationskoeffizient beträgt weniger als 3%, sowohl bei niedrigem, als auch hohem Pegel. Plasma-Glukose wurde mit dem Glukose-Oxidase-Verfahren bestimmt und FFA wurde photometrisch erfasst. Plasma-Glucagon wurde radioimmunochemisch unter Verwendung eines Meerschweinchen anti Glucagon Antikörpers, der spezifisch für pankreatisches Glucagon ist, ¹²⁵I-markiertem Glucagon als Tracer und Glucagon-Standard (Linco) bestimmt. Freie und gebundene Radioaktivität wurde unter Verwendung eines anti-IgG (Ziege anti-Meerschweinchen) Antikörpers (Linco) getrennt. Die Empfindlichkeit des Assays beträgt 7,5 pg/ml und der Variationskoeffizient betrug weniger als 9%. Blutpegel von Serum-Cholesterol und Triglyceriden wurden durch vollständig enzymatische Techniken bestimmt 39,40. Gesamt-Körper-Lipid wurde unter Verwendung eines alkoholischen Hydroxid-Verdaus mit Verseifung aller Lipide, Neutralisation, gefolgt von enzymatischer Bestimmung von Glycerol beurteilt.
Intravenöser Glukosetoleranz-Test
Die Mäuse wurden mit einer intraperitonealen Injektion von Midazolam 0,4 mg/Maus (Hoffman-La-Roche) und einer Kombination aus Fluanison (0,9 mg/Maus) und Fentanyl 0,02 mg/Maus (Janssen) anästhesiert. Danach wurde eine Blutprobe von dem retrobulbären, intraorbitalen, kapillären Plexus in heparinisierten Röhrchen entnommen, und D-Glukose 1 g/kg (British Drug Houses) wurde schnell intravenös injiziert. Neue Blutproben wurden nach 1, 5, 20 und 50 Minuten entnommen. Nach unmittelbarer Zentrifugation bei +4°C, wurde Plasma abgetrennt und bei –20°C oder bis zur Analyse gelagert.
Northern Blot
cDNA Sonden für Maus FoxC2, aP2, ADD-1/SREBP1, coxII, Adipsin, β_1-3-AR, GLUT4, IR, IRS1, und IRS2 wurden durch RT-PCR unter Verwendung von "First-Strand-cDNA" von epididymaler Maus Fett poly(A)⁺ RNA hergestellt. Die verwendeten PCR Primer zum Erzeugen dieser Sonden sind wie folgt:
FoxC2: 5' Primer, GCTTCGCCTCCTCCATGGGAA und 3' Primer, GGT TACAAATCCGCACTCGTT (GenBank # Y08222).
aP2: 5' Primer, CTCCTGTGCTGCAGCCTTTCTC und 3' Primer, CGTAACTCACCACCACCAGCTTGTC (GenBank # M 13261).
ADD1/SREBP-1: 5' Primer, GCCAACTCTCCTGAGAGCTT und 3' Primer, CTCCTGCTTGAGCTTCTGGTT (GenBank # AB017337).
CoxII: 5' Primer, CCATTCCAACTTGGTCTACAA und 3' Primer, GGAACCATTTCTAGGACAATG (GenBank # J01420).
Adipsin: 5' Primer, CGAGGCCGGATTCTGGGTGGCCAG und 3' Primer, TCGATCCACATCCGGTAGGATG (GenBank # X04673).
β₁-AR: 5' Primer, CGGCTGCAGACGCTCACCAA und 3' Primer, CGCCACCAGTGCATGAGGAT (GenBank # L 10084).
β₂-AR: 5' Primer, GCTGCAGAAGATAGACAAAT und 3' Primer, GGGATCCTCACACAGCAGTT (GenBank # X15643).
β₃-AR: 5' Primer, CTGCTAGCATCGAGACCTT und 3' Primer, CGAGCATAGACGAAGAGCAT (GenBank # X60438).
GLUT4: 5' Primer, CTCAGCAGCGAGTGACTGGGAC und 3' Primer, CCCTGAGTAGGCGCCAATGAGG (GenBank # D28561).
IR: 5' Primer, GTAGCCTGATCATCAACATCCG und 3' Primer, CCTGCCCATCAAACTCTGTCAC (GenBank # J05149).
IRS1: 5' Primer, ATGGCGAGCCCTCCGGATACCG und 3' Primer, CCTCTCCAACGCCAGAAGCTGCC (GenBank # X69722).
IRS2: 5' Primer, GGATAATGGTGACTATACCGAGA und 3' Primer, CTCACATCGATGGCGATATAGTT (GenBank # AF090738).
cDNA-Sonden wurden mit [α-³²P]dCTP (3000 Ci/mmol) durch das "Random-Labeling"-Verfahren radiomarkiert. Die Gesamt-RNA von Mäusen in jeder Gruppe wurde gepoolt und Teilmengen von 12 μg wurden auf einem Agarosegel getrennt. Die Filter wurden mit einer ³²P-markierten Sonde (10⁶ cpm/ml) während 1 h bei 62°C mit QuikHyb Lösung (Stratagene) hybridisiert und mit 0,1 % SDS/0,1 × SSC bei +62°C für 3 × 20 min gewaschen.
Transfektionen und Reporter-Gen-Analyse
Nicht-confluente Kulturen von 3T3-L1 Adipozyten wurden mit einem CAT Reporter (pCAT) transfiziert, angetrieben (driven) durch die menschlichen RIα proximalen Promotoren "upstream" von den in alternativer Weise gespleißten 1a und 1b Leader-Exons (Nukleotide 1509 bis 2470 GenBank #Y07641). Zum Steuern einer Transfektionseffizienz wurde ein pGL3-Kontroll (Promega) -, Luciferase-kodierender Vektor verwendet. In Co-Transfektionen wurde ein FOXC2 Expressionsvektor oder ein Vektor ohne Insert verwendet. Transfektionen wurden unter Verwendung von Lipofectamin (Gibco), gefolgt von CAT und Luciferase Assays ausgeführt.
PKA Immunoblotting und Kinase-Aktivität
WAT und BAT wurden durch einen Polytron Gewebehomogenisator (3 × 15 s) behandelt und mit Schall behandelt, auf Eis, in einem Puffer, enthaltend 10 mM Kaliumphosphat, pH 6,8, 150 mM Natriumchlorid, 1 mM EDTA, 10 mM CHAPS und Proteaseinhibitoren, und zentrifugiert (15,000 × g), um unlösliches Material zu entfernen. Protein-Konzentrationen wurden durch Bradford Assays (BioRad) bestimmt. Zum Immunoblotting wurden 30 μg an Protein durch 10% SDS-PAGE getrennt, auf PVDF Membranen transferiert und mit anti-RIα und anti-RIIβ mAb inkubiert. Primäre Antikörper wurden durch HRP-konjugiertes anti-Maus IgG (Transduction Laboratories, 1:5000) und ECL (Amersham) erfasst. PKA Aktivität wurde unter Verwendung von Kemptid (Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly) als Substrat in Abwesenheit oder Gegenwart von variierenden Konzentrationen an cAMP erfasst. Die niedrigen Pegel an Aktivität, nicht inhibiert durch PKI (2 μM), wurden subtrahiert, um PKA-spezifische Aktivität zu bestimmen.
BEISPIELE DER ERFINDUNG
Zusätzliche Merkmale der Erfindung werden aus den folgenden Beispielen klar. Die Beispiele 1 bis 10 sind gegenwärtig erfolgt, während die verbleibenden Beispiele prophetisch sind.
BEISPIEL 1: Isolierung von FOXC2 von menschlichem abdominalem Fettgewebe
Zur Identifizierung mutmaßlicher "Winged-Helix"-Gene, die in Fettgewebe exprimiert werden, durchmusterten wir eine menschliche Fettzell 5'-STRETCH plus cDNA Bibliothek (Clontech) unter Verwendung einer Strategie einer Hybridisierung mit niedriger Stringenz mit einem Gemisch von cDNA Sonden, die DNA-Bindungsdomänen von verschiedenen "Winged-Helix"-Proteinen entsprechen, um die Variation zwischen verschiedenen Familienmitgliedern abzudecken. Durch diese Technik konnten wir drei verschiedene "Forkhead"-Gene identifizieren, die als FKHL5, FKHL14 und FKHL18 bezeichnet werden. Von FKHL5 war bekannt, dass es ausschließlich in Lunge und Plazenta exprimiert wird (Pierrou et al., 1994) und eine Expression in Fettgewebe konnte nicht erfasst werden, nach einer Beurteilung durch Northern Blot Analyse (Daten nicht gezeigt). FKHL18 wurde als ein neues Mitglied der "Forkhead"-Familie (Cederberg et al., 1997) identifiziert, welches eine sehr hohe Homologie mit dem "Forkhead"-Motiv des Maus-Gens fkh-3 aufweist (Kaestner et al., 1993). Eine Sequenz von außerhalb des "Forkhead"-Motivs wurde für fkh-3 bislang nicht publiziert, aber angesichts der Diskrepanz der Expressionmuster, wobei FKHL18 in Arteriengefäßwand (Aorta) und zu einem geringen Ausmaß in Niere exprimiert wird und fkh-3 in einer breiten Vielfalt von Geweben exprimiert wird, wurde angenommen, dass diese zwei verschiedene Gene bilden. Wir konnten keine Expression von FKHL18 in Fettgewebe erfassen (Daten nicht gezeigt). Bei dem dritten identifizierten Gen, FKHL14 (worauf nachstehend als FOXC2 Bezug genommen wird; Miura, N. et al. (1997) Genomics 41, 489-492), wurde durch Northern Blot Analyse gezeigt, dass es ausschließlich in adultem menschlichem Fettgewebe exprimiert wird (3a). Das Maus-Homologe von FOXC2 ist als Mfh1 bekannt und wird in dynamischen Mustern in dem paraxialen Mesoderm des Rumpfs und Kopfs, in den Mesenchym- und Endothel-Zellen der Kiemenbögen (branchial arches) und an vielen anderen Stellen in dem Embryo exprimiert (Kaestner et al., 1996; Miura et al., 1993; Winnier et al., 1997). Es wurde durch Gen-Targeting-Experimente gezeigt, dass Mfh1 eine ausschlaggebende Rolle während einer embryonischen Entwicklung spielt. Homozygote Null-Mutanten starben prä- und perinatal mit mehrfachen Skelett-Defekten und kardiovaskulären Defekten, einschließlich von Defekten in dem Neurocranium und der Wirbelsäule, Unterbrechungen oder Verengungen des Aortenbogens und ventrikulären Septaldefekten (Iida et al., 1997; Winnier et al., 1997). Heterozygote Mäuse waren ununterscheidbar vom Wild-Typ und offensichtlich gesund. Die Expression von Mfh1 in adulten Geweben war auf WAT und BAT beschränkt (3b).
BEISPIEL 2: Physiologische Studien über FOXC2
In einem Northern-Blot-Experiment verwendeten wir RNA von Collagenase behandelten Adipozyten und Zellen mit niedrigem Triglyceridgehalt, zumeist Prä-Adipozyten/Adipozyten und Zellen von Stroma-/vaskularem Ursprung, um den Zell-Typ zu identifizieren, der FoxC2 exprimiert (3c). Wie aus 3c abgeleitet werden kann, ist die FoxC2-Expression in der Adipozyt-Fraktion mit einem niedrigem Expressionspegel in Stroma-/vaskularen Zellen am höchsten, am wahrscheinlichsten aufgrund der Gegenwart von Adipozyten mit niedrigerem Triglycerid-Gehalt – da der Adipozyt-spezifische Marker LPL (Lipoprotein-Lipase) ebenfalls durch diese Zellen exprimiert wird.
Um die allgemeine Frage der physiologischen Rolle/Regulation von FoxC2 anzugehen, führten wird das folgende Experiment durch: 3T3-L1 Adipozyten wurden separat und in Kombination mit dem cAMP-induzierenden Agens Forskolin, dem Proteinkinase C-Aktivator TPA und Ca²⁺-Ionophor A23187 stimuliert, um Signale nachzuahmen, die "downstream" von G-Protein gekoppelten Rezeptoren hervorgerufen werden. Während Forskolin allein oder in Kombination mit einem Ca²⁺-Ionophor eine 3-fache Erhöhung in "Steady-State"-Pegeln bzw. Pegeln des stationären Zustands von FoxC2 mRNA herstellt (3d), scheint ein Ca²⁺-Ionophor selbst die FoxC2-Pegel nicht zu regulieren. Im Gegenteil, TPA und Kombinationen, die TPA enthalten, ergeben eine starke Erhöhung (9-bis 10-fach) an FoxC2 mRNA (3d). Diese führt zu der Vermutung, dass FoxC2 durch intrazelluläre Ereignisse reguliert wird, die ähnlich zu jenen sind, die durch G-gekoppelte Hormonrezeptoren hervorgerufen werden.
BEISPIEL 3: Erzeugung von transgenen Mäusen, die FKHL14 überexprimieren
Um aufzuklären, welche Funktion FOXC2 in vivo haben könnte, beschlossen wir transgene Mäuse zu erzeugen, die FOXC2 im Fettgewebe überexprimieren. Um eine Überexpression von FOXC2 sowohl in weißem, als auch in braunem Fettgewebe zu erreichen, stellten wir ein Transgen-Konstrukt (4a) her, das FOXC2 kodiert, welches durch ein 5,4-kb DNA Fragment angetrieben wird, das den adipös-spezifischen Enhancer/Promotor des Gens enthält, das Adipozyt P2 kodiert (Ross et al., 1990). Integrations-positive Mäuse wurden unter Verwendung einer Southern-Blot-Analyse identifiziert (4b).
Wir untersuchten drei Linien von transgenen Mäuse (A, B und C), die von unabhängigen Gründern abgeleitet wurden. Eine Transgen-Expression, die durch Northern Blot unter Verwendung einer FOXC2 (human-spezifischen) Sonde analysiert wurde, wurde bei hohen Pegeln sowohl in WAT, als auch in BAT, für alle drei Gründer erfasst. Die drei verschiedenen Gründer wiesen einen geringen Unterschied in Expressionspegeln des Transgens in weißem Fett auf, wobei Gründer A den Höchsten und Gründer B den Niedrigsten aufwies, während die Expressionspegel in braunem Fett gleich waren (5c). Alle für die Studie verwendeten transgenen Mäuse waren hemizygot hinsichtlich des Transgens und waren aus der zweiten bis vierten Generation. Die transgenen Mäuse schienen bei einer äußerlichen Betrachtung normal und das Transgen-Allel war gemäß der erwarteten Mendelschen Verteilung fortgepflanzt. Bei Fütterung einer Standard-Nagetier-Futterernährung (4% Fett, 18,5% Protein und 55,7% Sucrose) wurde eine Gewichtszunahme für alle Gründer mit einem Alter von 4 Wochen bis zu 6 Monaten untersucht, wobei kein signifikanter Unterschied zwischen nicht-transgenen und transgenen Wurfgeschwistern beobachtet wurde (Daten nicht gezeigt).
Wir wählten drei unabhängige Gründer-Linien aus, die als tg-A, tg-B und tg-C benannt waren, wobei tg-A den höchsten, tg-B den niedrigsten und tg-C einen mittleren FOXC2 Expressionspegel in WAT aufweist. Eine klare Dosis-Wirkungs-Beziehung zwischen dem Expressionspegel des Transgens und einer Verringerung in dem relativen Gewicht des intraabdominalen WAT Depots liegt vor (5a). Ein ähnliches Dosis-Wirkungs-Muster besteht, wenn die Gewichtsverhältnisse von intra-abdominalen WAT zu interskapulärem BAT verglichen werden (5b). Das relative Gewicht des interskapulären BAT-Depots ist in tg Tieren erhöht, zeigt jedoch keinen Dosis-Wirkungs-Zusammenhang (5a), was in Übereinstimmung mit der Tatsache steht, dass kein Unterschied zwischen tg-A, tg-B und tg-C hinsichtlich einer Expression des Transgens in BAT vorliegt.
BEISPIEL 4: WAT von FOXC2 transgenen Mäuse ähnelt morphologisch BAT
Das interskapuläre Depot von braunem Fettgewebe und das intrabdominale weiße Fettgewebe wurde in 5 Monate alten Mäusen untersucht (6). Interskapuläre, transgene Mäuse hatten ein in hohem Maße vergrößertes zweilappiges (im Bild weg geschnitten) Fettpolster mit dem "Aussehen" von braunem Fettgewebe ohne die übliche Bedeckung aus weißem Fettgewebe (6b), das normalerweise zerschnitten werden muss, um das interskapuläre BAT-Depot freizulegen (6a). Eine freigelegte abdominale Ansicht von FOXC2 transgenen Mäusen zeigte eine sichtbare Abnahme an intrabdominaler Fettmasse und ebenfalls eine ausgeprägte Veränderung in der Erscheinung hin zu dem Phänotyp des braunen Fettgewebes (6d) bei einem Vergleich mit dem großem, blassen Lipid speichernden intrabdominalen Fettpolster von Wild-Typ-Mäusen (6c). Die Fettgewebeveränderung hinsichtlich der Erscheinung und der Masse zwischen transgenen und nicht-transgenen Mäusen war dann sehr auffallend, wenn die Depots ausgeschnitten wurden (6e & f).
Eine histologische Analyse von BAT und WAT von 5 Monate alten Mäusen zeigte tiefgreifende Unterschiede zwischen transgenen und nicht-transgenen Geweben. Die Mehrheit an Adipozyten in braunem Fett der transgenen Mäuse enthielt wenige deutlich vergrößerte Fetttröpfchen (7b), anstelle von kleinen, multilokulären Fetttröpfchen, die typisch für BAT sind (7a). Adipozyten in intrabdominalem, weißen Fett der transgenen Maus zeigte eine Größenheterogenität, wobei alle von diesen eine klar verringerte Größe aufwiesen (7d). Dies stand im Gegensatz zu WAT von einer Wild-Typ-Maus, das aus großen Adipozyten mit gleichförmiger Größe bestand, die mit einer großen, unilokulären lipid-speichernden Vacuole gefüllt waren (7c).
In einem Kälte-Anpassungs-Experiment (4°C, 4 Stunden) zeigen tg Mäuse eine klare Verringerung hinsichtlich der Größe und Anzahl der Triglyceridtröpfchen in BAT (7e–h). Dies zeigt, dass die Veränderungen hinsichtlich einer Gen-Expression, die durch das Transgen induziert ist, eine Netto-Ansammlung von Triglycerid bei Raumtemperatur (22°C) ermöglichen wird, während diese Triglyceride bei 4°C metabolisiert werden. In einem kürzlichen Bericht wurde vorgeschlagen, dass außer WAT und BAT, aP2 ebenfalls in aktivierten Makrophagen exprimiert wird. Erfassungen von zwei Cytokinen, IL-12 und IL-18, die beide an einer Makrophagen-Aktivierung beteiligt sind, zeigten keine Unterschiede zwischen tg und wt Mäusen (Daten nicht gezeigt).
Zur weiteren Untersuchung der Größenveränderung von Fettdepots in transgenen Mäusen verglichen wir die Gewichte von intrabdominalen WAT Depots und interskapulären BAT Depots von 5 Monate alten Wild-Typ-Weibchen (n=3) und FOXC2 transgenen Wurfgeschwistern (n=3). Bei transgenen Mäusen liegt eine Gewichtsabnahme des intrabdominalen WAT Depots vor (~40%), während das interskapuläre BAT Depot eine deutliche Zunahme zeigte (~7,5 mal; 8a). Folglich wurde das Verhältnis zwischen den Gewichten der intrabdominalen Fettdepots und der interskapulären, braunen Fettdepots in starkem Maße verringert (8b). Zwischen transgenen und nicht-transgenen Mäusen konnte weder ein signifikanter Unterschied hinsichtlich des Körpergewichts erfasst werden (8c), noch konnte irgendein Unterschied hinsichtlich des Nahrungsverbrauchs bei einer Erfassung während einer Zeitspanne von zwei Monaten beobachtet werden (8d).
BEISPIEL 5: Geänderte Gen-Expression in FOXC2 transgenen Mäusen
9 zeigt eine Analyse von mRNA "Steady State"-Pegeln in weißem und braunem Fettgewebe von Wild-Typ-Mäusen und der drei unabhängigen transgenen Gründer. Bei Wild-Typ-Mäusen war die mRNA für das Entkopplungsprotein 1 (UCP1) lediglich in BAT erfassbar, jedoch konnte bei transgenen Mäusen eine Expression in WAT in einer auf eine Dosis ansprechenden Weise im Verhältnis zu dem Expressionspegel von transgenen FKHL14 erfasst werden. Der WAT-Blot und der BAT-Blot hatten verschiedene Expositionszeiten, 2 Tage beziehungsweise 30 Minuten. UCP2 schien eine Tendenz aufzuweisen im Vergleich zu UCP1 in WAT von transgenen Mäusen in die entgegengesetze Richtung reguliert zu werden. Das in Skelett-Muskel und BAT exprimierte Entkopplungsprotein, UCP3, zeigte in transgenem BAT in starkem Maße verringerte Pegel. Die Cytochrom c-Oxidase Subeinheit II (CoxII), ein Gen, das durch das mitochondriale Genom kodiert wird, wurde als ein Marker für eine Mitochondriendichte verwendet. Die Mitochondriendichte in WAT und BAT von transgenen Tieren schien erhöht beziehungsweise in geringerem Ausmaß verringert zu sein. Bei Wild-Typ-Mäusen waren die mRNAs von β₁- und β₃-AR in WAT viel geringer als in BAT. Das FOXC2 Transgen hob diese Diskrepanz auf, indem diese mRNAs selektiv in WAT angehoben wurden, so dass diese gleich bzw. gleich hoch wurden, oder im Falle von β₃-AR sogar höher wurden, verglichen mit den Pegeln in BAT. Der β₂-AR mRNA Pegel wurde sowohl in WAT, als auch in BAT von transgenen Mäusen angehoben, wobei Pegel auftreten, die weder bei WAT, noch bei BAT von Wild-Typ-Wurfgeschwistern nicht beobachtet werden. Weiße Fettdepots von transgenen Tieren zeigten eine tiefgreifende Erhöhung bei vier der mRNAs hiervon, die mit vollständig differenzierten Adipozyten assoziiert sind, das heißt PPARγ2, C/EBPα, aP2 und Adipsin. Weiterhin wurde PGC-1, ein Co-Aktivator von PPARγ2 sowohl in WAT, als auch in BAT hoch-reguliert. Die mRNA für ADD1/SREBP1 war in WAT für alle drei Gründer erhöht. Die transgenen Tiere zeigten eine Verringerung der Menge an Leptin mRNA, wobei der deutlichste Effekt bei BAT auftrat. "Steady State"-Pegel von LPL mRNA scheinen in WAT von transgenen Mäusen leicht angestiegen zu sein. Alle untersuchten Marker, die an einer Insulinwirkung beteiligt sind, wurden hoch-reguliert: der Insulin-Rezeptor (InsR), IRS-1, IRS-2 und Insulin-ansprechender Glukosetransporter-4 (GLUT4). Die Hoch-Regulation war am deutlichsten in WAT. GAPDH wurde als eine Kontrolle verwendet, um das Vorliegen von gleichen Mengen an Gesamt-RNA in den verschiedenen Spuren zu verifizieren.
BEISPIEL 6: Triglycerid-Gehalt ist in FOXC2 transgenen Mäusen verändert
Der Serum-Triglycerid-Gehalt wurde für 14-Wochen alte Wild-Typ-Männchen (n=4) und FOXC2 transgene Wurfgeschwister (n=4), die ad libitum ernährt wurden, analysiert. Die transgenen Tiere zeigten eine Verringerung von ~60% in Serum-Triglycerid-Pegeln ( 10).
Der Gesamt-Körper-Lipid-Gehalt wurde unter Verwendung von alkoholischem Kaliumhydroxid-Verdau bei Verseifung aller Fette, Neutralisierung und dann einer enzymatischen Bestimmung von Glycerol (Triglyceride kit, Sigma), wie zuvor beschrieben (Salmon und Flatt, 1985), beurteilt. Der Assay wurde bei 6 Monate alten Wild-Typ-Männchen (n=4) und FOXC2 transgenen Wurfgeschwistern (n=4), die ad libitum ernährt wurden, ausgeführt. Der Gesamt-Körper-Lipid-Gehalt wurde auf 10% des Körpergewichts für transgene Mäuse verringert, verglichen mit dem normalen 30% an Körperlipid, der bei Wild-Typ-Mäusen beobachtet wird (11).
BEISPIEL 7: Niedrigere Blut-Glukose und effizientere Glukose-Eliminierung in FOXC2 transgenen Mäusen
Blut-Glukosepegel ohne Fasten wurden erfasst für 10-Wochen alte Wild-Typ-Männchen und Weibchen (n=5+5) und FOXC2 transgene Wurfgeschwister (n=5+5), die ad libitum ernährt wurden. Die transgenen Tiere zeigten eine signifikante 16% Verringerung in Blut-Glukosepegeln ohne Fasten (12a).
Ein Glukosetoleranz-Test wurde durchgeführt an 10-Wochen alten Wild-Typ-Männchen und Weibchen (n=5+5) und FOXC2 transgenen Wurfgeschwistern (n=5+5), die ad libitum ernährt wurden. Die Plasma-Glukosepegel wiesen ein Minute nach intravenöser Glukose-Verabreichung einen Peak bzw. eine Spitze auf und danach kehrten die Plasma-Glukosepegel zu Grundlinienpegeln innerhalb der 50-Minuten-Studienperiode zurück. Transgene Mäuse zeigten eine verstärkte Glukose-Eliminierung, wobei die Plasma-Glukosepegel bei 0, 20 und 50 Minuten in signifikanter Weise niedriger als bei Wild-Typ-Wurfgeschwistern sind (P<0,05; P<0,001; P<0,05) (12b). Die Daten sind Mittelwerte sowohl von Männchen, als auch von Weibchen, da kein Unterschied zwischen den Geschlechtern beobachtet wurde.
BEISPIEL 8: Erhöhte Insulin-Sensitivität in FOXC2 transgenen Mäusen
Plasma-Insulinpegel ohne Fasten in FOXC2 transgenen Mäusen wurden unter Verwendung der gleichen Gruppe von Tieren analysiert, die für Blut-Glukose-Erfassungen verwendet wurden. Die Konzentration an Plasma-Insulin in FOXC2 transgenen Mäusen war vor dem Start des Glukose-Toleranz-Tests auf ~50% der Pegel verringert, die für Wild-Typ-Wurfgeschwister aufgezeichnet sind (13a). Die schnelle intravenöse Injektion von Glukose (1 g/kg) führte zu einer 4-fachen Erhöhung der Plasma-Insulinpegel in Wild-Typ-Mäusen und zu einer 10-fachen Erhöhung in FOXC2 transgenen Wurfgeschwistern nach einer Minute (13c). Danach kehrten Plasma-Insulinpegel schnell zu Grundlinienwerten zurück, die vor der Glukose-Belastung beobachtet wurden, wobei transgene Mäuse signifikant niedrigere Pegel bei 20 und 50 Minuten aufweisen (P<0,05; P<0,05) (13b). Die Daten sind Mittelwerte sowohl von Männchen, als auch von Weibchen, da kein Unterschied zwischen den Geschlechtern beobachtet wurde.
Bei Mäusen mit fettreicher Ernährung liegen signifikant niedrigere Gewichtszunahmen bei transgenen Mäusen im Vergleich zu wt vor. Bei Weibchen ist die Gewichtszunahme 39% (p<0,02; 15a) niedriger im Vergleich zu wt Weibchen und für Männchen beträgt der Unterschied 21 % (p<0,03: 15b). Diese Ergebnisse betonen, dass FOXC2 nicht nur ein Gen ist, das von Wichtigkeit für Fettgewebe-Verteilung, -Morphologie und Gen-Expressionsprofil ist, sondern ebenso, was wichtiger ist, ein Hauptregulator des allgemeinen Lipid- und Glukose-Metabolismus ist, was einen Schutz gegen ernährungsinduzierte Gewichtszunahmen einschließt.
BEISPIEL 9: FOXC2 reguliert Körper-Zusammensetzung, Serum-Lipide und Insulin-Sensitivität
Einige physiologische Tests für und Erfassungen von kritischen Metaboliten, die für Obesität, Insulinresistenz und Typ2-Diabetes von Bedeutung sind, wurden ausgeführt, um die Auswirkung von erhöhter FOXC2 Expression auf systemischen Lipid- und Glukose-Metabolismus zu beurteilen. Wir untersuchten einen Gesamt-Körper-Lipid-Gehalt an ganzen Kadavern unter Verwendung des alkoholischen Kaliumhydroxid-Verdau-Verfahrens und fanden eine Abnahme von bzw. auf 30% an Gesamtlipiden in Kadavern von wt Mäusen im Vergleich zu lediglich 10% in tg Mäusen (p<0,0004; 16a). Ebenfalls liegt eine in hohem Maße signifikante Verringerung in Serum-Triglyceridpegeln um 57% (p<0,004; 16b) vor, während keine signifikante Veränderung in Serumcholesterol-Pegeln vorliegt (16c). FFA sind von 0,92meq/l auf 0,63meq/l in tg Tieren verringert (p<0,02; 16d). Bei ad libitum ernährten Tieren beobachten wir eine Abnahme in Plasma-Glukose-Pegeln um 10% (p<0,01; 16e) und Plasma-Insulinpegel sind um 43% tiefer bzw. verringert (p<0,001; 16f). Bei Mäusen mit fettreicher Ernährung ist die Gewichtszunahme für tg Mäuse 28% niedriger (p<0,01; 16g), im Vergleich zu wt Wurfgeschwistern. Obwohl Lipid-Gehalte in tg und wt Mäusen nach einer fettreichen Ernährung erhöht sind, widerstehen tg Mäuse noch einer Lipidansammlung im gleichem Ausmaß wie es bei wt Wurfgeschwistern der Fall ist, eine 49% Abnahme in tg Mäusen im Vergleich zu wt (p<0,0001; 16h). Bei einer Kontrollernährung (4,8% Fett) zeigen tg und wt Mäuse keine Zeichen von Unterschieden hinsichtlich einer metabolischen Effizienz bei einer Beurteilung durch Berechnung des Verhältnisses zwischen Gewichtszunahme und Gewicht an verspeister Nahrung (16i). Bei einer Ernährung mit einer fettreichen Ernährung (35,9% Fett) schienen tg Mäuse einen weniger effizienten Metabolismus aufzuweisen, da sie für jedes Gramm an Erhöhung des Körpergewichts mehr essen müssen (eine Verringerung um 30% p<0,01; 16i). Diese Ergebnisse sind interessant, da sie andeuten, dass eine metabolische Effizienz in FOXC2 tg in Antwort auf eine Nahrungszusammensetzung reguliert sein kann. Es liegen keine signifikanten Unterschiede bei Serum-Glucagonpegeln, Körpergewicht oder Nahrungsverbrauch (bei Standardernährung) zwischen wt und tg Tieren vor (nicht gezeigt), noch haben wird irgendwelche signifikanten geschlechtsspezifischen Unterschiede beobachtet.
Bei einem intravenösen Glukose-Toleranztest, wurde Plasma-Glukose 0, 1, 5, 20, 50 und 75 Minuten nach Glukose Verabreichung untersucht, wie in 17a dargestellt. Plasma-Glukosepegel für tg Mäuse mit Kontrollernährung sind in signifikanter Weise bei 0, 20 und 75 Minuten (p<0,05) und bei 50 Minuten (p<0,02) niedriger. Die Insulinkurve für das gleiche Experiment zeigt niedrigere Insulinpegel für tg Mäuse (17b) bei 0 Minuten (p<0,02), bei 1, 5 und 20 Minuten (p<0,05) und bei 50 und 75 Minuten (p<0,001). Bei einer fettreichen Ernährung ist der Unterschied nach einem intravenösen Glukose-Toleranztest viel deutlicher (17c und d). In tg Mäusen sind im Vergleich zu wt bei 0, 5, 20,50 und 75 Minuten Glukosepegel niedriger (p<0,001; 17c). Insulinpegel sind in tg Mäusen zu allen Zeitpunkten dramatisch verringert (p<0,001; 17d). Es ist ziemlich außergewöhnlich, dass tg Mäuse mit einer fettreichen Ernährung ein Plasma-Insulinprofil bewahren, das nahezu identisch zu jenem ist, das bei einer Standardernährung beobachtet wird, während wt Mäuse beinahe eine 3-fache Erhöhung in Insulin-Plasmapegeln zeigen (17b, d). Trotzdem zeigen wt Mäuse eine klare Erhöhung in Glukosepegeln, während tg Mäuse eine viel zurückhaltendere Erhöhung bei Glukose-Werten zeigen (17a, b). Diese Ergebnisse betonen, dass FOXC2 nicht nur ein Gen ist, das von Wichtigkeit für Fettgewebe-Verteilung, -Morphologie und Gen-Expressionsprofil ist, sondern ebenso, was wichtiger ist, ein Hauptregulator des allgemeinen Lipid- und Glukose-Metabolismus ist, was einen Schutz gegen ernährungsinduzierte Insulinresistenz einschließt.
BEISPIEL 10: Erhöhte Empfindlichkeit des β-adrenergen/cAMP/Proteinkinase A Wegs
Die Induktion des cAMP-regulierten ucp1 in WAT, die Hypertrophie von BAT, die Abnahme von intra-abdominalen WAT Depots und die Hoch-Regulation von mRNAs, die β-ARs kodieren, lassen darauf schließen, dass eine erhöhte Störung und Empfindlichkeit bei dem β-adrenergen/cAMP/Proteinkinase A (PKA) Signalgebungs-Weg zu dem Phänotyp von Mäusen, die FOXC2 über-exprimieren, beitragen kann. Bei Cotransfektionsexperimenten unter Verwendung von 3T3-L1 Adipozyten, zeigen wir, dass FOXC2 eine Reporter-Gen-Aktivität von einem Konstrukt erhöht, das durch den Promotor des RIα Gens (kodiert die regulatorische Subeinheit Iα von PKA; 18a) angetrieben wird, während keine derartige Regulation für den RIIβ Promotor beobachtet werden konnte (Daten nicht gezeigt). Zu diesen Ergebnissen ist konsistent, dass wir ebenfalls erhöhte RIαmRNA Pegel in Fettgewebe von tg Mäusen im Vergleich zu wt Wurfgeschwistern zeigen (18a, Einschub), in einer Dosisabhängigen Weise hinsichtlich einer Transgen-Expression. Dies wird von erhöhten Pegeln von RIα Protein und unveränderten (WAT) oder verringerten (BAT) Pegeln von RIIβ Protein in tg Mäusen begleitet (18b). Jedoch ist die Basis- und Gesamt-PKA-Aktivität in tg WAT und BAT verringert (18c). Dies kann durch eine erhöhte Empfindlichkeit auf eine Aktivierung durch cAMP, Dissoziation und dadurch einen Abbau von PKA Holoenzym bedingt sein. Das PKA Typ I Holoenzym (RIα₂C₂) bindet cAMP mit höherer Affinität und aktiviert einfacher als das PKA Typ 2 Enzym (RIIβ₂C₂), das normalerweise in WAT und BAT exprimiert wird. Tatsächlich aktiviert PKA von WAT von FOXC2 tg Mäusen mit erhöhten Proteinpegeln an RIα (18d, Einschub), einfacher als PKA von WAT von nicht-tg Wurfgeschwistern (19d, K_act von 140 beziehungsweise 250 nM), obgleich Proteinpegel von RIIβ unverändert erscheinen (18d, Einschub). Folglich werden Adipozyten von FOXC2 tg Mäusen einen niedrigeren Schwellwert für eine PKA Aktivierung durch adrenerge Stimuli im Vergleich zu Wild-Typ-Wurfgeschwistern aufgrund eines PKA-Isozym-Switchs aufweisen. Dies stimmt damit überein, was von Mäusen mit einer "Targeted Disruption" des RIIβ Gens berichtet wurde, wobei ein Isozym-Switch von PKA Typ II (RIIβ₂C₂) zu PKA Typ I (RIα₂C₂) mit einer Veränderung in K_act von 220 nM zu 80 nM in WAT, zu einer schlanken Maus mit ähnlichem Phänotyp wie die FOXC2 tg Maus führt. Zusätzlich zu der erhöhten Empfindlichkeit des PKA-Systems in FOXC2 tg Fettgewebe, zeigte eine Untersuchung der β-adrenergen Empfindlichkeit von WAT-Adipozyten von FOXC2 tg und wt Wurfgeschwistern deutliche Unterschiede. Während eine Stimulierung von wt Adipozyten mit einem nicht-selektiven β-Agonist zu einer 4 bis 5-fachen Erhöhung in cAMP Pegeln bei 1 min und zu einer schnellen Desensibilisierung des Signals führt, führt eine Stimulierung von tg Adipozyten zu einer starken (10-fachen), anhaltenden und ausdauernden Zunahme an cAMP Pegeln, wobei keine Desensibilisierung bei 10 min erfolgt (18e). Weiterhin zeigt eine β₃-Agonist-Stimulierung von Adipozyten, die aus tg WAT hergestellt wurden, eine deutliche Erhöhung (4-fach) in cAMP Pegeln bei erhöhten Pegeln über 10 min (19f). Im Gegensatz hierzu, wird eine geringe oder keine β₃-Agonist-Antwort in Adipozyten von wt WAT beobachtet. Diese Beobachtungen stehen in Übereinstimmung mit der starken Hoch-Regulation von β_1-2-AR und der Einführung von β₃-AR (welcher in wt virtuell abwesend ist) in tg WAT und zeigen, dass die Empfindlichkeit von einem β-adrenergen/cAMP/PKA Weg in WAT von FOXC2 tg Mäusen bei einigen Pegeln erhöht ist.
BEISPIEL 11: Interaction Trap / Two-Hybrid-System
Um Untersuchungen hinsichtlich von Polypeptiden durchzuführen, die mit dem FOXC2 Polypeptid wechselwirken, wird das Interaction Trap/Yeast Two-Hybrid (Y2H) Bibliotheksdurchmusterungsverfahren verwendet. Dieser in vivo Assay wurde zuerst in Fields & Song (1989) Nature 340, 245–246 beschrieben. Ein jüngeres Verfahren, das als Sos recuitment System (SRS) bezeichnet wird, wurde durch Aroheim & Karin (1997) Mol. Cell. Biol. 17, 3094–3102, beschrieben. Das SOS System unterscheidet sich von dem ursprünglichen yeast 2-hybrid insofern, als dass die Wechselwirkung zwischen Köder und Beute im Cytoplasma erfolgt. Ein Kit für SOS- Y2H ist von Stratagene, La Jolla-CA, USA (CytoTrapTwo-Hybrid System) erhältlich.
Eine Fusion einer FOXC2 Nukleotidsequenz und der menschlichen katalytischen Sos Domäne ohne der C-terminalen regulatorischen Domäne hiervon (Köder) wird in einem geeigneten Plasmid (beispielsweise pSos) unter Verwendung von Standard-Subklonierungstechniken konstruiert. In ähnlicher Weise wird eine "Myristylation-Sequence-Fusion"-Bibliothek (Beute) in einem zweiten Plasmid (beispielsweise pMyr) von cDNA von möglichen Bindungsproteinen konstruiert. Das Sos Fusions-Konstrukt wird durch Sequenzieren verifiziert und wird hinsichtlich seiner Unfähigkeit ein Wachstum von einem cdc25H Hefestamm bei der restriktiven Temperatur von 37°C zu ermöglichen und auf Zelltoxizität getestet, wobei beide hiervon eine erfolgreiche Two-Hybrid Analyse verhindern würden. Die Myr Sequenz stellt eine Verankerung der Myr/Bibliothek-Fusion-Polypeptide an die Plasma-Membran bereit und die Expression hiervon hängt von dem verwendeten Zucker-enthaltenden Medium ab. Hefe-Zellen sind (ca. 5–10 × 10⁶ Transformanten/mg DNA) sowohl mit Sos, als auch Myr Bibliotheks-Fusion-Plasmiden gemäß Standardvorgehensweisen transformiert. Eine in vivo Bindung von Sos/(FOXC2) mit Myr/Bibliotheks-Proteinen führt zu einer Rekrutierung des hSos Proteins zu der Membran, wodurch der Ras-Signalgebungs-Weg aktiviert wird und ein Wachstum der cdc25H Hefe-Zellen bei 37°C ermöglicht wird. Hefe-Zellen werden zunächst auf Glukosemedien ausgebracht, denen die Aminosäuren Leu und Ura fehlen, um beide Plasmide auszuwählen. Nach 4–5 Tagen bei 25°C, werden Platten für ein "Replica-Plating" auf Galaktose (-Leu, -Ura) Platten verwendet, die während 3–10 Tagen bei 37°C inkubiert werden. Kolonien, die wachsen, werden zunächst hinsichtlich ihrer Fähigkeit bei 37°C in Abhängigkeit von dem in dem Medium vorliegenden Zucker zu wachsen getestet. Jene Klone, die in Galaktose verglichen zu Glukose ein Wachstum zeigen, werden als Kandidaten betrachtet. Zum Testen der Spezifität der Bibliotheks-Plasmide, wird Plasmid-DNA aus Kandidat-Klonen extrahiert und verwendet um cdc25H Zellen mit entweder dem spezifischen Köder oder einem nicht-relevanten Köder zu co-transformieren. Insert-DNA wird sequenziert, um das Vorliegen eines "Open Reading Frame", der mit der Myr Sequenz fusioniert ist, zu verifizieren und um die Identität des wechselwirkenden Proteins zu bestimmen.
BEISPIEL 12: Mobility-Shift-DNA-Bindungsassay
Ein gelelektrophoretischer Mobility-Shift-Assay gemäß Standardvorgehensweisen kann schnell spezifische Protein-DNA-Wechselwirkungen erfassen. Sonden-DNA (<300 bp) wird erhalten von synthetischen Oligonukleotiden, Restriktionsendonuklease-Fragmenten oder PCR-Fragmenten und mit ³²P end-markiert. Eine Teilmenge gereinigtes FOXC2 (ca. 15 μg) oder von rohem FOXC2 Extrakt (ca. 15 ng) wird bei konstanter Temperatur (in dem Bereich 22–37°C) für mindestens 30 Minuten in 10–15 μl Puffer (d.h. TAE oder TBE, pH 8,0–8,5) inkubiert, der enthält, radiomarkierte Sonden-DNA, nicht-spezifische Träger-DNA (ca. 1 μg), BSA (300 μg/ml) und 10% (v/v) Glycerol. Das Reaktionsgemisch wird dann auf ein Polyacrylamid-Gel aufgebracht und bei 30–35 mA laufen gelassen, bis eine gute Auftrennung der freien Sonden-DNA von Protein-DNA-Komplexen erfolgt. Das Gel wird dann getrocknet und Banden, die der freien DNA und Protein-DNA-Komplexen entsprechen, werden durch Autoradiographie erfasst.
BEISPIEL 13: Reporter-Gen-Assay zum Identifizieren modulierender Verbindungen
Reporter-Gen-Assays sind wohlbekannte Mittel zum Anzeigen einer Transkriptionsaktivität in Zellen. (Für eine Übersicht über chemilumineszente und biolumineszente Reporter-Gen-Assays, siehe Bronstein et al. (1994) Analytical Biochemistry 219, 169–181.) Beispielsweise stellt das Photoprotein Luciferase ein nützliches Mittel zur Durchführen von Untersuchungen hinsichtlich von Modulatoren von FOXC2 Aktivität bereit. Zellen (beispielsweise CHO Zellen oder COS 7 Zellen) sind mit sowohl einem FOXC2 Expressionskonstrukt, als auch einem Reporter-Konstrukt, das ein Gen für das Luciferase-Protein "downstream" von einer Transkriptionsfaktor-Bindungsstelle enthält, transient co-transfiziert. Eine Agonist-Bindung an FOXC2 führt zu einer Expression des Luciferase-Gens. Eine Luciferase-Aktivität kann quantitativ unter Verwendung von beispielsweise Luciferase-Assay-Reagenzien, die von Promega (Madison, WI) kommerziell erhältlich sind, erfasst werden. Lumineszenz-Unterschiede in der Gegenwart verglichen mit der Abwesenheit von einer Kandidat-Modulator-Verbindung zeigen eine modulatorische Aktivität an.
BEISPIEL 14: "Expressing-Profiling" und Ziel-Identifizierung unter Verwendung von Mikroarrays
Um die Rolle von FOXC2 besser zu verstehen und somit neue Drogen-Targets zu identifizieren, können die Expressionsmuster einer großen Anzahl an Genen und ESTs unter Verwendung von GeneChip^® Expressions-Mikroarrays (http://www.affymetrix.com/products/app_exp.html) beobachtet werden. Mikroarrays bestehen aus einer in hohem Maße geordneten Matrix aus Tausenden von verschiedenen Sequenzen, die zum Erfassen von DNA und RNA Variation bei Anwendungen verwendet werden können, die umfassen, Gen-"Expression-Profiling", vergleichende Genforschung und Genotypisierung (für jüngere Übersichtsartikel, siehe beispielsweise: Harrington et al. (2000) Monitoring gene expression using DNA mcoarrays. Curr. Opin. Microbiol. 3(3): 285–291; oder Dugan et al. (1999) Expression profiling using cDNA microarrays. Nature Genetics supplement 21: 10–14).
Kurz gesagt, werden RNAs aus irgendwelchen Geweben oder Zellen in Kultur extrahiert, die für das Studium von FOXC2 von Bedeutung sind und einer reversen Transkription unter Verwendung eines T7-markierten Oligo-dT Primers unterworfen, um doppelsträngige cDNAs zu erzeugen. Diese cDNAs werden dann amplifiziert und unter Verwendung von In vitro Transkription (IVT) mit T7 RNA Polymerase und biotinylierten Nukleotiden markiert. Die nach IVT erhaltenen Populationen von cRNAs sind gereinigt und durch Hitze fragmentiert, um eine Verteilung von RNA-Fragment-Größen von etwa 35 bis 200 Basen herzustellen. GeneChip^® Expressionsarrays sind mit den Proben hybridisiert. Die Arrays werden gewaschen und angefärbt. Die Patronen (cartridges) werden unter Verwendung eines Konfokalscanners durchgemustert und die Bilder werden mit der Microarray Suite 4.0, Software (Affymetrix) analysiert.
Unter Verwendung dieser Analyse kann die Rolle von FOXC2 bei spezifischen Signalgebungs-Wegen aufgeklärt werden und neue Signalgebungs-Wege können identifiziert werden. Gene, die direkt oder indirekt durch FOXC2 reguliert werden, können identifiziert werden. Die Analyse wird Gene mit zuvor bekannter Funktion, jedoch auch neue Gene identifizieren. Gen-Produkte, die über die gleichen Wege wie FOXC2 funktionieren, können als mutmaßliche Ziel-Proteine betrachtet werden. Von einem Targeting derartiger Proteine könnte erwartet werden, dass einige oder alle der erwünschten Wirkungen als Ergebnis erhalten werden, die erwartet werden, wenn ein Targeting von FOXC2 in direkter Weise erfolgt.
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SEQUENCE LISTING

Claims

Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die bei der Behandlung von Fettleibigkeit nützlich ist, welches die Schritte umfasst (i) in Kontakt bringen einer Testverbindung mit dem humanen FOXC2-Gen; und (ii) Bestimmen, ob die Testverbindung die Expression des humanen FOXC2-Gens aktiviert, wobei die Aktivierung anzeigt, ob eine Verbindung bei der Behandlung von Fettleibigkeit nützlich ist.
Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die bei der Behandlung von Fettleibigkeit nützlich ist, welches die Schritte umfasst (i) in Kontakt bringen einer Testverbindung mit einem von dem humanen FOXC2 Gen kodiertem Polypeptid, (ii) Bestimmen, ob die Testverbindung die biologischen Aktivitäten des Polypeptids stimuliert, wobei die biologischen Aktivitäten die Reduktion des Gesamtlipidgehalts in einem Testtier umfassen, wobei eine derartige Stimulation anzeigt, ob eine Verbindung bei der Behandlung von Fettleibigkeit nützlich ist.