DE69935078T2

DE69935078T2 - Eine mutante phospholamban moleküle und deren verwendung zur behandlung von herzkrankheiten und herzversagen

Info

Publication number: DE69935078T2
Application number: DE69935078T
Authority: DE
Inventors: Kenneth La Jolla CHIEN; Wolfgang La Jolla DILLMAN; Susanne La Jolla MINAMISAWA; Huaping La Jolla HE; Masahiko La Jolla HOSHIJIMA; Markus La Jolla MEYER; Christopher La Jolla SCOTT; Yibin La Jolla WANG; Gregg J. La Jolla SILVERMAN
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1998-11-02
Filing date: 1999-11-02
Publication date: 2007-11-15
Anticipated expiration: 2019-11-03
Also published as: CA2349758A1; EP1126866A2; ATE353222T1; AU1711100A; JP2008037870A; WO2000025804A2; DE69935078D1; EP1126866B1; JP2002528512A; CN1354671A; WO2000025804A3; WO2000025804A9

Description

Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der am 2. November 1998 eingereichten vorläufigen US-Anmeldung Nr. 60/106,718 und der am 27. Juli 1999 eingereichten vorläufigen US-Anmeldung Nr. 60/145,883, auf die beide hier ausdrücklich Bezug genommen wird.
Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich allgemein auf ein mutantes Phospholamban-Molekül, wobei es sich bei der Mutation um S16E handelt, und die Verwendung dieses Moleküls zur Behandlung von myokardialer Dysfunktion.
Hintergrundinformationen
Herzversagen ist die häufigste Ursache von kombinierter Morbidität und Mortalität in den USA und anderen Industrieländern. Kongestive Herzinsuffizienz ist durch eine reduzierte Kontraktion und verzögerte Entspannung des Herzens gekennzeichnet, doch sind die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen, die die pathophysiologischen Wege für die kongestive Herzinsuffizienz antreiben, weitgehend unbekannt. Die derzeitige Therapie für die Herzkrankheit ist primär palliativ und zielt nicht auf die zugrundeliegenden biologischen Wege, die vermutlich zur Einleitung und zum Fortschreiten der Herzmuskeldysfunktion führen.
Herzmuskelversagen ist eine komplexe, integrative, multifaktorielle Krankheit, bei der die genetischen Wege, die Anfälligkeit verleihen, mit dem Umgebungsreiz der biomechanischen Beanspruchung, die mit Herzverletzung, Druck- und Volumenbelastung einhergeht, und genetischen Defekten in Komponenten des Cytoskeletts verwoben sind. Als Reaktion auf diese biomechanische Beanspruchung wird eine Reihe von parallelen und konvergierenden Signalwegen aktiviert, die zu der adaptiven Reaktion einer kompensatorischen Hypertrophie führen. Anschließend kann es zu einem Übergang zu Kammerdilatation und Pumpversagen kommen, die mit einem Verlust von lebensfähigen Myocyten, einer Abnahme von kontraktilen Elementen, Myofilamentverwirrung (Disarray) und interstitieller Fibrose verbunden sind.
Vor kurzem wurde die Aktivierung von Signalübertragungswegen, die das Einsetzen des programmierten Zelltods auslösen, mit der Förderung des pathologischen Übergangs zum Herzversagen sowie einem gp130-abhängigen Myocytenüberlebensweg, der die Wirkungen der proapoptotischen Wege blockieren und das frühe Einsetzen von Herzversagen und Kardiomyopathie verhindern kann, in Zusammenhang gebracht. Neben diesen extrinsischen belastungsabhängigen Wegen der Myocytenadaptation muss es auch intrinsische Signalwege geben, die zu einer Beeinträchtigung der Kopplung der kardialen Erregung-Kontraktion (EC) und damit verbundenen schweren Defekten in der Herzkontraktionsfunktion, die die klinischen Kennzeichen für das Fortschreiten des Herzversagensphänotyps sind, führen.
Das sarkoplasmatische Retikulum (SR) spielt eine integrale Rolle bei der Koordination der Bewegung von cytostolischem Ca²⁺ im gesamten Herzgewebe. In getrennten Studien von Mercadier et al. (J. Clin. Invest., 1990; 85: 305–309), Arai et al. (Circ. Res., 1993; 72: 463–469), de la Bastie et al. (Circ. Res., 1990; 66: 554–564) und Feldman et al. (Circ. Res., 1993; 73: 184–192) hat die Erforschung von versagenden Herzen beim Menschen und von Tiermodellen des Herzversagens nahegelegt, dass die reduzierte Aufnahme des cytostolischen Ca²⁺ durch das SR für die verlängerte diastolische Relaxation verantwortlich ist. Im SR gelagertes Ca²⁺ wird in das Cytosol freigesetzt, wobei es die Kontraktion des Herzmuskels aktiviert, und wird anschließend reakkumuliert, so dass eine Relaxation erreicht wird. Die Aktivität der kardialen SR-Ca²⁺-ATPase (SERCA2a) ist der geschwindigkeitsbestimmende Faktor der Ca²⁺-Wiederaufnahme in das SR, und die SERCA2a-Aktivität wird selbst durch Phospholamban reguliert, ein muskelspezifisches SR-Phosphoprotein mit 52 Aminosäuren.
Phospholamban (PLB) wurde in Forschungen von Tada et al. (J. Biol. Chem., 1974; 249: 6174–6180) zuerst als Hauptziel der Phosphorylierung in der SR-Membran identifiziert und schien in seiner unphosphorylierten Form ein starker Inhibitor der SERCA2a-Aktivität zu sein. Die inhibitorische Wirkung von PLB auf SERCA2a wird durch eine Erhöhung des intrazellulären Calciumgehalts oder durch die Phosphorylierung von PLB als Reaktion auf die β-adrenergische Stimulation reduziert. PLB liegt primär in einer pentameren Form vor, die zu fünf äquivalenten Monomeren dissoziiert, wenn man sie einer hohen Temperatur aussetzt.
Die Aminosäuren von monomerem PLB sind zu drei physikalischen und funktionellen Domänen gruppiert. Die Domänen Ia und II sind reich an α-Helices und sind durch die weniger strukturierte Domäne Ib miteinander verbunden. Die Domäne Ia besteht aus den Aminosäuren 1–20, von denen die Mehrzahl in einer α-helikalen Konformation vorliegen, und hat eine positive Nettoladung. Die Domäne Ib besteht aus den Aminosäureresten 21–30 und bildet den cytoplasmatischen Sektor des Monomers. Die Domäne II, Aminosäuren 31–52, bildet den Transmembransektor und besteht ausschließlich aus ungeladenen Resten, die für die Stabilisierung der Pentamerbildung verantwortlich sind.
PLB ist ein Mediator bei der Regulation der Myokardfunktion durch Catecholamine über die cAMP-Kaskade. Ser (16) und Thr (17) in Domäne Ia sind die bestätigten Bindungsstellen für cAMP-abhängige Protein-Kinase (PKA) bzw. Ca/Calmodulin-abhängige Protein-Kinase, deren Funktion es ist, die Phosphoester-Phosphorylierung von PLB zu katalysieren, was wiederum dessen Hemmung der SERCA2a-Aktivität reduziert. Da Ser (16) und Thr (17) durch die Kinasen phosphoryliert werden können, kann die Nettoladung der Aminosäuren von positiv nach neutral und sogar nach negativ verschoben werden. Zusammen mit den geladenen Resten von SERCA2a kann die Verschiebung von Ladungen in der Domäne Ia von PLB zu tiefgreifenden Veränderungen der Protein-Protein-Wechselwirkung des PLB-SERCA2a-Systems führen. Die Domäne II enthält auch insofern einige Schlüsselaminosäuren für die funktionelle Expression von PLB, als Aminosäuren von einer Fläche der Domäne-II-Helix mit der Transmembrandomäne von SERCA2a assoziiert sind.
Es kann zwei Wege geben, auf denen PLB die Aktivität der Ca²⁺-ATPase reguliert: 1) einen schnell wirkenden, kurzfristigen Mechanismus, der eine PLB-Phosphorylierung und Depression der Calciumpumpaktivität beinhaltet, und 2) einen langsamer wirkenden, aber längerfristigen Vorgang, der eine Änderung des molekularen Verhältnisses von PLB zur Ca²⁺-ATPase beinhaltet, die durch eine Steuerung der Genexpression hervorgerufen wird. Unter physiologischen Bedingungen ist die Phosphorylierung an Ser (16) durch PKA das vorherrschende Ereignis, das zu proportionalen Erhöhungen der Geschwindigkeit der Ca²⁺-Aufnahme in das SR führt und die ventrikuläre Relaxation beschleunigt. Eine Erhöhung des Verhältnisses von PLB zu SERCA2a ist eine wichtige Determinante der SR-Dysfunktion sowohl beim experimentellen als auch beim humanen Herzversagen. Außerdem kann die gedämpfte PLB-Phosphorylierung durch PKA für die beeinträchtigte diastolische Funktion und verlängerte Ca²⁺-Transienten bei versagenden Herzen verantwortlich sein, durch die das β-adrenergische Rezeptor-cAMP-System durch einen verstärkten sympathischen Tonus stark herunterreguliert wird.
Eine detaillierte Mutagenesestudie von Toyofuku et al. (J. Biol. Chem., 1994; 269: 3088–3094) zeigte, dass mehrere Aminosäuren in der cytoplasmatischen Domäne von PLB für dessen inhibitorische Funktion verantwortlich sind. Die Studie zeigte Folgendes: Wenn die bestimmten Aminosäuren zu Aminosäuren mit unterschiedlicher Ladung mutiert waren, verloren die PLB-Mutanten in HEK293-Zellen ihre inhibitorische Wirkung auf das cotransfizierte SERCA2. Es ist jedoch noch unklar, ob PLB, das diese Mutanten trägt, dominante negative Wirkungen auf endogenes Wildtyp-PLB ausüben und folglich endogenes SERCA2a in Herzmyocyten stimulieren kann. Außerdem ist unklar, wie die Mechanismen der Übertragung dieser PLB-Punktmutationen auf Cardiomyocyten die Barriere der cytoplasmatischen Membran durchbrechen, um eine endogene SERCA2a-Aktivität zu bewirken.
Genetisch begründete Mausmodelle der dilatierten Kardiomyopathie von Arber et al. (Cell, 88: 393–403; 1997) liefern einen Beweis dafür, dass Kammerdilatation und das Fortschreiten zum Herzversagen von einem spezifischen Defekt des Ca²⁺-Zyklus im kardialen sarkoplasmatischen Retikulum abhängen. Bei den Mausmodellen rettete die Ablation von Phospholamban (PLB) das Spektrum der strukturellen, funktionellen und molekularen Phänotypen, die einem Herzversagen ähneln. Weiterhin aktivierte die Aufhebung der Phospholamban-SERCA2a-Wechselwirkung durch die erzwungene in-vivo-Überexpression einer PLB-Punktmutation dominant die Kontraktilität von ventrikulären Muskelzellen. Somit besteht die Möglichkeit, dass eine Störung der PLB-SERCA2a-Wechselwirkung einen neuen therapeutischen Ansatz für die Prävention von Herzversagen liefern kann.
Es besteht Einvernehmen darüber, dass eine Störung der PLB-SERCA2a-Wechselwirkung ein potentieller therapeutischer Ansatz für die Behandlung von Herzversagen sein kann, doch bleibt die Internalisierung von exogenen Molekülen zur Verstärkung der Kontraktilität des Herzens durch lebende Myocyten ein ungelöstes Problem. Es muss ein Mittel verfügbar sein, um ein therapeutisches Mittel direkt in das Cytoplasma und den Zellkern von Herzmyocyten abzugeben. Penetratine, eine Klasse von Peptiden mit translozierenden Eigenschaften, haben die Fähigkeit, hydrophile Verbindungen durch die Plasmamembran zu transportieren. Forschungen von Schwarze et al. (Science 285: 1569–1572; 1999) haben einen Ansatz für die Proteintransduktion aufgezeigt, wobei ein auf Penetratin basierendes Fusionsprotein verwendet wird, das eine NH₂-terminale, aus 11 Aminosäuren bestehende Proteintransduktionsdomäne aus dem denaturierten HIV-TAT-Protein enthält (Genebank-Zugriffs-Nr. AF033819). Die Verwendung dieses zelltypunspezifischen Transfersystems erlaubt eine direkte Zielsteuerung von Oligopeptiden und Oligonucleotiden in das Cytoplasma und den Zellkern. Eines der am besten charakterisierten Translokationspeptide ist eines, das den Resten 43 bis 58 von Antennapedia, einem Drosophila-Transcriptionsfaktor, entspricht. Man glaubt, dass das Translokationspeptid mit geladenen Phospholipiden auf der Außenseite der Zellmembran wechselwirkt. Die Destabilisierung der Doppelschicht führt zur Bildung von invertierten Micellen, die das Peptid enthalten, durch die Zellmembran wandern und sich schließlich auf der cytoplasmatischen Seite öffnen. Während die Verwendung von Transportpeptiden zum Bewegen von Frachtmolekülen in Zellen nicht neu ist, wurde noch nicht nachgewiesen, dass Transportpeptide bei Cardiomyocyten gut funktionieren.
Es besteht also weiterhin ein Bedürfnis nach Verfahren zur Hemmung von PLB durch die Verwendung von Mutanten oder kleinen Molekülinhibitoren von PLB, um die PLB/SERCA2a-Wechselwirkung bei Herzmyocyten zu manipulieren, sowie einem Transportmittel für diese Mutanten oder kleinen Molekülinhibitoren von PLB zur Durchquerung der Barriere der Membran des sarkoplasmatischen Retikulums in das Cytoplasma von Herzmyocyten zur Behandlung von Herzkrankheiten und Herzversagen. Die vorliegende Erfindung befriedigt diese Bedürfnisse und sorgt auch für damit zusammenhängende Vorteile.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Phospholambanmolekül mit einer Mutation, und zwar S16E.
Es ist ein Vorteil der vorliegenden Erfindung, dass sie Verfahren zur Behandlung von Herzversagen durch Verwendung eines mutanten Phospholambanmoleküls ermöglicht.
Es ist ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung, ein rekombinantes Protein bereitzustellen, dessen Funktion es ist, die Kontraktilität von versagenden Herzen zu verstärken und bei Individuen mit Hypertonie den Blutdruck zu reduzieren, indem sie die Wechselwirkung zwischen Phospholamban und Ca²⁺-ATPase des sarkoplasmatischen Retikulums (SERCA2a) innerhalb von Cardiomyocyten hemmen.
Die mutante Form von PLB hat die Fähigkeit, die normale inhibitorische Wechselwirkung zwischen PLB und SERCA2a selektiv zu unterbrechen und damit wiederum die Herzkontraktilität dominant zu aktivieren.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Darstellung, die diagrammartig ein Arbeitsmodell für die Rolle der PLB-SERCA2a-Wechselwirkung beim Fortschreiten des Herzversagens zeigt.
2 zeigt die hämodynamische Analyse der Rettung der in-vivo-Herzdysfunktion bei DKO-Mäusen (a–d) und die hämodynamische Bewertung der β-adrenergischen Reaktion auf die progressive Infusion von Dobutamin (e–h), wobei 2a die Auftragung der maximalen ersten Ableitung des LV-Drucks, LV-dp/dtmax, zeigt. 2b zeigt die Auftragung der minimalen ersten Ableitung des LV-Drucks, LV-dp/dtmin. 2c zeigt die Auftragung für den enddiastolischen LV-Druck. 2d zeigt die Auftragung für Tau. 2e zeigt eine Graphik der maximalen ersten Ableitung des LV-Drucks, LV-dp/dtmax. 2f zeigt eine Graphik der minimalen ersten Ableitung des LV-Drucks, LV-dp/dtmin. 2g zeigt eine Graphik des enddiastolischen LV-Drucks. 2h zeigt eine Graphik der Herzfrequenz.
3 zeigt aufgetragene Daten aus der Analyse der Rettung von physiologischen Calciumsignaldefekten in DKO-Myocyten, wobei 3a eine Reihe von Graphiken des repräsentativen intrazellulären Ca²⁺-Transienten in WT-, MLPKO- und DKO-Myocyten ist. 3b ist ein Balkendiagramm der Amplitude von Ca²⁺-Transienten. 3c ist ein Balkendiagramm der intrazellulären diastolischen Ca²⁺-Konzentration. 3d ist ein Balkendiagramm des Ca²⁺-Gehalts des SR. 3e ist der Immunoblot der MLP-Defizienz.
4a zeigt eine Dot-Blot-Analyse der Rettung von embryonalen Genmarkern des Herzversagensphänotyps bei DKO-Mäusen. 4b ist ein Balkendiagramm, das die relative Induktion von mRNA für Wildtyp-, MLPKO- und DKO-Myocyten miteinander vergleicht.
5 veranschaulicht die Hemmung der Wechselwirkung zwischen PLB und SERCA2a, wobei 5a eine Reihe von Graphiken ist, in denen die Längenveränderung bei Myocyten aufgetragen ist. 5b ist eine Zusammenfassung der Daten für die Zelllängenveränderungen.
6a ist eine Western-Blot-Analyse von Monocyten, die die Adenovirus-Transgene enthalten, welche Sense-PLB (sPLB), Antisense-PLB (asPLB), E2A, R14E, S16N und K3E/R14E exprimieren, gegen monoklonale Anti-PLB-Antikörper. 6b ist ein Western-Blot, das die Ergebnisse der Zellinfektiosität durch PLB, sPLB und K3E/R14E zeigt. 6c zeigt die Western-Blot-Analyse der PLB-Infektiosität von Sol8-Zellen.
7 zeigt eine Auftragung der SR-Ca²⁺-Aufnahme in Homogenisaten von neonatalen Ratten-Cardiomyocyten, die mit Adenovirus infiziert sind, das die angegebenen Gene exprimiert.
8 zeigt eine Auftragung der Daten, die von Indo-1-Fluoreszenz-erleichterten Ca²⁺-Transienten von Myocyten abgeleitet sind.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird bei Betrachtung der folgenden Punkte besser verständlich.
Um die Rolle, die Defekte des Ca²⁺-Zyklus beim Übergang zum Herzversagen spielen, direkt zu bewerten, kann eine Kardiomyopathie bei Mäusen mit einer Defizienz des muskelspezifischen LIM-Proteins (MLP) revertiert werden, indem man das Gen entfernt, das für PLB codiert. Mäuse, die eine Ablation von MLP beherbergen, zeigen viele der phänotypischen Merkmale von humaner dilatierter Kardiomyopathie auf dem molekularen, zellulären und physiologischen Niveau. Ein gleichmäßiges Merkmal der dilatierten Kardiomyopathie im Endstadium ist eine merkliche Erhöhung der Herzwandspannung, die mit einer Verdünnung der Kammerwand und einer begleitenden Abnahme der Herzkontraktilität und -re laxation einhergeht. Da der Calciumzyklus sowohl für die Relaxation als auch für die Kontraktilität des Herzens entscheidend ist, sind Defekte in dem Weg, der die Calciumaufnahme und -freisetzung aus dem sarkoplasmatischen Retikulum steuert, vorrangige Kandidaten für den Antrieb des Fortschreitens von Herzversagen.
Mäuse, die neben einer MLP- auch eine PLB-Defizienz beherbergen, weisen eine Rettung vor allen phänotypischen Merkmalen von humanem Herzversagen auf, die man normalerweise bei MLP-Singulär-Knockout(MLPKO)-Mäusen findet. Um zu bestimmen, ob die funktionellen Vorteile, die mit der PLB-Ablation in MLPKO-Mäusen verbunden sind, spezifisch den Verlust der direkten Wechselwirkung zwischen PLB und SERCA2a widerspiegeln, hat die Anmeldering der vorliegenden Erfindung Punktmutationen im PLB-Gen hergestellt, die die funktionelle inhibitorische Wechselwirkung zwischen PLB und SERCA2a unterbrechen. Durch die Schaffung von rekombinanten Adenoviren, die Punktmutationen in PLB codieren, wird nachgewiesen, dass progressive Defekte der Erregungs-Kontraktions-Kopplung bei Herzversagen mit der verstärkten Hemmung von SERCA2a durch PLB zusammenhängen und dass die Einführung einer Phospholamban-Defizienz in den Aufbau eines transgenen Modells der Herzhypertrophie zu einer geretteten Herzfunktion führt. Diese Ergebnisse werden unabhängig dadurch gestützt, dass MLP-defiziente Mäuse, die ein Transgen beherbergen, das die herzspezifische Überexpression von SERCA2a steuert, ebenfalls eine Rettung des Kardiomyopathie-Phänotyps aufweisen. Zusammengenommen liefern diese Ergebnisse den eindeutigen Beweis dafür, dass der Calciumzyklus im sarkoplasmatischen Retikulum für den Fortschritt des Herzversagens entscheidend ist, und weisen auf die entscheidende regulatorische Rolle der PLB-Hemmung der SERCA2a-Aktivität beim Fortschreiten des Herzversagens. Dies wiederum zeigt deutlich die Möglichkeit von PLB als therapeutisches Schlüsseltarget auf.
Die weitere Untersuchung der MLP-PLB-Knockout(DKO)-Mäuse deutete darauf hin, dass die Induktion von PLB-Defizienz beim Aufbau einer kardiomyopathischen Mutation zu einer maximalen Stimulierung der kontraktilen Herzleistung führen kann. Die Kontraktilität der DKO-Herzen auf Grundniveaus war mit der Kontraktilität von Wildtypherzen nach maximaler β-adrenergischer Stimulation vergleichbar. Dieses Ergebnis lässt vermuten, dass es nach der Entfernung der tonischen Hemmung der SR-Calciumpumpfunktion durch PLB im Wesentlichen eine "Suprarettung" im Sinne der kontraktilen Herzfunktion des kardiomyopathischen Herzens gibt. Da PLB ein direktes Substrat für die Phosphorylierung sowohl durch von cyclischem AMP abhängige Protein-Kinase A als auch durch Calcium/Calmodulin-abhängige Kinase gibt, kann die Regulation der Herzkontraktilität durch cAMP-abhängige Reize über die Phosphorylierung von PLB erfolgen, was wiederum die inhibitorische Wechselwirkung mit SERCA2a verhindert.
Gemäß der Theorie hinter der Phosphorylierung von PLB könnte die "Suprarettung" der kardiomyopathischen, MLP-defizienten Mäuse auf übernormale Werte beim Aufbau der PLB-Defizienz einfach die Entfernung des geschwindigkeitsbestimmenden Schritts bei der tonischen Hemmung der Herzkontraktilität widerspiegeln. Im Einklang mit diesem Prinzip haben Studien von Rockman et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 7000–7005; 1998) dokumentiert, dass die Minderung der β-adrenergischen Desensibilisierung bei den MLP-defizienten Mäusen ebenfalls zu einer signifikanten Rettung des dilatierten kardiomyopathischen Phänotyps führen kann. Da PLB ein SR-Protein ist, das mit wenigstens drei regulatorischen Komponenten (cAMP-abhängiger Protein-Kinase, Calcium/Calmodulin-abhängiger Kinase und Protein-Phosphatase) wechselwirkt, sollte bestimmt werden, ob die dominante Wirkung der PLB-Ablation auf die Verbesserung der kontraktilen Herzleistung die chronische Wechselwirkung von PLB mit dem SERCA2a widerspiegelt oder ob dieser Rettungseffekt mit der Wechselwirkung von PLB mit anderen bekannten oder neuen Herzproteinen zusammenhängt.
Die vorliegende Erfindung sorgt für eine Punktmutation in PLB, die die normale inhibitorische Wechselwirkung zwischen PLB und SERCA2a selektiv unterbrechen kann und dominant die Herzkontraktilität in Herzklappen-Muskelzellen in Abwesenheit von Catecholamin aktivieren kann.
1 skizziert den Mechanismus, der für den bei den DKO-Mäusen beobachteten Rettungseffekt verantwortlich ist. Sowohl PLB als auch MLP sind muskelspezifische Proteine, und daher muss es einen muskelzellautonomen Weg geben, der für das Fortschreiten und die Rettung des Phänotyps erforderlich ist, im Unterschied zu extrinsischen Stresssignalen, die Myocyten-Überlebenswege fördern oder unterdrücken. Da PLB und MLP auf dem Proteinniveau nicht direkt miteinander Wechselwirken, was eine direkte Wechselwirkung zwischen PLB und MLP als Basis für die Rettung ausschließt, muss es einen physiologischen im Unterschied zu einem biochemischen Regulationsweg geben, der die PLB-Regulationswege mit dem Einsetzen von dilatierter Kardiomyopathie verknüpft. Wie in 1 gezeigt ist, werden im normalen Herzen SR-Calciumvorräte durch die Aktivität von SERCA2a aufrechterhalten, das zu einer Aufnahme von Calcium in das SR und einer daraus folgenden Aufrechterhaltung der normalen Herzrelaxation und Reduktion der Wandspannung führt. Anschließend führt die SR-Freisetzung von Calcium über den Calciumfreisetzungskanal zu einer normalen quantalen Calciumfreisetzung und einer daraus folgenden Aktivierung der Herzmyofilamente, die zu einer myokardialen Kontraktion führt. Dementsprechend führt ein erhöhter Ca²⁺-Gehalt im SR zu einer verstärkten Ca²⁺-Freisetzung mit einer entsprechenden Erhöhung der Herzkontraktilität.
Die Aktivität von SERCA2a wird durch die inhibitorischen Wirkungen der direkten Wechselwirkung von PLB mit SERCA2a reguliert, die durch die cAMP-abhängige Phosphorylierung von PLB nach der Abgabe von β-adrenergischen Reizen gemindert werden kann. Im Szenario des Herzversagens gibt es eine relative Abnahme der SERCA2a-Funktion aufgrund einer inhibitorischen Wirkung von PLB, die aufgrund einer abgestumpften β-adrenergischen Reaktivität auftritt. Als Ergebnis gibt es eine geringere Phosphorylierung von PLB und eine konstitutive Hemmung von SERCA2a über die chronische Wechselwirkung mit PLB, was zu einer relativen Abnahme des SR-Calciumgehalts gegenüber normalen Werten führt. Diese Abnahme der Calciumvorräte zeigt sich in einer Abnahme der quantalen Freisetzung von Calcium über den Calciumfreisetzungskanal und eine daraus folgende Abnahme der Einzelzellen-Calciumtransienten und der in-vivo-Herzkontraktilität. Bei den DKO-Mäusen ist die hemmende Wirkung von PLB aufge hoben, wie in 1 gezeigt ist, wodurch das System von den nachgeschalteten hemmenden Wirkungen von PLB auf die SR-Calciumpumpe befreit wird, was zur Aufrechterhaltung der SR-Calciumaufnahme und Reduktion der Wandspannung auf normale Werte führt. Gleichzeitig führt diese Zunahme des SR-Calciumgehalts zu einer Aufrechterhaltung der normalen quantalen Calciumfreisetzung, was zu einer Aufrechterhaltung der normalen Kontraktilität und Relaxation führt.
Knockout des muskelspezifischen LIM-Proteins und Doppel-Knockout-Mäuse
Tests wurden durchgeführt, wobei ein Doppel-Knockout(DKO)-Mausmodell verwendet wurde, das eine homozygote Ablation von zwei unabhängigen muskelspezifischen Genen beherbergt. Für diese Strategie werden PLB-Knockout(PLBKO)-Mäuse in den Hintergrund von MLP-Knockout(MLPKO)-Mäusen, die molekulare, strukturelle und physiologische Merkmale des komplexen in-vivo-Herzversagens-Phänotyps einer dilatierten Kardiomyopathie beherbergen, hineingepaart. Die F3-Generation dieser Mäuse wird für die tatsächlichen Experimente verwendet, um alle potentiellen Hintergrundwirkungen entweder von der PLBKO- oder von der MLPKO-Linie auf den beobachteten kardialen Phänotyp der DKO-Linie zu eliminieren.
MLPKO-Mäuse zeigen eine merkliche Zunahme des Herz/Körper-Gewichtsverhältnisses (6,34 ± 0,22 mg/g, n = 8) gegenüber Wildtypmäusen mit passendem Alter und Geschlecht (4,60 ± 0,21 mg/g, n = 7; p < 0,001). Das Herz/Körper-Gewichtsverhältnis bei DKO-Mäusen (5,13 ± 0,19 mg/g, n = 9) ist signifikant kleiner als das von MLPKO-Mäusen (p < 0,01) und ist von dem des Wildtyps nicht signifikant verschieden. Um zu bewerten, ob das reduzierte Herzgewicht bei DKO-Mäusen mit einer Verbesserung des bei MLPKO-Mäusen beobachteten Phänotyps des zerstörten Cytoskeletts verbunden ist, wird eine elektronenmikroskopische Analyse von Herzen aus MLPKO- und DKO-Wurfgeschwistern durchgeführt. Die Ablation von PLB im Hintergrund von MLP^–/– rettet das breite Spektrum der ultrastrukturellen Defekte, die ursprünglich bei den MLP-defizienten Herzen beobachtet werden, einschließlich Myofilamentverwirrung und massiver Fibrose.
Diese Daten lassen vermuten, dass die Ablation von PLB nicht nur die Zunahme der Gesamtherzmasse verhindert, sondern auch die Auflösung der Cytoarchitektur der Cardiomyocyten und die Fibrose bei kardiomyopathischen MLPKO-Mäusen verhindert.
Um zu bewerten, ob die merklichen Abnahmen, die man bei der globalen in-vivo-Herzfunktion beobachtet, in DKO-Mäusen gerettet werden, wird eine Echokardiographie mit Wurfgeschwistern mit passendem Alter durchgeführt. Wie in Tabelle 1 notiert ist, wird die Verhinderung der ventrikulären Dilatation bei DKO-Mäusen bestätigt. MLPKO-Mäuse haben vergrößerte Herzkammern, was sich durch erhöhte linksventrikuläre enddiastolische Durchmesser (LVEDD) und endsystolische Durchmesser (LVESD) zeigt, während DKO-Mäuse einen LVEDD im normalen Bereich haben. Die prozentuale fraktionale Verkürzung (%FS) und mittlere zirkumferenzielle Faserverkürzungsgeschwindigkeit (mittlere Vcf), Indikatoren der systolischen Herzfunktion, sind bei DKO-Wurfgeschwistern mit passendem Alter verbessert, was ebenfalls in Tabelle 1 notiert ist. Im Vergleich zu Wildtypmäusen, die keine Wurfgeschwister sind, als Kontrollen sind die meisten echokardiographischen Daten bei DKO-Mäusen denen von Wildtypmäusen ähnlich, obwohl die %FS bei DKO-Mäusen leicht reduziert ist. Weiterhin bleibt die Herzfunktion von DKO-Mäusen jenseits eines Alters von 6 Monaten im normalen Bereich (n = 2). Trotz der Reduktion der Kammerdilatation scheint es bei DKO-Herzen eine gewisse Hypertrophie zu geben. Das Verhältnis des LVEDD zur linksventrikulären Hinterwanddicke ist bei DKO-Mäusen merklich reduziert, was darauf hindeutet, dass die Wandspannung von DKO-Mäusen im Vergleich zu MLPKO- oder Wildtypmäusen reduziert ist. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die globale Herzfunktion von DKO-Mäusen in dem Bereich erhalten bleibt, der mit den Parametern von Kontrollherzen vergleichbar ist. Es sei angemerkt, dass Mäuse, die heterozygot in Bezug auf PLB-Defizienz sind, ein mittleres Niveau der funktionellen Rettung gegenüber den MLPKO- und DKO-Mäusen aufweisen, was vermuten lässt, dass eine partielle Ablation von PLB zu einer signifikanten funktionellen Verbesserung des Herzversagens-Phänotyps bei MLPKO-Mäusen führen kann. Tabelle 1 Echokardiographische Bewertung

MLPKO gegenüber MLPKO/PLBhet oder DKO oder Wildtype; *: p < 0,05, **: p < 0,01, ***: p < 0,001
Wildtyp gegenüber MLPKO/PLBhet oder DKO; †: p < 0,05, ‡: p < 0,01, §: p < 0,001 MLPKO/PLBhet gegenüber DKO; #: p < 0,05

MLPKO-Mäuse zeigten eine merkliche Abstumpfung der β-adrenergischen Reaktivität und eine reduzierte Adenyl-Cyclase-Aktivität. Die Ablation von PLB durch homologe Rekombination bei Mäusen kann die kontraktile Herzleistung auf ein Niveau erhöhen, das mit dem der maximalen β-adrenergischen Stimulierung des normalen Herzens vergleichbar ist. Um zu bestätigen, dass die Ablation von PLB die hämodynamischen Wirkungen und die merkliche Desensibilisierung von β-adrenergischen Rezeptoren, die mit dilatierter Kardiomyopathie einhergeht, umkehren kann, erhalten anästhetisierte Mäuse einen Herzkatheter und werden bewertet.
Mehrere unabhängige hämodynamische Parameter dokumentieren die Rettung der schweren kardialen Dysfunktion mit Kreislaufkongestion auf normale Werte bei den DKO-Mäusen. Die LV-Kontraktilität (bewertet anhand von LV-dp/dtmax) und die Relaxation (bewertet anhand von LV-dp/dtmin) auf der Grundlinie scheinen höher zu sein als bei Wildtypmäusen und sind mit denen von PLBKO-Mäusen vergleichbar, wie in den 2a und 2b gezeigt ist. Die Ablation von PLB kehrt den merklich erhöhten linksventrikulären enddiastolischen Druck, den man bei den kardiomyopathischen MLPKO-Mäusen beobachtet, um, wie in 2c zu sehen ist.
Eine Analyse von 2d zeigt, dass Tau, ein Indikator für die LV-Relaxation und diastolische Funktion, bei den DKO-Mäusen ebenfalls normalisiert ist, was mit einer Verbesserung der Wandspannung im Einklang steht. Diese Daten lassen vermuten, dass eine Ablation von PLB sowohl die systolische als auch die diastolische Dysfunktion bei den kardiomyopathischen MLPKO-Mäusen retten kann. Die abgestumpften Reaktionen von LV-dp/dtmax und LV-dp/dtmin auf die β-adrenergische Stimulierung wird bei MLPKO-Mäusen beobachtet, wie in den 2e und 2f gezeigt ist, was die Anwesenheit einer schweren β-adrenergischen Desensibilisierung bei MLPKO-Mäusen anzeigt. Es gibt bei DKO-Mäusen keine Stimulierung der Herzkontraktilität (LV-dp/dtmax) und -relaxation (LV-dp/dtmin) durch Dobutamin, wie wiederum in den 2e und 2f gezeigt ist. Diese Parameter werden in den DKO-Herzen bereits unter Grundbedingungen auf ihre maximalen Werte stimuliert.
Nach der maximalen Stimulierung von Wildtypherzen durch Dobutamin sind LV-dp/dtmax und LV-dp/dtmin von diesen Parametern bei den DKO-Mäusen in Abwesenheit einer Catecholamin-Stimulierung nicht zu unterscheiden. Dieses Beweismaterial bestätigt, dass die Wechselwirkung von PLB und SERCA2a die Herzkontraktilität sowohl bei normalen als auch bei myopathischen Herzen unterdrückt und dass eine Hemmung dieser Wechselwirkung eine dominante Wirkung auf die Maximierung der Herzleistung in Abwesenheit einer Catecholamin-Stimulierung ausüben könnte. 2h zeigt, dass die chronotrope Reaktivität auf Dobutamin sowohl bei DKO-Mäusen als auch bei MLPKO-Mäusen erhalten bleibt, wodurch die Spezifität der β-adrenergischen Reaktion in Bezug auf ventrikuläre Myocyten im Vergleich zu Schrittmacher-Zelltypen dokumentiert wird.
Um die Mechanismen zu bestimmen, die für die Rettung der in-vivo-Herzfunktion bei DKO-Mäusen verantwortlich sind, werden mehrere unabhängige Parameter des Ca²⁺-Signalwegs bewertet. Anscheinend führt eine veränderte Ca²⁺-Homöostase bei DKO-Mäusen zu den hämodynamischen Veränderungen, intrazellulären Ca²⁺-Transienten und der Expression von Proteinen, die mit dem Ca²⁺-Zyklus im SR zusammenhängen. MLPKO-Myocyten zeigen eine gedämpfte Amplitude von Ca²⁺-Transienten mit normalen Werten der diastolischen Ca²⁺-Konzentration, wie in den 3a–c gezeigt ist. Die Abklinggeschwindigkeit ist bei MLPKO-Mäusen leicht beschleunigt, was vermuten lässt, dass bei MLPKO-Mäusen während des Endes der Ca²⁺-Aufnahme ein kompensatorischer Mechanismus am Werk ist. Die Ablation von PLB ist mit einer verkürzten Dauer des Ca²⁺-Transienten, einem schnelleren Abklingen und einer beibehaltenen Amplitude verbunden. 3d zeigt, dass der SR-Ca²⁺-Gehalt im Vergleich zu Wildtypmäusen bei MLPKO-Mäusen signifikant gesenkt und bei DKO-Mäusen erhöht ist. Quantitatives Immunoblotting, das in 3e gezeigt ist, zeigt, dass die MLP-Defizienz nicht mit irgendwelchen signifikanten Veränderungen der Proteinkonzentrationen von SERCA2a, PLB und Calsequestrin verbunden ist, was vermuten lässt, dass die Defekte des Ca²⁺-Zyklus bei MLPKO-Mäusen auf einer funktionellen Beeinträchtigung der FC-Kopplung beruhen, im Unterschied dazu, dass sie einfach Abnahmen der Proteinkonzentrationen entweder von SERCA2a oder von Phospholamban widerspiegeln.
Eines der charakteristischen Merkmale eines Herzversagens ist die Reaktivierung eines embryonalen Genprogramms, das zu einer kompensatorischen Reaktion auf eine erhöhte hämodynamische Belastung beitragen kann. Um zu bestätigen, dass eine hämodynamische Verbesserung bei DKO-Mäusen mit einer Verbesserung von Veränderungen auf dem Transcriptionsniveau einhergeht, wird die Expression von mRNAs für ANF, α-Skelett-Actin und β-MHC, gut etablierten embryonalen Markern für Herzversagen, untersucht. Wie in den 4a und 4b gezeigt ist, zeigen Ventrikel von MLPKO-Mäusen eine 26-fache Erhöhung von ANF-, eine 13-fache Erhöhung von α-Skelett-Actin- und eine 8-fache Erhöhung von β-MHC-mRNA. DKO-Mäuse zeigen nur eine 1,9-fache Erhöhung von ANF- und keine signifikante Erhöhung von α-Skelett-Actin- oder β-MHC-mRNA. Die Ablation von PLB unterdrückt also großenteils die Induktion des embryonalen Genprogramms bei MLPKO-Mäusen.
Die oben genannten Studien deuten darauf hin, dass die Ablation von PLB unabhängige Parameter des Herzversagens und damit verbundene Defekte in der Herzkontraktilität retten kann. Um den Mechanismus des Rettungseffekts zu definieren, muss bewertet werden, ob die chronische Wechselwirkung von PLB und SERCA2a tatsächlich der begrenzende Faktor der Herzkontraktilität sowohl bei normalen als auch bei myopathischen Herzen ist. Die "Suprarettung" der basalen Herzfunktion bei den DKO-Mäusen auf Werte, die mit denjenigen von Wildtypmäusen nach maximaler Catecholamin-Stimulierung vergleichbar sind, lässt vermuten, dass eine Hemmung dieser Wechselwirkung eine dominante Wirkung ausüben könnte, die die Herzleistung in Abwesenheit einer Catecholamin-Stimulierung maximiert.
Rekombinante adenovirale transgene Mutanten von PLB
Unter Verwendung der Erkenntnis, dass bestimmte Aminosäurereste von PLB erforderlich sind, um seine hemmenden Wirkungen auf SERCA2a aufrechtzuerhalten, können mehrere einfache Punktmutationen von PLB, V49A (Seq. ID. Nr. 2), E2A (Seq. ID. Nr. 3), R14E (Seq. ID. Nr. 4), S16N (Seq. ID. Nr. 5), eine doppelte Punktmutation von PLB, K3E/R14E (Seq. ID. Nr. 6), und ein Sense- und Antisense-PLB-Transgen (Seq. ID. Nr. 1) gentechnisch hergestellt werden, um die hemmenden Wirkungen von PLB auf SERCA2a zu zerstören. Unter Verwendung von rekombinanten Adenoviren für die in-vivo-Maus-Herzgenübertragung zeigen Myocyten, die V49A, einer der einfachen Punktmutationen in PLB, überexprimieren, eine Erhöhung der Kontraktilität, während Myocyten, die das Wildtyp-PLB überexprimieren, eine Abnahme der Kontraktilität im Vergleich zu nichtinfizierten Myocyten zeigen, wie in 5 dokumentiert ist. Daraus kann geschlossen werden, dass die Machbarkeit und Nützlichkeit der Störung der Wechselwirkung zwischen SERCA2a und PLB eindeutig dokumentiert ist. Die PLB-SERCA2a-Wechselwirkung scheint der geschwindigkeitsbestimmende Schritt für die Etablierung des Sollwerts der basalen Herzkontraktilität und -relaxation in vivo zu sein, und die Zerstörung dieser Wechselwirkung kann den β-adrenergischen Weg kurzschließen.
Eine zusätzliche Western-Blot-Analyse von Myocyten, die die Adenovirus-Transgene enthalten, welche Sense-PLB (sPLB), Antisense-PLB (asPLB), E2A, R14E, S16N und K3E/R14E exprimieren, gegen monoklonalen Anti-PLB-Antikörper (Affinity BioReagents) ist in 6a gezeigt. Die Quantifizierung des PLB-Proteingehalts, normiert auf α-Actin in Bezug auf Belastungsvarianz und im Vergleich zu einer Adenovirus/SR-Kontrolle, der das Transgen fehlt, zeigt, dass sPLB-, E2A- und R14E-Mutanten den PLB-Proteinwert um 150% (PLB₅ + PLB₁), 72% bzw. 57% erhöhen. Dagegen führen asPLB und S16N zu einer Abnahme des PLB-Proteingehalts von 54% bzw. 33% innerhalb der Myocyten. Die Einführung einer K3E/R14E-Transgeninfektion von Myocyten führt zu einer Bildung eines deutlichen Musters von Pentamer-PLB. Mehrfache PLB-Banden erscheinen neben PLB₅ (dem Pentamer). Dies geht mit einer reduzierten Häufigkeit von PLB₅ im Vergleich zur Kontrolle einher.
Die Natur des Western-Blot-Bandenmusters wird weiter bewertet, indem man PLB-defiziente Sol8-Zellen anstelle von Herzmyocyten verwendet. Sol8-Zellen werden mit dem rekombinanten Adenovirus infiziert, das entweder das Transgen sPLB oder K3E/R14E allein oder in Kombination exprimiert. Wie man in 6b erkennt, zeigt der Western-Blot, dass der monoklonale PLB-Antikörper PLB in Zellen nachweist, die durch sPLB infiziert sind, aber kein K3E/R14E nachweist. Die Infektion von Sol8-Zellen mit einer Kombination der adenoviralen Transgene führt zur Bildung von mehrfachen PLB-Banden. Außerdem nimmt die Häufigkeit des PLB-Pentamers gleichzeitig mit dem Auftreten der oberen Banden ab. Es ist wohl etabliert, dass PLB vorwiegend als Monomer, das im Gleichgewicht mit dem nichthemmenden Pentamer vorliegt, mit SERCA2a wechselwirkt und es hemmt. Auf der Grundlage dieser Erkenntnis könnte das Heteropentamer von K3E/R14E und von Wildtyp-PLB stabiler sein als das Homopentamer von Wildtyp-PLB. Daher ist die Dissoziation des Heteropentamers zu Monomeren, die zur Hemmung von SERCA2a führt, nicht begünstigt. K3E/R14E wechselwirkt mit endogenem PLB und bildet einen solchen Komplex, was mit einer Abnahme der Homopentamerbildung einhergeht. Insofern kann das Monomer K3E/R14E als nichtinhibitorischer Konkurrent um endogenes Wildtyp-PLB wirken, indem es SERCA2a-PLB-Wechselwirkungsstellen blockiert.
Die Wirkungen von mutantem und Antisense-PLB auf SERCA2a wird weiterhin durch Bestimmung der SR-Calciumaufnahmeaktivität bewertet. Die bei unterschiedlichen Ca²⁺-Konzentrationen gemessene Anfangsgeschwindigkeit der Ca²⁺-Aufnahme durch das SR spiegelt die Aktivität von SERCA2a wider. Wie in 7 gezeigt ist, zeigen neonatale Rattenmyocyten, die mit den rekombinanten Adenovirus-Transgenen K3E/R14E und asPLB infiziert sind, eine Abnahme der Konzentration von Ca²⁺, die von SERCA2a für dieselbe Aktivität benötigt wird, im Vergleich zur Nichttransgen-Kontrolle, was auf eine Stimulation der SERCA2a-Aktivität hindeutet. Die EC₅₀-Werte der Ca²⁺-Konzentration, bei denen die Aufnahmeaktivität halbmaximal ist, betragen (in μmol/l) 0,20 ± 0,02 für die Nichttransgen-Kontrolle (SR-), 0,11 ± 0,01 für K3E/R14E und 0,13 ± 0,01 für asPLB. Die Wirkungen von K2E/R14E und asPLB auf SERCA2a werden auch bei adulten Rattenmyocyten untersucht. Das adenovirale Transgen K3E/R14E senkt den EC₅₀-Wert signifikant (um 36%), während die Änderung infolge einer asPLB-Infektion statistisch nicht signifikant ist. Diese scheinbare Diskrepanz in den Wirkungen zwischen neonatalen und adulten Herzmyocyten hängt möglicherweise mit den unterschiedlichen Häufigkeiten von PLB in Myocyten in unterschiedlichen Entwicklungsstadien ab. PLB ist im adulten fast zweimal so häufig wie im neonatalen Myokard.
Um die Wirkungen von K3E/R14E und asPLB auf SERCA2a weiter zu untersuchen, werden intrazelluläre Ca²⁺-Transienten in neonatalen Myocyten durch Verwendung des Fluoreszenzindikators Indo 1 gemessen. Ratiometrische Indo-1-Daten, die unter den jeweiligen experimentellen Bedingungen erhalten werden, werden auf das jeweilige Maximum und Minimum jedes kontraktilen Ca²⁺-Tran sienten normiert und dann aneinander ausgerichtet und gemittelt. Wie in 8 gezeigt ist, sind die Abklingkurven von K3E/R14E und asPLB zur linken Seite der LacZ-Kontrolie verschoben. Weiterhin ist K3E/R14E für die meisten diastolischen Zeitpunkte signifikant von LacZ verschieden, während bei mehreren diastolischen Zeitpunkten asPLB ebenfalls signifikant von LacZ verschieden ist. Die Halbwertszeiten für das Abklingen (RT₅₀) für LacZ, K3E/R14E und asPLB werden zu 0,28 Sekunden (100%), 0,20 Sekunden (73%) bzw. 0,22 Sekunden (79%) bestimmt. Die Werte für K3E/R14E (73%) und asPLB (79%) sind signifikant (p < 0,05) von den Werten verschieden, die man vom LacZ-exprimierenden Virus erhält.
Außer der Erzeugung von adenoviralen Transgenen unter Verwendung verschiedener Punktmutationen von PLB oder der Sense- oder Antisense-Sequenzen von PLB können auch Antikörper, die gegen das PLB-Peptid erzeugt und dann als RNA exprimiert wurden, in den adenoviralen Vektor eingefügt werden. Um polyklonalen PLB-Antikörper ("Contractilin" oder Hühner-Antikörperpeptide mit hyperaktiven Bereichen) zu erzeugen, wird ein Huhn wiederholt mit PLB-Peptid immunisiert, das die Aminosäuren 3 bis 19 der cytoplasmatischen Domäne darstellt. Nach drei Runden Auffrischimpfung, die am 15., 42. und 54. Tag verabreicht wurden, wird Gesamt-IgY aus dem Eidotter gereinigt, wobei man ein kommerziell erhältliches Reinigungssystem verwendet (EGGstract IgY Purification System, Promega). Bei Bestätigung einer positiven Immunantwort werden Lymphocyten aus der Milz und dem Knochenmark geerntet. RNA in Form der hypervariablen Bereiche sowohl von der leichten als auch von der schweren Kette des Antikörpers wird aus diesen Zellen erhalten und durch RT-PCR amplifiziert, wofür das Verfahren wohlbekannt ist.
Die amplifizierte und gereinigte RNA in Form des hypervariablen Bereichs wird dann mit einer einzigen cDNA (SEQ ID Nr. 9) fusioniert und anschließend in demselben Leseraster in einen Plasmidvektor, der für ein Phagen-Oberflächenprotein codiert, kloniert. Unter Verwendung einer Standard-Phagendisplay-Technik werden Phagen, die die Immunbibliothek des Huhns exprimieren, anhand ihrer positiven Reaktion auf das PLB-Peptid selektiert. Nach einer Reihe von Anreicherungen in Bezug auf Phagen, die spezifisch PLB binden, werden 20 Klone für ELISA ausgewählt. Die resultierenden 5 Klone, die am besten binden, werden dann unter Verwendung eines radioaktiven Ca²⁺-Transportassays analysiert. Die beiden besten Aktivatoren des SR-Ca²⁺-Transports werden weiter analysiert. Es zeigt sich, dass beide Klone die Geschwindigkeit des Ca²⁺-Transports in das SR dramatisch stimulieren.
Um zu beweisen, dass das rekombinante Protein, das aus Contractilin (dem PLB-Antikörper) erzeugt wurde, auch innerhalb einer lebenden Zelle funktionieren kann, wird ein adenoviraler Vektor aufgebaut, der Contractilin exprimiert. Eine Western-Blot-Analyse von neonatalen und adulten Rattencardiomyocyten, die mit dem adenoviralen Transgen infiziert waren, zeigt, dass Contractilin in Herzzellen exprimiert werden kann. Die radioaktive Ca²⁺-Transportanalyse deutet darauf hin, dass Contractilin wie das mutante und das Antisense-PLB die cytoplasmatische Ca²⁺-Entfernung beschleunigt.
In einem komplementären Ansatz wird eine Plasmidtransfektion anstelle einer adenoviralen Transfektion für die Genabgabe verwendet. Es zeigt sich, dass K3E/R14E- und asPLB-transfizierte Myocyten gemäß der Überwachung durch cotransfiziertes grünes fluoreszentes Protein Abnahmen des RT₅₀-Wertes von 43% (p < 0,05) bzw. 9% (p < 0,1) relativ zu den mit adenoviralem Vektor transfizierten Zellen aufweisen. Somit wird durch die Einführung von K3E/R14E und asPLB in die Herzmyocyten entweder durch das Adenovirus oder durch die Cotransfektionstechnik die Dauer der diastolischen Ca²⁺-Transienten reduziert. Diese Ergebnisse scheinen die Befunde von MLPKO- im Vergleich zu DKO-Mäusen widerzuspiegeln, wo die Variation der Ca²⁺-Transienten bestätigt, dass die Ablation von PLB mit einer verkürzten Dauer des Ca²⁺-Transienten, einem schnelleren Abklingen und einer beibehaltenen Amplitude einhergeht. Zusammengenommen bestätigen diese Daten, dass K3E/R14E und asPLB die SERCA2a-Aktivität stimulieren, was zu schnelleren Ca²⁺-Transienten in Myocyten führt.
Um zu bestimmen, ob die verstärkte SERCA2a-Aktivität und beschleunigten Ca²⁺-Transienten als Ergebnis der PLB-Mutanten zu einer Änderung des kontrak tilen Verhaltens führen, wird eine Kantendetektion verwendet, um die Kontraktilität von Myocyten zu analysieren. Adulte Kaninchenmyocyten werden mit den adenoviralen Transgenen von LacZ, K3E/R14E oder asPLB infiziert. Nach einer dreitägigen Inkubationszeit gibt es einen signifikanten Unterschied in der Zahl der spontan kontrahierenden Zellen zwischen den verschiedenen Gruppen (LacZ << asPLB < K3E/R14E). Tabelle 2 gibt die Wirkungen von K3E/R14E und asPLB auf die Myocytenkontraktilität an. Wie in der Tabelle gezeigt ist, erhöht K3E/R14E im Vergleich zur LacZ-Kontrolle die fraktionale Verkürzung um 74%, was mit einer 25%igen Abnahme des RT₅₀-Wertes und einer 115%igen Zunahme von +dL/dt einhergeht. Wenn die Myocytenkontraktilität nach einer asPLB-Infektion untersucht wird, zeigt sich, dass die fraktionale Verkürzung der Myocyten signifikant um 57% zunimmt, während die Änderungen in RT₅₀ und +dL/dt nicht signifikant sind. Tabelle 2

*: p < 0,05
**: p < 0,1

Die resultierenden Daten zeigen, dass sich die Zunahme der SERCA2a-Aktivität in einer beschleunigten Relaxation der Myocyten manifestiert. K3E/R14E-infizierte Myocyten zeigen eine verstärkte fraktionale Verkürzung, die eine Zunahme der SR-Beladungen an Ca²⁺ aufgrund der Verstärkung der SERCA2a-Aktivität vermuten lässt. Weiterhin erhöht die K3E/R14E-Infektion die Zahl der spontan kontrahierenden Myocyten, ein Phänomen, das höchstwahrscheinlich mit der erhöhten Menge von oszillierendem Ca²⁺ aufgrund der erhöhten SR-Beladung mit Ca²⁺ verbunden ist. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass K3E/R14E endogenes Wildtyp-PLB in einer Weise beeinflusst, die die Hemmung von SERCA2a signifikant reduziert, und daher eine gegenüber Wildtyp-PLB dominante hemmende Wirkung hat.
Therapeutikum auf Peptidbasis für die Hemmung der PLB-Aktivität
Ein Therapeutikum auf Peptidbasis für die Hemmung der Phospholambanaktivität und eine Verabreichungsweise für ein solches Therapeutikum auf der Basis des Ergebnisses, dass die PLB-Funktion durch Überwältigen von endogenem PLB mit mutanten PLB-Molekülen in dominanter negativer Weise gehemmt werden kann, kann bei versagenden Herzen zu einer verbesserten Funktion führen.
Damit ein Therapeutikum, wie ein Inhibitor der PLB-SERCA2a-Wechselwirkung, ein Targetzellsystem beeinflussen kann, muss es ein Mittel für die Internalisierung durch die Zellmembran in das Cytoplasma aufweisen. Der Modus der Übertragung des Inhibitors kann entweder durch einen Transport oder ein PLB-Peptid auf Penetratinbasis erfolgen, oder er kann auch adenoviralen Transfer oder Transfer auf Lipidvesikelbasis umfassen. Zu diesem Zweck wird eine Verbindung aufgebaut, die aus einer Fusion eines Transportpeptids und eines PLB-Proteinmoleküls besteht. Das Transportpeptid umfasst 16 Reste aus der Sequenz für Antennapedia, ein Drosophila-Transcriptionsfaktorprotein. Das zweite Peptid des Komplexes kann eine verkürzte Sequenz des PLB-Proteins sein. Weiterer therapeutischer Nutzen kann erreicht werden durch Verwendung von Peptiden, die nativem PLB-Protein sowie einer mutanten oder verkürzten Form von PLB-Protein entsprechen.
Eine günstige Funktion des Transportpeptid-PLB-Komplexes ist die Hemmung der Wechselwirkung zwischen PLB und SERCA2a innerhalb von Cardiomyocyten, die bei kranken Herzen zu einer verstärkten Kontraktilität führt. Die Wechselwirkung von PLB mit SERCA2a innerhalb der glatten Muskelschicht, die die Arterien/Arteriolen des Kreislaufsystems umgibt, führt zu einer Gefäßerweiterung und reduziertem Blutdruck. Es gibt also einen doppelten Nutzen der Behandlung von Herzkrankheit, der erste ist eine verstärkte Herzkontraktilität bei versagen den Herzen, der andere ist die Reduktion des Blutdrucks bei Individuen mit Hochdruck. Es wird auch vorhergesagt, dass es eine Hemmung von PLB-Wechselwirkungen mit SERCA-Proteinen anderer Zelltypen geben wird, wie der SERCA1-PLB-Wechselwirkung in Nervengewebe.
Die Einführung des Moleküls in den Blutstrom, der das Herz versorgt, kann am besten unter Verwendung eines Katheters erreicht werden, der sich in der Koronararterie befindet. Wenn sich das Molekül in der extrazellulären Umgebung befindet, die einen Cardiomyocyten umgibt, tritt es schnell in den Cardiomyocyten ein und hemmt die Assoziation von PLB mit SERCA2a. Die Translokationsfunktion kann dem Transportpeptid zugeschrieben werden, das die Fähigkeit aufweist, sich selbst und die daran befestigten "Fracht"-Peptide schnell in rezeptorabhängiger Weise durch die Zellmembranen zu translozieren. Sobald es innerhalb des Cytoplasmas des Cardiomyocyten ist, wirkt das PLB-Fragment als kompetitiver Inhibitor von endogenen PLB-Wechselwirkungen mit SERCA2a.
In Abwesenheit von PLB-Hemmung durch Assoziation pumpt SERCA2a effizienter Ca²⁺ in das SR, wodurch die Fähigkeit der Cardiomyocyten, sich stärker und schneller zu kontrahieren, zunimmt. Eine stärkere Kontraktilität der Cardiomyocyten manifestiert sich in einer stärkeren Kontraktilität des Herzens. In vivo könnte die vorliegende Erfindung als Behandlung für Herzversagen wirken und lässt sich am leichtesten verabreichen und ist am effektivsten bei Patienten, deren Herzen ein linksventrikuläres Unterstützungssystem (LVAD) erfordern oder bereits ein solches implantiert haben.
Die Reste 43 bis 58 von Antennapedia bilden ein gut charakterisiertes Translokationspeptid, das als Transportmethode gut funktioniert. Weitere potentielle Übertragungsverfahren umfassen die Verwendung eines achtästigen Polylysin-Gerüsts, um das Transport- und Frachtpeptid miteinander zu verknüpfen, sind aber nicht auf diese mehrästige Struktur beschränkt. Eine Verbindung, die aus einem Targetpeptid, das an ein PLB-Peptid gebunden ist, als ein langes Peptid besteht, wurde ebenfalls erforscht. Weiterhin wurden mehrere DNA-Konstrukte für die Herstellung von mit Hexahistidin (H6) markiertem Penetratin und rekombinanten Penetratin-PLB-Proteinen in Bakterien unternommen. Die Penetratinpeptide wurden so gestaltet, dass sie sich entweder am Amino- oder am Carboxyterminus des Proteins befanden.
Es hat sich gezeigt, dass das cytoplasmatische Fragment von PLB eine genauso starke Bindungsaffinität zum cytoplasmatischen Teil von SERCA2a hat wie das ganze PLB-Molekül. Daher wird vorhergesagt, dass das PLB-Fragment, sobald sich das Transport-PLB-Molekül innerhalb des Cytoplasmas des Cardiomyocyten befindet, als kompetitiver Inhibitor der endogenen PLB-Wechselwirkung mit SERCA2a wirkt.
Diese Form der Behandlung ist für den Patienten geeignet, der an einer schweren reduzierten Herzpumpfunktion, die einer medizinischen Therapie nicht zugänglich ist, leidet und der mechanische Unterstützungssysteme benötigt, während er auf eine Herztransplantation wartet. Außerdem können die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen für die dominante negative Funktion der PLB-Mutanten bei der Gestaltung und Ausführung der Hochdurchsatz-Screening-Strategien für kleine inhibitorische Moleküle verwendet werden.
Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung veranschaulichen, aber nicht einschränken.
Beispiel 1
Schaffung von Knockout-Mauslinien für die Echokardiographie
Um die strukturellen und physiologischen Merkmale des komplexen in-vivo-Herzversagens-Phänotyps der dilatierten Kardiomyopathie zu analysieren, wurden mehrere Linien von Knockout-Mäusen geschaffen. Dies wurde unter Verwendung eines Doppel-Knockout(DKO)-Mausmodells durchgeführt, das eine homozygote Ablation von zwei unabhängigen muskelspezifischen Genen beherbergt. Für diese Strategie wurden PLB^–/– (phospholambandefiziente) homozygote Mäuse mit MLP^–/– (MLP = muskelspezifisches LIM-Protein) homozygoten Mäusen gepaart. Die F1-Jungtiere, die aus einer homozygoten Kreuzung MLP^–/– × PLB^–/– entstanden, wurden dann miteinander gepaart, um den doppelt heterozygoten Genotyp MLP^+/–, PLB^+/– zu schaffen. Die F2-Nachkommen wurden durch eine doppelt heterozygote Paarung MLP^+/–/PLB^+/– erzeugt, wobei Mäuse entstanden, die homozygot in Bezug auf das mutante MLP-Allel und heterozygot in Bezug auf das mutante PLB-Allel waren oder die MLP-Wildtyp und heterozygot in Bezug auf das mutante PLB-Allel waren. Die F3-Nachkommen wurden durch Paarungen der Art MLP^–/–/PLB^+/– erzeugt, wobei Wurfgeschwister mit MLP^–/–/PLB^+/– (DKO), MLP^–/–/PLB^+/+ (MLPKO) und MLP^+/+/PLB^–/– (MLPKO/PLBhet) entstanden, oder durch Paarungen der Art MLP^+/+/PLB^+/–, wobei Wurfgeschwister mit MLP^+/+/PLB^–/– (PLBKO), MLP^+/+/PLB^+/+ (Wildtyp) und MLP^+/+/PLB^+/– (PLBhet) entstanden. Der Genotyp der genetisch gezielt durchgeführten Kreuzungen wurde durch PCR von genomischer DNA, die aus Schwanzbiopsien isoliert wurde, bestimmt.
Um die hämodynamischen Eigenschaften der verschiedenen Knockout-Mauslinien zu bewerten, wurden bei Versuchstieren, die entweder mit Avertin (2,5%, 20 μl/kg Körpergewicht) oder Xylazin (0,005 mg/g) und Ketamin (0,1 mg/g) anästhetisiert wurden, Herzkatheter angelegt und eine Echokardiographie durchgeführt. Transthorax-M-Moden-Echokardiographie-Kurven deuteten darauf hin, dass MLPKO-Mäuse eine Kammerdilatation mit reduzierter Wandbewegung aufwiesen, was eine deprimierte Herzfunktion und erhöhte Wandspannung anzeigt, während die Kammergröße und Herzfunktion bei den DKO-Mäusen normal sind. Grundlinienparameter für Wildtyp (WT), n = 7, MLPKO, n = 8, DKO, n = 9, und PLBKO, n = 5, sind in den 2a–d gezeigt. Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts ausgedrückt. MLPKO gegenüber anderen Gruppen; *: p < 0,5, **: p < 0,001, WT vs. DKO; #: p < 0,01. In den 2e–h erfolgte eine hämodynamische Beurteilung der β-adrenergischen Reaktivität auf progressive Infusion von Dobutamin, wobei WT (☐), n = 7, MLPKO (•), n = 8, und DKO (o), n = 9, Mäuse. MLPKO vs. WT oder DKO; #: p < 0,05, +: p < 0,01, *: p < 0,001, WT vs. DKO; ∋: p < 0,01.
Beispiel 2
Calciumtransientenanalyse
Um die Wirkung der Hemmung von PLB auf den SR-Calciumgehalt und Calciumtransienten zu bewerten, wurden Myocyten aus der rechten Kammerwand der Wildtyp- oder Knockout-Mäuse isoliert. Um die Veränderungen im intrazellulären Calcium zu überwachen, wurden die isolierten Myocyten 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit einem calciumempfindlichen Farbstoff, Fluo-3-AM (1 μg/ml), inkubiert. Dann wurden die Myocyten in eine Gewebekammer auf dem Objekttisch eines gestürzten Mikroskops übertragen und kontinuierlich mit einer Frequenz von 1 Hz stimuliert, um einen konstanten Grad der SR-Calciumbeladung aufrechtzuerhalten. Um die zelluläre Fluoreszenz zu messen, wurden die Myocyten mit einer Anregungswellenlänge von 480 nm beleuchtet. Veränderungen in der Fluoreszenz wurden bei 510 nm unter Verwendung eines Mikrofluorometers (FM-1000; Solamere Technologies) überwacht und für die spätere Analyse unter Verwendung der Software Cellsoft (D. Bergman; University of Calgary) digital aufgezeichnet. Fluoreszenzwerte wurden unter Verwendung der folgenden Gleichung geeicht: [Ca2+]i = KD(F – Fmin)/(Fmax – F) (1)mit einem angenommenen K_D von 864 nM, wobei F die experimentell abgeleiteten Fluoreszenzwerte sind. Für jeden Myocyten wurde Fmax bestimmt, indem man 10 μM Ionomycin zu der Superfusionslösung gab, und Fmin wurde bestimmt, indem man 4 mM MnCl₂ zu der Superfusionslösung gab.
Der SR-Calciumgehalt der isolierten Myocyten wurde unter Verwendung einer Standard-Coffein-Impuls-Vorschrift bewertet. Nach stabilen Aufzeichnungen von Calciumtransienten wurde ein 20 Sekunden langer Impuls von 10 mM Coffein auf den Myocyten angewendet. Diese Vorschrift führte zu einem schnellen coffeininduzierten Transienten, der langsam wieder zurück auf Grundlinienwerte abklang. Der SR-Calciumgehalt wurde definiert als die integrierte Fläche dieses coffeinin duzierten Calciumtransienten. 3a veranschaulicht den repräsentativen intrazellulären Calciumtransienten bei den WT-, MLPKO- und DKO-Myocyten. MLPKO-Myocyten zeigten eine gedämpfte Amplitude von Calciumtransienten mit normalen Werten der diastolischen Calciumkonzentration. DKO-Myocyten zeigten den Calciumtransienten mit einer verkürzten Dauer, einem schnelleren Abklingen und einer beibehaltenen Amplitude. Wie in 3b gezeigt ist, war die Amplitude des Calciumtransienten in MLPKO-Myocyten signifikant gedämpft und in DKO-Myocyten wiederhergestellt. 3c zeigt, dass die intrazelluläre diastolische Calciumkonzentration unter den drei verschiedenen Gruppen von Myocyten nicht unterschiedlich war. In 3d war der SR-Calciumgehalt in MLPKO-Mäusen signifikant gesenkt und nahm in DKO-Mäusen im Vergleich zu WT-Mäusen zu. In 3e zeigte repräsentatives quantitatives Immunoblotting, dass die MLP-Defizienz nicht mit irgendwelchen signifikanten Veränderungen der Proteinwerte von SERCA2a, PLB und Calsequestrin assoziiert war.
Beispiel 3
Konstruktion von mutantem PLB-Adenovirus und Genübertragung
I.M.A.G.E.-Konsortium-cDNA-Klone, die humanes PLB codieren, waren über Genome System, Inc. verfügbar. Das DNA-Fragment, das die gesamte codierende Sequenz von PLB beherbergt, wurde in pBluescriptII-KS-Vektor, einen wohlbekannten E.-coli-Klonierungsvektor (ATCC-Zugriffs-Nr. 87047), subkloniert. Eine Sense-Mutation (Val49Ala) wurde eingeführt, wobei man ein von Stratagene kommerziell erhältliches, auf PCR beruhendes Mutagenesesystem verwendete. Rekombinantes Adenovirus, das Wildtyp- und mutantes humanes PLB exprimiert, wurde durch homologe Rekombination zwischen Plasmid pJM17 und einem Shuttle-Plasmid, das RSV-Promotor- und SV40-Poly-A-Sequenzen enthält, erzeugt. Das konzentrierte Viruspräparat wurde unter Verwendung einer Standardvorschrift titriert. Die effiziente in-vivo-Herzgenübertragung wurde durchgeführt, indem man die Adenovirusvektoren in das Herz einer 1 Tag alten neonatalen Maus injizierte. Die Myocyten wurden 4 Wochen nach der Injektion in die Mäuseherzen isoliert, und die Zellverkürzung wurde gemessen. Myocyten, die die mutanten Transgene beherbergen, wurden durch Cotransfektion von adenoviralen Vektoren, die GFP als Marker exprimierten, identifiziert.
Bezugsbeispiel 4
Konstruktion eines PLB-Inhibitor-Transportpeptid-Komplexes
Ein PLB-Inhibitormolekül wurde hergestellt, indem man ein Transportpeptid und ein PLB-Protein indirekt an ein Polylysingerüst band. Alternativ dazu hätte das PLB-Molekül auch als einzelnes langes Peptid hergestellt werden können, das aus einer Transportsequenz besteht, die in Tandemanordnung an die Frachtpeptidsequenz gebunden ist. Das Transportpeptid bestand aus den Resten 43 bis 58 von Antennapedia (SEQ ID Nr. 7), einem Drosophila-Transcriptionsfaktorprotein. Das Frachtpeptid wurde unter Verwendung der ersten 16 Reste von PLB (SEQ ID Nr. 8) abgeleitet. Es ist wichtig festzustellen, dass diese Frachtsequenz auch von einem beliebigen Segment von Wildtyp-PLB oder mutantem PLB hätte abgeleitet sein können.
Das PLB-Inhibitormolekül wurde konstruiert, indem man 4 Transportpeptide mit 4 Peptiden, die den ersten 16 Resten von PLB entsprechen, verknüpfte. Der Gerüst-Linker war ein achtästiges Lysin, das üblicherweise bei der Synthese eines multiplen antigenen Peptids (MAP) verwendet wird. Die ersten 4 Äste des MAP-Harzes wurden verwendet, um das Antennapedia-Peptid zu synthetisieren. Die nächsten 4 Äste wurden dann von den Schutzgruppen befreit und als Ausgangspunkt für die Synthese des PLB-Frachtpeptids verwendet. Dieser besondere PLB-Inhibitor, der für die Anfangscharakterisierung verwendet wurde, wies also 4 Äste des Antennapedia-Peptids und 4 Äste des PLB-Frachtpeptids auf. Alternativ dazu hätte der PLB-Inhibitor auch als einzelnes Peptid, wobei das Fracht- und das Transportpeptid durch eine einzelne Peptidbindung aneinander gebunden sind, oder als Fracht- und Transportpeptid, die durch eine Disulfidbindung aneinander gebunden sind, konstruiert werden können. Das PLB-Inhibitormolekül wurde effizient in isolierte neonatale Rattencardiomyocyten transloziert und zeigte eine resultierende verstärkte Kontraktilität der Zelle; die Ergebnisse sind in den 5a und b zu sehen. Myocyten, die die V49A-PLB-Punktmutation überexprimierten, zeigten eine erhöhte Kontraktilität, während Myocyten, die das Wildtyp-PLB überexprimierten, im Vergleich zu nichtinfizierten Myocyten eine reduzierte Kontraktilität zeigten.
Beispiel 5
Penetratinpeptide TAT und ANT
Zellkonzentrationsstudien wurden durchgeführt, um die Fähigkeit von zwei Peptiden auf Penetratinbasis, zwei mutanten PLB-Penetratin-Peptiden und zwei multiplen Antigenpeptiden (MAP), den Kontraktionszyklus von isolierten Maus-Cardiomyocyten zu stärken, zu bewerten. Die zwei Peptide auf Penetratinbasis umfassen PLB-ANT (Seq. ID. Nr. 10) und TAT-PLB (Seq. ID. Nr. 11), die jeweils einen 20-Reste-Teil der PLB-Sequenz aufweisen, der entweder an das 5'-Ende von ANT (Seq. ID. Nr. 14) oder an das 3'-Ende von TAT (Seq. ID. Nr. 15) gebunden ist. Die zwei mutanten PLB-Peptide, mutantes-PLB-ANT (Seq. ID. Nr. 12) und TAT-mutantes-PLB (Seq. ID Nr. 13), weisen eine S16E-Mutation der 20-Reste-PLB-Sequenz auf. Zu den multiplen Antigenpeptiden gehören MAP mit 8 Penetratin(ANT)-Domänen sowie MAP mit 4 Penetratindomänen und 4 PLB-Domänen.
Jedes der Penetratin-PLB-Peptide wurde bewertet, um ihre Fähigkeit, den Kontraktionszyklus von isolierten Maus-Cardiomyocyten zu stärken, zu messen, wobei die Idee dahinter war, dass das Penetratin-PLB-Peptid als dominanter negativer Inhibitor der PLB-SERCA2a-Wechselwirkung wirken würde. Die Ergebnisse der Wirkung des TAT-PLB-Peptids auf die isolierten Cardiomyocyten sind in Tabelle 3 gezeigt. Für diese Daten wurden Tests an mehreren Gruppen von Cardiomyocyten wiederholt, um die relative Längenänderung über den Kontraktionszyklus hinweg mit dem TAT-PLB-Peptid (Proben 1–7) und ohne das Peptid (Kontrollen 1–8) zu bestimmen. Jede der Proben enthielt eine hinzugefügte Konzentration von 10 μM des TAT-PLB-Peptids, während die Kontrollen kein hinzugefügtes Peptid enthielten.
Tabelle 3
Messungen wurden alle 20 Millisekunden durchgeführt, und die Längeneinheit war willkürlich, lag jedoch im Allgemeinen in der Größenordnung von einer vollständigen Zelllänge. Die prozentuale Kontraktion wurde berechnet als (maximale Länge minus minimale Länge) dividiert durch die maximale Länge. Eine Auftragung von Zeit gegen Länge ergab eine U-förmige Kurve, aus der die am meisten linearen Segmente ausgewählt wurden, wobei die linke Seite des "U" die Kontraktion darstellt und die rechte Seite die Relaxation darstellt. Die r2-Spalte zeigt, wie gut die Daten zur Kurve passen, wobei 1,0 eine vollkommene Übereinstimmung darstellt.
Während es einen Trend hin zu einer größeren, schnelleren Kontraktion im Myocyten zu geben schien, wurde durch T-Test-Analyse aufgrund der hohen Variabilität der Daten kein statistischer Unterschied identifiziert.
Beispiel 6
Hexahistidin-markiertes Penetratin
Mehrere DNA-Konstrukte wurden erzeugt, um Hexahistidin(H6)-markiertes Penetratin und rekombinante Penetratin-PLB-Proteine in Bakterien herzustellen. Unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Expressionsvektors, pRSET (Invitrogen), wurde das rekombinante Protein H6-ANT (Seq. ID. Nr. 16) erzeugt. Während dieses rekombinante Protein kein PLB gebunden hatte, wurde es so gestaltet, dass es Epitopenmarker aufwies, die verwendet wurden, um das Protein nachzuweisen, während es in das Herz eintrat. Ebenfalls exprimiert wurde eine Variation von H6-ANT, die die PLB-Sequenz enthielt, H6-wtPLB-ANT (Seq. ID. Nr. 17), neben einem H6-PLB(S16E-Mutante)-ANT-Protein und einem H6-PLB(V49A-Mutante)-ANT-Protein (SEQ ID. Nr. 18 bzw. 19). H6-β-Galactosidase-ANT, H6-TAT und H6-β-Galactosidase-TAT wurden auf niedrigeren Niveaus ebenfalls exprimiert (Sequenzen nicht aufgeführt). Ein nichtfunktionelles ANT-Penetratin mit zwei Mutationen an den Resten 68 und 67, wo Trp zu Phe mutiert war, wurden als negative Kontrolle für die anderen drei Penetratin-PLB-Proteine hergestellt.
Um die Wirkung dieser rekombinanten, auf Penetratin beruhenden Proteine auf die Herzkontraktion zu messen, wurden einer Maus intraperitoneal 2 mg des H6-ANT-Peptids injiziert. Einer zweiten Maus wurden intraperitoneal 2 mg des H6-ANT-Mutantenproteins injiziert. Nach einer Inkubationszeit von 3 Stunden wurden die Mäuse getötet, und die Herzen wurden für eine Analyse entnommen. Das Blut im Herzen wurde entfernt, indem man Flüssigkeit rückwärts durch den Aortenbogen presste. Jedes Herz wurde in atriales Gewebe, linksventrikuläres Gewebe und rechtsventrikuläres Gewebe seziert. Das gesamte Gewebe wurde extensiv in einer physiologisch ausgewogenen PBS-Lösung gewaschen und in flüssiges Stickstoff schockgefroren. Dann wurde das Gewebe 10 Minuten lang in 8 M Harnstoff, 2% Triton-X100^TM, lysiert, und gleiche Mengen der Überstände wurden einer Elektrophorese auf 15% PAGE unterzogen. Die Banden wurden auf eine PVDF-Membran übertragen. Die Membranen wurden mit Anti-His-Antikörper markiert, um zu identifizieren, ob das Lysat das epitopenmarkierte Protein enthielt.
Die hier offenbarte Erfindung gibt ein Verfahren zur Behandlung von Herzversagen durch die Hemmung oder Veränderung der Wechselwirkung zwischen Phospholamban und Ca²⁺-ATPase des sarkoplasmatischen Retikulums innerhalb der Cardiomyocyten an.
Sequenzprotokoll

Claims

Phospholamban-Molekül mit einer Mutation, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Mutation um S16E handelt.
Verwendung eines Phospholamban-Moleküls gemäß Anspruch 1 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Herzversagen.