ES2273408T3

ES2273408T3 - Metodo para introducir medicamentos y acidos nucleicos en el musculo esqueletico.

Info

Publication number: ES2273408T3
Application number: ES98909691T
Authority: ES
Inventors: Iacob Mathiesen; Terje Lomo
Original assignee: Inovio AS
Current assignee: Inovio AS
Priority date: 1997-04-03
Filing date: 1998-04-03
Publication date: 2007-05-01
Anticipated expiration: 2018-04-03
Also published as: JP2006061701A; DE69835761T2; NO327806B1; CA2285056C; CN1198665C; IL132103A0; US6110161A; KR20010005932A; EP1023107B1; EA002087B1; KR100427786B1; AU6990698A; DE69835761D1; AU733628B2; ATE337794T1; WO1998043702A2; NZ337853A; CN1276740A; JP2001520537A; NO994820D0

Abstract

El uso de un ácido nucleico unido de forma operable a un promotor que es capaz de dirigir la expresión de una proteína codificada por dicho ácido nucleico en la fabricación de un medicamento para usar en un método para repartir dicho ácido nu- cleico al músculo esquelético de un mamífero, en el que a) dicho ácido nucleico va a ser inyectado en un músculo esquelético de dicho mamífero; b) los electrodos se van a colocar cerca del sitio de inyección de mane- ra que la corriente que viaja a través de los electrodos pase a través del sitio de inyección, y c) el músculo se va a estimular eléctricamente con una corriente eléctri- ca que tiene una intensidad de campo de entre 5 V/cm y 200 V/cm.

Description

Método para introducir medicamentos y ácidos nucleicos en el músculo esquelético.

La presente invención está relacionada con un método para hacer al músculo esquelético semipermeable a medicamentos farmacéuticos y ácidos nucleicos. Más específicamente, se hace al músculo esquelético semipermeable estimulando eléctricamente el músculo a bajas intensidades de campo seguido de una inyección de medicamentos farmacéuticos y ácidos nucleicos.

Fundamentos técnicos

Los científicos están descubriendo continuamente genes que son responsables de muchas enfermedades humanas, tales como genes responsables de algunas formas de cáncer de mama, cáncer de colon, distrofia muscular y fibrosis quística. Además, los científicos están descubriendo continuamente genes que codifican antígenos bacterianos y virales (por ejemplo, proteínas de cápside viral). A pesar de estos nuevos descubrimientos, un obstáculo principal que se presenta a la profesión médica es como repartir de forma segura cantidades eficaces de estos agentes a pacientes para tratar enfermedades o para inmunización genética.

Habitualmente, la mayoría de los agentes farmacéuticos se toman de forma oral o intravenosa. Los medicamentos orales e intravenosos y los métodos de reparto de genes, sin embargo, tienen diversas deficiencias. Primero, un alto porcentaje de medicamentos repartidos de forma oral o intravenosa son degradados por el cuerpo antes de llegar al órgano o células diana. Los ácidos y enzimas en el estómago e intestino, por ejemplo, pueden romper muchos medicamentos farmacéuticos. De forma similar, los genes pueden destruirse rápidamente mediante las proteínas que se encuentran en la sangre e hígado que rompen ADN. De forma adicional, los medicamentos y genes repartidos de forma intravenosa son aislados a menudo por el hígado o sistema inmune antes de llegar al órgano o células enfermos. Segundo, el reparto de medicamentos y genes orales e intravenosos no es específico. Esto es, el medicamento o gen se reparte tanto a células diana como no diana.

El músculo esquelético es un candidato prometedor para el reparto de medicamentos, terapia génica e inmunización genética. Primero, el músculo esquelético constituye más del 50% de la masa corporal de un ser humano, siendo la mayor parte fácilmente accesible en comparación con otros tejidos y órganos del cuerpo. Segundo, hay numerosos trastornos heredados y adquiridos, tales como distrofia muscular Duchenne (DMD), diabetes mellitus, hiperlipidemia y enfermedad cardiovascular, trastornos que son buenos candidatos para el reparto de medicamentos y genes en el músculo. Tercero, el músculo es un sitio ideal para la inmunización genética porque es fácilmente accesible y las proteínas hechas en el músculo se secretan, provocando así una respuesta inmune. Finalmente, las células del músculo esquelético no se dividen. Por lo tanto, las células del músculo esquelético son capaces de expresar una proteína codificada por un gen durante un periodo de tiempo más largo que el que se esperaría de otros tipos de células que se dividen continuamente. Ya que la proteína se expresa durante un tiempo más largo, serían necesarios menos tratamientos.

Habitualmente, sin embargo, no hay un método no viral para repartir eficazmente medicamentos farmacéuticos y ADN en el músculo esquelético in vivo. Hay varios métodos conocidos en la técnica para transferir medicamentos farmacéuticos y ADN en el músculo esquelético, tal como la inyección intramuscular de ADN. La aplicabilidad clínica de la inyección directa en el músculo, sin embargo, está limitada principalmente por la baja eficacia de transfección, típicamente menos del 1% de eficacia de transfección. Se ha demostrado que la eficacia de transfección puede mejorarse si las inyecciones de ADN se hacen en músculo de regeneración. La inyección se induce tres días antes de la inyección de ADN con el medicamento Bivucaina. Aunque la inyección en los músculos de regeneración inducida por Bivucaina muestra mayor eficacia, el método tiene aplicabilidad limitada en seres humanos por el grave daño provocado al músculo.

A partir de lo precedente, se apreciará que sería un avance en la técnica proporcionar un método no viral para repartir medicamentos farmacéuticos y ADN solo a órganos y células enfermas. También sería un avance en la técnica proporcionar un método de electroporación para repartir medicamentos farmacéuticos y ADN directamente en el músculo esquelético. Aún sería otro avance en la técnica si el método de electroporación pudiera repartir cantidades terapéuticamente eficaces de medicamentos farmacéuticos y ADN en el músculo esquelético en múltiples sitios a la vez. Sería un avance adicional si el método permitiera que se regulara las eficacias del reparto.

Dicho método se describe en este documento.

Breve resumen de la invencion

La presente invención proporciona un método para repartir o transferir medicamentos farmacéuticos y ADN en el músculo esquelético como se especifica en la reivindicación 1, sin estar atado por la teoría, el método está pensado para ser similar a la electroporación. La electroporación funciona según el principio de que las células actúan como un condensador eléctrico incapaz generalmente de pasar corriente. Someter células a un campo eléctrico de alto voltaje, por lo tanto, crea estructuras permeables transitorias o microporos en la membrana celular. Estos poros son suficientemente grandes para permitir a los medicamentos farmacéuticos, ADN y otros compuestos polares, acceder al interior de
la célula. Con el tiempo, los poros en la membrana celular se cierran y la célula se vuelve impermeable una vez más.

La electroporación convencional, sin embargo, emplea altas intensidades de campo de 0,4 a varios kV/cm. En contraste a la electroporación convencional, la intensidad de campo usada en la presente invención oscila de aproximadamente 25 V/cm a 250 V/cm. Estas menores intensidades de campo están pensadas para provocar menor daño en el músculo sin sacrificar, y de hecho aumentando, las eficacias de transfección. Además, usando la presente invención, las eficacias de transfección pueden regularse fuertemente alterando parámetros tales como frecuencia, duración del pulso y número de pulsos.

El aumento en al eficacia de transfección de ADN se observa sólo si el músculo se estimula eléctricamente de forma inmediata o poco después de la inyección de ADN. Así, la calidad semipermeable del tejido inducido por la estimulación es reversible. Además, es dependiente de la corriente a través del músculo; la actividad inducida a través del nervio no afecta a la eficacia de transfección.

Una vez transfectadas, la células musculares son capaces de expresar las proteínas codificadas por el ácido nucleico. Además, el método de transfección de la presente invención puede usarse, por ejemplo, para transfectar vectores de expresión para la inmunización genética (es decir, vacunas de ADN). En una realización, se transfectaron conejos con un plásmido que contenía el cADN para agrina de rata. Los músculos transfectados produjeron y secretaron proteína agrina. Diecinueve días después de la transfección, el suero de conejo contenía anticuerpos significativos contra la agrina de rata.

En una segunda realización, se transfectaron ratones y ratas usando el método de la presente invención con uno o más de tres diferentes vectores de expresión eucarióticos que contenían las secuencias de codificación para DH-CNTF, una variante agonista del factor neurotrófico ciliar humano, AADH-CNTF, una variante antagónica del factor neurotrófico ciliar humano y sec-DHCNTF, una forma secretada de DH-CNTF. Los músculos o bien no se estimularon eléctricamente o se estimularon inmediatamente después de la inyección de ADN. Se recogió sangre a diversos puntos de tiempo y se determinaron valoraciones del anticuerpo. Tanto en ratas como en ratones, la estimulación eléctrica inmediatamente después de la inyección de ADN llevó a aproximadamente 5 a 10 veces más de valoraciones de anticuerpo que la inyección simple de ADN.

El método de transfección de la presente invención puede usarse además para repartir sistémicamente proteínas para tratar enfermedades. En una realización preferida, un plásmido de ADN que abriga el gen eritropoyetina (EPO) se inyectó en el músculo esquelético y se estimuló según el método de la presente invención. Los controles o bien no se estimularon o se transfectaron con un vector de control que no abrigaba el gen EPO. Después de 14 días, solo el ratón transfectado con EPO según el método de la presente invención presentó un hematocrito aumentado que indica que los músculos transfectados fueron capaces de producir y secretar en la corriente sanguínea cantidades sustanciales de EPO.

También pueden transfectarse ácidos no nucleicos por el método de la presente invención. En una realización, se inyectó dextrano conjugado con rodamina en el músculo seguido de estimulación eléctrica. Tres a cinco días después, los músculos se congelaron en nitrógeno líquido y se seccionaron en un criostato. Se observó fluorescencia en las células inyectadas y estimuladas, indicando que el dextrano conjugado con rodamina fue capaz de entrar y permanecer en las células musculares.

Estos y otros objetos y ventajas de la presente invención serán evidentes en referencia a los dibujos y gráficos que la acompañan y leyendo la siguiente descripción detallada y reivindicaciones añadidas.

Compendio de los dibujos

Una descripción más particular de la invención descrita brevemente antes, se proporcionará en referencia a los dibujos y gráficos añadidos. Estos dibujos y gráficos solo proporcionan información que afecta a las realizaciones típicas de la invención y no tienen por lo tanto que considerarse limitantes de su alcance.

Figura 1 - ilustra gráficamente el método para repartir medicamentos farmacéuticos y ADN en el músculo esquelético de la presente invención.

Figura 2 - es una ilustración gráfica de una estimulación eléctrica repartida según el método de la presente invención.

Figura 3 - ilustra soportes totales de músculos que se ha inyectado con 50 \mul de disolución de ADN plasmídico Lac Z-RSV a una concentración de 1 \mug/\mul. Los músculos en 3a y 3b se sacaron 15 días después de la inyección de ADN. Los músculos en 3c y 3d se sacaron 7 días después de la inyección de ADN. Todos los músculos son pares de la misma rata.

Figura 4 - dibuja un músculo entero y una rodaja de 1 mm de un músculo transfectado. La mancha oscura indica o-nitrofenil-b-D-galactopiranósido (ONPG) que se ha catalizado mediante \beta-galactosidasa en el músculo para dar un precipitado oscuro. Las flechas ilustran las fibras musculares que se transfectaron con éxito usando el método de la presente invención.

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Figura 5 - incluye el número medio de fibras transfectadas de cada grupo de músculos esqueléticos que se muestran en la Figura 3.

Figura 6 - es un gráfico de barras que ilustra las fibras medias transfectadas de músculos procedentes de diversos experimentos diferentes y diversos lotes diferentes de ADN agrupados juntos. En las columnas marcadas SOL S y EDL S, los músculos (16 en cada grupo) se han estimulado directamente después de la inyección de ADN. En las columnas marcadas SOL NS y EDL NS, los músculos (10 en cada grupo) se han estimulado mediante el nervio, no se han estimulado en absoluto o se han estimulado directamente 10 minutos antes de la inyección de ADN.

Figura 7 - es un gráfico que ilustra el número de fibras musculares esqueléticas transfectadas frente al log de la frecuencia de estimulación. La duración de la serie de estimulación se mantuvo constante en 1 segundo.

Figura 8 - es una fotografía de músculos transfectados a partir de la que se generaron los datos de la Figura 7.

Figura 9 - ilustra los resultados alcanzados cuando soportes enteros de músculos se transfectaron según el método de la presente invención usando dos electrodos diferentes.

Figura 10 - es un gráfico que ilustra el número de fibras musculares esqueléticas transfectadas con frecuencia aumentada comparado con número de pulsos aumentados.

Figura 11 - es una ilustración gráfica del número de fibras musculares esqueléticas transfectadas frente al número de pulsos a frecuencia constante.

Figura 12 - es un gráfico que ilustra la actividad media de luciferasa frente al número de pulsos.

Figura 13 - es un gráfico que ilustra la dependencia del voltaje del método de estimulación de la presente invención. La Figura 13a ilustra la actividad de luciferasa de músculos estimulados con voltajes variables. La Figura 13b ilustra la actividad media de luciferasa de músculos estimulados con una amplitud por encima de 13 voltios y por debajo de 5 voltios.

Figura 14 - es un gráfico que ilustra el efecto de la duración de pulso en la eficacia de transfección.

Figura 15 - es un gráfico de barras que ilustra una comparación de las eficacias de transfección para duraciones variables de pulso y números de pulso.

Figura 16 - es un gráfico de barras que ilustra el efecto de la concentración de ADN en la eficacia de transfección.

Figura 17 - es una fotografía de músculos transfectados que ilustran el daño provocado por la estimulación y regeneración del músculo después de un corto periodo de tiempo. La Figura 17a ilustra un músculo inyectado que no se estimuló. La Figura 17b ilustra el daño muscular siguiente a la estimulación del músculo. La Figura 17c ilustra el músculo estimulado bajo condiciones de estimulación más duras. La Figura 17d ilustra que los músculos estimulados bajo las condiciones de los músculos en 17c se regeneran y reparan completamente después de 14 días. La Figura 17e ilustra músculos transfectados con proteína fluorescente verde (GFP). La Figura 17f ilustra que las fibras transfectadas pueden verse en la vecindad del área dañada.

Figura 18 - es una fotografía de células teñidas con anticuerpos policlonales anti-agrina derivados de un conejo genéticamente inmunizado con un vector de expresión codificado para la agrina de rata usando la técnica de estimulación de la presente invención.

Figura 19 - son gráficos que ilustran la inmunización genética mejorada de ratones y ratas usando la técnica de estimulación de la presente invención frente a la inyección de ADN desnudo.

Figura 20 - es una fotografía de músculos transfectados con dextrano conjugado con rodamina y proteína fluorescente verde. Arriba: fluorescencia de rodamina procedente del dextrano conjugado con rodamina. En medio: la misma sección que antes pero con filtros que revelan fluorescencia GFP. Abajo: teñido de hematoxilina y eosina de una sección vecina.

Descripcion detallada de la invencion

La presente invención está dirigida a un método nuevo para aumentar la permeabilidad del tejido muscular esquelético, permitiendo así a los ácidos nucleicos unidos de forma operable a un promotor capaz de dirigir la expresión de una proteína codificada por dicho ácido nucleico, entrar o transfectar las células. El método de la presente invención pasa una cantidad predeterminada de corriente eléctrica a través del tejido muscular esquelético. A diferencia de los métodos de electroporación descritos anteriormente, sin embargo, la presente invención se caracteriza por la baja intensidad de campo usada, a saber entre 5 V/cm y 200 V/cm, y la cantidad de daño que se da. Otros parámetros tales como el número de series, frecuencia, número de pulsos y duración de pulsos, puede variarse para regular la cantidad de ácido nucleico repartido.

Como se ilustra en la Figura 1, generalmente el músculo esquelético está expuesto y una cantidad predeterminada de una molécula se inyecta en el músculo. En una realización, el ADN se disuelve en cloruro sódico al 0,9% (NaCl). El disolvente exacto, sin embargo, no es crítico en la invención. Por ejemplo, es bien conocido en la técnica que otros disolventes tales como sacarosa son capaces de aumentar la absorción de ADN en el músculo esquelético. Otras sustancias también pueden co-transfectarse con la molécula de interés por una variedad de razones beneficiosas. Por ejemplo, P188 (Lee, et al. PNAS., 4524-8, 10, 89 (1992)), que se conoce por sellar membranas electropermeabilizadas, puede afectar beneficiosamente a las eficacias de transfección aumentando el grado de supervivencia de las fibras transfectadas.

Continuando con la referencia a la Figura 1, los electrodos se colocan en el músculo, separados aproximadamente 1-4 mm, cerca del área donde se inyectó la molécula. La posición o diseño exacto de los electrodos no es crítica mientras se permita a la corriente pasar a través de las fibras musculares en perpendicular a su dirección en el área de la molécula inyectada.

Una vez que los electrodos están en posición, el músculo se electropora o estimula. Como se ilustra en la Figura 2, la estimulación se da como un pulso bipolar cuadrado que tiene una amplitud y duración predeterminadas. Para optimizar las eficacias de transfección, estos parámetros se han variado ampliamente y las eficacias de transfección se han comparado. Por ejemplo, los voltajes han oscilado de aproximadamente 0 a 50 voltios; las duraciones de pulso han oscilado de 5 \mus a 5 ms; el número de pulsos han oscilado de un solo pulso a 30.000 pulsos; y la frecuencia de pulso dentro de las series han oscilado de 0,5 Hz a 1000 Hz.

La conclusión a partir de estos resultados es que mientras la intensidad de campo esté por encima de aproximadamente 50 V/cm, los otros parámetros pueden variarse dependiendo de las condiciones experimentales deseadas. Como no se detectó un límite superior, las eficacias de transfección efectivas se observaron con intensidades de campo mucho mayores. La intensidad de campo de la estimulación puede calcularse usando la fórmula:

E=V/(2r In(D/r)),

que da el campo eléctrico entre cables si D>>r. En la fórmula, V = voltaje = 10 V, D = distancia entre centros de los cables = 0,1-0,4 cm, r = diámetro del electrodo = 0,06 cm. Véase Hofmann, G.A. Cells in electric fields. In E. Neumann, A.E. Sowers, & C.A. Jordan (Eds.) Electroporation y electrofusion in cell biology (págs. 389-407). Plenum Publishing Corporation (1989). A 10 voltios, la intensidad de campo está entre 163 V/cm-43 V/cm (de 0,1 a 0,4 cm entre electrodos, respectivamente). Como D no es mucho mayor que r, puede ser más apropiado usar la fórmula para campos eléctricos entre placas paralelas grandes:

E=V/D

Esto da una intensidad de campo similar de entre 100 V/cm-25 V/cm (de 0,1-0,4 cm entre electrodos, respectivamente). Se apreciará que la intensidad de campo, además de otros parámetros, está afectada por el tejido a transfectar, y así pueden variar las condiciones óptimas. Usando los parámetros dados en la presente invención, sin embargo, los parámetros óptimos pueden obtenerse fácilmente por un experto en la técnica.

Como se ilustra en las Figuras 3 y 5-8, el método de la presente invención aumenta dramáticamente la eficacia del reparto de medicamento y ADN en el músculo esquelético. En una realización, se inyectaron músculos soleus o EDL de rata con plásmido de ADN que contenía el gen \beta-galactosidasa (lac Z). El gen \beta-galactosidasa da una proteína capaz de convertir un sustrato incoloro en un sustrato azul que puede analizarse visualmente o medirse espectrofotométricamente. La Figura 3 representa músculos soleus y EDL representativos que se han transfectado con gen \beta-galactosidasa usando diversos parámetros de estimulación.

La Figura 3 ilustra la eficacia de reparto de ADN mejorada de músculos soleus y EDL que se han transfectado según el método de la presente invención. Los músculos soleus y EDL (n=3) primero se desnervaron seccionando el nervio ciático. Esto se hizo para eliminar cualquier influencia de actividad inducida por el nervio que posiblemente podría contribuir al aumento de la eficacia de transfección observada. Tres días después de desnervar, los músculos se inyectaron con el gen \beta-galactosidasa como se describe anteriormente. Después de la inyección de ADN, los músculos fueron o no tratados o, inmediatamente después de la inyección de ADN, los músculos se estimularon según el método de la presente invención.

Quince días después de la inyección de ADN, los músculos soleus y EDL se analizaron. Como se ilustra en la Figura 3a, las células musculares que se estimularon inmediatamente después de la inyección de ADN (paneles de abajo) contienen más producto azul, indicando que se introdujo más gen \beta-galactosidasa en las células musculares. La eficacia de transfección se cuantificó por conteo de las fibras musculares en una sección transversal de 1 mm del músculo que contenía producto azul como se ilustra en la Figura 4. Como se ilustra por el gráfico de barras en la Figura 5a, el músculo soleus transfectado usando el método de la presente invención mostró un aumento en 47 veces sobre otros músculos que no se estimularon. De manera similar, el músculo EDL transfectado usando el método de la presente invención mostró un aumento de 12 veces sobre músculos que no se estimularon.

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Para determinar si la actividad del nervio afectó a la eficacia de transfección, el método de la presente invención se realizó en músculos soleus y EDL inervados (nervio ciático no seccionado) y desnervado (nervio ciático seccionado), como se describe anteriormente. Como se ilustra en la Figura 3b, quince días después de la inyección de ADN tanto los músculos inervados como desnervados produjeron una generosa cantidad de producto azul, indicando alta eficacia de transferencia del gen \beta-galactosidasa. Como se ilustra en la Figura 5b, la cuantificación de las fibras musculares transfectadas confirman alta eficacia de transfección tanto de los músculos inervados como desnervados.

Para excluir la posibilidad de que la eficacia de transfección aumentada observada fuera debido a la actividad muscular, la estimulación directa del nervio ciático se comparó con la estimulación del músculo (n=5). Si la eficacia de transfección aumentada fuera debida a la actividad muscular, la eficacia de transfección en músculos estimulados por medio del nervio daría eficacias similares a la estimulación muscular directa. Como se ilustra en la Figura 3c, la estimulación directa del nervio no aumentó significativamente las eficacias de transfección en comparación con la estimulación muscular directa. Como se ilustra en la Figura 5c, tanto en los músculos soleus como EDL, se observó una aumento de 10 veces en la eficacia de transfección con estimulación muscular directa.

Como se ilustra en la Figura 3d, la eficacia aumentada es transitoria, coherente con la electroporación. Los músculos estimulados directamente después de la inyección de ADN, manifiestan tinte azul más significativamente que los músculos que se estimularon antes de la inyección de ADN. De hecho, los músculos que se estimularon directamente después de la inyección de ADN manifiestan eficacias de transfección entre 10 y 25 veces mayores que los músculos que se estimularon 10 minutos antes de la inyección de ADN (Figura 5d).

La Figura 6 resume los resultados de la presente invención. Los músculos de diversos experimentos diferentes y diversos lotes diferentes de ADN, se agrupan juntos. En columnas marcadas con SOL S y EDL S, los músculos (16 en cada grupo) se han estimulado directamente después de la inyección de ADN. En las columnas marcadas con SOL NS y EDL NS, los músculos (10 en cada grupo) se han estimulado mediante el nervio, no se han estimulado en absoluto o se han estimulado directamente 10 minutos antes de la inyección de ADN.

El estimulador eléctrico usado para los experimentos se fabricó por FHC (Brunswick, ME 04011). Se han usado estimuladores tanto Pulsar 6bp y el Pulsar 6bp-a/s. El Pulsar 6bp-a/s reparte un voltaje máximo de 150 V y una corriente máxima de 50 mA. El voltaje máximo que puede repartirse requiere una resistencia entre los electrodos de más de 3000 ohms. Los estimuladores se han operado en modo de voltaje constante. Por la baja resistencia en el músculo, los voltajes se han disminuido como se trata en los Ejemplos posteriores. En todos los experimentos, la corriente se ha mantenido a 50 mA.

Se apreciará por un experto en la técnica que pueden emplearse numerosas configuraciones de electrodo distintos. Por ejemplo, la Figura 9 ilustra los resultados obtenidos usando dos configuraciones de electrodos diferentes. El electrodo mostrado en (A) se colocó perpendicular a las fibras musculares. Consistió en un cable de plata con diámetro (d) de 0,6 mm, (C) (este es el electrodo que se usó en todos los experimentos excepto en (B)). Un electrodo se colocó en cada lado del músculo. Un corto segmento en la tercera mitad del músculo es positivo para el teñido de Lac Z (A), indicando expresión localizada. En (B) se usó un electrodo de 1,5 cm hecho de un cable de plata aislado (d=0,3 mm). El aislamiento se eliminó de segmentos cortos (0,5-1,0 mm) a lo largo del cable a intervalos de 2 mm (D). El electrodo se penetró en el músculo en paralelo con las fibras musculares. Uno de los dos cables del electrodo se penetró en el músculo paralelo con las fibras musculares. El segundo cable se colocó en las superficie muscular, también paralelo con las fibras. Ambos tipos de electrodos (Figura 9c y 9d) dieron un número similar de fibras tansfectadas (aproximadamente 250). Usando el electrodo más largo en paralelo con las fibras musculares, sin embargo, dio un teñido de extensión más amplia, indicando una transfección a lo largo de un segmento más largo de las fibras y/o transfección aumentada.

Los músculos se tiñeron para Lac Z en soportes totales por métodos bien conocidos en la técnica. Después del teñido, los dibujos se tomaron con el lado más azul del músculo hacia arriba. Después el músculo se cortó en tres trozos como se ve en la Figura 2. Se contó el número de fibras azules en una rodaja de aproximadamente 1 mm de espesor del centro del músculo (no se contaron por lo tanto, las fibras transfectadas a distancia o próximas a la rodaja). Para contar las fibras transfectadas, las rodajas se diseccionaron en bultos más pequeños de forma que pudieran distinguirse fibras solas bajo un microscopio de disección.

En cuatro (4) músculos, se usó la construcción pSV40-luc. Se inyectó en el músculo soleus, 3 días después los músculos se eliminaron y la actividad de luciferasa se midió usando el Sistema de Ensayo de Luciferasa Promega (Daviset et al., 1993). Los músculos EDL no inyectados de las mismas ratas se usaron como control.

Se apreciará que cualquier ácido nucleico puede usarse con el método de la presente invención, por ejemplo, ADN plasmídico, ADN lineal, ADN antisentido y ARN. En una realización preferida, el ácido nucleico es un vector de expresión de ADN del tipo bien conocido en la técnica. Generalmente, un vector de expresión contiene un promotor unido de forma operable a una molécula de ADN que codifica la proteína de interés seguido por una señal de terminación tal como una señal de poliadenilación. Otros elementos necesarios para el crecimiento bacteriano y el correcto procesado de mamíferos pueden incluirse, tal como la región de codificación de \beta-lactamasa, un origen f1 y un origen de replicación de plásmido derivado de ColE1. Construcciones similares que contienen una región de codificación de ADN de interés pueden construirse por un experto en la técnica.

Como se ilustra en los ejemplos posteriores, pueden repartirse moléculas distintas a ácidos nucleicos al músculo usando la técnica de la presente invención. En una realización, dextrano conjugado con rodamina inyectado en los músculos y estimulado según el método de la presente invención, fue capaz de entrar en las células musculares. Además, pueden introducirse de forma simultánea ácidos nucleicos y proteínas en un músculo electroporado. En una realización, la gran señal de localización nuclear del antígeno-T se mezcló con un plásmido que contenía la región de codificación de ADN para Lac Z. La gran señal de localización nuclear del antígeno T es una proteína que enlaza ADN y facilita su transporte en el núcleo de una célula. En otros sistemas, la gran señal de localización nuclear del antígeno T se ha mostrado que aumenta la eficacia de transfección. Usando el método de la presente invención, la gran señal de localización nuclear del antígeno T aumentó la eficacia de transfección de Lac Z indicando que la proteína fue capaz de enlazar el ADN y entrar en la célula muscular.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se dan para ilustrar diversas realizaciones que se han hecho de la presente invención. Se entiende que los siguientes ejemplos no son detallados o exhaustivos de los muchos tipos de realizaciones que pueden prepararse de acuerdo con la presente invención.

Ejemplo 1 Músculos Estimulados Frente a No Estimulados

Se determinaron eficacias de transfección inyectando músculos esqueléticos con la construcción indicadora pSV40-luc en el músculo soleus. Tres días después de la inyección, los músculos se eliminaron y la actividad de luciferasa se midió usando el Sistema de Ensayo de Luciferasa Promega (Madisokn, WI) según los protocolos del fabricante. Los músculos EDL no estimulados de las mismas ratas se usaron como control. Los datos se muestran debajo en la
Tabla 1.

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TABLA 1

1

Ejemplo 2 Eficacia de Transfección Frente a Frecuencia

Fueron inyectadas ratas con 50 \mul de 1 mg/\mul de un plásmido que portaba el gen lac Z. Inmediatamente después de la inyección, se colocaron electrodos separados entre 2-3 mm y el músculo se estimuló con los siguientes parámetros de estimulación: voltaje = 30 voltios; duración de pulso = 0,2 ms (total 0,4 ms, bipolar); series = 30, 1 segundo encendido 1 segundo apagado durante 1 minuto. Las fibras transfectadas se contaron a partir de una rodaja de 1 mm del centro del músculo. El número de fibras transfectadas se muestra debajo en la Tabla 2 y se ilustra en la Figura 7. Estos datos ilustran también que el método de la presente invención transfecta más que las fibras musculares de la superficie; también se transfectan fibras musculares a varias capas celulares de profundidad.

TABLA 2

2

Ejemplo 3 Eficacia de Transfección Frente a Pulsos

Se inyectaron músculos soleus de ratas Wistar (200-270 gramos) con 50 \mug de plásmido de ADN luciferasa RVS en 50 \mul de NaCl al 0,9%. Poco después de la inyección, los músculos se estimularon eléctricamente usando los siguientes parámetros: 1000 Hz, entre 0 - 1000 pulsos bipolares de 200 \mus de duración en cada serie se aplicaron al músculo 30 veces durante un periodo de 1 minuto. Los músculos se eliminaron 3 días después de la transfección y se congelaron en nitrógeno líquido. Se tomaron secciones de criostato de los músculos y se tiñeron con Hematoxilina, Eosina y Safran (véase Ejemplo 9). Los trozos restantes se homogeneizaron como se describe en el Ejemplo 4 posterior. Como se ilustra en la Figura 10-12, la eficacia de transfección aumentó con el número de pulsos dados al músculo.

Ejemplo 4 Determinación del Efecto del Voltaje en la Eficacia de Transfección

Se inyectaron músculos EDL y soleus de ratas Wistar (245-263 gramos) con 25 \mug de ADN plasmídico de luciferasa conducido por RSV en 50 \mul de NaCl al 0,9%. Poco después de la inyección, los músculos inyectados se estimularon eléctricamente usando los siguientes parámetros: 100 Hz, 100 pulsos bipolares en cada serie de 200 \mus de duración, voltaje variado de entre 0 a 47,5. Los músculos se eliminaron 4 días después de la inyección y estimulación, se homogeneizaron en tampón de ensayo de luciferasa Promega (Madison, WI) y se midió la luminiscencia según los protocolos del fabricante. Se usaron un ordenador Macintosh y un programa de adquisición LabWiev para capturar los primeros pulsos de voltaje. Se hicieron grabaciones en paralelo con los electrodos de estimulación. Las medidas de voltaje se hicieron manualmente en impresiones como el promedio del máximo voltaje de 10 pulsos aproximadamente 100 ms después del comienzo de la estimulación.

Como se ilustra en la Figura 13a, hubo un pronunciado aumento en la eficacia de transfección con voltaje aumentado. Como se ilustra en la Figura 13b, en las condiciones de este experimento, los músculos estimulados con 13 voltios o más mostraron 40 veces más actividad de luciferasa comparado con los músculos estimulados con 5 voltios o menos.

Ejemplo 5 Determinación de la Duración Óptima del Pulso

Se inyectaron músculos soleus de ratas Wistar (200-270 gramos) con 50 \mug de plásmido de ADN que contiene el gen \beta-galactosidasa en 50 \mul de NaCl al 0,9%. Poco después de la inyección, los músculos se estimularon eléctricamente usando los siguientes parámetros: 100 Hz, 25 voltios, 100 pulsos bipolares en cada serie teniendo duraciones de pulso que oscilan de 5-200 \mus. El número de fibras transfectadas se contó en una sección de 1 mm de espesor de la mitad del músculo bajo un microscopio de disección. Un segundo conjunto de ratas se inyectó con 25 \mug de ADN plasmático de luciferasa conducido por RSV en 50 \mul de NaCl al 0,9% y se estimuló eléctricamente con los mismos parámetros que anteriormente, excepto en que las duraciones de pulso se variaron de 50-2000 \mus. Como se ilustra en la Tabla 3 posterior y la Figura 14, bajo estos parámetros de estimulación, la duración óptima de pulso osciló de aproximadamente 50 \mus a aproximadamente 200 \mus. Este método puede usarse para optimizar la duración de pulso de otros parámetros de estimulación.

TABLA 3

4

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Ejemplo 6 Corriente frente a número de pulsos

Se inyectaron músculos soleus de seis ratas Wistar (178-193 gramos) con 50 \mug de plásmido de ADN que contiene el gen \beta-galactosidasa en 50 \mul de NaCl al 0,9%. Poco después de la inyección, los músculos se estimularon eléctricamente como se describe anteriormente excepto en que la duración de pulso se varió. Los siguientes parámetros de electroporación se compararon: (1) 100 pulsos de 50 \mus de duración frente a 1 pulso de 5000 \mus; y (2) 10 series de 100 pulsos de 50 \mus frente a 10 pulsos de 5000 \mus. Los músculos se eliminaron 14 días después y se seccionaron en un criostato. Las secciones transversales se tiñeron como se describe previamente. El número de fibras transfectadas se contó. Como se ilustra en la Figura 15, las duraciones de pulso más largas dieron por resultado mayor eficacia de transfección.

Ejemplo 7 Concentración de ADN

Se inyectaron músculos EDL de seis ratas Wistar (178-193 gramos) o bien con 1 \mug/\mul o con 5 \mug/\mul de plásmido de ADN que contiene el gen \beta-galactosidasa en 50 \mul de NaCl al 0,9%. Poco después de la inyección, los músculos se estimularon eléctricamente con 30 series de 100 pulsos de 200 \mus de duración o no se estimularon. Los músculos se eliminaron 14 días después y se seccionaron en un criostato. Las secciones transversales se tiñeron como se describe previamente y las fibras transfectadas se contaron. Como se ilustra en la Figura 16, se obtuvieron mayores eficacias de transfección con mayores concentrados de ADN.

Ejemplo 8 Gran Señal de Localización Nuclear de Antígeno T

Se inyectaron músculos de rata Wistar con plásmido de ADN que contiene el gen \beta-galactosidasa que contiene un exceso molar 100:1 de señal grande de localización nuclear de antígeno T. Esto se ha mostrado en otros estudios de transfección para mejorar la transfección. (Véase, P. Collas et al., Transgenic Res., 6:451-8 (1996)). El músculo se estimuló con 10 series de 100 pulsos de 50 \mus de duración. Los músculos que contenían la señal grande de localización nuclear de antígeno T tenían el mayor número de fibras transfectadas. Específicamente, el músculo co-transfectado con señal grande de localización nuclear de antígeno T tenía 100 y 38 fibras transfectadas frente 7,3 y 4,7 para los músculos transfectados solo con ADN, respectivamente. Estos datos ilustran que las eficacias de transfección pueden ayudarse mezclando el ADN con moléculas de ácido no nucleico. Además, estos datos ilustran que las moléculas de ácido no nucleico pueden repartirse también al músculo usando las técnicas de electroporación de la presente invención. No se vio mejora en las células que no se estimularon después de la inyección.

Ejemplo 9 Daño Muscular Resultante de la Estimulación

Los músculos del Ejemplo 3 que se seccionaron y tiñeron para calcular el daño muscular procedente de la electroporación. Como se ilustra en la Figura 17a, algún daño puede darse solo con la inyección, aunque la mayoría de los músculos no estimulados no se dañaron. En los músculos estimulados con 300 pulsos, se observó más daño (Figura 17b). Como se ilustra en la Figura 17c, el músculo estimulado con 30 series de 1000 pulsos manifestaron mayor daño, indicando que el daño es proporcional con la extensión de la estimulación. La Figura 17d ilustra que los músculos estimulados bajo las condiciones de músculos en 17c se regeneran y reparar completamente después de 14 días.

En otro músculo que tuviera la mayor cantidad de estimulación (30 series de 1000 pulsos), el ADN plasmídico que codifica la proteína fluorescente verde (GFP), también se incluyó. La Figura 17e ilustra músculos transfectados con GFP. Las fibras transfectadas pueden verse en la vecindad del área dañada (Figura 17f). Las fibras de regeneración transfectadas no se observaron nunca en la sección transversal 3 días después de la electroporación.

Ejemplo 10 Inmunización Genética de Conejos

Se inyectó un conejo hembra (4,5 kg) en el recto femoral derecho con 2 milímetros de 1 \mug/\mul de plásmido de ADN que contiene cADN de agrina neural de rata conducido por el promotor CMV (Cohen et al. MCN, 9, 237-53 (1997)). El primer milímetro se inyectó de igual forma en diez sitios superficiales en el músculo seguido por 10 series de 1000 pulsos repartidos a una frecuencia de 1000 Hz. El segundo milímetro se situó más abajo en el músculo. Para probar el suero de conejo, se transfectaron músculos de rata y células COS con el mismo constructor. Los músculos se sacaron 5 días después de la transfección y las células COS se tiñeron 4 días después de la transfección.

Se recogieron sangrados en los días 0, 19, 50, 81 y 106 y se diluyeron 1:100 y 1:1000. Después de 19 días el sangrado contenía suficiente anticuerpo en el suero para dar un tintado ligero de fibras transfectadas cuando se diluían 1:10. Como un control positivo se usó el anticuerpo monoclonal (mAb) AG-86. Véase Hoch et al., EMBO J, 12 (13):2814-21 (1994). El suero preinmune no mostró ningún tintado de fibras transfectadas. Todos los sangrados posteriores tuvieron anticuerpos de agrina en el suero. El sangrado recogido el día 50 o posterior contenía suficientes anticuerpos para teñir secciones a una dilución de 1:1000.

La Figura 18a ilustra las células COS transfectadas de agrina teñidas con antisuero de conejo inmunizado (diluido 1:100) y anticuerpo secundario conjugado con fluoresceína. Las células COS se tiñeron primero fijando las células en paraformaldehído al 1,5% durante10 minutos, seguido de un lavado de 30 minutos con solución salina tamponada de fosfato (PBS). Las células se bloquearon después con albúmina de suero bovino al 0,2%, triton X-100 al 0,1% en PBS 0,1M, durante 4 minutos. El suero diluido en la misma disolución se añadió a las células y se dejó incubar durante 20 minutos. Las células se lavaron durante 4 minutos en PBS y se incubaron con el anticuerpo secundario (Cappel, 55646) durante 10 minutos seguido de un lavado con PBS. Se incluyó mAb Agr-86 principal de ratón en la misma mezcla de anticuerpos y se usó anticuerpo secundario conjugado con rodamina (Sigma T-5393, St. Louis. MO) en una dilución de 1:100. La Figura 18b ilustra las mismas células teñidas con conjugado de mAb Ag-86/rodamina. Estos datos ilustran el potencial de la técnica de la presente invención durante la inmunización genética o tecnología de vacuna de ADN.

Ejemplo 11 Inmunización Genética de Ratones

Se inocularon grupos de ratas Sprague Dawley machos de dos meses de edad de forma bilateral en los músculos EDL y soleus con un total de 200 microgramos (4 x 50 microlitros de una disolución de 1 mg/ml de ADN en solución salina) de tres vectores de expresión eucariótica diferentes que contenían el promotor inmediatamente anterior de citomegalovirus (CMV) y las secuencias de codificación para las siguientes proteínas: DH-CNTF, una variante agonista del factor neurotrófico ciliar humano (Saggio et al. EMBO J. 14, 3045-3054, 1995); AADH-CNTF, una variante antagonista del factor neurotrófico ciliar humano (Di Marco et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 9247-9252, 1996); sec-DHCNTF, una forma secretada de DH-CNTF. Los músculos o bien no se estimularon eléctricamente o se estimularon inmediatamente después de la inyección de ADN usando 30 series de 100 o 1000 pulsos bipolares cuadrados (duración de 200 microsegundos; ajuste de amplitud de 150 V, voltaje efectivo \sim25 V) cada uno, repartidos a una frecuencia de 1000 Hz con un intervalo de dos segundos entre series sucesivas.

Se inocularon grupos de ratones CD1 machos de dos meses de edad de forma bilateral en los músculos cuadriceps con 10 microgramos (2 x 50 microlitros de una disolución de 1 mg/ml de ADN en solución salina) de plásmido sec-DHCNTF, con o sin estimulación eléctrica del músculo inmediatamente después de la inyección de ADN. Las condiciones de estimulación fueron 10 series de 1000 pulsos bipolares cuadrados (ajuste de amplitud de 150 V) repartidos a una frecuencia de 1000 Hz con un intervalo de dos segundo entre series sucesivas.

Se recogió sangre del seno retroorbital a puntos de tiempo seleccionados y se preparó suero y se almacenó a -20ºC. L presencia de anticuerpos anti-CNTF en sueros de rata y ratón se determinó mediante ELISA. Se incubaron placas de microvaloración revestidas con CNTF humano recombinante con disoluciones en serie de sueros, seguido de anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina frente a IgG de rata o ratón (Pierce). Las placas se incubaron entonces en presencia de p-nitrofenil-fosfato y la absorbancia a 405 nm se determinó usando un lector de microplacas. Las valoraciones de anticuerpo se definieron como la disolución de suero que produce una lectura de absorbancia igual al 50% de la obtenida con una concentración de saturación de antisuero de anti-CNTF.

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Los resultados se muestras en la Figura 19. Las valoraciones no pudieron promediarse con precisión debido al hecho de que algunos animales no desarrollaron cantidades detectables de anticuerpo. Los datos se presentan, por lo tanto, para animales individuales, con un valor de 1:100 que representa una valoración de anticuerpo baja o no detectable (valoración recíproca ¾ 100). Los resultados fueron similares para todos los plásmidos usados, además de para ratas y ratones, como se representa en la Figura 19. También se obtuvieron resultados similares tanto en ratas como ratones con otro plásmido que codificaba una proteína viral no relacionada (no se muestran datos). Tanto en ratas como ratones, la estimulación eléctrica inmediatamente después de la inyección de ADN llevó a aproximadamente a valoraciones de anticuerpo de 5 a 10 veces más alta que con la inyección simple de ADN. Esto fue cierto para la estimulación tanto con un alto y bajo número de pulsos. Estos resultados demuestran que el método de electroporación aumenta la eficacia de la inmunización mediada por ADN.

Ejemplo 12 Proteínas Secretadas con Actividad Biológica Sistémica

Cincuenta microgramos (50 microlitros de una disolución de 1 mg/ml en NaCl al 0,9%) de un plásmido de expresión eucariótico (CMV-EPO) que contiene el cADN de eritropoyetina de ratón bajo el control del promotor inmediatamente anterior de citomegalovirus, se inyectó en el músculo cuadriceps izquierdo de ratones hembra 129xBalb/C de tres meses de edad. En cinco ratones (grupo I), los músculos se estimularon eléctricamente inmediatamente después de la inyección de ADN usando 10 series de 1000 pulsos bipolares cuadrados de 200 microsegundos de duración, con un intervalo de 2 segundos entre series sucesivas. La frecuencia de las series fue 1000 Hz y el ajuste de amplitud a 150 V (voltaje efectivo \sim25 V). En otro grupo de 5 ratones (grupo 2), los músculos no se estimularon después de la inyección de ADN. Como un control, se inyectó un grupo de 4 ratones (grupo 3) con un plásmido (CMV-GFP) que contenía la secuencia de codificación para la proteína de fluorescencia verde bajo el control del promotor CMV, seguido de estimulación eléctrica en las mismas condiciones que el grupo 1. El grupo 4 consistió en 5 ratones inyectados solo con solución salina sin estimulación eléctrica.

Se recogió sangre del seno retroorbital a puntos de tiempo seleccionados y se midió el hematocrito por centrifugado en tubos capilares. Las muestras de suero se analizaron para la presencia de EPO usando un equipo ELISA comercial (R&D Systems). Los resultados se muestran en la Tabla 4. En todos los grupos de ratones, excepto en los que se inyectaron con el constructor EPO y se estimularon eléctricamente inmediatamente después, los niveles de EPO circulantes estuvieron por debajo del límite de detección del equipo ELISA (<15 mU/ml). En contraste, los ratones inyectados con el constructor EPO y estimulados eléctricamente tuvieron niveles de EPO en suero significativamente elevados 5 días después de la inyección (promedio de aproximadamente 50 mU/ml). La concentración en suero de EPO permaneció elevada durante hasta 28 días después de la inyección de ADN (último punto de tiempo examinado; no se muestran datos). Estos niveles de EPO produjeron un aumento en los hematocrito, que se elevó de 46,2% antes de la inyección a 70,0% y 76,7% a 14 y 28 días después de la inyección de ADN, respectivamente. Estos valores fueron significativamente diferentes de los obtenidos con ambos grupos de control (grupos 3 y 4) y de los de ratones inyectados con el vector de expresión EPO sin estimulación eléctrica del músculo (grupo 2). De hecho, el último tenía niveles de hematocrito significativamente diferentes de los de los grupos de control (véase Tabla 4). Estos resultados demuestran que el método de electroporación es superior a la simple inyección de ADN tanto en términos de los niveles de expresión de una proteína secretada, como en la producción de un efecto biológico mediado por la proteína secretada.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 4

5

Ejemplo 13 Reparto en Moléculas de Ácido No Nucleico

Se inyectaron músculos con 50 \mul de una mezcla de ADN plasmídico de GFP 1 \mug/\mul y 2 \mug/\mul de dextrano conjugado con rodamina (10 kD de Molecular Probes). Tres a 5 días más tarde, los músculos (n=6) se congelaron en nitrógeno líquido y se seccionaron en un criostato. Como se ilustra en la Figura 20, los músculos estimulados (abajo) se transfectaron con dextrano conjugado con rodamina (arriba) y GFP (en medio). Como se ilustra adicionalmente, las mismas fibras musculares se transfectaron tanto con GFP como con dextrano conjugado con rodamina. Estos datos indican que las moléculas de ácido no nucleico pueden repartirse a células musculares usando la técnica de la presente invención.

Figura 2

El músculo total y una rodaja de 1 mm de espesor cortada de su centro. El número de fibras transfectadas se contaron después de dividirse en bultos más pequeños y las fibras solas podían verse a través de un microscopio de disección. En algunas áreas del músculo, la mayoría de fibras se transfectaron (flechas negras). Estas áreas se cerraron donde los electrodos se colocaron durante la estimulación.

Figura 9

Dos electrodos diferentes se han usado para mejorar la eficacia de transfección. El procedimiento de inyección y el patrón de estimulación (100 Hz) fue el mismo que el descrito anteriormente. El electrodo mostrado en (A) se colocó perpendicular a las fibras musculares. Consistió en un cable de plata con diámetro (d) de 0,6 mm, (C) (Este es el electrodo que se usó en todos los experimentos excepto en (B)). Un electrodo se colocó en cada lado del músculo. Un corto segmento en la tercera mitad del músculo es positivo para el teñido de Lac Z (A), indicando la expresión localizada. En (B) se usó un electrodo de 1,5 cm hecho de un cable de plata aislado (d=0,3 mm). El aislamiento se eliminó de cortos segmentos (0,5-1,0 mm) a lo largo del cable a intervalos de2 mm (D). El electrodo se penetró en el músculo en paralelo con las fibras musculares. Un segundo electrodo se colocó en la superficie del músculo. Se observó teñido azul positivo en aproximadamente 250 fibras que se localizaron en la tercera mitad del músculo. En (B), las fibras mostraron teñido extendido, indicando transfección a lo largo de un segmento más largo de la fibra y/o expresión aumentada del transgen.

Claims

1. El uso de un ácido nucleico unido de forma operable a un promotor que es capaz de dirigir la expresión de una proteína codificada por dicho ácido nucleico en la fabricación de un medicamento para usar en un método para repartir dicho ácido nucleico al músculo esquelético de un mamífero, en el que

a): dicho ácido nucleico va a ser inyectado en un músculo esquelético de dicho mamífero;

b): los electrodos se van a colocar cerca del sitio de inyección de manera que la corriente que viaja a través de los electrodos pase a través del sitio de inyección, y

c): el músculo se va a estimular eléctricamente con una corriente eléctrica que tiene una intensidad de campo de entre 5 V/cm y 200 V/cm.

2. El uso según la reivindicación 1, para inmunizar genéticamente dicho mamífero transfectando dicho ácido nucleico en el músculo esquelético de dicho mamífero.

3. El uso según la reivindicación 1, para repartir sistémicamente una proteína en dicho mamífero.

4. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha corriente eléctrica está en forma de un único pulso bipolar cuadrado.

5. El uso según la reivindicación 4, en el que dicho pulso bipolar tiene una duración de entre aproximadamente 50 \mus y 5000 \mus.

6. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha corriente eléctrica está en forma de entre aproximadamente 2 y 3000 pulsos bipolares cuadrados.

7. El uso según la reivindicación 6, en el que dichos pulsos bipolares tienen una duración total de entre aproximadamente 10 ms a 12000 ms.

8. El uso según la reivindicación 7, en el que dichos pulsos bipolares están en forma de al menos dos series.

9. El uso según la reivindicación 8, en el que la frecuencia de dichos pulsos está entre aproximadamente 0,5 Hz y 1000 Hz.