CN1198665C - 将药物和核酸导入骨骼肌的方法 - Google Patents

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Abstract

一种将分子体内传递给哺乳动物的骨骼肌的方法，它包括：将分子注射到哺乳动物的骨骼肌中；将电极放置在注射部位近旁，以使流过电极的电流能通过注射部位；用电场强度在25V/cm至200V/cm之间的电流刺激肌肉。

Description

将药物和核酸导入骨骼肌的方法
                            发明领域
本发明涉及一种使骨骼肌对药物和核酸呈半通透性的方法。更具体地说，通过在注射药物和核酸之后以低电场强度电刺激骨骼肌使其变成半通透性。
                            技术背景
科学家正不断地发现造成许多人类疾病的基因，如造成某些形式的乳房癌、结肠癌、肌肉营养不良和膀胱纤维症的基因。此外，科学家正不断地发现编码细菌和病毒抗原(如病毒衣壳蛋白)的基因。虽然有这些新发现，但医学界所面临的主要障碍是如何将有效量的这些制剂安全地投药于患者以治疗疾病或进行基因免疫接种。
目前，大多数的药剂采用口服或静脉注射的形式。然而，通过口服和静注药物和基因传递的方法有几种缺点。第一，口服或静注的药物中的很大部分在到达靶器官或细胞之前已在体内被降解。例如，胃肠中的酸和酶能将许多药物分解。同样地，血和肝脏中能分解DNA的蛋白质会将基因迅速地破坏。此外，静注的药物和基因在到达患病的器官或细胞之前往往会被肝脏或免疫系统处理掉。第二，通过口服和静注药物和基因传递是非专一性的，即，药物或基因不但被投向了靶细胞，而且也被投向了非靶细胞。
骨骼肌是进行药物传递、基因治疗和基因免疫接种的有希望的候选途径。第一，骨骼肌占人体质量的50％以上，与人体的其它组织和器官相比，大部分骨骼肌易于给药。第二，有许多遗传性和获得性疾病(如Duchenne氏肌肉营养不良病(DMD)、糖尿病、高血脂症和心血管疾病)是向肌肉传递药物和基因的良好的候选疾病。第三，肌肉是进行基因免疫接种的理想部位，因为它容易给药，并且肌肉中产生的蛋白质会分泌出来，从而引发免疫应答。最后，骨骼肌细胞是不分裂的。因此，骨骼肌细胞能够在比连续分裂的其它类型细胞所能预期的更长的时间内表达基因编码的蛋白质。由于能更长时间地表达蛋白质，因此，较少需要治疗。
然而，目前尚无将药物和DNA体内有效传递给骨骼肌的非病毒性方法。已有几种本领域已知的向骨骼肌传递药物和DNA的方法，例如肌肉内注射DNA。然而，直接肌肉注射的临床应用可能性受到限制，主要是由于转染率低，通常低于1％.业已证明，如在再生的肌肉中注射DNA，可提高转染率。在注射DNA之前3日，用药物Bivucain诱导注射。虽然由Bivucain诱导的在再生肌肉中的注射显示更高的效率，但该方法在人体应用的可能性受到限制，因为会引起肌肉严重伤害。
鉴于上述情况，可以理解，提供一种仅向患病的器官和细胞传递药物和DNA的非病毒性方法是本领域的一个进步。提供一种向骨骼肌传递药物和DNA的电穿孔(electroporation)方法也是本领域的一个进步。如果电穿孔法可将治疗有效量的药物和DNA同时传递到骨骼肌的多个部位，则是本领域的又一个进步。如果该方法能使传递效率可受调节，则是本领域的再一个进步。
本文公开了这样的方法。
                            发明概述
本发明提供一种向骨骼肌传递或转染药物和DNA的方法。不受理论的束缚，该方法被认为与电穿孔类似。电穿孔是根据以下原理工作的：细胞通常充当不能通过电流的电容器。将细胞置于高压电场中，由此在细胞膜中产生瞬时的可通透结构亦即微孔。这些微孔足够地大，可使药物、DNA和其它极性化合物得到进入细胞内部的入口。随着时间的变化，细胞膜中的微孔闭合，细胞重新变得不可通透。
然而，常规的电穿孔使用0.4至数kV/cm的高电场强度。与常规电穿孔相比，本发明中使用的电场强度范围约为25-250V/cm。据信这些较低的电场强度引起肌肉伤害很小且不会牺牲(实际上是提高)转染率。而且，使用本发明的方法，可通过改变频率、脉宽和脉冲数等参数来对转染率进行严密地调节。
只有在注射DNA之后立即或不久即电刺激肌肉，才可观察到DNA转染率的提高。因此，由电刺激引起的组织的半通透性是可逆的。而且，它取决于通过肌肉的电流；通过神经诱导的活动不会影响转染率。
一旦被转染，肌肉细胞能表达导入核酸编码的蛋白质。因此，可将本发明的转染方法用来(例如)转染用于基因免疫接种的表达载体(即，DNA疫苗)。在一个实例中，用含大鼠集聚蛋白cDNA的质粒转染家兔。转染的肌肉产生和分泌集聚蛋白。转染后19日，家兔血清含显著量的抗大鼠集聚蛋白的抗体。
在第二个实例中，用本发明的方法转染小鼠和大鼠，采用了三个不同的真核表达载体中的一个或多个，这三种载体包含编码DH-CNTF(一种人睫状神经营养因子的激动剂变体)，AADH-CNTF(一种人睫状神经营养因子的拮抗剂变体)和sec-DHCNTF(DH-CNTF的一种分泌形式)的序列。在注射DNA之后，不对这些肌肉进行电刺激或者立即刺激。在不同的时间收集血液并测定抗体滴度。在大鼠和小鼠中，注射DNA后立即电刺激均使抗体滴度比单纯注射DNA高约5-10倍。
本发明的转染方法还可用于全身传递蛋白质以治疗疾病。在一个较佳的实例中，按照本发明的方法将包含红细胞生成素(EPO)基因的DNA质粒注射到骨骼肌中并电刺激。作为对照，对另一些骨骼肌不刺激或用不含EPO基因的对照载体转染。14日后，只有按本发明方法用EPO转染的小鼠的血细胞比容升高，表明转染的肌肉可产生大量的EPO并分泌到血流中。
非核酸也可用本发明方法进行转染。在一个实例中，将罗丹明-葡聚糖结合物注射到肌肉中，然后电刺激。3至5日后，将肌肉冷冻于液氮中，在冷冻切片机中切片。在注射和刺激过的细胞中观察到荧光，表明罗丹明-葡聚糖结合物能进入并留在肌肉细胞中。
在参考了附带的图表和阅读了下面的详细说明和权利要求书之后，本发明的这些和其它目的和优点就会明白。
                            附图概述
下面结合附带的图表对本发明作更详细的说明。这些图表仅提供有关本发明的典型实例的信息而不应认为是对本发明范围的限定。
图1图示本发明将药物和DNA传递给骨骼肌的方法。
图2图示本发明的电刺激传递的方法。
图3图示已注射了50μL的浓度为1μg/μL的RSV-Lac Z质粒DNA溶液的整块肌肉。注射DNA后15天，将3a和3b中的肌肉取出。注射DNA后7天，将3c和3d中的肌肉取出。所有的肌肉均是成对地来自同一大鼠。
图4图示刺块肌肉和被转染肌肉的1mm切片。暗点显示被肌肉中的半乳糖苷酶催化的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)产生的暗色沉淀物。箭头指的是已成功地用本发明方法转染的肌肉纤维。
图5包含图3所示的各组骨骼肌的转染纤维的平均值。
图6是来自几个不同实验和几个不同批DNA分组合在一起的DNA的肌肉的转染纤维的平均值的条图。在标记SOL S和EDL S的条图中，肌肉(各组16条)在注射DNA之后立即进行了电刺激。在标记SOL NS和EDL NS的条图中，肌肉(各组10条)已被刺激过神经、根本未刺激或在注射DNA之前刚好10分钟进行过刺激。
图7图示转染骨骼肌纤维的数目与刺激频率的对数的关系。刺激序列的脉宽恒定地保持为1秒钟。
图8是转染肌肉的照片，从中得到图7中的数据。
图9图示按本发明的方法用二种不同的电极转染整块肌肉时得到的结果。
图10图示频率增加与脉冲数增加对转染的骨骼肌纤维数目影响的比较。
图11图示转染的骨骼肌纤维的数目与恒定频率的脉冲数的关系。
图12图示平均荧光素酶活性与脉冲数的关系。
图13图示本发明的电刺激方法对电压依从关系。图13a是用不同电压刺激的肌肉的荧光素酶活性。图13b是以大于13V和小于5V的幅度刺激的肌肉的平均荧光素酶活性。
图14图示脉宽对转染率的影响。
图15是比较不同脉宽和脉冲数对转染率的影响的条图。
图16是DNA浓度对转染率的影响的条图。
图17是转染肌肉的照片，它显示由电刺激引起的损伤和短时间后肌肉的再生。图17a是注射过但未刺激的肌肉。图17b是刺激后的肌肉损伤。图17c是在较严酷的电刺激条件下刺激过的肌肉。图17d是在17c的刺激条件下电刺激过的肌肉在14日之后完全再生和修复。图17e是用绿荧光蛋白(GFP)转染的肌肉。图17f是在损伤区域附近可看到的转染纤维。
图18是用抗集聚蛋白的多克隆抗体染色的细胞的照片，所用多克隆抗体得自以本发明刺激技术用编码大鼠集聚蛋白的表达载体进行过基因免疫的家兔。
图19图示与单纯的DNA注射相比，使用本发明刺激技术对小鼠和大鼠基因免疫的改善效果。
图20是用罗丹明-葡聚糖结合物和绿荧光蛋白转染的肌肉的照片。上图：罗丹明-葡聚糖结合物产生的罗丹明荧光。中图：与上图同一切片，但用滤光片显露出GFP荧光。下图：相邻切片的苏木素和曙红染色。
                            发明详述
本发明涉及一种增加骨骼肌组织的通透性从而使药物和核酸能进入或转染细胞的新方法。本发明的方法使预定量的电流通过骨骼肌组织。但与前述电穿孔方法不同，本发明方法的参数是独有的，尤其是关于所用的低电场强度和发生的损伤量而言。其它参数(如脉冲序列(串)数、频率、脉冲数和脉宽)可加以变化以调节药物或核酸的传递量。
如图1所示，一般地，暴露出骨骼肌并往骨骼肌中注射预定量的分子。在一个实例中，将DNA溶解在0.9％氯化钠(NaCl)溶液中。但提取溶剂对本发明不是很重要的。例如，其它溶剂(如蔗糖)可增加DNA在骨骼肌中的摄入在本领域是周知的。出于各种有益的理由，也可将其它物质与感兴趣的分子共转染。例如，P188(Lee等，PNAS.，4524-8，10，89(1992))是已知的电流可通透的密封膜，它可通过提高转染纤维的存活率而对转染率产生有益的作用。
继续参见图1，在肌肉的靠近注射过分子的区域，间隔约1-4mm放置电极。电极的准确位置或设计不很重要，只要能使电流通过与电极在注射分子的区域中的方向垂直的肌肉纤维即可。
一旦将电极放置妥当，即对肌肉电穿孔或电刺激。如图2所示，以具有预定幅度和脉宽的矩形双极脉冲的形式传递刺激。为使转染率最佳化，已对这些参数进行了广泛地变化并比较了转染率。例如，电压在约0-50V之间；脉宽在5μs至5ms之间；脉冲数在单个脉冲至30,000个脉冲之间；脉冲序列内的脉冲频率在0.5Hz至1000Hz之间。
由这些结果得出的结论是，只要电场强度在约50V/cm以上，其它参数可根据所需的实验条件加以变化。虽然未检测出上限，但在很高的电场强度观察到有效转染率。刺激的电场强度可用下式进行计算：
                        E＝V/(2r ln(D/r))
若D＞＞r，该公式给出了电线之间的电场。在该公式中，V＝电压＝10V，D＝电线中心之间的距离＝0.1-0.4cm，r＝电极的直径＝0.06cm。参见Plenum出版公司1989年出版、A.E.Sowers & C.A.Jordan编的Electroporation andelectrofusion in cell biology第389至407页(G.A.Hofmann著，Cells in electricfields.In E.Neumann)。在10V，电场强度在163V/cm至43V/cm之间(电极之间分别为0.1至0.4cm)。由于D不比r大很多，因此，采用适合大平行板之间的电场的公式可能更妥：
                        E＝V/D
它给出了100V/cm至25V/cm之间的类似电场强度(电极之间分别为0.1-0.4cm)。应明白，电场强度以及其它参数受被转染组织的影响，因而最佳条件可能会变化。然而使用本发明中给出的参数，本领域的技术人员可容易地得到最佳参数。
如图3和5-8所示，本发明的方法显著提高了药物和DNA传递到骨骼肌的效率。在一个实例中，用含β-半乳糖苷酶基因(lac Z)的DNA质粒注射大鼠比目鱼肌或EDL肌。β-半乳糖苷酶基因产生的蛋白能将无色物质转换成蓝色物质，而蓝色物质可用肉眼分析或分光光度计测定。图3显示以各种刺激参数用β-半乳糖苷酶基因转染的代表性比目鱼肌和EDL肌。
图3a显示用本发明方法转染的比目鱼肌和EDL肌改善的DNA传递效率。先通过切断坐骨神经将比目鱼肌和EDL肌(n＝3)的神经切除。这样做的目的是消除神经诱导的活动(对这种活动是否能增加所见的转染率尚有争论)的影响。切除神经3日之后，用上述β-半乳糖苷酶基因注射肌肉。注射DNA之后，将肌肉或者不加处理，或者在注射DNA之后立即用本发明的方法刺激。
DNA注射后第15日，分析比目鱼肌和EDL肌。如图3a所示，在注射DNA之后立即刺激的肌肉细胞(图下方组)含较多的蓝色产物，表明较多的β-半乳糖苷酶基因被导入肌肉细胞中。如图4所示，转染率是通过对1mm肌肉横截面的含蓝色产物的肌纤维进行计数而定量测定的。如图5a中的条图所示，用本发明方法转染的比目鱼肌比未刺激的肌肉增加4-7倍。同样地，用本发明方法转染的EDL肌比未刺激的肌肉增加12倍。
为确定神经活动是否对转染率有影响，如前面所述的，用本发明的方法对受神经支配的(坐骨神经未切断的)和切除了神经(坐骨神经切断的)的比目鱼肌和EDL肌进行了实验。如图3b所示，注射DNA后经过15日，受神经支配的肌肉和切除了神经的肌肉均产生了大量的蓝色物质，表明β-半乳糖苷酶基因的高转染率。如图5b所示，转染的肌纤维量证实了受神经支配的肌肉和切除了神经的肌肉两者的高转染率。
为排除观察到的转染率增加是由于肌肉活动的可能性，将直接刺激坐骨神经与刺激肌肉进行比较(n＝5)。如果转染率的增加是肌肉活动所致，则通过神经刺激肌肉的转染率应产生与直接肌肉刺激类似的效率。如图3c所示，与直接肌肉刺激相比，直接神经刺激并不显著增加转染率。如图5c所示，在比目鱼肌和EDL肌两者均观察到直接肌肉刺激使转染率增加10倍。
如图3d所示，转染率的增加是瞬时的、与电穿孔一致。注射DNA后立即刺激的肌肉显示出比先刺激后注射DNA的肌肉显著得多的蓝色染料。实际上，注射DNA后立即刺激的肌肉的转染率比注射DNA之前10分钟作过刺激的肌肉的转染率高10-25倍(图5d)。
图6归纳了本发明的结果。将几个不同实验和几批不同DNA(注射)的肌肉一起分组。在标记SOL S和EDL S的条图中，肌肉(各组16条)在注射DNA之后立即进行电刺激。在标记SOL NS和EDL NS的条图中，肌肉(各组10条)已作神经刺激、根本不刺激或在注射DNA前10分钟作刺激。
实验中所用的电刺激器是FHC公司(缅因州Brunswick市，邮编：04011)产品。Pulsar 6bp和Pulsar 6bp-a/s电刺激器均采用。Pulsar 6bp-a/s传输的最大电压是150V，最大电流是50mA。可传输的最大电压要求电极间的电阻大于3000欧姆。电刺激器以恒压模式运转。由于肌肉的电阻小，如下面的实施例中所讨论的，将电压调低了。在所有的实验中，肌肉保持在50mA。
本领域的技术人员会明白，可使用许多其它电极结构。例如，图9是用二种不同的电极结构得到的结果。(A)所示的电极与肌肉纤维垂直地放置。它是由直径(d)为0.6mm的银线组成的(C)(这是在除(B)之外的所有实验中使用的电极)。在肌肉的各端放置一个电极。在肌肉三等分的中间部分有一短片段Lac染色阳性(A)，表明已定位表达。在(B)中，使用由绝缘银线制成的1.5cm电极(d＝0.3mm)。沿着银线，每间隔2mm去除一短段(0.5-1.0mm)电线的绝缘层(D)。将电极与肌纤维平行地刺入肌肉中。将电极的二条线中的一条与肌纤维平行地穿入肌肉中。将第二条线置于肌肉表面，也与纤维平行。二种类型的电极(图9c和9d)产生了类似数目的转染纤维(约250条)。但使用与肌纤维平行的较长电极则产生了分布更广泛的染色，表明转染是沿着纤维的较长片段的和/或转染增加。
用本领域周知的方法对整块肌肉进行Lac Z染色。染色后，对肌肉的最蓝面拍照。然后，如图2所示，将肌肉切成3段。对来自肌肉中间部分的约1mm厚切片中的蓝纤维数目进行计数(据此，对远离或靠近切片的转染纤维不计数)。为计数转染纤维，将切片切成较小的束条，这样，能在解剖显微镜下分辨单条纤维。
在4条肌肉中，使用pSV40-luc构建物。将其注射到比目鱼肌中，3日后，取出肌肉，用Promega荧光素酶试验系统(Daviset等，1993)测定荧光素酶活性。用同一大鼠的未注射的EDL作为对照。
应明白，在本发明的方法中，可使用任何核酸，例如质粒DNA、线性DNA、反义DNA和RNA。在一个较佳实例中，所用核酸是本领域周知类型的DNA表达载体。一般地说，表达载体含有操作性地与编码所需蛋白的DNA分子和后面的终止信号(如聚腺苷酸化信号)连接的启动子。可包括细菌性生长和适宜的哺乳动物处理所需的其它元件，如β-内酰胺酶编码区、f1起点和ColE1衍生的质粒复制起点。含所需的DNA编码区的类似构建物可由本领域技术人员构建。
如下面的实施例所示，可用本发明的技术将核酸以外的分子传递到肌肉中。在一个实例中，用本发明方法注射到肌肉中并经刺激的罗丹明-葡聚糖结合物可进入肌肉细胞。此外，可将核酸和蛋白质同时导入到电穿孔的肌肉中。在一个实例中，将大T抗原核定位信号与含Lac Z编码区的DNA质粒混合。大T抗原核定位信号是一种结合DNA并促使其传输到细胞核中的蛋白质。在其它系统中，业已显示，大T抗原核定位信号可提高转染率。使用本发明的方法，大T抗原核定位信号还提高了Lac Z的转染率，表明该蛋白质能够结合DNA并进入肌肉细胞。
                              实施例
给出下面的实施例是为了举例说明构成本发明的各种实例。应明白，下面的实施例并非全面地或详尽无遗地对本发明实施的许多类型的实施方式作了说明。
实施例1-电刺激过的肌肉与未刺激过的肌肉
用pSV40-luc报道构建物注射比目鱼肌，测定转染率。注射后3日，取出肌肉，按照用户手册用Promega荧光素酶试验系统(威斯康星州Madison公司产品)测定荧光素酶活性。用同一大鼠的未刺激过的EDL肌作为对照。数据见下面的表1。
                                表1
                  电刺激过的肌肉与未电激过的肌肉
肌肉   刺激过(相对荧光素酶活性)   未刺激过(相对荧光素酶活性) 增加百分比
比目鱼肌动物I   34.40   1.950   1664％
比目鱼肌动物I   21.50   0.250   8500％
EDL肌动物I   0.045
EDL肌动物I   0.046
实施例2-转染率与频率
将50μL的1mg/μL携载lac Z基因的质粒注射大鼠。注射后立即以约2-3mm的间隔放置电极并以下列电刺激参数刺激肌肉：电压＝30V；脉宽＝0.2ms(总计0.4ms，双极)；脉冲序列数＝30，1秒钟通1秒钟断，进行1分钟。对肌肉中间部分作1mm切片，计数转染纤维数。转染纤维的数目见下面的表2并示于图7中。这些资料还显示，本发明的方法不仅使表面肌肉纤维转染，数细胞层深的肌肉纤维也被转染。
                       表2
                       转染率与频率
    频率(Hz)   转染纤维平均值   由电刺激而增加的百分比
    0   22   -
    1   83   277％
    10   153   595％
    100   215   877％
    1000   315   1332％
实施例3-转染率与脉冲
将50μg RSV荧光素酶DNA质粒在50μL 0.9％氯化钠中的溶液注射到Wistar大鼠的比目鱼肌中。注射后立刻用下列参数电刺激肌肉：在1分钟内将各脉冲序列的1000Hz、脉宽为200μs的0-1000个双极脉冲施加于肌肉30次。转染后3日，取出肌肉并冷冻在液氮中。在冷冻切片机中将肌肉切片并用苏木素、曙红和臧红染色(参见实施例9)。按下面的实施例4所述的方法，将剩余的切片制成匀浆。如图10-12所示，转染率随着传递到肌肉的脉冲数而增加。
实施例4-确定电压对转染率的影响
将25μg RSV驱动的荧光素酶DNA质粒在50μL 0.9％氯化钠中的溶液注射到Wistar大鼠(245-263g)的EDL肌和比目鱼肌中。注射后立刻用下述参数电刺激注射过的肌肉：各脉冲序列的脉宽为200μs，100Hz，100个双极脉冲，电压在0-47.5之间。注射和刺激后第4日，取出肌肉，按用户手册以Promega荧光素酶试验缓冲液(威斯康星州Madison公司产品)制成匀浆并测定发光。用Macintosh计算机和Lab Wiev采集程序捕捉最初的电压脉冲。与刺激电极平行地进行记录。电压测定是手工进行的，以开始刺激后约100ms的10个脉冲的最大电压的平均值表示。
如图13a所示，随着电压的增大，转染率显著提高。如图13b所示，在该实验条件下，用13V或更高的电压刺激的肌肉的荧光素酶活性比用5V或更低的电压刺激的肌肉大40倍。
实施例5-确定最佳脉宽
将50μg含β-半乳糖苷酶基因的DNA质粒在50μL 0.9％氯化钠中的溶液注射到Wistar大鼠(200-270g)的比目鱼肌中。注射后立刻用下列参数刺激肌肉：各脉冲序列100Hz，25V，脉宽5-200μs，100个双极脉冲。在解剖显微镜下对肌肉中间部分作1mm厚切片，计数转染纤维数。将25μgRSV驱动的荧光素酶质粒DNA在50μL 0.9％氯化钠中的溶液注射到第二组大鼠中，并用与前面相同的参数电刺激，所不同的是，脉宽在50-2000μs之间变化。如下面的表3和图14所示，在这些刺激参数下，最佳脉宽范围为约50μs至约200μs。可用本方法将其它刺激参数的脉宽最佳化。
                           表3
                     转染率与脉冲持续时间
    脉宽(μs)     转染纤维(平均值)     脉宽(μs)     荧光素酶活性(平均值)
    0     -     0     52.7
    5     51     50     631
    20     107     200     536
    50     228     500     348
    200     272     2000     194
实施例6-电流与脉冲数
将50μg含β-半乳糖苷酶基因的DNA质粒在50μL 0.9％氯化钠中的溶液注射到6只Wistar大鼠(178-193g)的比目鱼肌中。注射后立刻以前述条件电刺激肌肉，所不同的是，脉宽作了变化。比较下面的电穿孔参数：(1)脉宽为50μs的100个脉冲与脉宽脉宽为5000μs的1个脉冲；(2)50μs的100个脉冲的10个序列与5000μs的10个脉冲。14日后，取出肌肉，在冰冻切片机中切片。按前述方法染色横截面。计数转染纤维的数目。如图15所示，延长脉宽导致较高转染率。
实施例7-DNA浓度
将1μg/μL或5μg/μL含β-半乳糖苷酶基因的DNA质粒在50μL 0.9％氯化钠中的溶液注射到6只Wistar大鼠(178-193g)的比目鱼肌中。注射后立刻用脉宽为200μs的100个脉冲的30个序列进行电刺激或根本不电刺激。14日后，取出肌肉，在冷冻切片机中切片。按前述方法染色横截面并计数转染纤维数。如图16所示，增加DNA浓度获得更高转染率。
实施例8-大T抗原核定位信号
将含100∶1摩尔过量的大T抗原核定位信号和β-半乳糖苷酶基因的DNA质粒注射到Wistar大鼠肌肉中。在其它的转染研究中业已显示，这可改善转染(参见P.Collas等，Transgenic Res.，6：451-8(1996))。用脉宽为50μs的100个脉冲的10个序列刺激肌肉。含大T抗原核定位信号的肌肉被转染的纤维数最多。具体地说，用大T抗原核定位信号共转染的肌肉被转染的纤维数分别为100和38，而仅用DNA转染的肌肉被转染的纤维数分别为7.3和4.7。这些数据说明，将DNA与非核酸分子混合可能有助于转染率的提高。此外，该数据说明，非核酸分子也可用本发明的电穿孔技术传递给肌肉。在注射后未刺激的细胞中未观察到任何改善。
实施例9-电刺激导致的肌肉损伤
将实施例3的肌肉切片并染色，以评估电穿孔对肌肉的损伤。如图17a所示，单独注射会引起某些损伤，虽然大多数未刺激的肌肉不受损伤。在用300个脉冲刺激的肌肉中，观察到更多的损伤(图17b)。如图17c所示，用1000个脉冲的30个序列电刺激的肌肉损伤更大，表明损伤是与刺激程度成正比的。图17d说明，在17c中的肌肉条件下被刺激的肌肉在14日后完全再生和修复。
在另一个进行最高量电刺激(1000个脉冲30个序列)的肌肉中，还注射了编码绿荧光蛋白(GFP)的质粒DNA。图17e显示了用GFP转染的肌肉。在靠近受损伤区域处可观察到转染纤维(图17f)。电穿孔后3日，在横截面中未观察到转染后再生的纤维。
实施例10-家免的基因免疫
将2mL含有CMV启动子驱动的大鼠神经集聚蛋白cDNA的DNA质粒(1μg/μL)注射到雌兔(4.5kg)的右股直肌中(Cohen等，MCN，9，237-53(1997))。将第一毫升注射液均等地注射在肌肉表面的10个部位，然后用频率为1000Hz的1000个脉冲的10个序列刺激。再在肌肉的下部注射第二毫升注射液。为检验家兔血清，用相同的构建物转染大鼠肌肉和COS细胞。转染后第5日，取出肌肉，转染后第4日，将COS细胞染色。
在第0、19、50、81和106日收集血液并稀释100倍和1000倍。19日后，当稀释10倍时，血液中的血清含足够的抗体，可使转染纤维弱染色。使用单克隆抗体(mAb)AG-86作为阳性对照，参见Hoch等，EMBO J，12(13)：2814-21(1994)。免疫前血清不能使转染纤维染色.免疫后，所有血液的血清中都含集聚蛋白抗体。在第50日或其后收集的血液稀释1000倍时仍含有能使切片染色的足够抗体。
图18a显示用免疫家兔的抗血清(稀释100倍)和荧光素交联的第二抗体染色集聚蛋白转染的COS细胞。COS细胞的染色方法是，先将细胞在1.5％多聚甲醛中固定10分钟，然后用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤30分钟，接着在含0.2％牛血清白蛋白和0.1％Triton X-100的0.1M PBS中封闭4分钟。将同一溶液稀释的血清加入细胞并温育20分钟，细胞用PBS洗涤4分钟并与第二抗体(Cappel，55646)一起温育10分钟，然后用PBS洗涤。在相同的抗体混合物中加入小鼠第一单抗mAb Agr-86，并使用稀释100倍的罗丹明交联的第二抗体(密苏里州St.Louis市Sigma公司产品，商品名：T-5393)。图18b显示用mAb Ag-86/罗丹明交联物染色的同一细胞。这些资料显示了本发明的技术应用于基因免疫或DNA疫苗技术的可能性。
实施例11-小鼠的基因免疫
在几组2月龄Sprague Dawley雄性大鼠的EDL肌和比目鱼肌的两边接种总量2D0μg(4×50μL的1mg/mL的DNA盐水溶液)的三种不同真核表达载体，这些真核表达载体含巨细胞病毒立即早期启动子(CMV)和编码下述蛋白的序列：DH-CNTF，一种人睫状神经营养因子的激动剂变体(Saggio等，EMBO J.，14，3045-3054，1995)；AADH-CNTF，一种人睫状神经营养因子的拮抗剂变体(DiMarco等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，9247-9252，1996)；sec-DHCNTF，是DH-CNTF的一种分泌形式。对肌肉不进行电刺激，或者在注射DNA后立即各用100个或1000个矩形双极脉冲(脉宽200微秒；幅度设定为150V，有效电压为～25V)的30个序列刺激，在连续序列之间以二秒间隔1000Hz频率进行传递。
在几组2月龄的CD1雄性小鼠的股四头肌的两边接种100μg(2×50μL的1mg/mL的DNA盐水溶液)的sec-DHCNTF质粒，注射DNA后立即电刺激肌肉或不电刺激。刺激条件为1000个矩形双极脉冲(幅度设定为150V)的10个序列，在连续脉冲之间以二秒间隔1000Hz频率传递。
在选定的时间从眶后窦收集血液，制备血清并在-20℃贮存。用ELISA确定大鼠和小鼠血清中抗CNTF抗体的存在。将包被重组人CNTF的微量滴定板与血清的连续稀释液一起温育，然后加入碱性磷酸酶交联的抗大鼠或抗小鼠IgG抗体(Pierce公司产品)。再将滴定板在磷酸对硝基苯的存在下温育并用微量滴定板读数器测定405nm吸光值。将抗体滴度定义为：产生的吸光值读数等于用抗CNTF抗血清饱和浓度得到的读数的50％的血清稀释度。
结果见图19。由于有些动物未产生可测量的抗体，因此，不能精确地将滴度加以平均。由此，提供的是各动物的数据，1∶100的值表示抗体滴度低或未检测出(滴度倒数3/4 100)。如图19所示，对所用的所有质粒以及大鼠和小鼠得到的结果均类似。用另一种编码无关病毒蛋白的质粒转染大鼠和小鼠而得到的结果也均类似(数据未显示)。在大鼠和小鼠中，注射DNA后立即电刺激均导致抗体滴度比单纯的DNA注射提高约5-10倍。无论以高脉冲数还是以低脉冲数刺激均如此。这些结果表明，电穿孔法提高了DNA介导的免疫的效率。
实施例12-具有全身生物活性的分泌性蛋白
将50μg(50μL的1mg/mL的0.9％盐水溶液)含有在巨细胞病毒立即早期启动子控制下的鼠红细胞生成素cDNA的真核表达质粒(CMV-EPO)注射到3月龄的129xBalb/C雌鼠的左股四头肌中。在5只小鼠(第1组)中，在注射DNA后立即用脉宽200微秒的在连续脉冲之间以2秒间隔作10个脉冲序列(每个序列有1000个矩形双极脉冲)的杀虫剂。序列的频率为1000Hz，幅度设定在150V(有效电压～25V)。在另一组的5只小鼠(第2组)中，注射DNA后不刺激。作为对照，将含有在CMV启动子控制下的绿荧光蛋白的编码序列的质粒(CMV-GFP)注射第3组的4只小鼠，然后在与第1组相同的条件下电刺激。第4组5只小鼠仅注射盐水溶液而不电刺激。
在选定的时间从眶后窦收集血液，通过毛细管离心测定血细胞比容。用市售的ELISA试剂盒(R&D Systems公司产品)分析血清样品中EPO的存在。结果见表4。在所有小鼠组中，除了注射EPO构建物之后立即电刺激的那些小鼠之外，其它小鼠循环性EPO水平低于ELISA试剂盒的检测下限(＜15mU/mL)。相反注射EPO构建物并进行电刺激的小鼠在注射后第5日，血清EPO水平显著上升(平均约50mU/mL)。血清中的EPO浓度在注射DNA后第28日仍保持升高(检测到的最长时间；数据未显示)。此水平的EPO使血细胞比容从注射之前的46.2％分别增加到注射DNA后第14日的70.0％和第28日的76.7％。这些数值与由两对照组(第3组和第4组)得到的数值和由注射了EPO表达载体而未电刺激肌肉的小鼠(第2组)得到的数值明显不同。实际上，后者的血细胞比容与对照组的并无明显差并(参见表4)。这些结果表明，电穿孔法不仅在分泌性蛋白的表达水平上，而且在产生分泌性蛋白介导的生物作用上均优于单纯DNA注射。
                                           表4
                                      EPO血清浓度和活性
         第2日        第5日         第14日
小鼠No. HCT％   mEPO(mU/mL) HCT％ mEPO(mU/mL) HCT％   mEPO(mU/mL)
  第1组CMV-EPO电刺激   7   45   未测 未测 55.7   71   72.4
  8   48   未测 未测 54.6   68   5.3
  9   47   未测 未测 59   75.5   48.7
  10   44   未测 未测 62.2   69.5   62.9
  11   47   未测 未测 7.9   66   22.4
  平均值   46.2   未测 未测 47.9   70.0*   48.3
  标准偏差   1.6   3.6
  第2组CMV-EPO未电刺激   12   45   未测 未测 未测   50   ＜15
  13   45   未测 未测 未测   50   ＜15
  14   未测   未测 未测 未测   48   ＜15
  15   46   未测 未测 未测   49.5   ＜15
  16   44   未测 未测 未测   52   ＜15
  平均值   45   未测 未测 未测   49.9   ＜15
  标准偏差   0.8
  第3组CMV-GFP电刺激   2   未测   未测 未测 ＜15   43.5   ＜15
  3   未测   未测 未测 ＜15   48   ＜15
  5   未测   未测 未测 ＜15   46   ＜15
  6   未测   未测 未测 ＜15   46   ＜15
  平均值   未测   未测 未测 ＜15   45.9   ＜15
  标准偏差   1.8
  第4组CMV-EPO   17   45   未测 未测 ＜15   45.5   未测
  18   45   未测 未测 ＜15   49   未测
  19   43   未测 未测 ＜15   48   未测
  20   45   未测 未测 ＜15   51.5   未测
  21   50   未测 未测 ＜15   47   未测
  平均值   45.6   未测 未测 ＜15   48.2   未测
  标准偏差   2.6   2.3
*与第2组、第3组和第4组相比，p＜0.0001(Fisher氏保护最小显著差异法)
实施例13：在非核酸分子上的传递
将1μg/μL的GPF质粒DNA与2μg/μL的罗丹明-葡聚糖结合物(10kD，Molecular Probes公司产品)的50μL混合物注射到肌肉中。3至5日后，将肌肉(n＝6)冷冻于液氮中并在冰冻切片机中切片。如图20所示，将刺激过的肌肉(下图)用罗丹明-葡聚糖结合物(上图)和GFP(中图)转染。如进一步说明的那样，将相同的肌纤维用GFP和罗丹明-葡聚糖结合物两者转染。这些数据显示，可用本发明的技术将非核酸分子传递到肌肉细胞中。
图2
全肌和从该肌肉的中间部分切出的1mm厚切片。在将切片切成较小的束条后计数转染纤维数，可通过解剖显微镜观察到单条纤维。在肌肉的某些区域，大多数纤维被转染(黑箭头)。这些区域靠近刺激过程中放置电极的位置。
图9
使用了二个不同的电极以改善转染率。注射方法和刺激方式与前述的相同。(A)所示的电极与肌肉纤维呈垂直放置。它是由直径(d)为0.6mm的银线组成的(C)(这是在除(B)之外的所有实验中使用的电极)。在肌肉的各端放置一个电极。在肌肉三等分的中间部分有一短片段Lac染色阳性(A)，表明已定位表达。在(B)中，使用由绝缘银线制成的1.5cm电极(d＝0.3mm)。沿着银线，每间隔2mm去除一短段(0.5-1.0mm)电线的绝缘层(D)。将电极与肌纤维平行地刺入肌肉中。将第二电极放置在肌肉表面上。在约250条纤维中观察到阳性蓝色染色，这些纤维集中于肌肉三等分的中间部分。在(B)中，这些纤维显示了分布广泛的染色，表明转染是沿着纤维的较长片段的和/或转基因表达增加。

Claims (7)

1.将分子体内传递给哺乳动物的骨骼肌的设备，它包括：
注射装置，用于将分子注射到哺乳动物的骨骼肌中，
电极，用于放置在注射部位附近，使流过电极的电流能通过注射部位，
电刺激装置，用于电刺激骨骼肌，
其特征在于，所述电流的电场强度在25V/cm至200V/cm之间。
2.如权利要求1所述的设备，其中，所述电刺激装置产生1-30,000个脉冲。
3.如权利要求1所述的设备，其中，所述电刺激装置产生1-1000个矩形双极脉冲。
4.如权利要求3所述的设备，其中，所述双极脉冲的总脉宽在6毫秒至6,000毫秒之间。
5.如权利要求3所述的设备，其中，所述双极脉冲的总脉宽在5毫秒至200毫秒之间。
6.如权利要求4所述的设备，其中，所述脉冲的频率在1-1000Hz的范围内。
7.如权利要求1所述的设备，其中，所述分子是核酸，它操作性地与一个可指导该核酸编码的蛋白质在肌肉中的表达的启动子连接。
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