MX2008008981A - Dispositivo y metodo para electropermeacion in vivo de una sola aguja - Google Patents

Abstract

Se describe un dispositivo y método para administración de moléculas al tejido in vivo para varias aplicaciones médicas, dispositivos que comprenden una agujaúnica de inyección hipodérmica y al menos dos electrodos alargados, separados que proporcionan la capacidad, cuando la aguja se inserta en el tejido, tal como piel o músculo, de emitir impulsos al tejido con un campo eléctrico uniforme suficiente par provocar permeación reversible de células que están a lo largo o en proximidad cercana al camino hecho por la aguja en su inserción en el tejido.

Description

DISPOSITIVO Y METODO PARA ELECTROPERMEACION IN VIVO DE UNA SOLA AGUJA CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a electropermeación de células in vivo, en particular células de tejidos de un paciente. De manera más específica, esta invención se refiere a nuevos dispositivos y métodos para distribuir moléculas a células situadas en, cerca y/o adyacentes a un sitio de camino de inserción predeterminado de un electrodo alargado de una sola aguja. De manera más específica, la invención se refiere a la distribución electropermeada de sustancias en células a lo largo de y en la vecindad del camino de la aguja hecho por la inserción del electrodo desde la superficie de un tejido y en el tejido a una profundidad de 3 milímetros a 3 cm, tejidos que pueden comprender cualquier tejido, incluyendo sin limitación piel, músculo estriado y liso, mucosa y órganos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La siguiente descripción incluye información que puede ser útil en el entendimiento de la presente invención. No es una admisión que esta información sea técnica anterior, o pertinente, a las invenciones actualmente reivindicadas, o que cualquier publicación referida de manera específica o implícita sea técnica anterior.

Ref.: 193678 Se ha aplicado electropermeación para distribuir moléculas a tejidos sub-superficiales usando varios diseños de múltiples electrodos tal como arreglos de dos o más electrodos que se diseñan típicamente como electrodos de aguja para inserción en el tejido. En general, estos arreglos definen una zona de tratamiento que esta entre los electrodos de aguja del arreglo. Estas zonas de tratamiento comprenden por lo tanto un volumen tridimensional de tejido en donde se exponen células dentro de la zona de tratamiento a un campo eléctrico de una intensidad suficiente para provocar permeación temporal o reversible, o aun algunas veces permeación irreversible, de las membranas celulares a aquellas células que están dentro de y/o cerca del volumen tridimensional. Las prácticas actuales para electropermear células en tejido incluyen el uso de voltajes significativos a fin de impartir a través de la zona de tratamiento tridimensional un campo eléctrico relativamente uniforme. Por "relativamente uniforme" se quiere decir que las líneas eléctricas de fuerza coincidentes con aplicación de un impulso eléctrico suficiente para provocar permeación se imparte a través de las células algo uniformemente a todo lo largo del volumen de la zona de tratamiento tridimensional. Finalmente, un gran número de agujas de electrodo combinadas con grandes volúmenes de inyección y altos campos eléctricos han sido necesarios para asegurar un traslape suficiente entre un fármaco inyectado y el volumen de tejido que experimenta el campo eléctrico puesto que típicamente, el bolo de inyección que se distribuye a los tejidos se propaga rápidamente del sitio de inyección. Tiene varias desventajas el uso de altos campos eléctricos y grandes arreglos de electrodos. Por ejemplo, el uso de muchas agujas y campo eléctrico alto (voltaje) provoca más dolor en tanto que un alto volumen de inyección hace difícil de controlar la dosificación puesto que provoca desperdicio del fármaco (la mayoría del fármaco no entra en las células puesto que estará fuera de la zona de tratamiento) . También, es embarazoso el uso de múltiples dispositivos de aguja y una causa de aprensión desde el punto de vista del paciente. Además del aspecto invasivo de un dispositivo con múltiples agujas, las técnicas típicas de electropermeación, como se señala anteriormente, dan por resultado variabilidad en la electropermeación de células dentro de una zona de tratamiento. Esto es una desventaja al uso médico de electropermeación ya que la dispersión de moléculas de tratamiento del bolo inyectado en el tejido circundante da por resultado pérdidas de control con respecto a la cantidad de esta molécula de tratamiento que finalmente se transfecta en células dentro de la zona de tratamiento por el evento de electropermeación. De esta manera, existe una necesidad en las técnicas de electropermeación por un dispositivo y método para estrechar o refinar el control -sobre la "dosificación" de las moléculas de tratamiento en sitios de distribución específicos y bien definidos dentro del tejido de un paciente. Igualmente, existe aún la necesidad de la técnica de metodologías y dispositivos que puedan electropermear con menos invasión e impartan menos dolor del impulso del campo eléctrico empleado en la distribución de sustancias terapéuticas a varios tejidos incluyendo piel, músculo, mucosa y órganos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En una primera modalidad, esta invención proporciona electropermeación de células in situ, particularmente células que están localizadas de manera subcutánea, intradérmica, subdérmica y/o intramuscularmente (de manera particular músculo esquelético, músculo estriado y liso, por ejemplo, corazón, músculo) . En una modalidad relacionada, la invención proporciona la electropermeación de células cerca y/o adyacente al camino hecho por la inserción del electrodo alargado individual de aguja en el tejido. Por ejemplo, las células que se llegan a electropermear usando el dispositivo de la invención son aquellas situadas dentro de un radio del camino de la aguja dondequiera de entre 0.0 y 5 mm para comprender una zona de tratamiento en general cilindrica impartida por el nuevo diseño e impartición de impulsos del campo eléctrico impartido en el tejido por el electrodo de una sola aguja.

En una segunda modalidad, la invención proporciona cualquier número de arreglos estructurales que proporcionan al menos dos conductores opuestos de electrodo (es decir, al menos un ánodo y al menos un cátodo) situados en asociación con un árbol eléctricamente inerte, alargado, individual, árbol que por sí mismo puede comprender electrodos de un material eléctricamente inerte, tal como un plástico o policárbonato médicamente aceptable, rellenan el espacio entre los electrodos de entre 0.5 mm a 1.5 mm, o puede comprender solo electrodos separados opuestos alargados. En cualquier modalidad, los electrodos del electrodo de aguja individual que penetra el tejido o el árbol que contiene el electrodo, tienen dimensiones separadas de entre 0.5 mm y 1.5 mm. En una modalidad relacionada, los electrodos mismos pueden tener una longitud expuesta a lo largo del árbol alargado donde quiera de la longitud completa de la aguja a solo una sección de la aguja, tal como cerca de la punta de penetración del árbol. Además, los electrodos pueden tener dimensiones en sección transversal de entre 0.005 y 0.80 mm. En aun otra modalidad de arreglo estructural, el electrodo de una sola aguja puede comprender una aguja hipodérmica que comprende al menos dos electrodos alargados separados a lo largo de al menos una porción de la longitud del exterior de la aguja hipodérmica. Por ejemplo, la aguja hipodérmica puede incluir al menos dos electrodos (es decir, un ánodo y un cátodo) que corren a lo largo de una porción de la longitud de la aguja. (Ver Figura 1) . En modalidades de trabajo, cada electrodo se conecta a una fuente de energía eléctrica para generar un campo eléctrico entre polos opuestos, es decir, un electrodo es un ánodo y el otro es un electrodo de cátodo. En otros ejemplos, se pueden formar múltiples electrodos en el exterior de una aguja de inyección hipodérmica tal como se describe en la Figura 3 que comprende múltiples electrodos rectos y paralelos, o como se representa en las Figuras 2 y 4 que comprende múltiples electrodos en espiral al rededor de la aguja de inyección. En aun modalidades adicionales, los electrodos de una sola aguja se pueden fabricar usando cualquier número de métodos bien entendidos que incluyen grabado y estratificado por tecnologías con sistemas micro-electro-mecánicos (MEM) . En estos métodos de fabricación, se usan procesos de micromaquinado para adicionar o quitar capas de sustancias importantes a la fijación apropiada, aislamiento apropiado y conducto de impulsos eléctricos y circuitería. Las Figuras 13A, 13B, 13C, 13D y 13E son fotografías de la modalidad en donde los electrodos se graban sobre el árbol de la aguja de distribución. Específicamente, se ha revestido una capa de electrodo por arriba de una capa de una sustancia inerte (parileno) que por sí mismo se ha estratificado sobre el árbol de la aguja hipodérmica. Los métodos adicionales para fabricar los electrodos alargados incluyen tecnologías de extrusión en donde los conductores de electrodo se forman en y/o a lo largo del árbol de una composición eléctricamente inerte que tiene calidades aislantes, tal como un plástico, un derivado de poliéster, o polivinilcloruro (PVC) , o fibra de carbono aislante. Como se muestra en la Figura 14A y 14B, se puede extruir una aguja hueca alargada con el componente de electrodo, tal como por ejemplo, alambre ya sea a lo largo de lados opuestos del árbol hueco o de una manera en espiral como se muestra en la Figura 14B. Aun además, el árbol de la aguja también puede comprender secciones sin electrodos expuestos. Por ejemplo, un extremo del árbol de la aguja se conecta a un cubo que forma un conector para conectarse a una fuente de fluido, tal como por ejemplo, una jeringa. El aislamiento cerca o a lo largo de esta sección del árbol puede proporcionar disminución adicional de sensación de estímulos eléctricos perceptible por el paciente. En aún una modalidad adicional con respecto a cualquier configuración de electrodo descrito en la presente, cada uno de los electrodos se pueden energizar de manera individual de modo que cualquier combinación de los electrodos se puede energizar en pares (es decir, un cátodo y ánodo) de manera simultáneamente conjunta, o en cualquier secuencia determinada, y además usando cualquier tipo de impulso que incluye sin limitación monopolar, bipolar, decaimiento exponencial, o combinaciones de tren de impulsos de cualquiera de los anteriores.

En una tercera modalidad, la invención proporciona el uso de voltaje relativamente bajo y/o baja corriente, que a su vez no sólo proporciona suficiente energía eléctrica para hacer permeación reversible de células en la zona de tratamiento, sino también permite un bajo nivel de dolor experimentado por sujetos durante la aplicación de los impulsos eléctricos en el tejido circundante, esta aplicación que usa fuerzas nominales de campo eléctrico en general de entre 1 y 100V, típicamente entre 2 y 50V, de manera más preferente de entre 3 y 25V. En un aspecto relacionado, la corriente eléctrica empleada en el dispositivo de la invención y métodos de la invención usa en general entre 1 y 400 miliamperios, típicamente entre 5-200 miliamperios, y de manera más preferente entre 20 y 100 miliamperios. En una modalidad relacionada, el amperaje elegido depende del área superficial total de los electrodos. Por ejemplo, el dispositivo puede emplear un intervalo entre 10 a 40, o 25 a 100, o 50 a 150, o 125 a 200, ó 175 a 250, o 225 a 300, 250 a 300 ó 300 ó 400 miliamperios dependiendo del área superficial total del electrodo de cada electrodo. Entre más pequeña sea el área superficial, menor será el amperaje necesario para lograr un campo eléctrico electropermeador en el tejido in si tu . Se pueden aplicar impulsos entre 1 y 1000 milisegundos . En otra modalidad, la invención proporciona la distribución de moléculas de tratamiento a varias concentraciones (por ejemplo entre 0.05 µg-3 mg/ml) y de manera preferente a bajos volúmenes de bolo (por ejemplo, en general de 1 µl a 1 mi) . En una modalidad relacionada, usando una modalidad estructural incluyente de un tubo de distribución asociado con el árbol de electrodo de una sola aguja, el volumen de las moléculas de tratamiento inmediatamente después de la inyección en el tejido (tal como inyección controlada en donde el compuesto inyectado se distribuye durante la inserción de la aguja) permanece sorprendentemente a un nivel sustancial en la vecindad del camino de la aguja de inyección. Las moléculas de tratamiento se contempla que incluyan fármacos terapéuticos, por ejemplo, moléculas pequeñas, compuestos orgánicos, así como proteínas, y ácidos nucleicos que codifican para polipéptidos que tienen ya sea una actividad biológica o que inducirán una respuesta inmunitaria en el hospedero una vez que este polipéptido se exprese en la célula electropermeada. Los polipéptidos una vez expresados en las células están disponibles para interactuar con maquinaria metabólica celular y las rutas del sistema inmunitario. En aun otra modalidad, la energía eléctrica usada para emitir impulsos al tejido proporciona un campo eléctrico único que es diferente de los campos anteriores aplicados usados para electropermeación de tejidos similares. De manera específica, los campos eléctricos de la técnica anterior imparten de manera intencional e inherentemente lo que se ha reconocido en las técnicas de electropermeación como un campo eléctrico "uniforme" que significa que la energía eléctrica aplicada es de fuerza suficiente para impartir una fuerza de campo nominal y una caída de voltaje relativamente uniforme a través de la zona de tratamiento creada al separar ampliamente los electrodos a una distancia determinada uno del otro y al colocar la zona de tratamiento objetivo óptimamente central entre los electrodos separados. Estos diseños de arreglos de electrodos cuando se emiten impulsos en el tejido tienden a electropermear células principalmente dentro de la zona limitada por los electrodos en general en la vecindad de las líneas eléctricas de fuerza y aun menor grado una zona de células situada justo adyacente que circunda la zona de tratamiento tridimensional. En contraste, la presente invención usa campos eléctricos que comprenden un campo "no uniforme" en general cilindrico o columnar que se crea alrededor de la longitud del árbol de la aguja, creando de este modo una zona de tratamiento de células que esta dentro de un área suficientemente cercana a los electrodos centralmente colocados que se van a someter a un campo de electropermeación "fuera de" la ubicación inmediata de los electrodos, de fuerza suficiente para permear estas células. Esta zona de tratamiento es completamente externa a y circunda la aguja central y los electrodos y el campo no uniforme se disipa con relación a la distancia hacia afuera del electrodo/aguja. En general, se piensa que la disipación de la energía eléctrica conforme se incrementa la distancia del electrodo de una sola aguja es paralela a la disipación encontrada en otro fenómeno físico en donde la energía, aquí suficiente energía para permear de manera reversible células, se disipa a una velocidad exponencial. Sin embargo, esta velocidad de disipación si es aplicable no afecta de manera negativa el funcionamiento del dispositivo de la invención por el resultado propuesto de las sustancias de distribución en células en una zona definida. De esta manera, puesto que la energía eléctrica necesaria para provocar permeación celular se disipa con la distancia de la fuente de campo eléctrico, el área alrededor del camino de la aguja que es susceptible a electropermeación se confina inherentemente a un núcleo central que correlaciona a la longitud del camino de la aguja y lateralmente a un radio determinado que forma por lo tanto una zona de tratamiento en general cilindrica de radio variable dependiendo de la energía de impulso impartida a los electrodos. En una modalidad relacionada adicional, entre más energía se use para la emisión de impulsos, mayor será el potencial de dañar las células directamente en contacto con los electrodos. Es aún una intención adicional de los métodos de la invención emplear la capacidad para provocar este daño para el propósito de estimular adicionalmente el sistema inmunitario. De esta manera, se pueden usar regímenes de tratamiento que impartan de manera intencional una energía mayor en lugar de menor para proporcionar un estímulo para la actividad de la respuesta inmunitaria alrededor del sitio de tratamiento. En otras modalidades, el dispositivo se puede usar para distribuir fármacos, polipéptidos naturales que tienen una actividad biológica, y genes que codifican para estos polipéptidos que se pueden expresar in si tu en células dentro de la zona de tratamiento para tratar trastornos o para modular una respuesta inmunitaria en el hospedero y/o para tratar una variedad de enfermedades que incluyen pero no se limitan a enfermedades provocadas por organismos patógenos y virus y cánceres. Otras características y ventajas de la invención serán evidentes de las siguientes figuras, descripción detallada y reivindicaciones anexas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es una Figura que representa una aguja hipodérmica con electrodos alargados integrados en la misma.

La aguja presenta un orificio para distribuir una formulación líquida desde un lumen que corre a través de la misma, y un orificio para conectarse a un depósito que tiene el fluido. La Figura 2 representa una modalidad alternativa del dispositivo de la invención en donde los electrodos de ánodo y cátodo están paralelos entre sí a través de un plano formado en una espiral alrededor de la aguja. La Figura 3A es otra modalidad alternativa en donde una aguja de distribución comprende una multiplicidad de electrodos de ánodo y cátodo que corren rectos y paralelos a lo largo de la longitud de la aguja de distribución. Como también se representa, esta Figura incluye un ejemplo de un conector para conectar los electrodos a una fuente de energía eléctrica. La Figura 3B representa una vista de la sección transversal de un ejemplo de un electrodo de la invención a lo largo de la línea A-A. Como se muestra, en una configuración, los electrodos se pueden estratificar por cualquier número de técnicas conocidas por los expertos en las técnicas de fabricación en las secciones exteriores de un tubo de distribución y un lumen. En la Figura se representa una aguja interior 53 con el lumen 54 circundado por un material aislante 55 en el cual se estratifican los electrodos. La Figura 4 es otro ejemplo de una modalidad que comprende electrodos en espiral alrededor de la aguja de distribución. Los electrodos en espiral pueden comprender una multiplicidad de pares de ánodo y cátodo, pero típicamente comprenden uno o dos pares de electrodos, cada par que comprende un ánodo y un cátodo. Las Figuras 5A-5C representan una modalidad de la invención en donde el electrodo de la invención se muestra que comprende modalidades adicionales que incluyen un depósito, típicamente un depósito estilo jeringa, y una cubierta aguda que es capaz de retraerse conforme se inserta la aguja en el tejido de un paciente. En la figura también muestra otras características que se pueden incorporar dentro del dispositivo de la invención tal como una membrana resiliente que se puede perforar tal como por una aguja para llenar el depósito y mecanismos para permitir que la cubierta aguda y el émbolo de la jeringa se mantengan en su lugar en ya sea la posición extendida o retraída. Además, la cubierta aguda retraíble también actúa como una guía de jeringa y se puede adaptar con topes para actuar como una guía de profundidad. Aunque no se muestra, el electrodo de una sola aguja se puede adaptar a una jeringa y unir a un dispositivo de electropermeación de distribución simultánea de fluido/distribución automática en aguja tal como aquel representado en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 10/612,304 y PCT/GB2003/002887. En esta modalidad, el dispositivo solo tendrá una aguja y una jeringa. La Figura 6 muestra una representación del dispositivo de la invención en uso en donde durante la inserción o después de que se inserta la aguja de electrodo/distribución en el tejido, el material fluido administrado, los electrodos se energizan para impartir un campo eléctrico hacia afuera del camino de la aguja y en el tejido. El campo eléctrico se disipa hacia afuera en el tejido desde el sitio de la aguja insertada. La Figura 7 muestra una vista superior de un tejido hipotético y una representación del campo eléctrico típico que el dispositivo de la invención generaría en el tejido que circunda el camino de la aguja y que tiene dimensiones laterales (a) y (b) . Las Figuras 8A-8C son figuras que muestran arreglos de la técnica anterior con típicamente líneas relativamente uniformes de fuerza y campos eléctricos correspondientes entre "las agujas del arreglo como lo opuesto aquellas de la invención en donde líneas no uniformes de fuerza y el campo eléctrico respectivo circundan el arreglo y se disipan rápidamente del mismo. Por ejemplo, la Figura 8A muestra tres electrodos opuestos en un arreglo lineal en donde las líneas de fuerza entre los electrodos son relativamente uniformes. En las Figuras 8B y 8C se representan arreglos circulares en donde la zona de tratamiento está central a los electrodos y bajo líneas relativamente uniformes de fuerza y campos eléctricos respectivos (individualmente emitidos con impulsos en pares opuestos, Figura 8B, o emitidos con impulsos en pares de electrodos opuestos en diferentes orientaciones, Figura 8C) . Las Figuras 9A-9D muestran aun una modalidad adicional del dispositivo de la invención que comprende una guía para descansar la aguja y depósito para penetración del tejido que se va a tratar en un ángulo agudo para el uso en los métodos que incluyen distribución de sustancias de tratamiento cerca de la superficie del tejido. Este ángulo esta típicamente entre 3 y 25 grados desde el plano formado por el área en general de la superficie del tejido. Las Figuras 10A y 10B muestran una vista parcial de las agujas de distribución que comprenden electrodos expuestos cerca de la punta de la aguja de distribución. La Figura 10A representa una aguja que soporta electrodos rectos en tanto que la Figura 10B representa una aguja que soporta electrodos en espiral. Los conductores para cada uno de los ánodos positivo y negativo se representan corriendo en una sección interna de la aguja. También, esta representación se propone que represente que la porción superior de las agujas alargadas puede comprender aislamiento ya sea alrededor de los conductores del electrodo y/o que revista el árbol superior de la aguja. Las Figuras HA y 11B muestran los resultados de la electropermeación en un tejido en donde las células principalmente cerca del camino de la aguja se han afectado por permeación. En la Figura HA está una serie de fotos que muestran cortes adyacentes de tejido en tanto que la Figura 11B muestra un acercamiento de un corte central directamente a lo largo del camino de la aguja. La Figura 12 muestra los resultados de una inyección única en músculo alto de conejo de un ácido nucleico que contiene un vector de expresión que codifica para una proteína marcadora fluorescente (GFP) usando un dispositivo de electropermeación de acuerdo a la invención. Las Figuras 13A, 13B, 13C, 13D y 13E muestran fotografías aumentadas de una aguja hipodérmica prototipo en donde se han grabado electrodos alargados de oro sobre una aguja normal de inyección usando tecnología de MEM, es decir, micro-estratificación, y grabado y re-estratificación de materiales sobre el árbol de aguja de inyección base tal que los electrodos comprendan 1/4 de la circunferencia del árbol de la aguja cada uno. La Figura 13A muestra una vista de la aguja que muestra un electrodo largo que corre por la longitud de la aguja. En la Figura 13B, muestra una foto en detalle de un ángulo que permite la visualización de las secciones terminales de ambos electrodos de oro. La Figura 13C es otra perspectiva que muestra el detalle de las secciones terminales de los electrodos grabados sobre el árbol de la aguja. Las Figuras 13D y 13E muestran otra modalidad en donde los electrodos trabajados con MEM son 1/16 de la circunferencia del árbol de la aguja.

Las Figuras 14A, 14B y 14C son Figuras que muestran modalidades adicionales del diseño de una sola aguja en donde en el árbol comprende material eléctricamente inerte tal como por ejemplo, plástico extruido con conductores de electrodo construidos en el árbol hipodérmico extruido. La Figura 14A representa electrodos rectos que corren paralelos al árbol de la aguja. La Figura 14B representa electrodos en una espiral alrededor del árbol . La Figura 14C representa la sección transversal AA-AA de la Figura 14A que muestra una modalidad en donde el electrodo del árbol se puede conectar a los conductores de electrodo colocados en el cubo de la aguja. La Figura 15 es una gráfica que muestra el nivel de anticuerpos de conejo anti-IgG de humano producidos después del impulso de electropermeación usando la invención de una sola aguja (M) versus sin electropermeación (A) . La Figura 16 es una gráfica que muestra el nivel de anticuerpos de conejo anti-SEAP producidos después del impulso de electropermeación usando la invención de una sola aguja ( ) versus sin electropermeación (A) . Las Figuras 17A y 17B son fotografías que muestran los resultados de la expresión de la proteína fluorescente verde (GFP) después de la inyección de ADN de plásmido que codifica para GFP seguido por nada de electropermeación. En combinación de luz natural y fluorescente, la Figura 17A muestra cortes adyacentes de tejido en la vecindad del sitio del camino de la aguja/inyección. Las fotos no muestran expresión sin electropermeación. Las Figuras 18A y 18B son fotografías que muestran combinación de luz natural y fluorescencia verde, o fluorescencia sola, respectivamente, en donde la inyección de ADN de plásmido que codifica para GFP se siguió por electropermeación llevada a cabo usando un electrodo de una sola aguja que comprende una aguja de calibre 23 y electrodos de ánodo y cátodo que tiene un ancho de 1/16 la circunferencia del árbol de la aguja. En este experimento, los electrodos se emitieron con impulsos a una corriente constante de 50 mA. Las Figuras 19A y 19B son fotografías que muestran la combinación de luz natural y fluorescencia verde o fluorescencia únicamente, en donde la inyección de ADN de plásmido que codifica para GFP se siguió por electropermeación llevada a cabo usando un electrodo de una sola aguja que comprende una aguja de calibre 23 y electrodos de ánodo y cátodo que tienen un ancho de 1/16 la circunferencia del árbol de la aguja. En este experimento, los electrodos se emitieron con impulso a una corriente constante de 100 mA. Las Figuras 20A y 20B son fotografías que muestran la combinación de luz natural y fluorescencia verde, o fluorescencia únicamente, en donde la inyección de ADN de plásmido que codifica para GFP se siguió por electropermeación llevada a cabo usando un electrodo de una sola aguja que comprende una aguja de calibre 23 y electrodos de ánodo y cátodo que tienen un ancho de 1/4 la circunferencia del árbol de la aguja. En este experimento, los electrodos se emitieron con impulsos a una corriente constante de 50 mA. Las Figuras 21A y 21B son fotografías que muestran la combinación de luz natural y fluorescencia verde, o fluorescencia únicamente, en donde la inyección de ADN de plásmido que codifica para GFP se siguió por electropermeación llevada a cabo usando un electrodo de una sola aguja que comprende una aguja de calibre 23 y electrodos de ánodo y cátodo que tienen un ancho de 1/4 la circunferencia del árbol de la aguja. En este experimento, los electrodos se emitieron con impulsos a una corriente constante de 100 mA. Las Figuras 22A y 22B son fotografías que muestran la combinación de luz natural y fluorescencia verde, o fluorescencia únicamente, en donde la inyección de ADN de plásmido que codifica para GFP se siguió por electropermeación llevada a cabo usando un electrodo de una sola aguja que comprende una aguja de calibre 23 y electrodos de ánodo y cátodo que tienen un ancho de 1/4 la circunferencia del árbol de la aguja. En este experimento, los electrodos se emitieron con impulsos a una corriente constante de 150 mA. Las Figuras 23A y 23B son fotografías que muestran la combinación de luz natural y fluorescencia verde, o fluorescencia únicamente, respectivamente, en donde la inyección de ADN de plásmido que codifica para GFP se sigue por electropermeación llevada a cabo usando un electrodo de una sola aguja que comprende electrodos que se separan 1 mm sin modalidad de distribución de fluido. En este experimento, los electrodos se emiten con impulsos a una corriente constante de 75 mA. Las Figuras 24A y 24B son fotografías que muestran la combinación de luz natural y fluorescencia verde, o sólo fluorescencia, respectivamente, en donde la inyección de ADN de plásmido que codifica para GFP se sigue por electropermeación llevada a cabo usando un electrodo de una sola aguja que comprende electrodos separados 1 mm sin modalidad de distribución de fluido. En este experimento, los electrodos se emiten con impulsos a una corriente constante de 150 mA. Las Figuras 25A y 25B son fotografías que muestran la combinación de luz natural y fluorescencia verde, o sólo fluorescencia, respectivamente, en donde la inyección del ADN de plásmido que codifica para GFP se sigue por electropermeación llevada a cabo usando un electrodo de una sola aguja que comprende electrodos que se separan 1 mm sin modalidad de distribución de fluido. En este experimento, los electrodos se emiten con impulsos a una corriente constante de 250 mA.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En una primera modalidad, la invención comprende un dispositivo para electropermeación de tejido in vivo que comprende un árbol hueco hecho de un material capaz de inserción en un tejido u órgano biológico in si tu y de la distribución a través del mismo de un medio fluido (es decir, un árbol de aguja de distribución) , el árbol que comprende además al menos dos electrodos expuestos al menos en parte en una superficie exterior del árbol, en donde los electrodos que están separados uno del otro y situados paralelos uno con respecto al otro a lo largo del árbol de la aguja. Las modalidades para los electrodos pueden emplear una variedad de diseños estructurales de electrodo. Por ejemplo, se pueden colocar electrodos de ánodo y cátodo en asociación con una aguja de distribución que corre paralela a otra y a la longitud de la aguja de distribución tal como se describe en las Figuras 1 y 3A-3B o que están paralelas entre sí pero están en espiral alrededor del árbol de la aguja como se representa en las Figuras 2 y 4. El dispositivo de la invención también incluye conductos eléctricos que conectan cada uno de los electrodos a una fuente de energía eléctrica en donde los electrodos cuando la aguja se inserta en el tejido de un paciente, son capaces de ser energizados de forma individual, generando un campo eléctrico a las células en una zona de tratamiento que circunda la aguja suficiente para provocar que las células a lo largo y cerca de un camino hecho por la inserción de la aguja en el tejido se lleguen a permear de manera reversible para permitir que entren a las células las moléculas de tratamiento. La Fabricación de este electrodo que contiene agujas de distribución de fluido se puede llevar a cabo por cualquier número de métodos bien conocidos que incluyen micromaquinado tal como se entiende comúnmente como tecnología de MEM. Por ejemplo, se puede revestir una aguja hipodérmica normal (que puede ser de cualquier calibre tal como calibre 20, calibre 21, calibre 22, calibre 23, calibre 24, calibre 25, calibre 26, calibre 27, calibre 28, y calibre 29) con un material eléctricamente inerte seguido por depósito de material eléctricamente conductor tal como oro, seguido a su vez por grabado de material conductor en la orientación deseada en la superficie de la aguja. De manera específica, en general, el proceso comprende limpiar el árbol de la aguja hipodérmica en preparación para el depósito de la sustancia inerte, por ejemplo, un polímero que tiene propiedades de adherencia uniforme a superficies, tal como parileno. Después de la remoción del árbol metálico, se deposita parileno, tal como por depósito al vacío, sobre la aguja. Esto se graba a su vez usando un láser para depositar material conducible de electrodo, tal como oro, seguido a su vez por remoción selectiva del oro para formar electrodos en un patrón predeterminado en el árbol de la aguja. En la presente invención, el uso de la tecnología de MEM proporciona la capacidad de manipular la aguja tridimensional y los revestimientos y grabados a una escala miniatura. La capacidad de fabricar un electrodo de una sola aguja se confirma por las fotografías de las Figuras 13A a 131E. También se puede llevar a cabo la fabricación por tecnología de extrusión. Como se representa en las Figuras 14A-14C, en este aspecto, los electrodos 202 y 203 (Figura 14A) se extruyen como elementos de alambre fino con una sustancia eléctricamente inerte tal como cloruro de polivinilo o similar de una manera lineal. La punta de la aguja 204 se puede trabajar a máquina o cortar a una punta penetrante en el otro extremo equipado con un cubo 200 que comprende los conductores 201A y 201B de electrodo y un adaptador 205 para la unión a una fuente de medio fluido. La Figura 14B representa un ejemplo de una modalidad estructural que comprende una aguja extruida con electrodos en espiral y conductores 210 y 211 de electrodo. En una segunda modalidad, la invención comprende un método para distribuir moléculas a células in vivo, que comprende proporcionar al tejido de un paciente que contiene estas células una aguja de inyección que comprende además al menos dos electrodos alargados (es decir, un cátodo y un ánodo) colocados a lo largo del árbol de la aguja y al menos un depósito que contiene las moléculas en donde el depósito y las moléculas están en comunicación para fluidos con un lumen que corre a través del árbol de la aguja, inyectar las moléculas en el tejido, y energizar los electrodos con energía eléctrica para proporcionar un impulso eléctrico suficiente para provocar que las células en la vecindad del sitio de inyección y el camino de la aguja se lleguen a permear de forma reversible, electropermeando de este modo las células para su captación de las moléculas . En una tercera modalidad, el dispositivo proporciona electropermeación en células en una ubicación estrechamente definida, particularmente células a lo largo de o cerca del camino hecho por la aguja de inyección. En general, las células consideradas dentro del sitio de tratamiento son aquellas células que están en un radio alrededor del camino de la aguja de aproximadamente 5 mm, de manera más típica alrededor de 3 mm, y aun de manera más particular aproximadamente 2 mm y de manera más particular aproximadamente 1 mm. En una modalidad relacionada, la generación de campo eléctrico suficiente para electropermeación de células dentro del sitio de tratamiento es un campo que se debilita hacia afuera desde la aguja de inyección central tal que el sitio en el tratamiento se define por la incapacidad de la energía de impulso para extenderse en los tejidos mas allá de una cierta distancia desde los electrodos.

En una modalidad adicional relacionada, las células de la invención para el novedoso uso de una sonda alargada individual (que comprende la aguja de inyección y los electrodos) para realizar electropermeación in si tu de un conjunto altamente localizado en células en el tejido. En otra modalidad, el dispositivo de la invención se puede usar con cualquiera de una variedad de condiciones de emisión de impulsos eléctricos. Por ejemplo, los electrodos se pueden cargar con al menos un impulso de corriente constante en el intervalo de entre 1-400 miliamperios, típicamente entre 5-200 miliamperios, de manera más preferente entre 20 y 100 miliamperios. En otro ejemplo, los electrodos se pueden cargar con un impulso de voltaje en el intervalo de 1 a 100 voltios. Además, el impulso eléctrico puede ser ya sea un impulso monopolar o bipolar en donde el impulso puede ser una secuencia de impulso único, impulso doble o múltiples impulsos que tiene varias características tal como una caída establecida de voltaje, trenes de impulsos formados variables, o impulsos que emplean corriente constante. En otras modalidades, el dispositivo y método proporciona la distribución o transfectación de fármacos farmacéuticos, proteínas, ácidos nucleicos que incluyen ADN y ARN, y modificaciones sintéticas de los mismos como son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica, en los tejidos del paciente, particularmente a células que residen en los espacios subcutáneo, intradérmico y subdérmico así como compartimientos de músculo esquelético y estriado de un cuerpo mamífero, y órganos que incluyen corazón, pulmón, páncreas, bazo, hígado y órganos del tracto alimentario. Una vez transfectadas con el material seleccionado, las células se afectarán directamente por la actividad del fármaco, o proteína o ácido nucleico. Donde se transfectan ácidos nucleicos, típicamente estos ácidos nucleicos se emplean para la proteína codificada de este modo que se puede expresar en las células del sitio del tratamiento. Además, las sustancias pueden comprender citocinas, quimiocinas, y moléculas bioactivas pertinentes inmunitarias que incluyen moléculas activas tal como moléculas inmunomoduladoras seleccionadas del grupo que consiste de IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, LIF, LT, TGF-ß, IFN, TNF-a, BCGF, CD2 ó ICAM. En otra modalidad, el material que se va a distribuir a las células se puede distribuir en una forma líquida en un volumen de entre 0.01 mi a 1 mi. En una modalidad, se puede disolver el ácido nucleico que codifica para un polipéptido en cloruro de sodio (NaCl) al 0.9 %. El solvente exacto, sin embargo, no es crítico a la invención. Por ejemplo, es bien conocido en la técnica que otros solventes tal como sacarosas son capaces de incrementar la captación de ácidos nucleicos en el músculo esquelético. En una modalidad relacionada, el volumen que se va a distribuir se puede ajustar con relación a la longitud de la agua (puesto que la longitud del árbol de la aguja determinará el volumen de la sustancia que se transporte a través del mismo) , y el camino de la aguja hecho para determinar el volumen del espacio disponible para la sustancia para rellenarla, que se expresa a través de la aguja y en el camino de la aguja y el tejido circundante. Por ejemplo, se puede usar una aguja de 2 mm de largo para distribuir sustancias a tejidos de la capa cutánea y proporcionar inyección de un volumen en el intervalo de 0.01 mi a 0.05 mi, en tanto que se puede usar una aguja de 5 mm de largo para distribuir volúmenes en el intervalo de 0.1 mi a 0.15 mi, y se puede usar una aguja de 1.5 a 2 cm de largo para distribuir volúmenes en el intervalo de 0.3 mi a 0.5 mi. Otras sustancias también se pueden co-transfectar con la molécula de interés para una variedad de razones benéficas. Por ejemplo, la molécula P199 (lee, et al. PNAS . , 4524-8, 10, 89 (1992)), que se conoce que sella membranas electropermeabilizadas, puede afectar de manera benéfica las eficiencias de transfectación al incrementar la proporción de supervivencia de las fibras musculares transfectadas . Con referencia a la Figura 6, el electrodo que tiene la aguja hipodérmica se inserta en el tejido de un paciente a una profundidad deseada de penetración. El émbolo de la jeringa unida se activa para inyectar el volumen del líquido que contiene el material seleccionado para inyección, y los electrodos se, inmediatamente después, o de manera alternativa simultáneamente con la inyección del material, energizan con al menos un impulso de energía eléctrica suficiente para provocar que al menos alguna de las células en la zona de tratamiento se lleguen a permear de forma reversible. Aunque el embolo de la jeringa se activa típicamente usando medios animados, tal como por el uso de la mano, la jeringa también se puede fijar a una dispositivo de retención tal como se describe en la Figura 9, o aun un aparato automático de distribución, tal como un dispositivo descrito en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 10/612,304 presentada el 3 de julio de 2003 que se incorpora en la presente en su totalidad como referencia. En otras modalidades, la invención se puede aplicar a electropermeación de células a varias profundidades desde la superficie de un tejido corporal. Por ejemplo, además de la electropermeación de células que residen dentro de compartimientos del tejido muscular en los cuales la distribución de la sustancia se inicia por inyección de materiales en el tejido en una orientación de aproximadamente 90 grados desde la superficie del tejido, en una modalidad, el dispositivo de la invención se puede usar para electropermear células en los espacios subcutáneo, intradérmico o subdérmico de la piel . También se puede usar para electropermear sustancias en los nodulos linfáticos, o capas del tejido en otros órganos tal como tejido de vaso sanguíneos y cardiaco. Con respecto a electropermear células en cualquiera de estas ubicaciones, el uso del dispositivo para electropermear células en estas capas de tejido puede incluir el uso de ya sea agujas cortas que tienen una longitud suficiente para penetrar porciones exteriores de las capas de tejido (es decir, piel, capa subdérmica, etc.), para inyección y electropermeación a aproximadamente un ángulo de 90 grados a la superficie del tejido, o donde una aguja de distribución sea relativamente larga, tal como entre 3 y 4 cm, se puede hacer inserción de la aguja individual a un ángulo agudo al tejido de la superficie usando un dispositivo de retención como se representa en la Figura 9A. Esto permitirá la electropermeación de una mayor porción de tejido dentro de la capa deseada. Además, el ángulo agudo de inserción puede estar entre 3 a 25 grados del ángulo de la superficie del tejido. Esta superficie de tejido se puede describir como la que forma en general un área superficial plana que forma un plano que abarca el sitio para la inserción de la aguja individual/electrodo. Como se representa en las Figuras 9A a 9D, la jeringa se puede conectar a un medio de unión que se diseña para retener la aguja a un ángulo establecido en una bandeja 100 de guía plana con la aguja colocada a una distancia X establecida en el tejido como se determina en base a la profundidad deseada predeterminada de inserción de la aguja en el tejido. La bandeja guía con la aguja expuesta se pone en contacto con la superficie del tejido tal que la aguja se inserta en el tejido en el ángulo agudo preestablecido. Después de que se inserta de este modo la aguja y se expulsa la sustancia terapéutica de la jeringa, los electrodos se pueden energizar para dar lugar a la distribución del material inyectado en las células subcutáneas, intradérmicas o subdérmicas. El uso del dispositivo en un ángulo oblicuo como se analiza anteriormente también puede aplicarse para electropermear varias capas de tejido de órgano.

Ejemplos: Los siguientes ejemplos se dan para ilustrar varias modalidades que se han hecho de la presente invención. Se va a entender que los siguientes ejemplos no son comprensivos o exhaustivos de los muchos tipos de modalidades que se pueden preparar de acuerdo con la presente invención.

Ejemplo I Volviendo ahora a los varios aspectos de la invención, el dispositivo puede comprender los componentes del depósito 20 de distribución de moléculas y de la aquja 10 de electrodo como se muestra por ejemplo en (Figuras 5A-5C) . Las modalidades adicionales incluyen cubiertas aguas 11, membrana resiliente 12 que sella una porción de la estructura que comprende el depósito 20 para usos en el llenado del depósito (tal como por perforación de una aguja de jeringa) , y mecanismos tal como hoyuelos 13 y depresiones 14 y 14' en el depósito 20 que aloja la estructura para mantener las cubiertas agudas 11 en una posición semi-fija de ya sea abierta/retraída (Figura 5C) o cerrar/cubierta (Figuras 5A y 5B) . Las modalidades adicionales incluyen mecanismos para mantener el embolo 9 en una posición abierta/retraída semi-fija o cerrada/expulsada, tal como por ejemplo, los hoyuelos 15 y las depresiones 16 y 16'. Debe ser claro para el experto en la técnica que a pesar del método empleado para proporcionar la colocación semi-fija de las cubiertas agudas 11 y el embolo 9, esta colocación se puede cambiar fácilmente con ya sea energía animada, tal como fuerza por la mano, o mecánicamente, tal como por un accionador electrónicamente accionado. El extremo distante de la cubierta aguda 11 puede incluir unida removiblemente a la misma una cubierta 60 de esterilidad. La aguja 10 de electrodo puede comprender además un lumen que corre a través del mismo que termina en la punta 22 de perforación de tejido, y el orificio 25 para conexión al depósito 20 (ver Figura 1) . La aguja 10 de inyección puede ser de un calibre de entre 18 y 29 normal a los tamaños de calibre de agujas hipodérmicas . En una modalidad preferida, la aguja de distribución comprende al menos un par de electrodos, tal como los electrodos 21a y 21b de la Figura 1. Los electrodos comprenden al menos un electrodo de ánodo y un electrodo de cátodo que están en comunicación eléctrica con los conductores 24A y 24B de electrodo. Dependiendo del diseño elegido para cualquier producto de la invención particular, los conductores puede terminar en una terminal 23 de conductor (ver Figuras 3A-3B y 4, por ejemplo) , en conectarse por cualquier otro medio con alambres conductores que corren desde el electrodo a una fuente de energía eléctrica, tal como un generador de impulsos. El componente 10 de aguja puede incluir además un conector 26 (Figuras 3A-3B y 4) para la unión a un depósito de jeringa hipodérmica, o a un depósito de jeringa fijado con un mecanismo de fijación para sujetar de forma desmontable el componente 10 de aguja a un orificio de jeringa hipodérmica. En modalidades adicionales, el depósito 20 se puede fabricar con una sustancia predeterminada para tratar una condición particular. De manera alternativa, el depósito se puede llenar con una sustancia de interés ya sea al extraer esta sustancia en el depósito a través de la aguja 10 de electrodo, al extraer el embolo 9, o de manera preferente, el depósito se puede liberar primero del embolo al retraer el embolo a la posición abierta seguido por la distribución al depósito de la sustancia al inyectarla en el depósito mediante el sello resiliente 12, de manera similar al procedimiento comúnmente realizado en la extracción de fármacos de frascos estériles en jeringas y al introducirlos en otro depósito. La aguja 10 de distribución con su arreglo de electrodos (tal como electrodos 21a y b, 31a y b, 51a y b y 52a y b, o 41 y 42, Figuras 1-4, respectivamente) se puede insertar en el tejido, usualmente a 90 grados aproximados a la superficie del tejido, o de manera alternativa a un ángulo agudo con respecto a la superficie del tejido, y la sustancia inyectada en el camino de la aguja y los tejidos locales. Los electrodos se pueden energizar usando un generador de impulsos ya sea después de la inyección de la sustancia, o se pueden energizar simultáneamente con la inyección de la sustancia. Como se representa en la Figura 6, cuando se energizan con un impulso eléctrico, los electrodos soportan la generación de un campo eléctrico 20 que proporciona suficiente energía para provocar permeación reversible de las células dentro de este campo. El campo eléctrico generado no es uniforme ya que disminuye exponencialmente por la distancia desde el camino 80 de la aguja (Figura 7) . De esta manera, el campo eléctrico suficiente para proporcionar esta permeación tiene, dependiendo de la energía empleada, dimensiones laterales simétricas (a) x (b) (mostrada en la Figura 7) que forma un diámetro establecido de un campo eléctrico de electropermeación que, con respecto a la longitud del camino de la aguja, forma un volumen tridimensional definido. En general, el campo eléctrico suficiente para permeación tiene un radio desde la aguja 10 de electrodo de entre 0 y 5 mm, típicamente entre 0 y 4 mm, y de manera preferente entre 0 y 3 mm y de manera más preferente entre 0 y 2 mm. Como se entiende fácilmente por aquellos expertos en las técnicas de electropermeación, el campo generado por el electrodo de una sola aguja de la presente invención, diferente de los aparatos de electropermeación anteriores, es un campo eléctrico no uniforme en donde la intensidad del campo es mayor cerca de la aguja y disminuye como se mide hacia afuera de los electrodos . En contraste al arreglo actual de electrodos, las Figuras 8A-8C representan arreglos de electrodos anteriores en donde se emplea un campo eléctrico uniforme a través de un sitio de tratamiento de volumen grande. La presente invención es mensurablemente distinta de conceptos anteriores que sugirieron la necesidad de utilizar un campo "uniforme". Aquí, la invención emplea un campo no uniforme que proporciona permeación reversible de células a una mayor cantidad cerca de la posición de la aguja de distribución, es decir, el camino de la aguja. Esto permite a su vez un beneficio claro para determinar la ubicación precisa de aquellas células que reciben una dosis conocida de materiales terapéuticos. Esta invención a través de sus modalidades proporciona por lo tanto el "ajuste" del campo eléctrico al sitio de inyección para distribuir material a células de manera más uniforme y confinada a un área local de tejido como lo opuesto a la distribución variable permitida con los sistemas de electropermeación que usan un campo eléctrico uniforme convencional de un arreglo exterior de electrodos . Con respecto a los electrodos, en general, comprenden cualquier metal, pero de manera preferente son un metal que no imparte una toxicidad debida los iones metálicos a las células del tejido electropermeado. Estos materiales incluyen oro, tungsteno, nitruro de titanio, platino, platino-iridio, y óxido de iridio. El material de electrodo se puede formar en el tubo de distribución (es decir, aguja de inyección) tal que hay una capa de aislamiento entre los electrodos y el tubo de distribución como se sugiere en la Figura 3B. De manera alternativa, la aguja puede comprender un material que no es conductor por sí mismo eliminando la necesidad específica de aislar los electrodos del tubo de inyección. En este aspecto, el tubo de distribución se puede construir de cualquier material adecuado para la inserción en tejido in si tu que no es conductor, incluyendo, tal como un material cerámico, o plástico biocompatible endurecido, incluyendo cloruro de polivinilo o similares. En una modalidad adicional, el componente de aguja de distribución/electrodo se puede diseñar tal que los electrodos 90 ó 101 (Figuras 10A-10B) se expongan para electropermeación sólo cerca de la punta de la aguja como se representa en las Figuras 9A, y 10A y 10B. Las porciones 91 y 102 no expuestas de los electrodos se pueden aislar y correr a lo largo de la aguja de distribución exterior o interno a la aguja. De manera específica, donde se desea colocar el volumen de tratamiento definido (definido por -las dimensiones del campo eléctrico de electropermeación impartido al tejido por el arreglo de electrodos) en un tejido particular, con el intento de evitar la electropermeación de otros tejidos, se pueden usar electrodos, tal como se describe en la Figura 10, por ejemplo, para electropermear tejido muscular profundo y evitar otros tejidos que están cerca a la superficie del tejido, tal como capas de células de grasa, o de manera alternativa para electropermear tejido cerca de la superficie, tal como por ejemplo, tejidos subdérmicos, tal como se sugiere en la Figura 9A. Estas modalidades proporcionan control adicional sobre la colocación y tamaño del volumen de tratamiento.

Ejemplo II En este ejemplo, se representan resultados para distribuir moléculas por permeación reversible a células situadas a lo largo y cerca del camino formado por la inserción del electrodo de una sola aguja hipodérmica de la invención en un tejido.

Como se representa en las Figuras HA y 11B, se inyectaron músculos cuadríceps de conejo con ADN que codifica para ß-galactosidasa en un bolo que comprende 0.2 mi y concentración de 1 mg/ml . Los electrodos se emitieron con impulsos usando 2 impulsos de 250 miliamperios, 20 milisegundos de duración. Después de la electropermeación, el gen de beta-galactosidasa se expresó en las células afectadas por la electropermeación. En el día 4 después de la electropermeación, los conejos se sacrificaron y los músculos se prepararon en cortes de 3 mm de grueso a través del sitio en la inserción de la aguja individual/electrodo. Después de la fijación química, las células que expresan beta-galactosidasa en los cortes de músculo donde se visualizaron por una reacción enzimática. Las flechas en la Figura HA representan la dirección de la inserción del tubo de distribución en el músculo de los conejos. Como se muestra, la tinción se presenta predominantemente a lo largo del camino formado por la inserción en el tejido del electrodo de distribución de aguja.

Ejemplo III Este ejemplo describe experimentos que emplean un dispositivo de electropermeación de acuerdo a modalidades de la invención para distribuir ADN que codifica para proteína fluorescente verde (GFP) en el músculo cuadrípceps de conejos, los resultados se muestran en la Figura 12. Aquí, varios conejos machos blancos Nueva Zelanda, que pesan cada uno 4-5 kg (Perry Scientific, San Diego, California) , se inyectaron cada uno con un vector de expresión (gWizGFP, lote 12311, comprado de Aldevron, LLC, Fargo, ND; ver también Gene Therapy Systems, Inc., San Diego, CA) que codifica para GFP brillosa (Cheng, et al. (1996), Nature Biotechnology, vol. 14:606-9) la expresión del cual estuvo bajo el control de un promotor/intensificador temprano, inmediato, de citomegalovirus humano modificado. Antes de la inyección, cada conejo se sedó primero con acepromazina (1 mg/kg) y luego se anestesió por inyección intramuscular de una mezcla de cetamina (35 mg/kg) y xilazina (5 mg/kg) en la presencia de glicopirrolato (0.01 mg/kg), que se ha administrado anteriormente de forma subcutánea para impedir el latido desigual del corazón como resultado del tratamiento con cetamina/xilazina. El conejo entonces se rasuró en el sitio en donde se hizo la inyección, es decir, en el músculo cuadrípceps. Se pinchó un agujero en la piel que cubre el músculo al insertar primero una aguja calibre 18, y luego al ensanchar ligeramente usando un escalpelo. El dispositivo de electropermeación de una sola aguja, hecho de una aguja calibre 18 con dos electrodos paralelos aplicados opuestos entre sí a la superficie exterior de la aguja (como se representa en la Figura 1) , entonces se insertó lentamente en el tejido muscular, pausando periódicamente para inyectar ADN cada pocos milímetros a una profundidad final de inserción de aproximadamente 25 mm. Se inyectó un total de 500 ul de solución que contiene ADN que contiene 100 ug de gWizGFP en cada sitio de inyección. Brevemente después de terminar la inyección y en tanto que aún está insertado el dispositivo de aguja/electrodo a su profundidad final de inserción, se comenzó la electropermeación. Específicamente, se aplicaron cinco impulsos de 250 mA, cada uno de veinte milisegundos (ms) de duración, al dispositivo de aguja de electropermeación a intervalos de 10 Hz (es decir, 100 ms) usando un impulso sujetado por corriente (Inovio AS, Oslo, Noruega) Elgen 1000. Cuatro días después del tratamiento, se les practicó humanitariamente la eutanasia a los animales . La piel que cubre al región de la pata donde se distribuyó el vector se distribuyó cuidadosamente, después de lo cual cada animal se colocó a -20°C durante aproximadamente 1 hora. El músculo tratado entonces se removió, usando un escalpelo y luego se colocó a -20°C durante otras 1 o 2 horas. El tejido muscular congelado entonces se seccionó en cortes de aproximadamente 3 mm de grueso usando un cortador giratorio de carne. Los cortes de músculo se arreglaron en bandejas de plástico y se examinaron para la expresión de GFP usando un microscopio de disección Leica MZ 12 equipado con una combinación de luz UV y filtro de GFP. La Figura 12 es una fotografía representativa de los resultados obtenidos por este análisis, y muestra claramente que un dispositivo de electropermeación de acuerdo a la invención se puede usar para distribuir de manera exitosa un agente, por ejemplo un vector de expresión que codifica para una proteína deseada que entonces se expresa en forma activa, en las células.

Ejemplo IV En este ejemplo, en las Figuras 15 y 16 se muestran datos para el mismo, usando la configuración de electrodo de la invención, se electropermearon plásmidos que codifican para SEAP (pSEAP #3348, Aldevron) e IgG (pLNOH 2hg3 #11765, Aldevron) en células de tejidos de animales de prueba (es decir, inyección intramuscular en el tibialis anterior del animal) y la expresión se monitorizó para probar el éxito de la expresión en el músculo de conejo así como para medir las respuestas inmunitarias tanto contra una "semana" y un antígeno "fuerte" (SEAP e IgG, respectivamente) . En estos experimentos, se administraron plásmidos de SEAP e IgG a una concentración final de 1 ug/ul. Los animales usados fueron conejos machos blancos Nueva Zelanda de 3.5 a 4.5 kg. Se llevó a cabo la electropermeación usando un Elgen 1000 (Inovio AS, Oslo, Noruega, número de Serie 009) que comprendió además un generador de impulsos sujetado por corriente (prototipo) y un prototipo de una sola aguja en donde los electrodos corren paralelos al camino de inyección y aproximadamente entre 1 mm separados. Los electrodos se emitieron con impulsos de 20 milisegundos de duración con 5 impulsos cada uno a 150 mA con un intervalo de 250 milisegundos entre los impulsos (es decir, una frecuencia de aproximadamente 4 Hz) . Los electrodos se extendieron en el tejido a aproximadamente 1.0 cm de profundidad. Los experimentos comprendieron cada uno un proceso de distribución de dos pasos, es decir, inyección de la solución de plásmido (200 ul) usando una jeringa de insulina calibre 29 con inyección durante la inserción de la aguja para distribuir ADN a diferentes profundidades, seguido por remoción de la aguja del inyector y la inserción del electrodo de una sola jeringa. Como se muestra en la Tabla I posterior, cada uno de los experimentos de IgG y SEAP tienen dos grupos de animales de prueba, es decir, un conjunto de animales que recibió electropermeación y el otro que no (control) .

Tabla I Grupo # Corriente Tratamiento 150-250 100 ul x SEAP 1 mg/ml, 100 ul x 2 tibialis izquierdos, IgG 1 mg/ml 1 mA 100 ul x 2 tibialis derechos Sin EP 100 ul x SEAP 1 mg/ml, 100 ul x 2 tibialis izquierdos, IgG 1 mg/ml 2 100 ul x 2 tlbialis derechos Se tomaron muestras el Día 0, 14 y el día 21. Los animales entonces se terminaron en el día 21 con inyección subcutánea de 0.5 mi de hypnorm (Hypnorm 0.1 ml/kg) seguido por inyección intravenosa de 1 ml/kg de pentorbarbital al 10 % en la vena de la oreja. Como es claro de los resultados de las Figuras 15 y 16, los niveles de título de anticuerpo producidos por la distribución con una sola aguja están bastante en exceso del control negativo. Específicamente, los dos antígenos de prueba (IgG y SEAP) produjeron títulos con relación uno al otro como se espera con IgG que es un antígeno mucho más fuerte que SEAP (ver escala de títulos) . Ambos antígenos produjeron producción de anticuerpo en las muestras electropermeadas y virtualmente ninguna producción de anticuerpo en las muestras no electropermeadas.

Experimento V En este experimento, se probaron electrodos de una sola aguja, fabricados por MEM de prototipo en tejido de conejo usando una variedad de estrategias de emisión de impulsos y expresión de proteína fluorescente verde. Como se indica en la Tabla II, se probaron tres diferentes modalidades de electrodos, (1) un electrodo de una sola aguja en el cual los electrodos de ánodo y cátodo se aplicaron a una aguja calibre 23 a 1/16 de la circunferencia de la aguja cada uno y se aplicaron a la longitud completa de la aguja por tecnología de MEM (Figuras 13D-13E) , (2) un electrodo de una sola aguja en donde los electrodos son 1/4-ésimo de la circunferencia del lado de la aguja cada uno (Figuras 13A-13C) , y (3) un arreglo de una sola aguja en donde los electrodos están 1 mm separados sin un tubo de distribución de medio fluido. Como se muestra en la Tabla II, se realizaron las varias combinaciones de emisión de impulsos. El protocolo usado para cada animal en este experimento comprendió inyectar el plásmido de GFP a las concentraciones señaladas, electropermear el tejido usando una modalidad del electrodo de una sola aguja, seguido por sacrificio de los animales y realización de la penetración en tejido al cortar el músculo tratado en cortes adyacentes y al observar la fluorescencia. En general, debido a la dificultad en el corte del tejido para recuperar cortes paralelos al camino de la inyección, la fluorescencia de GFP en las fotografías de las figuras muestra frecuentemente círculos o elipses. Estos patrones de fluorescencia prueban que el concepto de una sola aguja es funcional y proporciona electropermeación de tejido a muy bajos voltajes y corriente eléctrica relativa en ubicaciones definidas que circundan el camino de la aguja y dentro del tejido.

Tabla II Las Figuras 17A y 17B muestran fotografías tanto de luz natural como de luz fluorescente, respectivamente, de la expresión de GFP después de la inyección de ADN de plásmido que codifica para CFP sin electropermeación. Como se indica, virtualmente no hay expresión de proteína fluorescente verde.

De esta manera, es claro que sin electropermeación no hay suficiente captación y expresión del gen deseado. Con respecto a electropermeación in si tu usando el modelo de electrodo de 1/16 de ancho, la capacidad para expresar GFP electropermeada se muestra en las Figuras 18A y 18B y 19A y 19B. Las Figuras 18A y 18B muestran los resultados de la expresión de GFP en electropermeación con una corriente constante de 50 mA, en tanto que las Figuras 19A y 19B muestran electropermeación a 100 mA. Para la expresión de GFP usando el electrodo de una sola aguja de circunferencia de 1/4, se proporcionan resultados en las Figuras 20A y 20B, 21A y 21B, y 22A y 22B, en donde se llevó a cabo la electropermeación usando 50, 100 y 150 mA, respectivamente. La expresión de GFP también se prueba usando una modalidad en donde el electrodo de una sola aguja no comprende un tubo de distribución de fluido asociado con los electrodos . Como se muestra en las Figuras 23A y 23B, 24A y 24B, 25A y 25B, esta modalidad de dispositivo de la invención se probó a 75, 150 y 250 mA cada una a corriente constante. Aquí, la cantidad de plásmido de GFP fue cinco veces la concentración de los experimentos mostrados en las Figuras 19A-22B. En consecuencia, la zona de tratamiento aparece más fácilmente. Todas las composiciones y métodos descritos y reivindicados en la presente se pueden hacer y ejecutar sin experimentación indebida en vista de la presente descripción. En tanto que las composiciones y métodos de esta invención se han descrito en términos de modalidades preferidas, será evidente para aquellos expertos en la técnica que se pueden aplicar variaciones a las composiciones y métodos y en los pasos o en la secuencia de los pasos del método descrito en la presente sin apartarse del espíritu y del alcance de la invención. De manera más específica, las modalidades descritas se van a considerar en todos los aspectos sólo como ilustrativas y no restrictivas. Todos los sustitutos y modificaciones similares aparentes para aquellos expertos en la técnica se juzgan que están dentro del espíritu y el alcance de la invención como se define por las reivindicaciones anexas . Todas las patentes, solicitudes de patente, y publicaciones mencionadas en la especificación son indicativas del nivel de aquellos expertos en la técnica a la cual corresponde la invención. Todas las patentes, solicitudes de patente, y publicaciones, que incluyen aquéllas a la cual se reivindica la prioridad u otro beneficio, se incorporan en la presente como referencia al mismo grado como si cada publicación individual se indicara de manera específica e individual para que se incorpore como referencia. La invención descrita de manera ilustrativa en la presente se puede practicar de manera adecuada en la ausencia de cualquier elemento no descrito específicamente en la presente. De esta manera, por ejemplo, en cada caso en la presente en los términos "que comprende", "que consiste esencialmente de", y "que consiste de" se puede reemplazar con cualquiera de los otros dos términos . Los términos y expresiones que se han empleado se usan como términos de descripción y no de limitación, y no hay intención que el uso de estos términos y expresiones implique excluir cualquier equivalente de las características mostradas y descritas en totalidad o en parte de la misma, pero se reconoce que son posibles varias modificaciones dentro del alcance de la invención reivindicada. De esta manera, se debe entender que aunque la presente invención se ha descrito específicamente por modalidades preferidas y características opcionales, la modificación y variación de los conceptos descritos en la presente se puede acoger por los expertos en la técnica, y que estas modificaciones y variaciones se considera que están dentro del alcance de esta invención como se define por las reivindicaciones anexas . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (34)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Dispositivo para electropermeación de tejido in vivo para distribuir sustancias terapéuticas en células del tejido, que comprende: a. un tubo alargado de distribución capaz de penetrar un tejido corporal que comprende al menos dos electrodos alargados expuestos a una superficie exterior del tubo, los electrodos están separados y eléctricamente aislados uno del otro y están colocados paralelos con respecto uno al otro; y b. conductos eléctricos capaces de conectar cada uno de los electrodos a una fuente de energía eléctrica; c. caracterizado porque los electrodos cuando el tubo se inserta en el tejido de un paciente y se energiza por la fuente de energía son capaces de generar un campo eléctrico a las células en una zona de tratamiento que circunda el tubo suficientemente como para provocar que las células a lo largo y cerca de un camino hecho por la inserción del tubo en el tejido se lleguen a permear de forma reversible para permitir que las células capten las sustancias .
2. 2. Dispositivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende un depósito expandible o contraible.
3. 3. Dispositivo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el depósito comprende una jeringa.
4. 4. Dispositivo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el depósito tiene una capacidad variable de volumen seleccionado del grupo que consiste de 0.0 a 0.5 mi, de 0.0 a 1 mi, de 0.0 a 3 mi, y de 0.0 a 5 mi.
5. 5. Dispositivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la planta de energía eléctrica es un generador de impulsos de electropermeación.
6. 6. Dispositivo de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el generador es capaz de generar impulsos eléctricos en donde el voltaje promedio puede variar entre 1 a 200 V.
7. 7. Dispositivo de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el generador es capaz de generar impulsos eléctricos que tienen una corriente de 1 mAmp a 400 mAmps .
8. 8. Dispositivo de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la corriente está dentro de un intervalo seleccionado del grupo que consiste de entre 10 y 40, 25 y 100, 50 y 150, 125 y 200, 175 y 250, 225 y 300, 250 y 300, y 300 y 400.
9. 9. Dispositivo de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el generador es capaz de generar impulsos eléctricos que tienen una frecuencia seleccionada del grupo que consiste de 1 a 10,000 Hz .
10. 10. Dispositivo de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el generador es capaz de generar impulsos eléctricos que tienen una duración de tiempo seleccionada del grupo que consiste de 0.1 a 1000 ms .
11. 11. Dispositivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el tubo es una aguja hipodérmica de un tamaño al calibre de una aguja de inyección seleccionada del grupo que consiste de calibre 20, calibre 21, calibre 22, calibre 23, calibre 24, calibre 25, calibre 26, calibre 27, calibre 28 y calibre 29.
12. 12. Dispositivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el tubo está eléctricamente aislado de cada electrodo.
13. 13. Dispositivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el tejido comprende cualquier tipo de tejido corporal, u órgano corporal, seleccionado del grupo que consiste de piel, tejido subcutáneo, tejido intradérmico, tejido subdérmico, músculo esquelético, músculo estriado, músculo liso, órganos, corazón, mama, pulmón, páncreas, hígado, bazo y mucosa.
14. 14. Dispositivo para distribuir una sustancia terapéutica en células de un tejido, caracterizado porque comprende: al menos dos electrodos alargados paralelos capaces de penetrar un tejido corporal en donde los electrodos comprende cada uno un árbol alargado que tiene un extremo próximo y un extremo distante en donde los electrodos se fijan en relación permanente uno al otro en el extremo próximo a una distancia de no más de 1 mm y en donde el dispositivo tiene componentes adicionales seleccionados del grupo que consiste de un material eléctricamente inerte en contacto con cada electrodo que corre por la longitud de los electrodos, y ningún material eléctricamente inerte entre los electrodos que corre por la longitud de los electrodos.
15. 15. Método para electropermear células in vivo con una composición terapéuticamente útil, caracterizado porque comprende : a. proporcionar un tubo para inyección de la composición que comprende al menos dos electrodos alargados colocados a lo largo de al menos una porción del tubo: b. proporcionar un depósito que contiene la composición, el depósito y la composición que están en comunicación fluida con un lumen que corre a través del tubo; c. formar un canal en un sitio preseleccionado de tratamiento de un paciente al insertar el tubo en el tejido in vivo en el paciente; d. inyectar la composición del depósito a través del lumen en el sitio de tratamiento que comprende el canal; e. proporcionar una fuente de energía eléctrica a cada uno de los electrodos suficientemente como para provocar permeación reversible de las células en el sitio de tratamiento; y f. activar la fuente de energía eléctrica para proporcionar un impulso eléctrico, electropermeado de este modo las células para su captación de la composición.
16. 16. Método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la composición comprende cualquiera de un fármaco, un ácido nucleico, un antígeno, un ácido nucleico que codifica para un antígeno expresable, un ácido nucleico que codifica para una molécula inmunomoduladora expresable.
17. 17. Método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la molécula inmunomoduladora es una citocina o una quimiocina.
18. 18. Método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la molécula inmunomoduladora se selecciona del grupo que consiste de IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, LIF, LT, TGF-ß, IFN, TNF-a, BCGF, CD2 O ICAM.
19. 19. Método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque las células comprenden células de un paciente vivo seleccionadas del grupo que consiste de células subcutáneas, células intradérmicas, células subdérmicas, células del músculo esquelético, células del músculo estriado, células del músculo liso, células de órganos, células de tejido de mama, células de páncreas, células de bazo, células de corazón, células hepáticas y células de mucosa.
20. 20. Método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque los electrodos comprenden oro y/o titanio.
21. 21. Método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el sitio de tratamiento está localizado en un músculo, brazo o torso del paciente.
22. 22. Método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la composición se inyecta en un volumen total seleccionado del grupo que consiste de 0.01 ul, 50 ul, 100 ul, 150 ul, 200 ul, 250 ul, 300 ul, 400 ul , y 500 ul .
23. 23. Método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la composición se inyecta en una concentración total de ingrediente activo seleccionada del grupo que consiste de 2 ng/ml a 3 mg/ml .
24. 24. Método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la composición se inyecta ya sea antes o simultáneamente con la activación de la fuente de energía suficientemente como para permear de manera reversible las células.
25. 25. Método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la composición después de la inyección reside en y alrededor del canal formado por la inserción del tubo en el tejido.
26. 26. Método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la composición se electropermea en las células del sitio de tratamiento.
27. 27. Método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el sitio de tratamiento comprende una zona de tejido/células que circunda un camino en el tejido hecho por la aguja y que se extiende radialmente fuera del camino a una distancia seleccionada del grupo que consiste de 1 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm y 5 mm.
28. 28. Dispositivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la fuente de energía eléctrica es un generador de impulsos de electropermeación.
29. 29. Método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el generador se emite con impulsos tal que el voltaje nominal está entre 1 y 200 V.
30. 30. Método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el generador se emite por impulsos a una corriente constante seleccionada del grupo que consiste de 1 a 400 miliamperios.
31. 31. Método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el intervalo de corriente constante se selecciona de en donde la corriente está dentro de un intervalo seleccionado del grupo que consiste de entre 10 y 40, 25 y 100, 50 y 150, 125 y 200, 175 y 250, 225 y 300, 250 y 300, y 300 y 4-00.
32. 32. Método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el generador se emite con impulsos a una frecuencia seleccionada de entre el intervalo de 1 a 10,000 Hz.
33. 33. Método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el generador se emite con impulsos durante una duración de tiempo entre aproximadamente 0.1 us a 1000 ms.
34. 34. Método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el tubo se hace de un tamaño a un calibre de una aguja de inyección seleccionada del grupo que consiste de calibre 20, calibre 21, calibre 22, calibre 23, calibre 24, calibre 25, calibre 26, calibre 27, calibre 28 y calibre 29.