KR20010005932A

KR20010005932A - 약물과 핵산의 골격 근육 내 주입방법

Info

Publication number: KR20010005932A
Application number: KR1019997009009A
Authority: KR
Inventors: 로모 터얼쥐; 마시에센 이아코브
Original assignee: 일렉트로우펙트 에이에스
Priority date: 1997-04-03
Filing date: 1998-04-03
Publication date: 2001-01-15
Also published as: JP2006061701A; DE69835761T2; NO327806B1; CA2285056C; CN1198665C; IL132103A0; US6110161A; EP1023107B1; EA002087B1; KR100427786B1; ES2273408T3; AU6990698A; DE69835761D1; AU733628B2; ATE337794T1; WO1998043702A2; NZ337853A; CN1276740A; JP2001520537A; NO994820D0

Abstract

본 발명은 약물과 핵산 같은 분자들을 생체 내 근육 세포에 전달하는 방법에 관한 것이다. 약물이나 핵산은 우선 근육 내에 한 부위 또는 여러 부위에 주입이 된다. 주입 후 즉시, 또는 짧은 시간내에 전극을 상기 주입된 부위에 위치시키고 일정한 전류를 상기 근육에 가하게 된다. 상기 전류에 의해 상기 근육은 투과성을 갖게 되어 상기 약물이나 핵산이 세포 안으로 전달되게 된다. 본 발명에 의한 전달 효율은 DNA백신을 이용한 강한 면역 반응을 가능하게 하고 전신 생물학적 활동이 관찰될 수 있는 정도의 충분한 단백질을 분비하게 된다. 상기 방법을 실시하기 위한 장치뿐만 아니라 상기 전달 방법에 사용되는 약물의 제조를 위한 약물 사용 방법과 그러한 장치의 사용 방법에 대해서도 개시되어 있다.

Description

약물과 핵산의 골격 근육 내 주입방법{Method for introducing phar-maceutical drugs and nucleic acids into skeletal muscle}

과학자들은 유방암, 결장암, 근위축증, 낭포성 섬유증 등의 많은 인체의 질병에 원인이 되는 유전자들을 밝히고 있다. 더욱이, 과학자들은 박테리아와 바이러스 항원의 유전정보에 대한 유전자들에 관하여 지속적으로 연구하고 있다.(예들 들어 바이러스 캡시드 단백질과 같은) 이러한 새로운 발견에도 불구하고, 대부분의 의학분야에서 직면하게 되는 문제들은 병을 치료하거나 유전적 면역을 하기위해 효과적인 양의 이러한 작인들을 어떤 방법으로 효과적이고 안전하게 환자들에게 전달할 수 있는가 하는 것이다.

현재 대부분의 작인 약물들은 복용하거나 정맥투여을 하게 된다. 그러나, 복용, 정맥 약물과 유전자 전달 방법들은 다소의 단점을 가지고 있다. 첫째는, 복용하거나 정맥투여된 약물들의 상당량은 목적 기관이나 세포에 도달하기 전에 인체 내에서 감소되어 전달되게 된다. 예를 들어, 위와 장에 있는 산이나 엔자임은 많은 약물들을 무용하게 만들 수가 있다. 마찬가지로, 유전자들은 DNA를 파괴하는 간과 혈액내 있는 단백질에 의해서 급격하게 파괴될 수가 있다. 더욱이, 정맥으로 전달되는 약물과 유전자들은 감염된 기관이나 세포에 도달하기 전에 간이나 면역시스템에 의해서 무용하게 되기도 한다. 두번째는, 복용약, 정맥약과 유전자 전달은 비특정화된다는 것으로 즉, 이러한 약과 유전자는 목적하는 기관이나 목적하지 않는 기관 모두에 전달된다는 것이다.

골격 근육은 약물전달, 유전자 치료와 유전적 면역에 있어서 아주 적합한 것으로 기대되는 곳이다. 첫 번째는, 골격 근육은 사람 몸무게의 50%이상을 구성하고 있으며 인체의 다른 조직이나 기관에 비하여 쉽게 접근이 가능하다. 두 번째로는 근육내에 약물과 유전자 전달로 치유할 수 있는 질병인 뒤센형 근위축증(DMD), 진성 당료병, 과유지질혈증, 심장혈관 질병과 같은 선천적 또는 후천적인 장애들이 있다. 세 번째로는 근육은 접근이 용이하고 근육에서 만들어진 단백질이 분비가 되어 면역 반응을 끌어낼 수 있기 때문에 근육은 유전적인 면역에 이상적인 곳이다. 마지막으로 골격 근육세포들은 분열을 하지 않는다. 그러므로, 골격근육 세포들은 지속적으로 분열하는 다른 형태의 세포들보다 오랜 기간동안 어떤 유전자에 의해 코딩된 단백질을 표현할 수가 있다. 이는 상기 단백질을 오랜 기간 유지하기 위해 약간의 조작만으로 가능하기 때문이다.

그러나, 현재 생체조건 안에서, 골격근육 안에 약물과 DNA를 효과적으로 투여하는 비바이러스성 방법(non-viral method)은 없다. 근육내 DNA 주입과 같은 골격근육 내에 약물과 DNA를 전달하는 시술 방법이 몇 가지가 알려져는 있다. 그러나, 직접 근육 주입에 대한 임상적 적용은 일반적으로 1%미만의 낮은 트렌스펙션 효율때문에 그 사용은 제한되어 있다. 이를 재생된 근육에서 실시하게 되면 트렌스펙션 효율이 향상된다는 것이 입증되어 있다. 주입은 DNA주입 전에 비부카인(Bivucain) 약으로 3일 전에 유도된다. 비부카인(Bivucain)에 의해 유도된 재생 근육에 DNA주입을 하는 동안은 높은 효율을 보이나 이러한 방법은 근육에 여러 손상의 원인이 되기때문에 인체의 적용에서는 제한적으로만 사용되어 왔다.

상술한 바와 같이, 본 발명은 시술에 있어서 감염된 기관이나 세포에만 약물과 DNA를 전달하는 비바이러스성 방법을 제공하는 진보된 시술이라고 할 수 있다. 또한 본 발명은 시술에 있어서 골격 근육에 직접 약물과 DNA를 전달할 수 있는 일렉트로폴레이션(electroporation) 방법을 제공하는 진보된 시술방법이라고 할 수 있다. 일렉트로폴레이션 방법를 사용하여 치료에 효과적인 양의 약물과 DNA를 골격근육 여러 부위에 동시에 전달할 수 있게 된다면, 본 발명은 새로운 진보된 시술이 될 것이다. 상기 방법이 전달효율을 조절할 수 있다면 본 발명은 다른 진보된 시술이라고 할 수가 있다.

이하에서는 이러한 방법에 대해서 기술하게 된다.

〈발명의 간단한 요약〉

본 발명은 약물과 DNA를 골격 근육에 직접 전달하거나 트랜스펙트하는 방법에 관해 제시하게 된다. 이론에 구속되지 않는다면, 본 방법은 일렉트로폴레이션 방법과 유사하다. 일렉트로폴레이션은, 보통 세포는 마치 전류가 흐르지 않는 축전기처럼 행동을 한다는 원리에서 근거한 것이다. 그러므로, 고전압이 걸린 세포는 순간적인 투과 구조를 형성하거나 세포막에 미세구멍들을 만들게 된다. 이렇게 형성된 상기 구멍들은 약물, DNA와 다른 극성 화합물들이 세포의 안 쪽으로 들어갈 수 있을 정도로 충분히 크다. 시간이 지나면 세포막에 구멍들은 닫치게 되고 세포는 다시 외부에서 침투할 수 없는 상태가 된다.

그러나, 보통의 일렉트로폴레이션은 0.4에서 수 kV/cm의 높은 전기장을 사용하게 된다. 보통의 일렉트로폴레이션과는 달리, 본 발명은 약 25V/cm에서 250V/cm정도의 전기장을 사용하게 된다. 이런 낮은 전기장 사용을 사용하기 때문에 근육에 손상을 줄일 수 있으며 트랜스펙션 효율을 떨어뜨리지 않고 오히려 증가시킬 수 있다고 생각할 수가 있다. 더욱이, 본 발명의 방법을 이용하므로써 주파수, 펄스 폭과 펄스의 숫자와 같은 파라메타들을 바꿈으로 해서 트랜스펙션 효율을 정확히 조절할 수가 있다.

DNA 트랜스펙션 효율의 증가는 DNA 주사후에 짧은 시간내지는 즉시 전기적인 자극이 근육에 가해졌을 때만 관찰된다. 그런데, 자극에 의해 유도된 조직의 반투과적인 특성은 가역적으로 나타난다. 더욱이, 이러한 특성은 근육에 작용하는 전류값에 따라 다르며 신경을 통해 유도된 활동은 트랜스펙션 효율에 영향을 주지 않는다.

일단 트랜스펙션된 뒤에는, 상기 근육세포들은 핵산에 의해 코드화된 단백질을 표현할 수 있게 된다. 그러므로, 본 발명의 상기 트랜스펙션 방법은, 예를 들어서 유전 면역(DNA 백신)에 관한 표현 벡터를 트랜스펙트할 수가 있다. 하나의 실시예로는, 쥐 아그린 cDNA가 포함된 플라스미드를 토끼에 트랜스펙트하는 것이다. 상기 트랜스펙트된 근육들은 아그린 단백질을 만들어 분비하게 된다. 트랜스펙트된 뒤 19일 째에는 토끼의 혈청은 쥐의 아그린에 대한 상당한 항체들을 갖게 된다.

두 번째 실시예로는, 본 발명의 방법을 사용하여 인체 실리에리 뉴로트로픽 인자(ciliary neurotrophic factor)인 단말마적(agonistic) 변위 DH-CNTF와; 인체 실리에리 뉴로트로픽 인자인 반단말마적 변위 AADH-CNTF와; DH-CNTF의 분비된 형태인 sec-DHCNTF 코딩을 갖는 세 가지 다른 성숙 표현 벡터들에서 하나 또는 그 이상을 가지고 생쥐들과 쥐에 트렌스펙트하는 것이다. 상기 근육들에 전기적인 자극을 가하지 않거나 DNA 주입후 바로 자극을 가하였다. 혈액은 여러 시점에서 추출하였고 항체의 역가를 측정하였다. 생쥐와 쥐들 모두에서 DNA 주입후 바로 자극을 가한 것들은 DNA 주입후 자극을 가하지 않는 것들보다 약 5배에서 10배정도 항체 역가가 나왔다.

본 발명의 트랜스펙션 방법은 또한 질병을 치료하기 위한 체계적인 단백질의 전달에도 사용할 수가 있다. 바람직한 한 가지 실시예로는, 에리트로포에틴(EPO) 유전자를 갖고 있는 DNA 플라스미드를 골격 근육내에 주입한 뒤에 본 발명의 방법 에따라 자극을 가하였다. 콘트롤은 자극을 주지 않거나 EPO 유전자가 없는 콘트롤 벡터로 트랜스펙트하였다. 14일 후에 본 발명의 방법에 따라 EPO로 트랜스펙트시킨 생쥐들만이 헤마토크릿트의 증가를 보이므로 해서 상기 트랜스펙트된 근육들이 혈류에 충분한 양의 EPO를 만들고 분비할 수 있음을 보여주었다.

핵산이 아닌 것들도 본 발명의 방법을 이용하여 트랜스펙트 될 수가 있다. 한 가지의 실시예로는, 덱스트란과 공역하는 로다민을 근육에 주입한 후에 전기적인 자극을 가한다. 3-5일 후에 상기 근육들을 액체 질소에서 냉각후 냉각조에서 절개를 한다. 주입후 자극한 세포에서는 형광이 관찰되어 덱스트란과 공역하는 로다민은 상기 근육 세포들내에 들어가 존재할 수 있음을 보여주었다.

본 발명의 이러한 목적과 다른 목적 및 효과는 이하의 그림과 상세한 설명과 첨부된 청구범위로부터 명확하게 될 것이다.

본 발명은 약물과 핵산에 대해 골격 근육이 반투성(semipermeable)을 갖도록 하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 설명하면 근육에 약물과 핵산의 주입 후에 약한 전기적인 자극을 가하여 골격 근육이 반투성을 갖도록 하는 방법에 관한 것이다.

위에서 간략히 기술한 본 발명의 보다 개별적인 설명은 첨부된 그림들과 사진들을 참조할 수 있다. 제시된 그림과 사진은 본 발명의 일반적 실시예에 관련된 것만을 제공하므로 방법의 범위에 대한 제한으로 고려될 수는 없다.

그림 1은 본 발명의 약물과 DNA를 골격 근육 내에 주입하는 방법을 나타낸 그림이다.

그림 2는 본 발명의 방법에 따라 전기적 자극이 전달되는 것을 보여주는 그림이다.

그림 3은 1㎍/㎕ 농도의 RSV-Lac Z 플라스미드 DNA 용액 50㎕를 주입한 근육의 전체 슬라이드를 보여주고 있다. 그림 3a와 그림 3b의 근육들은 DNA 주입 7일 후에 꺼낸 것이다. 모든 근육들은 같은 쥐에서 한 쌍으로 있는 것이다.

그림 4는 전체 근육과 트랜스펙트된 근육의 1㎜ 조각의 사진이다. 검은 무늬는 근육에서 검은 침전물을 만드는 β-칼락토시다제에 의해 촉매된 오르토-니트로페닐-베타-D-갈락토피라노시드(ONPG)이다. 화살표는 본 발명의 방법에 의해 성공적으로 트랜스펙트된 근섬유를 보여주고 있다.

그림 5는 그림 3에 있는 골격 근육들의 각 그룹으로부터 트랜스펙트된 근육 섬유들의 평균 숫자를 나타내고 있다.

그림 6은 여러 다른 실험으로부터의 평균 트랜스펙트된 근육 섬유와 여러 다른 DNA의 다발들을 함께 막대그래프로 나타낸 것이다. 가로축에 SOL S와 EDL S(각 그룹에서 16개)는 근육에 DNA주입후 바로 자극한 것들이며 SOL NS와 EDL NS(각 그룹에서 10개)는 신경에 의해서 자극된 것으로 전혀 자극을 주지 않았거나 DNA 주입 10분전에 바로 자극을 준 것이다.

그림 7은 자극 주파수에 대해 트랜스펙트된 골격근육 섬유 숫자의 로그값을 취한 그래프이다. 일속의 자극 신호들의 시간은 일정하게 1초를 유지하였다.

그림 8은 그림 7 데이타에 있는 트랜스펙트된 근육들의 사진이다.

그림 9는 두 종류의 서로 다른 전극들을 사용하여 본 발명의 방법에 따라서 트랜스펙트된 근육들의 결과에 대한 전체 슬라이드들을 보여주고 있다.

그림 10은 펄스 숫자의 증가와 비교한 주파수 증가에 대한 트랜스펙트된 골격근육 섬유들의 숫자를 나타내고 있다.

그림 11은 일정한 주파수에서 펄스의 숫자의 증가에 대한 트랜스펙트된 골격근육 섬유의 숫자에 관한 그림이다.

그림 12는 펄스 숫자에 대한 평균 루시페린효소 활동도에 관한 것이다.

그림 13은 본 발명의 자극 방법에서 전압 의존성을 보여주는 그림이다. 그림 13a는 전압을 변화시키면서 자극한 근육의 루시페린효소 활동도을 보여주고 있다. 그림 13b는 13V이상과 5V이하의 전압으로 자극한 근육의 평균 루시페린효소 활동도를 보여주고 있다.

그림 14는 트랜스펙숀 효율에 대한 펄스 폭의 효과를 보여주고 있다.

그림 15는 펄스 폭의 변화와 펄스 숫자의 변화에 대한 트랜스펙숀 효율의 비교를 막대그래프로 보여주고 있다.

그림 16은 트랜스펙숀 효율에 대한 DNA 농도의 영향을 막대그래프로 보여주고 있다.

그림 17은 짧은 시간후에 근육의 자극과 재생에 의한 손상을 보여주는 트랜스펙트된 근육들의 사진을 보여주고 있다. 그림 17a는 주입후 자극하지 않은 근육을 보여주고 있다. 그림 17b는 근육 자극후에 근육 손상을 보여주고 있다. 그림 17c는 보다 격렬한 자극 조건하에서 자극한 근육을 보여주고 있다. 그림 17d는 그림 17c의 조건에서 자극된 근육들이 14일 후에 완전히 재생되고 치유된 것을 보여주고 있다. 그림 17e는 녹색 형광 단백질(GFP)로 트랜스펙트된 근육들을 보여주고 있다. 그림 17f는 손상된 부위의 주변에서 볼 수 있는 트랜스펙트된 섬유들을 보여주고 있다.

그림 18은 본 발명의 자극 시술을 사용하여, 쥐 아그린을 코딩하는 표현 벡터에 의해 유전적으로 면역된 토끼에 있어 이로부터 유도된 항아그린 폴리클로날( polyclonal) 항체들로 염색된 세포들의 사진이다.

그림 19는 노출된 DNA 주입에 대해 본 발명의 자극 기술을 이용한 생쥐들과 쥐들의 향상된 유전적 면역을 보여주는 사진이다.

그림 20은 덱스트란과 공역하는 로다민과 녹색 형광 단백질로 트랜스펙트된 근육의 사진이다. 위쪽:덱스트란과 공역하는 로다민에서 나오는 로다민 형광. 중간:GFP 형광을 내는 필터가 있는 위쪽 그림의 동일한 단면. 아래쪽:주변 단면의 헤마톡실린과 에오신 염색.

본 발명은 골격 근육 조직의 투과성을 증가시키므로해서 약물와 핵산이 세포내로 들어가거나 트랜스펙트될 수 있도록 하는 새로운 방법에 관련된 것이다. 본 발명의 방법은 설정된 값의 전류를 골격근육 조직에 흘려주는 것이다. 그러나, 상술한 일렉트로폴레이션 방법과는 달리 본 발명의 방법에서 파라메타들은 특징적으로 사용하며 특히, 사용된 전기장의 세기와 발생하는 손상의 정도에서 차별된다. 일속의 숫자, 주파수, 펄스의 갯수와 펄스의 폭은 전달되는 약물과 핵산의 양을 조절하기 위하여 달리할 수가 있다.

그림 1에 나타난 것과 같이 일반적으로 골격 근육은 노출된 뒤에 설정된 양의 분자가 근육 내에 주입된다. 한 가지 실시예로는, 0.9% 염화나트륨(NaCl)에 DNA를 용해한다. 그러나, 본 발명에서 정확한 용매는 중요하지 않다. 예를 들어, 자당과 같은 용매들은 골격 근육에서 DNA 흡수를 증가시킬 수 있다는 것은 잘 알려진 기술이다. 다른 물질들 또한 유익한 이유에 의해 관심 분자를 같이 트랜스펙트할 수도 있다. 예를 들어, 전기적인 선택투과성을 갖는 세포막들을 막는 것으로 알려진 P188(Lee, 외. PNAS., 4524-8, 10, 89(1992))은 트랜스펙트된 섬유들의 생존율을 증가시킴으로써 트랜스펙숀 효율에 유익한 영향을 줄 수가 있다.

그림 1을 계속 참고하면, 전극들은 근육에서 상기 분자가 주입될 위치 근처에서 1-4㎜정도 떨어져서 위치하게 된다. 정확한 상기 전극들의 위치나 상기 전극들의 모양은 중요하지 않으며 전류가, 분자가 주입되는 영역에서 상기 근육 섬유들의 방향에 대해서 수직한 방향으로 흐를 수만 있으면 된다.

일단 상기 전극들이 위치하게 되면, 상기 근육은 일렉트로폴레이트되고 자극이 가해지게 된다. 그림 2에 나타난 것과 같이 자극은 설정된 크기와 폭을 갖는 쌍극의 구형파로 전달이 된다. 트랜스펙숀 효율을 최적화하기 위하여, 상기 파라메타들을 다양하게 변화시키면서 트랜스펙트 효율들을 비교하였다. 예를 들어, 전압은 0V에서 50V까지 변화시켰으며 펄스의 폭은 5㎲에서 5㎳까지 변화를 주었다. 펄스의 숫자는 단 펄스에서 30,000개의 펄스까지 변화시켰다. 다음으로 일속 내에서 펄스의 주파수는 0.5㎐에서 1000㎐까지 변화를 주었다.

결과에 대한 결론은 전기장의 세기가 약 50V/cm이상이면 다른 파라메타들은 원하는 실험 조건들에 따라서 달리 할 수가 있다. 상한값에 대한 제한을 관찰할 수는 없었지만, 효과적인 트랜스펙숀 효율은 높은 전기장에서 나타났다. 자극에서 전기장의 세기는 다음의 식을 이용하여 계산할 수가 있다.

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위 식은 D 〉〉 r의 경우에 전선사이에 전기장에 관한 식이다. 이 식에서 전압 V는 10V, 두 전선 중심사이에 거리 D는 0.1-0.4㎝, 전극의 지름 r은 0.06㎝이다.(참고: Hofmann, G. A. Cells in electric fields. In E. Neumann, A. E. Sowers, ＆ C. A. Jordan (Eds.), Electroporartion and electrofusion in cell biology(pp. 389-407). Plenum Publishing Corporation(1989)) 10V에서 전기장의 세기는 163V/㎝ - 43V/㎝(전극의 간격이 각각 0.1에서 0.4㎝일 때)가 된다. D는 r에 비해서 크지 않기 때문에, 커다란 평행판들 사이에 전기장에 대한 공식은 다음과 같이 쓸 수가 있다.

위 식에서 전기장의 세기는 100V/㎝-25V/㎝(전극 사이에 간격이 각각0.1-0.4㎝일때) 사이에 값으로 유사한 세기를 가진다. 다른 파라메타들 뿐만이 아니라 전기장의 세기는 트랜스펙트되는 조직에 의해서 영향을 받게 되며 따라서 최적 조건은 달라질 수가 있다. 그러나, 본 발명에서 제시한 상기 파라메타들을 사용하면, 본 시술에 익숙한 당업자는 쉽게 최적 파라메타를 구할 수가 있다.

그림 3과 그림5 - 그림8에서 나타난 것처럼, 본 발명의 방법은 골격 근육내에 약과 DNA전달 효율을 매우 효과적으로 향상시킬 수가 있다. 한 가지 실시예로는, 쥐의 슬와근이나 EDL 근육들에 β-갈락토시다제 유전자(lac Z)를 포함하는 DNA 플라스미드를 주입하는 것이다. β-갈락토시다제 유전자는 무색의 기질을 시각적으로 분석하거나 분광측광기적으로 측정할 수 있는 푸른 기질로 변환할 수 있는 단백질을 만들게 된다. 그림 3은 다양한 자극 파라메타들을 이용하여 β-갈락토시다제 유전자로 트랜스펙트된 대표적인 슬와근과 EDL 근육들을 보여주고 있다.

그림 3a는 본 발명의 방법에 따라 트랜스펙트된 슬와근과 EDL 근육들의 향상된 DNA 전달 효율을 보여주고 있다. 슬와근과 EDL 근육들(n=3)은 우선 좌골신경을 절개하여 신경지배를 제거하였다. 이는 관찰된 트랜스펙숀 효율의 증가에서, 신경에 의해 유도된 활동에 의해서 나타날 수 있는 영향을 배제하기 위한 것이다. 신경지배를 제거한 후 3일 뒤에 상기 근육들에 상술한 것과 같이 상기 β-갈락토시다제 유전자를 주입하였다. 상기 DNA 주입뒤에 자극하지 않거나 상기 DNA 주입 후 즉시 본 발명의 방법에 따라서 상기 근육들을 자극하였다.

DNA 주입뒤 15일 후에 상기 슬와근과 EDL 근육을 분석하였다. 그림 3a에 나타난 것과 같이 DNA 주입후에 즉시 자극된 근육 세포들에는(밑의 그림) 보다 많은 β-갈락토시다제 유전자가 근육 세포들 안에 유입되었음을 알려주는 푸른 색의 많은 생성물들이 포함되어 있었다. 상기 트랜스펙숀 효율은 그림 4에 제시된 것과 같이 푸른 생성물을 포함하는 근육의 1㎜ 단면에 있는 근육 섬유를 계수하여 정량화하였다. 그림 5a에 막대그래프로 도시된 것과 같이, 본 발명의 방법을 사용하여 트랜스펙트된 슬와근 근육에서는 자극되지 않은 근육에 비해 47배 증가하였음을 보여주고 있다. 마찬가지로, 본 발명의 방법을 이용하여 트랜스펙트된 EDL 근육은 자극되지 않은 근육에 비해 12배 증가하였음을 보여주고 있다.

신경 활동이 트랜스펙트 효율에 영향을 주는 지 여부를 측정하기 위하여 상술한 방법에 의하여 (절개되지 않은 좌골신경) 신경지배된 슬와근과 EDL 근육과 (절개된 좌골신경) 신경지배가 제거된 슬와근 EDL 근육에 본 발명의 방법을 실시하였다. 그림 3b에서 보여주는 것처럼 DNA 주입후 15일째에 신경지배된 근육과 신경지배가 제거된 근육 모두에서 β-갈락토시다제 유전자가 높은 효율로 전달되었음을 보여주는 많은 양의 푸른 생성물이 나타났다. 그림 5b에서 나타난 것처럼, 트랜스펙트된 근육섬유의 양은 신경지배된 근육들과 신경지배가 제거된 근육들 모두에서 높은 효율의 트랜스펙션이 일어났음을 확인시켜주고 있다.

관찰된 결과에서 근육 활동에 의한 트랜스펙션 효율의 증가 가능성을 배제하기 위하여, 좌골신경의 직접적인 자극과 상기 근육(n=5)의 자극을 비교하였다. 만약 트랜스펙션 효율의 증가가 근육 활동에 의한 것이라면, 신경에 의해 자극된 근육에서 트랜스펙션 효율은 직접 근육에 자극한 효율과 비슷한 결과를 보여주어야 한다. 그림 3c에서 나타난 것과같이, 직접적인 신경 자극은 직접 근육 자극과 비교하여 커다란 트랜스펙션 효율의 증가를 보이지는 않았다. 그림 5c에 보여주는 것처럼, 슬와근과 EDL 근육 모두에서 직접 근육 자극에서 10배 증가된 트랜스펙션 효율의 증가가 있었다.

그림 3d에서 증가된 효율은 일시적으로 나타났으며 이는 일렉트로폴레이션과 일치하는 것이다. DNA 주입후 바로 자극된 근육들은 DNA 투입전에 자극된 근육들에서보다 두드려지게 많은 푸른 염료가 있음을 보여준다. 실제로, DNA 주입 후 바로 자극한 근육들에서는 DNA 주입 10분전에 자극한 근육들에서보다 10배에서 25배 사이의 트랜스펙숀 효율의 증가를 보여주었다.(그림 5d)

그림 6에서는 본 발명의 결과를 요약하였다. 여러 다른 실험에서의 근육들과 여러 다른 DNA 다발들을 함께 모았다. SOL S와 EDL S로 표시된 것에서 근육들은(각 그룹에서 16개) DNA 주입후 바로 자극을 준 것이다. SOL NS와 EDL NS로 표시된 것에서 근육들은(각 그룹에서 10개) 신경에 의해서 자극된 것으로, 전혀 자극을 주지 않았거나, DNA 주입 바로 10분전에 자극을 가한 것이다.

상기 실험에서 사용한 전기 스티뮬레이터는 FHC(Brunswick, ME 04011)의 제품이다. Pulsar 6bp와 Pulsar 6bp-a/s 자극기 모두를 사용하였다. Pulsar 6bp-a/s는 최대 전압 150V, 최대 전류 50㎃의 출력을 갖는다. 가할 수 있는 최대 전압은 양 전극들 사이에 3000Ω이상의 저항값을 요구하고 있다. 상기 자극기들은 정압 모드에서 사용하였다. 근육의 저항값은 작기 때문에, 이하의 실시예에서 언급되는 것처럼 낮은 전압을 사용하였다. 모든 실험들에서 전류값은 50㎃를 유지하였다.

상기 기술의 당업자에게 있어서 많은 여러 다른 형태의 전극이 사용될 수가 있다. 예를 들어, 그림 9는 두 종류의 다른 형태의 전극들을 사용하여 얻은 결과를 보여주고 있다. (A)에서 전극들은 근육 섬유들 방향에 수직하게 위치시켰다. 0.6㎜ 직경의 은 전선(C)으로 구성되었으며 (B)의 실험을 제외하고는 모든 실험들에서 상기 전선을 사용하였다. 근육의 양 사이드에 하나의 전극이 위치한다. 그림 9의 세번째 근육에서 가운데 짧은 분절은 Lac Z 염색법에 대해 국소적인 표징을 나타내는 양성으로 나타난다. (B)에서는 절연 피복된 은 전선(d=0.3㎜)을 이용하여 만든 1.5㎝의 전극을 사용하였다. 절연 피복은 2㎜ 간격(D)의 양 전선을 따라서 짧은 마디(0.5-1.0㎜)를 내어 제거하였다. 상기 전극은 상기 근육 섬유들 방향에 평행하게 근육 안으로 삽입된다. 상기 두 전선 전극중에 하나는 상기 근육 섬유들과 평행하게 상기 근육 안 쪽으로 삽입된다. 다른 전선 하나는 마찬가지로 상기 근육 섬유들과 평형하게 상기 근육의 표면에 위치하게 된다. 두 가지 형태의 전극들(그림 9c와 그림 9d) 모두에서 유사한 숫자의 트랜스펙트된 섬유(약 250)가 나왔다. 그러나, 근육 섬유들과 평행한 방향으로하여 보다 긴 전극을 사용하면, 섬유들의 긴 마디를 따라 트랜스펙션되거나 또는 증가된 트랜스펙션을 보이는 보다 넓게 퍼져 염색이 나타난다.

근육들은 잘 알려진 방법에 의해 전체 슬라이드에서 Lac Z로 염색되었다. 염색후에 근육 위에 가장 푸른쪽의 사진을 찍었다. 그 다음에 상기 근육은 그림 2에 있는 것같이 세 조각으로 절개하였다. 상기 근육의 가운데로부터 약 1㎜ 두께의 조각에 있는 푸른 섬유들의 숫자를 계수하였다.(따라서, 상기 조각에 말단이나 기부에 트랜스펙트된 섬유들은 계수하지 않게 된다.) 상기 트랜스펙트된 섬유들을 계수하기 위하여, 상기 조각들을 보다 작은 다발들로 절개한 후 절단 현미경으로 단일 섬유들을 구별할 수 있게 만들었다.

4개의 근육들에서 pSV40-luc 구조를 사용하였다. 이를 슬와근 근육에 주입하고 3일 후에 상기 근육들을 제거한 뒤 루시페린효소 활동도를 프로메가 루시페린효소 분석시스템(Promega Luciferse Assay System; Daviset 외, 1993)을 사용하여 측정하였다. 같은 쥐들에서 나온 주입되지 않은 EDL 근육을 콘크롤로 사용하였다.

어떤 핵산도 본 발명의 방법을 사용할 수가 있다. 예를 들어, 플라스미드 DNA, 선형 DNA, 역감각 DNA와 RNA에 적용할 수가 있다. 하나의 바람직한 실시예로는, 상기 핵산으로 해당 시술에서 잘 알려진 형식의 DNA 표현 벡터를 사용하는 것이다. 일반적으로, 표현 벡터는 폴리아델레이션 신호와 같은 종료신호를 갖는 관심 단백질의 유전정보를 코딩하는 DNA 분자와 실시할 수 있게 연결된 조효소를 가지고 있다. β-락타마제 코딩부, f1 기시부와 유도된-CoE1 플라스미드 복제 기지부와 같은 박테리아 성장과 포유동물 조작과정에서 요구되는 다른 요소들이 포함될 수도 있다. 관심 DNA 코딩부를 가지는 유사한 구조들은 당해 기술에서의 당업자에 의하여 만들 수가 있다.

이하에서 제시되는 실시예와 같이 핵산들보다 분자들이 본 발명의 기술을 이용하여 근육내에 전달될 수가 있다. 하나의 실시예로는, 본 발명의 방법에 따라서 근육들 내에 주입되고 자극이 가해진 덱스트란과 공역하는 로다민은 근육 세포들 내에 들어 갈 수가 있다. 더욱이, 핵산과 단백질들이 일렉트로폴레이트된 근육 안으로 동시에 들어갈 수도 있다. 하나의 다른 실시예는, 거대 T-항원 핵정위 신호는 Lac Z에 대해 DNA 코딩부를 갖는 플라스미트와 혼합되는 것이다. 거대 T-항원 핵정위 신호는 DNA를 결합하고 있는 단백질이며 세포의 핵 안으로 전달되는 것을 촉진시키는 일을 한다. 다른 계통들에서는, 거대 T-항원 핵정위 신호는 트랜스펙션 효율을 증가시키는 것을 보여주었다. 본 발명의 방법을 적용하여, 거대 T-항원 핵정위 신호는 Lac Z의 트랜스펙션 효율을 증가시켜 단백질이 DNA와 결합하여 근육세포로 들어갈 수 있음을 보였다.

이하의 예제들은 본 발명으로 실시될 수 있는 다양한 예제를 제시하고 있다. 이하의 예제들은 본 발명이 적용될 수 있는 여러 다양한 형태의 실시예들을 광범위하게 포함하고 있지는 않다.

예제1. - 유자극 근육과 무자극 근육

pSV40-luc 리포터 구조를 골격 근육인 슬와근 근육내에 주입하여 트랜스펙션 효율을 측정하였다. 주입 3일 후에 상기 근육들을 제거하고 Promega Luciferase Assay System(Madison, WI) 제품의 제어 절차에 따라 루시페린효소 활동을 측정하였다. 동일한 쥐들에 자극을 가하지 않은 EDL 근육들을 콘트롤로 사용하였다. 데이타는 아래의 표1과 같다.

유자극 근육과 무자극 근육
근육	유자극(상대적인 루시페린효소 활동도)	무자극(상대적인 루시페린효소 활동도)	증가 비율
슬와근 동물 I	34.40	1.950	1664%
슬와근 동물 II	21.50	0.250	8500%
EDL 동물 I		0.045
EDL 동물 II		0.046

예제2. - 트랜스펙숀 효율과 주파수

Lac Z 유전자를 갖는 농도 1㎎/㎕인 플라스미드 50㎕를 쥐들에 주입하였다. 주입 후 즉시, 2-3㎜떨어져 전극을 위치시킨 후 근육에 다음의 자극 파라메터 값으로 자극을 주었다: 전압=30V, 펄스폭=0.2㎳(쌍극성 펄스 전체는 0.4㎳), 30개 펄스, 1분동안에 1초간격으로 신호를 전달. 근육 가운데 부분 1㎜ 조각의 트랜스펙트된 섬유들을 계수하였다. 트랜스펙트된 섬유들의 숫자는 아래의 표 2와 그림 7에 있다. 이 데이타는 본 발명의 방법에서 세포층들의 안 쪽에 근육 섬유들도 트랜스펙트되지만 근육 섬유들의 표면에서 트랜스펙트가 두드려지게 나타남을 보여주고 있다.

트랜스펙션 효율과 주파수
주파수(㎐)	평균(트랜스펙션된 섬유들)	자극에 의해 증가된 비율
0	22	-
1	83	277%
10	153	595%
100	215	877%
1000	315	1332%

예제3. - 트랜스펙션 효율과 펄스

위스타 쥐의 슬와근 근육들(200-270g)에 0.9% 염화나트륨 50㎕에 50㎍의 RSV 루시페린효소 DNA 플라스미드를 주입하였다. 주입후 바로 상기 근육들은 다음 파라메터값의 전기적인 자극을 주었다: 1000㎐의 주파수로 각 일속에서 200㎲ 펄스폭을 갖는 0-1000개의 쌍극성의 펄스를 1분 주기동안에 30번을 상기 근육에 가하였다. 트랜스펙션된 뒤 액체 질소에서 냉각 3일 후에 근육들을 제거하였다. 상기 근육을 저온조에서 절개하였으며 헤마톡실린, 에오신과 사프란(예제 9. 참고)으로 염색하였다. 남은 조각들은 이하 예제 4에서 기술하는 것처럼 균질화하였다. 그림 10 - 그림 12와 같이 트랜스펙션 효율은 상기 근육에 전달되는 펄스들의 숫자에 따라 증가하였다.

예제 4. - 트랜스펙션 효율에 대한 전압 효과의 측정.

위스타 쥐의 슬와근 근육들(245-263g)에 0.9% 염화나트륨 50㎕에 25㎍의 RSV , 유도된 루시페린효소 플라스미드 DNA를 주입하였다. 주입 후 바로 상기 주입된 근육들은 바로 다음 파라메타값의 전기적인 자극을 주었다: 100㎐의 주파수로 각 일속에서 200㎲ 펄스폭을 갖는 100개의 쌍극성의 펄스로 전압은 0에서 47.5V까지 변화를 주었다. 주입과 자극 4일 후에 근육들은 제거되었으며 프로메가 루시페린효소 분석버퍼(Promega luciferace assay buffer; Madison, WI)에서 균질화하여 제품의 제어절차에 따라서 루미네센스를 측정하였다. 맥킨토시 컴퓨터와 랩뷰(LabWiev) 획득 프로그램을 사용하여 첫 번째 전압 펄스들을 포착하였다. 기록은 자극 전극들과 병렬로 연결하여 실시하였다. 전압 측정은 자극 신호의 개시 약 100㎳후에 10개 펄스들에 최대 전압값의 평균을 취하였다.

그림 13a에서는, 전압의 증가에 따라서 트랜스펙션 효율의 현저한 증가를 보였다. 그림 13b에서는, 상기 실험의 조건들에서 13V보다 높은 전압을 걸어준 근육들의 경우에는 5V이하로 자극한 근육들과 비교하여 40배 이상 큰 루시페린효소 활동도를 보여 주었다.

예제5. - 최적 펄스폭의 측정.

위스타 쥐의 슬와근 근육들(200-270g)에 0.9% 염화나트륨 50㎕에 β-갈락토시다제 유전자를 포함하는 DNA 플라스미드 50㎍을 주입하였다. 주입 후 즉시, 상기 근육들은 다음의 파라메터값의 전기적인 자극을 주었다: 100㎐, 25V, 각 일속에서 5㎲-250㎲의 펄스폭을 갖는 100개의 쌍극성 펄스. 트랜스펙트된 섬유들의 숫자는 절개 현미경을 사용하여 상기 근육의 중간으로부터 1㎜ 두께 절개부의 섬유들을 계수하였다. 두 번째 집합의 쥐들은 0.9% 염화나트륨 50㎕에 유도된 RSV 루시페린효소 플라스미드 DNA를 주입한 후에 펄스폭을 50-200㎲로 변화시키는 것만을 제외하고는 상기 실험과 동일한 파라메타를 사용하여 자극을 가하였다. 표 3과 그림 14처럼, 이러한 자극 파라메타에서는, 최적의 펄스폭가 약 50㎲에서 약 200㎲로 나타났다. 상기 방법은 다른 자극 파라메타들의 펄스폭을 최적화하는데 사용할 수가 있다.

트랜스펙션 효율과 펄스폭
펄스 폭(㎲)	트랜스펙션된 섬유들(평균)	펄스 폭(㎲)	루시페린효소 활동도(평균)
0	-	0	52.7
5	51	50	631
20	107	200	536
50	228	500	348
200	272	2000	194

예제 6. - 전류값과 펄스들의 숫자.

위스타 쥐의 슬와근 근육들(178-193g)에 0.9% 염화나트륨 50㎕에 β-갈락토시다제 유전자가 포함된 DNA 플라스미드 50㎍을 주입하였다. 주입 후 즉시, 상기 근육들에 펄스 폭의 변화를 주는 것 외에는 상술한 것과 같이 전기적인 자극을 가한다. 이하 일렉트로폴레이션 파라메타들을 비교하였다: ⑴50㎲ 펄스 폭의 100개 펄스와 5000㎲의 1개 펄스, ⑵50㎲ 펄스 폭을 갖는 100개 펄스의 10개 일속과 5000㎲의 10개 펄스. 14일 후에 근육들은 제거되었으며 저온조에서 절개하였다. 단면들은 상술한 것처럼 염색되었다. 트랜스펙트된 섬유들의 숫자들을 계수하였다. 그림 15에 도시한 것처럼, 긴 펄스 폭의 경우에는 높은 트랜스펙숀 효율을 보였다.

예제 7. - DNA 농도

6 마리의 위스타 쥐의 EDL 근육들(178-193g)에 0.9% 염화나트륨 50㎕에 β-갈락토시다제 유전자를 포함하는 DNA 플라스미드 1㎍/㎕ 또는 5㎍/㎕을 주입하였다. 주입 후 즉시, 상기 근육들은 200㎲ 펄스 폭을 갖는 100개의 펄스의 30개 일속을 가하거나 전혀 자극을 주지 않았다. 14일 후에 근육들은 제거되었으며 저온조에서 절개하였다. 단면은 상술한 것과 같이 염색되었으며 트랜스펙트된 섬유들을 계수하였다. 그림 16과 같이, DNA 농도가 높을 수록 높은 트랜스펙트 효율을 보였다.

예제 8. - 거대 T-항원 핵 정위 신호

위스타 쥐의 근육들에 1:100의 몰 과잉 거대 T-항원 핵 정위 신호를 포함하는 β-갈락토시다제 유전자가 있는 DNA 플라스미드를 주입하였다. 이는 트랜스펙션을 향상시키기 위하여 다른 트랜스펙션 연구들에서도 보여진 것이다.(참고; P. Collas 외, Transgenic Res., 6:451-8(1996)) 상기 근육들은 50㎲ 펄스 폭을 갖는 100개 펄스들의 10개 일속으로 자극하였다. 거대 T-항원 핵 정위 신호가 있는 상기 근육들은 가장 많은 트랜스펙트된 섬유들을 가지고 있었다. 특히, 거대 T-항원 핵 전위 신호도 같이 트랜스펙트된 상기 근육은 100개와 38개, DNA만으로 트랜스펙트된 근육들은 7.3과 4.7개의 트랜스펙트된 섬유들을 각각 가지고 있었다. 이러한 데이타로부터 트랜스펙트 효율은 DNA를 비핵산 분자와 혼합하므로써 향상될 수 있다는 것을 보여주고 있다. 더욱이, 이 데이타는 비핵산 분자들 또한 본 발명의 일렉트로폴레이션을 사용하여 근육내 전달할 수 있다는 것을 보여주고 있다. 주입후에 자극되지 않은 세포 내에서는 향상된 것을 볼 수가 없었다.

예제 9. - 자극에 의한 근육의 손상.

예제 3의 근육을 절개하고 일렉트로폴레이션에 의한 상기 근육의 손상을 알기 위하여 염색하였다. 그림 17a에 있어, 비록 자극이 없는 대부분의 근육들은 손상이 없었지만, 주입만으로 다소의 손상이 일어날 수가 있다. 300개의 펄스로 자극된 근육들에서는 보다 큰 손상이 관찰되었다.(그림 17b) 그림 17c에 있듯이, 1000개 펄스의 30개 일속으로 자극된 근육은 상당한 손상을 보여주고 있으며, 이로부터 손상은 자극의 정도에 비례함을 알 수가 있다. 그림 17d에서는 그림 17c의 조건에서의 근육들이 14일 후에는 완전히 재생되어 치유가 된다는 것을 보여주고 있다.

상당한 정도의 자극(1000개의 펄스 30개의 일속에 의한)이 가해진 다른 근육에서는 녹색 형광 단백질(GFP)을 코딩하는 플라스미드 DNA 역시 포함되어 있었다. 그림 17e는 GFP로 트랜스펙트된 근육들을 보여주고 있다. 상기 손상된 부위의 근처에서 트랜스펙트된 섬유들을 볼 수가 있다.(그림 17f) 일렉트로폴레이션 3일 지나서는 트랜스펙트된 재생 섬유들은 전혀 관찰되지 않았다.

예제 10. - 토끼의 유전적 면역.

암컷 토끼(4.5㎏)에 CMV 조촉매에서 유도된 쥐 신경 아그린 cDNA를 포함하는 1㎍/㎕ 농도의 DNA 플라스미드 2㎖를 오른쪽 대퇴골 직근에 주입하였다.(Cohen 외. MCN, 9, 237-53(1997)) 처음은 상기 근육의 표면근처 10곳에 동일하게 주입하고 1000㎐의 주파수로 1000개 펄스 10개 일속으로 자극하였다. 다음은 근육의 보다 밑 쪽에 주입하였다. 상기 토끼의 혈청을 테스트하기 위하여, 쥐의 근육들과 COS 세포들은 같은 구조로 트랜스펙트되었다. 트랜스펙숀 5일 후에 근육들은 제거되었으며 COS 세포들은 트랜스펙숀 4일 후에 염색하였다.

혈액은 0, 10, 50, 81, 106일에 추출하였으며 1:100과 1:1000으로 희석하였다. 19일 후에 상기 혈액은 1:10으로 희석되었을 때 트랜스펙트된 섬유들에 약한 염색을 볼 수 있을 정도의 충분한 항체들이 생겼다. 양성 조절로써 모노클로널 항체(mAb) AG-86을 사용하였다.(참고: Hoch 외, EMBO J,12(13):2814-21(1994)) 프라임문네(preimmune) 혈청에는 트랜스펙트된 섬유들의 염색은 없었다. 나중 혈액의 혈청 전부에서는 아그린 항체들을 확인할 수 있었다. 50일 이후로 추출된 혈액들은 1:1000으로 희석되어 염색된 조각들에서 충분한 항체들이 있었다.

그림 18a는 면역된 토끼(1:100으로 희석)의 항혈청과 2차 항체와 공역을 이루는 플루오레스세인으로 염색되어 트랜스펙트된 COS 세포들의 아그린을 보여주고 있다. COS 세포들은 우선 10분 동안 1.5% 파라포름알데히드에서 상기 세포들을 고정하기 위하여 착색되고 함염물로 완충된 인산염(PBS)으로 30분 동안 세척하였다. 다음에 0.2% 소의 혈청 알부민, 트리톤 X-100, 0.1% PBS 0.1M으로 4분동안 상기 세포들을 차단하였다. 같은 용액에 희석된 혈청은 상기 세포들과 합해진 뒤에 20분 동안 배양하였다. PBS에서 4분 동안 세포들을 세척한 뒤 상기 2차 항체(Cappel, 55646)와 10분 동안 배양한 뒤 PBS에 세척하였다. 생쥐 1차 mAb Agr-86이 같은 항체 혼합에 포함되었으며 2차 항체와 공역하는 로다민(Sigma T-5393, St. Louis. MO)이 1:100으로 희석되어 사용되었다. 그림 18b는 mAb Ag-86/로다민 공역으로 염색된 같은 세포를 보여주고 있다. 이로부터 유전 면역이나 DNA 백신 기술에 대해 본 발명의 잠재적인 가능성을 알 수가 있다.

예제 11. - 생쥐의 유전적 면역성.

한 그룹의 2개월 된 수컷 스프라구 돌리(Sprague Dawley) --쥐의 EDL 근육과 슬와근 근육의 양측에 전부 200㎍(함염물에 1㎎/㎖ DNA 용액 4×50㎕)의 시토메갈로바이러스 직접 초기 조촉매(CMV)와 단백질들에 관한 코딩 시퀀스를 포함하는 세가지 다른 성숙 표현 벡터들을 접종하였다. 상기 단백질들은, 인체 실리에리 뉴로트로픽 인자(human ciliary neutrophic factor)인 단말마적(agonistic) 변위 DH-CNTF(Saggio 외, EMBO J. 14, 3045-3054, 1995); 인체 실리에리 뉴로트로픽 인자인 반단말마적(antagonistic) 변위 AADH-CNTF(Di Marco 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 9247-9252, 1996); DH-CNTF의 형태로 분비된 sec-DHCNTF이다. 상기 근육들은 전기적으로 자극을 가하지 않았거나 100개에서 1000개 구형 쌍극 펄스들로 이루어진 30개의 일속(펄스 폭 200㎳; 진폭 150V; 유효 전압∼25V)들을 2초의 간격을 두고 1000㎐의 주파수로 가했다.

2개월 된 수컷 CD1 생쥐들 한 그룹은 양 측 사두근들에 100㎍(함염물에 1㎎/㎖ DNA 용액 2×50㎕)의 sec-DHCNTF 플라스미드로 접종하고 DNA 주입후 즉시 전기적인 자극을 가하거나 전기적인 자극을 가하지 않았다. 자극 조건은 1000개의 구형 쌍극 펄스들로 이루어진 10개의 일속(진폭 150V)들을 2초의 간격을 두고 1000㎐의 주파수로 가하였다.

혈액은 선택된 시점에 역궤도 시누스(retroorbital sinus)에서 추출하였으며 혈청을 준비하여 -20˚에 저장한다. 쥐와 생쥐 혈청들에 anti-CNTF 항체들의 존재는 ELISA로 측정하였다. 재조합된 인체 CNTF로 코팅한 마이크로타이터 판들은 혈청들의 체감희석과 다음에 쥐나 생쥐 IgG(Pierce)에 대한 항체와 공역하는 알카리성 포스포타제에 의해서 배양된다. 상기 판들은 다음에 p-니트로페닐-포스페이트에서 배양이 되고 마이크로플레이트 판독기에 의해서 405nm에서 흡수도를 측정한다. 항체 역가들은 anti-CNTF 항혈청의 포화 농도에서 얻은 희석의 50%가 되는 흡수도를 갖는 혈청의 희석으로 정의된다.

그림 19는 상기 결과들이다. 어떤 동물들은 측정할 수 있을만한 양의 항체를 만들지 않기 때문에 역가의 정확한 평균을 낼 수는 없다. 그러므로, 각 동물들에 대해 낮거나 관찰할 수 없는 항독소 역가(역수 역가 3/4 100)를 나타내는 1:100의 값을 갖는 각 동물들에 대해서 나타내었다. 상기 결과들은 그림 19에 나타나듯이 쥐들이나 생쥐들 뿐만이 아니라 사용된 모든 플라스미드에서도 유사하다. 이러한 결과는 관계없는 바이러스 단백질로 코딩된 다른 플라스미드를 사용한 쥐들이나 생쥐들에서도 유사한 결과를 주었다.(자료 생략) 쥐들과 생쥐들 모두에서 DNA 주입후 즉시 전기적 자극을 가하였을 경우에는 약 5배에서 10배정도 DNA만 주입한 경우에 비해 항체 역가는 높게 나왔다. 이는 펄수의 숫자가 많거나 적거나 같았다. 이러한 결과들로부터 상기 일렉트로폴레이션 방법은 DNA가 개재되는 면역의 효율을 높일 수 있다는 것을 보여주고 있다.

예제 12. - 체계적인 생물학적 활동에 의해 분비된 단백질.

시토메갈로바이러스 직접 초기 조촉매의 통제하에 있는 생쥐 일리스로포이에틴의 cDNA를 포함하는 성장 표현 플라스미드(CMV-EPO) 50㎍(0.9% 염화나트륨에 1㎎/㎖ 농도의 50㎕ 용액)을 3개월 된 129xBalb/C 암컷 생쥐들의 좌측 사두근에 주입하였다. 5마리의 생쥐들(1 군)에서, 상기 근육들에 200㎲의 펄스폭을 갖는 1000개의 구형 쌍극 펄스들로 이루어진 10개 일속들을 2초의 간격을 두고 DNA 주입 후 바로 전기적인 자극을 가하였다. 상기 일속들의 주파수는 1000㎐이고 진폭은 150V(유효 전압∼25V)이다. 5마리의 다른 그룹(2 군)의 생쥐에서는, 상기 근육들은 DNA 주입후에 자극을 가하지 않았다. 콘트롤로 4마리의 생쥐 그룹(3 군)에는 CMV 조촉매의 통제하에 있는 녹색 형광 단백질의 코딩 시퀀스를 갖는 플라스미드(CMV-GFP)를 주입한 후, 1 군과 같은 조건의 전기적인 자극을 가하였다. 4 군은 5마리의 생쥐들로 구성되어 함염물 용액만을 주입하였으며 전기적 자극을 가하지 않았다.

혈액은 선택된 시점에 역궤도 시누스에서 추출하였으며 헤마토크리트은 모관에서 원심분리에 의해 측정하였다. 혈청 샘플들은 상업용 키트(R＆D systems)를 사용하여 EPO의 존재에 대한 분석을 하였다. 상기 결과를 표 4로 나타냈다. 생쥐들의 모든 군에 있어서, EPO 구조를 주입하고 즉시 전기적 자극을 가한 것들을 제외하고는 순환 EPO 레벨들은 ELISA 키트(〈165mU/ml)의 측정 한계 이하였다. 반면에, EPO 구조를 주입하고 전기적 자극을 가한 생쥐들은 주입 후 5일 후에 상당히 증가된 혈청 EPO 레벨을 보였다.(평균 약 〈 50mU/ml) 남은 EPO 혈청 농도는 DNA 주입 후 28일까지(가장 마지막으로 측정한 시점; 자료 생략)상승하였다. 이런 EPO 레벨은 헤마토크리트에 증가를 가져와서, 이는 주입 전 46.2%에서 DNA 주입 후 14일에는 70.0%, 28일에는 76.7%가 되었다. 상기 수치들은 콘트롤 군(3, 4군)과 근육에 EPO 표현 벡터를 주입하고 전기적인 자극을 가하지 않은 생쥐 군(2 군)과는 상당히 다른 결과이다. 특히, 2 군의 경우에는, 콘트롤 군의 헤마토크리트 레벨과 유사한 값을 보였다. 상기 결과들로부터 상기 일렉트로폴레이션 방법은 분비된 단백질의 표현 레벨의 기간과 상기 분비된 단백질에 의한 매개되는 생물학적 효과를 발생하는데 있어 모두 DNA 주입만을 실시하는 것보다는 우수함을 보여주고 있다.

EPO 혈청 농도와 활동도
	생쥐 숫자	2일	5일	14일
	생쥐 숫자	HCT(%)	mEPO(mU/ml)	HCT(%)	mEPO(mU/ml)	HCT(%)	mEPO(mU/ml)
1군CMV-EPO자극	7891011	4548474447	NDNDNDNDND	NDNDNDNDND	55.754.65962.27.9	716875.569.566	72.45.348.762.922.4
1군CMV-EPO자극	평균표준편차	46.21.6	ND	ND	47.9	70.0^abc3.6	48.3
2군CMV-EPO무자극	1213141516	4545ND4644	NDNDNDNDND	NDNDNDNDND	NDNDNDNDND	50504849.552	〈15〈15〈15〈15〈15
2군CMV-EPO무자극	평균표준편차	450.8	ND	ND	ND	49.9	〈15
3군CMV-EPO자극	2356	NDNDNDND	NDNDNDND	NDNDNDND	〈15〈15〈15〈15	43.5484646	〈15〈15〈15〈15
3군CMV-EPO자극	평균표준편차	ND	ND	ND	〈15	45.91.8	〈15
4군CMV-EPO	1718192021	4545434550	NDNDNDNDND	NDNDNDNDND	〈15〈15〈15〈15〈15	45.5494851.547	NDNDNDNDND
4군CMV-EPO	평균표준편차	45.62.6	ND	ND	〈15	48.22.3	ND

ND=측정안됨.^ap〈0.0001 대 2군;^bp〈0.0001 대 3군;^cp〈0.0001 대 4군

예제 13. - 비핵산 분자들의 전달.

근육들에 GPF 플라스미드 DNA 1㎍/㎕와 덱스트란과 공역하는 로다민(분자 소식자로부터 10kD)의 혼합 50㎕를 주입하였다. 3일에서 5일 후에 상기 근육들(n=6)은 액체 질소에서 냉동되어 저온조에서 절개하였다. 그림 20에 나타난 것처럼, 자극한 근육들(아래)은 덱스트란과 공역하는 로다민(위)과 GFP(중간)로 트랜스펙트되었다. 더 살펴보면, 상기 같은 근육들은 GFP와 덱스트란과 공역하는 로다민 모두로 트랜스펙트되었다. 이런 데이타들은 비핵산 분자들도 본 발명의 방법을 사용하여 근육 세포들에 전달될 수 있다는 것을 보여주고 있다.

그림 2.

전체 근육과 1㎜ 두께 조각은 이것의 가운데에서 절개하였다. 상기 조각을 보다 작은 다발로 만들어 한 개의 섬유를 절개 현미경으로 관찰할 수 있게 하여 트랜스펙트된 섬유들의 숫자를 계수하였다. 상기 근육의 어떤 부분들에서는 대부분의 섬유들이 트랜스펙트되었다.(검은 화살표들) 상기 영역들은 자극되는 동안 상기 전극들에 가깝게 위치한 영역들이다.

그림 9.

트랜스펙숀 효율을 향상시키기 위하여 다른 두 종류의 전극들을 사용하였다. 상기 주입 과정과 자극 형태(100㎐)는 상술한 것과 같다. (A)에 있는 상기 전극은 상기 근육 섬유들과 수직하게 위치하고 있다. 상기 전극은 직경이 0.6㎜(d)의 은 전선으로 되어 있다.(C)(상기 전극은 (B)실험을 제외하고는 모든 실험에서 사용되었다.) 상기 근육의 양 측면에 한 개의 전극이 위치하게 된다. 상기 근육의 세번째에서 가운데 짧은 마디는 Lac Z염색에 대해서 양성으로(A) 나타나 국소적인 표징을 보여주고 있다. (B)에서는 절연 피복된 은 전선(d=0.3㎜) 1.5㎝의 전극을 만들었다. 절연 피복은 2㎜ 간격(D)의 양 전선을 따라서 짧은 마디(0.5-1.0㎜)를 내어 제거하였다. 상기 전극은 근육 섬유들 방향에 평행하게 근육 안으로 삽입된다. 상기 두 전선 전극중에 다른 하나는 상기 근육의 표면에 위치하게 된다. 양성 푸른 염색이 상기 근육의 세 번째 가운데에서 국소적으로 약 250개의 섬유들이 관찰되었다. (B)에서는 상기 섬유들은 넓게 퍼진 염색이 관찰되어 상기 섬유의 긴 마디를 따라서 트랜스펙숀이 있거나 또는 트랜스젠닉 표현이 증가되었음을 알려주고 있다.

Claims

포유동물의 골격 근육 내에 분자를 주입하는 분자 주입과정과;

상기 주입 위치 근처에 전극들을 위치시켜서 상기 전극들에 흐르는 전류가 상기 주입 위치를 통해 흐르게 하는 전극 위치설정 과정과;

25V/cm에서 200V/cm사이의 전기장을 갖는 전류로 상기 근육에 전기적인 자극을 주는 전기적 자극과정으로 이루어진 것을 특징으로 하는 포유동물의 생체내 골격근육에 분자 전달방법.
제 1항에 있어서, 상기 전기 자극은 하나의 구형 쌍극 펄스의 형태로 가해지는 것을 특징으로 하는 분자 전달방법.
제 2항에 있어서, 상기 쌍극 펄스는 약 50㎲과 5000㎲ 사이의 펄스 폭을 갖는 것을 특징으로 하는 분자 전달방법.
제 1항에 있어서, 상기 전기 자극은 약 2개에서 30,000개의 구형 쌍극 펄스들의 형태로 가해지는 것을 특징으로 하는 분자 전달방법.
제 4항에 있어서, 상기 쌍극 펄스들은 약 10㎳에서 12,000㎳사이의 전체 펄스폭을 갖는 분자 전달방법.
제 5항에 있어서, 상극 쌍극 펄스들은 최소한 두 개 일속들의 형태로 가해지는 것을 특징으로 하는 분자 전달방법.
제 6항에 있어서, 상기 전기 자극의 주파수는 약 0.5㎐와 1000㎐ 사이인 것을 특징으로 하는 분자 전달방법.
제 1항에 있어서, 상기 분자는 핵산이며, 상기 핵산은, 상기 핵산에 의해 코드된 상기 근육 세포들의 단백질에 표현을 지시하는 조촉매와 실시 가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 분자 전달방법.
핵산에 의해 코드된 근육 단백질에 표현을 지시하는 조촉매와 실시 가능하게 연결된 핵산을 포유동물의 골격 근육 내에 투입하는 투입과정과;

상기 주입 위치 근처에 전극들을 위치시켜서 상기 전극들에 흐르는 전류가 상기 주입 위치를 통해 흐르게 하는 전극 위치설정 과정과;

약 5V/cm과 200V/cm 사이의 전기장 세기를 갖는 전류로 상기 근육을 자극하는 전기자극과정으로 이루어진 것을 특징으로 하는 포유동물의 골격 근육 내에 핵산을 트랜스펙트하여 포유동물을 유전적으로 면역시키는 방법.
제 9항에 있어서, 상기 전기 자극은 하나의 구형 쌍극 펄스를 가하는 것을 특징으로 하는 분자 전달방법.
제 10항에 있어서, 상기 쌍극 펄스는 약 50㎲과 5000㎲ 사이의 펄스 폭을 갖는 것을 특징으로 하는 분자 전달방법.
제 9항에 있어서, 상기 전기 자극은 약 2개에서 30,000개 사이의 구형 쌍극 펄스의 형태로 가해지는 것을 특징으로 하는 분자 전달방법.
제 12항에 있어서, 상기 쌍극 펄스들의 펄스 폭의 합은 약 10㎳에서 12,000㎳사이인 것을 특징으로 하는 분자 전달방법.
제 13항에 있어서, 상기 쌍극 펄스들은 최소한 두 개 일군들의 형태로 가해지는 것을 특징으로 하는 분자 전달방법.
제 14항에 있어서, 상기 전기 자극의 주파수는 약 0.5㎐과 1000㎐ 사이인 것을 특징으로 하는 분자 전달방법.
핵산에 의해 코드된 근육 단백질에 표현을 지시하는 조촉매와 실시 가능하게 연결된 상기 핵산을 포유동물의 근육에 주입하는 주입과정과;

상기 투입 위치 근처에 전극들을 위치시켜서 상기 전극들에 흐르는 전류가 상기 주입 위치를 통해 흐르게 하는 전극 위치설정 과정과;

5V/㎝과 200V/㎝ 사이의 전기장 세기를 갖는 전류로 자극하는 자극과정으로

이루어진 것을 특징으로 하는 포유동물 내에 단백질을 체계적으로 전달시키는 방법.
제 16항에 있어서, 상기 전기 전극은 하나의 구형 쌍극 펄스의 형태로 가해지는 것을 특징으로 하는 분자 전달방법.
제 17항에 있어서, 상기 쌍극 펄스는 약 50㎲과 5000㎲ 사이의 펄스 폭을 갖는 것을 특징으로 하는 분자 전달방법.
제 18항에 있어서, 상기 전기 전극은 약 2개와 30,000개 사이의 구형 쌍극 펄스들의 형태로 가해지는 것을 특징으로 하는 분자 전달방법.
제 19항에 있어서, 상기 쌍극 펄스들의 펄스 폭의 합은 약 10㎳에서 12,000㎳사이인 것을 특징으로 하는 분자 전달방법.
제 20항에 있어서, 상기 쌍극 펄스들은 최소한 두 개 일속들의 형태로 가해지는 것을 특징으로 하는 분자 전달방법.
제 21항에 있어서, 상기 전기 자극의 주파수는 약 0.5㎐과 1000㎐ 사이인 것을 특징으로 하는 분자 전달방법.