KR20010014298A - 핵산 벡터의 생체 내 조직으로의 적정화된 전기전달 장치 - Google Patents

Abstract

본 발명은 전달의 효율을 증가시키기 위하여 약한 전기장을 사용하여 핵산 벡터의 세포 내 특히 근육 세포 및 종양 세포 내로의 생체 내 전달을 현저히 증가시킬 수 있는 장치 및 시스템에 관한 것이다. 본 발명의 장치는 세포 또는 조직을 손상시키지 않고 세포 내로 핵산 벡터의 이동을 증진시키기 위하여 적정한 전압 구배를 제공하도록 설계된다. 그러한 장치는 독특한 전극 배열에 의하여, 그리고 최대 전압 조정에 의하여 정의된 독특한 전력 한계에 의하여 특징지워진다.

Description

핵산 벡터의 생체 내 조직으로의 적정화된 전기전달 장치 {DEVICE FOR OPTIMIZED ELECTROTRANSFER OF NUCLEIC ACID VECTORS TO TISSUES IN VIVO}

유전자 전달을 위한 벡터 및 방법

주어진 세포 내로의 유전자의 전달은 유전자 치료법에 있어서 기초에 해당한다. 그러나, 한 가지 문제점은 치료되어야 할 숙주 세포 내로 충분한 양의 핵산을 도입하는 것이다. 이러한 관점에서 채택된 한가지 접근은 바이러스 벡터, 특히 레트로바이러스, 아데노바이러스, 또는 아데노-관련 바이러스들 내에 핵산을 도입하는 것이었다. 이러한 시스템은 바이러스에 의하여 발현되는 세포 침투 메카니즘 뿐만 아니라, 분해에 대한 보호를 이용할 수 있다. 그러나, 이러한 접근은 문제점들을 제기한다. 한 가지는 숙주 유기체 내에서 유포되기 쉬운 감염성인 바이러스성 입자들의 생성에 대한 위험으로서, 레트로바이러스 벡터의 경우, 삽입성 돌연변이 유발의 위험이 있다. 또한, 치료적 또는 백신 유전자의 바이러스 게놈 내의 삽입 능력은 한계가 있다. 궁극적으로는, 바이러스 벡터에 대한 면역 반응이 종종 일어나며, 이는 면역적 제거(immune clearance)로 인한 불활성 바이러스의 재투여를 요하며, 또한 염증을 초래할 수도 있다.

또다른 접근(Wolf et al., Science 247, 1465-68, 1990; Davis et al., Proc. Natil. Acad. Sci. U.S.A. 93, 7213-18, 1996; US Patent No. 5,580,859 to Felgner et al.)은 근육 또는 혈관 내에 플라스미드 타입의 핵산을 투여하는 것인데, 여기서 상기 플라스미드 타입의 핵산은 그것의 트랜스펙션(transfection)을 용이하게 할 화합물, 즉 시험관 내에서의 트랜스펙션제인 단백질, 리포좀, 하전된 지방, 또는 폴리에틸렌이민과 같은 양이온성 중합체 등에 연결되거나 연결되지 않을 수 있다(Behr et al, Proc. Natil. Acad. Sci. USA 86, 6982-6, 1989; Felgner et al., Proc. Natil. Acad. Sci. USA 84, 7413-7, 1987; Boussif et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 7297-301, 1995; US Patent 5,676,954 and EP Patent 425,475).

근육에 관한 한, 상기 Wolff 일행의 최초 논문이 자유 플라스미드 형태로 주입된 DNA 를 흡수하는 근육 조직의 능력을 보여주고 있기 때문에, 여러 연구가들은 이러한 과정을 개선하기 위하여 노력하여 왔다 (Manthorpe et al, 1993, Human Gene Ther. 4, 419-413; Wolff et al, 1991, Bio Techniques 11, 474-485). 이러한 테스트들로 부터 명백히 일정한 경향이 생겨났다:

·볼(ball) 상에 DNA 를 흡착시킨 후 조직 상으로 쏘므로써 ("유전자 총(gene gun)" 세포 내로 DNA 의 도입을 강제하는 기계적인 방법의 사용 (Sanders Williams et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2726-2730; Fynan et al., 1993, BioTechniques 11, 474-485). 이러한 방법들은 백신화 전략에 있어서는 효과적인 것으로 입증되었으나, 단지 표피 조직층에만 접근할 수 있었다. 근육의 경우, 입자들이 피부 조직을 통과하지 못하므로, 이들의 사용은, 근육에 접근할 수 있도록 하기 위한 외과 수술(surgery)과 같은 접근을 필요로 할 것이다.

·자유 플라스미드 형태가 아니라 세포 내로의 복합체의 도입을 도와주는 운반체로서 작용할 수 있는 분자에 결합된 DNA 의 도입. 많은 다른 트랜스펙션 방법에서 사용된 양이온성 지방은, 근육으로의 그들의 적용에 있어서는, 지금까지 실망스러운 것으로 나타났는데, 그것은 시험된 지방들이 트랜스펙션을 억제하는 것으로 입증되었기 때문이다 (Schwartz et al, 1996, Gene Ther., 405-411). 양이온성 펩티드 및 중합체의 경우도 마찬가지이다 (Manthrope et al, 1993, Human Gene Ther. 4, 419-431). 폴리비닐 알콜 또는 폴리비닐피롤리돈의 DNA 와의 혼합물만이 오직 하나의 적합한 조합인 것으로 보인다. 이러한 조합물의 결과된 증가는 DNA 만을 주입한 것에 비하여 불과 10 미만의 차이를 나타낸다 (Mumper et al., 1996, Pharmaceutical Research 13, 701-709).

·처리되어야 할 조직을, DNA 확산 및/또는 안정성을 증가시킬 것으로 생각되는 용액(Davis et al., 1993, Hum. Gene Ther. 4, 151-159) 또는 핵산의 도입을 선호할 수 있는, 즉, 세포 복제의 유도 또는 재생성 형산을 일으킬 것으로 생각되는 용액으로 예비 처리하는 방법. 그러한 처리는 특히, 국부 마취 또는 심장독(cardiotoxin), 혈관 수축제, 내독소(endotoxin), 또는 다른 분자들의 사용과 관련된다 (Manthorpe et al., 1993, Human Gene Ther. 4, 419-431; Danko et al., 1994, Gene Ther. 1, 114-121; Vitadello et al., 1994, Hum. Gene Ther. 5, 11-18). 이러한 예비 처리 프로토콜은 다루기가 어렵다. 부피바카인(Vupivacaine) 은 특히, 효과를 나타내기 위하여, 치사량에 매우 근접한 양으로 사용되어야만 한다. 확산을 증가시키기 위한 초삼투성(hyperosmotic) 수크로즈(sucrose)의 예비 주입은 근육 내 트랜스펙션의 수준을 증가시키기 못한다 (Davis et al., 1993).

다른 조직들을, 플라스미드 DNA 만을 사용하거나 또는 합성 벡터들에 연결하여 생체 내에서 트랜스펙션시켰다 (reviews of Cotten and Wagner (1994), Current Opinion in Biotechnology 4, 705; Gao and Huang (1995), Gene Therapy, 2, 710; Ledley (1995), Human Gene Therapy 6, 1129). 연구된 중요 조직들은 간, 호흡기 상피 조직, 혈관벽, 중추 신경계 및 종양 등이었다. 최근 혈관 벽에서의 플라스미드 DNA 의 전달에 관한 고무적인 결과가 제시되기도 하였지만 (Iires et al. 1996, Human Gene Therapy 7, 959 and 989), 이 모든 조직들에 있어서 도입된 유전자의 발현 수준은 치료적 응용을 예상하기에는 너무 낮은 수준인 것으로 입증되었다 {예컨대, 간에 있어서, Chao 일행의 (1996) Huamn Gene Therapy 7, 901 참조). 뇌에 있어서, 전달의 효과는 종양의 경우에서와 마찬가지로 매우 낮았다(Schwartz et al. 1996, Gene Therapy 3, 405; Lu et al., 1994, Cancer Gene Therapy 1, 245; Son et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 12669).

유전자 전달을 위한 일렉트로포레이션(Electroporation)

및 이온영동법(Iontophoresis)

일렉트로포레이션, 또는 세포에 침투하기 위하여 전기장을 사용하는 것은, 세포 배양에 있어 DNA 트랜스펙션을 증진시키기 위하여 시험관 내에서 흔히 사용된다. 이 현상은 역가(threshold) 전기장의 세기를 맞추는 것에 따라 달라진다. 전기적 침투는 동물 세포에 대하여 비교적 높은 강도, 즉 800 내지 1,200 볼트/cm 차원에서 관찰된다. 이 기술은 또한 인간의 충실성 종양에서 블레오마이신(bleomycin)과 같은 항암제의 효율을 증대시키기 위하여 생체 내에서도 시도되었다 (US patent No. 5,468,228, L.M. Mir). 매우 짧은 기간 동안의 펄스(100 마이크로세컨드)로써, 이러한 전기적 조건(800 내지 1,200 볼트/cm)은 작은 분자들의 세포 내 전달에 매우 잘 적응한다. 이러한 조건(100 마이크로세컨드의 펄스)은 간으로의 생체 내 핵산의 전달은 증가시키지 못하였는데, 여기서 1,000 볼트/cm 미만의 전기장이 전혀 효과가 없었으며, 오히려 전기적 펄스 없이 DNA 만을 주입하는 것에 비하여 더 억제적이었다 (patent WO 97/07826 and HEller et al., FEBS Letters, 389, 225-8, 1996).

그 기술은 또한, 생체 내 적용에 있어서, 그와 같은 강도의 전기장을 적용하는 것은 과도한 조직 병변을 야기할 수 있으므로 인해 어려움을 제시한다. 표적 조직의 병변은 암 환자에 있어서 종양의 처리에 있어서는 문제가 되지 않지만, 종양 조직 이외의 조직, 특히 횡문근(striated muscle)으로 핵산을 투여하는 경우 상당한 단점을 나타낼 수 있다.

일렉트로포레이션 및 이온영동법에 대한 전기 펄스를 적용하기 위하여 사용되는 세가지의 기본적인 타입의 시스템이 있는데, 이들은 외부 전극, 내부 전극 {카테테르(catheter)를 포함하여}, 및 외부 및 내부 전극들의 조합이다.

외부 전극

장치의 한 형태에 있어서, 전극이 환자에 대하여 외부에 위치한다. 예를 들어 Hoffmann 의 미합중국 특허 제 5,318,514 호; Hoffmann 의 미합중국 특허 제 5,439,440 호; Hoffmann 의 미합중국 특허 제 5,462,520 호; Hoffmann 의 미합중국 특허 제 5,464,386 호; Hoffman 일행의 미합중국 특허 제 5,688,233 호; 및 Weaver 일행의 미합중국 특허 제 5,019,034 호를 참조하라. 이들은 참고 자료로서 본원에 포함된다. 외부 전극 장치에 있어서, 전극은 환자의 표피 조직 영역과 접촉해 있다. 장치는 환자의 피부에 전극을 적용하므로써 비침투적으로 사용하거나, 또는 전극을 외과 수술에 의하여 노출된 기관의 표피에 적용하므로써 침투적으로 사용할 수 있다.

Hoffman 의 '514 특허는 유전자, DNA 또는 의약과 같은 거대 분자들을 환자의 예비 선택된 표피 조직 영역 내로 도입하기 위하여 사용되는 장치를 개시한다. 그 장치는, 제 1 실시예에서, 대개 평평한 지지 수단 상에 위치하는 개방된 포어(pore) 탄성 중합체 상에 위치한 나선형의 도체(conductor)를 포함하는 헤드(head) 조립체를 가진다. 나선형 도체의 이웃한 평행의 단편들이 전극으로서 작용한다. 환자에게 전기적 펄스를 제공하기 위하여, 헤드 조립체는 환자의 예비 선택된 표피 조직 영역과 접촉하도록 놓이며, 도체도 피부와 접촉하여 놓인다. 거대 분자를 수송하는 액체 매질은, 탄성 중합체에 의하여 흡수되거나 스며든 액체를 포함한 탄성 중합체를 놓으므로써, 환자의 피부에 전달된다. 그 다음 전극 사이에서 인가되는 전기장을 일으키면서, 신호 발생기로 부터 전극으로의 고전압 펄스를 전달하기 위하여 스위치가 켜진다. 피부 내로의 전기장의 깊이는 전극 사이의 간격에 비례한다. 전기장은 조직 영역으로 액체를 주입한다.

다른 실시예에서, 헤드 조립체는 평평한 지지 수단과 거의 수직으로 뻗어 있는 다수의 미세한 바늘들을 포함한다. 그 바늘들은 줄을 지어 배열되며, 신호 발생기의 출력과 교대로 연결되어, 각 바늘은 이웃한 다른 바늘과 반대의 극성이다. 바늘들은 피부 세포의 최외부층을 침투하여 전기 펄스가 표적 지역으로 적용되는 것을 용이하게 한다.

Hoffmann 의 '440 특허는 전기장을 일으키기 위하여 조절할 수 있도록 간격을 두고 떨어져 있는 전극들을 포함하는 장치를 개시한다. 전극들은 이동 가능한 연결부 상에 장착되어 집게의 턱 부분과 같이 서로 다가가거나 멀어질 수 있도록, 사용자에 의하여 조작될 수 있다. 전극에 연결된 신호 발생기는 전극 사이에서 조직 내에 전기장을 발생시킬 수 있도록 적절한 스위치 장치에 의하여 작동될 수 있다.

내부 전극

전기 전달 시스템의 두번째 형태는 환자 내부에 위치하도록 이식될 수 있거나 삽입될 수 있어서, 이식되거나 또는 삽입된 전극 근처의 영역에 전기장을 전달할 수 있는 이식 가능하거나 삽입 가능한 전극을 사용하는 것이다. 예를 들어, Crandell 일행의 미합중국 특허 제 5,304,120 호; Hofmann 일행의 미합중국 특허 제 5,507,724 호; Hofmann 일행의 미합중국 특허 제 5,501,662 호; Hofmann 일행의 미합중국 특허 제 5,702,359 호; 및 Hofmann 의 미합중국 특허 제 5,273,525 호를 참조하라. 이들은 참고 자료로서 본원에 포함된다.

Crandell 의 '120 특허는 환자의 선택된 혈관 내로 삽입된 카테테르(catheter)를 개시한다. 카테테르는 다수의 축 방향으로 연장되며 원주 방향으로 떨어져 있는 혈관의 내벽과 접촉해 있는 전극들을 포함한다. 거대 분자들을 함유한 액체 매질이 전극 근처의 혈관 내로 주입되면, 전극들은 전기 전달을 위한 소정의 전기 신호를 인가하기 위하여 활성화된다. 떨어져 있는 전극들은 원하는 전기장을 발생하도록 활성화되는 나선형 또는 평행의 띠들일 수 있다.

Hofmann 의 '724 특허는 치료될 혈관 벽과 접촉하도록 혈관 내로 삽입되는 카테테르의 외면 상에 위치하는 서로 떨어져 있는 전극들을 가지는 카테테르에 기초한 전기 전달 장치의 또다른 예이다.

Hofmann 의 '662 특허는 원통형의 유전성(dielectric) 수송체 내에 장착된 떨어져 있는 한쌍의 전극을 개시한다. 전극들은 소정의 균일한 거리 만큼 서로 떨어져서 혈관 중심 주위 및 혈관의 중심 근방에 위치하여 혈관 내에서 흐르는 피가 전극 사이로 흐르도록 한다. 원통형의 유전성 수송체는 주위 혈관 내에 외과 수술적으로 이식된다. 소정의 전기 신호가 전극들에 인가되어, 전극 사이로 흐르는 피에 전기장을 형성한다.

Hofmann 의 '525 특허는, 전기 전달을 달성하기 위한 전극으로서 작용하는 바늘이 들어 있는 이중-바늘 주사기를 개시한다. 바늘이 일단 표적 영역 내로 삽입되면, 그 표적 영역에 직접 전기장을 적용하기 위하여, 전극에 전기적 신호가 인가된다. Hofmann 의 '359 특허 또한 전기 전달에 사용되는 바늘에 기초한 전극들을 개시한다.

외부 및 내부 전극의 조합

전기전달의 세번째 유형은 상기에서 언급한 시스템들의 특징들을 조합한 것이다. 이러한 장치들은 원하는 조직 영역에 전기장을 전달하기 위하여, 적어도 하나의 내부적으로 위치하는 전극 및 적어도 하나의 외부적으로 위치하는 전극을 사용한다. 예로써, Shapland 일행의 미합중국 특허 제 5,286,254 호; Shapland 일행의 미합중국 특허 제 5,499,971 호; Shapland 일행의 미합중국 특허 제 5,498,238 호; Shapland 일행의 미합중국 특허 제 5,282,785 호; 및 Shapland 일행의 미합중국 특허 제 5,628,730 호를 참조하라. 여기 개시된 내용은 참고 자료로서 본원에 포함된다.

이들 장치 중 전형적인 것은 Shapland 의 '785 특허에 개시된 것으로서, 이는 약제 전달 벽(예컨대, 그 벽을 통하여 약제 또는 다른 거대 분자가 통과할 수 있는 침투성 또는 반 침투성으로 된 벽)을 가진 약제실과, 상기 약제 전달 벽과 반대 방향으로 카테테르 내부에 위치한 전극을 포함하는 카테테르를 개시한다. 두번째 전극은 환자의 피부 상에서, 분리된 위치에 존재한다. 원하는 거대 분자를 함유하는 액체는, 전류가 제공되면, 상기 두개의 전극 사이에 생성되는 전기장에 놓일 약제실로 전달된다. 이러한 방식으로, 거대 분자들은 표적 영역으로 전달된다.

다른 특징들이 상기에서 언급된 특허들에서 개시되는데, 이들은, 전달을 위해 사용되는 방향과 반대 방향으로 과량의 거대 분자들을 구동하기 위하여, 전극의 극성을 역전시키는 방법 (예컨대, Shapland 의 '238 특허 및 '785 특허); 전기적으로 유도되는 부정맥 또는 비정상적인 심장 박동을 피하기 위하여, 전극으로의 전류의 전달과 심장 심실의 소극화(depolarization)를 동시에 진행시키는 시스템 (예로써, Feiring 의 미합중국 특허 제 5,236,413 호 및 제 5,425,703 호와, Shapland 의 미합중국 특허 제 5,634,899 호); 및 거대 분자의 전달을 위한 구동력으로서 소리 영동(phonophoresesis)으로 알려진 소리파를 발생하기 위하여, 전극 대신 초음파 압전기(piezoelectric) 변환기를 사용하는 방법 (예컨대, Shapland 의 '238 특허 및 '730 특허) 등을 포함한다.

발명의 요약

인용한 모든 연구들이, 생체 내에서 효과적이기 위해서는, 1,000 볼트/cm 단위의 상승된 전기장에 대한 필요를 언급하였지만, 정말 예상치 못하였으며 그리고 현저하게도, 이제 본원 출원인들은 조직 내로의 생체 내 핵산의 전달을, 낮은 강도(600 볼트/cm 미만), 즉 100 내지 200 볼트/cm 의 전기 펄스에 비교적 오랜 시간 동안 상기 조직을 적용시키므로써, 바람직하지 못한 효과 없이, 실질적으로 상당히 증가시킬 수 있음을 발견하였다. 본원 출원인들은 또한, 근육 내로의 DNA 전달의 선행 기술에서 관찰되는 플라스미드에 의해 수송된 전달 유전자의 발현에 있어서의 넓은 가변성이, 본 발명에 따른 방법에 의하여 현저히 감소되었음을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 하나 이상의 횡문근 또는 종양과 같은 생체 내 조직으로의 핵산 전달을 위한 방법 및 장치에 관한 것으로서, 여기서 조직 세포들은 조직 내로의 직접적인 투여 또는 국부적이거나 전신적인 투여를 통하여 전달될 핵산과 접촉하도록 놓이고, 또한 전달은 조직에 근육 당 한번 이상의 1 내지 400 볼트/cm, 및 종양과 같은 조직에 대해서는 1 내지 600 볼트/cm 강도 범위의 전기 펄스들을 적용하므로써 이루어질 수 있다.

따라서, 본 발명은, 다세포의 진핵 유기체들의 세포 내로의 생체 내 핵산의 전달을 위한 개선된 장치와 같은 시스템을 제공하는데, 여기서 조직 세포들은 조직으로의 직접적인 투여 또는 국부적 또는 전신적 투여에 의하여 전달될 핵산과 접촉하게 되며, 또한 전달은 특정 강도를 제공하도록 맞추어진 본 발명의 장치에 의하여 전달되는 한번 이상의 전기적 펄스를 조직에 적용하므로써 이루어진다. 특히, 전기장의 강도는 종양 세포로의 핵산의 전달을 위해서는 1 내지 600 볼트/cm, 그리고 근육 세포로의 핵산의 전달을 위해서는 1 내지 400 볼트/cm 의 범위에 있을 수 있다. 본 발명의 시스템(또는 장치)은 전기 펄스 발생기(또는 전기 펄스를 발생하기 위한 수단)와 전기 펄스 발생기에 연결된 전극을 포함하여 구성되는데, 여기서 상기 전기 펄스 발생기는 1 밀리 초(sec) 이상의 펄스 시간과 0.1 내지 1000 Hz 의 주파수에서 1 내지 400 또는 600 볼트/cm 의 강도를 가지는 전기 펄스들을 생성하며, 상기 전극들은 전극과 접하고 있는 생체 내 조직에서 전기장을 생성하기 위한 것이다. 특정 실시예에서, 전기 펄스 발생기는 30 내지 300 볼트/cm (근육 내로의 전달을 위해) 및 400 내지 600 볼트/cm (종양 세포 및 다른 작은 세포들로의 전달을 위해)의 강도를 가지는 펄스를 생성한다. 또다른 실시예에서, 전기 펄스 발생기는 10 밀리 초 이상의 펄스 시간을 생성한다. 또다른 특정 실시예에서, 전기 펄스 발생기는 2 내지 1000 개의 펄스를 발생한다.

본 발명에 따르면, 시스템 또는 개선된 장치의 전기 펄스 발생기는 서로에 대하여 불규칙적으로 펄스들을 발생할 수 있으며, 이로 인하여, 펄스 시간에 의존하는 전기장의 강도를 기술하는 함수는, 상기 시스템 또는 장치가 어떤 시간에도 상기에서 주어진 변수들 보다 큰 (또는 작은) 전기장을 공급하지는 않는다는 조건 하에, 다양할 수 있다. 예를 들어, 시간과 함께 전기장의 다양성을 기술하는 함수의 적분은 1 kV·msec/cm 를 초과할 수 있으며; 또다른 실시예에서는, 5 kV·msec/cm 와 동등하거나 또는 이를 초과할 수 있다.

전기 펄스 발생기(펄스 발생 수단)는 사각파(square-wave) 펄스, 지수적 감쇠파(exponential decay wave), 제한된 지속 기간의 진동 단극파(unipolar waves) 및 제한된 지속 기간의 진동 양극파(bipolar waves)로 구성되는 군으로 부터 선택되는 펄스를 생성할 수 있다. 바람직하게는, 전기 펄스 발생기는 사각파 펄스를 발생한다.

본 발명에 따라, 여러 전극 구조들이 고려될 수 있다. 예컨대, 전극은 개체의 표피 조직의 세포 내로 핵산을 전달하기 위하여 처리되어야 할 조직 상에 위치하기 위한 외부 전극일 수 있다. 또는, 전극은, 처리될 조직 내에 이식될 수 있는, 내부 전극 또는 조직 침투성 전극일 수 있다. 그와 같은 내부 전극은 바늘일 수 있고, 또한 핵산과 전기장의 동시적 적용을 가능하게 할 수 있는 주사기 시스템으로 구성될 수도 있다. 또다른 실시예에서, 본 발명은 외부 전극 및 내부 전극 모두를 제공한다.

본 발명의 외부 전극은 큰 근육에 매우 근접하여, 개체 몸의 외부의 일부분과 접촉하기 위한 크기로 될 수 있다. 구체적인 실시예에서, 그러한 전극은 평평한 판 전극이며; 또다른 실시예에서, 그것은 반-원통형 판 전극이다.

또다른 실시예에서, 전극은 동맥 내 또는 정맥 내 전극으로서, 예컨대 본 발명에 따라 개조된 유동적인 카테테르 장치이다.

본 발명의 전극을 위한 바람직한 재료는 스테인레스 스틸이다.

본 발명의 개선된 장치는 선행 기술 장치, 특히 그러한 장치들의 전기장 발생 수단을 개조하므로써, 본 발명의 전기장을 생성하기 위하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 전기 펄스를 발생하기 위한 수단은 400 또는 600 볼트/cm 에 대응하는 전압을 초과하지 않는 전압 게이트(gate)를 개조하므로써, 1 내지 400 또는 600 볼트/cm 사이의 펄스들을 제조하도록 적용될 수 있다. 그와 같은 개조된 장치의 한 구체예에서, 전압은 일정 전압으로 고정될 수 있고, 전극은 일정 공간의 거리를 두고 장치될 수 있다. 대안적으로는, 전기 펄스를 발생하기 위한 수단은 400 또는 600 볼트/cm 에 대응하는 전압을 초과하지 않는 장치를 표지화하므로써, 1 내지 400 또는 600 볼트/cm 사이의 펄스들을 제조하도록 적용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 조직을 손상시키지 않으면서 핵산의 전달에 적정한 것으로 발견된 전압 구배, 펄스 폭, 및 펄스 수를 가지는 전기장을 공급하기 위한 시스템을 제공하거나, 또는 현존하는 장치를 개조하는 것이다.

본 발명의 특별한 목적은, 일렉트로포레이션에 사용되는 것 (600 이상의 전압 구배, 및 일반적으로 1000 볼트/cm 이상의 전압 구배를 가지는) 보다 온화하고 보다 덜 손상적인 조건 하에서 핵산의 전기 전달을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 이온 영동에 사용되는 매우 낮은 전기장 강도 하에 달성될 수 있는 것에 비하여 훨씬 효과적인 세포 내 핵산의 전달을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 근육 세포 내로 핵산의 효율적이고도 재현 가능한 전달을 제공하는 것이다.

본 발명의 이러한, 그리고 다른 목적들은 상술한 바와 같이, 그리고 본 발명의 상세한 설명 및 첨부된 도면과 함께 실시예에서 보다 자세히 기술된 바에 따라 달성되었다.

본 발명은, 전달의 효율을 증가시키기 위하여, 약한 전기장을 사용하여 세포, 특히 근육 세포 내로 핵산 벡터의 생체 내 전달을 크게 향상시키는 것에 관한 것이다. 본 발명은 특히, 유전자 치료를 위한 그와 같은 핵산 벡터의 전달을 수행하는 방법, 장치 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 장치는 세포 또는 조직에 손상을 주지 않고, 세포 내로 핵산 벡터의 이동을 향상시키기 위한 적정 전압 구배를 제공하도록 설계된다. 그러한 장치는 전극의 독특한 배열, 및 최대 전압 조정에 의하여 한정되는 독특한 전력 제한에 의하여 특징된다.

도 1 : 생쥐 내 두개골의 경골 근육에서의 플라스미드 DNA pXL2774 의 트랜스펙션에 대한 높은 전기장 강도의 전기 펄스의 효과 ; 평균값 ±SEM.

도 2 : 생쥐 내 두개골의 경골 근육에서의 플라스미드 DNA pXL2774 의 트랜스펙션에 대한 중간 전기장 강도의 전기 펄스의 효과 ; 평균값 ±SEM.

도 3 : 생쥐 내 두개골의 경골 근육에서의 플라스미드 DNA pXL2774 의 트랜스펙션에 대한 약한 전기장 강도 및 다른 기간 동안의 전기 펄스의 효과 ; 평균값 ±SEM.

도 4 : 생쥐 내 두개골의 경골 근육에서의 플라스미드 DNA pXL2774 의 트랜스펙션에 대한 높은 전기장 강도의 전기 펄스의 효과 ; 평균값 ±SEM.

도 5 : 낮은 전기장 강도에서의 생쥐 내 두개골의 경골 근육에서의 플라스미드 DNA pXL2774 의 전기 전달의 효과 ; 평균값 ±SEM.

도 6 : 생쥐 두개골의 경골 근육에서의 루시퍼라제 발현의 역학. 전기 전달로써(■), 그리고 전기 전달 없이 (◆) 플라스미드 pXL2774 를 투여함. 평균값 ±SEM.

도 7 : 전기 전달로써 () 그리고 전기 전달 없이 (□) 투여된 DNA 투여량의 함수로서의 발현의 수준.

도 8 : 전기 전달 효과에 대한 전극의 상이한 전극 형태의 효과.

도 9 : 분비된 알칼린 포스페이트의 혈장 농도의 역학. 전기 전달로써 (■) 그리고 전기 전달 없이(◆) 플라스미드 pXL3010 을 투여함. 평균값 ±SEM.

도 10 : 전기 전달(개방된 분포 막대) 또는 전기 전달 없는(칠해진 분포 막대) 근육 내에서의 aFGF 의 발현 역학.

도 11 : 플라스미드 pXL3179 및 pXL3212 의 지도.

도 12 : 플라스미드 pXL3388 및 pXL3031 의 지도.

도 13 : 플라스미드 pXL3004 및 pXL3010 의 지도.

도 14 : 플라스미드 pXL3149 및 pXL3096 의 지도.

도 15 : 플라스미드 pXL3353 및 pXL3354 의 지도.

도 16 : 플라스미드 pXL3348 의 지도.

상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 조직을 낮은 강도의 전기 펄스에 적용시키므로써, 조직 내로의 생체 내 핵산의 전달을 크게 증가시키는 것에 관한 것이다. 예를 들어, 600 볼트/cm 미만의 전기장, 그리고 400 볼트/cm 미만, 및 바람직하게는 근육 내에서 약 0.5 내지 1 cm 간격을 두고 위치하고 있는 전극에 대한 100 내지 200 볼트/cm 의 전기장이 종양 내로의 핵산의 전달을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 이러한 전기장들은 비교적 긴 시간 동안 인가된다. 또한, 출원인들은 근육 내로의 DNA 전달에 관한 선행 기술에서 관찰되었던 전달 유전자들의 발현에 있어서의 광범위한 다양성이 본 발명에 따른 방법에 의하여 현저히 감소되었음을 발견하였다. 궁극적으로, 60 일 이상과 같은 긴 시간 주기 동안 발현이 지속됨을 관찰하였다. 구체적인 실시예에서, 높은 수준의 발현이 63 일 동안 관찰되었다.

지금까지 기술된 내용으로 부터 잘 알 수 있는 바와 같이, 출원인들은 이러한 조건 하에서의 생체 내 세포 내로의 핵산의 전달을 "전기 전달(electrotransfer)"이라고 표현하였는데, 지금까지 사용된 적절한 다른 용어로는 "일렉트로펙션(electrofection)"이 있다. 이들 두 용어는 모두 "일렉트로포레이션(electroporation)"(800 볼트/cm 이상의 전기장 사용) 및 "이온 영동(iontophoresis)"(매우 낮은 강도의 전기장 사용)과는 구별되는 핵산 전달을 위한 적정화된 조건을 의미한다.

따라서, 본 발명은 조직, 특히 횡문근 내로의 생체 내 핵산의 전달을 위한 조성물, 방법, 시스템 및 기구들(또는 장치)에 관한 것으로서, 여기서 상기 조직 세포는 조직 내로의 직접 투여에 의해 또는 국부 또는 전신적 투여를 통해 전달될 핵산과 접촉하게 되며, 상기 전달은 상기 조직으로 1 내지 600 볼트/cm (종양 세포에 대하여) 또는 1 내지 400 볼트/cm (근육 세포에 대하여) 사이의 강도를 가지는 전기 펄스를 한번 또는 그 이상 인가하므로써 이루어진다. 바꾸어 말하면, 본 발명은 특히 전기 전달을 위한 시스템(즉, 기구 또는 장치)에 관한 것이다.

바람직한 일 실시예에 의하면, 본 발명의 방법은 그 세포들이 특정 이성질체들, 예컨대, 큰 크기 및/또는 연장된 모양의 세포들 및/또는 전압에 대하여 자연적으로 반응하는 것 및/또는 특정 구조를 가지는 조직들에 적용된다.

전기장의 강도는 바람직하게 근육에 대해서는 4 내지 400 볼트/cm, 그리고 종양에 대해서는 600 볼트/cm 이하의 범위이며, 총 인가 시간은 1 밀리 초(msec), 및 바람직하게 10 msec 를 초과한다. 구체적인 실시예에서, 총 시간은 8 msec 또는 그 이상이다. 많은 실시예들에서, 펄스 기간은 20 msec 이며, 40 msec 보다 긴 시간도 효과적인 것으로 밝혀졌다. 사용된 펄스의 수는, 예컨대 1 내지 1,000 펄스이며, 바람직하게는 2 내지 100, 더욱 바람직하게는 4 내지 20 이며, 펄스 주파수는 0.1 내지 1,000 헤르츠(Hz), 보다 정확하게는 0.2 내지 100 Hz 범위이다. 펄스는 또한 불규칙적으로 유도될 수도 있으며, 시간에 의존하는 전기장의 강도를 기술하는 함수는 다양할 수 있다. 시간과 함께 전기장의 강도의 변화를 기술하는 함수의 적분은 1 kV·msec/cm 이상이다. 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 그러한 적분은 5 kV·msec/cm 와 같거나 그 이상이다. 그러나, 본 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 사람이라면 금방 이해할 수 있듯이, 이와 같이 적분된 함수는 상기에서 기술한 부수적인 전기 영동 전압에서 이루어져야 한다.

본 발명으로 부터의 이탈을 나타내는 특정 실시예에서, 본 발명의 장치는 짧은 기간 (1 msec 미만) 동안 적어도 하나의 보다 높은 전압 펄스(400 볼트/cm, 바람직하게는 500 내지 800 볼트/cm 사이)와, 뒤이은 훨씬 낮은 전기장 강도(200 V/cm)에서 하나 또는 그 이상의 보다 긴 펄스들(1 msec 이상)의 조합을 제공할 수 있다.

본 발명의 바람직한 한 실시예에 따르면, 펄스의 전기장 강도는 30 내지 300 볼트/cm 범위이다.

전기 펄스들은 사각파 펄스, 전기장을 발생하는 지수적으로 감쇠하는 파, 제한된 기간 동안 진동하는 소극파, 제한된 시간 동안 진동하는 양극파, 또는 다른 파형들 중에서 선택된다. 본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 전기 펄스는 사각파 펄스이다.

전기 펄스의 적용은 다음과 같은 당 분야에서 공지된 어떠한 방법으로도 수행될 수 있다 :

·처리될 조직의 양면 상에 위치하는 외부 전극 시스템, 특히, 피부와 접촉하도록 놓인 비침투성 전극,

·조직 내에 이식된 전극 시스템,

·핵산과 전기장의 동시 투여를 가능하게 하는 전극/주사기 시스템.

생체 내에서 수행되는 적용에 있어서는, 종종 비침투성 외부 전극에 대하여 전기적 지속성을 보장하기 위하여 중간체 산물들을 사용할 필요가 있다. 예를 들어, 겔 형태의 전해질이 관련될 것이다. 적절한 겔들의 예로는 이하의 실시예에서 사용된 겔 뿐만 아니라, 전기 심장 X 선상(electrocardiogram) 또는 세동제거기(defibrillator) 등의 사용시 전기적 접촉을 증가시키기 위하여 의학적으로 흔히 사용되는 겔도 포함한다.

핵산은 임의의 적절한 수단에 의하여 투여될 수 있지만, 바람직하게는 조직 내로 직접 생체 내 주사되거나, 또는 전기장 적용 부위 상에 그들이 도달할 수 있도록 하는, 국부 또는 전신적인 다른 경로에 의해 투여할 수 있다. 핵산은 이전에 기술한 바와 같은, 전달을 허용하거나 또는 용이하게 하는 시약들과 함께 투여될 수 있다. 그러한 핵산들은 명백히, 용액 내에서 자유 형태로, 또는 합성 시약에 결합되거나, 또는 바이러스 벡터에 의하여 수송된다. 합성 시약들은 당업자에게 공지된 지방 또는 중합체일 수 있거나, 또는 표적 조직의 막 상에 가능한 고정을 일으키는 표적화 요소들일 수도 있다. 그러한 요소들 중에는, 당, 펩티드, 항체, 수용체, 및 리간드들을 수송하는 벡터를 언급할 수 있다.

본 발명의 이와 같은 조건 하에서, 물론 전기장이 핵산이 투여된 후에도 계속적으로 인가된다는 조건 하에서, 핵산의 투여는 앞서 일어나거나, 또는 전기장의 인가와 동시에, 또는 심지어 인가 후에 일어날 수도 있음을 알 수 있을 것이다.

본 발명은 또한 그들의 동시적, 개별적 또는 시간차를 둔 포유 동물 세포, 특히 인간 세포 내로의 생체 내 핵산의 투여에 대한 조합물로서의 핵산 및 1 내지 600 볼트/cm (바람직하게는 400 볼트/cm) 사이의 전기장에 관한 것이다. 근육 내로의 전달을 위한 전기장의 강도는 바람직하게 4 내지 400 볼트/cm 이며, 더욱 바람직하게는 30 내지 300 볼트/cm 사이의 범위에 있다. 유사한 전기 전달 수용 성질을 가진 종양 및 세포 내로의 전달의 경우, 바람직한 전기장 강도는 400-600 볼트/cm ; 바람직하게는 약 500 (즉, 500 ±10%, 바람직하게는 5%) 볼트/cm 이다. 당 분야의 통상의 기술 중 하나에 의하여 즉시 이해할 수 있는 바와 같이, 그러한 조합은 핵산 구조를 정의하는데, 이 때 그러한 핵산은 전기장에 대한 특정 배향(orientation) 및 전기장 존재 하에서의 특정 2 차 및 3 차 구조를 채택한다. 또한, DNA 는 표적 조직에서 발견되는 세포 외 성분들을 동반할 것이며, 이는 아가로스 겔 또는 다른 실험실 조건에서의 낮은 전기장의 전기 영동에 적용되는 DNA 와 다른 점이다.

전기 전달 시스템 및 장치

임의의 전기 전달 시스템(즉, 장치 또는 기구 ; 여기서 이들 용어는 상호 교환적이다)의 첫번째 부품으로는 600 V/cm 이하의 펄스를 제공하도록 설계되거나 개조된 전기 펄스 발생기와 전극으로 구성된다. 특히 근육으로의 핵산의 전달을 위한 본 발명의 시스템 또는 장치는 400 볼트/cm 이하의 펄스를 제공한다. 당연히, 실제 전압은 전극 사이의 거리에 의존할 것이다. 당 분야에서 잘 알려진 바와 같이, 이 거리는 표적 조직을 통하여 고유 저항(저항율)에 영향을 미칠 것이다. 따라서, 실제 인가되는 전압은 저항에 의존할 것이며, 그리하여 전류, 및 따라서 총 전력은 수용할만한 수준으로 유지된다. 여기서 사용된 "수용할만한 수준"이란 상기 총 전력이 비가역적인 조직 손상, 특히 조직을 태워버리지 않는 것을 의미한다. 따라서, 바람직한 측면에서, 본 발명의 장치는 전압 및 전극 거리를 조정하므로써 수용할만한 전류를 조절하거나, 또는 전극 사이의 거리에 대하여 너무 높은 전압, 따라서 너무 센 전류가 흐르는 것을 방지하기 위한 피이드백(feedback) 수단을 포함한다. 본 발명의 시스템은 전압, 전류, 또는 이 둘 모두를 모니터하기 위하여 오실로스코프(oscilloscope) 또는 다른 측정 장치를 포함할 수 있다.

한 실시예에서, 본 발명의 시스템은 상업적으로 구입 가능한 기구들을 사용하여 제조된다. 바람직하게, 그러한 기구는 적정한 것으로서 여기서 정의된 특정 전기 전달 조건들을 제공하도록 개조된다. 다른 실시예에서는, 본 발명의 목적을 달성할 수 있도록 새로운 장치가 설계되어 제작된다. 개조되거나 제작된 펄스 발생기의 디자인 명세서는 근육으로의 투여를 위하여 600 또는 400 V/cm 미만, 바람직하게는 200 V/cm 미만의 원하는 전압 구배를 유지하기 위한 기계적 또는 전기적 조절기를 포함하나, 이에 제한하려는 의도는 아니다. 기계적 조절은 예를 들어, 너무 높은 전기장을 생성할 수도 있는 전압의 선택을 방지하는, 전압 선택 다이알 상의 정지점을 포함할 수 있을 것이다. 대안적으로는, 장치는 그러한 전압이 선택될 수 없도록 제작되거나 조절될 수도 있다. 또다른 실시예에서는, 장치는 전압이 (따라서 전류가) 본 발명의 변수들을 초과하는 경우 걸리게 되는 브레이커(breaker) 또는 퓨즈(fuse)를 포함할 수 있다. 또다른 실시예에서는, 마이크로프로세서(microprocessor) 조절기가 너무 큰 전압의 선택을 방지하거나 무시할 수 있다. 또 다른 실시예에서는, 본 발명의 전기장 강도를 제공하는 특정 전압 영역의 사용을 지시하는 표지를 적용하므로써, 펄스 발생기를 간단히 개조할 수 있다. 이러한 모든 개조는 당 분야에서 통상적으로 이루어지는 것이며 표준 전기 및 기계적 기술을 채용하는 것이다.

상기에서 언급한 바와 같이, 여기서 적정한 것으로 정의된 전기장 강도를 달성하기 위하여 본 발명의 시스템에 의하여 전달되는 실제 전압은, 부분적으로는 전극 사이의 간격에 의존할 것이다. 만약 전극이 고정된 방식으로 서로 떨어져 있다면, 전압은 (근육, 간, 심장 또는 종양 등과 같이 규정된 조직에 대하여) 미리 정해진 상수가 될 수 있다. 그러나, 만약 전극 사이의 거리를 변화시키도록 제공되는 것이 바람직하다면, 전압은 일정한 전압 구배를 유지하도록 조정되어야만 할 것이다. 이것은, 조정 후 그들의 간격에 대한 값을 제공하는 전극 상의 측정 수단을 포함하므로써, 또는 정확한 전압을 자동으로 제공하기 위하여 펄스 발생기로 피이드백되는 자동화된 측정 수단에 의하여, 전극 사이의 거리를 측정하므로써 결정될 수 있다 (Hofmann 의 미합중국 특허 제 5,439,440 호를 참조하라).

이하의 절들은 본원 발명에 맞추어 개조될 수 있는, 종래 기술 상의 펄스 발생기, 전극, 및 장치들을 보다 상세히 기술한다.

펄스 발생기

펄스 발생기("전압 발생기" 및 "펄스 또는 전압 발생 수단"이라고도 한다)는 규정된 전압, 시간, 펄스 폭, 충격 계수(duty cycle ; 펄스기와 휴지기의 총 시간), 및 펄스 주파수의 전류를 생성하는 전기 장치이다. 그러한 장치는 당 분야에 잘 알려져 있으며, 본원에 참고 자료로서 그 전체가 포함된 미합중국 특허 제 5,704,908 호에 기술된 바와 같은, 캘리포니아, 샌디에고의 BTX Instruments Division of Genetronics 사로 부터 구입 가능한 ELECTRO CELL MANIPULATOR 모델 ECM 600, T800L 및 T820 전압 발생기와 같은 상업적으로 구입 가능한 펄스 발생기를 포함한다. 대안적으로는, 펄스 발생기는 이하의 실시예에서 개시한 바와 같은, 프랑스, Jouan 으로 부터 구입할 수 있는 Electropulsator PS 15 를 사용할 수 있다. 또다른 실시예에서는, 본원에 참고 자료로서 그 전체가 포함된 미합중국 특허 제 5,634,899 호에서 기술한 하나 이상의 파를 생성할 수 있는 전압 발생기를 사용할 수도 있다. 전압은 변화할 다양한 형태, 강도, 및 주기의 펄스들을 생성하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 200 V/cm 또는 400 V/cm, 5-20 msec 의 펄스 후 보다 낮은 강도의 보다 긴 펄스를 생성할 수 있다. 그 장치는 또한 본 발명의 전기장과 조합하여 이온 영동 전기장을 공급할 수도 있을 것이다. 본 발명의 펄스 발생기는 하기와 같은 명세를 가질 것이다 :

·1 내지 600 또는 400 V/cm ; 바람직하게는 4 내지 400 V/cm ; 보다 바람직하게는 30 내지 300 V/cm 의 전압 구배를 생성한다. 근육 내로의 전기 전달을 위한 본 발명의 장치를 위하여 고려된 특정 전압 구배는 100 V/cm 및 200 V/cm ; 보다 바람직하게는 200 V/cm 이다. 종양 세포 또는 유사 세포들 내로의 전기 전달에 있어서는, 400-600 V/cm, 및 적정하게 약 500 V/cm 의 전기장이 예측할 수 없었던 정도로 바람직함이 밝혀졌다.

·0.1 내지 1,000 헤르츠(Hz)의 펄스 주파수들 ; 특정 실시예에서, 주파수는 약 2 Hz 또는 그 이상, 10 Hz 이하였고 ; 바람직하게는 1 Hz 이상이었다. 바람직한 실시예에서, 주파수는 3 또는 4 Hz 이다.

·다양한 충격 계수를 가지는 1 밀리초(msec) 이상의 펄스 시간(주기); 바람직하게는, 펄스 시간은 5 msec 보다 크다 ; 보다 바람직하게는 10 msec 보다 크다; 보다 바람직하게는 20 msec 보다 훨씬 크다.

바람직한 한 측면에서, 본 발명의 펄스 발생기는 적어도 두개, 바람직하게는 네개, 여섯개, 또는 여덟개의 펄스들을 생성한다. 예를 들어, 그것은 8 내지 1,000 개 사이의 펄스를 생성할 수 있다. 펄스 발생기는 환자가 부작용을 경험하기 시작하거나 또는 전기장의 세기가 조절되지 않는 경우를 대비하여 오버라이드(override) 또는 차단기(cut-off)를 포함하여야 한다. 그러한 오버라이드는 수동 또는 자동이거나, 둘 모두를 채택할 수 있다.

펄스들이 또다른 장치, 컴퓨터, 등과 같은 외부 신호에 의해 생성될 수 있음은 당해 기술 분야의 통상의 지식을 가진 사람에게는 명백할 것이다. 예를 들어, 심장 조직으로의 핵산 전달의 경우, 펄스 발생기는 펄스들이 심장 박동과 동시에 일어나도록 피실험자의 전기 심장 X선상(electrocardiogram)과 적정하게 간섭할 수 있다. 그러한 시스템은 바람직하게 피실험자의 심장 리듬, 즉 심박보조조정기(pacemaker)(Shapland 의 미합중국 특허 제 5,634,899 호를 참조하라)의 활성 속도계(pacing)를 포함한다.

전극

본 발명의 전극은 조직에서 전기장을 제공한다. 하나의 전극, 즉 음극(cathode)은 음으로(negatively) 하전되고; 양극(anode)는 양으로(positively) 하전된다. 일반적으로, 본 발명에 있어서, 하나의 전극으로 부터 다른 전극으로 이온의 알짜(net) 흐름(flow) 또는 유동(flux)이 있다 (그 흐름은 물론 이온성 입자들의 알짜 전하 및 전극의 극화에 의존한다). 일반적으로, 강한 알짜 음 전하를 수송하는 핵산은 양극 쪽으로 이동할 것이다.

본 발명에 따른 사용을 위한 전극은 효율적으로 전력을 발생하여야 하며, 사용되는 조건 하에서, 바람직하게는 불활성, 비 반응성, 및 무독성이다. 특히, 내부적 사용을 위한 전극은, 예컨대 해롭거나 독성일 수 있는 전극으로 부터의 금속 이온의 발생을 피하거나, 또는 전극 효율을 감소시키는 산화를 방지하기 위하여, 조금이라도 감지가능한 정도로 생물학적 물질들과 반응해서는 안된다. 본 발명의 전극으로서 바람직한 물질은 매우 비반응성이며, 전기 발생에 합리적으로 효과적이며, 또한 합리적인 가격으로 제조되기에 충분히 싼 스테인레스 스틸이다. 특히 내부적인 사용을 위한 보다 이상적인 전극은, 금 또는 백금이다. 그러나, 그러한 귀금속 전극들은 매우 비싸다. 이들 물질의 가격은 다른 전도체 위에 그들을 도금하므로써 낮출 수 있다. 다른 전도성 금속으로는 구리, 은, 또는 염화은, 주석, 니켈, 리튬, 알루미늄, 및 철과, 이들의 합금을 들 수 있다. 그러나, 알루미늄과 같은 특정 물질들은 내부적으로는 사용될 수 없다. 전극은 또한 지르코니움, 이리듐, 티타늄, 및 탄소의 특정 형태들로 부터 제조될 수도 있다.

은 및 구리와 같은 일부 전극들은 항균 활성을 가지는데, 이는 감염을 억제하기 위하여 내부 투여에 있어서 바람직할 수 있다.

전극은 표적 조직에 적절한 어떠한 구조로도 제작될 수 있는데, 직선 철사 형태, 감겨진 철사 형태 (카테테르로의 사용을 위해서는 직선 및 꼬인 형태의 철사형 전극이 이상적이다), 전도성 표면 (즉, 카테테르 또는 벌룬 카테테르(balloon catheters)의 표면 ; 본원에 그 전체가 참고 자료로 포함된 미합중국 특허 제 5,704,908 호를 참조하라), 금속띠, 바늘 (또는 탐침), 바늘들의 배열, 표면 전극, 또는 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 고려되는 전극 조합으로는 (1) 카테테르 전극 및 바늘 전극 ; (2) 카테테르 전극 및 표면 전극; 및 (3) 바늘 전극 및 표면 전극들이다. 한 구체예에서, 바늘 전극은 DNA 를 분배하기 위하여 주사기와 함께 사용될 수 있다. 그러한 바늘 전극은 그 길이 전체를 통하여 핵산 용액의 분배를 허용하도록 그 축의 길이를 통하여 구멍들을 가질 수 있다. 큰 기관, 특히 큰 근육으로의 핵산의 분배를 위하여, 두개의 표면 전극이 사용될 수 있다. 표면 전극들은 바람직하게는, 상기에서 기술된 바와 같이, 피부를 통한 양호한 접촉 및 전도를 보장하기 위하여 전해질 조성물과 조합하여 사용될 수 있다.

하나의 내부 전극 및 하나의 외부 전극을 가지는 특정 구체예에서, 외부 전극은 내부 전극 주변으로 위치하는 다수의 "헤드(head)"를 가질 수 있다. 실제로, 여기서 기술된 어떠한 구조에 있어서도, 일반적으로 하나의 전극은 다수의 "헤드"를 가질 수 있다.

본 발명은 또한 다음과 같은 전극의 배열들을 고려한다 : 그 축을 따라 구멍들을 가지는 바늘들; 전기적으로 분리된 상부 및 하부 부분들을 가지며, 규정되고 보정된 전도성 길이를 가지는 바늘들 (조직 내로의 바늘이 침투하는 깊이에 상관 없이, 조직 내로의 일정하고도 재현 가능한 전도성 영역을 제공하기 위하여); 조직 내로의 점간 전기적 아크(arc)를 방지하기 위하여 분리된 점들을 가지는 바늘들; 및 하나의 바늘 주위로 생성물을 함유하는 임의의 종류의 파우치(pouch)/저장기(reservoir).

바늘 전극에 대하여 상기에서 기술한 바와 같이, 판 전극들은 고립된 주변부들을 포함하여 구성될 수 있다.

일반적으로, 전극들은 그들 사이에 표적 조직이 직접적으로 존재하도록 배치된다. 그러한 방식으로, 핵산은 최대 전기장 강도에 적용된다. 그러나, 전기장의 흐름은 모두 전극 주변에 있기 때문에, 전극 사이에서 주변적으로 발생된 전기장 뿐만 아니라 전극 사이에서 직접적으로 발생된 전기장을 사용하는 것도 가능하다.

선행 기술의 개조된 장치들

구체적인 실시예에서, 전극이 환자에 대하여 외부적으로 배치된 장치(예로서, Hofmann 의 미합중국 특허 제 5,318,514 호 및 Weaver 일행의 미합중국 특허 제 5,019,034 호를 참조하라)가 본 발명에 따른 개선된 장치를 제공하기 위하여, 규정된 조건 하에 전기장을 제공하도록 본 발명에 따라 개조된다. 개선된 장치는 환자의 피부에 전극을 비침투적으로 적용하거나 또는 외과 수술적으로 노출된 기관의 표면에 전극을 침투적으로 적용하므로써 사용될 수 있다.

유사하게, 이식되거나/삽입된 전극들 옆의 영역에 전기장을 분배하기 위하여 환자 내부에 위치한 이식 가능하거나 침투 가능한 전극들, 특히 카테테르 전극(예로써, Crandell 일행의 미합중국 특허 제 5,304,120 호; Hofmann 일행의 5,507,724 호; Hofmann 의 5,501,662 호; Hofmann 일행의 5,702,359 호; 및 Hofmann 의 5,273,525 호를 참조하라)이 본 발명의 개선된 장치를 생산하기 위하여, 본 발명에 따라 개조될 수 있다.

당연히, 상기에서 언급한 시스템들, 즉 원하는 조직 영역에 전기장을 분배하기 위하여 적어도 하나의 내부적으로 위치한 전극 및 적어도 하나의 외부적으로 위치한 전극을 사용하는 시스템들의 특징들을 조합하는 전기 전달 장치(예로서, Shapland 일행의 미합중국 특허 제 5,286,254 호, Shapland 일행의 미합중국 특허 제 5,499,971 호, Shapland 일행의 5,498,238 호; Shapland 일행의 5,282,785 호; 및 Shapland 일행의 5,628,730 호를 참조하라)가 본 발명의 개선된 장치를 제공하기 위하여 본 발명에 따라 개조될 수 있다.

전기 전달 시스템을 사용하는 유전자 치료법

본 발명에 따른 방법은 유전자 치료법, 즉, 전달된 유전자의 발현 및 유전자의 조절 또는 억제가 특정 병상(病狀)의 치료를 가능하게 할 수 있는 치료법에 유용하다.

조직 세포들은 바람직하게 다음과 같은 것을 가능하게 하는 유전자 치료법의 관점에서 치료된다 :

·세포 자체의 기능 장애의 수정 {예를 들어, 췌장 섬유증(mucoviscidosis) 또는 근 위축증(muscular dystrophy)과 같은 유전적 결함과 관련된 질병의 치료를 위한 것) ;

·전달된 유전자에 의해 생성된 염증 억제 인자들에 의해, 또는 영양(trophic), 신경영양(neurotrophic), 맥관형성(angiogenic) 인자들에 의해, 근육, 기관 또는 뼈와 같은 조직의 혈관화(vascularization) 또는 신경지배(innervation)의 보호 및/또는 재생 ;

·치료적 생성물의 분비에 의하여 유전적 질병을 치유하기 위하여, 유전자 자체의 생성물 (예를 들어, 혈전증 및 지혈 조절 인자, 영양 인자, 성장 인자, 및 인슐린, 에리트로포에틴(erythropoietin), 및 렙틴(leptin)과 같은 호르몬) 또는 치료적 유전자의 첨가에 의하여 근육 내에서 합성된 활성 대사 산물과 같은, 치료적 효과를 일으키는 생성물을 분비하는 기관으로의 근육의 변형 ;

·종양 억제제 {망막모세포종(retinoblastoma) 단백질}, 자살 유전자 (예를 들어 HSV-티미딘 키나제), 항-맥관형성 유전자 (안지오스타틴, 엔도스타틴, 유로키나제의 아미노 말단 단편과 같은), 세포 순환 방해제, 세포자멸사(apoptosis) 유전자 (BAX 와 같은), 세포 내 단일 사슬 항체들, 및 면역 반응 자극 유전자 등과 같은 항-종양 유전자의 전달 ;

·핵산 백신 또는 면역 자극 유전자.

근육 내의 발현에 의한 전신적인 문제에 대한 유전자 치료에 있어서의 전기 전달의 이용의 특정 장점들은 여러 인자들에 존재한다 :

·수 개월을 초과하며 따라서 근육간 또는 분비된 치료적 단백질의 안정적이고도 지속적인 생성을 가능하게 하는, 전달 유전자 발현의 현저한 안정성 ;

·비 바이탈적(non-vital) 기관 내에 직접적이고 빠르며 안전한 투여를 가능하게 하는, 근육 조직에 대한 접근의 용이성 ;

·다수의 투여 부위를 가능하게 하는, 근육 덩어리의 큰 체적 ;

·근육의 풍부하게 나타나는 분비 능력.

이러한 장점들에 더하여, 국부적이며 표적화된 전기장의 사용에 의해 수반되는 국부적 치료에 의하여 안전성이 부여된다.

약한 전기장의 사용에 수반되는 안전성으로 인해, 본 발명은 심장 질병의 치료용으로, 예컨대, 안전한 전기전달을 보장하기 위하여 심장 페이싱(pacing)을 사용하여 심근에 적용될 수 있다(미합중국 특허 제5,634,899호 참조). 또한, GAX 단백질과 같이 평활근 세포 증식을 억제하는 유전자의 발현에 의하여 레스테노시스의 치료에도 적용될 수 있다.

생체 내 조직으로의 적용시 저 강도의 전기장과 긴 투여 지속 시간의 조합은 현저한 조직 손상을 일으키지 않으면서 핵산의 트랜스펙션을 향상시킨다. 이러한 결과는 핵산을 사용하는 유전자 치료에서 DNA 전달의 효율성을 향상시킨다.

결과적으로, 본 발명에 수반하는 잇점은 조직 또는 이의 근접 부위에서 생리학적 및/또는 치료학적 투여량으로의 약제의 생성, 또는 혈류 또는 림프계에서의 조직적인 분비이다. 더욱이, 본 발명은 처음으로, 예컨대, 다중 투여 위치로 트랜스펙션될 조직의 체적을 조정하거나 또는 심지어 전극의 갯수, 모양, 표면 및 배열을 조정하므로써, 발현된 전달 유전자의 효과량의 정교한 조정과 제어를 가능하게 한다. 부가적인 제어 요소는 펄스의 전기장 세기, 횟수, 지속 시간 및 주파수와, 또한 당 분야의 기술 상태에 따른 핵산의 투여량 및 체적의 변화에 의해 트랜스펙션의 효율을 조정하므로써 생긴다. 본 발명의 특별한 잇점은 종래 기술의 방법에서 달성하지 못했던, DNA 전달에 대한 탁월한 투여량-반응 커브가 얻어졌다는 것이다. 이리하여 바람직한 조직 내 생성 또는 분비의 수준에 적절한 트랜스펙션의 수준을 얻을 수 있다. 궁극적으로, 그 방법은, 표적 기관 외의 기관에 도달하는 것을 총체적으로 제외하거나 조절할 수는 없는 생체 내 유전자 전달의 화학적 또는 바이러스적 방법과 관련하여, 부가적인 안전성을 제공케 한다. 사실, 본 발명의 방법은 트랜스펙션된 조직의 국부화(국부적 전기 펄스에 처해진 조직의 체적에 엄격히 관련됨)의 제어를 가능케 하여 조직의 전체적 또는 부분적 절개에 의해 전달 유전자의 발현을 억압하는 가능성을 도입하는데, 이는 근육의 경우에서와 같이, 어떠한 조직은 중요하지 않거나 재생할 수 있기 때문에 가능할 것이다. 이러한 넓은 용도 융통성은 동물족(인간 및 동물 적용), 피검자의 나이 및 그 또는 그녀의 생리학적 및/또는 병리학적 조건에 따라 본 방법을 최적화하는 것을 가능케 한다.

본 발명의 방법은 더 나아가, 최초로, 캡시드(capside) 내에 맞는 바이러스 게놈의 크기에 의해 전달 유전자의 크기가 제한되는 바이러스성 방법과는 대조적으로, 큰 크기의 핵산을 트랜스펙션하는 것을 가능하게 한다. 이러한 가능성은 다이스트로핀(dystrophin)의 것과 같은, 또는 예컨대, 생리적으로 조절되는 호르몬의 생산을 위해 필요한 인트론 및/또는 큰 크기의 조절자 요소를 가진 매우 큰 크기의 유전자의 전달을 위해 중요하다. 이 가능성은 인공 효모 에피좀 또는 염색체 또는 미니 염색체의 전달을 위해서도 중요하다.

본 발명의 또 다른 목적은 전압장의 전기 펄스를 임의 투여의 형태로 배합된 핵산을 함유하는 조성물에 연결하는 것으로서, 이는 국소, 피부, 경구, 질, 비강내, 정맥내, 근육내, 피하, 안내(intraocular), 경피 경로 등으로 조직에 접근하는 것을 가능케 한다. 본 발명의 제약학적 조성물은 주입 가능한 배합물을 위해, 특히 바람직한 기관내로의 직접 투입, 또는 여느 다른 투여를 위해 제약학적으로 허용가능한 담체를 함유한다. 특히, 살균 등장 용액 또는 건성 조성물, 특히 동결 건조물을 포함할 수 있는데, 생리 식염 살균수의 첨가로 주입 가능한 용액 조성물을 제조할 수 있게 한다. 주입에 사용되는 핵산 투여량과 투여 횟수 및 주입량은 상이한 변수들, 특히 투여 방법, 관련 병변, 발현될 유전자 또는 심지어 처리 요망 기간에 의해 조절된다.

표적 조직

본 발명자는 본 발명에 따른 유전자 전달에 대한 최적 조건이 표적 조직에 따라 다름을 발견하였다. 예컨대, 200 볼트/cm 의 전기장은 근육 세포 내로의 유전자 전달을 크게 향상시키는 것으로 밝혀졌다. 이러한 조건 하에서, 마찬가지로 종양 세포 내로의 중요한 유전자 전달이 시행되었으나(특정 실험에서, 3 배의 유전자 전달의 향상이 관찰되었다), 종양 세포 내로의 유전자 전달은 400 볼트/cm 의 전기장에서 훨씬 더 효율적이다(유전자 전달 효율에서의 2 log 증가). 추가 실험에서, 500 볼트/cm 의 전기장 세기가 종양 세포로의 유전자 전달에 최적이었다.

이리하여, 본 발명에 따라서, 시스템 또는 향상된 장치가 근육 세포(및 다른 큰 세포)로의 핵산의 전달을 위해 만들어질 수 있으며, 상이한 전기장 세기 변수를 가진 시스템 또는 향상된 장치가 종양 세포로의 유전자의 전달을 위해 개발될 수 있다.

근육 세포로의 핵산의 전달을 위하여, 본 발명의 시스템 또는 장치는 1 내지 400 볼트/cm, 바람직하게는 4 내지 400 볼트/cm, 보다 바람직하게는 30 내지 300 볼트/cm 의 전압 구배를 발생시킬 것이다. 특정 예에서, 전압 구배는 100 내지 200 볼트/cm이다. 200 볼트/cm을 초과하지 않는 전압 구배를 제공하는 시스템 또는 장치가 특별히 고려된다.

종양 세포로의 핵산의 전달을 위하여, 본 발명의 시스템 또는 장치는 1 내지 600 볼트/cm, 바람직하게는 100 내지 600 볼트/cm, 보다 바람직하게는 400 내지 600 볼트/cm의 전압 구배를 발생시킬 것이다. 특정 예에서, 전압 구배는 400 내지 500 볼트/cm, 바람직하게는 약 500 V/cm이다. 600 볼트/cm 를 초과하지 않는 전압 구배를 제공하는 시스템 또는 장치가 특별히 고려된다.

핵산

핵산은 합성 또는 생합성 기원이거나, 또는 바이러스 또는 원핵 세포 또는 단세포체(예; 효모) 또는 다중 세포체로 부터 유래하는 진핵 세포로 부터 추출된 것일 수 있다. 이것은 원래의 유기체 및/또는 합성 시스템의 성분에 전부 또는 부분적으로 연결되어 투여될 수 있다.

핵산은 데옥시리보핵산이거나 리보핵산일 수 있다. 천연 또는 인공 기원의 서열, 및 특히, 게놈 DNA, cDNA, mRNA, tRNA 및 rRNA, 하이브리드 서열, 올리고뉴클레오티드의 합성 또는 반 합성 서열을, 변형 여부에 관계 없이 포함할 수 있다. 이들 핵산은 당업자에게 알려진 임의의 방법, 예컨대, 클로닝, 화학적 합성, 또는 클로닝에 의해 얻은 서열의 화학적 또는 효소적 변형을 포함하는 혼합 방법에 의하여 얻을 수 있다. 이들은 화학적으로 변형될 수 있다.

특히, 핵산은 센스 또는 안티센스 또는 리보자임과 같이 촉매 성질을 가진 DNA 또는 RNA일 수 있다. "안티센스"는 표적 서열에 상보적인 서열을 갖는 핵산을 일컫는 것으로서, 발현이 표적 서열 상의 하이브리드화에 의해 블로킹되는 mRNA 가 그 예이다. "센스"는 표적 서열과 동일하거나 동질적인 서열을 갖는 핵산을 일컫는 것으로서, 단백질 전사 인자에 연결되고 해당 유전자의 발현에 관여하는 서열이 그 예이다. 바람직한 일 구체예에 따라, 핵산은 관심 있는 유전자와 관심 있는 이 유전자의 발현을 가능하게 하는 요소를 함유한다.

데옥시리보핵산은 짧은 올리고 뉴클레오티드이거나, 보다 긴 서열과 같이 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. 이것은 전사 또는 복제를 조절하는 유전자, 서열 또는 다른 세포 성분에의 연결 지역 등을 포함할 수 있다. 이러한 유전자는 마커 유전자, 예컨대, 세포 기능, 이동, 또는 유전자 기능을 연구하기 위한 감지 가능한 마커를 생산하는 유전자; 치료 유전자; 보호 항원 또는 면역원성 유전자 등을 포함할 수 있다. 본 발명에 따라서, "치료 유전자"는 치료적 효과를 가진 RNA 또는 단백질 산물을 암호화하는 임의의 유전자를 의미한다. 암호화된 단백질은 단백질, 펩티드 등일 수 있다. 이 단백질 산물은 표적 세포와 동질적일 수 있다(즉, 병상없이 존재할 때, 표적 세포 내에서 정상적으로 발현되는 산물). 그 경우에, 전달 유전자의 발현은, 예컨대, 세포 내에서의 불충분한 발현 또는 변형으로 인해 불활성이거나 약활성인 단백질의 발현을 극복하는 것을 가능하게 하거나, 또는 상기 단백질을 과발현시킬 수 있다. 치료 유전자는 또한, 증가된 안정도, 변형된 안정도 등을 가진 세포 단백질의 변이체를 암호화할 수도 있다. 그 경우에, 발현된 단백질은 예컨대, 세포 내 부족한 활성을 도입하거나 완전하게 할 수 있거나 (근병증 또는 효소 결핍의 치료), 병상에 대항하게 하거나, 또는 종양의 치료에서와 같이 면역 반응을 자극하게 할 수 있다. 이는 암 또는 레스테노시스의 치료를 위하여 자살 유전자를 포함할 수 있다(헤르페스의 티미딘 키나아제).

핵산은 바람직하게 치료 유전자 및/또는 안티제닉 펩티드를 암호화하는 유전자의 조직 내 발현을 선호하거나 가능하게 하는 하는 서열을 또한 포함한다. 이는 트랜스펙션된 세포 내에서 기능할 수 있을 때, 고려된 유전자의 발현을 위해 자연적으로 책임이 있는 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상이한 기원을 갖는 서열(다른 단백질, 심지어는 합성 단백질의 발현에 대해 책임이 있는)을 포함할 수 있다. 특히, 이는 진핵성 또는 바이러스성 유전자 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 예컨대, 이는 트랜스펙션하기에 바람직한 세포의 게놈으로 부터 기원하는 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 진핵성 프로모터 중에서, 유전자의 특이 발현을 제공하게 할 유도자 또는 억제자를 사용할 수 있다. 강하거나 약하거나 또는 연속적이거나 유도적인 프로모터가 사용될 수 있다. 편재하는(연속적인) 프로모터는 HPRT, 비멘틴, α-액틴, 튜불린 등의 프로모터를 포함한다. 조직-특이적 프로모터(연장 인자-1-α-, flt, flk)가 사용될 수 있다. 유도성 프로모터는 호르몬(스테로이드 수용체, 레티논산 수용체 등)에 반응하는 프로모터, 항생 물질(테트라사이클린, 라파마이신 등)에 의해 조절되는 프로모터 또는 기타 천연 또는 합성 분자를 포함한다. 마찬가지로, 바이러스의 게놈으로 부터 유래하는 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 이와 연결하여, 예컨대, EIA, MLP, CMV, RSV 유전자 등의 프로모터를 언급할 수 있다. 더욱이 이들 발현 서열은 조건적, 순간적, 또는 일시적 발현, 조직 특이적 발현, 또는 일반적 발현 등을 허용하는 활성, 조절 서열의 첨가에 의해 변형될 수 있다.

게다가, 핵산은 또한 특히 상기 치료 유전자 외에 합성된 치료 산물을 표적 세포의 분비 덕트로 향하게 하는 시그널 서열을 함유할 수 있다. 이 시그널 서열은 치료 산물의 천연 시그널 서열일 수 있으나, 다른 기능적 시그널, 또는 인공 시그널 서열을 포함할 수도 있다. 핵산은 또한 합성된 치료 산물을 특별한 세포 내 기관, 예컨대, 미토콘드리아계 유전자 질병의 치료를 위한 미토콘드리아로 향하게 하는 시그널 서열을 함유할 수도 있다.

치료 유전자 및 유전자 산물

본 발명에 따른 치료 산물로는, 효소, 혈단백질, 인슐린과 같은 호르몬, 생장 호르몬, 림포카인; 인터류킨, 인터페론, 종양 사멸 인자(TNF) 등(프랑스 특허 제 92 03120호), 생장 인자, 예컨대, VEGF 또는 FGF 와 같은 맥관 형성 인자를 언급할 수 있다.

신경병의 치료를 위해, 신경 전달 물질 또는 이의 전구체 또는 신경 전달 물질을 합성하는 효소, 영양 인자, 특히 신경변성 질병 또는, 외상 또는 상해, 또는 레티날 퇴화에 의해 야기되는 신경 시스템의 손상의 치료를 위한 신경 영양 인자를 암호화하는 유전자가 본 발명의 시스템과 함께 전달될 수 있다. 예컨대, 신경 영양 인자 계열의 구성원은 신경 생장 인자(NGF), 뇌 유래 신경 영양 인자(BDNF), 뉴로트로핀-3(NT3), NT4/5, NT6(대립 형질 변이체, 및 동일 유전자 부류의 구성원을 포함)을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 다른 뉴로트로핀은 섬모성 신경 영양 인자(CNTF), 악소카인, 류케미아 억제 인자를 포함하는 섬모성 신경 영양 인자 부류를 포함하고; 다른 인자는 IL-6 및 관련 사이토카인; 카디오트로핀 및 관련 유전자; 글리아-유래 신경 영양 인자(GDNF) 및 관련 유전자; 인슐린-유사 생장 인자(IGF) 계열의 구성원, 예컨대, IGF-1, IFGF-2; 섬유아세포 생장 인자 계열의 구성원, 예컨대, FGF1 (산성 FGF), FGF2, FGF3, FGF4, FGF 5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9 등; 종양 생장 인자 계열의 구성원, 예컨대, TGFβ; HARP/플레이오트로핀, 또는 뼈 생장 인자; 조혈 인자 등을 포함한다.

다른 관심 있는 유전자는 치료 잇점을 갖는 분비되거나 분비되지 않는 근육 단백질, 예컨대, 다이스트로핀 또는 미니다이스트로핀(프랑스 특허 제 91 11947호), 또는 α-1-안티트립신을 암호화한다.

다른 관심있는 유전자는 응고에 관여하는 인자; VII, VIII, IX 인자; 자살 유전자(티미딘 키나아제, 사이토신 디아미나아제); 헤모글로빈 유전자 또는 기타 단백질 담체를 암호화한다.

다른 구체예에서, 지질 동화에 관여하는 단백질에 대응하는 유전자가 전달될 수 있는데, 예컨대, 아포지질단백질 A-I, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J 및 아포 중에서 선택되는 아포지질단백질, 및 지질단백질 리파아제, 간 리파아제, 레시틴 콜레스테롤 아실트랜스퍼라아제, 7-알파-콜레스테롤 히드록실라아제, 포스파티딜 산 포스파타아제와 같은 대사 효소, 또는 심지어 콜레스테롤 에스테르의 전달 단백질 및 인지질의 전달 단백질과 같은 지질 전달 단백질, HDL-결합 단백질 또는 LDL 수용체, 키로미크론 잔여 수용체 및 스캐빈져 수용체 등의 수용체까지도 전달될 수 있다.

다른 관심 있는 유전자는 맥관 내피 생장 인자 (VEFG, VEGF-2, VEGF-3, 혈소판 생장 인자) 및 안지오스타틴을 포함하는 맥관 형성 유전자를 포함한다. 다른 면에서, 전달은 맥관 형성, 특히 종양 맥관 형성의 억제자, 예컨대, 가용성 맥관 형성 인자 수용체, 맥관 형성 인자 수용체의 특이 억제자(Tie2, 유로키나아제 수용체, flt1, KDR), 맥관 형성 인자(예, 항-VEGF 또는 항-FGF)에 대한 항체(단일쇄 Fv 항체 포함), 항-인테그린 항체, 내피 종양-특이 독소, 맥관 형성의 폴리펩티드 억제자(우로키나아제-ATF, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 인터페론-α 또는 β, 인터류킨-12, 혈소판 인자 4, TNFα, 트롬보스폰딘, 혈소판 활성 인자(PAI)-1, PAI2, TIMP1, 프로락틴 단편 등의 아미노 말단 단편)를 암호화하는 유전자에 의해 영향받을 수 있다.

조직에 의해 분비될 수 있거나 그 조직에 의해 생성된 다른 단백질 또는 펩티드 중에는, 항체, 단일 사슬 항체(ScFv)의 가변 단편, 또는 면역 치료, 예컨대, 감염성 질병, 종양, 인술라 경화증(항-인자형 항체)과 같은 자가면역 질병에 사용하기 위한 인식 용량을 가진 다른 항체 단편에 주안을 두는 것이 중요하다. 다른 관심 있는 단백질은, 예컨대 항-HIV 치료를 위한 CD4 가용성 수용체 또는 TNF 가용성 수용체, 류마티스 관절염 치료를 위한 가용성 TNF 수용체(특히 가용성 TNFα수용체), 및 근무력증 치료를 위한 아세틸콜린 가용성 수용체와 같은 가용성 수용체; 예컨대, 천식, 혈전증, 레스테노시스, 전이 또는 염증(예컨대, TH1 세포 반응을 감소시키는 IL-4, IL-10 및 IL-13) 치료를 위한 기질 펩티드 또는 효소 억제자, 또는 심지어 수용체 촉진제 또는 길항제 펩티드 또는 부착 단백질; 및 인공, 키메라 또는 절단형 단백질이나, 이에 국한되는 것은 아니다.

중요한 관심 있는 호르몬 중에는, 당뇨병 경우의 인슐린, 생장 호르몬, 칼시토닌을 언급할 수 있다.

항종양성 또는 항감염성 면역 반응을 향상시키기 위하여, IL-2, IL-12, 콜로니 자극 인자(GM-CSF, G-CSF, M-CSF), 대식세포 염증 인자(MIP1, MIP2), 수상 세포 활성 인자(flt3 리간드) 등을 포함하는 면역 자극 사이토카인을 암호화하는 유전자를 공급할 수 있다.

다른 관심있는 유전자는 McKusick, V.A. Mendelian (Inheritance in man, catalogs of autosomal dominant, autosomal recessive, and X-linked phenotypes. Eighth edition. John Hopkins University Press(1988))에 의해, 그리고, Stanbury, J.B.et.al.(The metabolic basis of inherited disease. Fifth edition, McGraw-Hill(1983))에 의해 기술되어 있다. 관심 있는 유전자는 아미노산, 지질 및 기타 세포 구성 성분의 대사에 관여하는 단백질을 포함한다.

이리하여, 탄수화물 대사의 질병에 관련된 유전자, 예컨대, 프락토스-1-포스페이트 알도라아제, 프락토스-1,6-디포스파타아제, 글루코스-6-포스파타아제, 리소조말 a-1,4-글루코시다아제, 아밀로-1,6-글루코시다아제, 아밀로-(1,4:1,6)-트랜스글루코시다아제, 근육 포스포릴라아제, 근육 포스포프락토키나아제, 포스포릴라아제-b-키나아제, 갈락토오스-1-포스페이트 우리딜 트랜스퍼라아제, 피루빅 디하이드로제나아제 복합체, 피루빅 카복실라아제, 2-옥소글루타레이트 글리옥시라아제 카복시라아제, 및 D-글리세릭 디하이드로제나아제의 모든 효소를 언급할 수 있다.

또한, 아미노산 대사의 질병에 관련된 유전자, 예컨대, 페닐알라닌 히드록시라아제, 디히드로바이오프테린 신써타아제, 타이로신 아미노트랜스퍼라아제, 타이로시나아제, 히스티디나아제, 푸마릴아세토-아세타아제, 글루타티온 신써타아제, g-글루타밀시스테인 신써타아제, 오르니틴-t-아미노트랜스퍼라아제, 카바모일포스페이트 신써타아제, 오르니틴 카바모일트랜스퍼라아제, 아르기노노숙시네이트 신써타아제, 아르기노숙시네이트 리아제, 아르기나아제, L-리신 디하이드로제나아제, L-리신 케토글루타레이트 리덕타아제, 발린 트랜스아미나아제, 류신 이소류신 트랜스아미나아제, 측쇄 2-케토-산 디카르복실라아제, 이소발레릴-CoA 디히드로제나아제, 아실-CoA 디히드로제나아제, 3-히드록시-3-메틸글루타릴-CoA 리아제, 아세토아세틸-CoA 3-케토티오라아제, 프로피오닐-CoA 카르복실라아제, 메틸말로닐-CoA 뮤타아제, ATP: 코발아민 아데노실트랜스퍼라아제, 디히드로폴레이트 리덕타아제, 메틸렌 테트라히드로폴레이트 리덕타아제, 시스타티오닌 β-신써타아제, 사코신 디히드로제나아제 복합체, 글리신 절개 시스템에 속하는 단백질, β-알라닌 트랜스아미나아제, 혈청 카노시나아제, 및 대뇌 호모카노시나아제를 언급할 수 있으며,

지방 및 지방산 대사의 질병에 관련된 유전자, 예컨대, 지질단백질 리파아제, 아포지질단백질 C-II, 아포지질단백질 E, 다른 아포지질단백질, 레시틴 콜레스테롤아세틸트랜스퍼라아제, LDL 수용체, 간 스테롤 히드록실라아제, 및 "피타닌산" a-히드록실라아제를 언급할 수 있으며,

리소좀 결핍에 관련된 유전자, 예컨대, 리소조말 a-L-이두로니다아제, 리소조말 이두로네이트 설파타아제, 리소조말 헤파란 N-설파타아제, 리소조말 N-아세틸-a-D-글루코사미니다아제, 아세틸-CoA: 리소조말 a-글루코사민 N-아세틸트랜스퍼라아제, 리소조말 N-아세틸-a-D 글루코사민 6-설파타아제, 리소조말 갈락토사민 6-설페이트 설파타아제, 리소조말 β-갈락토시다아제, 리소조말 아릴설파타아제 B, 리소조말 β-글루쿠로니다아제, N-아세틸글루코사미닐-포스포로트랜스퍼라아제, 리소조말 a-D- 만노시다아제, 리소조말 a-뉴라미니다아제, 리소조말 아스파틸글루코사미니다아제, 리소조말 a-L-푸코시다아제, 리소조말 산 리파아제, 리소조말 산 세라미다아제, 리소조말 스핑고마이엘리나아제, 리소조말 글루코세레브로시다아제 및 리소조말 갈락토세레브로시다아제, 리소조말 갈락토실세라미다아제, 리소조말 아릴설파타아제 A, a-갈랄토시다아제 A, 리소조말 산 β-갈락토시다아제, 및 리소조말 헥소사미니다아제 A 의 사슬을 언급할 수 있다.

또한, 비제한적으로, 스테로이드 및 지질 대사의 질병에 관련된 유전자, 퓨린 및 피리미딘 대사의 질병에 관련된 유전자, 포르피린 및 헴 대사의 질병에 관련된 유전자, 결합 조직, 근육 및 뼈 대사의 질병에 관련된 유전자 및 피 및 조혈, 근육(근병증), 신경 시스템(신경변성증) 또는 순환 시스템(예컨대, 국소성 빈혈 및 협착증의 치료)의 질병에 관련된 유전자를 언급할 수 있다.

상기 다양한 예들과 뒤따르는 것들은 본 발명의 적용 분야의 잠정적 범위를 열거한 것이다. 아래의 예들은 각 뒤따르는 인자의 표현을 나타낸다.

전기 전달자 NT3. 뉴로트로핀 3(NT3)은 근육 조직으로의 전기 전달에 아주 바람직한 유전자이다. 아데노바이러스 벡터 또는 비-바이러스 벡터 내에서 근육 내로 전달된 NT3 은 pmn 마우스의 생존을 증가시키는 것으로 이미 밝혀졌다(Hasse et al., Nature 3:429-436, 1997). 이것은 "Lou Gehrig's Disease"로 주로 불리는 근위축성 측삭경화증(ALS)을 위한 유용한 동물 모델이다. NT3 유전자 치료법으로 이 잠행성 질병의 치료는 NT3 을 전기 전달로 전달함에 의하여 크게 용이해질 것으로 기대되는데, 이는 영양 인자의 충분하고 재생 가능한 발현을 확신한다.

전기 전달자 산성 FGF 또는 VEGF. 근육 조직으로의 전기 전달을 위한 다른 바람직한 유전자는 산성 FGF(aFGF; ECGF) 또는 맥관 내피 생장 인자(VEGF)이다. 이들 모두 동맥 폐색 질병을 치료하는데 효과적인 것으로 밝혀졌다. aFGF 또는 VEGF 전기전달-향상된 유전자 치료법으로의 이들 질병의 치료는 맥관 생장의 효율을 추가로 증가시키는 것으로 기대된다. 전기장을 페이싱된 방식으로, 특히 활성 심장 페이싱을 통해 적용하므로써 심동맥 폐색 질병의 치료도 또한 가능할 것이다.

또한 치료 핵산은 유전자 또는 안티센스 서열일 수 있는데, 이의 표적 세포내에서의 발현은 세포 mRNA 전사의 유전자 발현을 제어하는 것을 가능하게 한다. 이러한 서열은 예컨대, 표적 세포 내에서 세포 mRNA 에 상보적인 RNA 로 전사된 다음, 유럽 특허 제 140,308 호에 기술된 방법에 따라, 이의 단백질 해독을 방해한다. 치료 유전자는 또한 표적 RNA 를 선택적으로 파멸시킬 수 있는, 리보좀을 암호화하는 서열을 포함하기도 한다(유럽 특허 제321,201호).

면역원성 유전자 및 백신

상기 기술된 바와 같이, 핵산은 또한 인간 또는 동물에게서 면역 반응을 일으킬 수 있는 면역원성 또는 항원성 펩티드를 암호화하는 유전자를 하나 이상 함유할 수 있다. 따라서, 이 특별한 구체예에서, 본 발명은 미생물, 바이러스 또는 암에 대항하여 인간 또는 동물에 적용된 백신 또는 면역 치료를 가능하게 한다. 특히, 엡스테인-바르 바이러스, HIV 바이러스, B 형 간염 바이러스(유럽 특허 제185,573호), 의사-격노 바이러스, "신시티아 형성 바이러스", 다른 바이러스의 특이 항원성 펩티드 또는 심지어 MAGE 단백질과 같은 종양의 특이 항원(유럽 특허 제259,212호), 또는 박테리아 열 쇼크 단백질과 같이 항종양성 반응을 자극할 수 있는 항원을 포함할 수 있다.

벡터

본 발명에 따른 방법에서, 핵산은 제한 없이 유전자 전달을 향상시킬 수 있는 어떠한 형태의 벡터 또는 그러한 벡터의 조합, 예컨대, 바이러스, 합성 또는 생합성 제제(예, 지질, 폴리펩티드, 글리코시드 또는 중합체), 또는 심지어 추진되거나 되지 않은 볼과 같은 벡터에 연결될 수 있다. 핵산은 또한 예컨대, 국소적 또는 전신적 투여에서 약물학 성질 또는 효소의 치료와 같은 유전자 전달을 향상시킬 목적으로, 또는 외과적, 기계적, 온도적 또는 물리적 치료를 투과시킬 목적으로 치료를 받는 조직 내로 주입될 수 있다.

하기 실시예는 비제한적인 방식으로 본 발명을 예증하기 위한 것이다.

실시예 1: 표준 일렉트로포레이션 조건

예컨대, 미합중국 특허 제 5,468,223 호, 제 5,304,120 호, 제 5,507,724 호, 제 5,273,525 호, 제 5,318,514 호, 제 5,439,440 호, 제 5,462,520 호, 제 5,464,386 호, 제 5,019,034 호 및 제 5,389,069 호, 그리고 국제 특허 공보 WO 97/07826 호에서 보다 상세히 논의된 바와 같이, 표준 일렉트로포레이션 조건은 테스트된 결과, 낮은 효율, 심지어 횡문근으로의 핵산(플라스미드 DNA) 전달의 억제까지도 제공하는 것으로 밝혀졌다.

물질 및 방법

본 실시예에서는, 하기 산물이 사용되었다 :

DNA pXL2774(PCT/FR 특허 96/01414)는 루시퍼라아제 리포터 유전자를 함유하는 플라스미드 DNA 이다. 다른 산물은 시장의 공급자에게서 입수 가능하다: 케타민, 크실라진, 생리 식염수 (NaCl 0.9%).

오실로스코프 및 상업적 전기 펄스 발생기(장방형 또는 정방형) (Electropulsator PS 15, Jouan, France)가 사용된다. 사용되는 전극은 5.3 mm 간격으로 이격된 편평한 스테인레스 스틸 전극이다.

실험은 C57 B1/6 생쥐에서 수행되었다. 상이한 우리로 부터 나온 생쥐를 실험하기 전에 무작위로 분류한다("랜덤화"). 생쥐를 케타민 및 크실라진 혼합물로 마취시킨다. 플라스미드 용액(NaCl 0.9% 500 mg/ml 와의 30 mg/ml 용액)을 해밀턴 주사기를 이용하여 좌,우 발의 두개 정강이 내로 피부를 통해 세로 방향으로 주입한다. 두 개의 전극을 전도성 겔로 피막하고, 주입된 발을 전극에 접하게 하여 전극 사이에 위치시킨다.

전기 펄스를 주입한 일 분 후에 평방 펄스 발전기를 사용하여 근육 축에 직각이 되도록 적용한다. 오실로스코프는 전달된 펄스의 볼트 단위의 세기(실시예에서 표시된 값은 최고 값을 나타낸다), 밀리초 단위의 지속 시간 및 헤르츠 단위의 진동수를 체크하는 것을 가능하게 하는데, 8 번의 1 Hz 연속 펄스가 전달되었다.

근육의 트랜스펙션을 평가하기 위하여, 생쥐를 플라스미드 주입 후 7 일째에 죽인다. 그 후, 좌,우 발의 두 개의 정강근을 떼어 내어 무게를 재고, 완충 용해수에 둔다. 얻어진 현탁액을 맑은 상층액을 얻기 위해 원심분리시킨다. 상업적 루미노미터를 사용하여 상층액 10 ml 에 대하여 루시퍼라아제 활성을 측정한다. 발광 반응의 강도는 상층액 총 양을 경험한 근육에 대하여 RLU(상대적 발광 단위)로서 주어진다. 각 실험 조건은 10 점으로 테스트된다: 양쪽으로 주입된 다섯 마리 동물. 통계 비교는 비변수 테스트를 사용하여 행해진다.

결과 및 토의

선형 또는 로그 단위로 된 두개의 도면이 결과를 나타낸다.

첫 실시예에서, 종양의 일렉트로포레이션을 위해 사용된 조건인 800 내지 1,200 볼트/cm 전기장의 영향을 테스트하였다(Mir et.,Eur.J.Cancer 27, 68, 1991; US Patent No.5,468,223).

도 1 에 의하면, DNA 가 전기 펄스 없이 주입된 대조군과 비교하여,

·1,200 볼트/cm 의 8 펄스 및 0.1 msec 의 지속 시간에서 루시퍼라아제 활성의 평균값이 더 낮았고;

·1,200 볼트/cm 의 펄스 및 1 msec 에서는, 세 마리의 동물이 죽었고 루시퍼라아제 활성의 평균값이 더 낮았고;

·800 볼트/cm 의 펄스 및 1 msec 에서는, 루시퍼라아제 활성의 평균값이 역시 상당히 감소한 것으로 관찰되었다.

전기장의 작용을 겪은 근육의 대부분은 육안으로 변질되었다(무르고 희끄무레한 외관).

실시예 2: 핵산의 전기전달

본 실험은 C57 B1/6 생쥐를 가지고 실시되었다. 펄스의 전기장 세기 및 이의 지속 시간을 제외하고는, 실행 조건은 실시예 1 의 것과 같았다.

결과는 도 2 에 도시되어 있다. 실시예 1 의 결과가 재현되었다. 즉, 루시퍼라아제 활성에 대한 1 msec 의 지속 시간에서 800 볼트/cm 의 일련의 8 개 펄스의 방해 효과가 근육에서 탐지되었다. 600 볼트/cm 의 전기장에서, 동일한 방해 및 동일한 근육 조직의 변질이 관측되었다. 그러나, 이 전압에서 더 짧은 펄스 폭은 조직 상해를 피하면서 DNA 전달을 향상시키는 것 같았다. 반면에, 현저하고도 놀랍게도, 전압의 감소는 근육을 육안으로 더 이상 변질시키지 못하였으며, 더욱이, 400 및 200 볼트/cm 에서 근육의 트랜스펙션 수준은 전기장에 처해지지 않은 근육에 대하여 얻은 것 보다 평균적으로 더 높았다. 대조군(전기장에 처해지지 않음)과 비교하여, 루시퍼라아제 활성가의 분산이 200 볼트/cm 에서 상당히 감소된 것이 주목할 점이다{전기장(도2A)의 부재 하에서의 43.32% 와 비교되는, SEM = 20.59% 의 평균가).

당업자는 이러한 데이타가 종래의 전기전달용 장치가 본 발명의 발견에 따라 변형되어 본 발명의 시스템 또는 장치를 낳게 함을 지지한다는 것을 쉽게 확인할 수 있을 것이다. 비록 변형은 간단하지만, 이 변형에 의해 산출된 결과는 전혀 기대 밖이었다. 본 발명의 시스템 또는 장치는, 본 실시예 및 하기 실시예에서 보고되는 플라스미드 DNA 전달 실험에서 나타내는 바와 같이, 핵산 전달의 효율성 및 재현 가능성 양쪽 모두에서 기대 밖의 개선을 가져온다.

실시예 3: 전기전달은 전달 유전자 발현을 향상시킨다.

본 실시예는 C57 B1/6 생쥐를 가지고 실시되었다. 펄스의 전기장 세기 및 이의 지속 시간 및 펄스가 DNA 주입 후 25 초 동안 전달된 사실을 제외하고는, 실행 조건은 전술한 실시예들의 것과 같았다.

결과는 도 3 에 도시되어 있다. 발현된 루시퍼라아제 전달 유전자의 평균값은 200 볼트/cm 에서의 5 msec 펄스 지속 시간으로 부터 출발하여, 100 볼트/cm 에서의 20 msec 의 펄스 지속 시간으로 급격하게 증가되었다.

본 실험은 또한 근육에서의 일렉트로트랜스펙션에 의해 얻어진 루시퍼라아제 활성의 평균값이 200 내지 100 볼트/cm 의 전압이 사용될 때 전기 펄스의 지속 시간의 함수임을 분명히 보여 준다. 또한, 값의 분산이 일렉트로트랜스펙션된 그룹에서 현저히 감소된 것도 관측되었다(도 3). 전기 펄스의 부재(대조군)에서, SEM은 77.43% 의 평균값을 나타내는 반면, 상대 SEM 은 5 msec 펄스 횟수로의 200 볼트/cm 의 전기장 조건 하에서 14% 로, 20 msec 의 펄스 횟수로의 200 볼트/cm 의 전기장 조건 하에서 41.27% 로, 그리고 100 볼트/cm 에서 전기 전달을 위해 30% 내지 48% 사이로 감소하였다.

본 실험의 최적 조건에서, 전달 유전자의 발현은 전기장의 부재에서 주입된 대조군과 비교하여 89.7 의 인자 만큼 향상되었다.

실시예 4: 200 배 증가 발현

본 실시예는 가변 지속 시간의 200 볼트/cm 의 전기 펄스로 DBA 2 생쥐에서 실시되었다. 본 실험의 다른 조건은 실시예 3 에서와 동일하다.

본 실시예는 200 볼트/cm 에서 펄스 지속 시간이 5 msec 내지 그 이상의 지속 시간으로 증가될 때, 루시퍼라아제 활성의 트랜스펙션이 증가됨을 지지한다(도 4 및 5). 일렉트로트랜스펙션되지 않은 대조군과 비교하여 SEM 에 의해 나타낸 개체간의 가변도의 감소가 관측되었다. SEM 의 상대가는 대조군에 대하여 35% 로 같으며, 1, 5, 10, 15, 20 및 24 msec 의 일련의 펄스에 대하여 각각 25, 22, 16, 18 및 26% 이다. 본 실험에 사용된 최적 조건 하에서, 전달 유전자의 발현은 전기 펄스의 부재시 주입된 대조군과 비교하여 205 인자 만큼 향상되었다. 이러한 결과는 이들 실시예에 기술된 조건 하에서의 전기전달이 효율성 및 재현가능성 모두를 향상시킴을 지지한다.

실시예 5: 전기전달 효율성의 정량화

도 5 는 "펄스수 ×전기장 세기 ×각 펄스의 지속 시간"에 상응하는 변수의 중요성을 예증한다. 이 변수는 사실, 전기장의 변화를 기술하는 함수의 시간에 의존하는 적분값에 대응한다.

도 5 에서의 데이타는 실험 2, 3 및 5 의 경우에서 얻은 결과로 부터 얻은 것이다. 200 V/cm 및 100 V/cm 의 전기장 세기, 또는 전기장의 부재 하에 측정되었다. 데이타는 트랜스펙션의 효율성이 전기장에 노출된 총 지속 시간의 산물의 함수로서 전기장 세기에 의해 증가함을 보여준다. 핵산 전달의 향상은 "전기장 ×총 펄스 지속 시간" 산물의 1 kV ×msec/cm 을 초과하는 값으로 얻어진 것이다. 바람직한 구체예에 따라, 자극은 "전기장 ×펄스의 총 지속 시간" 산물의 5 kV ×msec/cm 과 같거나 초과하는 값에서 얻어진 것이다.

실시예 6: 전기전달의 광범위한 적용

위의 실시예 2-5 의 결과를 지지하는 추가 실험이 수행되었다. 정말로, 중요하고 재현 가능한 유전자 전달의 향상이 생쥐, 쥐, 및 토끼에서 저전압의 전기 펄스를 사용하여 얻어졌다. 사용된 조건은 종양, 피부, 또는 간 세포와 같은 연구된 다른 세포 유형에서 이전에 비효과적인 것으로 기술되었었다.

본 실시예에서는 하기 변수를 변화시켜 연구하였다:

- 전기장의 특징: 생쥐의 정강근에 대하여 최적 조건을 정의하는 볼트/cm, 횟수, 진동수, 펄스의 지속 시간은, 1 내지 2 Hz 에서 20 ms 동안 8 번의 200 V/cm 펄스로 정의됨.

- 전극의 모양/유형: 실험의 대부분은 비침투성 판 전극으로써 수행되었다. 바늘 전극의 편리함이 토끼 실험에서 보여졌다.

- DNA 의 양(생쥐 정강근에서의 최적 전달 조건을 사용하여)

- DNA 의 상이한 배치

- 상이한 리포터 유전자: 루시퍼라아제, LacZ(생쥐), FGF(쥐)

- 상이한 동물족: 생쥐, 쥐, 토끼

- 상이한 주입 위치: 생쥐의 정강, 장딴지, 사두근; 쥐의 정강; 토끼의 정강, 장딴지 및 삼두근

- 주입 위치 대 펄스 위치의 거리

- 주입 대 전기 펄스의 적용 시간

- 펄스의 주입 및 적용을 수행하는 상이한 실험

관측된 결과는 하기와 같다:

·네이키드(naked) DNA 의 단독 주입에 대한 유전자 전달의 상당한 향상: 대조군의 수준에 따라, 생쥐 근육에서 5-10 내지 100 배 또는 그 이상, 쥐에서 100 내지 250 배 향상, 토끼에서 100 내지 50,000 배.

·결과의 동물간 분산/가변도의 상당한 감소. 전기 펄스는 DNA 주입 후 그 위치에서 투여되어야 한다. DNA 벡터는 반응을 유의하게 감소시키지 않으면서 펄스 전 30 분까지 투여될 수 있다. 이는 단일 펄스에 이어 근처 위치에서의 다중 DNA 주입을 허용한다.

·LacZ 를 가지고 생쥐에서 수행된 실험에 대한 조직학적 분석은 이 절차가 유전자를 발현하는 근육 섬유를 약 10 배 이상 야기하게 함을 확인한다. FGF 로서의 쥐에서의 데이타 또한 발현 세포의 상당한 갯수 증가를 나타낸다.

·분비된 알칼라인 포스페이트, 분비된 리포터 단백질 유전자를 사용한 실험은 혈청에서 분비된 단백질에 대하여 2 로그 향상 인자를 가리킨다.

·크기에 대한 트랜스펙션 효율의 역 의존성. 플라스미드가 작을수록 보다 효과적으로 전달된다; 그러나, 전기전달 기구는 DNA 의 크기와 상관 없이 현저히 DNA 전달의 효율을 증가시켜, YAC, 코스미드 또는 인공 염색체의 트랜스펙션에 대한 상당한 장애를 극복하게 한다.

·프로모터 및 단백질 프로세싱의 독립성. 전기전달 효율성은 유전자 발현의 또 다른 제어 수준을 허용하는 전달 유전자 프로모터에 어떤 방식으로든 의존하지 않는다. 게다가, 유전자 산물 내에 분비자 또는 다른 조절자/프로세싱 서열의 존재는 전기전달 효율에 전혀 영향을 미치지 않는다.

이들 실험들은, 비록, 효과가 일렉트로포레이션 조건에 비교하여 최소일지라도 전기전달이 약간의 부작용도 없음을 보여준다. 국부적 염증 반응, 재생 반응이 펄스 후 7 일 동안 기록된다. 이 염증은 온화하고 가역적이다. 전기 펄스는 생쥐에서 일반적인 수축을 유도한다. 쥐에서의 이 영향은 훨씬 감소하며, 뒷 사지에 편재되어 있다. 토끼에서, 일차적 실험은 수축이 펄스에 처한 근육 그룹에 제한됨을 나타낸다. 마취된 쥐 또는 토끼에 의해 뚜렷한 통증 반응은 없었다. 마취로 부터의 회복 동안, 어떤 동물도 처리된 사지에서 뚜렷한 통증을 보이지 않았다.

이들 실험은, 핵산 전달의 향상, 실험간 가변도의 감소, 및 부작용의 감소 또는 제거의 측면에서, 본 적용에 기술된 조건 하에서 사용된 전기전달 기구의 우수성을 보여 준다. 이들 결과들은 하기 실시예에 의해 보다 상세히 제시된다.

실시예 7: 펄스 지속 시간의 함수로서의 트랜스펙션

본 실시예는 전기전달 조건 하에서 펄스 지속 시간의 증가가 트랜스펙션 효율에 미치는 영향을 나타낸다.

실험 조건은 Gentronics/BTX T820 펄스 생성기(BTX, a division of Genetronics, San Diego, California)가 사용된 것을 제외하고는, C57 B1/6 생쥐를 사용하여 실시예 1 에서와 유사하다. BTX 펄스 생성기는 지속 시간의 평방 펄스의 적용을 100 ms 까지 가능하게 했다. 플라스미드 pXL2774(WO 97/10343)를 주입한다(15㎍). 200 V/cm 의 일정한 전기장 세기에서, 펄스 지속 시간(T)의 증가는 트랜스펙션의 효율을 향상시키는 것으로 표 1 에서 보여진다.

이들 데이타는 근육으로의 핵산 전달을 위한 전기전달 기구에 대하여 최적화된 변수를 확립한다. 이러한 기구는 적어도 4, 보다 바람직하게는 8 의 펄스를 가지고 20 msec 또는 그 이상의 펄스를 바람직하게 제공한다.

펄스 지속 시간 의존성 전기전달의 효율

펄스 지속시간 (msec)	0	1	5	10	20	30	40	50	60	80
실행 A8 펄스	11 ±5	39 ±6	211 ±26	288 ±46	1158 ±238	1487 ±421	2386 ±278
실행 B4 펄스	11 ±5	26.8 ±6	123 ±17	246 ±32	575 ±88	704 ±130		3440 ±1077
실행 C4 펄스	15 ±8						2885 ±644		2626 ±441	1258 ±309ㅅ
근육 당 백만 단위의 RLU 에서의 루시퍼라아제 활성의 평균값 +/-SEM, N=10.전기전달 조건: 200 V/cm 전기장 세기, 1 Hz 의 진동수

이들 데이타는 본 출원에 기술된 최적화된 전기장 세기 하에서의 전기전달용 기구가 펄스의 지속 시간을 증가시킴으로 인하여 DNA 전달의 효율을 추가로 향상시킬 수 있음을 보여 준다. 예컨대, 지속 시간을 일련의 8 펄스를 가지고 적어도 40 msec 까지, 일련의 4 펄스를 가지고 50 msec 까지 증가시키므로써, 200 V/cm 에서 트랜스펙션 효율이 상당히 향상되었다. 유사한 기구의 최적화가 다른 전기장 세기에 대해서도 효과적일 수 있다.

실시예 8: 펄스 횟수의 함수로서의 트랜스펙션

본 실시예는 전기전달 조건 하에서 펄스 횟수의 증가가 트랜스펙션 효율에 미치는 영향을 나타낸다.

실험 조건은 C57 B1/6 생쥐를 사용하며, 실시예 1 에 기술된 것과 동일하다. 표 2 는 20 ms 의 펄스 지속 시간으로 200 V/cm 에서 트랜스펙션의 효율이 대조군(전기장 미적용)과 비교하여 분명히 향상되었음을 나타내는데, 단일 펄스로 부터 출발하여 8 내지 16 사이의 최적 펄스로의 펄스의 횟수가 2, 4, 6, 8, 12, 및 16 으로 증가할 때까지 계속하여 증가시켰다. 또한, 대조군에 비교하여 모든 일렉트로트랜스펙션된 그룹에 대해 분산에서의 감소가 눈에 띈다.

트랜스펙션 효율 대 펄스 수

펄스 수	0	1	2	4	6	8	12	16
평균(×10-7)	69.57	147.91	281.02	438.62	678.44	818.73	929.20	889.75
S.E.M.	80.09	17.76	16.38	11.44	19.05	8.87	18.20	15.44
근육 당 백만 단위의 RLU 에서의 평균 루시퍼라아제 발현 ±S.E.M.; 각 그룹당 N=10;200 V/cm 전기장 세기; 1 Hz 진동수

이들 데이타는 전기전달 기구가 더 많은 펄스로 DNA 전달의 효율을 향상시킴을 보여준다. 테스트된 전기장 세기(200 V/cm) 하에서, 기구는 4 또는 그 이상, 바람직하게는 8 또는 그 이상의 펄스를 최적으로 제공한다. 펄스 수를 변형시키므로써 전기전달 기구는 핵산 전달의 효율을 조절할 수 있으며, 이리하여 발현 수준을 조정하게 된다.

실시예 9: 진동수의 함수로서의 트랜스펙션

본 실시예는 펄스 진동수의 증가가 트랜스펙션 효율을 증가시킴을 보여준다. 임상적 사용시, 더 큰 진동수에서 펄스를 적용하는 전기전달 기구는 전기장이 적용되는 시간의 전체 길이를 감소시킴으로써 환자의 안락감을 향상시킨다. 즉, 효율성 및 환자의 안락감 모두가 진동수를 증가시키므로써 향상된다.

실험 조건은 C57B1/6 생쥐를 사용하며, 실시예 1 에 기술된 것과 동일하다. 플라스미드 pXL2774(15 ㎍)를 주입하였다. 20 ms 의 지속 시간 및 200 V/cm 의 전기장 세기에서 8 또는 4 번의 펄스로 진동수는 0.1 내지 4 Mz 로 변화한다.

트랜스펙션 효율 대 진동수 (Hz)

진동수(헤르츠)	0	0.1	0.2	0.5	1	2	3	4
실행 A8 펄스	5 ±2	54 ±13	95 ±16	405 ±60	996 ±156	1528 ±257
실행 B4 펄스		114 ±14	163 ±24	175 ±26	337 ±53	587 ±90
실행 C8 펼스	21 ±14				1294 ±189	2141 ±387	3634 ±868	2819 ±493
실행 D4 펄스					1451 ±228	1572 ±320	1222 ±126	2474 ±646
근육 당 백만 단위 RLU 에서의 평균 루시퍼라아제 활성 ±S.E.M.; 각 그룹당N=10; 200 V/cm 전기장 세기; 20 msec 펄스 길이

결과는 테스트된 전기전달 조건 하의 더 높은 진동수(1 Hz 이상, 바람직하게는 2 Hz 이상)에서 트랜스펙션 효율이 증가되었음을 나타낸다.

실시예 10: 지수적으로 감소하는 시간에 따라 변하는 전기장으로의 일렉트로트랜스펙션

본 실시예는 생체 내 핵산 전달의 효율에 대한 지수적으로 감소하는 전기장의 적용 영향을 보여준다.

C57B1/6 생쥐를 본 실험에 사용한다. 변형된 포티너스 피랄리스 루시퍼라아제(pGL3; Genbank accession no. CVU47295)를 사이토메갈로바이러스 이미디어트 어얼리(CMV-IE) 프로모터(Genbank accession no.HS5IEE)와 SV40 바이러스로 부터의 폴리아데닐레이션 신호(Genbank accession no. SV4CG)의 제어 하에 플라스미드 pXL2774 에 도입하므로써 유래된 플라스미드 pXL3031(도 12)을 본 실험에 사용하였다. DNA 10 ㎍ 을 주입하였다.

본원에 사용된 상업적 전기펄스기(Equibio electropulsater, model EasyjectT Plus, Kent, UK)는 지수적으로 감소하는 시간에 따라 변하는 전기장 펄스를 전달하기 위하여 구성되었다. 초 조절 가능한 변수는 커패시턴스(capacitance)(㎌ 단위)로서, 전달된 에너지의 양을 제어한다.

표 4 는 지수적으로 감소하는 전기장 펄스가 적용될 때, 전기장이 적용되지 않은 경우와 비교하여 아주 분명하게 전달 유전자의 발현에 있어서의 증가를 얻을 수 있음을 보여 준다. 이 결과는 상이한 전압에서, 및 상이한 지수의 시간 상수에 상응하는 상이한 에너지에 대하여 얻어지는데, 이는 조정가능한 장치의 커패시턴스에 의해 조절될 수 있다. 본 실시예에서 확립된 변수는 전기전달 기구에 적용될 수 있다.

지수적으로 증가하는, 시간에 따라 변하는 전기장으로의 트랜스펙션 효율

	Capa. ㎌150	Capa.㎌300	Capa. ㎌450	Capa.㎌600	Capa.㎌1200	Capa.㎌2400	Capa.㎌3000
40 V/cm						1.23	11
100 V/cm				16.5	2.8	6.5	23.9
150 V/cm				1.8	3.5	6.1
200 V/cm		5.1		15.8	18.8	121.5	189.7
300 V/cm	32.1	90.5	48.7	760.4	56.2
400 V/cm		795
600 V/cm	62
800 V/cm	3.1	1.1
대조군 수준과 비교하여 루시퍼라아제 발현 수준에 있어서의 증가, 이는 전기전달 조건 없이 플라스미드 pXL3031의 주입에 의해 성립되었다. 발현 수준에 있어서의 증가에 대한 평균값은 테스트 당 N=4 내지 6 마리의 생쥐로 나타난다.

비교에 의하여, 200 V/cm, 각 20 msec 의 8 회 펄스, 1 Hz 의 진동수에서의 평방 파장 펄스를 사용한 루시퍼라아제 활성에서의 증가는 44 였다.

이들 데이타는 시간에 대해 지수적으로 감소하는 전기장에 적용시킨 전기전달 기구가 보다 높은 커패시턴스를 가지고 보다 낮은 전기장 세기에서 발현을 증가시킬 수 있음을 보여 준다(예, 200 V/cm, 3000 μFarad 커패시턴스).

실시예 11: 짧은 고-전압 펄스 및 여러 번의 긴 저-전압 펄스의 조합

본 실시예는 전달된 전기장이 짧은 기간 동안 500 및 800 V/cm 사이의 적어도 하나의 긴 전기장, 예컨대, 50 또는 100 ㎲, 및 보다 긴 시간 동안 적어도 하나의 약한 전기장(<100 V/cm), 예컨대, 본 실험에서 1 ms 이상 90 ms 이하의 조합일 수 있음을 나타낸다. 본원에서의 약한 전기장 값은 각 90 ms 의 지속 시간으로 1 Hz 에서 4 번의 펄스에서 적용된 80 V/cm 이다. 한 번 및 그 다음의 다른 장치에 의한 전기적 전압의 전극판으로의 전달은 수동으로 작동 구조를 변형하므로써 1 초 미만으로 일어난다. 여기에 사용된 루시퍼라아제를 암호화하는 플라스미드는 pXL3031 이며, 주입된 양은 3 ㎍ 이다. 전기장 세기에 대한 값은 표 5 에 보고된 바와 같이 변하였다. 그 밖에, 실험 조건은 실시예 1 에 기술된 것과 동일하다.

표 5 는 실험을 요약한다. 이들 데이타는 대조군(전기장 미적용)과 비교하여, 하나의 짧은 고-전압 펄스 또는 4 번의 긴 저-전압 펄스, 또는 고 전압 펄스 전에 약한 전기장 펄스의 적용이 트랜스펙션 효율을 거의 향상시키지 않았음을 보여 준다. 반대로, 본 실험에서, 짧은 고 전압 펄스 다음 1 Hz 에서 90 ms 지속 시간의 80 V/cm 의 4 번의 펄스의 조합은 대조군에 비하여 트랜스펙션을 분명하게 증가시켰다. 이들 데이타로 부터, 바람직한 전기전달 기구는 보다 높은 전기장 세기에서 보다 짧은 일련의 펄스를 제공할 것으로 보인다.

가변적 세기 및 시간의 펄스의 조합

전기장 조건	실험 1(3 ㎍ pXL3031)	실험 2(3 ㎍ pXL3031)
대조군(전기장 미적용)	320 ±126	75 ±27
A: 500 V/cm, 1×0.1 msec	-	169 ±63
B: 800 V/cm, 1×0.1 msec	416 ±143	272 ±84
C: 80 V/cm, 4×90 msec, 1Hz	1282 ±203	362.21 ±85.17
조건: A, 뒤따라서 C	-	1479 ±276
조건: B, 뒤따라서 C	3991 ±418	1426 ±209
조건: C, 뒤따라서 B	-	347 ±66

실시예 1 에 보여진 바와 같이, 1 Hz 의 진동수에서 1 msec 동안 600, 800, 또는 1200 V/cm 의 8 번 펄스의 적용은 근육 상해 및 억제된 트랜스펙션을 일으켰다. 이 실시예에서 얻어진 결과는 특정 조건 하에서, 상해를 일으키지 않으면서 고 전압 전기장을 사용할 수 있음을 보여준다. 정말로, 육안으로의 근육 검사시 육안으로 보이는 어떠한 변형도 없었다. 짧은 시간 동안 고 전압, 뒤따라서 보다 긴 시간 기간 동안 약한 전기장의 사용은 DNA 전달의 효율을 조절하는 대안적인 방법을 제공한다.

실시예 12: 근육에서의 루시퍼라아제 발현의 동력학

본 출원의 전기전달 기구의 사용은 트랜스펙션 및 최소 넉 달 동안의 고 수준의 핵산의 안정된 발현을 가능하게 한다.

C67B1/6 생쥐를 본 실험에 사용한다. 생쥐를 플라스미드 pXL2774(15 ㎍)로 근육 내 주사한다. DNA 주입 후 하기 조건 하에서 전기장을 적용한다: 200 V/cm; 8 번의 20 msec 지속 시간 펄스; 1 Hz 의 진동수. 다른 조건은 실시예 1 에 기술된 바와 같다. 루시퍼라아제 활성은 DNA 주입 후 상이한 시간에 죽인 10 마리의 생쥐 그룹에 대해 측정되었다. 대조군 생쥐는 전기장에 노출되지 않았다.

도 6 의 데이타는 플라스미드 주입 후 3 시간 후 부터 루시퍼라아제 발현이 감지되었으며, 3 일(D3)째까지 증가하였음을 나타낸다. 루시퍼라아제 발현은 35 일째 부터 감소하기 시작한다. 전기장에 의해 처리된 그룹에서, 트랜스펙션은 발현 수준의 측정 시간과 무관하게 아주 분명하게 증가하였다는 것이 주목할 점이다. 121 일(D121)째, 대조군과 처리된 그룹간의 상이점은, 트랜스펙션된 DNA 의 발현이 전기전달 후 보유되는 반면, 대조군 근육에서는 발현이 감소됨으로 인하여 확인되었다.

보다 현저하게도, 전달 유전자의 발현 수준은 D121 까지 안정적이었다. 이 결과는 치료 유전자를 이용한 장기간의 임상 치료라는 면에서 특히 유리하다.

실시예 13: 일렉트로트랜스펙션된 근육의 조직학

동력학 실험 과정에 대한 조직학적 분석은 중요한 염증 반응의 부재를 확인시켰다. 대식세포 및 림프구의 존재에 의해 확인되는, 완화된 염증이 관찰되었다. 이 염증 반응은 D121 까지 급격히 감소한 반면, 도 6 에 도시된 바와 같이 전달 유전자의 발현 수준은 안정적이고 높게 유지되었다.

조직학 분석은 플라스미드 pXL3004(도 13)가 사용된 것을 제외하고는, 이들 조건 하에서 확인되었다. 이 플라스미드는 β-갈락토시다아제를 암호화하는 pCOR 플라스미드(pXL2774; WO 97/10343 참조)이다. pXL2774 플라스미드를 플라스미드 pCDNA3 으로 부터 수득한 CMV 프로모터(Invitrogen, Netherlands)의 제어 하에, 핵 편재화 시그널 서열(Mouvel et al., 1994, Virology 204:180-189 참조) 및 SV40 폴리아데닐레이션 시그널(Genbank accession no.SV4CG)로 변형된 lacZ 유전자의 도입에 의해 변형시켰다. 동물을 플라스미드 투여 후 7 일째에 죽였다. 조직학 검사는 β-갈락토시다아제 트랜스펙션된 세포(Xgal 조직화학) 및 알루마이징된 카마민 염색에 의한 염증 부분의 탐지와, 헤마테인-에오신 염색에 의한 근육 조직 조건의 규명을 허용한다. 대조군 생쥐는 전기장에 노출되지 않았다. 전기투과된 근육과 비-전기투과된 근육 사이의 상이점은 다음에 의해 보여진다:

·β-갈락토시다아제를 발현하는 근원 섬유의 갯수가 대조군(평균 8.5, N=8 마리 생쥐)에 비하여 일렉트로트랜스펙션된 근육(평균 76, N=6 마리 생쥐)에서 9 배 더 큰 근원 섬유였다. 이들 근육 섬유의 대부분은 주변에 위치한 핵과 휴지기였다. 매우 드물게 중심핵 근원 섬유(재생시)가 β-갈락토시다아제를 발현한다.

·β-갈락토시다아제의 발현 지역은 대조군과 비교하여 주입 위치로 부터 감소하는 발현 구배로서, 전기 투과된 근육(4 mm)에서 2 배 넓었다.

·본 연구에서, 전기 투과된 근육은 가역적인 많은 침윤체(대식세포 및 림프구), 핵 집중화로 재생하는 수많은 근육 섬유, 및 포식 대식세포에 의해 채워진 수많은 괴사성 섬유를 제시한다. 염증, 괴사, 및 재생 지대는 트랜스펙션된 근원 섬유 둘레의 지대와 일치한다. 이 반응은 2 주까지 지속되며, 자체적으로 역전된다. 비-트랜스펙션된 근육 부분은 양호한 조건으로 남아 있다.

·비-전기 투과된 근육에서, 일부 괴사성 근원 섬유와 재생하는 다른 것들은 일부 염증 부위와 함께 주입부 둘레에 편재되어 있다.

간단하게, 이들 데이타는 전기전달 조건이 관찰 가능한 염증을 야기하지만, 그 염증은 핵산 전달 효율의 급격한 향상이란 측면에서 심각하지 않음을 보여 준다. 더욱이, 동력학 연구로 부터의 데이타는 전달 유전자의 발현이 고 수준에서 일정하게 유지될 때 조차도 염증이 자체적로 회복됨을 나타낸다.

실시예 14: 전기장 적용 시간에 대한 플라스미드 주입 시간의 역할

본 실시예는, 핵산이 전기장 적용 전 적어도 30 분, 심지어 1 시간 전에도 조직(이 경우에는, 근육) 내로 주입될 수 있음을 보여 준다.

C57B1/6 생쥐에 pXL2774(15 또는 1.5 ㎍)를 근육 내로 주입한다. DNA 를 전기장을 적용하기 전 120 분에서 부터 적용 후 60 초까지 주입한다. 주입 전 또는 주입 후의 시간은 표 6 에 보고되어 있다. 사용된 전기장 조건은 다음과 같다: 200 V/cm; 8 번의 20 msec 지속 시간 펄스; 1 Hz 진동수. 대조군 생쥐에는 플라스미드만 주입하고 전기장에는 노출시키지 않았다. 다른 실험 조건은 실시예 1 의 것과 동일하다.

데이타는 표 6 에 보고되어 있다. 전기장 적용 전 1 시간까지의 DNA 의 주입은 루시퍼라아제 발현에 의해 감지되는 바와 같이, 증가된 트랜스펙션 효율의 달성을 야기하였다. 근육당 15 ㎍ 의 플라스미드의 주입으로 관찰된 동일한 경향이 그 보다 10 배 더 낮은, 즉, 1.5 ㎍ 의 DNA 의 주입에서도 관찰되었다. 플라스미드가 전기장 적용 후에 주입되었을 때에는 어떠한 DNA 트랜스펙션 효율의 향상도 관찰되지 않았다.

표 6

전기장 적용 전 및 후에 주입된 플라스미드의 전기 전달 효율

6A : 전기장 부재 하에서 DNA 주입(대조군)

전기장 적용에 대한 주입시간	실시예 1pXL2774(15 ㎍)	실시예 2pXL2774(15 ㎍)	실시예 3pXL2774(1.5 ㎍)	실시예 4pXL2774(15 ㎍)	실시예 5pXL2774(1.5 ㎍)
0	7 ±4	8 ±6	0.4 ±0.2	22 ±15	1 ±1

6B : 전기장 적용 전에 DNA 주입

시간	실시예 1	실시예 2	실시예 3	실시예 4	실시예 5
- 120 분				20 ±5	2 ±1
- 60 분				106 ±22	10 ±3
- 30 분	303 ±36	237 ±61	7 ±3	184 ±22	15 ±4
- 5 분	410 ±7
- 60 초	253 ±51
- 20 초	492 ±122	201 ±43	9 ±3	123 ±23	12 ±2

6C : 전기장 적용 후 DNA 주입

시간	실시예 1	실시예 2	실시예 3	실시예 4	실시예 5
+ 10 초				7 ±7
+ 20 초	11 ±6	0.4 ±0.1
+ 60 초	8 ±7			17 ±15

전기장 적용 전 1 시간까지의 플라스미드 DNA 의 주입이 시험관 내 플라스미드의 고수준의 발현을 제공한다는, 여기에서 관찰된 결과와는 반대로, 여러 발표자들은 일렉트로포레이션을 위해서는, 플라스미드가 전기장 적용 시간에 존재해야 함을 관찰하였다.

실시예 15: 전기전달과 투여량-반응

통계학적 분석은 본 실시예가 전기전달 조건 하에서 투여량-반응의 비교를 허용함을 제시한다. 본 연구는 전기전달 기구가 플라스미드 발현 수준의 가변도를 크게 감소시킴을 확인시켜 준다.

5 주 된 C57BI16 생쥐의 두 개의 정강근 양측으로 프로모터 CMVh 하에 세포질 발현을 위한 전달 유전자 루시퍼라아제를 포함한 0.25 내지 32 ㎍ 의 DNA 에 이르는 투여량을 DNA 투여당 10 마리의 생쥐에게 근육 내로 주입하였다. 주입 후 즉시, 두 개의 다리 중 하나를 1 Hz 의 진동수, 4 번의 20 ms 펄스로 250 V/cm 전기장에 노출시켰다. 동물을 처리 후 5 일째에 죽이고, 전달 유전자의 발현을 실시예 1 에 기술된 프로토콜에 따라 각 근육의 조직 추출물에서 연구하였다. 이러한 전기전달 조건 하에서, 근육의 육안 관찰은 처리에 처해진 150 개의 근육으로 부터의 조직에 대하여 오직 두 개의 약간의 열적 손상 자국만을 보여 준다.

각 시리즈의 생쥐(n=10)에 대한 평균의 것의 함수로서 분산에서의 비교 변화는 전달 유전자의 발현의 분포가 로그-정상적임을 보여준다. 계산에 의해 확인된 결과의 기하학적 분석(도 7)은, 효과가 주입된 DNA 투여량의 로그값에 대해 선형으로 변함을 보여 준다.

코크란(Cochran) 테스트로, 각 회귀(전기전달이 있을 때 및 없을 때)에 대한 분산의 균질성이 있음을 나타낼 수 있는데, 이 사실은 잔수 분산을 사용하여 모든 계산을 수행하는 것을 가능하게 한다. 전기전달 조건 하에서 선형도로 부터의 분산은 5% 의 신뢰도 정도로도 중요하지 않다. 반대로, 표준 조건(비-전기전달 조건) 하에서 선형도로 부터의 분산은 DNA 트랜스펙션 효율에 있어서의 상당한 불균질성을 나타내며 극히 중요하다 (p<0.01). 데이타는 잔수 분산이 전기 전달이 있었던 것에 비하여 전기 전달이 없었던 경우에 5 배 더 큼을 보여 준다.

잔수 분산에 대해 평가된 값을 고려할 때, 전기전달에 비하여 비-전기전달 조건 하에서 트랜스펙션 효율 비교 테스트에서 동일한 힘을 얻기 위해서는 5 배 더 많은 동물을 사용하는 것이 필요할 것이다. 이 분석은 전기전달 기구를 활용하는데 대한 명확한 잇점으로 환언된다. 95% 의 신뢰도로서 전달 유전자의 발현을 2, 5, 또는 10 배의 분산으로 나타내기 위하여, 비-전기전달 조건 하에서 165, 40, 또는 25 마리의 동물에 비하여, 전기전달 조건 하에서는 33, 8, 또는 5 마리의 동물에 주입하는 것이 필요할 것이다. 이러한 유형의 계산을 요약한 표를 하기 표 7 에 제시한다.

전기전달 장치를 이용한 통계학적으로 상당한 플라스미드 발현에 대한 동물 수의 계산

효율 비	P=95%	P=90%	P=85%	P=75%
2	33	28	24	19
5	8	7	6	6
10	5	5	4	4

상기 데이타는 전기전달 기술이 트랜스펙션의 효율을 크게 증가시킬 뿐만 아니라 반응의 가변성을 상당히 감소시킴을 보여준다. 이를 실행하기 위한 방법 및 장치는 치료적 처리의 범위 내에서 치료 유전자의 재현가능한 운반 뿐 아니라 조직 트랜스펙션에 대한 왕성한 분석적 연구를 허용한다.

각각의 회귀에 대하여 얻어진 슬로프의 비교 실험은 중요하지 않다. 따라서, 5% 의 위험으로 두 개 회귀의 평행성이 있다고 간주하는 것이 가능하다. 상대 효능의 계산은, 동일한 효과를 얻기 위한 전기전달 장치의 사용과 비교하여 약 250 배 많은 DNA 가 표준 조건 하에서 근육 당 주사되어야 함을 보여 준다 (243±85, 95% 의 신뢰 구간). 이러한 결과는 표준 DNA 주입과 비교하여 전기전달을 이용하여 주입된 동일한 투여량의 DNA 에 대한 전달 유전자의 발현에 있어 대략 500 배의 증가로 해석될 수 있다.

본 실시예는, 두 개의 루시퍼라아제-암호화 플라스미드를 이용하여, 주입된 플라스미드 투여량과 전기 전달 사이의 주목할 만한 선형 관계를 확립하는 것이 가능함을 보여준다. 이러한 관계는 전기전달 없이는 그 의미가 훨씬 적다. 통계적 분석은 또한 전기전달된 그룹에 대한 가변도에 있어서의 상당한 감소를 입증한다. 따라서, 본 발명의 전기전달 장치를 이용하여 주입되는 플라스미드의 양을 변화시킴에 의해 전달 유전자의 발현 수준을 효율적으로 예측 가능하게 조정하는 것이 가능하다.

실시예 16: 상이한 전극을 이용한 전기전달

본 실시예는, 두 가지 유형의 전극, 즉 평판 전극 및 바늘 전극 중 하나를 구비한 전기전달 장치의 핵산 전달 효율에 대한 효과를 비교한다. 또한, 바늘 전극은 상이한 이식 배향으로 시험되었다.

플라스미드 pXL2774(150 ㎍)를 쥐의 삼두근 내에 주입하였다. 판 전극을 실시예 1 에 기술된 바와 같이 1.2 cm 의 전극간 거리를 두고 배치시켰다. 바늘 전극의 경우, 전극간 거리는 0.9 cm 였다. 바늘 전극을 근육 조직 내에 동일한 길이로 주입 부위 주위의 근섬유 축에 평행 또는 수직하게 삽입하였다. 전극의 유형 또는 그 배향과 무관하게, 전기장 조건은 다음과 같았다: 200 V/cm 의 강도; 20 msec 의 8 개의 펄스; 2 Hz 의 진동수.

본 실험의 결과를 도 8 에 보인다. 이 데이터는 전기전달이 전기장의 적용 방식과 무관하게 필적할 만함을 보인다. 바늘 전극과 판 전극을 이용하여 유사한 수준의 트랜스펙션이 얻어졌다. 더욱이, 전기 전달의 효율은 근섬유의 배향에 대한 바늘 전극의 배향과 무관한 것으로 보인다.

이들 데이터는 전기전달 장치가 표적 조직에 대한 전극의 배향과 무관하게 판 또는 바늘 전극을 사용할 수 있음을 보인다. 핵산을 큰 크기의 근육에 투여하는데 있어서, 총 전압이 중간, 예컨대 200 V/cm 의 전기장 강도에 대하여 0.5 cm 이내의 바늘 전극의 배치로 100 V 임을 보증하기 위하여, 바늘 전극의 사용이 바람직할 것이다. 그러나, 작은 근육, 예컨대 손가락에 대해서는, 예컨대 관절염에 대한 치료 유전자의 운반을 위해, 비-침투성인 판 전극이 바람직할 것이다.

실시예 17: 상이한 근육 및 종 내로의 전기전달

본 실시예는 전기전달 장치가 상이한 종의 동물 내 많은 상이한 유형의 근육 내로의 핵산 전달을 실행하는데 이용될 수 있음을 보인다.

전기전달 장치는 표 8 에 정의된 바와 같은 각각의 종에 대한 조건을 제공하도록 조절되었다. 이 결과 또한 표 8 에 보인다.

다양한 종 및 근육 내 핵산 트랜스펙션의 전기전달의 향상

종	플라스미드	전기장조건	근육두개 경골	근육비복근	근육대퇴 직근	근육상완 삼두근	근육사두근
생쥐	10 ㎍pXL3031	8 ×200 V/cm20 msec, 2 Hz	×28	×196	×342	×1121
쥐	150 ㎍pXL3031	8 ×200 V/cm20 msec, 2 Hz	×31			×160	×13,2
토끼	200 ㎍pXL2774	4 ×200 V/cm20 msec, 1 Hz	×25417			×724	×3595
대조군 (비-전기전달)에 비하여 전기전달 장치를 이용한 루시퍼라아제 발현 수준에 있어서의 상대적인 증가를 알 수 있다. 이 데이터는 그룹 당 10 개의 근육에 대한 평균이다. 루시퍼라아제 활성은 플라스미드 투여 7 일 후에 측정하였다.

전기전달은 원숭이(Macaca fascicularis) 내에서 또한 실험되었다. 섬유아세포 성장 인자 1(산성 섬유아세포 성장 인자)(FGF1 또는 aFGF)을 암호화하는 유전자를 포함하는 플라스미드 pXL3179(도 11)를, 인간 섬유아세포 인터페론 시그날 펩티드가 aFGF (sp-FGF1, Jouanneau et al., 1991,, PNAS 88;2893-2897)에 대한 cDNA에 융합되고, 인간 CMV-IE 프로모터 및 SV40 폴리아데닐레이션 시그날의 조절 하에 도입된 플라스미드 pXL2774 로 부터 유도하였다. aFGF 발현을 면역-조직 화학에 의해 측정하였다. 500 ㎍ 의 플라스미드 pXL3179 의 근육 내 주사 3 일 후에, 양성 세포(aFGF를 발현하는 세포)의 수를 측정하였다. 전기장 조건은 1 Hz 의 진동수에서 200 V/cm, 각각 20 msec 의 8 개의 펄스였다. 대조군은 전기장으로 처리되지 않았다(전기전달-).

본 실험의 결과는 표 9 에 보인다. 이 데이타는 근 조직 내로의 DNA 전달 효율을 증가시키기 위한 전기전달 장치 사용 후에만 aFGF 단백질 발현이 검출될 수 있었음을 명백히 입증한다. 흥미롭게도, 이들 조건 하에서 전기전달의 부재 하에는 어떠한 발현도 검출될 수 없었다.

원숭이 근육 내 aFGF 발현의 면역 조직 화학적 분석

	전기전달-	전기전달+
삼두근	0	0
두개 경골	0	30
이두근	0	4
사두근	0	30
상이한 원숭이 근육 내에서의 aFGF 발현에 대한 면역 조직 화학적 분석.상기 값은, 전기장의 사용(+) 및 사용 없이(-) aFGF 를 암호화하는 플라스미드 pXL3179 500㎍ 의근육 내 주사 3 일 후 양성인 것들의 수이다.

실시예 18: 쥐 횡격막 근육 내에서의 전기전달

본 발명의 전기전달 장치의 사용에 의한 장기간 안정한 전달 유전자의 발현을 제공하는 능력은 횡격막의 기능에 영향을 미치는 퇴화성 질병, 주목할 만하게 진행성 근 이영양증의 치료에 있어 중요한 의미를 가진다.

본 실험들에서, 횡격막은 마취(라르각틸 1 mg/kg 및 케타민 150 mg/kg 의 혼합물) 후 흉골을 따라 절개하므로써 접근 가능하도록 되었다. 주입은 반횡격막 내에 행하여졌다 (NaCl 20 mM 및 글루코오스 5% 내 플라스미드 pXL2774 50 ㎍). 그 후, 판 전극을 전극간 거리 1 mm 에서 주사 경로를 따른 횡격막의 양면 중 한 면에 배치시켰다. 사용된 전기장 조건은 다음과 같았다: 160 V/cm 또는 300 V/cm; 각각 20 msec 지속 기간의 8 개 펄스; 진동수 1 Hz. 전기장을 주사 후 1 분 이내에 근육에 적용하였다. 그 다음, 동물 내 절개를 닫았다.

결과는 표 10 에 보인다.

쥐 횡격막 근육 내로의 전기전달

V/cm	0	160	300
총 RUL	48±33	920±474	51±29
루시퍼라제 발현에 대한 값은 근육 당 백만 단위의 RUL 내 루시퍼라제 활성의 평균 ±S.E.M.이다. 각각의 그룹 당 N=12.

본 실시예는 160 V/cm 의 장 강도에서 20 msec 의 8 개 펄스의 적용 후 횡격막 내 전달 유전자의 발현에 있어서의 상당한 개선을 입증한다 (Mann-Whitney 비-변수적 실험을 이용하여 p<0.003).

실시예 20: 분비된 알칼리성 포스포타아제 유전자의 전기전달

본 실시예는 분비된 단백질을 암호화하는 유전자를 트랜스펙션 및 발현시키는 능력을 입증한다. 분비된 단백질은, 예컨대, 전신적 유전자 치료의 접근에서 면역 반응(DNA 백신)을 생성하기 위해 사용된다. 본원에 제시되는 분비된 단백질은 증가된 농도로 순환 중에 있는 것으로 밝혀졌으며, 그 존재는 안정하였다.

본 실시예에서, 알칼리성 포스포타아제-암호화 플라스미드 pXL3010(도 13)이 성숙한 C57B1/6 생쥐의 두 개의 두개골 경골 근육 중 하나 내로 주입되었다. 플라스미드 pXL3010은, pSEAP-염기로부터 분비된 알칼리성 포스포타아제(SeAP)를 암호화하는 유전자(Clontech; Genbank accession no. CVU09660)가 CMV 프로모터 (pCDNA3; Invitrogen, Netherlands) 및 SV40 폴리아데닐레이션 시그널의 조절 하에 도입된 ColE1 으로 부터 유도되었다. 전기장의 적용은 표준 조건, 즉, 20 msec 지속 시간의 8 평방 펄스, 1 Hz 진동수, 및 플라스미드 주입 20 초 후 적용되는 200 V/cm, 하에 수행되었다. 혈청 알칼리성 포스포타아제 농도의 측정은 상업적 화학발광 분석(Phosphalight, Tropix, Bedford, Massachusetts, US)을 이용하여 7 일 후 눈으로 부터의 혈액 샘플(안와 뒤 신경총 천자) 상에서 수행되었다. 비-암호화 플라스미드(밸러스트 DNA)를 주입한 몇몇 근육을 전기장에 적용하거나 적용하지 않은 결과, 전달 유전자의 발현으로부터 유래하지 않은 혈청 알칼리성 포스포타아제의 없음을 확인하였다.

이들 조건 하에서 전기장의 적용에 의한 전달 유전자 발현의 향상 효과는 다양한 양의 주입 플라스미드에 대해 명백하였다 (표 11). 주입 플라스미드의 양을 증가시키므로써 높은 알칼리성 포스포타아제 혈청 농도에 도달하는 것이 가능하였다. 전통적인 트랜스펙션과 비교하여, 이러한 효과는 본 실험에서의 주입 후 장기간 동안 유지되었다.

전기전달을 사용 및 사용하지 않은 생쥐로 부터의 SeAP 발현

플라스미드 pXL3010㎍	플라스미드 pUC19㎍	전기전달-	전기전달+
0.1	0	0.03 ±0.01 (n=5)	1.23 ±0.21 (n=10)
0.3	0	0.05 ±0.02 (n=5)	1.92 ±0.33 (n=10)
1	0	0.16 ±0.04 (n=5)	7.58 ±1.18 (n=10)
10	0	1.52 ±0.59 (n=10)	262.87 ±54.97 (n=10)
400	0	15.64 ±10.77 (n=5)	2203.11 ±332.34 (n=5)
0.1	9.9	0.088 ±0.015 (n=5)	21.39 ±3.54 (n=10)
0.3	9.7	0.90 ±0.49 (n=5)	95.67 ±16.15 (n=10)
1	9	0.26 ±0.09 (n=5)	201.68 ±32.38 (n=10)
10	0	0.21 ±0.05 (n=10)	357.84 ±77.02 (n=10)
상기 표에서 혈청 내 SeAP 에 대한 평균 값 ±S.E.M.(ng/ml)이 보고된다.

400 ㎍ 의 플라스미드의 주입(좌우로 54 ㎕ 내 100 ㎍ DNA 주입 및 30 분 간격으로 2 회)은 대조군에 대한 0.016 ㎍ 과 비교하여 일렉트로트랜스펙션을 사용하여 알칼리성 포스포타아제 2.2 ㎍/ml 의 혈청 농도를 생산하였다. 더욱이, 플라스미드의 양과 무관하게 일정한 양의 DNA(생쥐 당 총 10 ㎍ 의 DNA)를 사용하여 작업하는 것을 가능하게 하는 밸러스트 DNA 의 사용은, 적은 양의 플라스미드 pXL3010(≤1㎍)에 대한 전기전달의 수준을 더욱 향상시켰다.

SeAP 발현의 역학 또한 행하여졌다. 이 경우, DNA 투여량은 15 ㎍ 이었 고, 좌우로 근육 당 주입되었다 (생쥐 당 30㎍). 이 결과는 도 9 에 제시된다. 트랜스펙션 7 일 후, pXL3010 의 전기전달의 결과로서, 상당히 안정한 (적어도 2 달 동안) SeAP 혈청 농도가 관측된다.

상기 결과는 본 발명의 장치를 이용한 근육 내 핵산의 전달이 분비된 전달 유전자의 높고 안정한 수준의 발현을 허용함을 확인한다. 따라서, (맥관형성 인자 또는 발육 이상 유전자와 같은) 근육 자체에 직접적으로 작용하는 치료 유전자의 발현을 지시할 뿐만 아니라, 원하는 분비된 단백질의 생산을 위한 기관으로서 근육을 사용하는 것이 가능하다.

실시예 21: 에리트로포에틴 유전자의 전기전달

본 실시예는, 본 발명의 장치를 이용하여 치료 유전자를 근육으로 운반할 수 있고, 그 유전자 생성물의 발현은 검출 가능하고 의미있는 생리학적 반응을 야기함을 입증한다. 이 경우, 에리트로포에틴 발현이 검출될 수 있으며, 발현된 단백질은 수용체 동물의 헤마토크리트(hematocrit)에 있어서의 증가를 유발한다.

에리트로포에틴을 암호화하는 유전자를 포함하는 플라스미드 pXL3348(도 16)을 C57BN1/6 생쥐의 두개골 경골 근육 내의 일측으로 주입하였다. 플라스미드 pXL3348 은, 인간 CMV-IE 프로모터 및 SV40 폴리아데닐레이션 시그널의 조절 하에 쥐 에리트로포에틴 유전자(NCBI:193086)를 도입하므로써 플라스미드 pXL2774 로 부터 유도하였다. 전기장(200 V/cm, 20 msec 의 지속 기간의 8 펄스, 1 Hz 진동수)을 플라스미드 주입 직후 적용시켰다.

본 실험의 결과는 표 12 에서 보고한다.

에리트로포에틴의 발현 및 그 효과

	D7 에서의에리트로포에틴의 혈청 수준(mIU/ml)	D24 에서의에리트로포에틴의 혈청 수준(mIU/ml)
플라스미드	전기전달-	전기전달+	전기전달-	전기전달+
pXL3348(1 ㎍)	0	3.0 ±1.6	0	1.12 ±0.8
pXL3348(10 ㎍)	0.9 ±0.9	61.8 ±15.8	0	74.1 ±28.9
pUC19(1 ㎍)		0		0

	D7 에서의 헤마토크리트의 증가 %	D24 에서의 헤마토크리트의 증가 %
플라스미드	전기전달-	전기전달+	전기전달-	전기전달+
pXL3348(1 ㎍)	38.5 ±0.5	35.0 ±3.6	50.8 ±2.3	81 ±0.5
pXL3348(10 ㎍)	32.0 ±3.2	26.0 ±4.1	69.0 ±5.1	83.0 ±1.0
PUC 19(1 ㎍)		30.8 ±2.3		43.2 ±0.9
평균 값 ±S.E.M.; N=그룹 당 4 내지 5 마리의 생쥐

D24 에서, 플라스미드 1 ㎍ 의 주입은 전형적으로 트랜스펙션된 생쥐에 있어서의 헤마토크리트의 온화한 증가와 연관되며, 일렉트로트랜스펙션된 생쥐의 경우 매우 높다. 10 ㎍ 의 플라스미드로써, 헤마토크리트는 대조군에 있어서 증가하였다. 전기전달될 군의 경우 헤마토크리트는 명백히 더 컸으며, 편차는 더 적었다. 유사한 결과가 적은 양의 DNA(1 ㎍)를 이용하여 얻어졌다.

실시예 22: VEGF(혈관 내피 성장 인자) 유전자의 전기전달

C57B1/6 또는 SCID 생쥐의 두개골 경골 근육 내 좌우로 15　㎍ 의 플라스미드 pXL3212(도 11), VEGF-암호화 플라스미드 pCOR hVEGF 를 삽입하였다. 플라스미드 pXL3212 는, 인간 CMV-IE 프로모터 및 SV40 아데닐레이션 시그널의 조절 하에 VEGF 를 암호화하는 cDNA(Genbank accession no. HUMEGFAA)를 도입하므로써 플라스미드 pXL2774 로 부터 유도하였다. 상업적 전기 펄서(Jouan)를 이용하여, 2 Hz 의 진동수로 200 V/cm 에서 20 msec 지속 시간의 8 개 펄스의 비율로 전기적 트랜스펙션을 수행하였다. 혈액 샘플을 안와 뒤 신경총으로 부터 건조 튜브 내에 채취하였다. 혈액 샘플을 플라스미드 주입 1 일 전 및 7 일 후에 채취하였다. Quantikine(R&D 시스템) 키트를 이용하여 인간 VEGF 의 면역 효소 정량화를 수행하였다. 추가 인간 VEGF 종을 생쥐 혈청 내에서 수행하였다. 이들 종에 대한 결과를 표 13 에 나타낸다.

생쥐 혈청 내 인간 VEGF 의 발현

생쥐 균주	일수	트랜스펙션 방법	인간 VEGF(ng/L)
C57BL6	D-1	단순 주입	검출되지 않음
C57BL6	D+7	전기전달	393±110
SCID	D-1	단순 주입	검출되지 않음
SCID	D+7	전기전달	99±26
C57Bl/6 및 SCID 생쥐 내 VEGF 의 혈청 농도(ng/리터). 대조군 생쥐 혈청은 플라스미드 주입 1일 전에 생쥐로 부터 채취하였다.

실시예 23: 응괴 인자 IX 유전자의 전기 트랜스펙션

실험 조건은, 15 ㎍ 의 응괴 인자 IX-암호화 플라스미드 pCor hFIX (pXL3388: 도 12)가 C57BL6 또는 SCID 생쥐의 근육 당 주입된 점을 제외하고는, 실시예 22 와 동일하였다. pXL3388 플라스미드는, CMV-IE 프로모터 및 SV40 폴리아데닐레이션 시그널의 조절 하에 인간 인자 IX(Christmas factor; Genbank accession no. HUMFIXA)를 암호화하는 cDNA 를 도입하므로써 플라스미드 pXL2774 로 부터 유도하였다. 전기전달 조건은 다음과 같았다: 200 V/cm 에서 20 msec 지속 기간의 8 펄스, 2 Hz 진동수. 인자 IX 수준을 플라스미드 주입 7 일 후 측정하였다. 혈액 샘플을 삼나트륨 시트레이트를 함유한 튜브 내에 안와 뒤 신경총으로 부터 채취하였고, 튜브를 얼음 내에 저장하였다.

다음의 표(표 14)는, 그 두개골 경골 근육에 pXL3388 플라스미드가 주입되고 본 발명의 전기전달 장치를 이용하여 전기장이 적용된 C57BL6 또는 SCID 생쥐의 혈액 내에서만 인간 인자 IX 가 발견되었음을 보여 준다.

인간 인자 IX 의 발현

생쥐 균주	주입	전기전달	인간 인자 IX(㎍/L)
C57BL/6	pXL3388	+	69 ±12
C57BL/6	pXL3388	-	검출되지 않음
C57/BL6	NaCl 0.9%	+	검출되지 않음
SCID	pXL3388	+	66 ±5
SCID	pXL3388	-	검출되지 않음
C57BL/6 및 SCID 생쥐 내 인자 IX 의 농도

본 발명의 전기전달 장치를 사용하지 않은 생쥐 혈액 내에서 인간 인자 IX 는 검출되지 않았다.

실시예 24: 산성 섬유아세포 성장 인자 (aFGF) 유전자의 전기 전달

실험 조건은, 15 ㎍ 의 FGF-암호화 플라스미드 pCor CMV aFGF (pXL3096: 도 14)를 C57BL6 또는 SCID 생쥐 근육 당 주입한 점을 제외하고는, 실시예 22 에서와 동일하였다. pXL3096 플라스미드는, CMV-IE 프로모터 다음 전사되고 비-번역된 HSV 티미딘 키나아제의 리더 서열 및 SV40 폴리아데닐레이션 시그널 서열의 조절 하에, 그 유전자가 인간 섬유아세포 인터페론의 시그널 펩티드와 FGF1 (sp-FGF1; Jouanneau et al., supra)을 암호화하는 cDNA 사이의 융합을 암호화하는, 삼중 나선 형성 서열(TH; Wils et al., 1997, Gene Ther. 4:323-330)을 도입하므로써, 플라스미드 pXL2774 로 부터 유도하였다. 다음의 전기전달 조건이 사용되었다: 20 msec 지속 기간의 8 펄스, 200 V/cm, 2 Hz 진동수. FGF 의 존재는 면역 조직 화학에 의하여 보여졌다.

C57Bl/6 생쥐의 트랜스펙션에 대한 결과는 도 10 에 나타나고, SCID 생쥐에 대한 결과는 표 15 에 보인다. 무작위로 선별된 부위 내 FGF 를 발현하는 섬유의 수는, pXL3096 플라스미드만의 주입을 받은 대조군 근육에 대한 것 보다 전기 트랜스펙션된 근육에 있어서 명백히 뛰어났다. 전기 트랜스펙션 후 FGF 의 발현은 D8 에서 최고치에 도달한다. D21 및 D35 에서, 대조군에 있어서 FGF 의 존재는 사실상 검출 불가능한 반면, 전기 형질감염된 군 내에서 다수의 양성 섬유가 관측되었다.

SCID 생쥐 내 FGF 의 발현

	전기전달	두개 경골 (좌)	두개 경골 (우)
pXL3096 (15㎍)	++	600700	450300
pXL3096 (15㎍)	---	330	000
pXL3096 (1.5㎍)	+++	8020110	7035100
pXL3096 (1.5㎍)	--	00	01
근육 부위 내에서 면역 조직 화학에 의해 검출된 aFGF 양성 섬유의 수가 개개 생쥐에 대하여측정되었다. 근육 부위는 근육의 중간으로 부터 수득하였다.

면역 조직 화학에 의해 드러나는 양성 섬유의 수에 의해 결정되는 aFGF 의 발현은 전기전달 장치의 처리를 받은 생쥐 내에서만 거의 독점적으로 검출되었다. 더욱이, aFGF 발현은 높은 DNA 투여량에서 뿐만 아니라 낮은 DNA 투여량에서도 검출되었다.

실시예 25: 향신경성 인자-3 (NT3) 유전자의 전기전달

5 주령의 C57Bl/6 및 어린 Xt/pmn 생쥐의 두개 경골 근육 내 한쪽으로, 향신경성 인자 NT3 를 암호화하는 플라스미드 pXL3149(도 14) 12.5 ㎍ 를 주입하였다. pmn 생쥐는, 운동성 뉴런의 초기의 신속한 퇴화 및 약 40 일의 평균 수명을 특징으로 하는 근위축성 측삭경화증(ASL; LouGehrig's 질병)에 대한 표본이다. 플라스미드 pXL3149 는, 인간 CMV-IE 프로모터 및 SV40 폴리아데닐레이션 시그널의 조절 하에 쥐 NT3 유전자(Genbank accession no. MMNT3)를 도입하므로써 플라스미드 pXL2774 로 부터 유도하였다. 생쥐 처리 7 일 후 PBS 완충액 내 분쇄된 근육의 원심분리(12,000 ×g)에 의해 제조된 상층액 내에서 NT3 의 발현을 연구하였고, ELISA 분석(Promega 키트)에 의해 정량화하였다.

C57Bl/6 생쥐는 12.5 ㎍ 의 플라스미드 DNA 주입을 받았다. 주입 직후 생쥐의 절반에 전기장(1 Hz 의 진동수에서 20 ms 의 4 펄스로 250V/cm)을 가하였다. 각각 95% 의 신뢰 간격으로, 20 근육에 대한 평균으로, 전기전달 부재시 77 ±11 pg/근육 및 전기전달 이용시 2.7 ±0.9 ng/근육으로 계산되었다.

4 내지 5 일령의 Xt/pmn 잡종성 생쥐 내 NT3 의 발현에 대하여 유사한 데이터를 얻었다. 이들 생쥐들은 상이한 근육 내 다수 영역의 주입(비복근, 25 ㎍; 두개 경골근, 12.5 ㎍) 후 동물 당 130 ㎍ 의 DNA 주입을 받았다. 다음의 전기전달 조건이 사용되었다: 20 msec 지속 기간의 4 펄스, 500 V/cm, 1 Hz. 이들 생쥐 내에서 플라스미드 투여 및 전기장 적용 7 일 후 NT3 를 검출하였다. 본 실험의 결과는 표 16 에 보고된다.

Xt/pmn 생쥐 내 NT3 의 발현

	NaCl 0.9% (대조군)	pXL3149
전기전달	-	+	-	+
플라스마	0(n=2)	0(n=2)	46 ±10(n=4)	1599 ±639(n=4)
비복근	3619 ±102(n=4)	1619 ±150(n=2)	3647 ±1078(n=8)	19754 ±3818(n=8)
두개 경골근	1415 ±363(n=4)	1453 ±375(n=2)	1400 ±155(n=8)	16826 ±3135(n=8)
NT3 ±S.E.M.의 평균값(근육 당 pg 또는 플라스마의 pg/ml)

본 실험에서 실험된 조건 하에, 비복근 및 두개 경골 내에서 NT3 의 기저 수준을 검출하였다. 표준 DNA 운반 조건 하에서, 플라스미드 pXL3149 의 주입은 NT3 발현의 수준을 증가시켰다. 본 발명의 장치 사용시, 조직 및 플라스마 내 NT3 양에 있어 매우 큰 증가가 관측된다. 따라서, 투여되는 DNA 플라스미드의 임의의 양에 대하여, 트랜스펙션 효율을 증가시키기 위한 본 발명의 장치의 이용은 근육 및 플라스마 내에서 모두 발현되는 전달 유전자의 양을 크게 증가시킨다. 이러한 증가는 향신경성 유전자 치료법을 달성하기 위하여 NT3 발현에 있어 특히 중요하다.

실시예 26: 인간 성장 호르몬 유전자의 전기전달

C57Bl/6 생쥐의 두개 경골근 내 한쪽으로 플라스미드 pXL3353 (도 15) 또는 플라스미드 pXL3354(도 15)(10 ㎍)를 주입하였다. 플라스미드 pXL3353 은, 인간 CMV-IE 프로모터 및 SV40 폴리아데닐레이션 시그널의 조절 하에, 게놈 인간 성장 호르몬 유전자(폴리아데닐레이션 시그널 후 224 염기쌍인, 전사 개시 시그널로 부터 BamII 부위로 연장하는 hGH 의 단편 XbaI/Sph)를 도입하므로써 플라스미드 pXL2774 로 부터 유도하였다. 다음의 프라이머들을 이용하는 30 사이클의 증폭 후, 인간 뇌하수체 mRNA 라이브러리로 부터 역 전사에 의하여 hGH cDNA 를 수득하였다:

5' 상보적 올리고:

5'-GGGTCTAGAGCCACCATGGCTACAGGCTCCCGGAC-3'

상기 올리고뉴클레오티드는 kozak XbaI 서열을 함유한다.

3' 상보적 올리고뉴클레오티드:

5'-GGGATGCATTTACTAGAAGCCACAGCTGCCTC-3'

상기 올리고뉴클레오티드는 NsiI 부위 및 정지 코돈을 함유한다.

증폭된 단편을 플라스미드 pCR2.1 (TA Cloining Kit, Invitrogen) 내로 클로닝하고 서열화하였다. hGH cDNA 를 함유하는 681 염기쌍의 XbaI/NsiI 단편을 pSL3353 의 XbaI/NsiI 단편을 이용하여 결찰시켜 플라스미드 pXL3354 를 생성하였다.

전기전달 조건은 다음과 같았다: 200 V/cm; 20 msec 지속 기간의 8 펄스; 1 Hz 진동수. 플라스미드 DNA 주입 직후 전기장을 가하였다. 생쥐 처리 7 일 후, 12,000 ×g 에서 원심분리 후 완충된 PBS 내 분쇄된 근육 상층액 내에서, hGH 의 존재를 검출하였다. hGH 의 양을 ELISA(Boehringer Manheim)를 이용하여 측정하였다.

본 실험의 결과를 표 17 에 보고한다.

인간 성장 호르몬의 발현

	주입 게놈 hGH(pXL3353)	주입 hGH cDNA(pXL3354)
전기전달	-	+	-	+
두개 경골근	87.1 ±9.3(n=10)	1477.6 ±67.6(n=10)	2820.0 ±487.5(n=10)	15739.1 ±915.5(n=10)
hGH 발현의 평균 값 (피코그램/근육) ±S.E.M

상기 결과는, 본 발명의 전기전달 장치의 사용이 인간 성장 호르몬의 휠씬 높은 발현을 허용함을 보여준다. 게놈 클론이 투여되든지 또는 hGH 를 암호화하는 cDNA 가 투여되든지 간에, 이러한 발현의 증가가 관측된다.

실시예 27: 백신 전달 유전자의 전기전달

본 실시예는, 본 발명의 전기전달 장치가 유전자 (또는 DNA) 백신에 대한 유전자 운반을 증진시킴을 보고한다. 본 실시예에서, 다음의 생성물을 사용하였다: VR-HA, flu 비루스(균주 A/PR/8/34)의 헤마글루티닌 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA. mVRgBDT 는 인간 거대세포 비루스(Towne 균주)의 글리코프로틴 B (gB) 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA 이다. 기타 산물은 상업적 공급업자로 부터 구입가능하다: 케타민, 크실라진 및 생리학적 염화나트륨 용액 (NaCl 0.9%). 본 실험은 9 주령 암컷 생쥐 Balb/c 내에서 수행되었다. 상이한 우리 내에서 유래된 생쥐를 실험 전에 무작위로 분포시켰다 (무작위화).

역전류 검출관 및 상업적 전기 펄스 발생기(삼각형 또는 사각형) (Electropulser PS15, Jouan, France)를 이용하였다. 사용되는 전극은 5 mm 간격으로 이격된 스테인레스 스틸 평(flat) 전극이었다.

케타민 및 크실라진의 혼합물을 이용하여 생쥐를 마취시켰다. 플라스미드 용액(NaCl 0.9 % 내 20 ㎕/ml 또는 200 ㎕/ml 용액 50 ㎕)을 Hamilton 주사기를 이용하여 왼쪽 다리의 두개 경골근 내로 피부를 통하여 세로로 주입하였다. 두개의 전극을 전도성 겔로 코팅하고, 주입된 다리를 전극 사이에 이들과 접촉하도록 배치시켰다. 주입 20 초 후, 사각 펄스 발생기를 이용하여 근육 축에 수직으로 전기 펄스를 가하였다. 역전류 검출관은 전기장의 모니터링을 가능하게 하였다: 8 연속 펄스에 대하여 200 V/cm, 20 ms 의 지속 기간, 1 Hz 의 진동수.

면역 반응 자극의 평가를 위하여, 다음의 면역화 프로토콜을 사용하였다 :

D 0예비-면역 혈청 샘플을 채취

D 1전기전달을 이용 또는 이용하지 않고 먼저 주입

D 21면역 혈청 샘플을 채취

D 22전기전달을 이용 또는 이용하지 않고 부스터 주입

D 42면역 혈청 샘플을 채취

D 63면역 혈청 샘플을 채취

혈청 샘플을 안와 뒤 정맥동으로 부터 채취하였다. 특이 항체의 양을 ELISA 에 의하여 측정하였다. 각각의 실험 조건이 한쪽으로 주입된 10 동물을 이용하여 10 포인트에서 실험되었다.

flu 헤마글루티닌에 대항하여 유도된 항체 역가의 결과를 표 18 에 제시한다.

항-flu 헤마글루티닌 항체 반응

	전기전달	D0	D21	D42	D63
VR-HA (1㎍)	-	<50	132 ±739	1201 ±4380	1314 ±2481
VR-HA (1㎍)	+	<50	1121 ±1237	10441 ±7819	8121 ±5619
(p)			(0.0135)	(0.0022)	(0.0033)
VR-HA (10㎍)	-	<50	781 ±666	5113 ±16015	4673 ±8238
VR-HA (10㎍)	+	<50	4153 ±2344	74761 ±89228	41765 ±52361
(p)			(0.0002)	(0.0005)	(0.0007)
전기전달 장치에 의하여 제공되는 전기장의 존재(+) 또는 부재(-) 하에 1 또는 10 ㎍의 VR-HADNA 주입 후 얻어진, flu 헤마글루티닌에 대항하여 유도된 항체 역가. 이 결과는 군 당 10 동물의 기하 평균(1㎍의 DNA 가 주입되고, 전기장에 노출되고, D63 에서 시험된 군에 대하여 N=8) ±표준 오차이다. 값 (p)는 비-변수 Mann-Whitney 실험을 이용하여, DNA 주입된 후 전기장으로 처리 또는 처리되지 않은 군을 둘씩 비교하므로써 얻어졌다.

이들 결과는, 전기전달 장치 처리된 군 내에서 flu 헤마글리티닌에 대항하여 유도된 항체 역가가 약 10 배로 크게 증가함을 보인다. 과연, 1 ㎍ 의 DNA 만을 받고 전기전달 장치 처리된 생쥐가, 10 ㎍ 의 DNA 를 받았으나 전기장 처리되지 않은 생쥐 보다 큰 항-헤마글루티닌 역가를 가졌다.

CMV 글리코프로틴 B 에 대항하여 유도된 항체 반응의 결과를 표 19 에 제시한다.

항-CMV 글리코프로틴 B 항체 반응

	전기전달	D0	D21	D42	D63
VR-gB (10㎍)	-	<50	73 ±138	755 ±1766	809 ±1363
VR-gB (10㎍)	+	<50	200 ±119	3057 ±1747	2112 ±1330
(p)			(0.0558)	(0.0108)	(0.0479)
전기 장치에 의해 제공되는 전기장의 부재(-) 또는 존재(+) 하에 10㎍의 VR-gB DNA 주입 후 얻어진 CMV 글리코프로틴 B 에 대항하여 유도되는 항체 역가. 이 결과는 군 당 10 동물의 기하 평균 (전기장에 노출된 군에 대하여 N=9) ±표준 오차이다. 값 (p)는 비-변수 Mann-Whitney 실험을 이용하여, DNA 주입된 후 전기장으로 처리 또는 처리되지 않은 군을 둘씩 비교하므로써 얻어졌다.

상기 결과는, 대조군과 비교하여 전기장 처리된 군 내에서 항-gB 역가가 42일까지 (D42) 4 배로 증가함을 보인다. 더욱이, 이미 관측된 바와 같이, 비처리 생쥐(대조군)와 비교하여, 전기전달 장치 처리된 생쥐에 있어서 가변도(표준 오차)가 크게 감소한다.

실시예 28: 종양 세포의 트랜스펙션을 위한 전기전달 장치

다음의 실시예는 전기전달 장치의 이용이 종양 조직 내로 핵산의 운반을 증진시킴을 예시한다. 특히, 핵산의 근육 내로의 전기전달을 위해 바람직한 것 보다 높은 전압을 제공하도록 본 발명의 전기전달 장치를 변경하므로써, 종양 세포 (및 대부분의 다른 세포)의 효율적인 생체 내 트랜스펙션이 실행될 수 있다. 본 실시예는, 누드(면역 결함) 생쥐 상에 이식된 인간 급원, 또는 C57Bl/6 (면역 컴피턴트) 생쥐 상에 이식된 쥐 급원의 상이한 종양에 미치는 전기전달의 효과를 입증한다. 낮은 강도의 전기장 펄스의 다음에 대한 효과가 입증되었다: A) 종양 내로의 주입에 의한 플라스미드 DNA 트랜스펙션, 및 B) 종양 내로의 주입 후 전달 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 플라스마 내로의 분비.

물질 및 방법

18-20 g 무게의 암컷 누드 또는 C57Bl/6 생쥐 중 하나의 면 상에 종양을 이식하였다. 20 ㎣ 의 인간 폐암 (H1299) 또는 대장 선암 (HT29) 종양을 누드 생쥐 내에 이식하였다. 쥐의 섬유육종(LBP) 세포 (10⁶세포) 또는 흑종 (B16) 또는 폐암(3LL) 종양(20㎣)을 C57Bl/6 생쥐 내에 이식하였다. 마우스를 종양 크기에 따라 분류하고 같은 선조를 가진 군으로 나누었다.

생쥐를 케타민 및 크실라진의 혼합물로 마취시켰다. 종양이 표적 부피에 도달한 후, 플라스미드 pXL3031 (원형질 루시퍼라아제) 또는 pXL3010 (분비된 알칼리성 포스포타아제)을 종양 내로 주입하였다. 플라스미드 용액(20 mM NaCl, 5 % 글루코오스 내 250 ㎍/ml DNA 용액의 40㎕)을 Hamilton 주사기를 이용하여 종양의 중심 내로 길이 방향으로 주입하였다. 종양의 측면을 전도성 겔로 코팅하고, 종양을 두개의 전극 사이에 배치시켰다. 주입 20 내지 30 초 후, 사각 펄스 발생기를 이용하여 전기 펄스를 가하였다. 역전류 검출관 및 상업적 전기 펄스(사각 또는 삼각) 발생기(Electro-pulsateur PS 15, Jouan, France)를 사용하였다. 전극은 0.45 내지 0.7 cm 이격된 스테인레스 스틸 평 전극이었다.

루시퍼라아제를 이용한 종양 형질감염을 평가하기 위하여, 생쥐(조건에 따라, 일반적으로 실험 군 당 10 마리의 생쥐)를 플라스미드 주입 2 일 후 안락사시켰다. 종양을 제거하고, 무게를 측정하고, 용해 완충액 내에서 분쇄하였다. 얻어진 분산액을 원심분리하여 맑은 상층액을 얻었다. 기질이 자동적으로 첨가되는 상업적 루미노미터를 이용하여 10 ㎕ 상층액 내에서 루시퍼라아제 활성을 측정하였다. 결과는 종양 당 총 RLUs(상대적인 광 단위)로 표현되었다.

상기 실시예 20 에서 기술된 바와 같이, DNA 주입 1, 2 및 8 일 후 (D1, D2 및 D8), 분비된 알칼리성 포스포타아제(SeAP)의 플라스마 수준을 측정하였다.

결과 및 논의

인간 폐암 종양 내로의 전기전달. 첫번째 실험에서, 근육 내 유전자 전기전달을 위해 일반적으로 사용되는 조건들이 사용되었고: 200 V/cm 의 전기장, 1 Hz진동수에서 8 펄스, 얻어진 결과는 300 내지 500 볼트/cm 범위의 더 높은 전압에서 얻어진 결과와 비교되었다. 두번째 실험의 목적은 최대의 트랜스펙션을 얻기 위해 사용되어야 하는 최적의 전압 조건 또는 400 내지 800 볼트/cm 범위의 전압을 결정하는 것이었다. 결과는 표 20 에 보인다.

인간 폐암 종양 내로의 전기전달

RLU/종양
	실험 1	실험 2
볼트/cm	평균	SEM	평균	SEM
0200300400500600800	32 807 758129 744 454585 033 3265 266 632 345	6 790 56539 119 425134 810 5341 473 785 460	4 723 3178 488 242 51914 201 644 5407 401 041 93011 884 115 963	10 163 3183 881 651 2016 162 551 2695 323 128 0474 048 340 474
플라스미드 pXL3031 을 암컷 누드 생쥐 내에서 200-300 ㎣의 표적 부피에 도달하였던 H1299 인간 폐암 종양 내로 주입하였다. 루시퍼라아제 발현의 평균값을 SEM 과 함께 보고한다.

표 20 에 의하면, DNA 가 후속적인 전기장의 적용 없이 주입되는 대조군에 비하여,

유전자 전달이, 200 내지 400 볼트/cm 의 적용되는 전압에 의존하는 방식으로, 500 볼트/cm 에서 시작하는, 얻어지는 최대 트랜스펙션에 상응하는 고지에 도달할 때까지 증가하고;

보다 높은 전압(600 내지 800 볼트/cm)에서는, 피부의 또는 더 깊은 화상이 얻어졌으나; 전달 유전자 발현은 감소하지 않았으며;

전기전달에 의한 유전자 전달의 증폭은 240 내지 320 배와 같음을 알 수 있다.

인간 대장 선암 종양 내로의 전기전달 두 실험의 결과가 표 21 에 제시된다. 전기전달이 없는 대조군과 비교하여, 600 볼트/cm 강도의 전기장의 적용은 전기전달이 없는 트랜스펙션 수준과 무관하게 최적의 트랜스펙션 율에 도달할 수 있게 하였다. 트랜스펙션은 각각 6 내지 32 배 향상되었고, 이는 400 내지 600 볼트/cm 사이에서 비교적 유사하였다.

인간 대장 선암 종양 내로의 전기전달

RLU/종양
	실험 1	실험 2
볼트/cm	평균	SEM	평균	SEM
0400500600	4 04 06216 037 13614 096 64024 223 872	1 827 2375 420 5727 629 2129 217 062	634 9995 537 35914 607 850	338 3113 571 4336 392 841
플라스미드 pXL3031을 암컷 누드 생쥐 내에서 100-200 ㎣의 표적 부피에 도달하였던 HT29 인간 대장 선암 종양 내로 주입하였다. 루시퍼라아제 발현의 평균값을 SEM 과 함께 보고한다. 본 실험에서 전극간 거리는 0.45 cm 였다.

쥐 섬유육종 종양 내로의 전기전달 두 실험의 결과를 표 22 에 보고한다. 전기전달이 없는 대조군과 비교하여, 300 내지 600 볼트/cm 강도의 전기장의 적용은 적용되는 전압과 무관하게 30 내지 70 배로 유전자 전달을 증진시켰다.

쥐의 섬유육종 종양 내로의 전기전달

RLU/종양
	실험 1	실험 2
Volt/cm	평균	SEM	평균	SEM
0300400500600	581 27026 296 35542 498 83216 966 612	348 64514 811 82631 152 74412 754 188	394 92211 579 94210 431 5746 034 95410 952 214	129 3954 615 3323 495 1181 818 4657 093 932
플라스미드 pXL3031을 암컷 C57Bl/6 생쥐 내에서 100-200 ㎣ 의 표적 체적에 도달하였던 쥐의LPB 섬유육종 내로 주입하였다. 루시퍼라아제 발현의 평균값을 SEM 과 함께 보고한다.

쥐의 흑종의 전기전달. 결과를 표 23 에 보고한다. 전기전달이 없는 대조군과 비교하여, 500 볼트/cm 강도의 전기장의 적용은 유전자 전달을 24 배 증진시켰다.

쥐의 흑종 종양의 전기전달

RLU/종양
Volt/cm	평균	SEM
0300500600	1 318 74014 275 48632 249 21817 215 505	667 5887 625 26212 605 0416 241 266
플라스미드 pXL3031을 암컷 C57Bl/6 생쥐 내에서 200-300 ㎣ 의 표적 부피에 도달하였던 쥐의 B16 흑종 종양 내로 주입하였다. 루시퍼라아제 발현의 평균값을 SEM과 함께 보고한다.

쥐의 폐암 종양의 전기전달 본 실험의 결과를 표 24 에 보고한다.

쥐의 폐암 종양의 전기전달

RLU/종양
볼트/cm	평균	SEM
0300500600	121 0803 715 877470 499 61253 275 350	37 3222 936 873237 588 44323 857 181
플라스미드 pXL3031을 암컷 C57Bl/6 생쥐 내에서 성장 5 일 후 30 ㎣ 의 표적 체적에 도달하였던 쥐의 3LL 폐암 종양 내로 주입하였다. 루시퍼라아제 발현의 평균값을 SEM과 함께 보고한다.

500 볼트/cm 강도의 전기장의 적용은 유전자 전달을 3885 배로 최적으로 증진시킨다. 이러한 인상적인 결과는 이들 종양이 이미 실험되었던 다른 종양들과 비교하여 전기전달이 없는 조건 하에서 천연 DNA 에 의해 매우 저조하게 전달될 수 있다는 사실과 관련이 있다.

인간 폐암 종양 내로의 분비된 전달 유전자의 전기전달. 본 실험의 결과를 표 25 에 보인다.

인간 폐암 종양 내로의 분비된 전달 유전자의 전기전달

플라스마 알칼리성 포스포타아제 수준
평가 시간	0 볼트/cm (AVG ±SEM)	500 볼트/cm (AVG ±SEM)
D1D2D8	1.42 ±0.071.40 ±0.011.31 ±0.01	8.90 ±1.749.04 ±1.551.67 ±0.12
플라스미드 pXL3031 (SeAP 를 발현하는)을 암컷 누드 생쥐 내에서 200-300 ㎣의 표적 부피에 도달하였던 인간 H1299 폐암 종양 내로 주입하였다. 루시퍼라아제 발현의 평균값을 SEM 과 함께 보고한다. 500V/cm의 단일 전기장을 적용하였고, 플라스마 내 SeAP 수준을 플라스마 주입 1, 2 및 8 일 후 측정하였다.

본 실험의 결과는, 전기전달 조건 하에 종양 세포의 트랜스펙션 후 플라스마 내 SeAP 수준에 있어서의 극적이고 일시적인 증가를 입증한다. GM-CSF 또는 IL-2와 같은 면역 자극 유전자의 종양에의 투여는 효율적인 양의 사이토킨을 제공하는 것으로 보인다. 더욱이, 이들 데이타는, 상기 보고된 루시퍼라아제 발현 데이터와 조합되어, HSV-티미딘 키나아제와 같은 자살 유전자와 함께 분비된 사이토킨의 투여가 강한 항-종양 반응을 유도할 것임을 암시한다. 대안적으로, SeAP 와 함께, 데이타는 유로키나아제의 아미노 말단 단편(ATF) 또는 안지오스타틴 (또는 엔도스타틴)과 같은 항-맥관형성 유전자로의 전기전달-중재 트랜스펙션이 또한 효율적인 종양 유전자 치료법이 될 것임을 암시한다.

상기 데이타는, 치료 유전자의 종양 세포 내로의 전기전달을 위한 장치가 400 내지 600 볼트/cm 강도, 최적으로 500 V/cm ±10% (즉, 250-550 V/cm) 강도의 최적의 전기장을 제공함을 더욱 입증한다.

본 발명은 본원에 기술된 특정 양태에 의해 범위가 제한되는 것이 아니다. 과연, 본원에 기술된 것 이외에 본 발명의 다양한 변경이 전술한 기술 및 첨부되는 도면으로 부터 당업자들에게 명백할 것이다. 그러한 변경은 첨부되는 청구항의 범위 내인 것으로 의도된다.

또한, 핵산 또는 폴리펩티드에 대하여 주어진 모든 염기의 크기 또는 핵산의 크기, 및 모든 분자량 또는 분자 질량값은 대략적인 것이며, 설명을 위해 제공된 것으로 이해되어야 한다.

다양한 논문들이 본원에서 인용되며, 그 개시는 전체로서 참고 자료로서 포함된다.

Claims (37)

1. 다세포성 진핵 생물체의 세포 내로 생체 내 핵산 전달을 위한 시스템으로서, 여기서 조직 세포는 조직 내로의 직접적인 투여 또는 경구 또는 전신적 투여에 의하여 전달되는 핵산과 접촉하게 되며, 상기 전달은 하나 이상의 1 내지 600 볼트/cm 범위의 강도를 가지는 전기 펄스의 조직으로의 적용에 의해 보증되는 시스템으로서,

   a) 1 밀리초 보다 큰 펄스 시간 및 0.1 내지 1,000 Hz 의 진동수에서 1 내지 600 볼트/cm 범위의 강도를 가지는 전기 펄스를 생성하는 전기 펄스 발생기; 및

   b) 전극과 접촉하는 조직 내에서 전기장을 발생시키기 위한, 전기 펄스 발생기에 연결된 전극을 포함하여 구성되는 시스템.
2. 제 1 항에 있어서, 전기 펄스 발생기가 1 내지 400 볼트/cm 범위의 강도를 가지는 펄스를 생성하는 시스템.
3. 제 1 항에 있어서, 전기 펄스 발생기가 30 내지 300 볼트/cm 범위의 강도를 가지는 펄스를 생성하는 시스템.
4. 제 1 항에 있어서, 전기 펄스 발생기가 10 밀리초 보다 큰 펄스 시간을 생성하는 시스템.
5. 제 1 항에 있어서, 전기 펄스 발생기가 2 내지 1,000 개의 펄스를 생성하는 시스템.
6. 제 1 항에 있어서, 전기 펄스 발생기가 서로에 대하여 불규칙적으로 펄스를 생성하므로써, 펄스의 시간 의존적인 전기장의 강도를 기술하는 함수가 가변적인 시스템.
7. 제 6 항에 있어서, 시간과 전기장의 변화를 기술하는 함수의 적분이 1 kV·msec/cm 를 초과하는 시스템.
8. 제 7 항에 있어서, 상기 적분이 5 kV·msec/cm 와 같거나 이를 초과하는 시스템.
9. 제 1 항에 있어서, 전기 펄스 발생기가 사각파 펄스, 지수적 감쇠파, 제한된 지속 기간의 진동 단극형파 및 제한된 지속 기간의 진동 양극형파로 구성되는 군으로 부터 선택되는 펄스를 생성하는 시스템.
10. 제 1 항에 있어서, 전기 펄스 발생기가 사각파를 생성하는 시스템.
11. 제 1 항에 있어서, 전극은 처리될 조직 상에 배치될 외부 전극인 시스템.
12. 제 1 항에 있어서, 전극은 처리될 조직 내에 이식가능한 내부 전극인 시스템.
13. 제 1 항에 있어서, 하나의 전극은 처리될 조직 상에 배치될 외부 전극이고, 또 하나의 전극은 처리될 조직 내에 이식 가능한 내부 전극인 시스템.
14. 제 13 항에 있어서, 외부 전극은 피검체의 외부와 큰 근육에 근접하여 접촉하도록 크기 조정되는 시스템.
15. 제 14 항에 있어서, 전극이 평판 전극인 시스템.
16. 제 14 항에 있어서, 전극이 반원통형 판 전극인 시스템.
17. 제 1 항에 있어서, 전극이 동맥 내 또는 정맥 내 전극인 시스템.
18. 제 12 항에 있어서, 내부 전극은 핵산 및 전기장의 동시 투여를 가능하게 하는 주사기 시스템인 시스템.
19. 제 18 항에 있어서, 전극은 처리될 조직 상에 배치될 외부 전극인 시스템.
20. 제 1 항에 있어서, 전극이 스테인레스 스틸 전극이 시스템.
21. 생체 내 조직 내에서 전기장을 발생시키기 위한 전극에 연결된 전기 펄스를 생성하기 위한 수단을 포함하는, 다세포성 진핵 생물체의 세포 내로 생체 내 핵산 전달을 위한 개선된 장치로서, 여기서의 개선점은 전기 펄스를 생성하기 위한 수단으로 하여금 1 밀리초 보다 큰 펄스 시간 및 0.1 내지 1,000 Hz 의 진동수에서 1 내지 600 볼트/cm 범위의 강도를 가지는 펄스를 생성하도록 함을 포함하는 장치.
22. 제 21 항에 있어서, 전기 펄스를 생성하기 위한 수단은 1 내지 400 볼트/cm 범위의 강도를 가지는 펄스를 생성하는 장치.
23. 제 21 항에 있어서, 유연한 카테테르 장치인 장치.
24. 제 21 항에 있어서, 조직 침투 전극에 의해 핵산을 조직 내로 이식하기 위한 장치인 장치.
25. 제 24 항에 있어서, 조직 침투 전극이 바늘인 장치.
26. 제 21 항에 있어서, 핵산을 피검체의 표면 조직의 세포 내로 전달하기 위한 장치인 장치.
27. 제 21 항에 있어서, 전기 펄스를 생성하기 위한 수단이, 600 볼트/cm 에 상응하는 전압을 초과하지 않도록 전압 게이트를 개조하므로써, 1 내지 600 볼트/cm 범위의 펄스를 생성하도록 적응되는 장치.
28. 제 27 항에 있어서, 전압이 일정 전압에 고정되고, 전극이 일정 이격 거리로 고정되는 장치.
29. 제 21 항에 있어서, 전기 펄스를 생성하기 위한 수단이, 600 볼트/cm 에 상응하는 전압을 초과하지 않도록 장치를 라벨링하므로써, 1 내지 600 볼트/cm 범위의 펄스를 생성하도록 적응되는 장치.
30. 제 21 항에 있어서, 전기 펄스를 생성하기 위한 수단이 30 내지 300 볼트/cm 범위의 강도를 가지는 펄스를 생성하는 장치.
31. 제 21 항에 있어서, 전기 펄스를 생성하기 위한 수단이 400 내지 600 볼트/cm 범위의 강도를 가지는 펄스를 생성하는 장치.
32. 제 21 항에 있어서, 전기 펄스를 생성하기 위한 수단이 10 밀리초 보다 큰 펄스 시간을 생성하는 장치.
33. 제 21 항에 있어서, 전기 펄스를 생성하기 위한 수단이 2 내지 1,000 개의 펄스를 생성하는 장치.
34. 제 21 항에 있어서, 전기 펄스를 생성하기 위한 수단이 서로에 대하여 불규칙적으로 펄스를 생성하므로써, 펄스의 시간 의존적인 전기장의 강도를 기술하는 함수가 가변적인 장치.
35. 제 21 항에 있어서, 전기 펄스를 생성하기 위한 수단이 사각파 펄스, 지수적 감쇠파, 제한된 지속 기간의 진동 단극형파 및 제한된 지속 기간의 진동 양극형파로 구성되는 군으로 부터 선택되는 펄스를 생성하는 장치.
36. 제 21 항에 있어서, 전기 펄스를 생성하기 위한 수단이 삭각파 펄스를 생성하는 장치.
37. 제 21 항에 있어서, 전극이 스테인레스 스틸 전극인 장치.