JP2007514407A - 細胞の透過処理用方法及び装置 - Google Patents
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Abstract
Description
1.一つ以上の細胞を一時的に透過性にするに当たり、
a)上記一つ以上の細胞を固体表面から有効な距離内の実質的に静止した位置に維持し、及び
b)前記固体表面に、上記一つ以上の細胞の特定の3次元的な位置を前もって認識することなく、該一つ以上の細胞の膜の透過化を誘導するに十分な電磁放射線を指向させ、ここで前記一つ以上の細胞を電磁放射線の経路に一致させることを備える細胞を一時的に透過性にする方法。
2.前記電磁放射線が前記の固体表面で多くても約0.001、0.002、0.003、0.006、0.01、0.02、0.03、0.06、0.1、0.2、0.3、0.6、1、2、3、4、5、6μJ/μm2を含む群より選択されるエネルギー密度を有する段落1の方法。
3.前記電磁放射線が前記固体表面で約0.001から約0.3pJ/μm2のエネルギー密度を有する段落1の方法。
4.前記有効距離が約1000μm未満、600μm、 300μm、 200μm、100μm、60μm、30μm、20μm、10μm、6μm、3μm、2μm、1μmからなる郡より選択される段落1の方法。
5.前記有効距離が約1μmから約20μmである段落1の方法。
6.前記電磁放射線を前記一つ以上の細胞に、多くても約1000秒、100秒、10秒、1秒、100ミリ秒、10ミリ秒、1ミリ秒、100マイクロ秒、10マイクロ秒、1 マイクロ秒、100ナノ秒、10ナノ秒、1ナノ秒、100ピコ秒、10ピコ秒、1ピコ秒、100フェムト秒、10フェムト秒、1フェムト秒、100アット秒、 10アット秒、及び1アット秒程度の群より選択される期間指向させる段落1の方法。
7.前記一つ以上の細胞を電磁放射線に約100ピコ秒から約10秒の期間暴露する段落1の方法。
8.前記方向付けが前記固体表面に放射線のパルスを供給することからなる段落1の方法。
9.前記方向付けが放射線のビームを経路のパターンに従って前記固体表面に通すことからなる段落1の方法。
10.前記一つ以上の細胞の膜の透過化を、少なくとも10、30、 100、300、1000、3000、10,000、30,000、100,000、300,000、1,000, 000、3, 000,000、10,000, 000、30, 000,000、100,000, 000、240, 000, 000細胞/秒の郡より選択される割合で誘導することを更に備える段落1の方法。
11.前記一つ以上の細胞の膜の透過化を、約300から約10,000,000細胞/秒の割合で誘導することを更に備える段落1の方法。
12.前記一つ以上の細胞の膜の透過化後の細胞の生存確率を、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%からなる郡より選択される割合で維持する段落1の方法。
13.前記透過化後の一つ以上の細胞の生存確率を、少なくとも50%から少なくとも90%の値で維持する段落1の方法。
14.前記一つ以上の細胞を非等張水性媒体と接触させることを更に備える段落1の方法。
15.前記透過膜内の物質が前記透過膜を通過できるように前記一つ以上の細胞を水性媒体と接触させることを更に備える段落1の方法。
16.前記一つ以上の細胞を透過膜を介して出て行くことができる物質を含む水性媒体に前記一つ以上の細胞を接触させる段落1の方法。
17.前記物質がイオン、有機分子、無機分子、及びコロイド粒子からなる郡より選択される段落16の方法。
18.前記物質が多糖類、ペプチド、たんぱく質、核酸、及び変性核酸からなる郡より選択される段落16の方法。
19.前記物質が透過膜を通して前記一つ以上の細胞を取り込む段落16の方法。
20.前記透過膜が、大体約0.3ミリ秒、1ミリ秒、3ミリ秒、10ミリ秒、30ミリ秒、100ミリ秒、300ミリ秒、1秒、 3秒、10秒、30秒、1分、2分、3 分、6分、10分、20分、30分からなる郡より選択される時間内に実質的に非透過性状態に回復する段落19の方法。
21.前記透過膜が約1秒間から約1分間の時間内に実質的に非透過性状態に回復する段落19の方法。
22.前記電磁放射線を前記固体表面の領域に少なくとも約0.0001, 0.0003, 0.001, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1,3, 10,30, 100,200, 300及び400cm2/秒からなる群から選択される割合で指向させる段落1の方法。
23.前記電磁放射線を前記固体表面表面の領域に約0.0003から約10平方センチメートル/秒の割合で指向させる段落1の方法。
24.前記電磁放射線が前記固体表面で約1×104W/cm2未満の出力密度を有する段落1の方法。
25.前記電磁放射線が前記固体表面で約1×104から約6×107W/cm2の出力密度を有する段落1の方法。
26.前記方向付けが、前記固体表面に放射線の2つ以上のパルスを少なくとも1、10、100、103、104、105、106、107、108、及び109Hzからなる群より選択される割合で供給することを備える段落1の方法。
27.前記方向付けが、前記固体表面に約102から約104Hzの割合で2つ以上の放射線のパルスを供給することを備える段落1の方法。
28.前記電磁放射線が、連続波レーザー、パルスレーザー、連続ランプ、及びフラッシュランプからなる群から選択されるエネルギー源から生ずる段落1の方法。
29.前記方向付けが、2つ以上の電磁放射線のパルスを前記固体表面にパルスの目的パターンに従って供給することを備える段落1の方法。
30.前記電磁放射線パルスの個々のパルスが、多くても約1000秒、100秒、10秒、1秒、100ミリ秒、10ミリ秒、1ミリ秒、100マイクロ秒、10マイクロ秒、1 マイクロ秒、100ナノ秒、10ナノ秒、1ナノ秒、100ピコ秒、10ピコ秒、1ピコ秒、100フェムト秒、10フェムト秒、1フェムト秒、100アット秒、 10アット秒、及び1アット秒程度からなる群より選択される持続時間を有する段落29の方法。
31.前記電磁放射線パルスの個々のパルスが約100ピコ秒から約10秒の持続時間を有する段落29の方法。
32.電磁放射線の少なくとも2つのパルスを前記パルスの目的パターン内の単一のパルスの目的物に指向させる段落29の方法。
33.前記電磁放射線を前記固体表面上の所定領域に指向させ、該所定領域が少なくとも0.0001、0.0003、0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、200、300、及び400平方センチメートルからなる群から選択される領域を有する段落1の方法。
34.前記電磁放射線を前期固体表面上の所定領域に指向させ、該所定領域が約0.0001から約10cm2の領域を有する段落1の方法。
35.前記電磁放射線を前記所定領域のほぼ全体に同時に指向させる段落1の方法。
36.前記電磁放射線の経路が少なくとも10、12、 14、16、 18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、 100、300、l×103、2×103、 3×103、4×103、5×103、6×103、7×103、8×103、9×103、及び1×104μmからなる群より選択される幅を有する段落1の方法。
37.前記電磁放射線の経路が約10から約1000μmの幅を有する段落1の方法。
38.細胞を一時的に透過性にするための装置で、
a)細胞膜の透過化を誘導するに十分な電磁放射線を放射するエネルギー源、ここで前記細胞が実質的に静止して所定容量に含まれ、該所定容量内での細胞の特定の座標が不明であり、前記所定容量を一部固体表面により境界付けし、
b)前記所定容量のほぼ全体に前記電磁放射線を指向させるように構成した方向付け装置、ここで前記細胞を前記電磁放射線の経路と一致させ、該所定容量内の電磁放射線が前記固体表面でたかだか約6μJ/μm2のエネルギー密度を有し、及び
c)前記固体表面
を備える装置。
39.前記所定容量内の電磁放射線が固体表面上で、多くとも約0.001、0.002、 0.003、0.006、 0.01、 0.02、 0.03、0.06、0.1、0.2、0.3、0.6、1、2、3、4、及び5μJ/μm2からなる群より選択されるエネルギー密度を有する段落38の装置。
40.前記所定容量内の電磁放射線が固体表面上で、多くとも約0.001から約0.3μJ/μm2のエネルギー密度を有する段落38の装置。
41.前記方向付け装置が、電磁放射線のパルスを前記所定容量にパルスの目的パターンに従って指向させる段落38の装置。
42.前記電磁放射線パルスの個々のパルスが多くても約1000秒、100秒、10秒、1秒、100ミリ秒、10ミリ秒、1ミリ秒、100マイクロ秒、10マイクロ秒、1 マイクロ秒、100ナノ秒、10ナノ秒、1ナノ秒、100ピコ秒、10ピコ秒、1ピコ秒、100フェムト秒、10フェムト秒、1フェムト秒、100アット秒、 10アット秒、及び1アット秒程度からなる群より選択される持続時間を有する段落40の装置。
43.前記電磁放射線パルスの個々のパルスが約10秒から約100ピコ秒の持続時間を有する段落40の装置。
44.少なくとも2つの電磁放射線のパルスを前記パルスの目的パターン内の単一のパルスの目的物に指向させる段落40の装置。
45.前記電磁放射線の経路が少なくとも10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、 90、100、300、l×103、2×103、 3×103、 4×103、 5×103、 6×103、7×103、 8×103、9×103、及び1×104マイクロメートルからなる群より選択される幅を有する段落38の装置。
46.前記電磁放射線の経路が約10マイクロメートルから約1000マイクロメートルの幅を有する段落38の装置。
47.細胞を一時的に透過性にするための装置で、
a)細胞膜の透過化を誘導するに十分な電磁放射線を発するエネルギー源、ここで前記細胞が所定容量に含まれる実質的に静止した細胞で、前記所定容量内での細胞の特定の座標が未知で、
b)前記所定容量のほぼ全体に電磁放射線を指向させるための命令、及び
c)前記命令に応じて前記電磁放射線を指向させるように構成した方向付け装置、
を備える装置。
48.前記命令が電磁放射線のパルスをパルスの目的パターンに従って指向させるための命令からなる段落47の装置。
49、前記電磁放射線パルスの個々のパルスが多くても約1000秒、100秒、10秒、1秒、100ミリ秒、10ミリ秒、1ミリ秒、100マイクロ秒、10マイクロ秒、1 マイクロ秒、100ナノ秒、10ナノ秒、1ナノ秒、100ピコ秒、10ピコ秒、1ピコ秒、100フェムト秒、10フェムト秒、1フェムト秒、100アット秒、 10アット秒、及び1アット秒程度からなる群より選択される持続時間を有する段落48の装置。
50.前記電磁放射線パルスの個々のパルスが約100ピコ秒から約10秒の持続時間を有する段落48の装置。
51.少なくとも2つの電磁放射線のパルスを前記パルスの目的パターン内の単一のパルスの目的物に指向させる段落48の装置。
52.前記所定容量内の電磁放射線が前記固体表面上で、多くとも約0.001、0.002、 0.003、0.006、 0.01、 0.02、 0.03、0.06、0.1、0.2、0.3、0.6、1、2、3、4、及び5μJ/μm2からなる群より選択されるエネルギー密度を有する段落47の装置。
53.前記所定容量内の電磁放射線が前記固体表面上で、多くとも約0.001から約0.3μJ/μm2のエネルギー密度を有する段落47の装置。
54.前記所定容量内の電磁放射線の瞬時の経路が少なくとも10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、 90、100、300、l×103、2×103、 3×103、 4×103、 5×103、 6×103、7×103、 8×103、9×103、及び1×104μmからなる群より選択される幅を有する段落47の装置。
55.前記所定容量内の電磁放射線の瞬時の経路が約10から約1000μmの幅を有する段落47の装置。
56.細胞を一時的に透過性にするための装置で、
a)細胞膜の透過化を誘導するに十分な電磁放射線を発するエネルギー源で、ここで前記細胞が所定容量に含まれる実質的に静止した細胞で、前記所定容量内の細胞の特定の座標が未知で、前記所定容量を固体表面により部分的に境界付けし、
b)前記所定容量のほぼ全体に前記電磁放射線のパルスをパルスの目的パターンに従って指向させるように構成した方向付け装置、及び
c)前記の固体表面、
を備える装置。
57.前記電磁放射線パルスの個々のパルスが多くても約1000秒、100秒、10秒、1秒、100ミリ秒、10ミリ秒、1ミリ秒、100マイクロ秒、10マイクロ秒、1 マイクロ秒、100ナノ秒、10ナノ秒、1ナノ秒、100ピコ秒、10ピコ秒、1ピコ秒、100フェムト秒、10フェムト秒、1フェムト秒、100アット秒、 10アット秒、及び1アット秒程度からなる群より選択される持続時間を有する段落56の装置。
58.前記電磁放射線パルスの個々のパルスが約100ピコ秒から約10秒の持続時間を有する段落56の装置。
59.少なくとも2つの電磁放射線のパルスを前記のパルスの目的パターン内の単一のパルスの目的物に指向させる段落56の装置。
60.前記の所定容量内での前記電磁放射線パルスの個々のパルスが少なくとも約10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、 90、100、300、l×103、2×103、 3×103、 4×103、 5×103、 6×103、7×103、 8×103、9×103、及び1×104μmからなる群より選択される幅を有する段落56の装置。
61.前記所定容量内の前記電磁放射線パルスの個々のパルスが約10から約1000μmの幅を有する段落56の装置。
62.細胞を一時的に透過性にするための装置で、
a)細胞膜の透過化を誘導するに十分な電磁放射線を発するエネルギー源で、ここで前記細胞が所定容量に含まれる実質的に静止した細胞で、前記所定容量内での細胞の特定の座標が未知で、
b)前記所定容量のほぼ全体に電磁放射線のパルスをパルスの目的パターンに従って指向させるための命令、及び
c)前記命令に応じて前記電磁放射線を指向させるように構成した方向付け装置
を備える装置。
63.前記電磁放射線パルスの個々のパルスが多くても約1000秒、100秒、10秒、1秒、100ミリ秒、10ミリ秒、1ミリ秒、100マイクロ秒、10マイクロ秒、1 マイクロ秒、100ナノ秒、10ナノ秒、1ナノ秒、100ピコ秒、10ピコ秒、1ピコ秒、100フェムト秒、10フェムト秒、1フェムト秒、100アット秒、 10アット秒、及び1アット秒程度からなる群より選択される持続時間を有する段落62の装置。
64.前記電磁放射線パルスの個々のパルスが約100ピコ秒から約10秒の持続時間を有する段落62の装置。
65.少なくとも2つの電磁放射線のパルスをパルスの目的パターン内の単一のパルスの目的物に指向させる段落62の装置。
66.前記所定容量内の前記電磁放射線パルスの個々のパルスが少なくとも約10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、 90、100、300、l×103、2×103、 3×103、 4×103、 5×103、 6×103、7×103、 8×103、9×103、及び1×104マイクロメートルからなる群より選択される幅を有する段落62の装置。
67.前記所定容量内の前記電磁放射線パルスの個々のパルスが約10から約1000μmの幅を有する段落62の装置。
68.細胞を一時的に透過性にするに当たり、
a)前記細胞を所定容量内で実質的に静止した位置に維持し、ここで前記所定容量を固体表面により部分的に境界付けし、更に固体表面から有効な距離により境界付けし、
b)細胞膜の一時的な透過化を誘導するに十分な電磁放射線を前記所定容量のほぼ全体に指向させることを備える細胞を一時的に透過性にする方法。
69.前記所定容量内の前記電磁放射線が固体表面上で多くとも約0.001、0.002、 0.003、0.006、 0.01、 0.02、 0.03、0.06、0.1、0.2、0.3、0.6、1、2、3、4、5、及び6μJ/μm2からなる群より選択されるエネルギー密度を有する段落の68の方法。
70.前記所定容量内の前記電磁放射線が固体表面上で多くとも約0.001から約0.3μJ/μm2のエネルギー密度を有する段落68の方法。
71.前記有効な距離が1000μm、600μm、300μm、200μm、100μm、60μm、30μm、20μm、10μm、6μm、3μm、2μm、及び1μmからなる群より選択される段落68の方法。
72.前記有効な距離が約1μmから約20μmである段落68の方法。
73.前記細胞を前記電磁放射線に多くても約1000秒、100秒、10秒、1秒、100ミリ秒、10ミリ秒、1ミリ秒、100マイクロ秒、10マイクロ秒、1 マイクロ秒、100ナノ秒、10ナノ秒、1ナノ秒、100ピコ秒、10ピコ秒、1ピコ秒、100フェムト秒、10フェムト秒、1フェムト秒、100アット秒、 10アット秒、及び1アット秒程度からなる群より選択される期間暴露する段落68の方法。
74.前記細胞を前記電磁放射線に約100ピコ秒から約10秒の期間暴露する段落68の方法。
75.前記方向付けが、前記所定容量に放射線のパルスを供給することを備える段落68の方法。
76.前記方向付けが、放射線のビームを経路のパターンに従って前記所定容量に通すことを備える段落68の方法。
77. 細胞の透過化を少なくとも 10、30、100、300、1000、3000、10,000、30,000、 100,000、300,000、1,000, 000、3, 000,000、 10,000, 000、30, 000,000、100,000, 000、及び240,000, 000細胞/秒からなる群より選択される割合で誘導することを更に備える段落68の方法。
78.細胞の透過化を約300から約10,000, 000細胞/秒の割合で誘導することを備える段落68の方法。
79.前記透過化後の細胞の生存確率を少なくとも50%、 60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、及び99%からなる群より選択される値で維持する段落68の方法。
80.前記透過化後の細胞の生存確率を少なくとも約50%から約90%の値で維持する段落68の方法。
81.前記細胞を非等張水性媒体に接触させることを更に備える段落68の方法。
82.前記細胞を透過膜を介して通過し得る物質を含む水性媒体と接触させる段落68の方法。
83.前記物質がイオン、有機分子、無機分子、多糖類、ペプチド、たんぱく質、コロイド粒子、核酸、及び変性核酸からなる群より選択される段落82の方法。
84.前記物質が透過膜を介して前記細胞を取り込む段落82の方法。
85.前記透過膜が実質的に非透過性状態に大体0.3 m秒、1m秒、3m秒、10m秒、30m秒、100m秒、300 m秒、1秒、3秒、10秒、30秒、1分、2分、3分、6分、10分、20分、及び30分からなる群より選択される時間内で回復する段落84の方法。
86.前記透過膜が実質的に非透過性状態に約1秒から約1分の時間内で回復する段落84の方法。
87.前記電磁放射線を前記固体表面の領域に少なくとも0.0001、0.0003、0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1,3、10、30、100、200、300、及び400cm2/秒からなる群より選択される割合で指向させる段落68の方法。
88.前記電磁放射線を前記固体表面の領域に約0.0003から約10平方センチメートル/秒の割合で指向させる段落68の方法。
89.前記電磁放射線が前記所定容量内で約6×107未満、3×107、2×107、l×107、6×106、3×106、2×106、l×106、6×105、3×105、2×105、l×105、6×104、3×104、2×104、及び1×104 W/cm2からなる群より選択される出力密度を有する段落68の方法。
90.前記方向付けが、前記所定容量に2つ以上の放射線のパルスを少なくとも1、10、100、103、104、105、 106、107、108、及び109 Hzからなる群より選択される割合で供給することを備える段落68の方法。
91.前記方向付けが、前記所定容量に2つ以上の放射線のパルスを約102から約104の割合で供給することを備える段落68の方法。
92.前記電磁放射線が、持続波レーザー、パルスレーザー、持続ランプ、及び閃光灯からなる群より選択されるエネルギー源から発する段落68の方法。
93.2つ以上の電磁放射線のパルスを前記所定容量にパルスの目的パターンに従って供給することを備える段落68の方法。
94.前記電磁放射線パルスの個々のパルスが多くても約1000秒、100秒、10秒、1秒、100ミリ秒、10ミリ秒、1ミリ秒、100マイクロ秒、10マイクロ秒、1 マイクロ秒、100ナノ秒、10ナノ秒、1ナノ秒、100ピコ秒、10ピコ秒、1ピコ秒、100フェムト秒、10フェムト秒、1フェムト秒、100アット秒、 10アット秒、及び1アット秒程度からなる群より選択される持続時間を有する段落93の方法。
95.前記電磁放射線パルスの個々のパルスが約100ピコ秒から約10秒の持続時間を有する段落93の方法。
96.少なくとも2つの電磁放射線のパルスを前記パルスの目的パターン内の単一のパルスの目的物に指向させる段落93の方法。
97.前記電磁放射線を前記固体表面上の所定領域に指向させ、該所定領域が少なくとも0.0001、0.0003、0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1,3、10、30、100、200、300,及び400平方センチメートルからなる群より選択される領域である段落68の方法。
98.前記電磁放射線を前記固体表面上の所定領域に指向させ、該所定領域が約0.0001から約10平方センチメートルの領域である段落68の方法。
99.前記電磁放射線を前記所定容量のほぼ全体に同時に施行させる段落68の方法。
100.前記所定容量内の前記電磁放射線の経路が少なくとも10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、 90、100、300、l×103、2×103、 3×103、 4×103、 5×103、 6×103、7×103、 8×103、9×103、及び1×104マイクロメートルからなる群より選択される幅を有する段落68の方法。
101.前記所定容量内の前記電磁放射線の経路が約10から約1000マイクロメートルの幅を有する段落68の方法。
102.細胞を一時的に透過性にするための装置で、
a)細胞膜の透過化を誘導するに十分な電磁放射線を発するエネルギー源で、ここで前記細胞を実質的に静止し所定容量に含まれ、該所定容量内での細胞の特定の座標が未知で、
b)前記所定容量内の複数の位置に、該複数の位置の特徴によらず前記電磁放射線を指向させるための命令、及び該命令に応じて前記電磁放射線を指向させるように構成した方向付け装置
とを備える装置。
103.細胞を一時的に透過性にするための装置で、
a)細胞膜の透過化を誘導するに十分な電磁放射線を発するエネルギー源で、ここで前記細胞を実質的に静止し所定容量に含まれ、該所定容量内での細胞の特定の座標が未知で、
b)前記所定容量内の複数の位置に、該複数の位置の特徴によらず前記電磁放射線を指向させるための命令で、ここで前記所定容量内の前記電磁放射線が固体表面上で大体6μJ/μm2のエネルギー密度を有し、及び
c)前記の命令に応じて前記電磁放射線を指向させるように構成した方向付け装置
を備える装置。
104. 一連の指令を備える記憶システムで、該指令を実行すると、コンピュータが実質的に静止した細胞の膜の透過化を誘導するに十分な電磁放射線を該細胞の特定の3次元的な位置を前もって認識することなく固体表面に指向させることを備える動作を実行し、ここで前記細胞を前記電磁放射線の経路に一致させる記憶システム。
105.前記一つ以上の細胞を、物質を含まないか又は該一つ以上の細胞内の物質の濃度より低い濃度で前記物質を含む水性媒体と、前記一つ以上の細胞内の物質が一時的な透過膜を介して該一つ以上の細胞を出し得るように接触させる請求項1の方法。
106.前記物質がイオン、有機分子、無機分子、コロイド粒子、多糖類、ペプチド、タンパク質、核酸、及び変性核酸からなる群より選択される請求項105の方法。
107.前記一つ以上の細胞を水性媒体と、該水性媒体内の物質が一時的な透過膜を介して前期一つ以上の細胞を取り込み得るように接触させる請求項1の方法。
108.前記物質がイオン、有機分子、無機分子、コロイド粒子、多糖類、ペプチド、タンパク質、核酸、及び変性核酸からなる群より選択される請求項107の方法。
109.前記一時的な透過膜が、大体約0.3ミリ秒、1ミリ秒、3ミリ秒、10ミリ秒、30ミリ秒、100ミリ秒、300ミリ秒、1秒、 3秒、10秒、30秒、1分、2分、3 分、6分、10分、20分、30分からなる郡より選択される時間内に実質的に非透過性状態に回復する請求項107の方法。
110.前記一時的な透過膜が約1秒間から約1分の時間内に実質的に非透過性状態に回復する請求項107の方法。
哺乳動物細胞におけるRNA干渉(RNAi)を介した効果的な遺伝子抑制に関する最近の発見以降(Elbashir.,S. M. , Harborth, J. , Lendeckel, W. , Yalcin, A., Weber, K. , & Tuschl, T. 2001. 哺乳動物の培養細胞における、2本鎖の21ヌクレオチドのRNAを介したRNA干渉。Nature, 411: 494-498;この全文を引用し本願に援用する)、学術研究者及び企業研究者の両方によって、発見及び治療への応用の両方に関して有意義な検証が行われ、関心が持たれてきている。RNAiは従来の遺伝子抑制に関するアンチセンス技術よりも多くの利点があり、これは多くの有用なモデル系に関する近年の多くの報告をもたらしている。しかし、核酸は完全な生きた細胞の膜を容易に通過しないので、これまでの報告のほとんどはRNAiを導入するために既存の細胞への遺伝子導入法を使用することに関する限界について述べている。RNAiは潜在的に非常に強力な手段であるけれども、高効率で高生存率の利用可能な遺伝子導入法がない。レーザーを介したオプトインジェクションが他の技術に付随する多くの限界を乗り越える可能性を具備している。
この実施例では、SU−DHL−6細胞内でのbcl−2/IgH遺伝子抑制をsiRNAのオプトインジェクションで達成して細胞の増殖を抑制(図10)し、これは細胞機能に影響する機能的なsiRNAの供給を明確に示す。細胞をRPMI1640及び10%FBSを有する384ウェルプレート中一ウェル当たり500細胞で成育させた。bcl−2をコードするsiRNAを1%のHSAをふくむPBS中に10nMの濃度で加えた。この実施例では、所定容量がウェルの全面積(約0.03平方センチメートル)と、約10−20マイクロメートルの有効な距離とを備える。これはSU−DHL−6細胞が固体表面に付着して成長しないからである。25μm直径ビームの532nmの光のショットを25マイクロメートル間隔のグリッドパターンにおいて1パルスあたり10μJ及び0.5ナノ秒のパルス幅(1パルスあたり0.01μJ/μm2のエネルギー密度と、2×109W/cm2のピーク出力密度とを生じ、試料中の所定容量への伝達効率が50%であると考えられている)で用いて細胞のオプトインジェクションを行った。この実施例では、所定容量を約4秒で照射するように、パルスを1秒あたり1200回の割合で発火した。オプティインジェクションの後直ちに細胞を洗浄し、成育媒体を加え、次いで細胞を培養した。24時間後、細胞の生存率は50%より大きかった。細胞を全10日間培養し、細胞数を2、4、6、8、及び10日目に数えた。効果的な細胞の透過化、ローディング、遺伝子抑制に加えて、これらのデータはsiRNAの存在無しでもしくは無関係の目標(すなわちGFP)に対するsiRNAでのオプトインジェクション後の通常の細胞の成育を示す。
細胞外の媒体からのイオンを細胞に負荷しうることを実証するために、極めて低い細胞内量を有するZn2+をオプトインジェクション用に選択した。まず、NIH―3T3細胞を、バッファーとして[Zn2+]0=1mMを有するPBSを使用してZn2+感受性の指示薬(RhodZin−1;モレキュラープローブス社、ユージーン、OR)で染色した。所定領域の周囲(約0.001平方センチメートル)が図11中で明確に視認できる。これらの細胞が固体表面に付着して増殖するので、有効な距離は数マイクロメートルである。2μJ/pulse及び10ナノ秒パルス幅である523nmの波長のパルス化レーザービームを直径30μm(1パルスあたり0.001μJ/μm2のエネルギー密度と、1×107W/cm2のピーク出力密度とを生じ、、試料の所定容量に対する伝達効率は50%と考えられる)に集中させ、所定のグリッドパターン内の隣接ショット間の距離がx及びy方向の両方とも50μmであるようにパルスを連続的に発火、導いた。図11は530nmで励起し590nmで発光を検出した蛍光画像を示す。パネルAは、約0の基底[Zn2+]iでの細胞が極めて低い蛍光強度を有することを示す。パネルBは、オプトインジェクション後の細胞を示し、ここで所定容量内の細胞(すなわち左下の隅)が[Zn2+]iの増加により増大したRhodZin−1の蛍光強度を有する。これら条件下での細胞の生存率が90%より大きいことを確認した。この結果は、高[Zn2+]0存在下で所定容量内の細胞へのレーザー照射が[Zn2+]iの増加を生ずることを実証する。この実験は、細胞基質へのイオンの流入が細胞内の貯蔵よりもむしろ細胞外の媒体からであることを更に示す。
以下に引用した全ての文献についてその全体を本願に引用して援用する。
Proc.SPIE, 3260 : 38-44.
Claims (44)
- a)一つ以上の細胞を固体表面から有効な距離内の実質的に静止した位置に維持し、及び
b)前記固体表面に、上記一つ以上の特定の3次元的な位置は前もって認識することなく、該一つ以上の細胞の膜の透過化を誘導するに十分な電磁放射線を指向させ、ここで前記一つ以上の細胞を前記電磁放射線の経路に一致させることを備える
ことを特徴とする一つ以上の細胞を一時的に透過性にする方法。 - 前記電磁放射線が前記固体表面で多くても約0.001、0.002、0.003、0.006、0.01、0.02、0.03、0.06、0.1、0.2、0.3、0.6、1、2、3、4、5、及び6μJ/μm2からなる群より選択されるエネルギー密度を有する請求項1記載の方法。
- 前記電磁放射線が前記固体表面で約0.001から約0.3pJ/μm2のエネルギー密度を有する請求項1記載の方法。
- 前記有効な距離が約1000μm未満、600μm、 300μm、 200μm、100μm、60μm、30μm、20μm、10μm、6μm、3μm、2μm、及び1μmからなる郡より選択される請求項1記載の方法。
- 前記有効な距離が約1μmから約20μmである請求項1記載の方法。
- 前記電磁放射線を前記一つ以上の細胞に多くても約1000秒、100秒、10秒、1秒、100ミリ秒、10ミリ秒、1ミリ秒、100マイクロ秒、10マイクロ秒、1 マイクロ秒、100ナノ秒、10ナノ秒、1ナノ秒、100ピコ秒、10ピコ秒、1ピコ秒、100フェムト秒、10フェムト秒、1フェムト秒、100アット秒、 10アット秒、及び1アット秒からなる群より選択される期間指向させる請求項1記載の方法。
- 前記一つ以上の細胞に前記電磁放射線を約100ピコ秒から約10秒の期間照射する請求項1記載の方法。
- 前記方向付けが、固体表面に放射線のパルスを供給することを備える請求項1記載の方法。
- 前記方向付けが放射線のビームを経路のパターンに従って前記の固体表面に通すことを備える請求項1記載の方法。
- 前記一つ以上の細胞の膜の一時的透過化を、少なくとも10、30、 100、300、1000、3000、10,000、30,000、100,000、300,000、1,000, 000、3, 000,000、10,000, 000、30, 000,000、100,000, 000、240, 000, 000細胞/秒からなる郡より選択される割合で誘導することを更に備える請求項1記載の方法。
- 前記一つ以上の細胞の膜の一時的透過化を、約300から約10,000,000細胞/秒の割合で誘導することを更に備える請求項1記載の方法。
- 前記一つ以上の細胞の膜の一時的透過化後の細胞の生存確率を、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%からなる郡より選択される割合で維持する請求項1記載の方法。
- 前記一時的透過化後の前記一つ以上の細胞の生存確率を、少なくとも50%から少なくとも90%の値で維持する請求項1記載の方法。
- 前記一つ以上の細胞を非等張水性媒体と接触させることを更に備える請求項1記載の方法。
- 前記一つ以上の細胞が、物質の無い又は前記一つ以上の細胞内の物質の濃度よりも低い濃度で該物質を含む水性媒体と、前記一つ以上の細胞内の物質が一時的透過膜を介して一つ以上の細胞を出すことができるように接触する請求項1記載の方法。
- 前記物質がイオン、有機分子、無機分子、コロイド粒子、多糖類、ペプチド、たんぱく質、核酸及び変性核酸からなる郡より選択される請求項15記載の方法。
- 前記一つ以上の細胞が水性媒体と、該水性媒体内の物質が一時的透過膜を介して前記一つ以上の細胞を取り込み得るように接触する請求項1記載の方法。
- 前記物質がイオン、有機分子、無機分子、コロイド粒子、多糖類、ペプチド、タンパク質、核酸及び変性核酸からなる群より選択される請求項17記載の方法。
- 前記一時的透過膜が、大体約0.3m秒、1m秒、3m秒、10m秒、30m秒、100m秒、300m秒、1秒、 3秒、10秒、30秒、1分、2分、3 分、6分、10分、20分、30分からなる郡より選択される時間内に実質的に非透過性状態に回復する請求項17記載の方法。
- 前記一時的透過膜が、約1秒間から約1分間の時間内に実質的に非透過性状態に回復する請求項17記載の方法。
- 前記電磁放射線を前記固体表面の領域に少なくとも約0.0001, 0.0003, 0.001, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1,3, 10,30, 100,200, 300及び400cm2/秒からなる群から選択される割合で指向させる請求項1記載の方法。
- 前記電磁放射線を前記固体表面の領域に約0.0003から約10cm2/秒の割合で指向させる請求項1記載の方法。
- 前記方向付けが、前記固体表面に2つ以上の放射線のパルスを上から少なくとも1、10、100、103、104、105、106、107、108、及び109Hzからなる群より選択される割合で供給することを備える請求項1記載の方法。
- 前記方向付けが、前記固体表面に2つ以上の放射線のパルスを約102から約104Hzの割合で供給することを備える請求項1記載の方法。
- 前記電磁放射線が、連続波レーザー、パルスレーザー、連続ランプ、及びフラッシュランプからなる群から選択したエネルギー源から生ずる請求項1記載の方法。
- 前記方向付けが、2つ以上の電磁放射線のパルスを前記固体表面にパルスの目的パターンに従って供給することを備える請求項1記載の方法。
- 前記電磁放射線パルスの個々のパルスが、多くても約1000秒、100秒、10秒、1秒、100ミリ秒、10ミリ秒、1ミリ秒、100マイクロ秒、10マイクロ秒、1 マイクロ秒、100ナノ秒、10ナノ秒、1ナノ秒、100ピコ秒、10ピコ秒、1ピコ秒、100フェムト秒、10フェムト秒、1フェムト秒、100アット秒、 10アット秒、及び1アット秒からなる群より選択される持続時間を有する請求項26記載の方法。
- 前記電磁放射線パルスの個々のパルスが約100ピコ秒から約10秒の持続時間を有する請求項26記載の方法。
- 前記電磁放射線の少なくとも2つのパルスを前記パルスの目的パターン内の単一のパルスの目的物に指向させる請求項26記載の方法。
- 前記電磁放射線を前記固体表面上の所定領域に指向させ、該所定領域が少なくとも0.0001、0.0003、0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、200、300、及び400cm2からなる群から選択される領域を有する請求項1記載の方法。
- 前記電磁放射線を前記固体表面上の所定領域に指向させ、該所定領域が約0.0001から約10cm2の領域を有する請求項1記載の方法。
- 前記電磁放射線を前記所定領域のほぼ全体に同時に指向させる請求項1記載の方法。
- 前記電磁放射線の経路が少なくとも10、12、 14、16、 18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、 100、300、l×103、2×103、 3×103、4×103、5×103、6×103、7×103、8×103、9×103、及び1×104μmからなる群より選択される幅を有する請求項1記載の方法。
- 前記電磁放射線の経路が約10から約1000μmの幅を有する請求項1記載の方法。
- 細胞を一時的に透過性にするための装置で、
a)細胞膜の一時的透過化を誘導するに十分な電磁放射線を放射するエネルギー源で、ここで前記細胞が実質的に静止して所定容量内に含まれ、該所定容量内での細胞の特定の座標が未知であり、前記所定容量を固体表面によって部分的に境界付けし、
b)前記所定容量のほぼ全体に電磁放射線を指向させるように構成した方向付け装置、ここで前記細胞を前記電磁放射線の経路と一致させ、該所定容量内の電磁放射線が前記の固体表面で多くとも約6μJ/μm2のエネルギー密度を有し、及び
c)前記固体表面
を備える装置。 - 前記所定容量内の電磁放射線が固体表面上で、多くとも約0.001、0.002、 0.003、0.006、 0.01、 0.02、 0.03、0.06、0.1、0.2、0.3、0.6、1、2、3、4、及び5μJ/μm2からなる群より選択されるエネルギー密度を有する請求項35記載の装置。
- 前記所定容量内の電磁放射線が固体表面上で、約0.001から約0.3μJ/μm2のエネルギー密度を有する請求項35記載の装置。
- 前記方向付け装置が、電磁放射線のパルスを前記所定容量にパルスの目的パターンに従って指向させる請求項35記載の装置。
- 前記電磁放射線パルスの個々のパルスが多くても約1000秒、100秒、10秒、1秒、100ミリ秒、10ミリ秒、1ミリ秒、100マイクロ秒、10マイクロ秒、1 マイクロ秒、100ナノ秒、10ナノ秒、1ナノ秒、100ピコ秒、10ピコ秒、1ピコ秒、100フェムト秒、10フェムト秒、1フェムト秒、100アット秒、 10アット秒、及び1アット秒からなる群より選択される持続時間を有する請求項37記載の装置。
- 前記電磁放射線パルスの個々のパルスが約10秒から約100ピコ秒の持続時間を有する請求項37記載の装置。
- 少なくとも2つの電磁放射線のパルスを前記パルスの目的パターン内の単一のパルスの目的物に指向させる請求項37記載の装置。
- 前記電磁放射線の経路が少なくとも10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、 90、100、300、l×103、2×103、 3×103、 4×103、 5×103、 6×103、7×103、 8×103、9×103、及び1×104μmからなる群より選択される幅を有する請求項35記載の装置。
- 前記電磁放射線の経路が約10から約1000μmの幅を有する請求項35記載の装置。
- 一連の指令を備える記憶システムで、該指令を実行すると、コンピュータが実質的に静止した細胞の膜の透過化を誘導するに十分な電磁放射線を該細胞の特定の3次元的な位置を前もって認識することなく固体表面に指向させることを備える動作を実行し、ここで前記細胞を前記電磁放射線の経路に一致させる記憶システム。
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