CN1886503A - 用于细胞透化的方法和仪器 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于将物质导入细胞内和释放出细胞的方法和仪器，更具体地涉及用于使活细胞瞬时透化以使得不同物质(例如，离子、蛋白质和核酸)中的任何一种或多种能被载入或释放出该细胞的方法和仪器。

Description

用于细胞透化的方法和仪器
                           发明背景
技术领域
本发明涉及用于将物质导入细胞内和释放出细胞的方法和仪器，更具体地涉及用于使活细胞瞬时透化以使得不同物质(例如，离子、蛋白质和核酸)中的任何一种或多种能被载入或释放出该细胞的方法和仪器。
相关技术描述
由于将物质导入细胞的重要性和没有任何理想的方法，开发了多种技术。例如，DNA的导入是通过例如以下方法进行：磷酸钙沉淀、脂质体、阳离子脂质、二乙氨(基)乙基(DEAE)葡聚糖、病毒载体、电穿孔、聚氮丙啶、肽介导的基因送递、活化的树枝状聚合物(dendrimer)、多胺、聚-L-鸟氨酸以及基于珠的方法，例如bolistics、珠负载(bead-loading)和免疫穿孔(immunoporation)。这些方法通常受到多种缺点的影响，这些缺点包括(i)仅适用于一种要导入的物质；(ii)对细胞有伤害作用(如，降低细胞的成活力和生长、改变细胞生理)；(iii)对组织有伤害作用(如，诱发白血病)；(iii)效率低；以及(iv)对导入物质的损害。
显微注射法是一种用毛细管将物质物理注射到细胞内的技术。这种技术非常有用，这是因为它可选择性地将不适用于其它技术的物质载入细胞，而且没有上文所述的许多技术中所存在的限制和潜在问题。由于显微注射在实践中可注射任何物质(甚至细胞器)，因此说它是多用途的。然而，相关的广泛人工和极低的处理量将该方法的有用性限制在了特定应用中。所需的是一种高通量且多用途的将物质载入细胞的方法。
已使用激光来将物质导入细胞，这种方法被称为光注射(optoinjection)。已假设的光注射机理是：当激光致密地聚集在细胞膜的某个部分上时，它可在膜中形成物理孔。光注射的一个限制是需要对每一个要载入的单细胞进行定位并用激光来定向。被称为光致孔的相关的技术将激光聚集在培养物质上，而所得的冲击波使得相邻细胞的膜发生瞬时的透化。光致孔的缺点在于造成了显著的细胞死亡以及离冲击波不同距离的细胞的载入程度存在差异。
因此，需要一种能以高细胞存活率、快速有效地将不同物质载入细胞的方法和仪器。本发明满足了这一需求，并同时提供了相关的优点。
                           发明概述
本发明提供了用于将大致固定的细胞瞬时透化的方法，所述细胞位于由离开固相表面的有效距离所限定的体积中，该方法无需事先知道位于所述体积中的所述细胞的具体三维定位。总体方法包括：通过将电磁辐射定向到细胞所在的体积，使足以在细胞膜上产生透化作用的电磁辐射辐照这一细胞。可通过在离开固相表面有效距离中的空间区域中放入大量的细胞，然后用电磁辐射迅速辐照该空间区域以获得高比例的细胞透化。可通过选择适当的电磁辐射剂量参数(波长、能量密度和总辐照时间)，在获得高细胞存活率的同时获得高得率的透化。能量密度是功率密度和总辐照时间的函数。在以连续脉冲形式施予辐照的电磁辐射方案中，总辐照时间是脉冲持续时间和脉冲总数的函数。此外，在以连续脉冲形式施予辐照的电磁辐射方案中，脉冲间的时间(即，脉冲的周期性)也可为一个关键性的参数。当透化状态的细胞与含有要被载入这些细胞的物质的水性介质相接触时，该方法在保持高细胞存活率的同时，使得各种物质迅速而有效的被载入细胞。
实施方式涉及了用于将位于限定体积中大致固定的细胞瞬时透化而无需事先知道位于所述限定体积中所述细胞的具体三维定位的仪器。通常而言，实施方式中可包括这样一种仪器，其包括：能发射出足以使细胞膜透化的电磁辐射的能源、将电磁辐射定向到细胞所存在的基本上全部限定体积的定向器件、以及固相表面，其中所述限定体积由固相表面部分限定并进一步由离开固相表面的有效距离限定。该固相表面可进一步包括基本透明的材料，该材料在电磁辐射的光路中。实施方式也可包括这样一种仪器，其包括：能发射出足以使细胞膜透化的电磁辐射的能源、用于将电磁辐射定向到细胞所存在的限定体积基本上全部的命令、以及根据命令对电磁辐射进行定向的定向器件
一些实施方式涉及使一个或多个细胞瞬时透化的方法。所述方法可包括：a)将一个或多个细胞维持在离开固相表面有效距离内的大致固定的位置上；以及b)使所述一个或多个细胞瞬时透化的电磁辐射定向到固相表面，而无需事先知道所述一个或多个细胞的具体三维定位，其中所述一个或多个细胞可与电磁辐射的路径相符。
所述电磁辐射在固相表面上的能量密度可为，例如，最大为约0.001、0.002、0.003、0.006、0.01、0.02、0.03、0.06、0.1、0.2、0.3、0.6、1、2、3、4、5和6μJ/μm2。所述电磁辐射的能量密度可为各上述密度或其任何组合的任何子集，以及上述密度中的任何范围。此外，电磁辐射在固相表面上的能量密度可为约0.001-0.3μJ/μm2。
所述有效距离可为，例如，小于约1000μm、600μm、300μm、200μm、100μm、60μm、30μm、20μm、10μm、6μm、3μm、2μm、1μm等。所述有效距离可为上述各距离或其任何组合的任何子集，以及上述距离中的任何范围。此外，有效距离可为约1μm-20μm。
可将电磁辐射定向到一个或多个细胞一段时间，例如，最多为约1000秒、100秒、10秒、1秒、100毫秒、10毫秒、1毫秒、100微秒、10微秒、1微秒、100纳秒、10纳秒、1纳秒、100皮秒、10皮秒、1皮秒、100飞秒、10飞秒、1飞秒、100埃秒、10埃秒和1埃秒数量级。所述时间段可为上述各时间段或其任何组合的任何子集，以及上述时间段中的任何范围。也可将所述一个或多个细胞暴露在电磁辐射下例如约100皮秒-10秒。
所述电磁辐射的波长可为，例如，约300-3,000纳米、约330-1,100纳米、约400-700纳米等。
所述定向可包括：例如，将脉冲辐射传递到固相表面、根据光路模式使辐射束穿过固相表面等。
对一个或多个细胞中的膜瞬时透化诱导发生的速率可为，例如，至少10、30、100、300、1000、3000、10,000、30,000、100,000、300,000、1,000,000、3,000,000、10,000,000、30,000,000、100,000,000和240,000,000个细胞/秒。所述瞬时透化诱导速率可为上述各速率或其任何组合的任何子集，以及上述速率中的任何范围。所述方法还可包括在一个或多个细胞的膜中以约300-10,000,000个细胞/秒的速率诱导透化。
膜瞬时透化后所述一个或多个细胞的存活机率可维持在例如至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％和99％的数值。所述存活率可为上述各存活率或其任何组合的任何子集，以及上述存活率中的任何范围。此外，膜瞬时透化后所述一个或多个细胞的存活机率可维持在例如，至少50％-90％的数值。
本方法还可包括将所述一个或多个细胞与例如非等渗水性介质接触。本方法可包括将所述一个或多个细胞与包含浓度低于所述一个或多个细胞中该物质浓度的物质的水性介质接触，从而使得所述一个或多个细胞中的所述物质能通过经透化的膜从所述一个或多个细胞释放出来。当然，水性介质中物质的浓度低于一个或多个细胞中物质的浓度的一个例子可为水性介质中的浓度为0。所述物质可为，例如，离子、有机分子、无机分子、胶粒、多糖、肽、蛋白质、核酸、经修饰的核酸等。所述一个或多个细胞也可接触水性介质，从而使得水性介质中的物质能穿过经瞬时透化的该细胞的膜进入该细胞。所述经瞬时透化的膜可在一段时间内恢复到基本上非透化的状态，例如，最多约0.3毫秒、1毫秒、3毫秒、10毫秒、30毫秒、100毫秒、300毫秒、1秒、3秒、10秒、30秒、1分钟、2分钟、3分钟、6分钟、10分钟、20分钟和30分钟。同样，所述时间也可为上述各时间或其任何组合的任何子集，以及上述时间中的任何范围。所述经瞬时透化的膜可在例如约1秒-1分钟的时间段中恢复到基本非透化的状态。
可将所述电磁辐射以一定速率定向到所述固相表面的某一面积上，例如，至少约0.0001、0.0003、0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、200、300和400平方厘米/秒。所述面积可为上述各面积或其任何组合的任何子集，以及上述面积中的任何范围。此外，可将所述电磁辐射以例如约0.0003-10平方厘米/秒的速率定向到固相表面的某一面积上。
所述定向可包括以一定速率例如，至少为1、10、100、103、104、105、106、107、108和109Hz将两种或多种脉冲辐射递送到固相表面上。所述速率可为上述各速率或其任何组合的任何子集，以及上述速率中的任何范围。此外，该定向可包括以例如约102-104Hz的速率将两种或多种脉冲辐射递送到固相表面上。该定向还可包括根据脉冲靶向模式将两种或多种脉冲辐射递送到固相表面上。也可将至少两种电磁辐射脉冲定向到脉冲靶向模式中的单一脉冲靶。
所述电磁辐射可从能源发出，例如，连续波激光、脉冲激光、连续光灯(continuous lamp)、闪光灯等。
电磁辐射脉冲中的单一脉冲的持续时间可为，例如，最多为1000秒、100秒、10秒、1秒、100毫秒、10毫秒、1毫秒、100微秒、10微秒、1微秒、100纳秒、10纳秒、1纳秒、100皮秒、10皮秒、1皮秒、100飞秒、10飞秒、1飞秒、100埃秒、10埃秒、和1埃秒数量级。所述持续时间可为上述各持续时间或其任何组合的任何子集，以及上述持续时间中的任何范围。例如，电磁辐射脉冲的单一脉冲的持续时间可为100皮秒-10秒。
可将电磁辐射定向到固相表面上的限定区域上，所述限定区域的面积可为例如，至少0.0001、0.0003、0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、200、300和400平方厘米。所述面积可为上述各面积或其任何组合的任何子集，以及上述面积中的任何范围。例如，可将电磁辐射定向到固相表面上的限定区域上，所述限定区域的面积可为约0.0001-10平方厘米。电磁辐射也可同时定向到大致全部的所述限定区域。
电磁辐射路径的宽度可为，例如至少10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、300、1×103，2×103、3×103、4×103、5×103、6×103、7×103、8×103、9×103和1×104微米。同样，所述宽度也可为上述各宽度或其任何组合的任何子集，以及上述宽度中的任何范围。例如，电磁辐射路径的宽度可为约10微米-1000微米。
所述固相表面对于电磁辐射可为例如基本透明的。同样，所述固相表面可包括例如聚合物材料、玻璃材料等。
其它实施方式涉及用于使细胞瞬时透化的仪器。所述仪器可包括例如，a)能源，所述能源发射出足以诱导细胞膜透化的电磁辐射，其中所述细胞可为大致固定的且包含在限定体积中，而该细胞在所述限定体积中的具体坐标未知，并且所述限定体积可由固相表面部分限定；b)定向器件，所述定向器件将电磁辐射定向到所述限定体积的基本上全部，其中所述细胞可与电磁辐射的路径相符，且所述限定体积中的电磁辐射在固相表面的能量密度最多为约6J/μm；以及任选地c)固相表面。
限定体积中的电磁辐射在固相表面上的能量密度可为，例如最多约0.001、0.002、0.003、0.006、0.01、0.02、0.03、0.06、0.1、0.2、0.3、0.6、1、2、3、4和5μJ/μm2。同样，所述能量密度也可为上述各密度或其任何组合的任何子集，以及上述密度中的任何范围。例如，限定体积中的电磁辐射在固相表面上的能量密度可为约0.001-0.3μJ/μm2。
所述定向器件可例如根据脉冲靶向模式将电磁辐射脉冲定向到限定体积。同样，可将至少两种电磁辐射脉冲定向到所述脉冲靶向模式中的单个脉冲靶上。电磁辐射脉冲中各脉冲的持续时间可为，例如，最多为约1000秒、100秒、10秒、1秒、100毫秒、10毫秒、1毫秒、100微秒、10微秒、1微秒、100纳秒、10纳秒、1纳秒、100皮秒、10皮秒、1皮秒、100飞秒、10飞秒、1飞秒、100埃秒、10埃秒和1埃秒数量级。同样，所述持续时间也可为上述各持续时间或其任何组合的任何子集，以及上述持续时间中的任何范围。例如，所述持续时间可为约10秒-100皮秒。
电磁辐射的路径的宽度可为，例如，至少为约10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、300、1×103、2×103、3×103、4×103、5×103、6×103、7×103、8×103、9×103和1×104微米。同样，所述宽度为上述各宽度任何组合的任何子集，以及上述宽度任何范围。例如，所述宽度可为约10微米-1000微米。
其它的实施方式涉及用于使细胞瞬时透化的仪器。所述仪器可包括，例如，a)能源，所述能源发射出足以诱导细胞的膜发生透化的电磁辐射，其中所述细胞可为包含在限定体积中的大致固定的细胞，且所述限定体积中的细胞的具体坐标是未知的；b)命令，所述命令将电磁辐射定位到基本上全部的所述限定体积；和c)定向器件，所述定向器件根据命令对电磁辐射进行定向。
所述命令可包括，例如，用于根据脉冲靶向模式对电磁辐射脉冲进行定向。同样，例如也可将至少两种电磁辐射脉冲定位到脉冲靶向模式的单个脉冲靶。电磁辐射脉冲中的各个脉冲的持续时间可为，例如，最多约为1000秒、100秒、10秒、1秒、100毫秒、10毫秒、1毫秒、100微秒、10微秒、1微秒、100纳秒、10纳秒、1纳秒、100皮秒、10皮秒、1皮秒、100飞秒、10飞秒、1飞秒、100埃秒、10埃秒、和1埃秒数量级。同样，所述持续时间也可为上述各持续时间或其任何组合的任何子集，以及上述持续时间中的任何范围。例如，电磁辐射脉冲中的各个脉冲的持续时间可为约100皮秒-10秒。
所述限定体积内的电磁辐射在固相表面上的能量密度可为，例如，最多约0.001、0.002、0.003、0.006、0.01、0.02、0.03、0.06、0.1、0.2、0.3、0.6、1、2、3、4、5和6μJ/μm2。同样，所述能量密度也可为上述各密度或其任何组合的任何子集，以及上述密度中的任何范围。例如，所述限定体积内的电磁辐射在固相表面上的能量密度可为约0.001-0.3μJ/μm2。
此外，限定体积内的电磁辐射的瞬时路径可为，例如，至少10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、300、1×103、2×103、3×103、4×103、5×103、6×103、7×103、8×103、9×103和1×104微米。同样，所述宽度也可为上述各宽度或其任何组合的任何子集，以及上述宽度中的任何范围。例如，所述宽度可为约10微米-1000微米。
其它实施方式涉及用于使细胞瞬时透化的仪器。所述仪器可包括，例如，a)能源，所述能源发射足以诱导细胞的膜发生透化的电磁辐射，其中所述细胞可为包含在限定体积中的大致固定的细胞，且所述限定体积中的细胞的具体坐标是未知的，其中所述限定体积可由固相表面部分限定；b)定向器件，所述定向器件根据脉冲靶向模式将电磁辐射脉冲定向到基本上整个所述限定体积；和任选地，c)固相表面。
电磁辐射脉冲中的各个脉冲的持续时间可为，例如，最多为约1000秒、100秒、10秒、1秒、100毫秒、10毫秒、1毫秒、100微秒、10微秒、1微秒、100纳秒、10纳秒、1纳秒、100皮秒、10皮秒、1皮秒、100飞秒、10飞秒、1飞秒、100埃秒、10埃秒、和1埃秒数量级。同样，所述持续时间也可为上述各持续时间或其任何组合的任何子集，以及上述持续时间中的任何范围。例如，电磁辐射脉冲中的各个脉冲的持续时间可为约100皮秒-10秒。
此外，可将至少两种电磁辐射脉冲定位到脉冲靶向模式中的单一脉冲靶。限定体积中电磁辐射脉冲的各脉冲的宽度可为，例如，至少约10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、300、1×103、2×103、3×103、4×103、5×10′，6×103、7×103、8×103、9×103和1×104微米。同样，所述宽度也可为上述各宽度或其任何组合的任何子集，以及上述宽度中的任何范围。例如，限定体积中电磁辐射脉冲的各脉冲的宽度可为约10微米-1000微米。
其它实施方式涉及用于使细胞瞬时透化的仪器。所述仪器可包括，例如，a)能源，所述能源发射出足以诱导细胞的膜发生透化的电磁辐射，其中所述细胞可为包含在限定体积中的大致固定的细胞，且所述限定体积中的细胞的具体坐标是未知的；b)命令，所述命令用于根据脉冲靶向模式将电磁辐射脉冲定向到基本上整个所述限定体积；和c)定向器件，所述定向器件根据命令对电磁辐射进行定向。
电磁辐射脉冲中的各个脉冲的持续时间可为，例如，最多约1000秒、100秒、10秒、1秒、100毫秒、10毫秒、1毫秒、100微秒、10微秒、1微秒、100纳秒、10纳秒、1纳秒、100皮秒、10皮秒、1皮秒、100飞秒、10飞秒、1飞秒、100埃秒、10埃秒、和1埃秒数量级。同样，所述持续时间也可为上述各持续时间或其任何组合的任何子集，以及上述持续时间中的任何范围。例如，电磁辐射脉冲中的各个脉冲的持续时间可为约100皮秒-10秒。
可将至少两种电磁辐射脉冲定向到脉冲靶向模式中的单一脉冲靶上。限定体积中电磁辐射脉冲的各脉冲宽度可为，例如，至少约10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、300、1×103、2×103、3×103、4×103、5×103、6×103、7×103、8×103、9×103和1×104微米。同样，所述宽度也可为上述各宽度或其任何组合的任何子集，以及上述宽度中的任何范围。例如，限定体积中电磁辐射脉冲的各脉冲宽度可为约10微米-1000微米。
其它实施方式涉及使细胞瞬时透化的方法。所述方法可包括，例如，a)将所述细胞保持在限定体积中大致固定的位置，其中所述限定体积由固相表面部分限定并由离开固相表面的有效距离进一步限定；以及b)将足以瞬时诱导所述细胞的膜发生透化的电磁辐射定向到基本上整个所述限定体积。
限定体积内的电磁辐射在固相表面上的能量密度可为，例如，最多约0.001、0.002、0.003、0.006、0.01、0.02、0.03、0.06、0.1、0.2、0.3、0.6、1、2、3、4、5和6μJ/μm2。同样，所述能量密度也可为上述各密度或其任何组合的任何子集，以及上述密度中的任何范围。例如，限定体积内的电磁辐射在固相表面上的能量密度可为约0.001-0.3μJ/μm2。
所述有效距离可为，例如，小于约1000μm、600μm、300μm、200μm、100μm、60μm、30μm、20μm、10μm、6μm、3μm、2um和1um。同样，所述有效距离也可为上述各距离或其任何组合的任何子集，以及上述距离中的任何范围。例如，所述有效距离可为约1-20μm。
可将所述细胞暴露在电磁辐射下一段时间，例如，最多约1000秒、100秒、10秒、1秒、100毫秒、10毫秒、1毫秒、100微秒、10微秒、1微秒、100纳秒、10纳秒、1纳秒、100皮秒、10皮秒、1皮秒、100飞秒、10飞秒、1飞秒、100埃秒、10埃秒、和1埃秒数量级。同样，所述时间段也可为上述各时间段或其任何组合的任何子集，以及上述时间段中的任何范围。例如，可将所述细胞暴露在电磁辐射中约100皮秒-10秒。
所述定向可包括，例如，将辐射脉冲递送到所述限定体积，还包括根据路径模式将辐射束穿过所述限定体积。
所述方法还可包括在细胞中用以下速率诱导瞬时透化，例如，至少10、30、100、300、1000、3000、10,000、30,000、100,000、300,000、1,000,000、3,000,000、10,000,000、30,000,000、100,000,000和240,000,000个细胞/秒。同样，所述速率也可为上述各速率或其任何组合的任何子集，以及上述速率中的任何范围。例如，可在细胞中以约300-10,000,000个细胞/秒的速率诱导瞬时透化。
可将透化后的细胞存活机率保持在，例如，至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％和99％的数值。同样，所述数值也可为上述各数值或其任何组合的任何子集，以及上述数值中的任何范围。例如，透化后的细胞存活机率可保持至少50％-至少90％的数值。
所述方法还可包括将所述细胞与非等渗水性介质接触。所述方法可包括水性介质，所述水性介质含有当与所述细胞接触时可穿过所述细胞经透化的膜的物质。
所述物质可为，例如，离子、有机分子、无机分子、多糖、肽、蛋白质、胶粒、核酸、经修饰的核酸等。所述物质可通过经透化的膜进入或离开细胞。
经瞬时透化的膜可在如下时间段中恢复到基本上非透化的状态，例如，最多约0.3毫秒、1毫秒、3毫秒、10毫秒、30毫秒、100毫秒、300毫秒、1秒、3秒、10秒、30秒、1分钟、2分钟、3分钟、6分钟、10分钟、20分钟和30分钟。同样，所述恢复时间也可为上述各恢复时间或其任何组合的任何子集，以及上述恢复时间中的任何范围。例如，经瞬时透化的膜可在约1秒-1分钟的时间段中恢复到基本上非透化的状态。
可将电磁辐射以一定速率定向到所述固相表面的某一区域，例如，至少0.0001、0.0003、0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、200、300和400平方厘米/秒。同样，所述速率也可为上述各速率或其任何组合的任何子集，以及上述速率中的任何范围。例如，可将电磁辐射以约0.0003-10平方厘米/秒的速率定向到所述固相表面的某一区域。
限定体积中的电磁辐射的功率密度可为，例如，至少约6×107、3×107、2×107、1×107、6×106、3×106、2×106、1×106、6×105、3×105、2×105、1×105、6×104、3×104、2×104和1×104W/cm2。同样，所述功率密度也可为上述各密度或其任何组合的任何子集，以及上述密度中的任何范围。
所述定向可包括以一定速率将两种或多种辐射脉冲递送到所述限定体积，例如，以至少1、10、100、103、104、105、106、107、108和109Hz的速率。同样，所述速率也可为上述各速率或其任何组合的任何子集，以及上述速率中的任何范围。例如，所述定向可包括以约102-104Hz的速率将两种或多种辐射脉冲递送到所述限定体积。所述定向可包括根据脉冲靶向模式将两种或多种辐射脉冲递送到所述限定体积。
产生所述电磁辐射的能源可为，例如，连续波激光、脉冲激光、连续光灯、闪光灯等。
电磁辐射脉冲中的各个脉冲的持续时间可选自下组：最多为1000秒、100秒、10秒、1秒、100毫秒、10毫秒、1毫秒、100微秒、10微秒、1微秒、100纳秒、10纳秒、1纳秒、100皮秒、10皮秒、1皮秒、100飞秒、10飞秒、1飞秒、100埃秒、10埃秒和1埃秒数量级。同样，所述持续时间也可为上述各持续时间或其任何组合的任何子集，以及上述持续时间中的任何范围。例如，电磁辐射脉冲中的各个脉冲的持续时间可为约100皮秒-10秒。也可将至少两种电磁辐射脉冲定向到脉冲靶向模式中的单一脉冲靶。
可将电磁辐射定向到所述固相表面的限定区域，所述限定区域的面积可为，例如，至少约0.0001、0.0003、0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、200、300和400平方厘米。同样，所述面积也可为上述各面积或其任何组合的任何子集，以及上述面积中的任何范围。例如，可将电磁辐射定向到所述固相表面的限定区域，所述限定区域的面积可为约0.0001-10平方厘米。也可将电磁辐射同时定向到基本上整个所述固相表面。
限定体积内的电磁辐射的路径的宽度可为，例如，至少约10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、300、1×103，2×103、3×103、4×103、5×103、6×103、7×103、8×103、9×103和1×104微米。同样，所述宽度也可为上述各宽度或其任何组合的任何子集，以及上述宽度中的任何范围。例如，限定体积内的电磁辐射的路径宽度可为约10微米-1000微米。
实施方式还涉及用于使细胞瞬时透化的仪器。所述仪器可包括，例如，a)能源，所述能源发射出足以诱导细胞的膜发生透化的电磁辐射，其中所述细胞可为包含在限定体积中的大致固定的细胞，且所述限定体积中的细胞的具体坐标是未知的；b)命令，所述命令用来将电磁辐射定向到限定体积中的多个位置，而无需考虑所述多个位置的特性；以及c)定向器件，所述定向器件根据命令对电磁辐射进行定向。
其它实施方式涉及用于使细胞瞬时透化的仪器。
所述仪器可包括，例如，a)能源，所述能源发射出足以诱导细胞的膜发生透化的电磁辐射，其中所述细胞可为包含在限定体积中的大致固定的细胞，且所述限定体积中的细胞的具体坐标是未知的；b)命令，所述命令用来将电磁辐射定向到基本上整个限定体积中的多个位置，其中限定体积内的电磁辐射在固相表面上的能量密度最多为6μJ/μm2；和c)定向器件，所述定向器件根据命令对电磁辐射进行定向。
实施方式涉及带有存储器的系统，所述系统可包括一系列指令，从而在运行时计算机执行以下操作，包括：将足以对大致固定的细胞的膜诱导发生透化的电磁辐射定向到固相表面，而无需事先知道所述细胞的具体三维定位，其中所述细胞可与所述电磁辐射的路径相符。
任何实施方式中的细胞可为任何细胞，包括真核和原核细胞、哺乳动物细胞和非哺乳动物细胞、干细胞、研究动物细胞、植物细胞、细菌、真菌、病毒等。
在以下段落中将对本发明的一些实施方式进行描述：
1.一种使一个或多个细胞瞬时透化的方法，所述方法包括：
a)将所述一个或多个细胞保持在离开固相表面有效距离内大致固定的位置上；和
b)将足以诱导所述一个或多个细胞的膜发生透化的电磁辐射定向到所述固相表面，而无需事先知道所述一个或多个细胞的具体三维定位，其中所述一个或多个细胞与所述电磁辐射的路径相符；
2.如段落1所述的方法，其中所述电磁辐射在所述固相表面上的能量密度选自下组：最多约0.001、0.002、0.003、0.006、0.01、0.02、0.03、0.06、0.1、0.2、0.3、0.6、1、2、3、4、5和6μJ/μm2；
3.如段落1所述的方法，其中所述电磁辐射在所述固相表面上的能量密度为约0.001-0.3μJ/μm2；
4.如段落1所述的方法，其中所述有效距离选自下组：小于约1000μm、600μm、300μm、200μm、100urn、60μm、30、μm、20、μm、10μm、6μm、3μm、2μm和1μm；
5.如段落1所述的方法，其中所述有效距离为约1-20μm；
6.如段落1所述的方法、其中将所述电磁辐射定向到所述一个或多个细胞一段时间，所述时间段选自下组：最多为1000秒、100秒、10秒、1秒、100毫秒、10毫秒、1毫秒、100微秒、10微秒、1微秒、100纳秒、10纳秒、1纳秒、100皮秒、10皮秒、1皮秒、100飞秒、10飞秒、1飞秒、100埃秒、10埃秒、和1埃秒数量级；
7.如段落1所述的方法，其中所述一个或多个细胞暴露在所述电磁辐射中约100皮秒-10秒；
8.如段落1所述的方法，其中所述定向包括将辐射脉冲传递到所述固相表面；
9.如段落1所述的方法，其中所述定向包括根据路径模式使辐射束穿过所述固相表面；
10.如段落1所述的方法，所述方法还包括以选自下组的速率在所述一个或多个细胞中的膜上诱导透化：至少10、30、100、300、1000、3000、10,000、30,000、100,000、300,000、1,000,000、3,000,000、10,000,000、30,000,000、100,000,000和240,000,000个细胞/秒；
11.如段落1所述的方法，所述方法还包括以约300-10,000,000个细胞/秒的速率在所述一个或多个细胞中的膜上诱导透化；
12.如段落1所述的方法，其中在所述一个或多个细胞的膜经所述透化后，所述一个或多个细胞的存活机率在保持选自下组的数值：至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％和99％；
13.如段落1所述的方法，其中在所述一个或多个细胞的膜经所述透化后，所述一个或多个细胞的存活机率保持至少50％-至少90％的数值；
14.如段落1所述的方法，所述方法还包括将所述一个或多个细胞与非等渗水性介质接触；
15.如段落1所述的方法，其中还将所述一个或多个细胞与水性介质接触，从而使得所述经透化的膜内的物质可穿过所述经透化的膜；
16.如段落1所述的方法，其中还将所述一个或多个细胞与水性介质接触，所述水性介质中包含能穿过经透化的膜从所述一个或多个细胞释放出来的物质；
17.如段落16所述的方法，其中所述物质选自下组：离子、有机分子、无机分子和胶粒；
18.如段落16所述的方法，其中所述物质选自下组：多糖、肽、蛋白质、核酸和经修饰的核酸；
19.如段落16所述的方法，其中所述物质通过经透化的膜进入所述一个或多个细胞；
20.如段落19所述的方法，其中所述经透化的膜还在选自下组的时间段中恢复到基本上非透化的状态：最多约0.3毫秒、1毫秒、3毫秒、10毫秒、30毫秒、100毫秒、300毫秒、1秒、3秒、10秒、30秒、1分钟、2分钟、3分钟、6分钟、10分钟、20分钟和30分钟；
21.如段落19所述的方法，其中所述经透化的膜在约1秒-1分钟的时间段中恢复到基本上非透化的状态；
22.如段落1所述的方法，其中将所述电磁辐射以选自下组的速率定向到所述固相表面的一定区域：至少约0.0001、0.0003、0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、200、300和400平方厘米/秒；
23.如段落1所述的方法，其中将所述电磁辐射以约0.0003-10平方厘米/秒的速率定向到所述固相表面的一定区域；
24.如段落1所述的方法，其中所述电磁辐射在所述固相表面上的功率密度小于约1×104W/cm2；
25.如段落1所述的方法，其中所述电磁辐射在所述固相表面上的功率密度约为1×104W/cm2-6×107W/cm2；
26.如段落1所述的方法，其中所述定向包括将两种或多种辐射脉冲以选自下组的速率传递到所述固相表面：至少为1、10、100、103、104、105、106、107、108和109Hz；
27.如段落1所述的方法，其中所述定向包括将两种或多种辐射脉冲以约102-104Hz的速率传递到所述固相表面；
28.如段落1所述的方法，其中由选自下组的能源产生所述电磁辐射：连续波激光、脉冲激光、连续光灯和闪光灯；
29.如段落1所述的方法，其中所述定向包括根据脉冲靶向模式将两种或多种电磁辐射脉冲传递到所述固相表面；
30.如段落29所述的方法，其中所述电磁辐射脉冲中的各脉冲的持续时间选自下组：最多为1000秒、100秒、10秒、1秒、100毫秒、10毫秒、1毫秒、100微秒、10微秒、1微秒、100纳秒、10纳秒、1纳秒、100皮秒、10皮秒、1皮秒、100飞秒、10飞秒、1飞秒、100埃秒、10埃秒和1埃秒数量级；
31.如段落29所述的方法，其中所述电磁辐射脉冲中的各脉冲的持续时间为约100皮秒-10秒；
32.如段落29所述的方法，其中将至少两种电磁辐射脉冲定向到所述脉冲靶向模式中的单个脉冲靶上；
33.如段落1所述的方法，其中将所述电磁辐射定向到所述固相表面上的限定区域，所述限定区域的面积选自下组：至少为0.0001、0.0003、0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、200、300和400平方厘米；
34.如段落1所述的方法，其中将所述电磁辐射定向到所述固相表面上的限定区域，所述限定区域的面积为约0.0001-10平方厘米；
35.如段落1所述的方法，其中将所述电磁辐射同时定向到基本上整个所述限定区域；
36.如段落1所述的方法，其中所述电磁辐射的所述路径的宽度选自下组：至少为10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、300，1×103、2×103、3×103、4×103、5×103、6×103、7×103、8×103、9×103和1×104微米；
37.如段落1所述的方法，其中所述电磁辐射的所述路径的宽度为约10-1000微米；
38.一种用于使细胞瞬时透化的仪器，所述仪器含有：a)能源，所述能源发射出足以诱导细胞的膜发生透化的电磁辐射，其中所述细胞可为包含在限定体积中的大致固定的细胞，且所述限定体积中的细胞的具体坐标是未知的，其中所述限定体积由固相表面部分限定；b)定向器件，所述定向器件用于将所述电磁辐射定向到基本上整个所述限定体积，其中所述细胞与所述电磁辐射的路径相符，且其中所述限定体积中的所述电磁辐射在固相表面上的能量密度最多为约6μJ/μm2；和c)所述固相表面；
39.如段落38中所述的仪器，其中所述限定体积中的所述电磁辐射在固相表面上的能量密度选自下组：最多约0.001、0.002、0.003、0.006、0.01、0.02、0.03、0.06、0.1、0.2、0.3、0.6、1、2、3、4和5μJ/μm2；
40.如段落38中所述的仪器，其中所述限定体积中的所述电磁辐射在固相表面上的能量密度为约0.001-0.3μJ/μm2；
41.如段落38中所述的仪器，其中所述定向器件根据脉冲靶向模式将电磁辐射脉冲定向到所述限定体积；
42.如段落40中所述的仪器，其中所述电磁辐射脉冲中的各脉冲的持续时间选自下组：至多为1000秒、100秒、10秒、1秒、100毫秒、10毫秒、1毫秒、100微秒、10微秒、1微秒、100纳秒、10纳秒、1纳秒、100皮秒、10皮秒、1皮秒、100飞秒、10飞秒、1飞秒、100埃秒、10埃秒、和1埃秒数量级；
43.如段落40中所述的仪器，其中所述电磁辐射脉冲中的各脉冲的持续时间为约10秒-100皮秒；
44.如段落40中所述的仪器，其中将至少两种电磁辐射定向到所述脉冲靶向模式中的单个脉冲靶上；
45.如段落38中所述的仪器，其中所述电磁辐射的所述路径的宽度选自下组：至少10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、300、1×103、2×103、3×103、4×103、5×103、6×103、7×103、8×103、9×103和1×104微米；
46.如段落38中所述的仪器，其中所述电磁辐射的所述路径的宽度为约10-1000微米；
47.一种用于使细胞瞬时透化的仪器，所述仪器包括：a)能源，所述能源发射出足以诱导细胞的膜发生透化的电磁辐射，其中所述细胞可为包含在限定体积中的大致固定的细胞，且所述限定体积中的细胞的具体坐标是未知的；b)命令，所述命令用于使所述电磁辐射定向到基本上整个所述限定体积；和c)定向器件，所述定向器件用于根据所述命令对所述电磁辐射进行定向；
48.如段落47所述的仪器，其中所述命令包括用于根据脉冲靶向模式对电磁辐射脉冲进行定向；
49.如段落48所述的仪器，其中所述电磁辐射脉冲中的各脉冲的持续时间选自下组：最多依次为约1000秒、100秒、10秒、1秒、100毫秒、10毫秒、1毫秒、100微秒、10微秒、1微秒、100纳秒、10纳秒、1纳秒、100皮秒、10皮秒、1皮秒、100飞秒、10飞秒、1飞秒、100埃秒、10埃秒、和1埃秒；
50.如段落48所述的仪器，其中所述电磁辐射脉冲中的各脉冲的持续时间为约100皮秒-10秒；
51.如段落48所述的仪器，其中将至少两种电磁辐射脉冲定向到所述脉冲靶向模式中的单个脉冲靶；
52.如段落47所述的仪器，其中所述限定体积中的所述电磁辐射在固相表面上的能量密度选自下组：最多约0.001、0.002、0.003、0.006、0.01、0.02、0.03、0.06、0.1、0.2、0.3、0.6、1、2、3、4、5和6μJ/μm2；
53.如段落47所述的仪器，其中所述限定体积中的所述电磁辐射在固相表面上的能量密度为约0.001-0.3μJ/μm2；
54.如段落47所述的仪器，其中所述限定体积中的所述电磁辐射的瞬时路径宽度选自下组：至少为10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、300、1×103、2×103、3×103、4×103、5×103、6×103、7×103、8×103、9×103和1×104微米；
55.如段落47所述的仪器，其中所述限定体积中的所述电磁辐射的瞬时路径宽度为约10-1000微米；
56.一种用于使细胞瞬时透化的仪器，所述仪器包括：a)能源，所述能源发射出足以诱导细胞的膜发生透化的电磁辐射，其中所述细胞可为包含在限定体积中的大致固定的细胞，且所述限定体积中的细胞的具体坐标是未知的，其中所述限定体积由固相表面部分限定；b)定向器件，所述定向器件用于根据脉冲靶向模式将所述电磁辐射脉冲定向到基本上整个所述限定体积；和c)所述固相表面；
57.如段落56所述的仪器，其中所述电磁辐射脉冲中的各脉冲的持续时间选自下组：最多为约1000秒、100秒、10秒、1秒、100毫秒、10毫秒、1毫秒、100微秒、10微秒、1微秒、100纳秒、10纳秒、1纳秒、100皮秒、10皮秒、1皮秒、100飞秒、10飞秒、1飞秒、100埃秒、10埃秒、和1埃秒数量级；
58.如段落56所述的仪器，其中所述电磁辐射脉冲中的各脉冲的持续时间为约100皮秒-10秒；
59.如段落56所述的仪器，其中将至少两种电磁辐射定向到所述脉冲靶向模式中的单个脉冲靶上；
60.如段落56所述的仪器，其中所述限定体积中所述电磁辐射脉冲中各脉冲的宽度选自下组：至少为约10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、300、1×103、2×103、3×103、4×103、5×103、6×103、7×103、8×103、9×103和1×104微米；
61.如段落56所述的仪器，所述限定体积中所述电磁辐射脉冲中各脉冲的宽度为约10-1000微米；
62.一种用于使细胞瞬时透化的仪器，所述仪器包括：a)能源，所述能源发射出足以诱导细胞的膜发生透化的电磁辐射，其中所述细胞可为包含在限定体积中的大致固定的细胞，且所述限定体积中的细胞的具体坐标是未知的；b)命令，所述命令用于根据脉冲靶向模式使所述电磁辐射脉冲定向到基本上整个所述限定体积；和c)定向器件，所述定向器件用于根据所述命令对所述电磁辐射进行定向；
63.如段落62所述的仪器，其中所述电磁辐射脉冲中的各脉冲的持续时间选自下组：最多为约1000秒、100秒、10秒、1秒、100毫秒、10毫秒、1毫秒、100微秒、10微秒、1微秒、100纳秒、10纳秒、1纳秒、100皮秒、10皮秒、1皮秒、100飞秒、10飞秒、1飞秒、100埃秒、10埃秒、和1埃秒数量级；
64.如段落62所述的仪器，其中所述电磁辐射脉冲中的各脉冲的持续时间为约100皮秒-10秒；
65.如段落62所述的仪器，其中将至少两种电磁辐射脉冲定向到所述脉冲靶向模式中的单个脉冲靶；
66.如段落62所述的仪器，其中所述限定体积中的所述电磁辐射脉冲中各脉冲的宽度选自下组：至少为约10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、300、1×103、2×103、3×103、4×103、5×103、6×103、7×103、8×103、9×103和1×104微米；
67.如段落62所述的仪器，其中所述限定体积中的所述电磁辐射脉冲中各脉冲的宽度为约10-1000微米；
68.一种使细胞瞬时透化的方法，所述方法包括：a)将所述细胞保持在限定体积中大致固定的位置，其中所述限定体积由固相表面部分限定并由离开固相表面的有效距离进一步限定；和b)将足以瞬时诱导所述细胞的膜发生透化的电磁辐射定向到基本上整个所述限定体积；
69.如段落68所述的方法，其中所述限定体积中的所述电磁辐射在固相表面上的能量密度选自下组：最多0.001、0.002、0.003、0.006、0.01、0.02、0.03、0.06、0.1、0.2、0.3、0.6、1、2、3、4、5和6μJ/μm2；
70.如段落68所述的方法，其中所述限定体积中的所述电磁辐射在固相表面上的能量密度为约0.001-0.3μJ/μm2；
71.如段落68所述的方法，其中所述有效距离选自下组：小于1000μm、600μm、300μm、200μm、100μm、60μm、30μm、20μm、10μm、6μm、3μm、2μm和1μm；
72.如段落68所述的方法，其中所述有效距离为约1-20μm；
73.如段落68所述的方法，其中将所述细胞以选自下组的时间段暴露在所述电磁辐射下：最多为1000秒、100秒、10秒、1秒、100毫秒、10毫秒、1毫秒、100微秒、10微秒、1微秒、100纳秒、10纳秒、1纳秒、100皮秒、10皮秒、1皮秒、100飞秒、10飞秒、1飞秒、100埃秒、10埃秒和1埃秒数量级；
74.如段落68所述的方法，其中将所述细胞暴露在所述电磁辐射下约100皮秒-约10秒；
75.如段落68所述的方法，其中所述定向包括将辐射脉冲传递到所述限定体积；
76.如段落68所述的方法，其中所述定向包括根据路径模式使辐射束穿过所述限定体积；
77.如段落68所述的方法，所述方法还包括在细胞中以选自下组的速率诱导透化：至少为10、30、100、300、1000、3000、10,000、30,000、100,000、300,000、1,000,000、3,000,000、10,000,000、30,000,000、100,000,000和240,000,000个细胞/秒；
78.如段落68所述的方法，所述方法还包括在细胞中以约300-10,000,000个细胞/秒的速率诱导透化；
79.如段落68所述的方法，其中经所述透化后，所述细胞的存活机率保持选自下组的数值：至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％和99％；
80.如段落68所述的方法，其中经所述透化后，所述细胞的存活机率保持至少50％-至少90％的数值；
81.如段落68所述的方法，所述方法还包括将所述细胞与非等渗水性介质接触；
82.如段落68所述的方法，其中将所述细胞与水性介质接触，所述水性介质含有当与所述细胞接触时可穿过所述细胞经透化的膜的物质；
83.如段落82所述的方法，其中所述物质选自：离子、有机分子、无机分子、多糖、肽、蛋白质、胶粒、核酸和经修饰的核酸；
84.如段落82所述的方法，其中所述物质通过经透化的膜进入所述细胞；
85.如段落84所述的方法，其中所述经透化的膜在选自下组的时间段中恢复到基本上非透化的状态：最多0.3毫秒、1毫秒、3毫秒、10毫秒、30毫秒、100毫秒、300毫秒、1秒、3秒、10秒、30秒、1分钟、2分钟、3分钟、6分钟、10分钟、20分钟和30分钟；
86.如段落84所述的方法，其中所述经透化的膜在约1秒-约1分钟的时间段中恢复到基本上非透化的状态；
87.如段落68所述的方法，其中将所述电磁辐射以选自下组的速率定向到所述固相表面的一定区域：至少0.0001、0.0003、0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、200、300和400平方厘米/秒；
88.如段落68所述的方法，其中将所述电磁辐射以约0.0003-10平方厘米/秒的速率定向到所述固相表面的一定区域；
89.如段落68所述的方法，其中所述电磁辐射在所述限定体积中的功率密度选自下组：小于约6×107、3×107、2×107，1×107、6×106、3×106、2×106，1×106、6×105、3×105、2×105，1×105、6×104、3×104、2×104和1×104W/cm2；
90.如段落68所述的方法，其中所述定向包括将两种或多种辐射脉冲以选自下组的速率传递到所述限定体积：至少1、10、100、103、104、105、106、107、108和109Hz；
91.如段落68所述的方法，其中所述定向包括将两种或多种辐射脉冲以约102-104Hz的速率传递到所述限定体积；
92.如段落68所述的方法，其中用选自下组的能源产生所述电磁辐射：连续波激光、脉冲激光、连续光灯和闪光灯；
93.如段落68所述的方法，其中所述定向包括根据脉冲靶向模式将两种或多种电磁辐射脉冲传递到所述限定体积；
94.如段落93所述的方法，其中所述电磁辐射脉冲中的各脉冲的持续时间选自下组：最多为1000秒、100秒、10秒、1秒、100毫秒、10毫秒、1毫秒、100微秒、10微秒、1微秒、100纳秒、10纳秒、1纳秒、100皮秒、10皮秒、1皮秒、100飞秒、10飞秒、1飞秒、100埃秒、10埃秒和1埃秒数量级；
95.如段落93所述的方法，其中所述电磁辐射脉冲中的各脉冲的持续时间为约100皮秒-10秒；
96.如段落93所述的方法，其中将至少两种电磁辐射脉冲定向到所述脉冲靶向模式中的单个脉冲靶上；
97.如段落68所述的方法，其中将所述电磁辐射定向到所述固相表面上的限定区域，所述限定区域的面积选自下组：至少为0.0001、0.0003、0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、200、300和400平方厘米；
98.如段落68所述的方法，其中将所述电磁辐射定向到所述固相表面上的限定区域，所述限定区域的面积为约0.0001-10平方厘米；
99.如段落68所述的方法，其中将所述电磁辐射同时定向到基本上整个所述限定体积；
100.如段落68所述的方法，其中所述限定体积中所述电磁辐射的所述路径宽度选自下组：至少10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、300、1×103、2×103、3×103、4×103、5×103、6×103、7×103、8×103、9×103和1×104微米；
101.如段落68所述的方法，其中所述限定体积中所述电磁辐射的所述路径宽度为约10-1000微米；
102.一种用于使细胞瞬时透化的仪器，所述仪器包括：
a)能源，所述能源发射出足以诱导细胞的膜发生透化的电磁辐射，其中所述细胞可为包含在限定体积中的大致固定的细胞，且所述限定体积中的细胞的具体坐标是未知的；
b)命令，所述命令用于使所述电磁辐射定向到所述限定体积中的多个位点而无需考虑所述多个位点的性质；和
定向器件，所述定向器件用于根据所述命令对所述电磁辐射进行定向；
103.一种用于使细胞瞬时透化的仪器，所述仪器包括：
a)能源，所述能源发射出足以诱导细胞的膜发生透化的电磁辐射，其中所述细胞可为包含在限定体积中的大致固定的细胞，且所述限定体积中的细胞的具体坐标是未知的；
b)命令，所述命令用于使所述电磁辐射定向到包含基本上整个所述限定体积的多个位点，其中所述限定体积中的所述电磁辐射在所述固相表面上的能量密度最多为6μJ/μm2；和
c)定向器件，所述定向器件根据所述命令对所述电磁辐射进行定向；
104.一种带有存储器的系统，所述系统包括一系列指令，从而在运行时计算机执行以下操作，包括：将足以诱导大致固定的细胞的膜发生透化的电磁辐射定向到所述固相表面，而无需事先知道所述细胞的具体三维定位，其中所述一个或多个细胞与所述电磁辐射的路径相符；
105.如权利要求1所述的方法，其中还将所述一个或多个细胞与水性介质接触，所述水性介质缺乏一种物质、或含有浓度低于所述一个或多个细胞内物质的所述物质，从而使得所述一个或多个细胞中的所述物质能通过瞬时透化的膜释放出所述一个或多个细胞；
106.如权利要求105所述的方法，其中所述物质选自下组：离子、有机分子、无机分子、胶粒、多糖、肽、蛋白质、核酸和经修饰的核酸；
107.如权利要求1所述的方法，其中还将所述一个或多个细胞与水性介质接触，从而使得所述水性介质中的物质能透过瞬时透化的膜进入所述一个或多个细胞；
108.如权利要求107所述的方法，其中所述物质选自下组：离子、有机分子、无机分子、胶粒、多糖、肽、蛋白质、核酸和经修饰的核酸；
109.如权利要求107所述的方法，其中所述经瞬时透化的膜在选自下组的时间段中恢复到基本上非透化的状态：最多约0.3毫秒、1毫秒、3毫秒、10毫秒、30毫秒、100毫秒、300毫秒、1秒、3秒、10秒、30秒、1分钟、2分钟、3分钟、6分钟、10分钟、20分钟和30分钟；
110.如权利要求107所述的方法，其中所述经瞬时透化的膜在约1秒-约1分钟的时间段中恢复到基本上非透化的状态。
                         附图概述
图1所示为限定体积(V，以x乘以y′乘以d计算)的透视图，描述了固相表面(S)上的限定区域(A，以x乘以y计算)，从所述限定区域出发垂直的有效距离(d)。还可看到在所述限定体积中存在的几个细胞，以及形成所述固相表面的基本上透明的固体材料(M)。
图2所示为细胞处理仪的一个实施方式的透视图，显示了外壳和显示器的外部设计。
图3所示为细胞处理仪的一个实施方式去除外壳的透视图，并显示了内部组件。
图4所示为细胞处理仪的一个实施方式中的光学部件设计框图。
图5所示为细胞处理仪的一个实施方式中的光学部件的一个实施方式的透视图。
图6为光学部件的一个实施方式的侧视图，显示了扫描透镜和可移动的载物台的排列。
图7所示为光学部件的一个实施方式的底部透视图。
图8所示为所述细胞处理仪的可移动载物台的顶部透视图。
图9为通过光注射编码DNA的siRNA后使GFP表达沉默的示意图，通过48小时后的荧光来测定。
图10所示为将siRNA光注射入SU-DHL-6细胞后的细胞生长图。
图11所示为将Zn2+加到NIH-3T3细胞中，通过一分钟后Zn2+指示剂RhodZin-1的荧光来测定。
                           详细描述
实施方式涉及用电磁辐射非特异性辐照细胞以诱导透化的瞬时状态的方法和仪器。所述透化的瞬时状态对于使各种物质进入细胞或载入细胞(细胞装载，cellloading)或使得各种物质从细胞中分离出来(细胞卸载，cell unloading)是非常有利的，且还能使得细胞载入或卸载后，这些细胞在一段时间后恢复到有益于所述细胞继续存活的基本上非透化的状态。
在以下的参考文献中可找到对光注射和光致孔方法的综合讨论，这些文献各自以其全文纳入本文作为参考：Guo，Y.，Liang，H.，和Berns，M.W。1995年。稻中的激光介导基因转移(“Laser-mediated gene transfer in rice”)。Physio.Plant，93：19-24；Shirahata，Y.，Ohkohchi，N.，Itagak，H.，和Satomi，S。2001年。使用激光辐射进行基因转染的新技术(“New technique for gene transfection using laser irradiation”)。J.Invest.Med.，49：184-190；Tao，W.，Wilkinson，J.，Stanbridge，E.J.，和Berns，M.W。1987年。通过细胞膜激光微穿刺易化的直接基因转移进入人培养细胞(“Direct genetransfer into human cultured cell facilitated by laser micropuncture of the cellmembrane”)。PNAS，84：4180-4184；Tirlapur，U.K.和Konig，K.2002年。通过飞秒激光进行的靶向性转染(“Targeted transfection by femtosecond laser”)。Nature，418：290-291；Kurata，S.，Tsukakoshi，M.，Kasuya，T.，和Ikawa，Y.1986年。用于有效将外源DNA导入培养细胞的激光学方法(“The laser method for efficient introduction offoreign DNA into cultured cell”)。Exp.Cell Res.，162：372-378；Koller，M.R.，Hanania，E.G.，Eisfeld，T.M.，和Palsson，B.O.出版于2002年6月20日的美国专利申请公开第20020076744号，名称为：光注射方法(“Optoinjection methods”)，要求2001年9月21日提交的美国专利申请第09/961,691号优先权；Palsson，B.O.，提交于2003年2月4日的美国专利申请第10/359,483号，名称为：用于选择性地靶向细胞群中特异细胞的方法和仪器(“Method and Apparatus for Selectively TargetingSpecific cell within a cell Population”)；Krasieva，T.B.，Chapman，C.F.，LaMorte，V.J.，Venugopalan，V.，Berns，M.W.，和Tromberg，B.J.1998年。通过激光微辐射使细胞透化的机理(“Mechanisms of cell permeabilization by laser microirradiation”)。Proc.SPIE，3260：38-44；和Tsukakoshi，M.，Kurata，S.，Nominya，Y.，Ikawa，Y.，和Kasuya，T.1984年。一种通过激光微束细胞手术进行DNA转染的新方法(“A novelmethod of DNA transfection by laser microbeam cell surgery”)。Appl.Phys.，35：135-140。
本文所描述的方法和仪器无需为了诱导透化的瞬时状态而知道细胞具体三维定位。取而代之的是，可使要进行瞬时透化的细胞存在于限定体积中，其中所述限定体积具有已知的尺寸和空间位置。所述细胞优选可在所述限定体积内处于大致固定的位置，其中大致固定是指在辐照过程中所述细胞不能穿过所述限定体积的边界(不论是进入该限定体积或是离开该限定体积)。所述限定体积由固相表面上的限定区域部分限定，其中所述限定区域在固相表面上具有已知的尺寸和位置。所述限定的区域可具有不同的有效尺寸和/或边界(如，多孔组织培养板中单孔内底面的面积(area)，或组织培养瓶内底面的面积)，这取决于本发明的应用，其包括但不限于：至少0.0001、0.0003、0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、200、300和400平方厘米。所述限定体积还可由从限定区域出发的垂直有效距离限定，其中所述有效距离是预设的距离，已知在这段距离中电磁辐射可有效达到在细胞中诱导透化的瞬时状态的目的(参见图1)。如本文所用，“垂直地”是垂直的副词形式，是指以直角相交或平置。透化的瞬时状态可在细胞内通过将质量和数量足以诱导所述细胞膜透化的电磁辐射定向到所述限定体积来进行诱导。包含在被辐照的限定体积中的细胞与电磁辐射的路径相符，从而使得这些细胞接受能诱导透化剂量的电磁辐射。当细胞与电磁辐射的路径相符，是指至少部分细胞和至少部分电磁辐射在同一时间占据了同样的空间区域。
在一些实施方式中，所述仪器可包括能发射出足以诱导细胞膜透化的电磁辐射的能源。此类能源的常用类型包括但不限于：连续波激光；脉冲激光；连续光灯；和闪光灯。此类能源的特殊类型包括但不限于：带有或不带有滤光器的弧光灯(如，汞灯、氙灯、金属卤化物灯等)；发光二极管(LED)；染料激光器；气体激光器；固态激光器；Q-开关激光器等。在任何瞬间穿过限定体积的电磁辐射的路径(即，限定体积中电磁辐射的瞬时路径)可具有如下有效宽度，例如，至少10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、300、1×103、2×103、3×103、4×103、5×103、6×103、7×103、8×103、9×103和1×104微米。也可有效施用该组宽度中具体宽度范围。例如，所述宽度可为约10微米-1000微米。大于一个细胞的宽度由于可同时辐照多于一个的细胞而具有优势。在许多实施方式中，在电磁辐射的光路(当其从所述能源传播到所述限定体积时)中加入能使电磁辐射成束的光学元件也是很有效的，该辐射束在所述限定体积中在有效的束宽度范围内。
在一些实施方式中，所述仪器还可包括定向器件，所述定向器件用于将电磁辐射定向到所述限定体积从而使得所述电磁辐射透射过基本上整个所述限定体积。一旦电磁辐射离开能源，就需要至少一个元件来将其以足以诱导细胞膜透化的质量和数量定向到限定体积。将从能源发出的电磁辐射的轨道定向到限定体积的元件的例子包括但不限于：反射元件(例如反射器)、折射元件(例如棱镜或光纤)、衍射元件、检流元件、压电倾斜平台(piezo-electric tilt platform)和声光致偏器。
将电磁辐射以有效质量定向到限定体积的一个例子是用光学设计领域已知的光学元件使电磁辐射束形成一定的几何外形。该几何外形可包括而不受限制：在限定体积中的会聚角/扩张角、限定体积中辐射束的直径、限定体积中光束腰的直径、光束中的辐射能量分布等。将电磁辐射以有效质量定向到限定体积的另一个例子是控制电磁辐射各脉冲的持续时间，其中各脉冲的持续时间(即，脉冲宽度)为约1埃秒-约1000秒数量级之间是很有效的。这种控制可通过以下方法来完成，例如，通过：机械快门、光学快门、对能源进行电控制以产生不连续和限定脉冲等方法。将电磁辐射以有效质量定向到限定体积的另一个例子是控制定向到限定体积中同一位置的连续脉冲的频率(通过，例如：机械快门、光学快门、对能源进行电控制以产生不连续和限定脉冲等方法等)；这种脉冲频率的例子包括但不限于，频率范围为至少1Hz-109Hz。同时，将电磁辐射以有效质量定向到限定体积的一个例子是例如通过一个或多个滤光器控制电磁辐射的波长。
将电磁辐射以有效量定向到限定体积的一个例子是在将电磁辐射投射透过基本上整个限定体积的同时，控制投射到固相表面上限定区域的能量面密度或每单位面积的能量。例如，该控制可包括：将辐射束的能量集中在限定光束直径中；通过控制限定体积中激光束的会聚角来控制激光束腰的形状；用滤光器削弱辐射束的能量；通过控制脉冲宽度来限制限定体积中辐射束辐照的持续时间；通过控制定向到限定区域中特定位置的脉冲数来限定辐射束辐照的累积持续时间；或者，将具有小于限定区域的横断面面积的辐射束定向到限定区域中的多个位置，从而使得整个限定区域接受基本均一的累积能量面密度。此外，辐射束可为连续的(如，非闪烁的或脉冲的)且还可具有小于限定区域的横断面面积。在将电磁辐射投射透过基本上整个限定体积时，通过使辐射束以一定路径模式穿过限定区域可使整个限定体积接受基本均一的累积能量密度，该路径模式将重叠路径的量控制在可接受的累积能量面密度限度内。研究者通过将电磁辐射定位于小部分细胞膜(以小于细胞直径的辐照点)并采用了等于或大于7μ(微)J/μ(微)m2的能量密度对细胞进行了透化(Tao，W.，Wilkinson，J.，Stanbridge，E.J.，和Berns，M.W.1987年。在“通过细胞膜激光微穿刺易化的直接基因转移进入人培养细胞”(“Direct gene transfer into humancultured cell facilitated by laser micropuncture of the cell membrane”)。PNAS，84：4180-4184一文中使用了约7-21μJ/μm2的能量密度；Palumbo G，Caruso M，CrescenziE，Tecce MF，Roberti G，Colasanti A.1996年。在“真核细胞中通过染料辅助的激光光致孔进行的靶向性基因转移”(“Targeted gene transfer in eucaryotic cell bydye-assisted laser optoporation”)。J Photochem Photobiol B，36(1)：41-6一文中使用了约1.6×105μJ/μm2的能量密度；以及Guo，Y.，Liang，H.，和Berns，M.W.1995年。在“稻中的激光介导基因转移”(“Laser-mediated gene transfer in rice”)。Physio.Plant，93：19-242一文中使用了约2.5×102-1.3×103μJ/μm2的能量密度；这些参考文献各以其全文纳入本文作为参考)。然而，在本发明的一些优选实施方式中可使用等于或低于6、1、0.1、0.01或甚至0.001μJ/μm2的能量密度来进行细胞瞬时透化，尤其是当整个细胞均被辐照(与仅将部分细胞膜置于辐照下相反)或当以极短的时间段来进行能量传递(例如在小于1微秒、1纳秒、1皮秒、1飞秒或1埃秒的时间段中)时。
为了获得有效诱导瞬时透化的能量密度，以不同的时间段用电磁辐射辐照细胞是有利的，而时间长度取决于能源的性质和在限度体积中所获得的功率密度。例如，具有相对低能量输出的能源(如，连续光灯)可能需要约1000秒的时间来诱导有效程度的瞬时透化。作为另一个例子，可传递出极高能量脉冲的能源(例如，闪光灯或脉冲激光)可能仅需要单个辐射脉冲来诱导有效程度的瞬时透化，使得辐照时间可为约1微秒、1纳秒、1皮秒、1飞秒或甚至1埃秒数量级。
将电磁辐射以有效量定向到限定体积的另一个例子是在将电磁辐射投射透过基本上整个限定体积的同时，控制投射到固相表面上限定区域的能量面密度或每单位面积的能量。例如，该控制可包括：将辐射束的能量集中在限定光束直径中；通过控制限定体积中激光束的会聚角来控制激光束腰的形状；或者，用滤光器削弱辐射束的能量。因此，定向可不仅仅包括了控制限度体积内电磁辐射的轨道，因为它还可包括控制控制限度体积内电磁辐射的质量和数量，而这一控制取决于能源的性质和生物应用所需。
固相表面可存在于不同的细胞容纳器件(cell-containment device)，所述器件包括但不限于：标准组织培养多孔板(例如，6孔板、12孔板、24孔板、48孔板、96孔板、384孔板和1536孔板)；培养皿；显微镜载玻片；塑料袋；组织培养烧瓶；以及组织培养瓶。这些细胞容纳器件的固相表面通常与水性细胞培养基接触。在一些实施方式中，电磁辐射的光路(从能源到限度体积)可包含或不包含形成固相表面的固相材料，从而产生至少两种极为不同的类型的光路配置，每种都具有其独特的优点。
在一类光路配置中，光路从固相表面包含细胞的一侧(即，细胞空间)到达限定体积。此类光路配置的一个例子是细胞和与细胞接触的水性培养基包含在容纳器件中，其中该容纳器件具有水平取向的固相底面、固相壁以及开放式的顶部或对电磁辐射基本上透明的顶部部件。电磁辐射从容纳器件的上方到达容纳器件中的限定体积，它穿过开放式的顶部或对电磁辐射基本上透明的顶部部件、穿过顶部的液相界面、进入限定体积的顶部界限、穿过限定体积并到达固相底面上的限定区域，从而辐照在包含在限定体积中的细胞上。在此类光路配置中，形成固相表面的固体材料对于入射到限定区域上的电磁辐射无需是可透过的，这是由于电磁辐射已经在入射到限定区域的同时穿过了所述限定体积。这种类型光路配置的显著优点是可较简单而价廉地制造细胞容纳器件，这是由于无需采用特殊的透明材料作为固相材料来形成固相表面。
在另一种类型的光路配置中，光路从固相表面包含固体材料的一侧到达限定体积。此类光路配置的一个例子是细胞和与细胞接触的水性培养基包含在容纳器件中，其中该容纳器件具有壁和水平取向的固相底面，该固相底面包含对电磁辐射基本上透明的材料。电磁辐射从容纳器件的下方到达容纳器件中的限定体积，它穿过基本上透明的固相底面的底部、穿过固相底面、穿过固相底面表面上的限定区域并穿过限定体积，从而辐照在包含在限定体积中的细胞上。在此类光路配置中，形成固相表面的固相材料对电磁辐射必须是基本上透明，这是由于电磁辐射必须穿过固相材料才能到达限定体积。这种类型的光路配置的优点包括但不限于：a)具有基本上透明底面的容纳器件能允许产生高分辨率的细胞图像；和，b)透过水性细胞培养基的光路得以最小化，从而使得与水相光学性质相关的变异性最小化。此外，根据本发明的应用和具体实施方式，固相表面可包含不同的材料，包括但不限于：聚合物和玻璃。
该仪器还可包括用于将电磁辐射定向到基本上整个限定体积的命令。在任何给定的瞬间，定向到限定体积的电磁辐射会与一部分限定体积乃至整个限定体积相交。在给定瞬间与电磁辐射相交的限定体积的这一部分被称为相交体积。当相交体积小于整个限定体积时，所述命令必须将电磁辐射定向到多个相交体积、或穿过空间路径扫描相交体积，以确保整个限定体积被辐照到。有效用于将电磁辐射定向到基本上整个限定体积的命令的例子包括但不限于：用于将电磁辐射的各脉冲根据脉冲靶向的模式(即，脉冲靶向模式)进行电磁辐射定向的命令，其中单个脉冲靶可接受一种、两种或多种脉冲；用于将电磁辐射的各脉冲根据栅格模式进行电磁辐射定向的命令(例如，二维垂直栅格模式或三维垂直栅格模式)；用于将连续辐射束根据扫描模式(sweeping pattern)进行电磁辐射定向的命令，其中所述扫描模式允许从事实上的0-100％的辐射束覆盖量；用于电磁辐射单脉冲的命令；用于电磁辐射多脉冲的命令；用于将电磁辐射的连续辐射束定向到限定体积一段特定时间的命令；用于使能源打开或开始辐照的命令；用于使能源关闭或停止辐照的命令；用于使光闸开或关的命令；以及，用于将反射器或透镜移动到特定位置的命令。例如，其中脉冲激光能源各脉冲的相交体积可包括整个限定体积的仅10％，所述命令通过指令发生至少10个系列激光脉冲来将电磁辐射定位到基本上整个限定体积，其中各激光脉冲具有独立的相交体积，且这10个相交体积的重叠是最小的(如，0％的重叠率，用占整个限定体积10％的10个脉冲得到100％的整个限定体积)；这一系列的10个脉冲可，例如，根据脉冲靶向模式定向到限定体积，形成2脉冲靶乘以5脉冲靶的正交栅格，其中当电磁辐射定向到各脉冲靶时，那个脉冲靶产生独立的相交体积，而10个独立相交体积的集合包括了基本上整个限定体积。作为第二个例子的是，来自连续激光能源的电磁辐射束在给定瞬间可包括整个限定体积的仅1％，约1毫秒的辐射辐照包含足以在给定体积内诱导细胞的膜透化的能量剂量，该命令可根据路径模式，通过指令辐射束扫描过整个限定体积，在约100毫秒的时间段内将电磁辐射定向到基本上整个限定体积，该路径模式包括约1毫秒的点特异性停留时间和在限定体积中事实上无路径重叠。例如，所述这些命令可通过计算机或其它电控制自动产生或通过人类操作员手工控制产生。对于具有这种命令的仪器，具有配置用于根据这种命令将电磁辐射定向的定向器件也是很有用的。用于将电磁辐射定向的这种定向器件可包括但不限于：反射元件、折射元件、衍射元件、检流元件、压电倾斜平台、声光致偏器、光闸和滤光器。配置用于电磁辐射定向的此类定向器件还可包括响应这些命令的电或机械激励器。
以小于限定体积的相交体积与限定体积相交的电磁辐射束可要求定向到多个相交体积，从而使得整个限定体积接受到基本上均一剂量的电磁辐射。在本文中，基本上均一剂量理解为该剂量是基本上在限定的量值范围内的。电磁辐射剂量可通过不同方式来量化：能量平面密度、能量体积密度、功率体积密度、能通量和其它工程和光学中已知的电磁辐射量化标准。
一些实施方式使用可被限定体积中的各种材料和对象显著吸收、漫射、折射或反射的电磁辐射波长。所述此类和对象包括但不限于：活细胞、死细胞、细胞碎片和水性培养基。在此类实施方式的设计中要考虑到不同材料和对象对穿过限定体积的电磁辐射的传播可能发生的影响。用于使细胞瞬时透化的电磁辐射波长的范围约为300-3000纳米，其中电磁光谱中可见部分的波长(约400-700纳米)尤为有效。用于有效使细胞瞬时透化的包括近-UV波长的波长范围的一个例子是330-400纳米。用于有效使细胞瞬时透化的包括近-IR波长的波长范围的一个例子是700-1100纳米。
限定体积中不良光学现象影响(例如，吸收、漫射、折射或反射)可通过使用足以使此类不良影响忽略不计的电磁辐射剂量来弥补。同样，可限定确定限定体积的与固相表面的有效距离，从而对限定体积进行限制，考虑到辐射的漫射、折射、反射和吸收后，在该限定体积中的细胞位于可足以使细胞膜被有效诱导发生瞬时透化的距离内。例如，有效距离可为附着于固相表面上的单细胞的厚度(例如，约1μ(微)m-约1000μm数量级)。超过约1000μm数量级的距离会使电磁辐射的能量或功率密度发生显著量的衰减。弥补不良影响的另一类方式包括但不限于：在较长的时间段内使用较低的功率，从而在保持所需总能量剂量的同时降低限定体积中由电磁辐射吸收而造成的温度升高；以及，在限定表面上使用多角度的入射电磁辐射。
可通过多种途径来控制细胞透化速率。可对电磁辐射剂量方法和量进行设计以诱导限定体积中具有特定细胞密度范围的特定细胞类型的透化。这一设计信息可用于选择或设计适当的能源和定向器件以传递经设计的剂量。可将细胞以广泛的细胞密度范围置于限定体积中，该范围为例如，从单个细胞/限定体积-活动物组织中的细胞密度(例如，高达108细胞/立方厘米)。此外，如果所述能源具有充分的能量输出且定向器件可将电磁辐射以高达400平方厘米/秒的速率定向到限定区域上，则细胞透化速率为限定体积中细胞密度与限定区域辐射速率的函数(由此在辐照限定区域期间，限定体积基本上被辐照到)。高通量细胞透化仪的例子是包含闪光灯和定向器件的仪器，该仪器使得由持续时间小于1秒的闪光灯产生的单个辐射脉冲可同时辐照到4块标准多孔板上(每块板度量约8.5cm×12.7cm)，由此得到的辐照超过400平方厘米/秒；在该例中，限定体积包括包含在所有板中的所有孔。例如，各标准多孔板包含至少60×106个细胞，每秒可辐照超过240×106个细胞。可基于这些法则衍生出其它仪器和方法实施方式，以得到很多种有效的细胞透化速率。在某些实施方式中，对一个区域的辐照可以至少0.0001、0.0003、0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、200、300或400平方厘米/秒的速率发生，更优选的速率为至少约0.0003-10平方厘米/秒。在某些实施方式中，细胞的透化可以至少10、30、100、300、1000、3000、10,000、30,000、100,000、300,000、1,000,000、3,000,000、10,000,000、30,000,000、100,000,000或240,000,000个细胞/秒的速率发生，更优选的速率为至少约300-至少约10,000,000个细胞/秒。
透化的瞬时状态对于将各种物质载入细胞或从细胞中卸载，同时使细胞在载入后的一定时间内恢复到有益于细胞继续存活的基本上非透化的状态是很有用的。例如，可在存在于细胞膜内的物质浓度大于细胞膜外的该物质的浓度时发生卸载，所述物质会从较高浓度的位置释放到较低浓度的位置。为了使物质能够被载入瞬时透化的细胞，所述物质可包含于限定体积中包围细胞的水性介质中。此类物质包括但不限于：离子、有机分子、无机分子(如，量子点(Han，M.，Gao，X.，Su，J.Z.，和Nie，S。2001年。用于各种光学编码活质分子的量子点标记微珠，“Quantum-dot-taggedmicrobeads for multiplexed optical coding of biomolecules”。Nat.Biotech.，19：631-635；以其全文作为参考纳入本文))、多糖、肽、蛋白质、胶粒、核酸(如，寡核苷酸、多核苷酸和质粒)以及经修饰的核酸(如，肽核酸)。根据应用，所述核酸可为单链或双链DNA或RNA。寡核苷酸是通过磷酸二酯键连接的最多20个核苷酸的序列。多核苷酸通常为多于约20个核苷酸的序列。离子的例子包括而不限于：锌和钙离子。无机分子的例子包括而不限于：半导体纳米晶体(也称为量子点)。在透化的瞬时状态中，此类物质可通过透化的膜进入细胞。
当对电磁辐射剂量进行了适当的控制，所述经透化的膜可在一定时间内恢复到基本上非透化的状态，这种状态既有益于将足量的物质载入细胞又有益于载入后细胞的继续存活。对于离子(Nilius B，Hess P，Lansman JB，Tsien RW。心室细胞中的新型心脏钙通道，“A novel type of cardiac calcium channel in ventricular cell”。Nature.1985年8月1-7；316(6027)：443-6；以其全文纳入本文作为参考)和其它小分子，有效的瞬时透化时间可短至小于0.3毫秒。超过约30分钟数量级的瞬时透化时间通常会导致较低的细胞存活率。在膜恢复到基本非透化的状态后，载入的物质可在细胞中保持其原来的形式不同长短的时间段，这取决于所述物质在特定细胞中的命运。例如，所述物质可被快速水解、磷酸化、酶切或整合入细胞基因组。通常需要调整电磁辐射的剂量(质、量和施予的方法)从而使得载入后的细胞存活率保持在大于至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。优选的存活率为至少约50％-至少约90％。
可选择不同的时间点来测定载入后的细胞存活率，所述时间点的适合度取决于具体的应用。例如，所述时间点可为能确定物质已进入细胞的时间、物质对细胞代谢或遗传流程(genetic circuitry)的时间或载入后的固定时间段(例如24小时)。
在一些实施方式中，为保持可接受的高水平细胞存活率，电磁辐射剂量通常具有小于1×1013瓦(W)/cm2的功率密度。Tirlapur等(Nature，418卷，182002年7月，第290-1页)揭示了使用1×1012W/cm2的平均功率密度，其相当于在单个脉冲中1019W/cm2的峰值密度，Tao等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84卷，第4180-4184页，1987年6月)揭示了使用约7.3×1010W/cm2-2.1×1011W/cm2，Palumbo等(J.ofPhotochem.Photobio.B：Biology 36，1996年，第41-46页)揭示了使用约6.4×107W/cm2，而Guo等(Physiologia Plantarum 93，第19-24页，1995年)揭示了使用约1.7×1012W/cm2的-8.5×1012W/cm2。Tirlapur等、Tao等和Palumbo等的参考文献各以其全文纳入本文作为参考。在一些实施方式中，例如，如果辐照时间足够短或对细胞存活率的要求相对较低，则可使用大于约1×1013、2×1013、3×1013、6×1013、1×1014、2×1014、3×1014、6×1014、1×1015、2×1015、3×1015、6×1015、1×1016、2×1016、3×1016、6×1016和1×1017W/cm2的能量密度。此外，在其它实施方式中，例如，如果辐照时间足够长且辐照区域大到足以容纳可行的细胞透化速率，则可使用小于约6×107、3×107、2×107、1×107、6×106、3×106、2×106、1×106、6×105、3×105、2×105、1×105、6×104、3×104、2×104和1×104W/cm2的能量密度。
物质进入细胞的载入速率的其它提高可通过将非等渗水性介质与细胞中瞬时透化的诱导结合使用来获得。可在电磁辐射诱导透化之前、之中或之后将细胞暴露于非等渗水性介质，以获得物质载入速率的提高。该速率可用不同术语来表示，包括但不限于：每个细胞所载入物质的量；每个细胞在每单位时间内载入物质的量；或者，限定体积内成功载入阈值水平物质的总细胞的分数(或百分比)。有效的低渗水性介质的例子是含有25mM KCl、0.3mM KH2PO4和90mOsm/Kg肌醇的溶液；也可将这一溶液与标准等渗磷酸缓冲盐(PBS)溶液以1∶1的比例混合以产生具有更缓和的低渗透性的低渗介质。有效的高渗水性介质的例子是含有25mM KCl、0.3mM KH2PO4和400mOsm/Kg肌醇的溶液；也可将这一溶液与标准等渗磷酸缓冲盐(PBS)溶液以1∶1的比例混合以产生具有更缓和的高渗透性的高渗介质。本领域的技术人员应认识到其它非等渗水性介质配方也可有效用于提高物质载入速率。
图2所示为可用于使细胞发生瞬时透化和/或将物质载入细胞的仪器10的一个实施方式。仪器10包括外壳15，其中容纳有内部组件。所述外壳包括激光安全开关以确保使用者的安全，还可限制外部影响的干扰(如，周围的光线、灰尘等)。位于外壳15上部的是用于显示程序信息的显示单元20。键盘25和鼠标30用于输入数据和控制仪器10。通道门35提供了支持细胞容器的可移动载物台的入口。
图3所示为仪器10的内视图。如图所示，仪器10配备有用来支持仪器内部组件的上部托架200和下部托架210。上部托架200包括用于过滤被吸入仪器10内部的环境空气的一对进气过滤器215A、B。通道门35下方的是光学部件(未示出)。所述光学部件安装在上部托架200上，在图4-7中将进行详细描述。
下部托架210上的是计算机225，其存储了运行仪器10的软件程序、命令和指令。此外，计算机225通过电信号连接为处理仪提供控制信号，以对来自激光源的电磁辐射进行定向。
如本文所用“计算机”可为(不限于这些)任何微处理器或由处理器控制的器件，例如个人电脑、工作站、服务器、客户机、微电脑、主机、便携计算机、个人电脑网络、移动计算机、掌上电脑、手提电脑、TV机顶盒、互动电视、互动亭(interactivekiosk)、个人数码助理(digital assistant)、互动无线通讯器、移动浏览器或它们的组合。所述计算机还可具有输入装置，例如键盘、鼠标、触摸板、手柄、手写输入板，以及输出装置，例如计算机屏幕和扬声器。这些计算机可为单处理器或多处理器机。
此外，这些计算机可包括可寻址存储器或存储介质或计算机可接受介质，例如随机存取存储器(RAM)、电可擦可编程只读存储器(EEPROM)、可编程只读存储器(PROM)、可擦可编程只读存储器(EPROM)、硬盘、软盘、光盘播放器、数码映像设备、高密度磁盘、录像磁带、录音磁带、磁性记录轨道、电子网络和其它用于传输或存储电子内容(例如程序和数据)的技术。在一些实施方式中，计算机可配备有网络通讯设备，例如网络接口卡、调制解调器或适于连接到网络通讯介质的其它网络连接设备。
如图所示，系列电源230A、B、C为仪器10中的各种电子组件提供电能。此外，还装有用于使仪器在短时外能中断时继续工作的不间断电源235。
图4所示为仪器10的一个实施方式中的光学部件设计300的一个实施方式的线路图。激光400被递呈以辐照细胞。如图所示，激光400通过光闸410后输出523nm的能量束。虽然代表性的激光输出能量束所具波长为523nm，由其它能源产生的其它波长的能量也同样在本发明的范围中。
一旦激光能量束穿过光闸410，它就进入了光束扩展器(Special Optics，Wharton，NJ)415，该光束扩展器将固相表面平面上的能量束调整到适宜的直径。光束扩展器415之后的是半波偏振片420，该半波偏振片控制了能量束的偏振。然后，激光能量束经反射器425反射并进入立方分束器350。激光能量束在立方分束器350中被反射90°。经立方分束器350通过反射器355反射出的激光束长波由检流器360转向，然后进入扫描透镜365，最后聚焦在限定体积中。
由于其稳定、高反射重复率和长期无需维护维修的优点而使用Nd:YLF倍频固相固态激光器(Spectra-Physics，Mountain View，CA)。其它类似的激光器，包括Nanolaser(JDS Uniphase，San Jose，CA)Nd:YAG第一谐波(first harmonic，1064nm)、Nd:YAG第二谐波(532nm)和Nd:YAG第三谐波(355nm)型均可用于本仪器。
现在参考图5，所示为光学部件的一个实施方式的透视图。如图5的透视图中所示，激光400将能量传递过光闸410并进入光束扩展器415。来自激光400的能量穿过光束扩展器415，穿过半波偏振片420，然后击中折叠反射器425，进入立体分束器350被反射90°到达长波递送反射器355，并由反射器355将其反射到计算机控制的检波反射器360。由检波反射器360导向后，激光能量束穿过扫描透镜365，命中限定体积以诱导限定体积中存在的任何细胞发生透化。
为了适应具有很大表面积的待处理样品，所述仪器还包括可移动的载物台，该载物台相对于扫描透镜使样品容器机械移动。由此，一旦固相表面的某一特定区域被处理后，可移动载物台将固相表面的另一区域移到扫描透镜视场中。如图6所示，计算机控制的可移动载物台500承载要进行处理的容器(未示出)。可移动载物台500通过计算机控制的伺服马达沿两个轴移动，从而使得样品容器可根据该仪器的光学组件进行移动。沿限定路径的载物台移动与仪器的其它操作是协调的。此外，可存储具体的坐标并调用以使得可移动载物台回复到感兴趣的位置。x和y移动的编码器对载物台位置进行闭环反馈控制。
平场(F-θ)扫描透镜365安装在可移动载物台之下。透镜365安装有使透镜365自动上升和下降(沿z轴)的步进马达，从而达到将系统聚焦在限定体积的目的。
现在参考图8，图8所示为可移动载物台500的顶视图。如图所示，容器放置在可移动载物台500中。容器505架在上部轴套片510上，该套片设计为可根据可移动载物台500在前/后方向上移动。步进马达(未示出)与上部轴套片510和计算机系统连接，从而使样品容器505在来自计算机的命令下前/后移动。
可移动载物台500还与同步齿形带515相连，从而使得可移动载物台500沿一对支座轨道525A、B从一侧向另一侧移动。同步齿形带515与装在滑轮盖530下的滑轮(未示出)接触。滑轮与驱动同步齿形带515的步进马达535相连以使可移动载物台500从一侧向另一侧移动。步进马达535电连接于计算机系统，从而通过计算机系统中的命令使得可移动载物台500从一侧向另一侧移动。移动限制传感器540与计算机系统连接并在可移动载物台移动超过预设侧向距离时产生警报。
优选将一对加速计545A、B安装在这一平台上以记录可能会干扰仪器操作的任何过度碰撞或震动。此外，优选将双轴倾斜仪550安装在可移动载物台上以确保容器水平，从而减少容器中由重力引起的移动。
该箱室(chamber))具有带风道的风扇以消除容器上的冷凝，以及热电偶以测定该箱室是否在可接受的温度范围内。安装其它风扇以排散出由电子组件所产生的热量，并在空气进气口215A、B上安装适当的过滤器。
计算机系统225控制了上述各种电子硬件部分的操作和同步化。计算机系统可为任何能与硬件连接的商业化计算机。计算机可使用任何适合的操作系统，包括但不限于，例如：Linux、Unix、Microsoft、Windows、Apple、MacOS和IBMOS/2。此类计算机系统的例子是运行MicrosoftWindows NT操作系统的基于英特尔奔腾II的计算机。计算机系统的另一例子是具有奔腾III或IV处理器和可运行WindowsXP操作系统的计算机。软件用于沟通各种设备并控制下述的操作方式。
一旦将容器放置在可移动载物台上并关上门，计算机传送信号使平台移动到起始位置。风扇初始化以开始预热并为容器除雾。此时，容器中的细胞沉降于固相表面。此外，在此时，仪器可运行确保容器被适当放置并处于光学系统的聚焦范围内的命令。例如，可通过系统对容器上的特殊标记进行定位并聚焦以确保扫描透镜已恰当地聚焦在容器的底部。在适宜的时间后，计算机关闭风扇以防止处理中的过度震动，并开始处理。
操作者可通过键盘和鼠标直接对仪器进行操作，例如，以选择将容器的哪一部分暴露在电磁辐射下。然后，计算机指令将可移动载物台定位在扫描透镜之上从而使得容器要被辐照的第一区域直接位于扫描透镜视场中。激光器开始以预设的速率发射，并通过移动检流器反射器将各激光脉冲定向到不同的限定体积。由于激光器和检流器的速度，数以千计的脉冲可每秒定向到数以千计的限定体积，从而实现高通量的细胞膜透化。检流器的一个牌子是Cambridge Technology，Inc.型号6860(Cambridge，MA)。这种检流器可在1毫秒内极精确地复位，从而使得在适当量的时间内进行大面积的处理成为可能。通过检流器控制板连续产生的报错型号由计算机以闭环形式检测以在激光器发射前确保反射器处于适当的位置且稳定。
应注意和理解可对图2-8中所描述的系统进行改造。例如，有些方法和仪器无需某些光学组件(例如照相机和照明源)，虽然那些组件可用于本文所揭示的实施方式中。
其它实施方式涉及带有存储器的系统，所述存储器包括一系列指令。当执行指令时可使得计算机执行某一动作。该动作可包括：将足以诱导大致固定的细胞的膜发生透化的电磁辐射定向到所述固相表面，而无需事先知道所述细胞的具体三维定位，其中所述一个或多个细胞与所述电磁辐射的路径相符。该动作还可包括：将电磁辐射定向到限定体积中的某个位置上而无需考虑该位置的特性。“该位置的特性”可包括知晓细胞是否处于某一特定位置，例如基于该位置的显影、位置的颜色、位置的荧光、光传播等。这一点与基于荧光标记、可视影像、染料等对辐射进行定向是相反的。电磁辐射的量可有效诱导与电磁辐射相符的细胞的膜透化。
所述存储器可为任何适宜的存储器，包括上述的任何存储器。该套指令可为C++编码、其它任何编码、初始化文件、模拟电路(analogue circuit)等。计算机可为任何计算机，包括上述用于任何操作系统的那些，包括Windows XP操作系统。
下述的实施例所示为所描述的方法和仪器在不同应用中的用途。
                            实施例
                   实施例1：将核酸载入细胞
由于最近在哺乳动物细胞中发现了有效的RNA干扰(RNAi)介导的基因沉默(Elbashir，S.M.，Harborth，J.，Lendeckel，W.，Yalcin，A.，Weber，K.，和Tuschl，T。2001年。培养的哺乳动物细胞中由21个核苷酸RNA双链介导的RNA干扰，“Duplexes of21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells”。Nature，411：494-498；以其全文纳入本文作为参考)，对其发现和治疗用途，学术界和法人研究者已有重要的证实和兴趣。RNAi相对于更早的用于基因沉默的反义技术具有很多优点，从而使得很多最近的报告提到了很多有用的模式系统。然而，核酸不易穿过完整的活细胞膜，且目前大多数的报告描述了关于现有细胞转染方法对使用RNAi的限制。虽然RNAi是极具潜能的工具，却没有可用的高效和高存活率的转染方法。激光介导的光注射与其它技术相结合能克服许多所述限制。
在这一实施例中，编码有义和反义RNAi链的DNA购自AlleleBiotechnology(圣地亚哥，CA)。这一方法是基于RNAi盒的，其中基于U6 RNA的聚合酶III启动子和经修饰的终止子用于在细胞内高水平且特异性地表达RNAi。在试剂盒中配备有DNA模板和上游引物。下游GFP特异性引物(有义和反义)用于通过PCR产生有义和反义小干扰RNA(siRNA)转录物，PCR所用条件为厂商推荐条件(LineSilenceTM Kit，Allele Biotechnology，San Diego，CA)。以下54bp的DNA序列代表终止子、基因特异性下游序列和模板配对区。
5′-caaaaactgtaaa AA GAACGGCATCAAGGTGAA C ggtgtttcgtcctttccaca-3′(SEQ ID NO：1)
5′-caaaaactgtaaa AA GTTCACCTTGATGCCGTT C ggtgtttcgtcctttccaca-3′(SEQ ID NO：2)
然后纯化PCR产物，退火并用于光注射研究，以实现对GFP报告基因的基因沉默。
生长在含有10％FBS和0.2mg/ml G418的RPMI 1640中的293T-GFP细胞(293T获自ATCC，马塞诸塞，VA，用phrGFP-1(Stratagene，La Jolla，CA)转染)经胰蛋白酶消化，铺在384-孔板内。孵育所述细胞，用24小时使其贴壁，然后以PBS洗涤一次进行原位处理，再加入在5μl(微升)Hypo-osmolar Buffer(Brinlcman，Westbury，NY)中的有义和反义PCR寡核苷酸(10-25ng)。将孔的一个区域暴露在预定栅格模式的激光照射中，而无需在照射前知道靶细胞的位置。仅供参考的是，该区域的周长(约0.0001平方厘米)示于图9中的虚线框。由于这些细胞是附着在固相表面上生长的，所述有效距离为数微米。将波长为523nm、10μ(微)J/脉冲且脉冲宽度为10纳秒的脉冲激光束聚焦在到低至30μ(微)m的直径(考虑到样品中限定体积的50％传播效率，所得能量密度为每脉冲0.007μJ/μm2，而峰值功率密度为7×107W/cm2)，然后发射脉冲并引导，以使得预定栅格模式中相邻发射间的距离在x和y方向上均为20μm。以300次/秒的速率发射和引导激光脉冲，使得在小于1/10秒内辐照整个限定体积。这一方法使得限定体积中的每个细胞都受到辐照而无需事先知道细胞的位置。图9所示的图像仅供参考，并不是用于靶向细胞或区域。在激光处理后立即去除缓冲液，并换上生长培养基并将板直接放置在培养箱中。48小时后，用碘化丙锭确定了细胞的存活率为＞70％，并用荧光显影来确定框中细胞GFP基因的沉默。在限定体积外的孔对照区域中(无激光辐射，但暴露在同样的试剂中)，大部分细胞表达GFP。在限定体积中，所有细胞(数量约为30个)的GFP表达显著下降。结果显示限定体积中的细胞成功地被透化并载入了DNA，使得GFP基因沉默。
                   实施例2：将siRNA载入细胞
在这一实施例中，通过光注射siRNA使得SU-DHL-6细胞中的bcl-2/IgH基因沉默从而使得细胞生长受到抑制(图10)，这一结果明确证实传递了功能性siRNA以影响细胞功能。细胞以500个细胞/孔的密度生长在384孔培养板中，培养基为RPMI 1640和10％FBS。以10nM(在含1％HAS的PBS中)的浓度加入编码bcl-2的siRNA。在这一实施例中，限定体积包含孔的整个区域(约0.03平方厘米)，有效距离为约10-20微米，这是由于SU-DHL-6细胞不是附着在固相表面上生长的。用532nm光、25μm直径的辐射束来对细胞进行光注射，所用栅格模式为25微米间距，10μJ/脉冲和0.5纳秒的脉冲宽度(考虑到样品中限定体积的50％传播效率，所得能量密度为每脉冲0.01μJ/μm2，峰值功率密度为2×109W/cm2)。在这一实施例中，以1,200/秒的速率发射并引导脉冲，从而使限定体积在4秒内被辐照。在激光处理后立即洗涤细胞并加入生长培养基，然后对细胞进行孵育。48小时后的细胞存活率＞50％。将细胞培养总共10天，在第2、4、6、8和10天进行细胞计数。除了有效的细胞透化、载入和基因沉默，这些数据显示光注射后无siRNA，或有针对不相关目标(即GFP)的siRNA的正常细胞生长。
这种细胞转染的方法非常简单、快速和无害(＞90％的存活率，细胞生长速率不变)，且可应用于广范围的试剂(如，质粒、寡核苷酸、小的有机分子、离子等)。
                     实施例3：将锌载入细胞
为了证实来自胞外介质中的离子可被载入，选择了细胞内含量极低的Zn2+进行光注射。首先用Zn2+敏感指示剂(RhodZin-1；Molecular Probes，Inc.Eugene，OR)对NIH-3T3细胞进行染色，所用的缓冲液为含[Zn2+]o＝1mM的PBS。限定区域的周长(约0.001平方厘米)在图11中清晰可见。由于这些细胞生长是附着在固相表面上的，有效距离为数微米。将波长为523nm、脉冲宽度为10纳秒的两个脉冲的脉冲激光束聚焦在到低至30μm的直径(考虑到样品中限定体积的50％传播效率，所得能量密度为每脉冲0.001μJ/μm2，而峰值功率密度为1×107W/cm2)，然后发射脉冲并引导，以使得预定栅格模式中相邻发射间的距离在x和y方向上均为50μm。图11所示的荧光图像是在530nm处激发，而在发射则是在590nm检测到的。A组显示了细胞在约为0的基础[Zn2+]I时具有极低的荧光强度。B组显示了光注射后的细胞，其中限定体积中的细胞(即，左下角)由于[Zn2+]i的提高而具有提高的RhodZin-1荧光强度。在这些条件下测得的细胞存活率为＞90％。该结果证实对限定体积内细胞的激光辐照，在高[Zn2+]0时造成提高的[Zn2+]i。该试验还证实进入细胞液的离子流是来自胞外介质中，而不是来自胞内储备的。
虽然已通过本文例举的具体实施方式对本发明的方面进行了描述，但本发明不仅限于此。
                       所引用的参考文献
所有下述和本文中的参考文献均以其全文纳入本文作为参考。
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                          序列表
<110>肿瘤股份有限公司(ONCOSIS，Inc.)
     M.R.科勒(KOLLER，Manfren，R.)
     E.G.哈南拉(HANANLA，Elie，G.)
     R.布兰德斯(BRANDES，Rolf)
     T.M.艾斯费尔德(EISFELD，Timothy，M.)
<120>用于细胞透化的方法和仪器
<130>ONCOSIS.005VPC
<140>US 10/698343
<141>2003-10-31
<160>2
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>54
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于GFP基因特异性RNA干扰中的PCR产物
<400>1
caaaaactgt aaaaagaacg gcatcaaggt gaacggtgtt tcgtcctttc caca              54
<210>2
<211>54
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于GFP基因特异性RNA干扰中的PCR产物
<400>2
caaaaactgt aaaaagttca ccttgatgcc gttcggtgtt tcgtcctttc caca              54

Claims (44)

1.一种瞬时透化一个或多个细胞的方法，所述方法包括：
a)将所述一个或多个细胞保持在离开固相表面有效距离中大致固定的位置上；和
b)将足以诱导所述一个或多个细胞的膜发生瞬时透化的电磁辐射定向到所述固相表面，而无需事先知道所述一个或多个细胞的具体三维定位，其中所述一个或多个细胞与所述电磁辐射的路径相符。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述电磁辐射在所述固相表面上的能量密度选自下组：最多约0.001、0.002、0.003、0.006、0.01、0.02、0.03、0.06、0.1、0.2、0.3、0.6、1、2、3、4、5和6μJ/μm2。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述电磁辐射在所述固相表面上的能量密度为约0.001-0.3μJ/μm2。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有效距离选自下组：小于约1000μm、600μm、300μm、200μm、100μm、60μm、30μm、20μm、10μm、6μm、3μm、2μm和1μm。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有效距离为约1-20μm。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述电磁辐射以选自下组的时间段定向到所述一个或多个细胞：最多为1000秒、100秒、10秒、1秒、100毫秒、10毫秒、1毫秒、100微秒、10微秒、1微秒、100纳秒、10纳秒、1纳秒、100皮秒、10皮秒、1皮秒、100飞秒、10飞秒、1飞秒、100埃秒、10埃秒和1埃秒数量级。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述一个或多个细胞暴露于所述电磁辐射约100皮秒-约10秒。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述定向包括将辐射脉冲传递到所述固相表面。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述定向包括根据路径模式使辐射束穿过所述固相表面。
10.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括以选自下组的速率诱导所述一个或多个细胞的膜瞬时透化：至少10、30、100、300、1000、3000、10,000、30,000、100,000、300,000、1,000,000、3,000,000、10,000,000、30,000,000、100,000,000和240,000,000个细胞/秒。
11.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括以约300-10,000,000个细胞/秒的速率诱导所述一个或多个细胞的膜瞬时透化。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述一个或多个细胞的膜经所述透化后，所述一个或多个细胞的存活机率保持选自下组的数值：至少为50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％和99％。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述一个或多个细胞的膜经所述透化后，所述一个或多个细胞的存活机率保持至少50％-至少90％的数值。
14.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括将所述一个或多个细胞与非等渗水性介质接触。
15.如权利要求1所述的方法，其特征还在于，将所述一个或多个细胞与水性介质接触，所述水性介质缺乏物质、或含有比所述一个或多个细胞内所述物质浓度低的所述物质，从而使得所述一个或多个细胞中的所述物质能通过瞬时透化的膜释放出所述一个或多个细胞。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述物质选自下组：离子、有机分子、无机分子、胶粒、多糖、肽、蛋白质、核酸和经修饰的核酸。
17.如权利要求1所述的方法，其特征还在于，将所述一个或多个细胞与水性介质接触，从而使得所述水性介质中的物质可穿过经瞬时透化的膜进入所述一个或多个细胞。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述物质选自下组：离子、有机分子、无机分子、胶粒、多糖、肽、蛋白质、核酸和经修饰的核酸。
19.如权利要求17所述的方法，其特征还在于，所述经瞬时透化的膜经选自下组的时间段恢复到基本上非透化的状态：最多约0.3毫秒、1毫秒、3毫秒、10毫秒、30毫秒、100毫秒、300毫秒、1秒、3秒、10秒、30秒、1分钟、2分钟、3分钟、6分钟、10分钟、20分钟和30分钟。
20.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述经瞬时透化的膜经约1秒-约1分钟的时间段恢复到基本上非透化的状态。
21.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述电磁辐射以选自下组的速率定向到所述固相表面的某一区域：至少约0.0001、0.0003、0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、200、300和400平方厘米/秒。
22.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述电磁辐射以约0.0003-10平方厘米/秒的速率定向到所述固相表面的某一区域。
23.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述定向包括将两种或多种辐射脉冲以选自下组的速率传递到所述固相表面：至少1、10、100、103、104、105、106、107、108和109Hz
24.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述定向包括将两种或多种辐射脉冲以约102-104Hz的速率传递到所述固相表面。
25.如权利要求1所述的方法，其特征在于，由选自下组的能源产生所述电磁辐射：连续波激光、脉冲激光、连续光灯和闪光灯。
26.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述定向包括根据脉冲靶向模式将两种或多种电磁辐射脉冲传递到所述固相表面。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述电磁辐射脉冲中各脉冲的持续时间选自下组：最多为1000秒、100秒、10秒、1秒、100毫秒、10毫秒、1毫秒、100微秒、10微秒、1微秒、100纳秒、10纳秒、1纳秒、100皮秒、10皮秒、1皮秒、100飞秒、10飞秒、1飞秒、100埃秒、10埃秒和1埃秒数量级。
28.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述电磁辐射脉冲中各脉冲的持续时间为约100皮秒-约10秒。
29.如权利要求26所述的方法，其特征在于，将至少两种电磁辐射脉冲定向到所述脉冲靶向模式中的单个脉冲靶。
30.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述电磁辐射定向到所述固相表面上的限定区域，所述限定区域的面积选自下组：至少0.0001、0.0003、0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、200、300和400平方厘米。
31.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述电磁辐射定向到所述固相表面上的限定区域，所述限定区域的面积为约0.0001-10平方厘米。
32.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述电磁辐射同时定向到基本上整个所述限定区域。
33.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述电磁辐射的路径宽度选自下组：至少为10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、300、1×103、2×103、3×103、4×103、5×103、6×103、7×103、8×103、9×103和1×104微米。
34.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述电磁辐射的路径宽度为约10-1000微米。
35.一种用于使细胞瞬时透化的仪器，所述仪器包括：
a)能源，所述能源发射出足以诱导细胞的膜发生透化的电磁辐射，其中所述细胞可为包含在限定体积中的大致固定的细胞，且所述限定体积中的细胞的具体坐标是未知的，其中所述限定体积由固相表面部分限定；
b)定向器件，所述定向器件用于将所述电磁辐射定向到基本上整个所述限定体积，其中所述细胞与所述电磁辐射的路径相符，且其中所述限定体积中的所述电磁辐射在固相表面上的能量密度最多为约6μJ/μm2；和
c)所述固相表面。
36.如权利要求35所述的仪器，其特征在于，所述限定体积中的所述电磁辐射在固相表面上的能量密度选自下组：最多约0.001、0.002、0.003、0.006、0.01、0.02、0.03、0.06、0.1、0.2、0.3、0.6、1、2、3、4和5μJ/μm2。
37.如权利要求35所述的仪器，其特征在于，所述限定体积中的所述电磁辐射在固相表面上的能量密度为约0.001-0.3μJ/μm2。
38.如权利要求35所述的仪器，其特征在于，所述定向器件根据脉冲靶向模式将电磁辐射脉冲定向到所述限定体积。
39.如权利要求37所述的仪器，其特征在于，所述电磁辐射脉冲中的各脉冲的持续时间选自下组：最多为1000秒、100秒、10秒、1秒、100毫秒、10毫秒、1毫秒、100微秒、10微秒、1微秒、100纳秒、10纳秒、1纳秒、100皮秒、10皮秒、1皮秒、100飞秒、10飞秒、1飞秒、100埃秒、10埃秒和1埃秒数量级。
40.如权利要求37所述的仪器，其特征在于，所述电磁辐射脉冲中的各脉冲的持续时间约10秒-100皮秒。
41.如权利要求37所述的仪器，其特征在于，将至少两种电磁辐射脉冲定向到所述脉冲靶向模式中的单个脉冲靶上。
42.如权利要求35所述的仪器，其特征在于，所述电磁辐射的路径宽度选自下组：至少为10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、300、1×103、2×103、3×103、4×103、5×103、6×103、7×103、8×103、9×103和1×104微米。
43.如权利要求35所述的仪器，其特征在于，所述电磁辐射的路径宽度为约10-1000微米。
44.一种带有存储器的系统，所述系统包括一系列指令，从而在运行时计算机执行以下操作，包括：将足以诱导大致固定的细胞的膜发生透化的电磁辐射定向到所述固相表面，而无需事先知道所述细胞的具体三维定位，其中所述细胞与所述电磁辐射的路径相符。
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