JP6758371B2 - 細胞の培養方法および培養液 - Google Patents
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- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
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Description
本発明は、細胞の培養方法および培養液に関する。
細胞を培養する際の足場材料として、セルロースナノファイバー等のナノファイバーを用いることが知られている。
例えば、特許文献１には、間葉系幹細胞をセルロースナノファイバー等の天然物由来の多糖類が分散されてなる細胞培養液の中に液中を漂うように分散させることにより、培養液を凍結させることなく、培養条件下で間葉系幹細胞の分化を抑制し、そして望みの一定期間、初期状態を維持し保存することができること、および、セルロースナノファイバー等のナノファイバーの形態にある多糖類といった天然物由来の多糖類を用いることにより、一般的な細胞回収方法により、培養液からの間葉系幹細胞の回収が可能であり、間葉系幹細胞の再利用が可能となることが記載されている（［００１１］）。
また、特許文献２には、ヒドロゲルまたは膜の形態の植物由来の機械的に崩壊させたセルロースナノファイバーおよび／またはその誘導体を含む細胞培養または細胞送達組成物が記載され、さらに、細胞を提供する工程、細胞をこの細胞培養または細胞送達組成物と接触させ、マトリックスを形成する工程、およびそのマトリックス内で三次元または二次元の配置で細胞を培養する工程を含む細胞を培養する方法、ならびに、細胞培養培地および細胞を含む材料を提供する工程、細胞培養材料を分解酵素と接触させる工程、細胞および細胞凝集体を沈降させるために材料を遠心する工程、およびデカンテーションによりセルロースナノファイバーを除去する工程を含む、細胞培養材料から植物ベースのセルロースナノファイバーおよび／またはその培養体を除去する方法が記載されている（特許請求の範囲）。
例えば、特許文献１には、間葉系幹細胞をセルロースナノファイバー等の天然物由来の多糖類が分散されてなる細胞培養液の中に液中を漂うように分散させることにより、培養液を凍結させることなく、培養条件下で間葉系幹細胞の分化を抑制し、そして望みの一定期間、初期状態を維持し保存することができること、および、セルロースナノファイバー等のナノファイバーの形態にある多糖類といった天然物由来の多糖類を用いることにより、一般的な細胞回収方法により、培養液からの間葉系幹細胞の回収が可能であり、間葉系幹細胞の再利用が可能となることが記載されている（［００１１］）。
また、特許文献２には、ヒドロゲルまたは膜の形態の植物由来の機械的に崩壊させたセルロースナノファイバーおよび／またはその誘導体を含む細胞培養または細胞送達組成物が記載され、さらに、細胞を提供する工程、細胞をこの細胞培養または細胞送達組成物と接触させ、マトリックスを形成する工程、およびそのマトリックス内で三次元または二次元の配置で細胞を培養する工程を含む細胞を培養する方法、ならびに、細胞培養培地および細胞を含む材料を提供する工程、細胞培養材料を分解酵素と接触させる工程、細胞および細胞凝集体を沈降させるために材料を遠心する工程、およびデカンテーションによりセルロースナノファイバーを除去する工程を含む、細胞培養材料から植物ベースのセルロースナノファイバーおよび／またはその培養体を除去する方法が記載されている（特許請求の範囲）。
従来の培養細胞の回収方法では、浮遊培養した細胞を遠沈処理にかけ、沈降させた細胞を回収していた（特許文献１、特許文献２）。
しかし、遠沈処理時に細胞にかかる遠心加速度によって細胞が潰されてダメージを受けるため、細胞増殖率および細胞回収率を両立できないことが問題となっていた。
また、遠沈処理を行うために、培養により得られた細胞分散液を希釈する必要があるなど、煩雑な操作を要する工程が増加することによって、培養コストが上昇する等の不利益があった。
しかし、遠沈処理時に細胞にかかる遠心加速度によって細胞が潰されてダメージを受けるため、細胞増殖率および細胞回収率を両立できないことが問題となっていた。
また、遠沈処理を行うために、培養により得られた細胞分散液を希釈する必要があるなど、煩雑な操作を要する工程が増加することによって、培養コストが上昇する等の不利益があった。
そこで、本発明は、培養した細胞が回収時に受けるダメージを抑制して、細胞増殖率および細胞回収率を両立することができ、しかも、煩雑な回収操作を簡略化することができる細胞の培養方法、ならびに、この培養方法に用いる培養液を提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、高温でゾルからゲルに相転移し、低温でゲルからゾルに相転移する培養液を用いて、培養液をゾルからゲルに相転移させた後、ゲルからゾルに相転移する温度以上で細胞を浮遊培養すると、培養終了後に培養液をゲルからゾルに相転移する温度未満まで降温させるだけで培養された細胞を沈降させることができ、培養した細胞が回収時に受けるダメージを抑制して、細胞増殖率および細胞回収率を両立することができ、しかも、煩雑な回収操作を簡略化することができることを知得し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は次の［１］〜［２３］を提供する。
［１］ 昇温時相転移温度ＴｃおよびＴｃよりも温度が低い降温時相転移温度Ｔｃｓを有する培養液をＴｃ未満からＴｃ以上に昇温する昇温工程と、
上記昇温工程において上記培養液をＴｃ以上に昇温した後、Ｔｃｓ以上の培養温度で、上記培養液中で細胞を浮遊培養する培養工程と、
を備える、細胞の培養方法。
ここで、上記昇温時相転移温度Ｔｃは、上記培養液が５．０℃／分の昇温速度で３．０℃から９８．０℃まで昇温されたとする場合において、上記培養液の３．０℃における粘度がηｓであるときの、上記培養液の粘度が１０×ηｓとなる時の温度であり、上記降温時相転移温度Ｔｃｓは、上記培養液が５．０℃／分の降温速度で９８．０℃から３．０℃まで降温されたとする場合において、上記培養液の粘度が１０×ηｓとなる時の温度であり、温度の単位を℃、粘度の単位をＰａ・ｓとする。
［２］ ＴｃおよびＴｃｓが下記式（１）を満たす、上記［１］に記載の細胞の培養方法。
１．０℃≦Ｔｃ−Ｔｃｓ≦７０．０℃ （１）
［３］ 上記培養工程の後に、さらに、
上記培養液をＴｃｓ未満に降温して、上記培養工程において培養された細胞を沈降させ、回収する回収工程、
を備える、上記［１］または［２］に記載の細胞の培養方法。
［４］ 上記降温時相転移温度Ｔｃｓが３．０℃以上４１．０℃以下である、上記［１］〜［３］のいずれか１つに記載の細胞の培養方法。
［５］ 上記培養液が、平均直径２．０ｎｍ以上１００ｎｍ以下のセルロースナノファイバーと、熱ゾルゲル変化剤と、を含む、上記［１］〜［４］のいずれか１つに記載の細胞の培養方法。
［６］ 上記セルロースナノファイバーのカルボキシ基含有量が０．６０ｍｍｏｌ／ｇ以上２．０ｍｍｏｌ／ｇ以下である、上記［５］に記載の細胞の培養方法。
［７］ 上記セルロースナノファイバーの含有量が上記培養液中０．０１質量％以上１．０質量％以下である、上記［５］または［６］に記載の細胞の培養方法。
［８］ 上記セルロースナノファイバーに酸化処理が施されている、上記［５］〜 ［７］のいずれか１つに記載の細胞の培養方法。
［９］ 上記熱ゾルゲル変化剤の含有量が上記培養液中０．０５質量％以上３．０質量％以下である、上記［５］〜［８］のいずれか１つに記載の細胞の培養方法。
［１０］ 上記熱ゾルゲル変化剤がメチルセルロースである、上記［５］〜［９］のいずれか１つに記載の細胞の培養方法。
［１１］ 上記細胞が幹細胞である、上記［１］〜［１０］のいずれか１つに記載の細胞の培養方法。
［１２］ 上記昇温工程の後、かつ、上記培養工程の前に、さらに、
上記昇温工程において上記培養液をＴｃ以上に昇温した後、上記培養液に細胞を播種するゲル化後播種工程
を備える、上記［１］〜［１１］のいずれか１つに記載の細胞の培養方法。
［１３］ 上記昇温工程の前に、さらに、
上記培養液に細胞を播種するゲル化前播種工程
を備える、上記［１］〜［１１］のいずれか１つに記載の細胞の培養方法。
［１４］ 昇温時相転移温度Ｔｃおよび降温時相転移温度Ｔｃｓを有する培養液。
ここで、上記昇温時相転移温度Ｔｃは、上記培養液が５．０℃／分の昇温速度で３．０℃から９８．０℃まで昇温されたとする場合において、上記培養液の３．０℃における粘度がηｓであるときの、上記培養液の粘度が１０×ηｓとなる時の温度であり、上記降温時相転移温度Ｔｃｓは、上記培養液が５．０℃／分の降温速度で９８．０℃から３．０℃まで降温されたとする場合において、上記培養液の粘度が１０×ηｓとなる時の温度であり、温度の単位を℃、粘度の単位をＰａ・ｓとする。
［１５］ ＴｃおよびＴｃｓが下記式（１）を満たす、上記［１４］に記載の培養液。
１．０℃≦Ｔｃ−Ｔｃｓ≦７０．０℃ （１）
［１６］ 上記降温時相転移温度Ｔｃｓが３．０℃以上４１．０℃以下である、上記［１４］または［１５］に記載の培養液。
［１７］ 平均直径２．０ｎｍ以上１００ｎｍ以下のセルロースナノファイバーと、熱ゾルゲル変化剤と、を含む、上記［１４］〜［１６］のいずれか１つに記載の培養液。
［１８］ 上記セルロースナノファイバーのカルボキシ基含有量が０．６０ｍｍｏｌ／ｇ以上２．０ｍｍｏｌ／ｇ以下である、上記［１７］に記載の培養液。
［１９］ 上記セルロースナノファイバーを０．０１質量％以上１．０質量％以下含む、上記［１７］または［１８］に記載の細胞の培養液。
［２０］ 上記セルロースナノファイバーに酸化処理が施されている、上記［１７］〜［１９］のいずれか１つに記載の培養液。
［２１］ 上記熱ゾルゲル変化剤を０．０５質量％以上３．０質量％以下含む、上記［１７］〜［２０］のいずれか１つに記載の培養液。
［２２］ 上記熱ゾルゲル変化剤がメチルセルロースである、上記［１７］〜［２１］のいずれか１つに記載の培養液。
［２３］ 上記［１］〜［１３］のいずれか１つに記載の細胞の培養方法に使用するための、上記［１４］〜［２２］のいずれか１つに記載の培養液。
［１］ 昇温時相転移温度ＴｃおよびＴｃよりも温度が低い降温時相転移温度Ｔｃｓを有する培養液をＴｃ未満からＴｃ以上に昇温する昇温工程と、
上記昇温工程において上記培養液をＴｃ以上に昇温した後、Ｔｃｓ以上の培養温度で、上記培養液中で細胞を浮遊培養する培養工程と、
を備える、細胞の培養方法。
ここで、上記昇温時相転移温度Ｔｃは、上記培養液が５．０℃／分の昇温速度で３．０℃から９８．０℃まで昇温されたとする場合において、上記培養液の３．０℃における粘度がηｓであるときの、上記培養液の粘度が１０×ηｓとなる時の温度であり、上記降温時相転移温度Ｔｃｓは、上記培養液が５．０℃／分の降温速度で９８．０℃から３．０℃まで降温されたとする場合において、上記培養液の粘度が１０×ηｓとなる時の温度であり、温度の単位を℃、粘度の単位をＰａ・ｓとする。
［２］ ＴｃおよびＴｃｓが下記式（１）を満たす、上記［１］に記載の細胞の培養方法。
１．０℃≦Ｔｃ−Ｔｃｓ≦７０．０℃ （１）
［３］ 上記培養工程の後に、さらに、
上記培養液をＴｃｓ未満に降温して、上記培養工程において培養された細胞を沈降させ、回収する回収工程、
を備える、上記［１］または［２］に記載の細胞の培養方法。
［４］ 上記降温時相転移温度Ｔｃｓが３．０℃以上４１．０℃以下である、上記［１］〜［３］のいずれか１つに記載の細胞の培養方法。
［５］ 上記培養液が、平均直径２．０ｎｍ以上１００ｎｍ以下のセルロースナノファイバーと、熱ゾルゲル変化剤と、を含む、上記［１］〜［４］のいずれか１つに記載の細胞の培養方法。
［６］ 上記セルロースナノファイバーのカルボキシ基含有量が０．６０ｍｍｏｌ／ｇ以上２．０ｍｍｏｌ／ｇ以下である、上記［５］に記載の細胞の培養方法。
［７］ 上記セルロースナノファイバーの含有量が上記培養液中０．０１質量％以上１．０質量％以下である、上記［５］または［６］に記載の細胞の培養方法。
［８］ 上記セルロースナノファイバーに酸化処理が施されている、上記［５］〜 ［７］のいずれか１つに記載の細胞の培養方法。
［９］ 上記熱ゾルゲル変化剤の含有量が上記培養液中０．０５質量％以上３．０質量％以下である、上記［５］〜［８］のいずれか１つに記載の細胞の培養方法。
［１０］ 上記熱ゾルゲル変化剤がメチルセルロースである、上記［５］〜［９］のいずれか１つに記載の細胞の培養方法。
［１１］ 上記細胞が幹細胞である、上記［１］〜［１０］のいずれか１つに記載の細胞の培養方法。
［１２］ 上記昇温工程の後、かつ、上記培養工程の前に、さらに、
上記昇温工程において上記培養液をＴｃ以上に昇温した後、上記培養液に細胞を播種するゲル化後播種工程
を備える、上記［１］〜［１１］のいずれか１つに記載の細胞の培養方法。
［１３］ 上記昇温工程の前に、さらに、
上記培養液に細胞を播種するゲル化前播種工程
を備える、上記［１］〜［１１］のいずれか１つに記載の細胞の培養方法。
［１４］ 昇温時相転移温度Ｔｃおよび降温時相転移温度Ｔｃｓを有する培養液。
ここで、上記昇温時相転移温度Ｔｃは、上記培養液が５．０℃／分の昇温速度で３．０℃から９８．０℃まで昇温されたとする場合において、上記培養液の３．０℃における粘度がηｓであるときの、上記培養液の粘度が１０×ηｓとなる時の温度であり、上記降温時相転移温度Ｔｃｓは、上記培養液が５．０℃／分の降温速度で９８．０℃から３．０℃まで降温されたとする場合において、上記培養液の粘度が１０×ηｓとなる時の温度であり、温度の単位を℃、粘度の単位をＰａ・ｓとする。
［１５］ ＴｃおよびＴｃｓが下記式（１）を満たす、上記［１４］に記載の培養液。
１．０℃≦Ｔｃ−Ｔｃｓ≦７０．０℃ （１）
［１６］ 上記降温時相転移温度Ｔｃｓが３．０℃以上４１．０℃以下である、上記［１４］または［１５］に記載の培養液。
［１７］ 平均直径２．０ｎｍ以上１００ｎｍ以下のセルロースナノファイバーと、熱ゾルゲル変化剤と、を含む、上記［１４］〜［１６］のいずれか１つに記載の培養液。
［１８］ 上記セルロースナノファイバーのカルボキシ基含有量が０．６０ｍｍｏｌ／ｇ以上２．０ｍｍｏｌ／ｇ以下である、上記［１７］に記載の培養液。
［１９］ 上記セルロースナノファイバーを０．０１質量％以上１．０質量％以下含む、上記［１７］または［１８］に記載の細胞の培養液。
［２０］ 上記セルロースナノファイバーに酸化処理が施されている、上記［１７］〜［１９］のいずれか１つに記載の培養液。
［２１］ 上記熱ゾルゲル変化剤を０．０５質量％以上３．０質量％以下含む、上記［１７］〜［２０］のいずれか１つに記載の培養液。
［２２］ 上記熱ゾルゲル変化剤がメチルセルロースである、上記［１７］〜［２１］のいずれか１つに記載の培養液。
［２３］ 上記［１］〜［１３］のいずれか１つに記載の細胞の培養方法に使用するための、上記［１４］〜［２２］のいずれか１つに記載の培養液。
本発明によれば、培養した細胞が回収時に受けるダメージを抑制して、細胞増殖率および細胞回収率を両立することができ、しかも、煩雑な回収操作を簡略化することができる細胞の培養方法、ならびに、この培養方法に用いる培養液を提供することができる。
まず、本発明の従来技術に対する有利な点および作用効果を奏するメカニズムを説明する。
従来の細胞の培養方法では、浮遊培養により得られた培養細胞分散液（培養された細胞と培養液とからなる細胞分散液をいう。）を遠沈処理にかけて培養した細胞を沈降させ、培養された細胞を回収していた。そのため、遠沈処理を行う従来の培養細胞の回収方法では、遠沈処理の際に細胞にかかる遠心加速度によるダメージが大きく、遠沈処理の前後における細胞の死亡率が高かった。
これに対して、本発明の細胞の培養方法では、培養液に、高温でゾル状態からゲル状態に相転移し、低温でゲル状態からゾル状態に相転移する機能を付与し、高温でゲル化させた培養液中で浮遊培養し、培養終了後に低温でゲル化した培養液をゾル化することによって、培養された細胞（細胞塊（スフェロイド）を含む。）を沈降させることができるので、遠沈処理によらず細胞を沈降させることができ、培養された細胞が回収時に受けるダメージを抑制するとともに、煩雑な回収操作を簡略化することができる。
従来の細胞の培養方法では、浮遊培養により得られた培養細胞分散液（培養された細胞と培養液とからなる細胞分散液をいう。）を遠沈処理にかけて培養した細胞を沈降させ、培養された細胞を回収していた。そのため、遠沈処理を行う従来の培養細胞の回収方法では、遠沈処理の際に細胞にかかる遠心加速度によるダメージが大きく、遠沈処理の前後における細胞の死亡率が高かった。
これに対して、本発明の細胞の培養方法では、培養液に、高温でゾル状態からゲル状態に相転移し、低温でゲル状態からゾル状態に相転移する機能を付与し、高温でゲル化させた培養液中で浮遊培養し、培養終了後に低温でゲル化した培養液をゾル化することによって、培養された細胞（細胞塊（スフェロイド）を含む。）を沈降させることができるので、遠沈処理によらず細胞を沈降させることができ、培養された細胞が回収時に受けるダメージを抑制するとともに、煩雑な回収操作を簡略化することができる。
従来の細胞の培養方法では、培養中に培養液を撹拌することにより、培養中の細胞が沈降することを防止し、浮遊培養を維持していた。
これに対して、本発明の細胞の培養方法では、ゲル化した培養液中に細胞を浮遊させるため、培養中に培養液を撹拌することなく、浮遊培養を維持することができる。また、培養中の細胞は容易に沈降せず、かつ本発明のゲルは増殖に必要な栄養素および酸素を十分に拡散できるように強すぎないゲルを構成するため、高い細胞増殖率を達成することができる。
これに対して、本発明の細胞の培養方法では、ゲル化した培養液中に細胞を浮遊させるため、培養中に培養液を撹拌することなく、浮遊培養を維持することができる。また、培養中の細胞は容易に沈降せず、かつ本発明のゲルは増殖に必要な栄養素および酸素を十分に拡散できるように強すぎないゲルを構成するため、高い細胞増殖率を達成することができる。
また、本発明の細胞の培養方法では、ゲル化状態の培養液中で細胞（スフェロイドを含む。）を浮遊培養させた後、温度をゲル−ゾル転移点以下に下げるだけでゾル状態とすることができ、培養された細胞を沈降しやすくする。温度操作だけで培養された細胞を容易に沈降させることができるので、降温操作が簡単であり、細胞へのダメージが少ないことから、高い細胞沈降率および低い細胞死亡率を達成することができる。
本明細書においては、セルロースナノファイバー（cellulose nanofiber）を「ＣＮＦ」という場合がある。
また、本明細書においては、メチルセルロース（methyl cellulose）を「ＭＣ」という場合がある。
また、本明細書においては、カードラン（curdlan）を「ＣＵ」という場合がある。
また、本明細書においては、カルボキシメチル（carboxymethyl）を「ＣＭ」という場合がある。
また、本明細書においては、２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジン−Ｎ−オキシル（2,2,6,6-tetramethyl-1-pyperizine-N-oxyl）を「ＴＥＭＰＯ」という場合がある。
また、本明細書において「〜」を用いて表される範囲は、その範囲に「〜」の前後に記載された両端を含む範囲を意味する。例えば、「ａ〜ｂ」（ここで、ａおよびｂはある数値（実数）を表し、かつ、ａ＜ｂであるとする。）という範囲には、ａおよびｂを含む。
また、本明細書においては、温度の単位を℃、粘度の単位をＰａ・ｓとする。
また、本明細書においては、メチルセルロース（methyl cellulose）を「ＭＣ」という場合がある。
また、本明細書においては、カードラン（curdlan）を「ＣＵ」という場合がある。
また、本明細書においては、カルボキシメチル（carboxymethyl）を「ＣＭ」という場合がある。
また、本明細書においては、２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジン−Ｎ−オキシル（2,2,6,6-tetramethyl-1-pyperizine-N-oxyl）を「ＴＥＭＰＯ」という場合がある。
また、本明細書において「〜」を用いて表される範囲は、その範囲に「〜」の前後に記載された両端を含む範囲を意味する。例えば、「ａ〜ｂ」（ここで、ａおよびｂはある数値（実数）を表し、かつ、ａ＜ｂであるとする。）という範囲には、ａおよびｂを含む。
また、本明細書においては、温度の単位を℃、粘度の単位をＰａ・ｓとする。
［細胞の培養方法］
以下、本発明の細胞の培養方法を詳細に説明する。
本発明の細胞の培養方法は、培養液をＴｃ未満からＴｃ以上に昇温する昇温工程と、Ｔｃｓ以上の培養温度で、培養液中で細胞を浮遊培養する培養工程と、を備える。
本発明の細胞の培養方法においては、昇温工程において培養液をＴｃ以上に昇温した後、培養工程においてＴｃｓ以上の培養温度で細胞を浮遊培養する前に、培養液はＴｃｓ以上に保たれることが好ましい。
また、本発明の培養方法は、培養液をＴｃｓ未満に降温して、培養された細胞を沈降させる回収工程を備えることが好ましい。
また、本発明の培養方法は、昇温工程の後に培養液に細胞を播種するゲル化後播種工程、または昇温工程の前に培養液に細胞を播種するゲル化前播種工程を備えることが好ましい。
また、本発明の培養方法に用いる培養液は、昇温時相転移温度Ｔｃおよび降温時相転移温度Ｔｃｓを有する。
以下、本発明の細胞の培養方法を詳細に説明する。
本発明の細胞の培養方法は、培養液をＴｃ未満からＴｃ以上に昇温する昇温工程と、Ｔｃｓ以上の培養温度で、培養液中で細胞を浮遊培養する培養工程と、を備える。
本発明の細胞の培養方法においては、昇温工程において培養液をＴｃ以上に昇温した後、培養工程においてＴｃｓ以上の培養温度で細胞を浮遊培養する前に、培養液はＴｃｓ以上に保たれることが好ましい。
また、本発明の培養方法は、培養液をＴｃｓ未満に降温して、培養された細胞を沈降させる回収工程を備えることが好ましい。
また、本発明の培養方法は、昇温工程の後に培養液に細胞を播種するゲル化後播種工程、または昇温工程の前に培養液に細胞を播種するゲル化前播種工程を備えることが好ましい。
また、本発明の培養方法に用いる培養液は、昇温時相転移温度Ｔｃおよび降温時相転移温度Ｔｃｓを有する。
〈培養液〉
本発明の細胞の培養方法において使用する培養液（以下、単に「本発明の培養液」という場合がある。）について詳細に説明する。
本発明の培養液は、昇温時相転移温度ＴｃおよびＴｃよりも温度が低い降温時相転移温度Ｔｃｓを有する。
本発明の細胞の培養方法において使用する培養液（以下、単に「本発明の培養液」という場合がある。）について詳細に説明する。
本発明の培養液は、昇温時相転移温度ＴｃおよびＴｃよりも温度が低い降温時相転移温度Ｔｃｓを有する。
ここで、昇温時相転移温度Ｔｃおよび降温時相転移温度Ｔｃｓは以下のとおり定義される。
昇温時相転移温度Ｔｃは、培養液が５．０℃／分の昇温速度で３．０℃から９８．０℃まで昇温されたとする場合において、培養液の３．０℃における粘度がηｓであるときの、培養液の粘度が１０×ηｓとなる時の温度である。
降温時相転移温度Ｔｃｓは、培養液が５．０℃／分の降温速度で９８．０℃から３．０℃まで降温されたとする場合において、培養液の粘度が１０×ηｓとなる時の温度である。
ここで、ＴｃおよびＴｃｓは、Ｔｃ＞Ｔｃｓの関係を満たす。
また、上記定義から、ＴｃおよびＴｃｓは、３．０＜Ｔｃ＜９８．０および３．０＜Ｔｃｓ＜９８．０の関係を満たすこともいえる。
昇温時相転移温度Ｔｃは、培養液が５．０℃／分の昇温速度で３．０℃から９８．０℃まで昇温されたとする場合において、培養液の３．０℃における粘度がηｓであるときの、培養液の粘度が１０×ηｓとなる時の温度である。
降温時相転移温度Ｔｃｓは、培養液が５．０℃／分の降温速度で９８．０℃から３．０℃まで降温されたとする場合において、培養液の粘度が１０×ηｓとなる時の温度である。
ここで、ＴｃおよびＴｃｓは、Ｔｃ＞Ｔｃｓの関係を満たす。
また、上記定義から、ＴｃおよびＴｃｓは、３．０＜Ｔｃ＜９８．０および３．０＜Ｔｃｓ＜９８．０の関係を満たすこともいえる。
また、本発明において、粘度が１０×ηｓ以上である状態を「ゲル化状態」といい、粘度が１０×ηｓ以上となることを「ゲル化（する）」といい、粘度が１０×ηｓ未満である状態を「ゾル化状態」といい、粘度が１０×ηｓ未満となることを「ゾル化（する）」という。
図１を参照しながら、培養液のゾル−ゲル転移を説明する。
培養液の昇温時の温度Ｔ−粘度ηの関係は、図１のグラフの下側の曲線によって表され、培養液の降温時の温度Ｔ−粘度ηの関係は、図１のグラフの上側の曲線によって表される。
昇温時の３．０℃における粘度がηｓである。
まず、培養液の温度を昇温してゆき、温度がＴｃになると、培養液の粘度は１０×ηｓとなる。すなわち、温度Ｔｃにおいては、培養液はゲル化状態にある。
培養液の温度をＴ１まで昇温すると、培養液の粘度はη１となる。すなわち、温度Ｔ１においては、培養液はゲル化状態にある。ただし、Ｔ１はＴ１≧Ｔｃを満たす温度とし、η１はη１≧１０×ηｓを満たす粘度とする。
次に、培養液の温度をＴ１から降温してゆき、温度がＴｃｓになると、培養液の粘度は１０×ηｓとなる。すなわち、温度Ｔｃｓにおいては、培養液はゲル化状態にある。
さらに、培養液の温度をＴ２まで降温すると、培養液の粘度はη２となる。すなわち、温度Ｔ２においては、培養液はゾル化状態にある。ただし、Ｔ２はＴ２＜Ｔｃｓを満たす温度とし、η２はη２＜１０×ηｓを満たす粘度とする。
培養液の昇温時の温度Ｔ−粘度ηの関係は、図１のグラフの下側の曲線によって表され、培養液の降温時の温度Ｔ−粘度ηの関係は、図１のグラフの上側の曲線によって表される。
昇温時の３．０℃における粘度がηｓである。
まず、培養液の温度を昇温してゆき、温度がＴｃになると、培養液の粘度は１０×ηｓとなる。すなわち、温度Ｔｃにおいては、培養液はゲル化状態にある。
培養液の温度をＴ１まで昇温すると、培養液の粘度はη１となる。すなわち、温度Ｔ１においては、培養液はゲル化状態にある。ただし、Ｔ１はＴ１≧Ｔｃを満たす温度とし、η１はη１≧１０×ηｓを満たす粘度とする。
次に、培養液の温度をＴ１から降温してゆき、温度がＴｃｓになると、培養液の粘度は１０×ηｓとなる。すなわち、温度Ｔｃｓにおいては、培養液はゲル化状態にある。
さらに、培養液の温度をＴ２まで降温すると、培養液の粘度はη２となる。すなわち、温度Ｔ２においては、培養液はゾル化状態にある。ただし、Ｔ２はＴ２＜Ｔｃｓを満たす温度とし、η２はη２＜１０×ηｓを満たす粘度とする。
また、ＴｃとＴｃｓの差ΔＴｃ＝Ｔｃ−Ｔｃｓは、特に限定されないが、好ましくは１．０℃≦ΔＴｃ≦７０．０℃であり、より好ましくは５．０℃≦ΔＴｃ≦６５．０℃であり、さらに好ましくは１０．０℃≦ΔＴｃ≦６０．０℃である。
ΔＴｃがこの範囲内であると、ゾル−ゲル転移の幅が広く、ゾル化およびゲル化が同時に起きにくく、培養液がより安定となり、細胞増殖率が向上しやすい。
また、昇温時相転移温度（Ｔｃ）が高温になりにくい。Ｔｃが高温になりにくいことによって、昇温工程における培養液の加熱処理の際の温度が低く、培養液中の培地成分が変性し難く、細胞の増殖率を向上しやすい。
また、降温時相転移温度（Ｔｃｓ）が低温になりにくい。Ｔｃｓが低温になりにくいことによって、回収工程における降温処理の際の温度が低くならず、細胞死亡率を低下させやすい。
ΔＴｃがこの範囲内であると、ゾル−ゲル転移の幅が広く、ゾル化およびゲル化が同時に起きにくく、培養液がより安定となり、細胞増殖率が向上しやすい。
また、昇温時相転移温度（Ｔｃ）が高温になりにくい。Ｔｃが高温になりにくいことによって、昇温工程における培養液の加熱処理の際の温度が低く、培養液中の培地成分が変性し難く、細胞の増殖率を向上しやすい。
また、降温時相転移温度（Ｔｃｓ）が低温になりにくい。Ｔｃｓが低温になりにくいことによって、回収工程における降温処理の際の温度が低くならず、細胞死亡率を低下させやすい。
（相転移温度の測定方法）
培養液の粘度を、プレート型粘度計（例えば、Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ 社製ＭＣＲ３０１）を用い、プレート径＝４５ｍｍ、ギャップ＝０．０４９ｍｍ、および剪断速度＝０．１ｓ−１の測定条件で、３．０℃から９８．０℃まで、昇温速度５．０℃／分で昇温しながら測定し、粘度が３．０℃における粘度の１０倍となる温度を「昇温時相転移温度（Ｔｃ）」とする。
次に、培養液の粘度を、同じ測定条件で、９８．０℃から３．０℃まで、降温速度５．０℃／分で降温しながら測定し、粘度が昇温時の３．０℃における粘度の１０倍となる温度を「降温時相転移温度（Ｔｃｓ）」とする。
培養液の粘度を、プレート型粘度計（例えば、Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ 社製ＭＣＲ３０１）を用い、プレート径＝４５ｍｍ、ギャップ＝０．０４９ｍｍ、および剪断速度＝０．１ｓ−１の測定条件で、３．０℃から９８．０℃まで、昇温速度５．０℃／分で昇温しながら測定し、粘度が３．０℃における粘度の１０倍となる温度を「昇温時相転移温度（Ｔｃ）」とする。
次に、培養液の粘度を、同じ測定条件で、９８．０℃から３．０℃まで、降温速度５．０℃／分で降温しながら測定し、粘度が昇温時の３．０℃における粘度の１０倍となる温度を「降温時相転移温度（Ｔｃｓ）」とする。
（ヒステリシス）
本発明では、熱で培養液のゾル−ゲル転移が生じるが、昇温時相転移温度（Ｔｃ）（「ゲル化温度」という場合がある。）および降温時相転移温度（Ｔｃｓ）（「ゾル化温度」という場合がある。）にヒステリシスが存在することが特徴である。
そして、上記した通り、ＴｃおよびＴｃｓは、Ｔｃ＞Ｔｃｓの関係を満たすため、本発明の培養液は、降温してもゲル化状態を維持でき、ゲル化温度が広がって、培養温度を広く取れるという特徴を有する。
また、本発明の培養液は、ゾル−ゲル転移のヒステリシスが大きいが、ゾル−ゲル転移のヒステリシスが大きいと、培養液をＴｃ以上に昇温してゲル化させると、Ｔｃを下回ってもゾル化し難く、浮遊力が得やすい。すなわち、本発明の培養液は、一度高温に曝してゲル化させると、低温（培養温度）に低下させてもゾル化せず、ゲル化状態のままで浮力を維持する。
さらに、ヒステリシスが大きいことにより、ゾル−ゲルの転移温度を広く取ることができるので、材料設計しやすい。
本発明では、熱で培養液のゾル−ゲル転移が生じるが、昇温時相転移温度（Ｔｃ）（「ゲル化温度」という場合がある。）および降温時相転移温度（Ｔｃｓ）（「ゾル化温度」という場合がある。）にヒステリシスが存在することが特徴である。
そして、上記した通り、ＴｃおよびＴｃｓは、Ｔｃ＞Ｔｃｓの関係を満たすため、本発明の培養液は、降温してもゲル化状態を維持でき、ゲル化温度が広がって、培養温度を広く取れるという特徴を有する。
また、本発明の培養液は、ゾル−ゲル転移のヒステリシスが大きいが、ゾル−ゲル転移のヒステリシスが大きいと、培養液をＴｃ以上に昇温してゲル化させると、Ｔｃを下回ってもゾル化し難く、浮遊力が得やすい。すなわち、本発明の培養液は、一度高温に曝してゲル化させると、低温（培養温度）に低下させてもゾル化せず、ゲル化状態のままで浮力を維持する。
さらに、ヒステリシスが大きいことにより、ゾル−ゲルの転移温度を広く取ることができるので、材料設計しやすい。
《培養液の成分》
培養液の成分は、昇温時相転移温度（Ｔｃ）および降温時相転移温度（Ｔｃｓ）を有することができれば、特に限定されないが、平均直径２．０ｎｍ以上１００ｎｍ以下のセルロースナノファイバーおよび熱ゾルゲル変化剤を含むことが望ましい。
培養液の成分は、昇温時相転移温度（Ｔｃ）および降温時相転移温度（Ｔｃｓ）を有することができれば、特に限定されないが、平均直径２．０ｎｍ以上１００ｎｍ以下のセルロースナノファイバーおよび熱ゾルゲル変化剤を含むことが望ましい。
（平均直径２．０ｎｍ以上１００ｎｍ以下のセルロースナノファイバー）
セルロースナノファイバー（以下「ＣＮＦ」という。）の平均直径は、２．０ｎｍ以上１００ｎｍ以下であれば特に限定されないが、好ましくは３．０ｎｍ〜５０ｎｍ、より好ましくは４．０〜２０ｎｍである。
ＣＮＦの平均直径が２．０ｎｍ未満では、ＣＮＦのネットワーク構造が脆弱であるため、培養液をゲル化状態としても、培養中の細胞の浮遊性が十分でなく、沈降しやすいため、良好な細胞増殖率を達成することができない。
一方、ＣＮＦの平均直径が１００ｎｍ超では、ＣＮＦのネットワーク構造が強固であるため、培養液をゾル化状態としても、培養された細胞の沈降性が十分でなく、沈降し難いため、良好な細胞沈降率を達成することができない。
なお、本発明において、培養終了後、培養液に温度差を与えるだけで細胞が沈降することを指して、回収性が良好であるという場合がある。
セルロースナノファイバー（以下「ＣＮＦ」という。）の平均直径は、２．０ｎｍ以上１００ｎｍ以下であれば特に限定されないが、好ましくは３．０ｎｍ〜５０ｎｍ、より好ましくは４．０〜２０ｎｍである。
ＣＮＦの平均直径が２．０ｎｍ未満では、ＣＮＦのネットワーク構造が脆弱であるため、培養液をゲル化状態としても、培養中の細胞の浮遊性が十分でなく、沈降しやすいため、良好な細胞増殖率を達成することができない。
一方、ＣＮＦの平均直径が１００ｎｍ超では、ＣＮＦのネットワーク構造が強固であるため、培養液をゾル化状態としても、培養された細胞の沈降性が十分でなく、沈降し難いため、良好な細胞沈降率を達成することができない。
なお、本発明において、培養終了後、培養液に温度差を与えるだけで細胞が沈降することを指して、回収性が良好であるという場合がある。
((ＣＮＦの平均直径))
ＣＮＦの平均直径は、その製造条件を調整することによって、調節することができる。
例えば、機械解砕でＣＮＦを製造する場合、解砕機の圧力を高くするほど、または解砕機の処理回数（パス回数）を多くするほど、ＣＮＦの平均直径を小さくすることができる。すなわち、ＣＮＦの平均直径を細くすることができる。解砕機の圧力を低くするほど、または解砕機の処理回数（パス回数）を少なくするほど、ＣＮＦの平均直径を大きくすることができる。すなわち、ＣＮＦの平均直径を太くすることができる。
また、例えば、化学解砕でＣＮＦを製造する場合、化学修飾（例えば、酸化（特許第４９９８９８１号公報を参照）、カルボキシメチル化（例えば、国際公開第２０１５／１０７９９５号を参照）、またはリン酸エステル化（例えば、国際公開第２０１４／１８５５０５号を参照）など）の後に機械解砕し、解砕機の圧力および／または処理回数を調整することによって、ＣＮＦの平均直径を調節することができる。機械解砕でＣＮＦを製造する場合と同様、解砕機の圧力を高くするほど、または解砕機の処理回数（パス回数）を多くするほど、ＣＮＦの平均直径を小さくすることができ、解砕機の圧力を低くするほど、または解砕機の処理回数（パス回数）を少なくするほど、ＣＮＦの平均直径を大きくすることができる。
ＣＮＦの平均直径は、その製造条件を調整することによって、調節することができる。
例えば、機械解砕でＣＮＦを製造する場合、解砕機の圧力を高くするほど、または解砕機の処理回数（パス回数）を多くするほど、ＣＮＦの平均直径を小さくすることができる。すなわち、ＣＮＦの平均直径を細くすることができる。解砕機の圧力を低くするほど、または解砕機の処理回数（パス回数）を少なくするほど、ＣＮＦの平均直径を大きくすることができる。すなわち、ＣＮＦの平均直径を太くすることができる。
また、例えば、化学解砕でＣＮＦを製造する場合、化学修飾（例えば、酸化（特許第４９９８９８１号公報を参照）、カルボキシメチル化（例えば、国際公開第２０１５／１０７９９５号を参照）、またはリン酸エステル化（例えば、国際公開第２０１４／１８５５０５号を参照）など）の後に機械解砕し、解砕機の圧力および／または処理回数を調整することによって、ＣＮＦの平均直径を調節することができる。機械解砕でＣＮＦを製造する場合と同様、解砕機の圧力を高くするほど、または解砕機の処理回数（パス回数）を多くするほど、ＣＮＦの平均直径を小さくすることができ、解砕機の圧力を低くするほど、または解砕機の処理回数（パス回数）を少なくするほど、ＣＮＦの平均直径を大きくすることができる。
なお、ＣＮＦの平均直径は、以下の方法（特許第５５４４０５３号明細書を参照）により求めたものである。
ＣＮＦ濃度が０．００１質量％となるように希釈したＣＮＦ水分散液を調製する。このＣＮＦ分散液をマイカ製試料台に薄く延ばし、５０℃で加熱乾燥させて観察用試料を作成する。観察用試料をＡＦＭ（Atomic Force Microscope；原子間力顕微鏡）を用いて観察し、観察した形状像の断面高さを１０点計測する。１０点の計測値の算術平均値をＣＮＦの平均直径とする。
ＣＮＦ濃度が０．００１質量％となるように希釈したＣＮＦ水分散液を調製する。このＣＮＦ分散液をマイカ製試料台に薄く延ばし、５０℃で加熱乾燥させて観察用試料を作成する。観察用試料をＡＦＭ（Atomic Force Microscope；原子間力顕微鏡）を用いて観察し、観察した形状像の断面高さを１０点計測する。１０点の計測値の算術平均値をＣＮＦの平均直径とする。
((ＣＮＦの平均繊維長))
ＣＮＦの平均繊維長は、特に限定されないが、好ましくは０．２０μｍ以上２．０μｍ以下であり、より好ましくは０．３０μｍ以上１．５μｍ以下であり、さらに好ましくは０．４０μｍ以上１．０μｍ以下である。
この範囲内であると、培養液をゲル化状態からゾル化状態に相転移させた際に、より細胞が沈降しやすく、より良好な細胞沈降率を達成することができる。
なお、ＣＮＦの平均繊維長は、特表２０１３−５４１９５６号公報に記載された方法にしたがって測定することができる。
ＣＮＦの平均繊維長は、特に限定されないが、好ましくは０．２０μｍ以上２．０μｍ以下であり、より好ましくは０．３０μｍ以上１．５μｍ以下であり、さらに好ましくは０．４０μｍ以上１．０μｍ以下である。
この範囲内であると、培養液をゲル化状態からゾル化状態に相転移させた際に、より細胞が沈降しやすく、より良好な細胞沈降率を達成することができる。
なお、ＣＮＦの平均繊維長は、特表２０１３−５４１９５６号公報に記載された方法にしたがって測定することができる。
ＣＮＦの平均繊維長は、その製造条件を調整することによって、調節することができる。
例えば、機械解砕でＣＮＦを製造する場合、解砕処理時のＣＮＦ分散液の温度を上げるほど平均繊維長を短くすることができ、ＣＮＦ分散液の温度を下げるほど平均繊維長を長くすることができる。
また、例えば、化学解砕でＣＮＦを製造する場合、化学修飾（例えば、酸化（特許第４９９８９８１号公報を参照）、カルボキシメチル化（例えば、国際公開第２０１５／１０７９９５号を参照）、またはリン酸エステル化（例えば、国際公開第２０１４／１８５５０５号を参照）など）の際の処理温度を上げるほど平均繊維長を短くすることができ、処理温度を下げるほど平均繊維長を長くすることができる。
例えば、機械解砕でＣＮＦを製造する場合、解砕処理時のＣＮＦ分散液の温度を上げるほど平均繊維長を短くすることができ、ＣＮＦ分散液の温度を下げるほど平均繊維長を長くすることができる。
また、例えば、化学解砕でＣＮＦを製造する場合、化学修飾（例えば、酸化（特許第４９９８９８１号公報を参照）、カルボキシメチル化（例えば、国際公開第２０１５／１０７９９５号を参照）、またはリン酸エステル化（例えば、国際公開第２０１４／１８５５０５号を参照）など）の際の処理温度を上げるほど平均繊維長を短くすることができ、処理温度を下げるほど平均繊維長を長くすることができる。
((ＣＮＦ含有量))
培養液中のＣＮＦ含有量が多いほど、昇温時相転移温度（Ｔｃ）は下降し、ＣＮＦ含有量が少ないほど、Ｔｃは上昇する。
培養液中のＣＮＦ含有量は、特に限定されないが、好ましくは０．０１質量％以上１．０質量％以下であり、より好ましくは０．０２質量％以上０．５０質量％以下、より好ましくは０．０３質量％以上０．１０質量％以下である。
培養液中のＣＮＦ含有量が多いほど、昇温時相転移温度（Ｔｃ）は下降し、ＣＮＦ含有量が少ないほど、Ｔｃは上昇する。
培養液中のＣＮＦ含有量は、特に限定されないが、好ましくは０．０１質量％以上１．０質量％以下であり、より好ましくは０．０２質量％以上０．５０質量％以下、より好ましくは０．０３質量％以上０．１０質量％以下である。
本発明の培養液がＣＮＦを含むと、よりゲル化し易くなり、昇温時相転移温度（Ｔｃ）がより低温側にシフトするため、より低温でゲル化することができる。
本発明の培養液がＣＮＦを含む場合は、含まない場合に比べて、より低温でゲル化することができるので、細胞を培養するための培地成分の変性を抑制することができ、好ましい。ＣＮＦ含有量が上記範囲内であると、昇温時相転移温度（Ｔｃ）を低下させる効果がより発現しやすい。
また、本発明の培養液がＣＮＦを含む場合は、含まない場合に比べて、培養中の細胞を浮遊させることがより容易になり、培養中により沈降し難くなるので、より良好な細胞増殖率を達成することができる。
本発明の培養液がＣＮＦを含む場合は、含まない場合に比べて、より低温でゲル化することができるので、細胞を培養するための培地成分の変性を抑制することができ、好ましい。ＣＮＦ含有量が上記範囲内であると、昇温時相転移温度（Ｔｃ）を低下させる効果がより発現しやすい。
また、本発明の培養液がＣＮＦを含む場合は、含まない場合に比べて、培養中の細胞を浮遊させることがより容易になり、培養中により沈降し難くなるので、より良好な細胞増殖率を達成することができる。
((カルボキシ基含有量))
ＣＮＦは、カルボキシ基を含有することが好ましい。
ＣＮＦのカルボキシ基含有量は、特に限定されないが、好ましくは０．６ｍｍｏｌ／ｇ以上２．０ｍｍｏｌ／ｇ以下であり、より好ましくは０．７ｍｍｏｌ／ｇ以上１．９ｍｍｏｌ／ｇ以下であり、さらに好ましくは０．９ｍｍｏｌ以上１．８ｍｍｏｌ／ｇ以下である。
ＣＮＦがカルボキシ基を含有すると、カルボキシ基によってＣＮＦの分散が促進されて、本発明の培養液中でＣＮＦの繊維が大きく広がり、ＣＮＦ間の相互作用が大きくなる。その結果、本発明の培養液のゾル−ゲル転移をし易くする効果が発揮される。
また、ＣＮＦと熱ゾルゲル変化剤との相互作用を大きくし、ゲル形成を促す効果もある。
ＣＮＦは、カルボキシ基を含有することが好ましい。
ＣＮＦのカルボキシ基含有量は、特に限定されないが、好ましくは０．６ｍｍｏｌ／ｇ以上２．０ｍｍｏｌ／ｇ以下であり、より好ましくは０．７ｍｍｏｌ／ｇ以上１．９ｍｍｏｌ／ｇ以下であり、さらに好ましくは０．９ｍｍｏｌ以上１．８ｍｍｏｌ／ｇ以下である。
ＣＮＦがカルボキシ基を含有すると、カルボキシ基によってＣＮＦの分散が促進されて、本発明の培養液中でＣＮＦの繊維が大きく広がり、ＣＮＦ間の相互作用が大きくなる。その結果、本発明の培養液のゾル−ゲル転移をし易くする効果が発揮される。
また、ＣＮＦと熱ゾルゲル変化剤との相互作用を大きくし、ゲル形成を促す効果もある。
ＣＮＦにカルボキシ基を導入する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、ＴＥＭＰＯ（2,2,6,6-tetramethyl-1-pyperizine-N-oxyl；２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジン−Ｎ−オキシル）酸化による方法（例えば、国際公開２０１０／１１６８２６号、または国際公開第２００９／０８４５６６号等を参照）、およびカルボキシメチル化する方法（例えば、国際公開第２０１４／０８８０７２号、または特許第４０５５９１４号公報等を参照）などが挙げられる。酸化処理の際の反応時間、反応温度および／もしくは酸化剤の量、ならびに／またはカルボキシメチル化処理の際の反応時間、反応温度および／もしくはカルボキシメチル化剤の量等を調整することにより、カルボキシ基導入量を調整することができる。
なお、ＣＮＦのカルボキシ基含有量は、以下の方法（特許第５３５１５８６号明細書を参照）により求めたものである。
ＣＮＦの０．５質量％スラリーを６０ｍＬ調製し、０．１Ｍ塩酸水溶液を加えてｐＨ２．５とする。このスラリーに０．０５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を滴下してｐＨが１１になるまで電気伝導度を測定する。電気伝導度の変化が緩やかな弱酸の中和段階において消費された水酸化ナトリウム水溶液量Ａ（ｍＬ）から、下記式により算出する。
カルボキシ基含有量（ｍｍｏｌ／ｇ）＝Ａ（ｍＬ）×０．０５（ｍｏｌ／Ｌ）／ＣＮＦ質量（ｇ）
ＣＮＦの０．５質量％スラリーを６０ｍＬ調製し、０．１Ｍ塩酸水溶液を加えてｐＨ２．５とする。このスラリーに０．０５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を滴下してｐＨが１１になるまで電気伝導度を測定する。電気伝導度の変化が緩やかな弱酸の中和段階において消費された水酸化ナトリウム水溶液量Ａ（ｍＬ）から、下記式により算出する。
カルボキシ基含有量（ｍｍｏｌ／ｇ）＝Ａ（ｍＬ）×０．０５（ｍｏｌ／Ｌ）／ＣＮＦ質量（ｇ）
((ＣＮＦの酸化処理))
また、ＣＮＦは酸化処理が施されていることが好ましい。
酸化処理としては、上記したＴＥＭＰＯ酸化処理などが挙げられる。
すなわち、ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦは、カルボキシ基を含有するとともに、酸化処理が施されているＣＮＦである。
また、ＣＮＦは酸化処理が施されていることが好ましい。
酸化処理としては、上記したＴＥＭＰＯ酸化処理などが挙げられる。
すなわち、ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦは、カルボキシ基を含有するとともに、酸化処理が施されているＣＮＦである。
（熱ゾルゲル変化剤）
熱ゾルゲル変性材をＣＮＦと併用することで、Ｔｃｓを制御することができる。
熱ゾルゲル変性材は降温の際のゾル化を促す。すなわち、あまり低温まで下げずに、ゲル化状態の培養液をゾル化させる効果、すなわち、ゾル化温度を上昇させる降下を有する。
この結果、培養液をゾル化し細胞を沈降、回収する際に、細胞が死亡するような低温にまで培養液温度を下げずにすみ、細胞の死亡率を抑制できる。
熱ゾルゲル変性材をＣＮＦと併用することで、Ｔｃｓを制御することができる。
熱ゾルゲル変性材は降温の際のゾル化を促す。すなわち、あまり低温まで下げずに、ゲル化状態の培養液をゾル化させる効果、すなわち、ゾル化温度を上昇させる降下を有する。
この結果、培養液をゾル化し細胞を沈降、回収する際に、細胞が死亡するような低温にまで培養液温度を下げずにすみ、細胞の死亡率を抑制できる。
((熱ゾルゲル変化剤の種類))
熱ゾルゲル変化剤は、特に限定されないが、例えば、メチルセルロース（ＭＣ）、およびカードラン（ＣＵ）等を挙げることができ、好ましくはＭＣまたはＣＵであり、より好ましくはＭＣである。
熱ゾルゲル変化剤は、特に限定されないが、例えば、メチルセルロース（ＭＣ）、およびカードラン（ＣＵ）等を挙げることができ、好ましくはＭＣまたはＣＵであり、より好ましくはＭＣである。
((熱ゾルゲル変化剤の分子量または重合度))
ＭＣおよびＣＵの重合度は、特に限定されないが、好ましくは１００〜１万であり、より好ましくは２００〜６０００であり、さらに好ましくは３００〜４０００である。
この範囲内であると、ゾル化の効果をより発現しやすく、かつ、培養の粘度がより低下するため、より良好な細胞沈降率を達成することができる。
ＭＣおよびＣＵの重合度は、特に限定されないが、好ましくは１００〜１万であり、より好ましくは２００〜６０００であり、さらに好ましくは３００〜４０００である。
この範囲内であると、ゾル化の効果をより発現しやすく、かつ、培養の粘度がより低下するため、より良好な細胞沈降率を達成することができる。
ＭＣは、特に限定されず、様々な分子量または重合度のＭＣを使用することができる。
ＭＣ（例えば、メチルセルロース＃４００，ナカライテスク社製）は、ゲル化温度（Ｔｃ）が約６０℃であり、ゾル化温度（Ｔｃｓ）が約２０℃である。
市販のＭＣとしては、例えば、メチルセルロース＃１００、メチルセルロース＃４００、メチルセルロース＃１５００、またはメチルセルロース＃４０００（いずれもナカライテスク社製；＃のあとの数字は重合度を示す）を用いることができる。
ＭＣ（例えば、メチルセルロース＃４００，ナカライテスク社製）は、ゲル化温度（Ｔｃ）が約６０℃であり、ゾル化温度（Ｔｃｓ）が約２０℃である。
市販のＭＣとしては、例えば、メチルセルロース＃１００、メチルセルロース＃４００、メチルセルロース＃１５００、またはメチルセルロース＃４０００（いずれもナカライテスク社製；＃のあとの数字は重合度を示す）を用いることができる。
ＣＵは、特に限定されず、例えば、和光純薬（生化学用）、またはキリン協和フーズから購入したものを使用することができる。
ＣＵ（例えば、カードラン（生化学用），和光純薬工業株式会社製）は、ゲル化温度（Ｔｃ）が約８０℃であり、ゾル化温度（Ｔｃｓ）が約１５℃である。
ＣＵ（例えば、カードラン（生化学用），和光純薬工業株式会社製）は、ゲル化温度（Ｔｃ）が約８０℃であり、ゾル化温度（Ｔｃｓ）が約１５℃である。
((熱ゾルゲル変化剤含有量))
培養液中の熱ゾルゲル変性剤含有量が多いほど、降温時相転移温度（Ｔｃｓ）は上昇し、熱ゾルゲル剤含有量が少ないほど、Ｔｃｓは下降する。
即ち熱ゾルゲル変性剤は、培養液がゾル化する温度を上昇させる効果を有する。この結果、培養液をゾル化し細胞を沈降、回収する際に、細胞が死亡するような低温にまで培養液温度を下げずにすみ、細胞の死亡率を抑制できる。
培養液中の熱ゾルゲル変性剤含有量が多いほど、降温時相転移温度（Ｔｃｓ）は上昇し、熱ゾルゲル剤含有量が少ないほど、Ｔｃｓは下降する。
即ち熱ゾルゲル変性剤は、培養液がゾル化する温度を上昇させる効果を有する。この結果、培養液をゾル化し細胞を沈降、回収する際に、細胞が死亡するような低温にまで培養液温度を下げずにすみ、細胞の死亡率を抑制できる。
本発明の培養液中の熱ゾルゲル変化剤の含有量は、特に限定されないが、好ましくは０．０５質量％以上３．０質量％以下であり、より好ましくは０．１質量％以上１．５質量％以下であり、さらに好ましくは０．２質量％以上〜０．７質量％以下である。
熱ゾルゲル変化剤の含有量がこの範囲内であると、熱ゾルゲル変化剤のゾル化の効果がよりよく発揮され、Ｔｃｓが低温になりすぎることがなく、細胞の降温処理温度が低温にならず、細胞死亡率をより低下させることができる。また、ＴｃｓとＴｃとの差が大きいため、培養液がより安定になり、細胞増殖率がより向上しやすい。
（ゾル−ゲル転移能の付与）
本発明の好ましい実施態様は、次のような特徴を有する。
培養液がＣＮＦおよび熱ゾルゲル変化剤を含むことにより、培養液にゾル−ゲル転移能が付与される。
培養液をゲル化し、ゲル化状態の培養液中で細胞を浮遊培養することにより、高い細胞増殖率を達成することができる。
培養液のゲル中で浮遊培養を行った後、培養液をゾル化して、培養された細胞を沈降させ、回収し易くする。
このようなゲル化およびゾル化は、意外なことに、ＣＮＦと熱ゾルゲル変化剤と相互作用により発現する。
培養液をゲル化温度（Ｔｃ）以上の温度に昇温すると、培養液中でハイドロゲルが形成されてゲル化し、細胞が浮遊するが、培養液をゾル化温度（Ｔｃｓ）未満に降温すると、ハイドロゲルが崩れ、細胞が沈降する。
熱ゾルゲル変化剤だけでもゲル化温度（Ｔｃ）およびゾル化温度（Ｔｃｓ）を発現することは可能であるが、培養時の細胞浮遊性を確保するためには、ＣＮＦを併用することが望ましい。
本発明の好ましい実施態様は、次のような特徴を有する。
培養液がＣＮＦおよび熱ゾルゲル変化剤を含むことにより、培養液にゾル−ゲル転移能が付与される。
培養液をゲル化し、ゲル化状態の培養液中で細胞を浮遊培養することにより、高い細胞増殖率を達成することができる。
培養液のゲル中で浮遊培養を行った後、培養液をゾル化して、培養された細胞を沈降させ、回収し易くする。
このようなゲル化およびゾル化は、意外なことに、ＣＮＦと熱ゾルゲル変化剤と相互作用により発現する。
培養液をゲル化温度（Ｔｃ）以上の温度に昇温すると、培養液中でハイドロゲルが形成されてゲル化し、細胞が浮遊するが、培養液をゾル化温度（Ｔｃｓ）未満に降温すると、ハイドロゲルが崩れ、細胞が沈降する。
熱ゾルゲル変化剤だけでもゲル化温度（Ｔｃ）およびゾル化温度（Ｔｃｓ）を発現することは可能であるが、培養時の細胞浮遊性を確保するためには、ＣＮＦを併用することが望ましい。
（ΔＴｃの調節）
なお、ＴｃはＣＮＦの含有量によって調節することができ、Ｔｃｓは熱ゾルゲル変性剤の含有量によって調節することができ、これらは独立しているので、ΔＴｃ＝Ｔｃ−Ｔｃｓは、ＣＮＦおよび熱ゾルゲル変化剤の含有量比で調節することができる。
なお、ＴｃはＣＮＦの含有量によって調節することができ、Ｔｃｓは熱ゾルゲル変性剤の含有量によって調節することができ、これらは独立しているので、ΔＴｃ＝Ｔｃ−Ｔｃｓは、ＣＮＦおよび熱ゾルゲル変化剤の含有量比で調節することができる。
（細胞を培養するための培地成分）
本発明の培養液は、細胞を培養するための培地成分を含んでもよい。
細胞を培養するための培地成分は、細胞の種類によって適宜選択することができるが、ヒト細胞を培養するための基礎培地成分を含む培地としては、例えば、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ（Eagle’s minimal essential medium）と称する場合がある。）および／またはその変法培地などが挙げられる。ＥＭＥＭの変法培地として、例えば、ダルベッコ・フォークト変法イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ（Dulbecco's modified Eagle medium））が挙げられる。また、基礎培地成分を含む培地としては、これらの最小必須培地にビタミン、アミノ酸、およびグルコース等の成分を添加したものも含まれる。
本発明の培養液は、細胞を培養するための培地成分を含んでもよい。
細胞を培養するための培地成分は、細胞の種類によって適宜選択することができるが、ヒト細胞を培養するための基礎培地成分を含む培地としては、例えば、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ（Eagle’s minimal essential medium）と称する場合がある。）および／またはその変法培地などが挙げられる。ＥＭＥＭの変法培地として、例えば、ダルベッコ・フォークト変法イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ（Dulbecco's modified Eagle medium））が挙げられる。また、基礎培地成分を含む培地としては、これらの最小必須培地にビタミン、アミノ酸、およびグルコース等の成分を添加したものも含まれる。
〈昇温工程〉
昇温工程は、培養液をゲル化温度Ｔｃ未満からゾル化温度Ｔｃ以上に昇温する工程である。
昇温工程においては、加熱処理により培養液をＴｃ以上に昇温することにより、培養液をゲル化させる。
昇温工程は、培養液をゲル化温度Ｔｃ未満からゾル化温度Ｔｃ以上に昇温する工程である。
昇温工程においては、加熱処理により培養液をＴｃ以上に昇温することにより、培養液をゲル化させる。
ゲル化温度Ｔｃは、培養液の成分、例えば、セルロースナノファイバーの含有量、を調整することによって適宜調節することができ、特に限定されないが、好ましくは４２．０℃以上９０．０℃以下であり、より好ましくは４４．０℃以上８５．０℃以下であり、さらに好ましくは４５．０℃以上８０．０℃以下である。
ゲル化温度Ｔｃがこの範囲内であると、培養工程において、ゲル化した培養液の内部まで酸素が拡散するため、細胞増殖率をより高くすることができる。また、細胞を培養するための培地成分が分解されず、培養される細胞が利用できるため、細胞増殖率をより高くすることができる。
ゲル化温度Ｔｃがこの範囲内であると、培養工程において、ゲル化した培養液の内部まで酸素が拡散するため、細胞増殖率をより高くすることができる。また、細胞を培養するための培地成分が分解されず、培養される細胞が利用できるため、細胞増殖率をより高くすることができる。
培養液をゲル化する温度、すなわち、加熱処理の温度は、Ｔｃ以上であれば特に限定されないが、好ましくはＴｃ以上９９．０℃以下であり、より好ましくはＴｃ＋２．０℃以上９７．０℃以下であり、さらに好ましくはＴｃ＋４．０℃以上９５．０℃以下である。
加熱処理の温度がこの範囲内であると、培養液のゲル化が十分に進み、培養工程におおいて細胞に十分な浮力が与えられるため、細胞増殖率がより向上する。また、細胞を培養するための培地成分が加熱処理によって分解されることがないので、細胞増殖率を低下させない。
加熱処理の温度の下限は、ゲル化温度（Ｔｃ）に依存するため、培養液に依存して決定される。一方、加熱処理の温度の上限は、細胞を培養するための培地成分の熱分解により規定されるため、ゲル化温度（Ｔｃ）に依存しない。
加熱処理の温度がこの範囲内であると、培養液のゲル化が十分に進み、培養工程におおいて細胞に十分な浮力が与えられるため、細胞増殖率がより向上する。また、細胞を培養するための培地成分が加熱処理によって分解されることがないので、細胞増殖率を低下させない。
加熱処理の温度の下限は、ゲル化温度（Ｔｃ）に依存するため、培養液に依存して決定される。一方、加熱処理の温度の上限は、細胞を培養するための培地成分の熱分解により規定されるため、ゲル化温度（Ｔｃ）に依存しない。
加熱処理の時間は、そのときの加熱温度で培養液をゲル化することができる時間であれば特に限定されないが、好ましくは１．０秒以上１０分以下であり、より好ましくは５．０秒以上８．０分以下であり、さらに好ましくは１０秒以上５．０分以下である。
加熱処理の時間がこの範囲内であると、培養液のゲル化が十分に進み、培養工程におおいて細胞に十分な浮力が与えられるため、細胞増殖率がより向上する。また、細胞を培養するための培地成分が加熱処理によって分解されることがないので、細胞増殖率を低下させない。
なお、細胞を培養するための培地成分のうち、アミノ酸、タンパク質、糖、およびビタミンなど、加熱により変性しやすい成分は、後述する培養液調製工程では添加せず、昇温工程の後に培養液に添加することも好ましい。
加熱処理の時間がこの範囲内であると、培養液のゲル化が十分に進み、培養工程におおいて細胞に十分な浮力が与えられるため、細胞増殖率がより向上する。また、細胞を培養するための培地成分が加熱処理によって分解されることがないので、細胞増殖率を低下させない。
なお、細胞を培養するための培地成分のうち、アミノ酸、タンパク質、糖、およびビタミンなど、加熱により変性しやすい成分は、後述する培養液調製工程では添加せず、昇温工程の後に培養液に添加することも好ましい。
本発明の細胞の培養方法は、後述するように、培養液に細胞を播種する播種工程を行ってもよいが、昇温工程の前に播種工程を行う場合、昇温工程における加熱処理の温度は、好ましくは４２．０℃以上５０．０℃以下、よりに好ましくは４２．０℃以上４８．０℃以下、さらに好ましくは４２．０℃以上４５．０℃以下である。
加熱処理の温度がこの範囲内であると、加熱による細胞の死亡を抑制し、培養工程における細胞増殖率を向上させることができる。
加熱処理の温度がこの範囲内であると、加熱による細胞の死亡を抑制し、培養工程における細胞増殖率を向上させることができる。
《加熱方法》
加熱処理のための方法（加熱方法）は、特に限定されないが、例えば、培養容器をプレートヒーター上に乗せて培養容器を加熱する方法、培養容器を湯せんにより加熱する方法、などが挙げられる。また、放射熱源（赤外線ヒーター等）を用いる方法でも良い。
加熱処理のための方法（加熱方法）は、特に限定されないが、例えば、培養容器をプレートヒーター上に乗せて培養容器を加熱する方法、培養容器を湯せんにより加熱する方法、などが挙げられる。また、放射熱源（赤外線ヒーター等）を用いる方法でも良い。
〈培養工程〉
培養工程は、昇温工程において培養液をＴｃ以上に昇温した後、Ｔｃｓ以上の培養温度で、培養液中で細胞を浮遊培養する工程である。
培養工程は、昇温工程において培養液をＴｃ以上に昇温した後、Ｔｃｓ以上の培養温度で、培養液中で細胞を浮遊培養する工程である。
昇温工程において培養液をゲル化温度（Ｔｃ）以上に昇温してゲル化させた後、細胞の浮遊培養が行われる。
培養液をゲル化した後、培養開始前においては、培養液をゲル化状態、好ましくは培養液の温度をゾル化温度（Ｔｃｓ）以上、に保つ。
また、培養開始後、すなわち培養中においては、培養液の温度をＴｃｓ以上に保つ。
培養液をゲル化した後、培養液の温度をＴｃｓ以上に保つと、培養液がゲル化状態を保ちやすい。
なお、培養中の培養液の温度、すなわち培養温度については、後述する。
培養液をゲル化した後、培養開始前においては、培養液をゲル化状態、好ましくは培養液の温度をゾル化温度（Ｔｃｓ）以上、に保つ。
また、培養開始後、すなわち培養中においては、培養液の温度をＴｃｓ以上に保つ。
培養液をゲル化した後、培養液の温度をＴｃｓ以上に保つと、培養液がゲル化状態を保ちやすい。
なお、培養中の培養液の温度、すなわち培養温度については、後述する。
培養中においては、培養液の温度をＴｃｓ以上に保っていれば、Ｔｃｓ以上の範囲内で温度を上下してもかまわない。これは、ゲル化状態の培養液は、ゲル構造が熱力学的に安定な構造であるため、Ｔｃｓ以上では、安定したゲル構造を維持するからである。
培養方法としては、例えば、国際公開第２０１５／１１１７３４号（［００３２］〜［００３３］）、国際公開第２０１４／１３６５８１号（［００６３］〜［００９５］）などに記載された方法を用いる事ができる。
《培養温度》
本発明の培養液は、熱によってゾル−ゲル転移が生じるが、ゲル化温度（Ｔｃ）およびゾル化温度（Ｔｃｓ）にヒステリシスが存在することが特徴である。
Ｔｃ＞Ｔｃｓであり、この結果、低温に下げてもゲル状態を維持できるため、ゲル化温度が広がり、培養温度を広く取れる特徴を有する。
本発明の培養液は、熱によってゾル−ゲル転移が生じるが、ゲル化温度（Ｔｃ）およびゾル化温度（Ｔｃｓ）にヒステリシスが存在することが特徴である。
Ｔｃ＞Ｔｃｓであり、この結果、低温に下げてもゲル状態を維持できるため、ゲル化温度が広がり、培養温度を広く取れる特徴を有する。
したがって、培養温度は、Ｔｃｓ以上であれば特に限定されないが、好ましくはＴｃｓ以上Ｔｃ以下であり、より好ましくはＴｃｓ＋２．０℃以上Ｔｃ−２．０℃以下であり、さらに好ましくはＴｃｓ＋５．０℃以上Ｔｃ−５．０℃以下である。
より具体的には、培養温度は、培養液がゲル化状態である温度であれば特に限定されないが、好ましくは１０．０℃以上５５．０℃以下であり、より好ましくは１５．０℃以上５０．０℃以下であり、さらに好ましくは２０．０℃以上４５．０℃以下である。
《細胞》
細胞は、特に限定されず、種々の細胞を含み得る。
細胞の由来は、特に限定されないが、好ましくは動物細胞であり、より好ましくはヒト細胞である。
細胞の種類は、特に限定されないが、好ましくは幹細胞であり、より好ましくは胚性幹細胞（以下「ＥＳ細胞」という場合がある。：ＥＳ，embryonic stem）、体性幹細胞、および人工多能性幹細胞（以下「ｉＰＳ細胞」という場合がある。：ｉＰＳ，induced pluripotent stem）からなる群から選択される少なくとも１つである。
細胞の由来および種類は、特に限定されないが、好ましくはヒト幹細胞であり、より好ましくはヒト胚性幹細胞（ヒトＥＳ細胞）、ヒト体性幹細胞、およびヒト人工多能性細胞（ｉＰＳ細胞）からなる群から選択される少なくとも１つである。
幹細胞は比較的温度変化に強く、培養温度から降温処理の温度まで温度を変化させても、細胞の生存率を高くすることができるためである。
細胞は、特に限定されず、種々の細胞を含み得る。
細胞の由来は、特に限定されないが、好ましくは動物細胞であり、より好ましくはヒト細胞である。
細胞の種類は、特に限定されないが、好ましくは幹細胞であり、より好ましくは胚性幹細胞（以下「ＥＳ細胞」という場合がある。：ＥＳ，embryonic stem）、体性幹細胞、および人工多能性幹細胞（以下「ｉＰＳ細胞」という場合がある。：ｉＰＳ，induced pluripotent stem）からなる群から選択される少なくとも１つである。
細胞の由来および種類は、特に限定されないが、好ましくはヒト幹細胞であり、より好ましくはヒト胚性幹細胞（ヒトＥＳ細胞）、ヒト体性幹細胞、およびヒト人工多能性細胞（ｉＰＳ細胞）からなる群から選択される少なくとも１つである。
幹細胞は比較的温度変化に強く、培養温度から降温処理の温度まで温度を変化させても、細胞の生存率を高くすることができるためである。
体性幹細胞としては、例えば、造血幹細胞、臍帯血幹細胞、衛星細胞、腸管幹細胞、毛包幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞、内皮幹細胞、嗅粘膜幹細胞、神経冠幹細胞、および精巣細胞などが挙げられ、好ましくは間葉系幹細胞である。
また、ヒト体性幹細胞としては、例えば、ヒト造血幹細胞、ヒト臍帯血幹細胞、ヒト衛星細胞、ヒト腸管幹細胞、ヒト毛包幹細胞、ヒト間葉系幹細胞、ヒト神経幹細胞、ヒト内皮幹細胞、ヒト嗅粘膜幹細胞、ヒト神経冠幹細胞、およびヒト精巣細胞などが挙げられ、好ましくはヒト間葉系幹細胞である。
また、ヒト体性幹細胞としては、例えば、ヒト造血幹細胞、ヒト臍帯血幹細胞、ヒト衛星細胞、ヒト腸管幹細胞、ヒト毛包幹細胞、ヒト間葉系幹細胞、ヒト神経幹細胞、ヒト内皮幹細胞、ヒト嗅粘膜幹細胞、ヒト神経冠幹細胞、およびヒト精巣細胞などが挙げられ、好ましくはヒト間葉系幹細胞である。
いろいろな型の細胞分化可能で、治療に活用され得る間葉系幹細胞は、通常、生体から採取し、選別し、そして純化したものを陥る。本発明の回収方法において使用できる間葉系幹細胞としては、患者から直接採取される臨床用の初代ヒト間葉系幹細胞ばかりでなく、試験研究用に用い得る細胞バンクより入手できる間葉系幹細胞、および不死化された間葉系幹細胞株も挙げられる。
当業者であれば既知のとおり、これらの間葉系幹細胞は、臨床上の適用の観点から捉えると、自家ソース由来、異種異系ソース由来、または異種間ソース由来のいずれの細胞であってもよい。また、採取源は、ドナー骨髄、組織生検、胚性ソース、または出生後ソースなどのいずれの採取源であってもよい。具体的には、腸骨稜の骨髄、大腿頸骨、脊椎、肋骨、もしくはその他の骨髄腔由来、または胚性卵黄嚢、胎盤、臍帯、骨膜、胎児または青年期の皮膚、および血液を含む組織生検由来などの採取源が挙げられる。
当業者であれば既知のとおり、これらの間葉系幹細胞は、臨床上の適用の観点から捉えると、自家ソース由来、異種異系ソース由来、または異種間ソース由来のいずれの細胞であってもよい。また、採取源は、ドナー骨髄、組織生検、胚性ソース、または出生後ソースなどのいずれの採取源であってもよい。具体的には、腸骨稜の骨髄、大腿頸骨、脊椎、肋骨、もしくはその他の骨髄腔由来、または胚性卵黄嚢、胎盤、臍帯、骨膜、胎児または青年期の皮膚、および血液を含む組織生検由来などの採取源が挙げられる。
ｉＰＳ細胞としては、例えば、国際公開第２０１５／０３７５３５号、特許第５５９０６４６号公報、国際公開第２０１１／０４３４０５号、国際公開第２０１３／０７７４２３号、または国際公開第２０１４／１３６５８１号（［００５０］〜［００６１］）に記載されたｉＰＳ細胞を使用することができる。
なお、沈降工程における「培養された細胞」、後述する播種工程における「播種された細胞」および種細胞としての「細胞」、ならびに後述する培養工程における「浮遊培養される細胞」および種細胞から浮遊培養する「細胞」は、いずれも、上記した細胞であってよい。
〈播種工程〉
本発明の細胞の培養方法は、昇温工程の前または後に、播種工程を実施してもよい。
播種工程は、培養液に細胞を播種する工程である。
培養液に細胞を播種する方法は、特に限定されないが、例えば、細胞を培養液に分散して調製した懸濁液を培養液に注入する方法が挙げられる。
本発明の細胞の培養方法は、昇温工程の前または後に、播種工程を実施してもよい。
播種工程は、培養液に細胞を播種する工程である。
培養液に細胞を播種する方法は、特に限定されないが、例えば、細胞を培養液に分散して調製した懸濁液を培養液に注入する方法が挙げられる。
《播種のタイミング》
播種工程は、昇温工程の後（「ＡＲＴ」（after rising temperature）という場合がある。）に行ってもよいし、昇温工程の前（「ＢＲＴ」（before rising temperature）という場合がある。）に行ってもよい。
播種工程は、昇温工程の後（「ＡＲＴ」（after rising temperature）という場合がある。）に行ってもよいし、昇温工程の前（「ＢＲＴ」（before rising temperature）という場合がある。）に行ってもよい。
《播種時の細胞濃度》
また、播種工程において、播種時の細胞濃度は特に限定されないが、好ましくは１．０×１０５個／ｍＬ〜１．０×１０１０個／ｍＬであり、より好ましくは１．０×１０６個／ｍＬ〜１．０×１０９個／ｍＬであり、さらに好ましくは１．５×１０６個／ｍＬ〜５．０×１０８個／ｍＬである。
また、播種工程において、播種時の細胞濃度は特に限定されないが、好ましくは１．０×１０５個／ｍＬ〜１．０×１０１０個／ｍＬであり、より好ましくは１．０×１０６個／ｍＬ〜１．０×１０９個／ｍＬであり、さらに好ましくは１．５×１０６個／ｍＬ〜５．０×１０８個／ｍＬである。
《ゲル化後播種工程》
本発明の細胞の培養方法において、昇温工程の後に行う播種工程を、特に、ゲル化後播種工程という。
ゲル化後播種工程を行う場合は、ゲル化状態にある培養液を弱く撹拌し、細胞を播種することで、培地内部まで細胞を拡散できる。培養液を撹拌する方法としては、例えば、スパチュラーを用いて手で撹拌する方法、マグネティックスターラーおよび撹拌子を用いて撹拌する方法などが挙げられる。撹拌する際の回転数は、特に限定されないが、好ましくは１０ｒｐｍ〜１５０ｒｐｍであり、撹拌時間は、特に限定されないが、好ましくは０．１分〜５分である。これは、以下の理由による。
本発明の培養液がゲル化状態にあるとき、そのゲル構造は熱力学的に安定であるため、撹拌によってゲル構造が壊れても、ゲル化状態を維持できる温度範囲にあれば容易に再構築される。再構築までの時間は、ゲル構造の破壊の程度が大きいほど時間を要するが、弱い撹拌による弱い構造破壊では、１分〜３０分で構造が復元し、細胞の浮遊培養が可能となる。
さらに、上記撹拌は、播種の前に行ってもよいし、播種の後に行なってもよい。弱い撹拌なので、遠心処理のような強い撹拌と異なり、播種後に行っても細胞が死亡するようなことがない。
ゲル化後播種工程は、昇温工程において培養液をＴｃ℃以上に昇温してゲル化した後、培養液をゲル化状態に保ったまま、好ましくは培養液の温度をＴｃｓ以上に保ったまま行われる。
培養液をゲル化した後、培養液の温度をＴｃｓ以上に保つと、培養液がゲル化状態を保ちやすい。
本発明の細胞の培養方法において、昇温工程の後に行う播種工程を、特に、ゲル化後播種工程という。
ゲル化後播種工程を行う場合は、ゲル化状態にある培養液を弱く撹拌し、細胞を播種することで、培地内部まで細胞を拡散できる。培養液を撹拌する方法としては、例えば、スパチュラーを用いて手で撹拌する方法、マグネティックスターラーおよび撹拌子を用いて撹拌する方法などが挙げられる。撹拌する際の回転数は、特に限定されないが、好ましくは１０ｒｐｍ〜１５０ｒｐｍであり、撹拌時間は、特に限定されないが、好ましくは０．１分〜５分である。これは、以下の理由による。
本発明の培養液がゲル化状態にあるとき、そのゲル構造は熱力学的に安定であるため、撹拌によってゲル構造が壊れても、ゲル化状態を維持できる温度範囲にあれば容易に再構築される。再構築までの時間は、ゲル構造の破壊の程度が大きいほど時間を要するが、弱い撹拌による弱い構造破壊では、１分〜３０分で構造が復元し、細胞の浮遊培養が可能となる。
さらに、上記撹拌は、播種の前に行ってもよいし、播種の後に行なってもよい。弱い撹拌なので、遠心処理のような強い撹拌と異なり、播種後に行っても細胞が死亡するようなことがない。
ゲル化後播種工程は、昇温工程において培養液をＴｃ℃以上に昇温してゲル化した後、培養液をゲル化状態に保ったまま、好ましくは培養液の温度をＴｃｓ以上に保ったまま行われる。
培養液をゲル化した後、培養液の温度をＴｃｓ以上に保つと、培養液がゲル化状態を保ちやすい。
（ゲル化後播種工程−播種時の培養液の温度）
また、ゲル化後播種工程において、細胞を播種する際の培養液の温度はゾル化温度Ｔｃｓ以上であれば特に限定されないが、好ましくはＴｃｓ以上Ｔｃ以下であり、より好ましくはＴｃｓ＋２．０℃以上Ｔｃ−２．０℃以下であり、さらに好ましくはＴｃｓ＋５．０℃以上Ｔｃ−５．０℃以下である。
播種時の培地の温度は、細胞に与えるストレスを軽減するため、培養温度付近とすることが望ましい。
また、ゲル化後播種工程において、細胞を播種する際の培養液の温度はゾル化温度Ｔｃｓ以上であれば特に限定されないが、好ましくはＴｃｓ以上Ｔｃ以下であり、より好ましくはＴｃｓ＋２．０℃以上Ｔｃ−２．０℃以下であり、さらに好ましくはＴｃｓ＋５．０℃以上Ｔｃ−５．０℃以下である。
播種時の培地の温度は、細胞に与えるストレスを軽減するため、培養温度付近とすることが望ましい。
《ゲル化前播種工程》
本発明の細胞の培養方法において、昇温工程の前に行う播種工程を、特に、ゲル化前播種工程という。
ゲル化前播種工程を行う場合は、昇温時相転移温度（Ｔｃ）が低温であることが望ましい。播種工程の後に昇温工程を行っても、低温で培養液をゲル化することができるため、昇温工程の加熱処理に伴う細胞の死亡を抑制でき、培養後の細胞増殖率をより高くすること、および／または、沈降後の細胞死亡率をより低くすること、ができる。
このような昇温時相転移温度（Ｔｃ）は、細胞の耐熱性、生存率閾値等に影響され、一律に規定することはできないが、好ましくは４５．０℃以下であり、より好ましくは４３．０℃以下であり、さらに好ましくは４２．０℃以下である。
本発明の細胞の培養方法において、昇温工程の前に行う播種工程を、特に、ゲル化前播種工程という。
ゲル化前播種工程を行う場合は、昇温時相転移温度（Ｔｃ）が低温であることが望ましい。播種工程の後に昇温工程を行っても、低温で培養液をゲル化することができるため、昇温工程の加熱処理に伴う細胞の死亡を抑制でき、培養後の細胞増殖率をより高くすること、および／または、沈降後の細胞死亡率をより低くすること、ができる。
このような昇温時相転移温度（Ｔｃ）は、細胞の耐熱性、生存率閾値等に影響され、一律に規定することはできないが、好ましくは４５．０℃以下であり、より好ましくは４３．０℃以下であり、さらに好ましくは４２．０℃以下である。
（ゲル化前播種工程−播種時の培養液の温度）
また、ゲル化前播種工程において、細胞を播種する際の培養液の温度はゲル化温度Ｔｃ未満であれば特に限定されないが、好ましくはＴｃｓ以上Ｔｃ未満であり、より好ましくはＴｃｓ＋２．０℃以上Ｔｃ−２．０℃以下であり、さらに好ましくはＴｃｓ＋５．０℃以上Ｔｃ−５．０℃以下である。
播種時の培地の温度は、細胞に与えるストレスを軽減するため、培養温度付近とすることが望ましい。
また、ゲル化前播種工程において、細胞を播種する際の培養液の温度はゲル化温度Ｔｃ未満であれば特に限定されないが、好ましくはＴｃｓ以上Ｔｃ未満であり、より好ましくはＴｃｓ＋２．０℃以上Ｔｃ−２．０℃以下であり、さらに好ましくはＴｃｓ＋５．０℃以上Ｔｃ−５．０℃以下である。
播種時の培地の温度は、細胞に与えるストレスを軽減するため、培養温度付近とすることが望ましい。
〈回収工程〉
本発明の細胞の培養方法は、培養工程の後に、さらに、回収工程を実施してもよい。
回収工程は、培養液をＴｃｓ未満に降温して、培養工程において培養された細胞を沈降させ、回収する工程である。
培養液をＴｃｓ未満に降温する処理を降温処理といい、その操作を降温操作という場合がある。
なお、本明細書において、Ｔｃｓをゾル化温度という場合がある。ただし、Ｔｃｓの定義より、Ｔｃｓでは培養液はゲル化状態にある。
本発明の細胞の培養方法は、培養工程の後に、さらに、回収工程を実施してもよい。
回収工程は、培養液をＴｃｓ未満に降温して、培養工程において培養された細胞を沈降させ、回収する工程である。
培養液をＴｃｓ未満に降温する処理を降温処理といい、その操作を降温操作という場合がある。
なお、本明細書において、Ｔｃｓをゾル化温度という場合がある。ただし、Ｔｃｓの定義より、Ｔｃｓでは培養液はゲル化状態にある。
ゾル化温度Ｔｃｓは、培養液の成分、例えば、熱ゾルゲル変化剤の含有量、を調整することによって適宜調節することができる、特に限定されないが、好ましくは３．０℃以上４１．０℃以下であり、より好ましくは５．０℃以上４０．０℃以下であり、さらに好ましくは１０．０℃以上３８．０℃以下である。
ゾル化温度Ｔｃｓがこの範囲内であると、回収工程において、あまり低温にすることなく細胞を沈降させることができ、かつ、ゲル化状態からゾル化状態への転移が安定するため、細胞死亡率をより低下させることができるとともに、細胞沈降率をより向上させることができる。
ゾル化温度Ｔｃｓがこの範囲内であると、回収工程において、あまり低温にすることなく細胞を沈降させることができ、かつ、ゲル化状態からゾル化状態への転移が安定するため、細胞死亡率をより低下させることができるとともに、細胞沈降率をより向上させることができる。
本発明の細胞の培養方法の回収工程において、培養工程において培養された細胞を沈降させるためには、培養液をＴｃｓ未満に降温するだけでよい。培養液の温度をＴｃｓ未満の温度（以下「降温処理の温度」という場合がある。）に降温することで、ゲル化状態にあった培養液をゾル化させ、培養された細胞を沈降させて、回収することができる。
降温処理の温度は、Ｔｃｓ未満であれば特に限定されないが、好ましくは３．０℃以上Ｔｃｓ−３．０℃以下であり、より好ましくは５．０℃以上Ｔｃｓ−５．０℃以下である。
降温処理の温度がこの範囲内であると、沈降が十分であり、細胞回収率がより向上するとともに、細胞に与える温度ストレスが少なく、細胞死亡率がより低下する。
降温処理の温度の上限は、ゾル化温度（Ｔｃｓ）に依存するため、培養液に依存して決定される。一方、降温処理の温度の下限は、その温度での細胞の生存率に依存するため、ゾル化温度（Ｔｃｓ）に依存しない。
降温処理の温度がこの範囲内であると、沈降が十分であり、細胞回収率がより向上するとともに、細胞に与える温度ストレスが少なく、細胞死亡率がより低下する。
降温処理の温度の上限は、ゾル化温度（Ｔｃｓ）に依存するため、培養液に依存して決定される。一方、降温処理の温度の下限は、その温度での細胞の生存率に依存するため、ゾル化温度（Ｔｃｓ）に依存しない。
降温処理の時間、すなわち、培養液を上記降温処理の温度に保つ時間は、培養液をゾル化することができれば特に限定されないが、好ましくは１秒以上であり、より好ましくは１０秒以上であり、さらに好ましくは３０秒以上である。
《降温方法》
降温処理のための方法（降温方法）は、特に限定されるものではないが、例えば、培養器を水等の冷媒に浸ける方法、培養器にクーラーを接触させる方法等が挙げられる。また冷風をあてることで降温させても良い。
降温処理のための方法（降温方法）は、特に限定されるものではないが、例えば、培養器を水等の冷媒に浸ける方法、培養器にクーラーを接触させる方法等が挙げられる。また冷風をあてることで降温させても良い。
《回収方法》
培養液をゾル化して細胞を沈降させた後、上清の培養液をデカンテーション、デカントアスピレーション、またはアスピレーション等の方法で除去することにより、細胞を回収することができる。
培養液をゾル化して細胞を沈降させた後、上清の培養液をデカンテーション、デカントアスピレーション、またはアスピレーション等の方法で除去することにより、細胞を回収することができる。
〈培養液調製工程〉
本発明の細胞の培養方法は、最初に培養液調製工程を実施してもよい。
培養液調製工程は、細胞を培養するための培養液を調製する工程である。
本発明の培養液がＣＮＦおよび熱ゾルゲル変化剤を含む場合、培養液調製工程は、ＣＮＦの調製と、培養液の調製との二段階を含み得る。
ただし、ＣＮＦとして既製品を使用する場合は、ＣＮＦの調製を省略することができる。
本発明の細胞の培養方法は、最初に培養液調製工程を実施してもよい。
培養液調製工程は、細胞を培養するための培養液を調製する工程である。
本発明の培養液がＣＮＦおよび熱ゾルゲル変化剤を含む場合、培養液調製工程は、ＣＮＦの調製と、培養液の調製との二段階を含み得る。
ただし、ＣＮＦとして既製品を使用する場合は、ＣＮＦの調製を省略することができる。
《ＣＮＦの調製》
（１）ＴＥＭＰＯ（2,2,6,6-tetramethyl-1-pyperizine-N-oxyl；２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジン−Ｎ−オキシル）化ＣＮＦの調製方法
ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦの調製方法は、特に限定されないが、例えば、特開２００９−２６３８５３号公報（［００１５］〜［００３０］）に記載された方法にしたがって、セルロース系材料を酸化剤（次亜塩素酸ナトリウム）存在下でＴＥＭＰＯ（2,2,6,6-tetramethyl-1-pyperizine-N-oxyl；２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジン−Ｎ−オキシル）触媒酸化処理を行って酸化処理されたセルロース系原料を、超高圧ホモジナイザーを用いて湿式微粒化処理して解繊することにより、ＴＥＭＰＯ化セルロースナノファイバーを調製することができる。
（１）ＴＥＭＰＯ（2,2,6,6-tetramethyl-1-pyperizine-N-oxyl；２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジン−Ｎ−オキシル）化ＣＮＦの調製方法
ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦの調製方法は、特に限定されないが、例えば、特開２００９−２６３８５３号公報（［００１５］〜［００３０］）に記載された方法にしたがって、セルロース系材料を酸化剤（次亜塩素酸ナトリウム）存在下でＴＥＭＰＯ（2,2,6,6-tetramethyl-1-pyperizine-N-oxyl；２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジン−Ｎ−オキシル）触媒酸化処理を行って酸化処理されたセルロース系原料を、超高圧ホモジナイザーを用いて湿式微粒化処理して解繊することにより、ＴＥＭＰＯ化セルロースナノファイバーを調製することができる。
（２）ＣＭ（carboxymethyl；カルボキシメチル）化ＣＮＦの調製方法
ＣＭ化ＣＮＦの調製方法は、特に限定されないが、例えば、国際公開第２０１５／１０７９９５号（［００５６］）に記載された方法にしたがって、アルカリ触媒存在下で、ＣＭ化剤であるモノクロロ酢酸を用いてＣＭ化処理されたセルロース系原料を、高圧ホモジナイザーを用いて湿式微粒化処理して解繊することにより、ＣＭ化セルロースナノファイバーを調製することができる。
その他、特開２０１５−２２７５１７号公報、特開２０１５−１３４８７３号公報、特開２０１５−４０３２号公報、特開２０１４−１９３５８０号公報、特開２０１３−１８５１２２号公報、特許３６４２１４７号公報、特許４０５５９１４号公報、国際公開第１３／１３７１４０号、国際公開第２０１５／１０７９９５号、国際公開第２０１５／５０１１７号、国際公開第２０１４／１８１５６０号、国際公開第２０１４／１８１２６０号、国際公開第２０１４／０８８０７２号、または国際公開第２０１４／０８７７６７号等に記載されたＣＭ化ＣＮＦの調製方法を使用できる。
ＣＭ化ＣＮＦの調製方法は、特に限定されないが、例えば、国際公開第２０１５／１０７９９５号（［００５６］）に記載された方法にしたがって、アルカリ触媒存在下で、ＣＭ化剤であるモノクロロ酢酸を用いてＣＭ化処理されたセルロース系原料を、高圧ホモジナイザーを用いて湿式微粒化処理して解繊することにより、ＣＭ化セルロースナノファイバーを調製することができる。
その他、特開２０１５−２２７５１７号公報、特開２０１５−１３４８７３号公報、特開２０１５−４０３２号公報、特開２０１４−１９３５８０号公報、特開２０１３−１８５１２２号公報、特許３６４２１４７号公報、特許４０５５９１４号公報、国際公開第１３／１３７１４０号、国際公開第２０１５／１０７９９５号、国際公開第２０１５／５０１１７号、国際公開第２０１４／１８１５６０号、国際公開第２０１４／１８１２６０号、国際公開第２０１４／０８８０７２号、または国際公開第２０１４／０８７７６７号等に記載されたＣＭ化ＣＮＦの調製方法を使用できる。
（３）リン酸処理ＣＮＦ
リン酸基をＣＮＦに導入することにより、より好ましくはリン酸エステル化することにより、調製することができる。
例えば、国際公開第２０１４／１８５５０５号、特開２０１６−３７０３１号公報、国際公開第２０１６／００２６８９号、または国際公開第２０１６／００２６８８号に記載された方法を使用することができる。
リン酸基をＣＮＦに導入することにより、より好ましくはリン酸エステル化することにより、調製することができる。
例えば、国際公開第２０１４／１８５５０５号、特開２０１６−３７０３１号公報、国際公開第２０１６／００２６８９号、または国際公開第２０１６／００２６８８号に記載された方法を使用することができる。
（４）機械解砕ＣＮＦの調製方法
機械解砕ＣＮＦの調製方法は、特に限定されないが、例えば、国際公開第２０１５／１１１７３４号（［００３９］）に記載された方法にしたがって、セルロース系原料を、高圧ホモジナイザーを用いて湿式微粒化処理して解繊することにより、機械解砕ＣＮＦを調製することができる。
機械解砕ＣＮＦの調製方法は、特に限定されないが、例えば、国際公開第２０１５／１１１７３４号（［００３９］）に記載された方法にしたがって、セルロース系原料を、高圧ホモジナイザーを用いて湿式微粒化処理して解繊することにより、機械解砕ＣＮＦを調製することができる。
各種ＣＮＦの調製において、原料ＣＮＦの由来は特に限定されず、パルプ由来のＣＮＦ、バクテリアセルロース（ＢＣ；ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）由来のＣＮＦ、およびエレクトロスピニングによるナノファイバーのいずれも使用することができるが、特に好ましくはパルプ由来のＣＮＦである。これは、繊維強度が強く、継代でスフェロイドが細分化し難いからである。
ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ、ＣＭ化ＣＮＦ、および機械解砕ＣＮＦから選択する場合、好ましくはＴＥＭＰＯ化ＣＮＦまたはＣＭ化ＣＮＦであり、より好ましくはＴＥＭＰＯ化ＣＮＦである。
すなわち、ＣＮＦとしては、好ましくはカルボキシ基を含有するＣＮＦであり、より好ましくはカルボキシ基を含有するとともに酸化処理が施されているＣＮＦである。
ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦはＴＥＭＰＯ酸化処理により、カルボキシ基の導入と酸化処理が施されている。
ＣＭ化ＣＮＦはカルボキシメチル化によりカルボキシ基が導入されているが、酸化処置は施されていない。
機械解砕ＣＮＦはカルボキシ基が導入されておらず、酸化処理も施されていない。
すなわち、ＣＮＦとしては、好ましくはカルボキシ基を含有するＣＮＦであり、より好ましくはカルボキシ基を含有するとともに酸化処理が施されているＣＮＦである。
ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦはＴＥＭＰＯ酸化処理により、カルボキシ基の導入と酸化処理が施されている。
ＣＭ化ＣＮＦはカルボキシメチル化によりカルボキシ基が導入されているが、酸化処置は施されていない。
機械解砕ＣＮＦはカルボキシ基が導入されておらず、酸化処理も施されていない。
《培養液の調製》
（ＣＮＦ無添加培養液の調製）
使用する細胞に適した基礎培地を、従来公知の方法によって、調製することができる。
例えば、国際公開第２０１５／１１１７３４号（［００２９］〜［００３１］）に記載された培地、または国際公開第２０１４／１３６５８１号（［００６２］）に記載された培地を使用してもよい。
（ＣＮＦ無添加培養液の調製）
使用する細胞に適した基礎培地を、従来公知の方法によって、調製することができる。
例えば、国際公開第２０１５／１１１７３４号（［００２９］〜［００３１］）に記載された培地、または国際公開第２０１４／１３６５８１号（［００６２］）に記載された培地を使用してもよい。
（ＣＮＦおよび熱ゾルゲル変化剤の添加）
基礎培地にＣＮＦおよび熱ゾルゲル変化剤を添加することにより、本発明の細胞の培養方法で用いる培養液を調製する。
ＣＮＦおよび熱ゾルゲル変化剤の添加順序は、特に限定されず、ＣＮＦを添加した後に熱ゾルゲル変化剤を添加してもよいし、ＣＮＦを添加する前に熱ゾルゲル変化剤を添加してもよい。また、ＣＮＦおよび熱ゾルゲル変化剤を同時に基礎培地に添加してもよい。
ＣＮＦを熱ゾルゲル変化剤の添加後に添加する場合、ＣＮＦを添加するときに急激な撹拌を行うことで、ＣＮＦと熱ゾルゲル変化剤との混合を促し、ＣＮＦと熱ゾルゲル変化剤との相互作用によるゾル−ゲル転移を起こし易くすることができる。
また、熱ゾルゲル変化剤をＣＮＦの添加後に添加する場合、熱ゾルゲル変化剤を添加するときに急激な撹拌を行うことで、熱ゾルゲル変化剤とＣＮＦとの混合を促し、熱ゾルゲル変化剤とＣＮＦとの相互作用によるゾル−ゲル転移を起こし易くすることができる。
さらに、ＣＮＦおよび熱ゾルゲル変化剤を同時に添加する場合、ＣＮＦおよび熱ゾルゲル変化剤を添加するときに急激な撹拌を行うことで、ＣＮＦと熱ゾルゲル変化剤との混合を促し、ＣＮＦと熱ゾルゲル変化剤との相互作用によるゾル−ゲル転移を起こし易くすることができる。
具体的には、ＣＮＦおよび／または熱ゾルゲル変化剤を培地に添加する際、マグネティックスターラー等で撹拌することが好ましく、さらには、添加後高回転のホモジナイザーで撹拌することが好ましい。
ホモジナイザーの回転数は、好ましくは１０００ｒｐｍ〜１０万ｒｐｍ、より好ましくは３０００ｒｐｍ〜５万ｒｐｍ、さらに好ましくは６０００ｒｐｍ〜２万ｒｐｍである。
ホモジナイザーの撹拌時間は、好ましくは１０秒〜３０分、より好ましくは２０秒〜１５分、さらに好ましくは３０秒〜１０分である。
回転数および時間がともにこの範囲内であると、細胞増殖率および細胞沈降率がともに向上しやすい。
基礎培地にＣＮＦおよび熱ゾルゲル変化剤を添加することにより、本発明の細胞の培養方法で用いる培養液を調製する。
ＣＮＦおよび熱ゾルゲル変化剤の添加順序は、特に限定されず、ＣＮＦを添加した後に熱ゾルゲル変化剤を添加してもよいし、ＣＮＦを添加する前に熱ゾルゲル変化剤を添加してもよい。また、ＣＮＦおよび熱ゾルゲル変化剤を同時に基礎培地に添加してもよい。
ＣＮＦを熱ゾルゲル変化剤の添加後に添加する場合、ＣＮＦを添加するときに急激な撹拌を行うことで、ＣＮＦと熱ゾルゲル変化剤との混合を促し、ＣＮＦと熱ゾルゲル変化剤との相互作用によるゾル−ゲル転移を起こし易くすることができる。
また、熱ゾルゲル変化剤をＣＮＦの添加後に添加する場合、熱ゾルゲル変化剤を添加するときに急激な撹拌を行うことで、熱ゾルゲル変化剤とＣＮＦとの混合を促し、熱ゾルゲル変化剤とＣＮＦとの相互作用によるゾル−ゲル転移を起こし易くすることができる。
さらに、ＣＮＦおよび熱ゾルゲル変化剤を同時に添加する場合、ＣＮＦおよび熱ゾルゲル変化剤を添加するときに急激な撹拌を行うことで、ＣＮＦと熱ゾルゲル変化剤との混合を促し、ＣＮＦと熱ゾルゲル変化剤との相互作用によるゾル−ゲル転移を起こし易くすることができる。
具体的には、ＣＮＦおよび／または熱ゾルゲル変化剤を培地に添加する際、マグネティックスターラー等で撹拌することが好ましく、さらには、添加後高回転のホモジナイザーで撹拌することが好ましい。
ホモジナイザーの回転数は、好ましくは１０００ｒｐｍ〜１０万ｒｐｍ、より好ましくは３０００ｒｐｍ〜５万ｒｐｍ、さらに好ましくは６０００ｒｐｍ〜２万ｒｐｍである。
ホモジナイザーの撹拌時間は、好ましくは１０秒〜３０分、より好ましくは２０秒〜１５分、さらに好ましくは３０秒〜１０分である。
回転数および時間がともにこの範囲内であると、細胞増殖率および細胞沈降率がともに向上しやすい。
熱ゾルゲル変化剤を添加した後は、上記した昇温工程において昇温するまで、培養液の温度が昇温時相転移温度（Ｔｃ）以上とならないようにすることが望ましい。ゲル状態は粘度が高すぎ、ゾル状態に比べて、取扱い性が悪くなるからである。
また、培養液としては、国際公開第２０１５／１１１７３４号（［００２９］〜［００３１］）に記載された培地、または国際公開第２０１４／１３６５８１号（［００６２］）に記載された培地をベースとしたものも使用できる。
培養容器あたりの培養液の量は、特に限定されないが、好ましくは０．５Ｌ以上であり、より好ましくは０．６Ｌ以上５０Ｌ以下であり、さらに好ましくは０．７Ｌ以上５．０Ｌ以下である。
培養液の量がこの範囲内であると、浮遊培養の際に細胞に酸素を十分に供給することができるため、細胞増殖率を高くして、大量の細胞を培養することができる。その結果、効率的に培養された細胞の回収をすることが容易となる。
培養液の量がこの範囲内であると、浮遊培養の際に細胞に酸素を十分に供給することができるため、細胞増殖率を高くして、大量の細胞を培養することができる。その結果、効率的に培養された細胞の回収をすることが容易となる。
［培養液］
本発明は、また、本発明の細胞の培養方法に使用するための培養液を提供する。
培養液は既に説明したとおりである。
本発明は、また、本発明の細胞の培養方法に使用するための培養液を提供する。
培養液は既に説明したとおりである。
［実施例１〜実施例６、比較例１］
実施例１〜６、および比較例１は、熱ゾルゲル変化剤の効果を示す例である。
実施例１〜６、および比較例１は、熱ゾルゲル変化剤の効果を示す例である。
〈比較例１〉
比較例１は、セルロースナノファイバーを含むが、熱ゾルゲル変化剤を含まない培養液を使用した例である。
比較例１は、セルロースナノファイバーを含むが、熱ゾルゲル変化剤を含まない培養液を使用した例である。
《培養液調製工程》
（セルロースナノファイバーの調製）
特開２００９−２６３８５３号公報（［００１５］〜［００３０］）に記載された方法にしたがって、セルロース系材料を酸化剤（次亜塩素酸ナトリウム）存在下でＴＥＭＰＯ（2,2,6,6-tetramethyl-1-pyperizine-N-oxyl；２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジン−Ｎ−オキシル）触媒酸化処理を行って酸化処理されたセルロース系原料を、超高圧ホモジナイザーを用いて湿式微粒化処理して解繊することにより、ＴＥＭＰＯ化セルロースナノファイバーを調製した。
調製したＴＥＭＰＯ化セルロースナノファイバーの平均直径およびカルボキシ基導入量を後述する方法にしたがって測定したところ、平均直径は４．０ｎｍであり、カルボキシ基導入量は１．７ｍｍｏｌ／ｇであった。以下、このＴＥＭＰＯ化セルロースナノファイバーを「ＴＥＭＰＯ１」と称する場合がある。
（セルロースナノファイバーの調製）
特開２００９−２６３８５３号公報（［００１５］〜［００３０］）に記載された方法にしたがって、セルロース系材料を酸化剤（次亜塩素酸ナトリウム）存在下でＴＥＭＰＯ（2,2,6,6-tetramethyl-1-pyperizine-N-oxyl；２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジン−Ｎ−オキシル）触媒酸化処理を行って酸化処理されたセルロース系原料を、超高圧ホモジナイザーを用いて湿式微粒化処理して解繊することにより、ＴＥＭＰＯ化セルロースナノファイバーを調製した。
調製したＴＥＭＰＯ化セルロースナノファイバーの平均直径およびカルボキシ基導入量を後述する方法にしたがって測定したところ、平均直径は４．０ｎｍであり、カルボキシ基導入量は１．７ｍｍｏｌ／ｇであった。以下、このＴＥＭＰＯ化セルロースナノファイバーを「ＴＥＭＰＯ１」と称する場合がある。
・平均直径の測定方法
セルロースナノファイバーの濃度が０．００１質量％となるように希釈したセルロースナノファイバー水分散液（以下「ＣＮＦ水分散液」という場合がある。）を調製した。このＣＮＦ水分散液をマイカ製試料台に薄く延ばし、５０℃で加熱乾燥して観察用試料を作成し、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ：atomic force microscope）を用いて観察した形状像の断面高さを１０点計測し、平均直径を算出した。
セルロースナノファイバーの濃度が０．００１質量％となるように希釈したセルロースナノファイバー水分散液（以下「ＣＮＦ水分散液」という場合がある。）を調製した。このＣＮＦ水分散液をマイカ製試料台に薄く延ばし、５０℃で加熱乾燥して観察用試料を作成し、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ：atomic force microscope）を用いて観察した形状像の断面高さを１０点計測し、平均直径を算出した。
・カルボキシ基導入量の測定方法
セルロースナノファイバーの０．５質量％スラリーを６０ｍＬ調製し、０．１Ｍ塩酸水溶液を加えてｐＨ２．５とした後、０．０５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を滴下してｐＨが１１になるまで電気伝導度を測定し、電気伝導度の変化が穏やかな弱酸の中和段階において消費された０．０５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液の量（ａ）から、下記式を用いて算出した。
カルボキシ基導入量（ｍｍｏｌ／ｇ）＝ａ（ｍＬ）×０．０５／セルロースナノファイバー質量（ｇ）
セルロースナノファイバーの０．５質量％スラリーを６０ｍＬ調製し、０．１Ｍ塩酸水溶液を加えてｐＨ２．５とした後、０．０５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を滴下してｐＨが１１になるまで電気伝導度を測定し、電気伝導度の変化が穏やかな弱酸の中和段階において消費された０．０５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液の量（ａ）から、下記式を用いて算出した。
カルボキシ基導入量（ｍｍｏｌ／ｇ）＝ａ（ｍＬ）×０．０５／セルロースナノファイバー質量（ｇ）
（培養液の調製）
調製したＴＥＭＰＯ１を純水と混合して０．３質量％水分散液（以下「ＣＮＦ分散液」という場合がある。）を得た。このＣＮＦ分散液を、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌し、滅菌後、室温まで冷却した。
粉末培地（ダルベッコ変法イーグル培地２，日水製薬（株）製）に加水し、３０分程マグネティックスターラーで撹拌してダルベッコ変法イーグル培地２溶液（以下「ＤＭＥＭ２溶液」という場合がある。）を調製した。ＤＭＥＭ２溶液を、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌し、滅菌後、室温まで冷却した。
オートクレーブ滅菌後、室温まで冷却したＤＭＥＭ２溶液に、滅菌したＣＮＦ分散液を、表１記載の濃度になるように無菌条件下で滴下した。滴下後、ＣＮＦ分散液を添加したＤＭＥＭ２溶液を、ホモミキサーを用いて、１００００ｒｐｍで５分間撹拌処理し、ＣＮＦ添加ＤＭＥＭ２溶液を得た。
このＣＮＦ添加ＤＭＥＭ２溶液を室温まで冷却した後に、ろ過滅菌したＬ−グルタミン溶液（Ｌ−グルタミン溶液（×１００），和光純薬工業（株）製；２００ｍｍｏｌ／Ｌ）を終濃度２ｍＭとなるように添加した。さらに、滅菌した１０質量％炭酸水素ナトリウム水溶液を１ｍＬ加え、アミノ酸添加ＤＭＥＭ２溶液を得た。
得られたアミノ酸添加ＤＭＥＭ２溶液の少量を採取し、ｐＨ試験紙を使用して溶液のｐＨがｐＨ７．０〜８．０の範囲内であることを確認した。少量を採取して残ったアミノ酸添加ＤＭＥＭ２溶液に、使用前に１０体積％となるようにＦＢＳ（fetal bovine serum；ウシ胎児血清）を加え、細胞の培養に使用する培養液を得た。
培養容器として、親水化処理したポリスチレン製培養容器（浮遊細胞培養用フラスコ ＭＳ−２１８００，住友ベークライト社製；培養面積２２５ｃｍ２；容量８００ｍＬ）を準備した。なお、培養容器は、培養液を注入した際の培養液の高さが４．０〜５．０ｃｍとなる培養面積（底面積）を有するものを選定した。
準備した培養容器に、調製した培養液を表１に示す量、無菌的に注入した。
調製したＴＥＭＰＯ１を純水と混合して０．３質量％水分散液（以下「ＣＮＦ分散液」という場合がある。）を得た。このＣＮＦ分散液を、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌し、滅菌後、室温まで冷却した。
粉末培地（ダルベッコ変法イーグル培地２，日水製薬（株）製）に加水し、３０分程マグネティックスターラーで撹拌してダルベッコ変法イーグル培地２溶液（以下「ＤＭＥＭ２溶液」という場合がある。）を調製した。ＤＭＥＭ２溶液を、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌し、滅菌後、室温まで冷却した。
オートクレーブ滅菌後、室温まで冷却したＤＭＥＭ２溶液に、滅菌したＣＮＦ分散液を、表１記載の濃度になるように無菌条件下で滴下した。滴下後、ＣＮＦ分散液を添加したＤＭＥＭ２溶液を、ホモミキサーを用いて、１００００ｒｐｍで５分間撹拌処理し、ＣＮＦ添加ＤＭＥＭ２溶液を得た。
このＣＮＦ添加ＤＭＥＭ２溶液を室温まで冷却した後に、ろ過滅菌したＬ−グルタミン溶液（Ｌ−グルタミン溶液（×１００），和光純薬工業（株）製；２００ｍｍｏｌ／Ｌ）を終濃度２ｍＭとなるように添加した。さらに、滅菌した１０質量％炭酸水素ナトリウム水溶液を１ｍＬ加え、アミノ酸添加ＤＭＥＭ２溶液を得た。
得られたアミノ酸添加ＤＭＥＭ２溶液の少量を採取し、ｐＨ試験紙を使用して溶液のｐＨがｐＨ７．０〜８．０の範囲内であることを確認した。少量を採取して残ったアミノ酸添加ＤＭＥＭ２溶液に、使用前に１０体積％となるようにＦＢＳ（fetal bovine serum；ウシ胎児血清）を加え、細胞の培養に使用する培養液を得た。
培養容器として、親水化処理したポリスチレン製培養容器（浮遊細胞培養用フラスコ ＭＳ−２１８００，住友ベークライト社製；培養面積２２５ｃｍ２；容量８００ｍＬ）を準備した。なお、培養容器は、培養液を注入した際の培養液の高さが４．０〜５．０ｃｍとなる培養面積（底面積）を有するものを選定した。
準備した培養容器に、調製した培養液を表１に示す量、無菌的に注入した。
また、調製した培養液の粘度を測定した。
（１）昇温時の粘度の測定
調製した培養液を、３．０℃から９８．０℃まで、昇温速度５．０℃／分で昇温しながら、プレート型粘度計（ＭＣＲ３０１，Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ社製）を用いて、プレート径＝４５ｍｍ、ギャップ＝０．０４９ｍｍ、剪断速度＝０．１ｓ−１の測定条件で粘度を測定した。３．０℃から９８．０℃までの範囲で、粘度が３．０℃における粘度の１０倍となることはなかった。
（２）降温時粘度の測定
９８．０℃に昇温した培養液を、降温速度５．０℃／分で降温しながら、３．０℃まで昇温時と同じ測定条件で粘度測定した。９８．０℃から３．０℃までの範囲で、粘度が３．０℃における粘度の１０倍となることはなかった。
（１）昇温時の粘度の測定
調製した培養液を、３．０℃から９８．０℃まで、昇温速度５．０℃／分で昇温しながら、プレート型粘度計（ＭＣＲ３０１，Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ社製）を用いて、プレート径＝４５ｍｍ、ギャップ＝０．０４９ｍｍ、剪断速度＝０．１ｓ−１の測定条件で粘度を測定した。３．０℃から９８．０℃までの範囲で、粘度が３．０℃における粘度の１０倍となることはなかった。
（２）降温時粘度の測定
９８．０℃に昇温した培養液を、降温速度５．０℃／分で降温しながら、３．０℃まで昇温時と同じ測定条件で粘度測定した。９８．０℃から３．０℃までの範囲で、粘度が３．０℃における粘度の１０倍となることはなかった。
《昇温工程》
培養液調製工程の後、昇温工程を行った。
培養容器に注入した培養液を表１の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載の温度で、「加熱処理の時間 分」欄に記載の時間、加熱処理した。
培養液調製工程の後、昇温工程を行った。
培養容器に注入した培養液を表１の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載の温度で、「加熱処理の時間 分」欄に記載の時間、加熱処理した。
《播種工程》
培養液を注入した培養容器に、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ（human mesenchymal stem cells），Ｌｏｎｚａ社製；カタログ番号 ＰＴ−２５０１）（以下「ｈＭＳＣ」という場合がある。）を、表１の「播種工程」の「播種時の細胞濃度［個／ｍＬ］」に記載した細胞濃度となるように、播種した（培養容器内の培養液に種細胞を播種したものを、以下「播種細胞分散液」という場合がある。）。具体的には、ヒト間葉系幹細胞ＰＴ−２５０１を培養液に分散して調製した懸濁液（以下「ＰＴ−２５０１懸濁液」という。）を培養液に注入した。
播種時の培養液の状態および培養液の温度は、表１の「播種工程」の該当欄に示すとおりであった。
培養液を注入した培養容器に、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ（human mesenchymal stem cells），Ｌｏｎｚａ社製；カタログ番号 ＰＴ−２５０１）（以下「ｈＭＳＣ」という場合がある。）を、表１の「播種工程」の「播種時の細胞濃度［個／ｍＬ］」に記載した細胞濃度となるように、播種した（培養容器内の培養液に種細胞を播種したものを、以下「播種細胞分散液」という場合がある。）。具体的には、ヒト間葉系幹細胞ＰＴ−２５０１を培養液に分散して調製した懸濁液（以下「ＰＴ−２５０１懸濁液」という。）を培養液に注入した。
播種時の培養液の状態および培養液の温度は、表１の「播種工程」の該当欄に示すとおりであった。
《培養工程》
昇温工程の後、細胞を播種した培養容器を、表１の「培養工程」の「培養液の平均温度 ℃」の欄に記載した温度に設定したインキュベーター（Ｈｅｒａｃａｌｌ ＶＩＯＳ ＣＯ２インキュベーター，サーモフィッシャー株式会社製）の中に入れ、細胞の培養を開始した（培養工程における、浮遊培養中の細胞および培養液からなる細胞分散液を「浮遊細胞分散液」という。）。
培養条件は、二酸化炭素濃度５．０体積％、および湿度９５％ＲＨとした。
培養開始から１日後、培養容器に接着した細胞を取り除くため、培養容器中の浮遊細胞分散液を新しいアズノール滅菌容器（アズノール滅菌シャーレ ＧＤ９０−１５，アズワン社製）に移し、さらに４日間、培養を継続して、スフェロイドを形成した。
昇温工程の後、細胞を播種した培養容器を、表１の「培養工程」の「培養液の平均温度 ℃」の欄に記載した温度に設定したインキュベーター（Ｈｅｒａｃａｌｌ ＶＩＯＳ ＣＯ２インキュベーター，サーモフィッシャー株式会社製）の中に入れ、細胞の培養を開始した（培養工程における、浮遊培養中の細胞および培養液からなる細胞分散液を「浮遊細胞分散液」という。）。
培養条件は、二酸化炭素濃度５．０体積％、および湿度９５％ＲＨとした。
培養開始から１日後、培養容器に接着した細胞を取り除くため、培養容器中の浮遊細胞分散液を新しいアズノール滅菌容器（アズノール滅菌シャーレ ＧＤ９０−１５，アズワン社製）に移し、さらに４日間、培養を継続して、スフェロイドを形成した。
《回収工程》
培養終了後、表１の「回収工程」の「降温処理の温度 ℃」に記載した温度に５分間曝した後、表１の「回収工程」の「沈降手段」の欄に記載した手段で、培養した細胞を沈降させた。
培養細胞分散液（回収工程における、培養終了した培養容器中の培養された細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）中の総細胞数、細胞増殖率、細胞沈降率、および細胞死亡率を以下に記載する方法にしたがって求めた。
培養終了後、表１の「回収工程」の「降温処理の温度 ℃」に記載した温度に５分間曝した後、表１の「回収工程」の「沈降手段」の欄に記載した手段で、培養した細胞を沈降させた。
培養細胞分散液（回収工程における、培養終了した培養容器中の培養された細胞および培養液からなる細胞分散液をいう。）中の総細胞数、細胞増殖率、細胞沈降率、および細胞死亡率を以下に記載する方法にしたがって求めた。
・細胞総数の算出方法
培養細胞分散液を２ｍＬサンプリングし、トリプシン処理によってスフェロイドを形成している細胞をばらばらにした後、光学顕微鏡を用いて、培養細胞分散液１ｍＬあたりの細胞数を計測し、これに培養細胞分散液量をかけて培養細胞分散液中の細胞総数を算出した。
培養細胞分散液を２ｍＬサンプリングし、トリプシン処理によってスフェロイドを形成している細胞をばらばらにした後、光学顕微鏡を用いて、培養細胞分散液１ｍＬあたりの細胞数を計測し、これに培養細胞分散液量をかけて培養細胞分散液中の細胞総数を算出した。
・細胞増殖率の算出方法
培養細胞分散液中の細胞総数をＮ個、播種した細胞数をＮｆ個として、細胞増殖率を下記式により算出した。
細胞増殖率＝Ｎ／Ｎｆ 倍
細胞増殖率は高いほどよく、特に５．２倍以上であることが望ましい。
培養細胞分散液中の細胞総数をＮ個、播種した細胞数をＮｆ個として、細胞増殖率を下記式により算出した。
細胞増殖率＝Ｎ／Ｎｆ 倍
細胞増殖率は高いほどよく、特に５．２倍以上であることが望ましい。
・細胞沈降率の算出方法
１）降温操作前の全スフェロイド数（Ｎ）の計測：
培養細胞分散液を２ｍＬサンプリングし、これを３７℃に保った直径２０ｍｍのポリスチレン製培養ウェルに注入した。培養ウェルの中央部を、光学顕微鏡を用いて、倍率２００倍で１０視野観察し、各視野についてスフェロイド数を測定した。この平均値をＮ１とした。これを１０個の培養ウェルの培養液に対して繰返し実施し、Ｎ２、Ｎ３、・・・、Ｎ１０を求めた。Ｎ１〜Ｎ１０の平均値から培養細胞分散液１ｍＬあたりのスフェロイド数Ｎ 個／ｍＬ を算出した。なお、直径５０μｍ以上の細胞塊をスフェロイドとして扱った。
２）降温操作後の浮遊（非沈降性）スフェロイド数（ｎ）の計測：
上記培養ウェルに降温処理を行った後、ウェル中の培養液の上澄みを静かに採取した。採取した上澄みを、同様に顕微鏡を用いて倍率２００倍で１０視野観察し、各視野について浮遊しているスフェロイド数を測定した。この平均値をｎ１とした。これを１０個の培養ウェルの培養液に対して繰り返し測定し、ｎ２、ｎ３、・・・、ｎ１０を求めた。ｎ１〜ｎ１０の平均値から上澄み１ｍＬあたりの浮遊スフェロイド数ｎ 個／ｍＬ を算出した。なお、直径５０μｍ以上の細胞塊をスフェロイドとして扱った。
３）細胞沈降率の算出：
下記式により細胞沈降率（％）を算出した。
細胞沈降率（％）＝｛（Ｎ−ｎ）／Ｎ｝×１００ （％）
細胞沈降率は高いほどよく、特に７５．０％以上であることが望ましい。
１）降温操作前の全スフェロイド数（Ｎ）の計測：
培養細胞分散液を２ｍＬサンプリングし、これを３７℃に保った直径２０ｍｍのポリスチレン製培養ウェルに注入した。培養ウェルの中央部を、光学顕微鏡を用いて、倍率２００倍で１０視野観察し、各視野についてスフェロイド数を測定した。この平均値をＮ１とした。これを１０個の培養ウェルの培養液に対して繰返し実施し、Ｎ２、Ｎ３、・・・、Ｎ１０を求めた。Ｎ１〜Ｎ１０の平均値から培養細胞分散液１ｍＬあたりのスフェロイド数Ｎ 個／ｍＬ を算出した。なお、直径５０μｍ以上の細胞塊をスフェロイドとして扱った。
２）降温操作後の浮遊（非沈降性）スフェロイド数（ｎ）の計測：
上記培養ウェルに降温処理を行った後、ウェル中の培養液の上澄みを静かに採取した。採取した上澄みを、同様に顕微鏡を用いて倍率２００倍で１０視野観察し、各視野について浮遊しているスフェロイド数を測定した。この平均値をｎ１とした。これを１０個の培養ウェルの培養液に対して繰り返し測定し、ｎ２、ｎ３、・・・、ｎ１０を求めた。ｎ１〜ｎ１０の平均値から上澄み１ｍＬあたりの浮遊スフェロイド数ｎ 個／ｍＬ を算出した。なお、直径５０μｍ以上の細胞塊をスフェロイドとして扱った。
３）細胞沈降率の算出：
下記式により細胞沈降率（％）を算出した。
細胞沈降率（％）＝｛（Ｎ−ｎ）／Ｎ｝×１００ （％）
細胞沈降率は高いほどよく、特に７５．０％以上であることが望ましい。
・細胞死亡率の算出方法
降温操作前の細胞について、特表２０１３−５４１９５６号公報（［００８２］）に記載の方法にしたがって、生細胞と死細胞とを染め分け、降温操作前の細胞生存率Ｘａ（％）を算出した。
次に、降温操作後の細胞について、同様にして、降温操作後の細胞生存率Ｘｂ（％）を算出した。
降温操作による細胞死亡率を下記式により算出した。
細胞死亡率（％）＝Ｘａ（％）−Ｘｂ（％）
細胞死亡率は低いほどよく、特に１１．０％以下であることが望ましい。
降温操作前の細胞について、特表２０１３−５４１９５６号公報（［００８２］）に記載の方法にしたがって、生細胞と死細胞とを染め分け、降温操作前の細胞生存率Ｘａ（％）を算出した。
次に、降温操作後の細胞について、同様にして、降温操作後の細胞生存率Ｘｂ（％）を算出した。
降温操作による細胞死亡率を下記式により算出した。
細胞死亡率（％）＝Ｘａ（％）−Ｘｂ（％）
細胞死亡率は低いほどよく、特に１１．０％以下であることが望ましい。
さらに、細胞増殖率（ａ）、細胞沈降率（ｂ）、および細胞死亡率（ｃ）から、以下の式によりスコアを算出し、総合評価とした。
スコア＝ａ×｛（１００−ｃ）／１００｝×（ｂ／１００）
スコアは大きいほどよく、特に４．４以上であることが望ましい。
スコア＝ａ×｛（１００−ｃ）／１００｝×（ｂ／１００）
スコアは大きいほどよく、特に４．４以上であることが望ましい。
その結果、表１に示すとおり、細胞増殖率８．２倍であり、細胞沈降率３５．０％であり、細胞死亡率４．０％であり、スコア２．８であった。
〈実施例１〉
《培養液調製工程》
ＣＮＦ添加ＤＭＥＭ２溶液を室温まで冷却した後に、メチルセルロース（メチルセルロース４００，和光純薬工業株式会社製）を表１記載の濃度になるように無菌的に添加し、次いで、ろ過滅菌したＬ−グルタミン溶液（Ｌ−グルタミン溶液（×１００），和光純薬工業（株）製；２００ｍｍｏｌ／Ｌ）を終濃度２ｍＭとなるように添加した点、およびメチルセルロース添加からの一連の操作およびその後の操作を、約３７℃に保って行った点を除いて、比較例１と同様にして行った。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、以下の測定方法によって測定した。
《培養液調製工程》
ＣＮＦ添加ＤＭＥＭ２溶液を室温まで冷却した後に、メチルセルロース（メチルセルロース４００，和光純薬工業株式会社製）を表１記載の濃度になるように無菌的に添加し、次いで、ろ過滅菌したＬ−グルタミン溶液（Ｌ−グルタミン溶液（×１００），和光純薬工業（株）製；２００ｍｍｏｌ／Ｌ）を終濃度２ｍＭとなるように添加した点、およびメチルセルロース添加からの一連の操作およびその後の操作を、約３７℃に保って行った点を除いて、比較例１と同様にして行った。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、以下の測定方法によって測定した。
・培養液の相転移温度の測定方法
（１）昇温時相転移温度（Ｔｃ）の測定
調製した培養液を、３．０℃から９８．０℃まで、昇温速度５．０℃／分で昇温しながら、プレート型粘度計（ＭＣＲ３０１，Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ社製）を用いて、プレート径＝４５ｍｍ、ギャップ＝０．０４９ｍｍ、剪断速度＝０．１ｓ−１の測定条件で粘度を測定し、粘度が３．０℃における粘度の１０倍になった時の温度を「昇温時相転移温度（Ｔｃ）」とした。
（２）降温時相転移温度（Ｔｃｓ）の測定
９８．０℃に昇温した培養液を、降温速度５．０℃／分で降温しながら、３．０℃まで昇温時と同じ測定条件で粘度測定し、粘度が昇温時の３．０℃における粘度の１０倍になった時の温度を「降温時相転移温度（Ｔｃｓ）」とした。
（１）昇温時相転移温度（Ｔｃ）の測定
調製した培養液を、３．０℃から９８．０℃まで、昇温速度５．０℃／分で昇温しながら、プレート型粘度計（ＭＣＲ３０１，Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ社製）を用いて、プレート径＝４５ｍｍ、ギャップ＝０．０４９ｍｍ、剪断速度＝０．１ｓ−１の測定条件で粘度を測定し、粘度が３．０℃における粘度の１０倍になった時の温度を「昇温時相転移温度（Ｔｃ）」とした。
（２）降温時相転移温度（Ｔｃｓ）の測定
９８．０℃に昇温した培養液を、降温速度５．０℃／分で降温しながら、３．０℃まで昇温時と同じ測定条件で粘度測定し、粘度が昇温時の３．０℃における粘度の１０倍になった時の温度を「降温時相転移温度（Ｔｃｓ）」とした。
《昇温工程》
培養液調製工程の後、昇温工程を行った。
培養容器に注入した培養液を表１の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載の温度で、「加熱処理の時間 分」欄に記載の時間、加熱処理した。
培養液調製工程の後、昇温工程を行った。
培養容器に注入した培養液を表１の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載の温度で、「加熱処理の時間 分」欄に記載の時間、加熱処理した。
《播種工程》
昇温工程の後、実施例１と同様にして、播種工程を行った。
昇温工程の後、実施例１と同様にして、播種工程を行った。
《培養工程》
播種工程の後、実施例１と同様にして、培養工程を行った。
播種工程の後、実施例１と同様にして、培養工程を行った。
《回収工程》
培養工程の後、降温処理の温度を表１の「回収工程」の「降温処理の温度 ℃」の欄に記載した温度とした点を除いて、実施例１と同様にして、回収工程を行った。
培養工程の後、降温処理の温度を表１の「回収工程」の「降温処理の温度 ℃」の欄に記載した温度とした点を除いて、実施例１と同様にして、回収工程を行った。
その結果、表１に示すとおり、細胞増殖率８．９倍であり、細胞沈降率８７．０％であり、細胞死亡率１１．０％であり、スコア６．９であった。
〈実施例２〉
《培養液調製工程》
熱ゾルゲル変化剤としてメチルセルロース（ＭＣ）を表１に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表１に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１と同様にして測定した。
《培養液調製工程》
熱ゾルゲル変化剤としてメチルセルロース（ＭＣ）を表１に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表１に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１と同様にして測定した。
《昇温工程》
培養液調製工程の後、温度および時間を、表１の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載した温度、とした点を除いて、実施例１と同様にして、培養容器に注入した培養液を、加熱処理した。
培養液調製工程の後、温度および時間を、表１の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載した温度、とした点を除いて、実施例１と同様にして、培養容器に注入した培養液を、加熱処理した。
《播種工程》
昇温工程の後、実施例１と同様にして、播種工程を行った。
昇温工程の後、実施例１と同様にして、播種工程を行った。
《培養工程》
播種工程の後、実施例１と同様にして、培養工程を行った。
播種工程の後、実施例１と同様にして、培養工程を行った。
《回収工程》
培養工程の後、降温処理の温度を表１の「回収工程」の「降温処理の温度 ℃」の欄に記載した温度とした点を除いて、実施例１と同様にして、回収工程を行った。
培養工程の後、降温処理の温度を表１の「回収工程」の「降温処理の温度 ℃」の欄に記載した温度とした点を除いて、実施例１と同様にして、回収工程を行った。
その結果、表１に示すとおり、細胞増殖率９．４倍であり、細胞沈降率９１．０％であり、細胞死亡率５．０％であり、スコア８．１であった。
〈実施例３〉
《培養液調製工程》
熱ゾルゲル変化剤としてメチルセルロース（ＭＣ）を表１に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表１に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１と同様にして測定した。
《培養液調製工程》
熱ゾルゲル変化剤としてメチルセルロース（ＭＣ）を表１に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表１に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１と同様にして測定した。
《昇温工程》
培養液調製工程の後、温度および時間を、表１の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載した温度、とした点を除いて、実施例１と同様にして、培養容器に注入した培養液を、加熱処理した。
培養液調製工程の後、温度および時間を、表１の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載した温度、とした点を除いて、実施例１と同様にして、培養容器に注入した培養液を、加熱処理した。
《播種工程》
昇温工程の後、実施例１と同様にして、播種工程を行った。
昇温工程の後、実施例１と同様にして、播種工程を行った。
《培養工程》
播種工程の後、実施例１と同様にして、培養工程を行った。
播種工程の後、実施例１と同様にして、培養工程を行った。
《回収工程》
培養工程の後、降温処理の温度を表１の「回収工程」の「降温処理の温度 ℃」の欄に記載した温度とした点を除いて、実施例１と同様にして、回収工程を行った。
培養工程の後、降温処理の温度を表１の「回収工程」の「降温処理の温度 ℃」の欄に記載した温度とした点を除いて、実施例１と同様にして、回収工程を行った。
その結果、表１に示すとおり、細胞増殖率９．６倍であり、細胞沈降率９５．０％であり、細胞死亡率４．０％であり、スコア８．８であった。
〈実施例４〉
《培養液調製工程》
熱ゾルゲル変化剤としてメチルセルロース（ＭＣ）を表１に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表１に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１と同様にして測定した。
《培養液調製工程》
熱ゾルゲル変化剤としてメチルセルロース（ＭＣ）を表１に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表１に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１と同様にして測定した。
《昇温工程》
培養液調製工程の後、温度および時間を、表１の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載した温度、とした点を除いて、実施例１と同様にして、培養容器に注入した培養液を、加熱処理した。
培養液調製工程の後、温度および時間を、表１の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載した温度、とした点を除いて、実施例１と同様にして、培養容器に注入した培養液を、加熱処理した。
《播種工程》
昇温工程の後、実施例１と同様にして、播種工程を行った。
昇温工程の後、実施例１と同様にして、播種工程を行った。
《培養工程》
播種工程の後、実施例１と同様にして、培養工程を行った。
播種工程の後、実施例１と同様にして、培養工程を行った。
《回収工程》
培養工程の後、降温処理の温度を表１の「回収工程」の「降温処理の温度 ℃」の欄に記載した温度とした点を除いて、実施例１と同様にして、回収工程を行った。
培養工程の後、降温処理の温度を表１の「回収工程」の「降温処理の温度 ℃」の欄に記載した温度とした点を除いて、実施例１と同様にして、回収工程を行った。
その結果、表１に示すとおり、細胞増殖率９．３倍であり、細胞沈降率９０．０％であり、細胞死亡率３．０％であり、スコア８．１であった。
〈実施例５〉
《培養液調製工程》
熱ゾルゲル変化剤としてメチルセルロース（ＭＣ）を表１に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表１に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１と同様にして測定した。
《培養液調製工程》
熱ゾルゲル変化剤としてメチルセルロース（ＭＣ）を表１に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表１に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１と同様にして測定した。
《昇温工程》
培養液調製工程の後、温度および時間を、表１の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載した温度、とした点を除いて、実施例１と同様にして、培養容器に注入した培養液を、加熱処理した。
培養液調製工程の後、温度および時間を、表１の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載した温度、とした点を除いて、実施例１と同様にして、培養容器に注入した培養液を、加熱処理した。
《播種工程》
昇温工程の後、実施例１と同様にして、播種工程を行った。
昇温工程の後、実施例１と同様にして、播種工程を行った。
《培養工程》
播種工程の後、実施例１と同様にして、培養工程を行った。
播種工程の後、実施例１と同様にして、培養工程を行った。
《回収工程》
培養工程の後、降温処理の温度を表１の「回収工程」の「降温処理の温度 ℃」の欄に記載した温度とした点を除いて、実施例１と同様にして、回収工程を行った。
培養工程の後、降温処理の温度を表１の「回収工程」の「降温処理の温度 ℃」の欄に記載した温度とした点を除いて、実施例１と同様にして、回収工程を行った。
その結果、表１に示すとおり、細胞増殖率８．５倍であり、細胞沈降率８３．０％であり、細胞死亡率８．０％であり、スコア６．５であった。
〈実施例６〉
《培養液調製工程》
熱ゾルゲル変化剤としてメチルセルロース（ＭＣ）を表１に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表１に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１と同様にして測定した。
《培養液調製工程》
熱ゾルゲル変化剤としてメチルセルロース（ＭＣ）を表１に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表１に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１と同様にして測定した。
《昇温工程》
培養液調製工程の後、温度および時間を、表１の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載した温度、とした点を除いて、実施例１と同様にして、培養容器に注入した培養液を、加熱処理した。
培養液調製工程の後、温度および時間を、表１の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載した温度、とした点を除いて、実施例１と同様にして、培養容器に注入した培養液を、加熱処理した。
《播種工程》
昇温工程の後、実施例１と同様にして、播種工程を行った。
昇温工程の後、実施例１と同様にして、播種工程を行った。
《培養工程》
播種工程の後、実施例１と同様にして、培養工程を行った。
播種工程の後、実施例１と同様にして、培養工程を行った。
《回収工程》
培養工程の後、降温処理の温度を表１の「回収工程」の「降温処理の温度 ℃」の欄に記載した温度とした点を除いて、実施例１と同様にして、回収工程を行った。
培養工程の後、降温処理の温度を表１の「回収工程」の「降温処理の温度 ℃」の欄に記載した温度とした点を除いて、実施例１と同様にして、回収工程を行った。
その結果、表１に示すとおり、細胞増殖率７．５倍であり、細胞沈降率８０．０％であり、細胞死亡率８．０％であり、スコア５．５であった。
〈実施例１〜実施例６、および比較例１の結果の説明〉
実施例１〜実施例６は、熱ゾルゲル変化剤（ＭＣ）を添加した例である。
ＭＣを含まない比較例１は、ゾル化温度Ｔｃｓおよびゲル化温度Ｔｃが無く、培養液を降温しただけでは細胞はほとんど沈降せず、細胞沈降率が低い（３５．０％）。
培養液のＴｃはＣＮＦ含有量に依存し、ＴｃｓはＭＣ含有量に依存するが、実施例１〜６では、ＣＮＦ含有量は同一であり、ＭＣ含有量のみが異なる。
したがって、ＭＣ含有量が多くなるほど、Ｔｃｓも上昇し、ΔＴｃ＝Ｔｃ−Ｔｃｓが減少する。ＭＣ含有量が少なくなるほど、Ｔｃｓは下降し、ΔＴｃは増加する。ΔＴｃが大きい方が細胞増殖率が向上しやすいことがわかる。
実施例１は細胞死亡率が１１．０％と高いが、これは、回収工程において、降温処理の温度が低かったためであると考えられる。
また、実施例６の細胞増殖率が７．５倍と低いが、これは、培養工程において、ゲル化温度Ｔｃとゾル化温度Ｔｃｓとが近く、培養液のゲル化状態が不安定であったためであると考えられる。
実施例１〜実施例６は、熱ゾルゲル変化剤（ＭＣ）を添加した例である。
ＭＣを含まない比較例１は、ゾル化温度Ｔｃｓおよびゲル化温度Ｔｃが無く、培養液を降温しただけでは細胞はほとんど沈降せず、細胞沈降率が低い（３５．０％）。
培養液のＴｃはＣＮＦ含有量に依存し、ＴｃｓはＭＣ含有量に依存するが、実施例１〜６では、ＣＮＦ含有量は同一であり、ＭＣ含有量のみが異なる。
したがって、ＭＣ含有量が多くなるほど、Ｔｃｓも上昇し、ΔＴｃ＝Ｔｃ−Ｔｃｓが減少する。ＭＣ含有量が少なくなるほど、Ｔｃｓは下降し、ΔＴｃは増加する。ΔＴｃが大きい方が細胞増殖率が向上しやすいことがわかる。
実施例１は細胞死亡率が１１．０％と高いが、これは、回収工程において、降温処理の温度が低かったためであると考えられる。
また、実施例６の細胞増殖率が７．５倍と低いが、これは、培養工程において、ゲル化温度Ｔｃとゾル化温度Ｔｃｓとが近く、培養液のゲル化状態が不安定であったためであると考えられる。
［実施例７〜実施例９］
実施例７〜実施例９は、加熱処理の温度の効果を示す例である。
実施例７〜実施例９は、加熱処理の温度の効果を示す例である。
〈実施例７〉
《培養液調製工程》
（セルロースナノファイバーの調製）
国際公開第２０１５／１０７９９５号（［００５６］）に記載された方法にしたがって、アルカリ触媒存在下で、カルボキシメチル化（以下「ＣＭ化」という場合がある。）剤であるモノクロロ酢酸を用いてＣＭ化処理されたセルロース系原料を、高圧ホモジナイザーを用いて湿式微粒化処理して解繊することにより、ＣＭ化セルロースナノファイバー（以下「ＣＭ１」という場合がある。）を調製した。調製したＣＭ１の平均直径およびカルボキシ基導入量を、比較例１と同様にして測定したところ、表２に示すとおりであった。
《培養液調製工程》
（セルロースナノファイバーの調製）
国際公開第２０１５／１０７９９５号（［００５６］）に記載された方法にしたがって、アルカリ触媒存在下で、カルボキシメチル化（以下「ＣＭ化」という場合がある。）剤であるモノクロロ酢酸を用いてＣＭ化処理されたセルロース系原料を、高圧ホモジナイザーを用いて湿式微粒化処理して解繊することにより、ＣＭ化セルロースナノファイバー（以下「ＣＭ１」という場合がある。）を調製した。調製したＣＭ１の平均直径およびカルボキシ基導入量を、比較例１と同様にして測定したところ、表２に示すとおりであった。
（培養液の調製）
ＴＥＭＰＯ１に代えて、調製したＣＭ１を表２に示す添加量で使用した点、および熱ゾルゲル変化剤としてメチルセルロース（ＭＣ）を表２に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表２に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１と同様にして測定した。
ＴＥＭＰＯ１に代えて、調製したＣＭ１を表２に示す添加量で使用した点、および熱ゾルゲル変化剤としてメチルセルロース（ＭＣ）を表２に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表２に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１と同様にして測定した。
《昇温工程》
培養液調製工程の後、昇温工程を行った。
培養容器に注入した培養液を表２の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載の温度で、「加熱処理の時間 分」欄に記載の時間、加熱処理した。
培養液調製工程の後、昇温工程を行った。
培養容器に注入した培養液を表２の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載の温度で、「加熱処理の時間 分」欄に記載の時間、加熱処理した。
《播種工程》
ヒト間葉系幹細胞ＰＴ−２５０１（ｈＭＳＣ）に代えて、ヒトｉＰＳ細胞ＩＭＲ９０−１（WiCell Research Institute, Inc., Madison, WI, USA）（以下「ＩＭＲ９０−１」という場合がある。）を使用した点、播種時の細胞濃度を表２に示す細胞濃度とした点、および播種時の培養液の温度を表２に示す温度とした点を除いて、実施例１と同様にして細胞を播種した。
播種時の培養液の状態および培養液の温度は、表２の「播種工程」の該当欄に示すとおりであった。
ヒト間葉系幹細胞ＰＴ−２５０１（ｈＭＳＣ）に代えて、ヒトｉＰＳ細胞ＩＭＲ９０−１（WiCell Research Institute, Inc., Madison, WI, USA）（以下「ＩＭＲ９０−１」という場合がある。）を使用した点、播種時の細胞濃度を表２に示す細胞濃度とした点、および播種時の培養液の温度を表２に示す温度とした点を除いて、実施例１と同様にして細胞を播種した。
播種時の培養液の状態および培養液の温度は、表２の「播種工程」の該当欄に示すとおりであった。
《培養工程》
播種工程の後、表２の「培養液の平均温度 ℃」の欄に記載した温度に設定したインキュベーターを使用した点を除いて、実施例１と同様にして、培養工程を行った。
播種工程の後、表２の「培養液の平均温度 ℃」の欄に記載した温度に設定したインキュベーターを使用した点を除いて、実施例１と同様にして、培養工程を行った。
《回収工程》
培養工程の後、降温処理の温度を表２の「回収工程」の「降温処理の温度 ℃」の欄に記載した温度とした点を除いて、実施例１と同様にして、回収工程を行った。
培養工程の後、降温処理の温度を表２の「回収工程」の「降温処理の温度 ℃」の欄に記載した温度とした点を除いて、実施例１と同様にして、回収工程を行った。
その結果、表２に示すとおり、細胞増殖率８．２倍であり、細胞沈降率９３．０％であり、細胞死亡率４．０％であり、スコア７．３であった。
〈実施例８〉
《培養液調製工程〉
実施例７と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表２に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１と同様にして測定した。
《培養液調製工程〉
実施例７と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表２に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１と同様にして測定した。
《昇温工程》
培養液調製工程の後、昇温工程を行った。
培養容器中の培養液を表２の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載の温度で、「加熱処理の時間 分」欄に記載の時間、加熱処理した。
培養液調製工程の後、昇温工程を行った。
培養容器中の培養液を表２の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載の温度で、「加熱処理の時間 分」欄に記載の時間、加熱処理した。
《播種工程》
昇温工程の後、実施例７と同様にして、播種工程を行った。
昇温工程の後、実施例７と同様にして、播種工程を行った。
《培養工程》
播種工程の後、実施例７と同様にして、培養工程を行った。
播種工程の後、実施例７と同様にして、培養工程を行った。
《回収工程》
培養工程の後、実施例７と同様にして、回収工程を行った。
培養工程の後、実施例７と同様にして、回収工程を行った。
その結果、表２に示すとおり、細胞増殖率９．８倍であり、細胞沈降率９７．０％であり、細胞死亡率３．０％であり、スコア９．２であった。
〈実施例９〉
《培養液調製工程〉
実施例７と同様にして、培養液を調製した。
調製した培養液を表２に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１と同様にして測定した。
《培養液調製工程〉
実施例７と同様にして、培養液を調製した。
調製した培養液を表２に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１と同様にして測定した。
《昇温工程》
培養液調製工程の後、温度を、表２の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載した温度とした点を除いて、実施例７と同様にして、培養容器に注入した培養液を、加熱処理した。
培養液調製工程の後、温度を、表２の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載した温度とした点を除いて、実施例７と同様にして、培養容器に注入した培養液を、加熱処理した。
《播種工程》
昇温工程の後、実施例７と同様にして、播種工程を行った。
昇温工程の後、実施例７と同様にして、播種工程を行った。
《培養工程》
播種工程の後、実施例７と同様にして、培養工程を行った。
播種工程の後、実施例７と同様にして、培養工程を行った。
《回収工程》
培養工程の後、実施例７と同様にして、回収工程を行った。
培養工程の後、実施例７と同様にして、回収工程を行った。
その結果、表２に示すとおり、細胞増殖率８．３倍であり、細胞沈降率７５．０％であり、細胞死亡率４．０％であり、スコア６．０であった。
〈実施例７〜実施例９の結果の説明〉
実施例９は、細胞増殖率が８．３倍であり、細胞沈降率が７５．０％であり、実施例８の細胞増殖率および細胞沈降率に比べて低かった。
これは、昇温工程における加熱処理の温度が高く、培養工程および回収工程でゲル強度が高かったためであると考えらえる。
また、実施例７は、細胞増殖率が８．２倍であり、実施例８の細胞増殖率に比べて低かった。
これは、昇温工程における加熱処理の温度が低く、ゲル強度が低かったため、培養工程において浮力が低下したためであると考えられる。
実施例９は、細胞増殖率が８．３倍であり、細胞沈降率が７５．０％であり、実施例８の細胞増殖率および細胞沈降率に比べて低かった。
これは、昇温工程における加熱処理の温度が高く、培養工程および回収工程でゲル強度が高かったためであると考えらえる。
また、実施例７は、細胞増殖率が８．２倍であり、実施例８の細胞増殖率に比べて低かった。
これは、昇温工程における加熱処理の温度が低く、ゲル強度が低かったため、培養工程において浮力が低下したためであると考えられる。
［実施例１０〜実施例１２］
実施例１０〜１２は、降温処理の温度の効果を示す例である。
実施例１０〜１２は、降温処理の温度の効果を示す例である。
〈実施例１０〉
《培養液調製工程》
（セルロースナノファイバーの調製）
表２に示す平均直径およびカルボキシ基含有量となるように酸化剤の使用量および超高圧ホモジナイザーの圧力を調整した点を除いて、比較例１と同様にしてＴＥＭＰＯ化セルロースナノファイバー（以下「ＴＥＭＰＯ２」という場合がある。）を調製した。調製したＴＥＭＰＯ２の平均直径およびカルボキシ基導入量を、比較例１と同様にして測定したところ、表２に示すとおりであった。
《培養液調製工程》
（セルロースナノファイバーの調製）
表２に示す平均直径およびカルボキシ基含有量となるように酸化剤の使用量および超高圧ホモジナイザーの圧力を調整した点を除いて、比較例１と同様にしてＴＥＭＰＯ化セルロースナノファイバー（以下「ＴＥＭＰＯ２」という場合がある。）を調製した。調製したＴＥＭＰＯ２の平均直径およびカルボキシ基導入量を、比較例１と同様にして測定したところ、表２に示すとおりであった。
（培養液の調製）
ＴＥＭＰＯ１に代えて、調製したＴＥＭＰＯ２を表２に示す添加量で使用した点、および熱ゾルゲル変化剤としてカードラン（カードラン（生化学用），和光純薬工業株式会社製）（以下「ＣＵ」（curdlan）という場合がある。）を表２に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表２に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１と同様にして測定した。
ＴＥＭＰＯ１に代えて、調製したＴＥＭＰＯ２を表２に示す添加量で使用した点、および熱ゾルゲル変化剤としてカードラン（カードラン（生化学用），和光純薬工業株式会社製）（以下「ＣＵ」（curdlan）という場合がある。）を表２に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表２に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１と同様にして測定した。
《昇温工程》
培養液調製工程の後、昇温工程を行った。
培養容器に注入した培養液を表２の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載の温度で、「加熱処理の時間 分」欄に記載の時間、加熱処理した。
培養液調製工程の後、昇温工程を行った。
培養容器に注入した培養液を表２の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載の温度で、「加熱処理の時間 分」欄に記載の時間、加熱処理した。
《播種工程》
ヒト間葉系幹細胞ＰＴ−２５０１（ｈＭＳＣ）に代えて、ヒトＥＳ細胞ＫｈＥＳ−１（京都大学再生医療科学研究所附属幹細胞医学研究センター）（以下「ＫｈＥＳ−１」という場合がある。）を使用した点、播種時の細胞濃度を表２に示す細胞濃度とした点、および播種時の培養液の温度を表２に示す温度とした点を除いて、実施例１と同様にして細胞を播種した。
播種時の培養液の状態および培養液の温度は、表２の「播種工程」の該当欄に示すとおりであった。
ヒト間葉系幹細胞ＰＴ−２５０１（ｈＭＳＣ）に代えて、ヒトＥＳ細胞ＫｈＥＳ−１（京都大学再生医療科学研究所附属幹細胞医学研究センター）（以下「ＫｈＥＳ−１」という場合がある。）を使用した点、播種時の細胞濃度を表２に示す細胞濃度とした点、および播種時の培養液の温度を表２に示す温度とした点を除いて、実施例１と同様にして細胞を播種した。
播種時の培養液の状態および培養液の温度は、表２の「播種工程」の該当欄に示すとおりであった。
《培養工程》
播種工程の後、表２の「培養液の平均温度 ℃」の欄に記載した温度に設定したインキュベーターを使用した点を除いて、実施例１と同様にして、培養工程を行った。
播種工程の後、表２の「培養液の平均温度 ℃」の欄に記載した温度に設定したインキュベーターを使用した点を除いて、実施例１と同様にして、培養工程を行った。
《回収工程》
培養工程の後、降温処理の温度を表２の「回収工程」の「降温処理の温度 ℃」の欄に記載した温度とした点を除いて、実施例１と同様にして、回収工程を行った。
培養工程の後、降温処理の温度を表２の「回収工程」の「降温処理の温度 ℃」の欄に記載した温度とした点を除いて、実施例１と同様にして、回収工程を行った。
その結果、表２に示すとおり、細胞増殖率９．６倍であり、細胞沈降率８５．０％であり、細胞死亡率５．０％であり、スコア７．８であった。
〈実施例１１〉
《培養液調製工程〉
実施例１０と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表２に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１と同様にして測定した。
《培養液調製工程〉
実施例１０と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表２に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１と同様にして測定した。
《昇温工程》
培養液調製工程の後、実施例１０と同様にして、培養容器に注入した培養液を、加熱処理した。
培養液調製工程の後、実施例１０と同様にして、培養容器に注入した培養液を、加熱処理した。
《播種工程》
昇温工程の後、実施例１０と同様にして、播種工程を行った。
昇温工程の後、実施例１０と同様にして、播種工程を行った。
《培養工程》
播種工程の後、実施例１０と同様にして、培養工程を行った。
播種工程の後、実施例１０と同様にして、培養工程を行った。
《回収工程》
培養工程の後、実施例１０と同様にして、回収工程を行った。
培養工程の後、実施例１０と同様にして、回収工程を行った。
その結果、表２に示すとおり、細胞増殖率９．６倍であり、細胞沈降率９８．０％であり、細胞死亡率４．０％であり、スコア９．０であった。
〈実施例１２〉
《培養液調製工程〉
実施例１０と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表２に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１と同様にして測定した。
《培養液調製工程〉
実施例１０と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表２に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１と同様にして測定した。
《昇温工程》
培養液調製工程の後、実施例１０と同様にして、培養容器に注入した培養液を、加熱処理した。
培養液調製工程の後、実施例１０と同様にして、培養容器に注入した培養液を、加熱処理した。
《播種工程》
昇温工程の後、実施例１０と同様にして、播種工程を行った。
昇温工程の後、実施例１０と同様にして、播種工程を行った。
《培養工程》
播種工程の後、実施例１０と同様にして、培養工程を行った。
播種工程の後、実施例１０と同様にして、培養工程を行った。
《回収工程》
培養工程の後、実施例１０と同様にして、回収工程を行った。
培養工程の後、実施例１０と同様にして、回収工程を行った。
その結果、表２に示すとおり、細胞増殖率９．６倍であり、細胞沈降率９１．０％であり、細胞死亡率１２．０％であり、スコア７．７であった。
〈実施例１０〜実施例１２の結果の説明〉
実施例１０は実施例１１と比べて細胞沈降率が低かった。これは、降温処理の温度がゾル化温度に近く、ゾルゲル変換が不安定になったためであると考えられる。
実施例１２は実施例１２と比べて細胞死亡率が高かった。これは、降温処理の温度が低く、細胞に温度ストレスを与えたためであると考えられる。
実施例１０は実施例１１と比べて細胞沈降率が低かった。これは、降温処理の温度がゾル化温度に近く、ゾルゲル変換が不安定になったためであると考えられる。
実施例１２は実施例１２と比べて細胞死亡率が高かった。これは、降温処理の温度が低く、細胞に温度ストレスを与えたためであると考えられる。
［実施例１３〜実施例１９］
実施例１３〜実施例１９はセルロースナノファイバーの含有量の効果を示す例である。
実施例１３〜実施例１９はセルロースナノファイバーの含有量の効果を示す例である。
〈実施例１３〉
《培養液調製工程》
セルロースナノファイバーを添加しなかった点、および熱ゾルゲル変化剤としてメチルセルロース（ＭＣ）を表３に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表３に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１と同様にして測定した。
《培養液調製工程》
セルロースナノファイバーを添加しなかった点、および熱ゾルゲル変化剤としてメチルセルロース（ＭＣ）を表３に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表３に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１と同様にして測定した。
《昇温工程》
培養液調製工程の後、昇温工程を行った。
培養容器に注入した培養液を表３の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載の温度で、「加熱処理の時間 分」欄に記載の時間、加熱処理した。
培養液調製工程の後、昇温工程を行った。
培養容器に注入した培養液を表３の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載の温度で、「加熱処理の時間 分」欄に記載の時間、加熱処理した。
《播種工程》
ヒト間葉系幹細胞ＰＴ−２５０１（ｈＭＳＣ）に代えて、ヒト胚性幹細胞Ｈ９（WiCell Research Institute, Inc., Madison, WI, USA）を使用した点、播種時の細胞濃度を表３に示す細胞濃度とした点、および播種時の培養液の温度を表３に示す温度とした点を除いて、実施例１と同様にして細胞を播種した。
播種時の培養液の状態および培養液の温度は、表３の「播種工程」の該当欄に示すとおりであった。
ヒト間葉系幹細胞ＰＴ−２５０１（ｈＭＳＣ）に代えて、ヒト胚性幹細胞Ｈ９（WiCell Research Institute, Inc., Madison, WI, USA）を使用した点、播種時の細胞濃度を表３に示す細胞濃度とした点、および播種時の培養液の温度を表３に示す温度とした点を除いて、実施例１と同様にして細胞を播種した。
播種時の培養液の状態および培養液の温度は、表３の「播種工程」の該当欄に示すとおりであった。
《培養工程》
播種工程の後、表３の「培養液の平均温度 ℃」の欄に記載した温度に設定したインキュベーターを使用した点を除いて、実施例１と同様にして、培養工程を行った。
播種工程の後、表３の「培養液の平均温度 ℃」の欄に記載した温度に設定したインキュベーターを使用した点を除いて、実施例１と同様にして、培養工程を行った。
《回収工程》
培養工程の後、降温処理の温度を表３の「回収工程」の「降温処理の温度 ℃」の欄に記載した温度とした点を除いて、実施例１と同様にして、回収工程を行った。
培養工程の後、降温処理の温度を表３の「回収工程」の「降温処理の温度 ℃」の欄に記載した温度とした点を除いて、実施例１と同様にして、回収工程を行った。
その結果、表３に示すとおり、細胞増殖率６．２倍であり、細胞沈降率８２．０％であり、細胞死亡率５．０％であり、スコア４．８であった。
〈実施例１４〉
《培養液調製工程》
（セルロースナノファイバーの調製）
比較例１と同様にしてＴＥＭＰＯ化セルロースナノファイバー（ＴＥＭＰＯ１）を調製した。調製したＴＥＭＰＯ１の平均直径およびカルボキシ基導入量を、比較例１と同様にして測定したところ、表２に示すとおりであった。
《培養液調製工程》
（セルロースナノファイバーの調製）
比較例１と同様にしてＴＥＭＰＯ化セルロースナノファイバー（ＴＥＭＰＯ１）を調製した。調製したＴＥＭＰＯ１の平均直径およびカルボキシ基導入量を、比較例１と同様にして測定したところ、表２に示すとおりであった。
（培養液の調製）
調製したＴＥＭＰＯ１を表３に示す添加量で使用した点、および熱ゾルゲル変化剤としてメチルセルロース（ＭＣ）を表３に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１と同様にして、培養液を調製した。
調製した培養液を表３に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１３と同様にして測定した。
調製したＴＥＭＰＯ１を表３に示す添加量で使用した点、および熱ゾルゲル変化剤としてメチルセルロース（ＭＣ）を表３に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１と同様にして、培養液を調製した。
調製した培養液を表３に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１３と同様にして測定した。
《昇温工程》
培養液調製工程の後、昇温工程を行った。
培養容器に注入した培養液を表３の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載の温度で、「加熱処理の時間 分」欄に記載の時間、加熱処理した。
培養液調製工程の後、昇温工程を行った。
培養容器に注入した培養液を表３の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載の温度で、「加熱処理の時間 分」欄に記載の時間、加熱処理した。
《播種工程》
昇温工程の後、実施例１３と同様にして、細胞を播種した。
昇温工程の後、実施例１３と同様にして、細胞を播種した。
《培養工程》
播種工程の後、実施例１３と同様にして、培養工程を行った。
播種工程の後、実施例１３と同様にして、培養工程を行った。
《回収工程》
培養工程の後、実施例１３と同様にして、回収工程を行った。
培養工程の後、実施例１３と同様にして、回収工程を行った。
その結果、表３に示すとおり、細胞増殖率８．２倍であり、細胞沈降率８８．０％であり、細胞死亡率５．０％であり、スコア６．９であった。
〈実施例１５〉
《培養液調製工程》
ＴＥＭＰＯ１を表３に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１４と同様にして、培養液を調製した。
調製した培養液を表３に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１４と同様にして測定した。
《培養液調製工程》
ＴＥＭＰＯ１を表３に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１４と同様にして、培養液を調製した。
調製した培養液を表３に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１４と同様にして測定した。
《昇温工程》
培養液調製工程の後、昇温工程を行った。
培養容器に注入した培養液を表３の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載の温度で、「加熱処理の時間 分」欄に記載の時間、加熱処理した。
培養液調製工程の後、昇温工程を行った。
培養容器に注入した培養液を表３の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載の温度で、「加熱処理の時間 分」欄に記載の時間、加熱処理した。
《播種工程》
昇温工程の後、実施例１３と同様にして、細胞を播種した。
昇温工程の後、実施例１３と同様にして、細胞を播種した。
《培養工程》
播種工程の後、実施例１３と同様にして、培養工程を行った。
播種工程の後、実施例１３と同様にして、培養工程を行った。
《回収工程》
培養工程の後、実施例１３と同様にして、回収工程を行った。
培養工程の後、実施例１３と同様にして、回収工程を行った。
その結果、表３に示すとおり、細胞増殖率８．５倍であり、細胞沈降率９３．０％であり、細胞死亡率４．０％であり、スコア７．６であった。
〈実施例１６〉
《培養液調製工程》
ＴＥＭＰＯ１を表３に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１４と同様にして、培養液を調製した。
調製した培養液を表３に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１４と同様にして測定した。
《培養液調製工程》
ＴＥＭＰＯ１を表３に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１４と同様にして、培養液を調製した。
調製した培養液を表３に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１４と同様にして測定した。
《昇温工程》
培養液調製工程の後、昇温工程を行った。
培養容器に注入した培養液を表３の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載の温度で、「加熱処理の時間 分」欄に記載の時間、加熱処理した。
培養液調製工程の後、昇温工程を行った。
培養容器に注入した培養液を表３の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載の温度で、「加熱処理の時間 分」欄に記載の時間、加熱処理した。
《播種工程》
昇温工程の後、実施例１３と同様にして、細胞を播種した。
昇温工程の後、実施例１３と同様にして、細胞を播種した。
《培養工程》
播種工程の後、実施例１３と同様にして、培養工程を行った。
播種工程の後、実施例１３と同様にして、培養工程を行った。
《回収工程》
培養工程の後、実施例１３と同様にして、回収工程を行った。
培養工程の後、実施例１３と同様にして、回収工程を行った。
その結果、表３に示すとおり、細胞増殖率９．６倍であり、細胞沈降率９７．０％であり、細胞死亡率５．０％であり、スコア８．８であった。
〈実施例１７〉
《培養液調製工程》
ＴＥＭＰＯ１を表３に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１４と同様にして、培養液を調製した。
調製した培養液を表３に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１４と同様にして測定した。
《培養液調製工程》
ＴＥＭＰＯ１を表３に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１４と同様にして、培養液を調製した。
調製した培養液を表３に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１４と同様にして測定した。
《昇温工程》
培養液調製工程の後、昇温工程を行った。
培養容器に注入した培養液を表３の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載の温度で、「加熱処理の時間 分」欄に記載の時間、加熱処理した。
培養液調製工程の後、昇温工程を行った。
培養容器に注入した培養液を表３の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載の温度で、「加熱処理の時間 分」欄に記載の時間、加熱処理した。
《播種工程》
昇温工程の後、実施例１３と同様にして、細胞を播種した。
昇温工程の後、実施例１３と同様にして、細胞を播種した。
《培養工程》
播種工程の後、実施例１３と同様にして、培養工程を行った。
播種工程の後、実施例１３と同様にして、培養工程を行った。
《回収工程》
培養工程の後、実施例１３と同様にして、回収工程を行った。
培養工程の後、実施例１３と同様にして、回収工程を行った。
その結果、表３に示すとおり、細胞増殖率９．２倍であり、細胞沈降率９１．０％であり、細胞死亡率４．０％であり、スコア８．０であった。
〈実施例１８〉
《培養液調製工程》
ＴＥＭＰＯ１を表３に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１４と同様にして、培養液を調製した。
調製した培養液を表３に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１４と同様にして測定した。
《培養液調製工程》
ＴＥＭＰＯ１を表３に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１４と同様にして、培養液を調製した。
調製した培養液を表３に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１４と同様にして測定した。
《昇温工程》
培養液調製工程の後、昇温工程を行った。
培養容器に注入した培養液を表３の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載の温度で、「加熱処理の時間 分」欄に記載の時間、加熱処理した。
培養液調製工程の後、昇温工程を行った。
培養容器に注入した培養液を表３の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載の温度で、「加熱処理の時間 分」欄に記載の時間、加熱処理した。
《播種工程》
昇温工程の後、実施例１３と同様にして、細胞を播種した。
昇温工程の後、実施例１３と同様にして、細胞を播種した。
《培養工程》
播種工程の後、実施例１３と同様にして、培養工程を行った。
播種工程の後、実施例１３と同様にして、培養工程を行った。
《回収工程》
培養工程の後、実施例１３と同様にして、回収工程を行った。
培養工程の後、実施例１３と同様にして、回収工程を行った。
その結果、表３に示すとおり、細胞増殖率８．５倍であり、細胞沈降率９１．０％であり、細胞死亡率５．０％であり、スコア７．３であった。
〈実施例１９〉
《培養液調製工程》
ＴＥＭＰＯ１を表３に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１４と同様にして、培養液を調製した。
調製した培養液を表３に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１４と同様にして測定した。
《培養液調製工程》
ＴＥＭＰＯ１を表３に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１４と同様にして、培養液を調製した。
調製した培養液を表３に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１４と同様にして測定した。
《昇温工程》
培養液調製工程の後、昇温工程を行った。
培養容器に注入した培養液を表３の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載の温度で、「加熱処理の時間 分」欄に記載の時間、加熱処理した。
培養液調製工程の後、昇温工程を行った。
培養容器に注入した培養液を表３の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載の温度で、「加熱処理の時間 分」欄に記載の時間、加熱処理した。
《播種工程》
昇温工程の後、実施例１３と同様にして、細胞を播種した。
昇温工程の後、実施例１３と同様にして、細胞を播種した。
《培養工程》
播種工程の後、実施例１３と同様にして、培養工程を行った。
播種工程の後、実施例１３と同様にして、培養工程を行った。
《回収工程》
培養工程の後、実施例１３と同様にして、回収工程を行った。
培養工程の後、実施例１３と同様にして、回収工程を行った。
その結果、表３に示すとおり、細胞増殖率５．２倍であり、細胞沈降率９０．０％であり、細胞死亡率６．０％であり、スコア４．４であった。
〈実施例１３〜実施例１９の結果の説明〉
ＣＮＦ含有量が増加するにしたがってゲル化温度Ｔｃが低下する。
ＣＮＦを含まない実施例１３は細胞増殖率および細胞沈降性が低い。これは、ゲル化温度Ｔｃおよびゾル化温度Ｔｃｓがいずれも高く、昇温工程の加熱処理の温度および回収工程の降温処理の温度がいずれも高くなったためであると考えられる。
実施例１９は細胞増殖率が低い。これは、ゲル強度が強いため、培養液内部の酸素濃度が低下したためであると考えられる。
ＣＮＦ含有量が増加するにしたがってゲル化温度Ｔｃが低下する。
ＣＮＦを含まない実施例１３は細胞増殖率および細胞沈降性が低い。これは、ゲル化温度Ｔｃおよびゾル化温度Ｔｃｓがいずれも高く、昇温工程の加熱処理の温度および回収工程の降温処理の温度がいずれも高くなったためであると考えられる。
実施例１９は細胞増殖率が低い。これは、ゲル強度が強いため、培養液内部の酸素濃度が低下したためであると考えられる。
［実施例２０〜実施例２２］
実施例２０〜２２はＣＮＦの種類の効果およびＣＮＦのカルボキシル基の効果を示す例である。
実施例２０〜２２はＣＮＦの種類の効果およびＣＮＦのカルボキシル基の効果を示す例である。
〈実施例２０〉
《培養液調製工程》
（セルロースナノファイバーの調製）
表４に示す平均直径およびカルボキシ基含有量となるように酸化剤の使用量および超高圧ホモジナイザーの圧力を調整した点を除いて、比較例１と同様にしてＴＥＭＰＯ化セルロースナノファイバー（以下「ＴＥＭＰＯ３」という場合がある。）を調製した。調製したＴＥＭＰＯ３の平均直径およびカルボキシ基導入量を、比較例１と同様にして測定したところ、表４に示すとおりであった。
《培養液調製工程》
（セルロースナノファイバーの調製）
表４に示す平均直径およびカルボキシ基含有量となるように酸化剤の使用量および超高圧ホモジナイザーの圧力を調整した点を除いて、比較例１と同様にしてＴＥＭＰＯ化セルロースナノファイバー（以下「ＴＥＭＰＯ３」という場合がある。）を調製した。調製したＴＥＭＰＯ３の平均直径およびカルボキシ基導入量を、比較例１と同様にして測定したところ、表４に示すとおりであった。
（培養液の調製）
ＴＥＭＰＯ１に代えて、調製したＴＥＭＰＯ３を表４に示す添加量で使用した点、および熱ゾルゲル変化剤としてメチルセルロース（ＭＣ）を表４に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表４に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１と同様にして測定した。
ＴＥＭＰＯ１に代えて、調製したＴＥＭＰＯ３を表４に示す添加量で使用した点、および熱ゾルゲル変化剤としてメチルセルロース（ＭＣ）を表４に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表４に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１と同様にして測定した。
《昇温工程》
培養液調製工程の後、昇温工程を行った。
培養容器に注入した培養液を表４の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載の温度で、「加熱処理の時間 分」欄に記載の時間、加熱処理した。
培養液調製工程の後、昇温工程を行った。
培養容器に注入した培養液を表４の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載の温度で、「加熱処理の時間 分」欄に記載の時間、加熱処理した。
《播種工程》
ヒト間葉系幹細胞ＰＴ−２５０１（ｈＭＳＣ）に代えて、ヒトＥＳ細胞ＫｈＥＳ−１（京都大学再生医療科学研究所附属幹細胞医学研究センター）（以下「ＫｈＥＳ−１」という場合がある。）を使用した点、播種時の細胞濃度を表４に示す細胞濃度とした点、および播種時の培養液の温度を表４に示す温度とした点を除いて、実施例１と同様にして細胞を播種した。
播種時の培養液の状態および培養液の温度は、表４の「播種工程」の該当欄に示すとおりであった。
《培養工程》
播種工程の後、表４の「培養液の平均温度 ℃」の欄に記載した温度に設定したインキュベーターを使用した点を除いて、実施例１と同様にして、培養工程を行った。
ヒト間葉系幹細胞ＰＴ−２５０１（ｈＭＳＣ）に代えて、ヒトＥＳ細胞ＫｈＥＳ−１（京都大学再生医療科学研究所附属幹細胞医学研究センター）（以下「ＫｈＥＳ−１」という場合がある。）を使用した点、播種時の細胞濃度を表４に示す細胞濃度とした点、および播種時の培養液の温度を表４に示す温度とした点を除いて、実施例１と同様にして細胞を播種した。
播種時の培養液の状態および培養液の温度は、表４の「播種工程」の該当欄に示すとおりであった。
《培養工程》
播種工程の後、表４の「培養液の平均温度 ℃」の欄に記載した温度に設定したインキュベーターを使用した点を除いて、実施例１と同様にして、培養工程を行った。
《回収工程》
培養工程の後、降温処理の温度を表４の「回収工程」の「降温処理の温度 ℃」の欄に記載した温度とした点を除いて、実施例１と同様にして、回収工程を行った。
培養工程の後、降温処理の温度を表４の「回収工程」の「降温処理の温度 ℃」の欄に記載した温度とした点を除いて、実施例１と同様にして、回収工程を行った。
その結果、表４に示すとおり、細胞増殖率９．６倍であり、細胞沈降率９８．０％であり、細胞死亡率３．０％であり、スコア９．１であった。
〈実施例２１〉
《培養液調製工程》
（セルロースナノファイバーの調製）
表４に示す平均直径およびカルボキシ基含有量となるようにカルボキシメチル化剤の使用量および高圧ホモジナイザーの圧力を調整した点を除いて、実施例７と同様にしてＣＭ化セルロースナノファイバー（以下「ＣＭ２」という場合がある。）を調製した。調製したＣＭ２の平均直径およびカルボキシ基導入量を、比較例１と同様にして測定したところ、表４に示すとおりであった。
《培養液調製工程》
（セルロースナノファイバーの調製）
表４に示す平均直径およびカルボキシ基含有量となるようにカルボキシメチル化剤の使用量および高圧ホモジナイザーの圧力を調整した点を除いて、実施例７と同様にしてＣＭ化セルロースナノファイバー（以下「ＣＭ２」という場合がある。）を調製した。調製したＣＭ２の平均直径およびカルボキシ基導入量を、比較例１と同様にして測定したところ、表４に示すとおりであった。
（培養液の調製）
ＴＥＭＰＯ３に代えて、調製したＣＭ２を表４に示す添加量で使用した点を除いて、実施例２０と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表４に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１と同様にして測定した。
ＴＥＭＰＯ３に代えて、調製したＣＭ２を表４に示す添加量で使用した点を除いて、実施例２０と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表４に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１と同様にして測定した。
《昇温工程》
培養液調製工程の後、昇温工程を行った。
培養容器に注入した培養液を表４の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載の温度で、「加熱処理の時間 分」欄に記載の時間、加熱処理した。
培養液調製工程の後、昇温工程を行った。
培養容器に注入した培養液を表４の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載の温度で、「加熱処理の時間 分」欄に記載の時間、加熱処理した。
《播種工程》
昇温工程の後、実施例２０と同様にして、細胞を播種した。
昇温工程の後、実施例２０と同様にして、細胞を播種した。
《培養工程》
播種工程の後、実施例２０と同様にして、培養工程を行った。
播種工程の後、実施例２０と同様にして、培養工程を行った。
《回収工程》
培養工程の後、実施例２０と同様にして、回収工程を行った。
培養工程の後、実施例２０と同様にして、回収工程を行った。
その結果、表４に示すとおり、細胞増殖率９．０倍であり、細胞沈降率９３．０％であり、細胞死亡率６．０％であり、スコア７．９であった。
〈実施例２２〉
《培養液調製工程》
（セルロースナノファイバーの調製）
国際公開第２０１５／１１１７３４号（［００３９］）に記載された方法にしたがって、セルロース系原料を、高圧ホモジナイザーを用いて湿式微粒化処理して解繊することにより、機械解砕セルロースナノファイバー（以下「ＭＥＣ１」という場合がある。）を調製した。調製したＭＥＣ１の平均直径を、比較例１と同様にして測定したところ、表４に示すとおりであった。ＭＥＣ１は酸化処理等のカルボキシ基導入処理を行っていないことから、カルボキシ基導入量は０．０ｍｍｏｌ／ｇである。
《培養液調製工程》
（セルロースナノファイバーの調製）
国際公開第２０１５／１１１７３４号（［００３９］）に記載された方法にしたがって、セルロース系原料を、高圧ホモジナイザーを用いて湿式微粒化処理して解繊することにより、機械解砕セルロースナノファイバー（以下「ＭＥＣ１」という場合がある。）を調製した。調製したＭＥＣ１の平均直径を、比較例１と同様にして測定したところ、表４に示すとおりであった。ＭＥＣ１は酸化処理等のカルボキシ基導入処理を行っていないことから、カルボキシ基導入量は０．０ｍｍｏｌ／ｇである。
（培養液の調製）
ＴＥＭＰＯ３に代えて、調製したＭＥＣ１を表４に示す添加量で使用した点を除いて、実施例２０と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表４に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１と同様にして測定した。
ＴＥＭＰＯ３に代えて、調製したＭＥＣ１を表４に示す添加量で使用した点を除いて、実施例２０と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表４に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１と同様にして測定した。
《昇温工程》
培養液調製工程の後、昇温工程を行った。
培養容器に注入した培養液を表４の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載の温度で、「加熱処理の時間 分」欄に記載の時間、加熱処理した。
培養液調製工程の後、昇温工程を行った。
培養容器に注入した培養液を表４の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載の温度で、「加熱処理の時間 分」欄に記載の時間、加熱処理した。
《播種工程》
昇温工程の後、実施例２０と同様にして、細胞を播種した。
昇温工程の後、実施例２０と同様にして、細胞を播種した。
《培養工程》
播種工程の後、実施例２０と同様にして、培養工程を行った。
播種工程の後、実施例２０と同様にして、培養工程を行った。
《回収工程》
培養工程の後、実施例２０と同様にして、回収工程を行った。
培養工程の後、実施例２０と同様にして、回収工程を行った。
その結果、表４に示すとおり、細胞増殖率８．１倍であり、細胞沈降率８９．０％であり、細胞死亡率９．０％であり、スコア６．６であった。
〈実施例２０〜実施例２２の結果の説明〉
細胞増殖率および細胞死亡率とも、実施例２０（ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ）が最も良好であり、実施例２１（ＣＭ化ＣＮＦ）がその次に良好であった。
実施例２２（機械解砕ＣＮＦ）はゲル化温度Ｔｃが高くなり易く、加熱処理の温度が高めとなり、増殖率がやや低下し、さらにゾル化温度Ｔｃｓがやや低くなり、降温処理の温度が低めとなって細胞死亡率がやや増加したものと考えられる。
細胞増殖率および細胞死亡率とも、実施例２０（ＴＥＭＰＯ化ＣＮＦ）が最も良好であり、実施例２１（ＣＭ化ＣＮＦ）がその次に良好であった。
実施例２２（機械解砕ＣＮＦ）はゲル化温度Ｔｃが高くなり易く、加熱処理の温度が高めとなり、増殖率がやや低下し、さらにゾル化温度Ｔｃｓがやや低くなり、降温処理の温度が低めとなって細胞死亡率がやや増加したものと考えられる。
［実施例２３、実施例２４］
実施例２３および実施例２４は、熱ゾルゲル変化剤の種類の効果を示す例である。
実施例２３および実施例２４は、熱ゾルゲル変化剤の種類の効果を示す例である。
〈実施例２３〉
《培養液調製工程》
（セルロースナノファイバーの調製）
表４に示す平均直径およびカルボキシ基含有量となるように酸化剤の使用量および超高圧ホモジナイザーの圧力を調整した点を除いて、比較例１と同様にしてＴＥＭＰＯ化セルロースナノファイバー（以下「ＴＥＭＰＯ４」という場合がある。）を調製した。調製したＴＥＭＰＯ４の平均直径およびカルボキシ基導入量を、比較例１と同様にして測定したところ、表４に示すとおりであった。
《培養液調製工程》
（セルロースナノファイバーの調製）
表４に示す平均直径およびカルボキシ基含有量となるように酸化剤の使用量および超高圧ホモジナイザーの圧力を調整した点を除いて、比較例１と同様にしてＴＥＭＰＯ化セルロースナノファイバー（以下「ＴＥＭＰＯ４」という場合がある。）を調製した。調製したＴＥＭＰＯ４の平均直径およびカルボキシ基導入量を、比較例１と同様にして測定したところ、表４に示すとおりであった。
（培養液の調製）
ＴＥＭＰＯ１に代えて、調製したＴＥＭＰＯ４を表４に示す添加量で使用した点、および熱ゾルゲル変化剤としてメチルセルロース（ＭＣ）を表４に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表４に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１と同様にして測定した。
ＴＥＭＰＯ１に代えて、調製したＴＥＭＰＯ４を表４に示す添加量で使用した点、および熱ゾルゲル変化剤としてメチルセルロース（ＭＣ）を表４に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表４に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１と同様にして測定した。
《昇温工程》
培養液調製工程の後、昇温工程を行った。
培養容器に注入した培養液を表４の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載の温度で、「加熱処理の時間 分」欄に記載の時間、加熱処理した。
培養液調製工程の後、昇温工程を行った。
培養容器に注入した培養液を表４の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載の温度で、「加熱処理の時間 分」欄に記載の時間、加熱処理した。
《播種工程》
ヒト間葉系幹細胞ＰＴ−２５０１（ｈＭＳＣ）に代えて、ヒト胚性幹細胞Ｈ９（WiCell Research Institute, Inc., Madison, WI, USA）を使用した点、播種時の細胞濃度を表４に示す細胞濃度とした点、および播種時の培養液の温度を表４に示す温度とした点を除いて、実施例１と同様にして細胞を播種した。
播種時の培養液の状態および培養液の温度は、表４の「播種工程」の該当欄に示すとおりであった。
ヒト間葉系幹細胞ＰＴ−２５０１（ｈＭＳＣ）に代えて、ヒト胚性幹細胞Ｈ９（WiCell Research Institute, Inc., Madison, WI, USA）を使用した点、播種時の細胞濃度を表４に示す細胞濃度とした点、および播種時の培養液の温度を表４に示す温度とした点を除いて、実施例１と同様にして細胞を播種した。
播種時の培養液の状態および培養液の温度は、表４の「播種工程」の該当欄に示すとおりであった。
《培養工程》
播種工程の後、表４の「培養液の平均温度 ℃」の欄に記載した温度に設定したインキュベーターを使用した点を除いて、実施例１と同様にして、培養工程を行った。
播種工程の後、表４の「培養液の平均温度 ℃」の欄に記載した温度に設定したインキュベーターを使用した点を除いて、実施例１と同様にして、培養工程を行った。
《回収工程》
培養工程の後、降温処理の温度を表４の「回収工程」の「降温処理の温度 ℃」の欄に記載した温度とした点を除いて、実施例１と同様にして、回収工程を行った。
培養工程の後、降温処理の温度を表４の「回収工程」の「降温処理の温度 ℃」の欄に記載した温度とした点を除いて、実施例１と同様にして、回収工程を行った。
その結果、表４に示すとおり、細胞増殖率９．７倍であり、細胞沈降率９８．０％であり、細胞死亡率３．０％であり、スコア９．２であった。
〈実施例２４〉
《培養液調製工程》
熱ゾルゲル変化剤としてカードラン（ＣＵ）を表４に示す添加量で使用した点を除いて、実施例２３と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表４に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１と同様にして測定した。
《培養液調製工程》
熱ゾルゲル変化剤としてカードラン（ＣＵ）を表４に示す添加量で使用した点を除いて、実施例２３と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表４に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１と同様にして測定した。
《昇温工程》
培養液調製工程の後、昇温工程を行った。
培養容器に注入した培養液を表４の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載の温度で、「加熱処理の時間 分」欄に記載の時間、加熱処理した。
培養液調製工程の後、昇温工程を行った。
培養容器に注入した培養液を表４の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載の温度で、「加熱処理の時間 分」欄に記載の時間、加熱処理した。
《播種工程》
昇温工程の後、実施例２３と同様にして、細胞を播種した。
昇温工程の後、実施例２３と同様にして、細胞を播種した。
《培養工程》
播種工程の後、実施例２３と同様にして、培養工程を行った。
播種工程の後、実施例２３と同様にして、培養工程を行った。
《回収工程》
培養工程の後、実施例２３と同様にして、回収工程を行った。
培養工程の後、実施例２３と同様にして、回収工程を行った。
その結果、表４に示すとおり、細胞増殖率８．３倍であり、細胞沈降率９１．０％であり、細胞死亡率７．０％であり、スコア７．０であった。
〈実施例２３および実施例２４の結果の説明〉
実施例２３（ＭＣ）の方が実施例２４（カードラン）に比べ、細胞増殖率および細胞沈降性に優れ、細胞死亡率もやや小さい。
実施例２３（ＭＣ）の方が実施例２４（カードラン）に比べ、細胞増殖率および細胞沈降性に優れ、細胞死亡率もやや小さい。
［実施例２５、比較例２］
実施例２５および比較例２は、回収工程における降温操作を変更した例である。実施例２５は降温処理によって細胞を沈降させた例であり、比較例２は遠沈処理によって細胞を沈降させた例である。
実施例２５および比較例２は、回収工程における降温操作を変更した例である。実施例２５は降温処理によって細胞を沈降させた例であり、比較例２は遠沈処理によって細胞を沈降させた例である。
〈実施例２５〉
《培養液調製工程》
（セルロースナノファイバーの調製）
表４に示す平均直径およびカルボキシ基含有量となるように酸化剤の使用量および超高圧ホモジナイザーの圧力を調整した点を除いて、比較例１と同様にしてＴＥＭＰＯ化セルロースナノファイバー（以下「ＴＥＭＰＯ５」という場合がある。）を調製した。調製したＴＥＭＰＯ５の平均直径およびカルボキシ基導入量を、比較例１と同様にして測定したところ、表４に示すとおりであった。
《培養液調製工程》
（セルロースナノファイバーの調製）
表４に示す平均直径およびカルボキシ基含有量となるように酸化剤の使用量および超高圧ホモジナイザーの圧力を調整した点を除いて、比較例１と同様にしてＴＥＭＰＯ化セルロースナノファイバー（以下「ＴＥＭＰＯ５」という場合がある。）を調製した。調製したＴＥＭＰＯ５の平均直径およびカルボキシ基導入量を、比較例１と同様にして測定したところ、表４に示すとおりであった。
（培養液の調製）
ＴＥＭＰＯ１に代えて、調製したＴＥＭＰＯ５を表４に示す添加量で使用した点、および熱ゾルゲル変化剤としてメチルセルロース（ＭＣ）を表４に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表４に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１と同様にして測定した。
ＴＥＭＰＯ１に代えて、調製したＴＥＭＰＯ５を表４に示す添加量で使用した点、および熱ゾルゲル変化剤としてメチルセルロース（ＭＣ）を表４に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表４に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１と同様にして測定した。
《昇温工程》
培養液調製工程の後、昇温工程を行った。
培養容器に注入した培養液を表４の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載の温度で、「加熱処理の時間 分」欄に記載の時間、加熱処理した。
培養液調製工程の後、昇温工程を行った。
培養容器に注入した培養液を表４の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載の温度で、「加熱処理の時間 分」欄に記載の時間、加熱処理した。
《播種工程》
ヒト間葉系幹細胞ＰＴ−２５０１（ｈＭＳＣ）に代えて、ヒトＥＳ細胞ＫｈＥＳ−１（京都大学再生医療科学研究所附属幹細胞医学研究センター）（以下「ＫｈＥＳ−１」という場合がある。）を使用した点、播種時の細胞濃度を表４に示す細胞濃度とした点、および播種時の培養液の温度を表４に示す温度とした点を除いて、実施例１と同様にして細胞を播種した。
播種時の培養液の状態および培養液の温度は、表４の「播種工程」の該当欄に示すとおりであった。
ヒト間葉系幹細胞ＰＴ−２５０１（ｈＭＳＣ）に代えて、ヒトＥＳ細胞ＫｈＥＳ−１（京都大学再生医療科学研究所附属幹細胞医学研究センター）（以下「ＫｈＥＳ−１」という場合がある。）を使用した点、播種時の細胞濃度を表４に示す細胞濃度とした点、および播種時の培養液の温度を表４に示す温度とした点を除いて、実施例１と同様にして細胞を播種した。
播種時の培養液の状態および培養液の温度は、表４の「播種工程」の該当欄に示すとおりであった。
《培養工程》
播種工程の後、表４の「培養液の平均温度 ℃」の欄に記載した温度に設定したインキュベーターを使用した点を除いて、実施例１と同様にして、培養工程を行った。
播種工程の後、表４の「培養液の平均温度 ℃」の欄に記載した温度に設定したインキュベーターを使用した点を除いて、実施例１と同様にして、培養工程を行った。
《回収工程》
培養工程の後、降温処理の温度を表４の「回収工程」の「降温処理の温度 ℃」の欄に記載した温度とした点を除いて、実施例１と同様にして、回収工程を行った。
培養工程の後、降温処理の温度を表４の「回収工程」の「降温処理の温度 ℃」の欄に記載した温度とした点を除いて、実施例１と同様にして、回収工程を行った。
その結果、表４に示すとおり、細胞増殖率９．４倍であり、細胞沈降率９５．０％であり、細胞死亡率５．０％であり、スコア８．５であった。
〈比較例２〉
《培養液調製工程》
実施例２５と同様にして、培養液を調製した。
調製した培養液を表４に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１と同様にして測定した。
《培養液調製工程》
実施例２５と同様にして、培養液を調製した。
調製した培養液を表４に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１と同様にして測定した。
《播種工程》
培養液調製工程の後、昇温工程を行わず、実施例２５と同様にして、播種工程を行った。
培養液調製工程の後、昇温工程を行わず、実施例２５と同様にして、播種工程を行った。
《培養工程》
播種工程の後、実施例２５と同様にして、培養工程を行った。
播種工程の後、実施例２５と同様にして、培養工程を行った。
《回収工程》
培養工程の後、降温操作を遠沈処理（相対遠心加速度３３５×ｇ）により行った。
培養工程の後、降温操作を遠沈処理（相対遠心加速度３３５×ｇ）により行った。
その結果、表４に示すとおり、細胞増殖率５．５倍であり、細胞沈降率８５．０％であり、細胞死亡率５１．０％であり、スコア２．３であった。
〈実施例２５および比較例２の結果の説明〉
降温処理により細胞を沈降させた実施例２５に比べて、遠沈処理により細胞を沈降させた比較例２は、細胞死亡率が明らかに高かった。
これは、遠沈処理の際の相対遠心加速度が大きく、細胞に過大なストレスを与えたため、細胞の死亡率が高くなったことによると考えられる。
降温処理により細胞を沈降させた実施例２５に比べて、遠沈処理により細胞を沈降させた比較例２は、細胞死亡率が明らかに高かった。
これは、遠沈処理の際の相対遠心加速度が大きく、細胞に過大なストレスを与えたため、細胞の死亡率が高くなったことによると考えられる。
［実施例２６、比較例３］
実施例２６および比較例３は、ＣＮＦ以外の浮遊性素材（ゲランガム）の効果を示す例である。
実施例２６および比較例３は、ＣＮＦ以外の浮遊性素材（ゲランガム）の効果を示す例である。
〈実施例２６〉
《培養液調製工程》
（セルロースナノファイバーの調製）
表５に示す平均直径およびカルボキシ基含有量となるように酸化剤の使用量および超高圧ホモジナイザーの圧力を調整した点を除いて、比較例１と同様にしてＴＥＭＰＯ化セルロースナノファイバー（以下「ＴＥＭＰＯ６」という場合がある。）を調製した。調製したＴＥＭＰＯ６の平均直径およびカルボキシ基導入量を、比較例１と同様にして測定したところ、表５に示すとおりであった。
《培養液調製工程》
（セルロースナノファイバーの調製）
表５に示す平均直径およびカルボキシ基含有量となるように酸化剤の使用量および超高圧ホモジナイザーの圧力を調整した点を除いて、比較例１と同様にしてＴＥＭＰＯ化セルロースナノファイバー（以下「ＴＥＭＰＯ６」という場合がある。）を調製した。調製したＴＥＭＰＯ６の平均直径およびカルボキシ基導入量を、比較例１と同様にして測定したところ、表５に示すとおりであった。
（培養液の調製）
ＴＥＭＰＯ１に代えて、調製したＴＥＭＰＯ６を表５に示す添加量で使用した点、および熱ゾルゲル変化剤としてメチルセルロース（ＭＣ）を表５に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表５に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１と同様にして測定した。
ＴＥＭＰＯ１に代えて、調製したＴＥＭＰＯ６を表５に示す添加量で使用した点、および熱ゾルゲル変化剤としてメチルセルロース（ＭＣ）を表５に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表５に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１と同様にして測定した。
《昇温工程》
培養液調製工程の後、昇温工程を行った。
培養容器に注入した培養液を表５の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載の温度で、「加熱処理の時間 分」欄に記載の時間、加熱処理した。
培養液調製工程の後、昇温工程を行った。
培養容器に注入した培養液を表５の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載の温度で、「加熱処理の時間 分」欄に記載の時間、加熱処理した。
《播種工程》
ヒト間葉系幹細胞ＰＴ−２５０１（ｈＭＳＣ）に代えて、ヒトＥＳ細胞ＫｈＥＳ−１（京都大学再生医療科学研究所附属幹細胞医学研究センター）（以下「ＫｈＥＳ−１」という場合がある。）を使用した点、播種時の細胞濃度を表５に示す細胞濃度とした点、および播種時の培養液の温度を表５に示す温度とした点を除いて、実施例１と同様にして細胞を播種した。
播種時の培養液の状態および培養液の温度は、表５の「播種工程」の該当欄に示すとおりであった。
ヒト間葉系幹細胞ＰＴ−２５０１（ｈＭＳＣ）に代えて、ヒトＥＳ細胞ＫｈＥＳ−１（京都大学再生医療科学研究所附属幹細胞医学研究センター）（以下「ＫｈＥＳ−１」という場合がある。）を使用した点、播種時の細胞濃度を表５に示す細胞濃度とした点、および播種時の培養液の温度を表５に示す温度とした点を除いて、実施例１と同様にして細胞を播種した。
播種時の培養液の状態および培養液の温度は、表５の「播種工程」の該当欄に示すとおりであった。
《培養工程》
播種工程の後、表５の「培養液の平均温度 ℃」の欄に記載した温度に設定したインキュベーターを使用した点を除いて、実施例１と同様にして、培養工程を行った。
播種工程の後、表５の「培養液の平均温度 ℃」の欄に記載した温度に設定したインキュベーターを使用した点を除いて、実施例１と同様にして、培養工程を行った。
《回収工程》
培養工程の後、降温処理の温度を表５の「回収工程」の「降温処理の温度 ℃」の欄に記載した温度とした点を除いて、実施例１と同様にして、回収工程を行った。
培養工程の後、降温処理の温度を表５の「回収工程」の「降温処理の温度 ℃」の欄に記載した温度とした点を除いて、実施例１と同様にして、回収工程を行った。
その結果、表５に示すとおり、細胞増殖率９．５倍であり、細胞沈降率９０．０％であり、細胞死亡率４．０％であり、スコア８．２であった。
〈比較例３〉
《培養液調製工程》
ＴＥＭＰＯ６に代えて、ゲランガム（脱アシル化ジェランガム ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ，三晶株式会社製）を表５に示す添加量で使用した点を除いて、実施例２５と同様にして、培養液を調製した。
調製した培養液を表５に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１と同様にして測定した。
《培養液調製工程》
ＴＥＭＰＯ６に代えて、ゲランガム（脱アシル化ジェランガム ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ，三晶株式会社製）を表５に示す添加量で使用した点を除いて、実施例２５と同様にして、培養液を調製した。
調製した培養液を表５に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１と同様にして測定した。
《昇温工程》
培養液調製工程の後、昇温工程を行わず、実施例２６と同様にして、播種工程を行った。
培養液調製工程の後、昇温工程を行わず、実施例２６と同様にして、播種工程を行った。
《播種工程》
昇温工程の後、実施例２６と同様にして、細胞を播種した。
昇温工程の後、実施例２６と同様にして、細胞を播種した。
《培養工程》
播種工程の後、実施例２６と同様にして、培養工程を行った。
播種工程の後、実施例２６と同様にして、培養工程を行った。
《回収工程》
培養工程の後、実施例２６と同様にして、回収工程を行った。
培養工程の後、実施例２６と同様にして、回収工程を行った。
その結果、表５に示すとおり、細胞増殖率８．０倍であり、細胞沈降率３５．０％であり、細胞死亡率６．０％であり、スコア２．６であった。
〈実施例２６および比較例３の結果の説明〉
比較例３（ゲランガム）はゾルゲル転移せず、細胞沈降性および細胞回収率が実施例２６（ＣＮＦ）に比べて劣っていた。
比較例３（ゲランガム）はゾルゲル転移せず、細胞沈降性および細胞回収率が実施例２６（ＣＮＦ）に比べて劣っていた。
［実施例２７、実施例２８］
実施例２７および実施例２８は、昇温工程の前に播種工程を行った場合（実施例２７）と、昇温工程の後に播種工程を行った場合（実施例２８）とを比較する例である。
実施例２７および実施例２８は、昇温工程の前に播種工程を行った場合（実施例２７）と、昇温工程の後に播種工程を行った場合（実施例２８）とを比較する例である。
〈実施例２７〉
《培養液調製工程》
熱ゾルゲル変化剤としてメチルセルロース（ＭＣ）を表５に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表５に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１と同様にして測定した。
《培養液調製工程》
熱ゾルゲル変化剤としてメチルセルロース（ＭＣ）を表５に示す添加量で使用した点を除いて、実施例１と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表５に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１と同様にして測定した。
《播種工程》
培養液調製工程の後、培養液の温度をＴｃ［℃］未満に保ったまま、細胞を播種した。
細胞の播種は、実施例１と同様に、ヒト間葉系幹細胞ＰＴ−２５０１（ｈＭＳＣ）を使用し、播種時の細胞濃度を表５に示す細胞濃度とした点、および播種時の培養液の温度を表５に示す温度とした点を除いて、実施例１と同様にして細胞を播種した。
播種時の培養液の状態および培養液の温度は、表５の「播種工程」の該当欄に示すとおりであった。
培養液調製工程の後、培養液の温度をＴｃ［℃］未満に保ったまま、細胞を播種した。
細胞の播種は、実施例１と同様に、ヒト間葉系幹細胞ＰＴ−２５０１（ｈＭＳＣ）を使用し、播種時の細胞濃度を表５に示す細胞濃度とした点、および播種時の培養液の温度を表５に示す温度とした点を除いて、実施例１と同様にして細胞を播種した。
播種時の培養液の状態および培養液の温度は、表５の「播種工程」の該当欄に示すとおりであった。
《昇温工程》
播種工程の後、昇温工程を行った。
培養容器中の培養液を表５の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載の温度で、「加熱処理の時間 分」欄に記載の時間、加熱処理した。
播種工程の後、昇温工程を行った。
培養容器中の培養液を表５の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載の温度で、「加熱処理の時間 分」欄に記載の時間、加熱処理した。
《培養工程》
播種工程の後、表５の「培養液の平均温度 ℃」の欄に記載した温度に設定したインキュベーターを使用した点を除いて、実施例１と同様にして、培養工程を行った。
播種工程の後、表５の「培養液の平均温度 ℃」の欄に記載した温度に設定したインキュベーターを使用した点を除いて、実施例１と同様にして、培養工程を行った。
《回収工程》
培養工程の後、降温処理の温度を表５の「回収工程」の「降温処理の温度 ℃」の欄に記載した温度とした点を除いて、実施例１と同様にして、回収工程を行った。
培養工程の後、降温処理の温度を表５の「回収工程」の「降温処理の温度 ℃」の欄に記載した温度とした点を除いて、実施例１と同様にして、回収工程を行った。
その結果、表５に示すとおり、細胞増殖率９．３倍であり、細胞沈降率９３．０％であり、細胞死亡率３．０％であり、スコア８．４であった。
〈実施例２８〉
《培養液調製工程》
実施例２７と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表５に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１と同様にして測定した。
《培養液調製工程》
実施例２７と同様にして培養液を調製した。
調製した培養液を表５に示す量、培養容器に注入して、以降の工程に用いた。
さらに、調製した培養液の相転移温度（ＴｃおよびＴｃｓ）を、実施例１と同様にして測定した。
《昇温工程》
培養液調製工程の後、昇温工程を行った。
培養容器中の培養液を表５の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載の温度で、「加熱処理の時間 分」欄に記載の時間、加熱処理した。
培養液調製工程の後、昇温工程を行った。
培養容器中の培養液を表５の「昇温工程」の「加熱処理の温度 ℃」欄に記載の温度で、「加熱処理の時間 分」欄に記載の時間、加熱処理した。
《播種工程》
昇温工程の後、培養液の温度をＴｃｓ以上に保ったまま、細胞を播種した。
細胞の播種は、実施例１と同様に、ｈＭＳＣを使用し、播種時の細胞濃度を表５に示す細胞濃度とした点、および播種時の培養液の温度を表５に示す温度とした点を除いて、実施例１と同様にして細胞を播種した。
播種時の培養液の状態および培養液の温度は、表５の「播種工程」の該当欄に示すとおりであった。
昇温工程の後、培養液の温度をＴｃｓ以上に保ったまま、細胞を播種した。
細胞の播種は、実施例１と同様に、ｈＭＳＣを使用し、播種時の細胞濃度を表５に示す細胞濃度とした点、および播種時の培養液の温度を表５に示す温度とした点を除いて、実施例１と同様にして細胞を播種した。
播種時の培養液の状態および培養液の温度は、表５の「播種工程」の該当欄に示すとおりであった。
《培養工程》
播種工程の後、実施例２７と同様にして、培養工程を行った。
播種工程の後、実施例２７と同様にして、培養工程を行った。
《回収工程》
培養工程の後、実施例２７と同様にして、回収工程を行った。
培養工程の後、実施例２７と同様にして、回収工程を行った。
その結果、表５に示すとおり、細胞増殖率９．３倍であり、細胞沈降率９３．０％であり、細胞死亡率３．０％であり、スコア８．４であった。
〈実施例２７および実施例２８の結果の説明〉
実施例２７と実施例２８との間で、効果に差異はなかった。
実施例２７と実施例２８との間で、効果に差異はなかった。
Claims (21)
- 昇温時相転移温度ＴｃおよびＴｃよりも温度が低い降温時相転移温度Ｔｃｓを有する培養液をＴｃ未満からＴｃ以上に昇温する昇温工程と、
前記昇温工程において前記培養液をＴｃ以上に昇温した後、Ｔｃｓ以上の培養温度で、前記培養液中で細胞を浮遊培養する培養工程と、
を備え、
前記培養液が、平均直径２．０ｎｍ以上１００ｎｍ以下のセルロースナノファイバーと、熱ゾルゲル変化剤と、を含む、細胞の培養方法。
ここで、前記昇温時相転移温度Ｔｃは、前記培養液が５．０℃／分の昇温速度で３．０℃から９８．０℃まで昇温されたとする場合において、前記培養液の３．０℃における粘度がηｓであるときの、前記培養液の粘度が１０×ηｓとなる時の温度であり、前記降温時相転移温度Ｔｃｓは、前記培養液が５．０℃／分の降温速度で９８．０℃から３．０℃まで降温されたとする場合において、前記培養液の粘度が１０×ηｓとなる時の温度であり、温度の単位を℃、粘度の単位をＰａ・ｓとする。 - ＴｃおよびＴｃｓが下記式（１）を満たす、請求項１に記載の細胞の培養方法。
１．０℃≦Ｔｃ−Ｔｃｓ≦７０．０℃ （１） - 前記培養工程の後に、さらに、
前記培養液をＴｃｓ未満に降温して、前記培養工程において培養された細胞を沈降させ、回収する回収工程、
を備える、請求項１または２に記載の細胞の培養方法。 - 前記降温時相転移温度Ｔｃｓが３．０℃以上４１．０℃以下である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞の培養方法。
- 前記セルロースナノファイバーのカルボキシ基含有量が０．６０ｍｍｏｌ／ｇ以上２．０ｍｍｏｌ／ｇ以下である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞の培養方法。
- 前記セルロースナノファイバーの含有量が前記培養液中０．０１質量％以上１．０質量％以下である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞の培養方法。
- 前記セルロースナノファイバーに酸化処理が施されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞の培養方法。
- 前記熱ゾルゲル変化剤の含有量が前記培養液中０．０５質量％以上３．０質量％以下である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞の培養方法。
- 前記熱ゾルゲル変化剤がメチルセルロースである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞の培養方法。
- 前記細胞が幹細胞である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の細胞の培養方法。
- 前記昇温工程の後、かつ、前記培養工程の前に、さらに、
前記昇温工程において前記培養液をＴｃ以上に昇温した後、前記培養液に細胞を播種するゲル化後播種工程
を備える、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の細胞の培養方法。 - 前記昇温工程の前に、さらに、
前記培養液に細胞を播種するゲル化前播種工程
を備える、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の細胞の培養方法。 - 昇温時相転移温度Ｔｃおよび降温時相転移温度Ｔｃｓを有し、
平均直径２．０ｎｍ以上１００ｎｍ以下のセルロースナノファイバーと、熱ゾルゲル変化剤と、を含む、培養液。
ここで、前記昇温時相転移温度Ｔｃは、前記培養液が５．０℃／分の昇温速度で３．０℃から９８．０℃まで昇温されたとする場合において、前記培養液の３．０℃における粘度がηｓであるときの、前記培養液の粘度が１０×ηｓとなる時の温度であり、前記降温時相転移温度Ｔｃｓは、前記培養液が５．０℃／分の降温速度で９８．０℃から３．０℃まで降温されたとする場合において、前記培養液の粘度が１０×ηｓとなる時の温度であり、温度の単位を℃、粘度の単位をＰａ・ｓとする。 - ＴｃおよびＴｃｓが下記式（１）を満たす、請求項１３に記載の培養液。
１．０℃≦Ｔｃ−Ｔｃｓ≦７０．０℃ （１） - 前記降温時相転移温度Ｔｃｓが３．０℃以上４１．０℃以下である、請求項１３または１４に記載の培養液。
- 前記セルロースナノファイバーのカルボキシ基含有量が０．６０ｍｍｏｌ／ｇ以上２．０ｍｍｏｌ／ｇ以下である、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の培養液。
- 前記セルロースナノファイバーを０．０１質量％以上１．０質量％以下含む、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の細胞の培養液。
- 前記セルロースナノファイバーに酸化処理が施されている、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の培養液。
- 前記熱ゾルゲル変化剤を０．０５質量％以上３．０質量％以下含む、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の培養液。
- 前記熱ゾルゲル変化剤がメチルセルロースである、請求項１３〜１９のいずれか１項に記載の培養液。
- 請求項１〜１２のいずれか１項に記載の細胞の培養方法に使用するための、請求項１３〜２０のいずれか１項に記載の培養液。
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