JP7410491B2 - 浮遊培養用培地添加剤、培地組成物及び培養方法 - Google Patents
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Description
本発明は、細胞を浮遊させて培養するために用いられる浮遊培養用培地添加剤、並びに、細胞を浮遊させて培養可能な培地組成物、及びそれを用いた培養方法に関する。
細胞をその周囲の環境と三次元的に相互作用させながら培養させる手法として、三次元細胞培養が知られている。三次元細胞培養では、例えば液体培地中で細胞を培養すると、細胞が沈降して凝集してしまう。細胞を凝集させないための手法として、ハイドロゲルを用いる手法や、スピナーで攪拌することで細胞を浮遊させる手法がある。
しかしながら、ハイドロゲルを用いる手法では、ゲルマトリックス中に取り込まれた細胞の生長がゲルの圧力により妨げられ、またゲルの構造が不均一なことに起因して細胞集合体が不均一な大きさになりやすく、更にゲルと細胞を分離しにくいという問題がある。また、スピナーで攪拌する攪拌培養では、常時攪拌されることで細胞にダメージを与えることが懸念される。
特許文献１には、スピナーで攪拌することなく細胞を浮遊させて培養可能な手法として、セルロースナノファイバーと熱ゲルゾル変化剤とを含む培養液で細胞を培養する方法が開示されている。しかしながら、セルロースナノファイバーは、高圧ホモジナイザーなどを用いた機械的解繊により得られる微細なセルロース繊維であり、一般にその水分散液は高粘度であるため、培養した細胞を回収しにくい。
本発明の実施形態は、細胞を浮遊した状態で培養することができ、培養した細胞を容易に回収することができる、浮遊培養用培地添加剤、培地組成物及び培養方法を提供することを目的とする。
本発明の実施形態に係る浮遊培養用添加剤は、細胞を浮遊させて培養するために培地に添加される培地添加剤であって、セルロースのウィスカー状結晶であるセルロースナノクリスタルを含むものである。
本発明の実施形態に係る培地組成物は、細胞を浮遊させて培養できる培地組成物であって、セルロースのウィスカー状結晶であるセルロースナノクリスタルを含むものである。
本発明の実施形態に係る細胞の培養方法は、該培地組成物中で細胞を培養することを含むものである。
本発明の実施形態であると、セルロースナノクリスタルを培地に配合することにより、細胞を浮遊させた状態で培養することができる。また、セルロースナノクリスタルを添加しても培地は低粘度に維持されるので、例えば濾過などにより細胞を容易に回収することができる。
１．浮遊培養用培地添加剤
本実施形態に係る浮遊培養用培地添加剤（以下、単に培地添加剤ということがある）は、セルロースナノクリスタル（以下、ＣＮＣということがある。）を含むものである。ＣＮＣは、非水溶性であり、水中での分散安定性に優れることから、液体培地中で細胞を浮遊させた状態に保持する効果を持つ。そのため、細胞を浮遊させて培養するための添加剤として用いることができる。
本実施形態に係る浮遊培養用培地添加剤（以下、単に培地添加剤ということがある）は、セルロースナノクリスタル（以下、ＣＮＣということがある。）を含むものである。ＣＮＣは、非水溶性であり、水中での分散安定性に優れることから、液体培地中で細胞を浮遊させた状態に保持する効果を持つ。そのため、細胞を浮遊させて培養するための添加剤として用いることができる。
（Ａ）セルロースナノクリスタル
セルロースナノクリスタル（ＣＮＣ）は、セルロースのウィスカー状結晶（針（ひげ）状結晶とも称される。）である。ＣＮＣは、一般に平均幅が３～５０ｎｍ、平均長が１００ｎｍ～数μｍ、平均アスペクト比が２００未満、重合度が９０～６０００である剛直なウィスカー状の結晶であり、平均繊維径が３～１００ｎｍ、平均繊維長が数μｍ以上、アスペクト比が数百以上である柔軟性を有する繊維状をなすセルロースナノファイバー（ＣＮＦ）とは異なる。
セルロースナノクリスタル（ＣＮＣ）は、セルロースのウィスカー状結晶（針（ひげ）状結晶とも称される。）である。ＣＮＣは、一般に平均幅が３～５０ｎｍ、平均長が１００ｎｍ～数μｍ、平均アスペクト比が２００未満、重合度が９０～６０００である剛直なウィスカー状の結晶であり、平均繊維径が３～１００ｎｍ、平均繊維長が数μｍ以上、アスペクト比が数百以上である柔軟性を有する繊維状をなすセルロースナノファイバー（ＣＮＦ）とは異なる。
ＣＮＣの原料は、天然由来のセルロース材料であり、植物または動物、微生物等のセルロースであれば特に限定はない。これらのセルロース繊維に機械的、化学的、もしくは酵素処理を施すことによって、セルロース繊維の結晶部位を抽出し、そのほとんどが結晶構造で構成されるＣＮＣを得ることができる。詳細には、天然セルロースを酸加水分解、例えば濃硫酸水溶液中で加温し、加水分解することによって、ＣＮＣの水分散液が得られる。このように、ＣＮＣは一般に酸加水分解により製造されそのほとんどが結晶構造で構成されるのに対し、ＣＮＦは一般に機械的解繊により製造され結晶性を有する部分と非結晶性を有する部分が混在したものである。
ＣＮＣはＩ型結晶構造を有する天然由来のセルロース原料を微細化したものであるため、Ｉ型の結晶構造を有する。
ＣＮＣは、化学的または物理的に修飾された誘導体でもあり得る。例えば、スルホン酸基、カルボキシル基、カルボキシメチル基、エステル基を修飾したものでもよく、表面上にアニオン性、カチオン性、もしくは非イオン性物質を物理的吸着したものでもよい。これらの修飾は、ＣＮＣの製造前、製造後、または製造中に実施することができる。
ＣＮＣの平均幅は、３～５０ｎｍであることが好ましく、より好ましくは１０～４０ｎｍであり、１０～３０ｎｍでもよい。また、ＣＮＣの平均長は特に限定されないが、１００ｎｍ～３μｍであることが好ましく、より好ましくは１００～５００ｎｍである。ＣＮＣの平均アスペクト比は特に限定されないが、１８０以下であることが好ましく、より好ましくは２～１００であり、１０～８０でもよい。
ＣＮＣの平均幅は、短幅と長幅を持つウィスカー状結晶において、短幅の平均値であり、平均長は長幅の平均値である。平均幅および平均長は、次のようにして測定することができる。すなわち、固形分率で０．０５～０．１質量％のＣＮＣの水分散液を調製し、その水分散液を、親水化処理済みのカーボン膜被覆グリッド上にキャストして、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）の観察用試料とする。なお、大きな幅のＣＮＣを含む場合には、ガラス上へキャストした表面の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）像を観察してもよい。また、観察用試料は、例えば２質量％ウラニルアセテート水溶液でネガティブ染色してもよい。そして、構成するＣＮＣの大きさに応じて５０００倍、１００００倍あるいは５００００倍のいずれかの倍率で電子顕微鏡画像による観察を行い、任意の２０本の短幅および長幅を測定し、それらの相加平均をそれぞれ平均幅および平均長とする。平均アスペクト比は、上記の平均幅と平均長の値を用いて、平均アスペクト比＝平均長（ｎｍ）／平均幅（ｎｍ）により算出される。
（Ｂ）培地添加剤
培地添加剤は、ＣＮＣの水分散液でもよい。すなわち、培地添加剤は、ＣＮＣとともに水を含み、該水中にＣＮＣを分散させたものであることが好ましい。培地添加剤が水分散液であることにより、液体培地中にＣＮＣを容易に分散させることができる。なお、培地添加剤は、ＣＮＣのみで構成されてもよい。
培地添加剤は、ＣＮＣの水分散液でもよい。すなわち、培地添加剤は、ＣＮＣとともに水を含み、該水中にＣＮＣを分散させたものであることが好ましい。培地添加剤が水分散液であることにより、液体培地中にＣＮＣを容易に分散させることができる。なお、培地添加剤は、ＣＮＣのみで構成されてもよい。
上記水分散液の場合、ＣＮＣの濃度としては、特に限定されないが、例えば０．０１～２％（ｗ／ｖ）でもよく、０．５～１％（ｗ／ｖ）でもよい。なお、本明細書において「％（ｗ／ｖ）」は、溶液１００ｍＬ中に含まれる対象成分の質量（ｇ）を意味する。
ＣＮＣは、その水分散液における動的光散乱法（ＤＬＳ）により測定される最大強度の粒子径が０．３～１０μｍであることが好ましい。すなわち、ＣＮＣの水分散液におけるＣＮＣの粒子径は、動的光散乱法による測定における最大強度の粒子径が０．３～１０μｍであることが好ましい。ＣＮＣは何本かのウィスカー状結晶が束ねられたように凝集しており、水分散液においてかかるウィスカー状結晶の凝集体として存在するものを含む。そのため、動的光散乱法による最大強度の粒子径は比較的大きいが、ＣＮＦに比べれば小さく、この点でもＣＮＦと区別することができる。ＣＮＣの水分散液における最大強度の粒子径は、より好ましくは０．５μｍ以上であり、更に好ましくは０．８μｍ以上であり、また５．０μｍ以下であることが好ましく、より好ましくは３．０μｍ以下である。
ＣＮＣの水分散液には、塩化ナトリウムが含まれてもよい。すなわち、ＣＮＣの水分散液は、ＣＮＣを食塩水に分散させたものでもよく、より詳細にはＣＮＣを生理食塩水に分散させたものでもよい。
培地添加剤には、上記成分の他、例えば、メチル化セルロースなどの添加剤が含まれてもよい。
２．培地組成物
本実施形態に係る培地組成物は、細胞を浮遊させて培養できる培地組成物であって、ＣＮＣを含むことを特徴とする。ＣＮＣとしては、上記１．で述べたものを用いることができる。すなわち、実施形態に係る培地組成物は、培地に上記浮遊培養用培地添加剤を添加し混合してなるものである。
本実施形態に係る培地組成物は、細胞を浮遊させて培養できる培地組成物であって、ＣＮＣを含むことを特徴とする。ＣＮＣとしては、上記１．で述べたものを用いることができる。すなわち、実施形態に係る培地組成物は、培地に上記浮遊培養用培地添加剤を添加し混合してなるものである。
上記の通りＣＮＣは液体培地中で細胞を浮遊させた状態に保持する効果を持つため、ＣＮＣを添加した培地組成物は、細胞を浮遊させて培養可能な液体の培地組成物である。また、ＣＮＣは培地中に浮遊した状態で分散しており、その状態で細胞を浮遊した状態に保持するものであり、ハイドロゲルのように固形化することでマトリックス中に細胞を取り込んで保持するものではない。そのため、ＣＮＣは細胞（細胞集合体であるスフェロイドを含む）の運動ないし生長を制限しないと考えられ、よって、大きさがより均一であり、また真円度の高い細胞を得ることができる。
培地組成物に含まれる培地としては、細胞の種類によって適宜選択することができ、種々の液体培地を用いることができる。具体的には、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ：Dulbecco's modified Eagle medium）、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ：Eagle's Minimum Essential Medium）、αＭＥＭ培地（MinimumEssential Medium Eagle, Alpha Modification）、グラスゴー最小必須培地（ＧＭＥＭ：Glasgow Minimum Essential Medium）、ハムＦ１２培地（NutrientMixture F-12 Ham）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Dulbecco's modified EagleMedium/Nutrient Mixture F-12 Ham）、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ：Iscove'sModified Dulbecco's Medium）、ＲＰＭＩ－１６４０培地、マッコイ５Ａ培地（McCoy's5A Medium）などが挙げられる。
培地に含まれる成分としては、特に限定されず、例えば、アミノ酸、無機塩、グルコース、ビタミンなど、一般に培地に配合される各種成分を配合することができる。
培地組成物におけるＣＮＣの濃度は、特に限定されないが、０．０１～２％（ｗ／ｖ）であることが好ましく、より好ましくは０．５～１％（ｗ／ｖ）である。ＣＮＣの濃度が０．０１％（ｗ／ｖ）以上であることにより、培地組成物中でのＣＮＣの分散安定性を向上して細胞を浮遊させることができ、０．５％（ｗ／ｖ）以上とすることでその効果をより高めることができる。また、２％（ｗ／ｖ）以下であることにより、ピペット等での分注の際に水分散液として容易に取り扱うことができる。なお、ＣＮＣの濃度が低い場合、比較的短期間で透明な上澄み（上層）とＣＮＣが分散した下層との二層に分離することがあるが、その場合でもＣＮＣが分散した下層において同様に浮遊培養することができるので、そのような分離した状態で浮遊培養してもよい。
培地組成物の製造方法としては、特に限定されない。例えば、上記ＣＮＣの水分散液を用いる場合、該水分散液と液体培地をそれぞれ予め滅菌してから、両者を混合して培地組成物中にＣＮＣを均一に分散させてもよい。なお、培地に細胞を添加分散させてから、ＣＮＣの水分散液と混合してもよく、その場合、培地組成物が得られた段階で当該培地組成物中に細胞も含まれている。あるいはまた、ＣＮＣの水分散液と液体培地を混合して培地組成物中にＣＮＣを均一に分散させてから、滅菌することで培地組成物を調製してもよい。
本実施形態において細胞としては、特に限定されず、動物由来の細胞でも、植物由来の細胞でもよい。動物由来の細胞としては、生殖細胞、体細胞、幹細胞、前駆細胞、不死化した細胞（細胞株）、遺伝子改変細胞等が挙げられ、生体から採取ないし分離され、場合によっては更に人為的な操作が加えられた細胞を用いることができる。幹細胞とは、自己増殖能と分化する能力をあわせ持つ細胞であり、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、体性幹細胞（例えば神経幹細胞、造血幹細胞、皮膚幹細胞等）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等が挙げられる。前駆細胞とは、幹細胞から特定の体細胞や生殖細胞に分化する途中の段階にある細胞である。細胞株とは、生体外での人為的な操作により無限の増殖能を獲得した細胞であり、例えば、ＨｅＬａ（ヒト子宮頸癌由来の細胞株）等が挙げられる。
本実施形態に係る培地組成物は、細胞を浮遊させて培養できるものであり、即ち浮遊培養が可能である。ここで、浮遊培養とは、培養容器に対して細胞が接着せずに、液体培地中に浮遊したままで培養することをいう。本実施形態では、液体の培地組成物に対して外部からの圧力ないし振動や当該培地組成物中での攪拌等を伴わずに、すなわち培地組成物を静置した状態でも、細胞を液体の培地組成物中に浮遊させて培養できることが好ましく、従って、培地組成物は静置浮遊培養が可能であることが好ましい。培地組成物を静置した状態で細胞を浮遊させること、すなわち静置浮遊が可能な期間としては、１時間以上であることが好ましく、より好ましくは２４時間以上、更に好ましくは４８時間以上である。
培地組成物の粘度は、特に限定されないが、２５℃における粘度が２０．０ｍＰａ・ｓ以下であることが好ましく、１０．０ｍＰａ・ｓ以下でもよい。培地組成物の粘度は低いほど好ましいため、下限は特に限定されず、例えば０．５０ｍＰａ・ｓ以上でもよい。
３．培養方法
本実施形態に係る細胞の培養方法は、上記培地組成物中で細胞を培養することを含む。具体的には、細胞を培地組成物中に均一に分散させるように混合し、得られた培養液を培養容器中で培養すればよい。培養容器としては、特に限定されず、例えば、フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、マルチウエルプレートなどが挙げられる。
本実施形態に係る細胞の培養方法は、上記培地組成物中で細胞を培養することを含む。具体的には、細胞を培地組成物中に均一に分散させるように混合し、得られた培養液を培養容器中で培養すればよい。培養容器としては、特に限定されず、例えば、フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、マルチウエルプレートなどが挙げられる。
細胞を培地組成物中に分散させる方法としては、ＣＮＣを含む培地組成物を調製した後、該培地組成物に細胞を添加し混合してもよく、あるいはまた、培地に細胞を添加し混合した後、これにＣＮＣを加えて混合してもよい。
培養は、培養液を静置状態にしてもよく、必要に応じて培養液を回転、振とう或いは撹拌してもよい。好ましくは、細胞へのダメージを低減するために静置状態とすることである。本実施形態では、培養液中に分散したＣＮＣにより、細胞が培養液の底面のみに偏在せずに三次元的な広がりをもって分散し、静置浮遊培養が可能である。
一実施形態において、細胞は、培養により、三次元的な細胞集合体（細胞同士が集合・凝集化した球状の細胞重合体）であるスフェロイドを形成してもよい。スフェロイドの大きさは、細胞種及び培養期間によって異なるため、特に限定されず、例えば、直径が２０～１０００μｍでもよく、４０μｍ～５００μｍでもよく、５０～３００μｍでもよい。
培養する際の温度や時間等の条件としては、培養する細胞に応じて適宜設定することができる。例えば、動物細胞であれば、培養温度は、通常２５～３９℃でもよく、好ましくは３３～３９℃である。ＣＯ２濃度は、通常、培養の雰囲気中、４～１０体積％でもよく、好ましくは４～６体積％である。培養時間は、通常３～３５日間であるが、培養の目的に合わせて適宜に設定すればよい。また、植物細胞であれば、培養温度は、通常２０～３０℃でもよく、光が必要であれば照度２０００～８０００ルクスの照度条件下としてもよい。また、培養時間は、通常３～７０日間であるが、培養の目的に合わせて適宜に設定すればよい。
細胞濃度としても、培養する細胞に応じて適宜設定することができ、特に限定されず、例えば、播種時（即ち、細胞を培地組成物に播種した段階）の細胞濃度で１．０×１０３個／ｍＬ～１．０×１０１０個／ｍＬでもよく、１．０×１０４個／ｍＬ～１．０×１０８個／ｍＬでもよい。
培養においては、培地交換を行ってもよい。すなわち、本実施形態に係る細胞の培養方法は、上記培地組成物中で細胞を培養する工程と、該培養により得られた細胞をＣＮＣとともに培地から分離し、分離した細胞及びＣＮＣを新しい培地と混合して更に培養を行う工程とを含んでもよい。細胞をＣＮＣとともに培地から分離する方法としては、例えば遠心分離により細胞及びＣＮＣを沈降させ、上清としての培地を除去すればよい。分離した細胞及びＣＮＣに新しい培地を添加し混合することにより、細胞及びＣＮＣを培養液中に再分散させることができる。そのため、新たにＣＮＣを添加することなく浮遊培養が可能であり、ＣＮＣを繰り返し使用できる。
本実施形態に係る培養方法は、更に、培養した細胞を回収する工程を含んでもよい。回収は、培養した細胞を培養液から分離する工程であり、例えば濾過処理により行うことができる。上記ＣＮＣは培養液中で分散することにより細胞を培養液中に三次元的な広がりをもって分散した状態に保持するが、ＣＮＣと細胞とは結合していない。そのため、ＣＮＣと細胞との分離が容易である。また、ＣＮＣは水分散液の粘度の上昇が小さく、そのため培地組成物及び培養液も低粘度である。そのため、自然濾過による濾過処理が可能であり、細胞へのダメージを低減することができる。
一実施形態において、培養した細胞（例えば、スフェロイド）はＣＮＣよりも大きい。例えば、培養は、細胞がＣＮＣよりも大きくなるまで実施することが好ましい。このようにＣＮＣが培養した細胞（スフェロイド）よりも小さいことにより、ＣＮＣの粒径よりも大きくかつ培養した細胞よりも小さな孔径を持つフィルターを用いて濾過することにより、培養した細胞を培地及びＣＮＣから容易に分離・回収することができる。
以下、実施例により更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
１．試薬
ＤＭＥＭ、ペニシリン－ストレプトマイシン、ダルベッコリン酸緩衝液（ＤＰＢＳ）、カルセイン－ＡＭ、ヨウ化プロピジウムは富士フイルム和光純薬工業より購入した。超純水はＭｉｌｌｉ－Ｑシステム（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ Ａｄｖａｎｔａｇｅ Ａ－１０、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で供給した。その他は、ナカライテスクより特級以上の試薬を購入し、使用した。
ＤＭＥＭ、ペニシリン－ストレプトマイシン、ダルベッコリン酸緩衝液（ＤＰＢＳ）、カルセイン－ＡＭ、ヨウ化プロピジウムは富士フイルム和光純薬工業より購入した。超純水はＭｉｌｌｉ－Ｑシステム（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ Ａｄｖａｎｔａｇｅ Ａ－１０、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で供給した。その他は、ナカライテスクより特級以上の試薬を購入し、使用した。
２．実験方法
（１）ＣＮＣ水分散液の調製
Ｊ．Ａｒａｋｉら，“Flow properties ofmicrocrystalline cellulose suspension prepared by acid treatment of nativecellulose”，Ｃｏｌｌｏｉｄｓ ａｎｄ Ｓｕｒｆａｃｅｓ Ａ：Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ａｓｐｅｃｔｓ，１９９８年，１４２，７５－８２に記載の方法に従い、マボヤ由来のＣＮＣを調製した。
（１）ＣＮＣ水分散液の調製
Ｊ．Ａｒａｋｉら，“Flow properties ofmicrocrystalline cellulose suspension prepared by acid treatment of nativecellulose”，Ｃｏｌｌｏｉｄｓ ａｎｄ Ｓｕｒｆａｃｅｓ Ａ：Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ａｓｐｅｃｔｓ，１９９８年，１４２，７５－８２に記載の方法に従い、マボヤ由来のＣＮＣを調製した。
簡潔には、漂白、粉砕処理したマボヤの被嚢と４Ｍの塩酸を混合し、８０℃で８時間撹拌した。得られた反応液に超純水を加えて２１５０ｇで５分間遠心して上清を取り除いた後に、超純水を加えてセルロースを再分散した。この操作を繰り返すことにより精製し、ＣＮＣ水分散液を得た。得られたＣＮＣは、平均幅が１７ｎｍであった。
（２）ＣＮＣの分散安定性評価
（１）において調製したＣＮＣ水分散液を１％（ｗ／ｖ）に調整し、得られた水分散液２５０μＬと、２×ＤＭＥＭ（２倍濃度のＤＭＥＭ）２５０μＬを１ｍＬバイアル中で混合した。３７℃で所定時間インキュベーションし、ＣＮＣの分散性を目視により経時的に観察した。
（１）において調製したＣＮＣ水分散液を１％（ｗ／ｖ）に調整し、得られた水分散液２５０μＬと、２×ＤＭＥＭ（２倍濃度のＤＭＥＭ）２５０μＬを１ｍＬバイアル中で混合した。３７℃で所定時間インキュベーションし、ＣＮＣの分散性を目視により経時的に観察した。
（３）ＣＮＣ分散液のＤＬＳ測定
（１）において調製したＣＮＣ水分散液を０．００５％（ｗ／ｖ）に調整し、得られた水分散液８０μＬをセルに加え、２５℃で３分間静置した後に測定した。測定には、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳＰ（Ｍａｌｖｅｒｎ）を用い、温度：２５℃、散乱角度：１７３°とし、Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ Ｌａｔｅｘを標準試料としたキュムラント解析により流体力学直径を算出した。ＤＬＳ測定は３回実施し（ｎ＝３）、その平均値を求めた。
（１）において調製したＣＮＣ水分散液を０．００５％（ｗ／ｖ）に調整し、得られた水分散液８０μＬをセルに加え、２５℃で３分間静置した後に測定した。測定には、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳＰ（Ｍａｌｖｅｒｎ）を用い、温度：２５℃、散乱角度：１７３°とし、Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ Ｌａｔｅｘを標準試料としたキュムラント解析により流体力学直径を算出した。ＤＬＳ測定は３回実施し（ｎ＝３）、その平均値を求めた。
（４）培地組成物の粘度測定
（１）において調製したＣＮＣ水分散液を１％（ｗ／ｖ）、０．２％（ｗ／ｖ）に調整し、得られた１％（ｗ／ｖ）または０．２％（ｗ／ｖ）の水分散液１ｍＬと、２×ＤＭＥＭ１ｍＬとをそれぞれ２ｍＬチューブ中で混合した。また、０．２％（ｗ／ｖ）セルロースナノファイバー水分散液（レオクリスタ、第一工業製薬）１ｍＬと、２×ＤＭＥＭ１ｍＬとを２ｍＬチューブ中で混合した。このようにして調製した培地組成物について、音叉振動式粘度計（ＳＶ－１Ａ、Ａ＆Ｄ、３０Ｈｚ）を用い、測定温度は２５℃として粘度を測定した。
（１）において調製したＣＮＣ水分散液を１％（ｗ／ｖ）、０．２％（ｗ／ｖ）に調整し、得られた１％（ｗ／ｖ）または０．２％（ｗ／ｖ）の水分散液１ｍＬと、２×ＤＭＥＭ１ｍＬとをそれぞれ２ｍＬチューブ中で混合した。また、０．２％（ｗ／ｖ）セルロースナノファイバー水分散液（レオクリスタ、第一工業製薬）１ｍＬと、２×ＤＭＥＭ１ｍＬとを２ｍＬチューブ中で混合した。このようにして調製した培地組成物について、音叉振動式粘度計（ＳＶ－１Ａ、Ａ＆Ｄ、３０Ｈｚ）を用い、測定温度は２５℃として粘度を測定した。
（５）細胞培養
ＨｅＬａ細胞（ＪＣＲＢ細胞バンク）は、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含んだＤＭＥＭ中で、３７℃、５％ＣＯ２条件下、１０ｃｍディッシュで培養し、約８０％コンフルエントまで培養して継代した。継代は以下の操作により実施した：培地を除去し、１０ｍＬのＤＰＢＳをディッシュに加え穏やかに撹拌した。ＤＰＢＳを除去し、０．５ｍｇ／ｍＬのトリプシン溶液を１ｍＬ加えて全面に広げて３７℃、５％ＣＯ２条件下で５分間インキュベーションした。ＤＭＥＭを９ｍＬ加えて懸濁させ、新しいディッシュに０．３～１ｍＬ移し、全量が１０ｍＬとなるようＤＭＥＭを加えて穏やかに撹拌し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。
ＨｅＬａ細胞（ＪＣＲＢ細胞バンク）は、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含んだＤＭＥＭ中で、３７℃、５％ＣＯ２条件下、１０ｃｍディッシュで培養し、約８０％コンフルエントまで培養して継代した。継代は以下の操作により実施した：培地を除去し、１０ｍＬのＤＰＢＳをディッシュに加え穏やかに撹拌した。ＤＰＢＳを除去し、０．５ｍｇ／ｍＬのトリプシン溶液を１ｍＬ加えて全面に広げて３７℃、５％ＣＯ２条件下で５分間インキュベーションした。ＤＭＥＭを９ｍＬ加えて懸濁させ、新しいディッシュに０．３～１ｍＬ移し、全量が１０ｍＬとなるようＤＭＥＭを加えて穏やかに撹拌し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。
（６）ＣＮＣ分散液を用いた浮遊培養
（５）において継代の際に用いなかった細胞懸濁液を１５ｍＬチューブに移し、遠心（５００ｒｐｍ、３分間）した。上清を取り除いた後、２×ＤＭＥＭを１０ｍＬ加えて懸濁し、遠心（同条件）する操作を３回繰り返した。細胞懸濁液と０．４％のトリパンブルー溶液を１：１（体積比）で混合した溶液を、血球計算盤にアプライして生細胞数をカウントし、細胞濃度が１．０×１０５個／ｍＬとなるよう２×ＤＭＥＭで希釈した。９６穴プレート中で５０μＬの細胞懸濁液と５０μＬのＣＮＣ水分散液を混合し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で所定時間インキュベーションした。ＣＮＣ水分散液としては、（１）で調製したものをオートクレーブ滅菌（１２１℃、２０分）し、１．０％（ｗ／ｖ）に調整して用いた。培地交換は２日毎に、以下の操作により実施した：細胞培養液を１．５ｍＬチューブに移し、１ｍＬのＤＭＥＭを添加し、遠心（２００ｇ、５分間、２５℃）した。上清を取り除いた後、全量が１００μＬとなるようＤＭＥＭを加えて再分散し、９６穴プレートに移した。細胞の形態は蛍光顕微鏡（ＺＯＥ蛍光セルイメージャー、Ｂｉｏ－ｒａｄ）の明視野モードにより観察した。
（５）において継代の際に用いなかった細胞懸濁液を１５ｍＬチューブに移し、遠心（５００ｒｐｍ、３分間）した。上清を取り除いた後、２×ＤＭＥＭを１０ｍＬ加えて懸濁し、遠心（同条件）する操作を３回繰り返した。細胞懸濁液と０．４％のトリパンブルー溶液を１：１（体積比）で混合した溶液を、血球計算盤にアプライして生細胞数をカウントし、細胞濃度が１．０×１０５個／ｍＬとなるよう２×ＤＭＥＭで希釈した。９６穴プレート中で５０μＬの細胞懸濁液と５０μＬのＣＮＣ水分散液を混合し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で所定時間インキュベーションした。ＣＮＣ水分散液としては、（１）で調製したものをオートクレーブ滅菌（１２１℃、２０分）し、１．０％（ｗ／ｖ）に調整して用いた。培地交換は２日毎に、以下の操作により実施した：細胞培養液を１．５ｍＬチューブに移し、１ｍＬのＤＭＥＭを添加し、遠心（２００ｇ、５分間、２５℃）した。上清を取り除いた後、全量が１００μＬとなるようＤＭＥＭを加えて再分散し、９６穴プレートに移した。細胞の形態は蛍光顕微鏡（ＺＯＥ蛍光セルイメージャー、Ｂｉｏ－ｒａｄ）の明視野モードにより観察した。
（７）細胞の生死判定
（６）に従い５日間浮遊培養した後の細胞培養液に、２μＭのカルセイン－ＡＭおよび４μＭのヨウ化プロピジウムを含んだＤＰＢＳ溶液を１００μＬ添加し、３７℃で１５分間インキュベーションした。染色した細胞は蛍光顕微鏡（ＺＯＥ蛍光セルイメージャー、Ｂｉｏ－ｒａｄ）により観察した。
（６）に従い５日間浮遊培養した後の細胞培養液に、２μＭのカルセイン－ＡＭおよび４μＭのヨウ化プロピジウムを含んだＤＰＢＳ溶液を１００μＬ添加し、３７℃で１５分間インキュベーションした。染色した細胞は蛍光顕微鏡（ＺＯＥ蛍光セルイメージャー、Ｂｉｏ－ｒａｄ）により観察した。
（８）培養した細胞の回収
（６）に従い５日間浮遊培養した後の細胞培養液を１．５ｍＬチューブに移し、１ｍＬのＤＰＢＳを添加して分散させた。分散液をナイロン製メッシュフィルター（孔径４０μｍ、フナコシ）により濾過した。フィルター上に残った細胞を、フィルターの逆側から２００μＬのＤＰＢＳをフローすることで９６穴プレートに回収し、その形態を蛍光顕微鏡（ＺＯＥ蛍光セルイメージャー、Ｂｉｏ－ｒａｄ）の明視野モードにより観察した。
（６）に従い５日間浮遊培養した後の細胞培養液を１．５ｍＬチューブに移し、１ｍＬのＤＰＢＳを添加して分散させた。分散液をナイロン製メッシュフィルター（孔径４０μｍ、フナコシ）により濾過した。フィルター上に残った細胞を、フィルターの逆側から２００μＬのＤＰＢＳをフローすることで９６穴プレートに回収し、その形態を蛍光顕微鏡（ＺＯＥ蛍光セルイメージャー、Ｂｉｏ－ｒａｄ）の明視野モードにより観察した。
３．結果および考察
（１）ＣＮＣの分散安定性評価結果
ＣＮＣを血清培地（ＤＭＥＭ）中に分散させて所定時間（半日、１日、２日）静置した際の外観を図１に示す。２日間静置した場合にも目視によるＣＮＣの沈降は観察されず、タンパク質や無機塩など様々な物質が共存する溶液中でもＣＮＣは安定に分散できることがわかった。
（１）ＣＮＣの分散安定性評価結果
ＣＮＣを血清培地（ＤＭＥＭ）中に分散させて所定時間（半日、１日、２日）静置した際の外観を図１に示す。２日間静置した場合にも目視によるＣＮＣの沈降は観察されず、タンパク質や無機塩など様々な物質が共存する溶液中でもＣＮＣは安定に分散できることがわかった。
（２）ＣＮＣのＤＬＳ測定結果
ＣＮＣ分散液のＤＬＳ測定の結果を図２に示す。主成分として１．２μｍ程度、副成分として６．４μｍ程度にピークが観測された。最大強度の粒子径は１２２６ｎｍであった。
ＣＮＣ分散液のＤＬＳ測定の結果を図２に示す。主成分として１．２μｍ程度、副成分として６．４μｍ程度にピークが観測された。最大強度の粒子径は１２２６ｎｍであった。
（３）培地組成物の粘度測定結果
ＣＮＣをＤＭＥＭ中に分散させた培地組成物の粘度を測定した。０．１％（ｗ／ｖ）の濃度のＣＮＣを含む培地組成物は粘度が１．３３±０．０３ｍＰａ・ｓであった。この値は、ＣＮＣと同様に天然由来のセルロース集合体であるセルロースナノファイバーを０．１％（ｗ／ｖ）含む培地組成物の粘度（２．９９±０．３４ｍＰａ・ｓ）より低かった。さらに、浮遊培養に用いた０．５％（ｗ／ｖ）の濃度のＣＮＣを含む培地組成物では、粘度が６．７９±０．７２ｍＰａ・ｓであり、０．１％（ｗ／ｖ）の場合とオーダーは変わらず、低粘度であることがわかった。
ＣＮＣをＤＭＥＭ中に分散させた培地組成物の粘度を測定した。０．１％（ｗ／ｖ）の濃度のＣＮＣを含む培地組成物は粘度が１．３３±０．０３ｍＰａ・ｓであった。この値は、ＣＮＣと同様に天然由来のセルロース集合体であるセルロースナノファイバーを０．１％（ｗ／ｖ）含む培地組成物の粘度（２．９９±０．３４ｍＰａ・ｓ）より低かった。さらに、浮遊培養に用いた０．５％（ｗ／ｖ）の濃度のＣＮＣを含む培地組成物では、粘度が６．７９±０．７２ｍＰａ・ｓであり、０．１％（ｗ／ｖ）の場合とオーダーは変わらず、低粘度であることがわかった。
（４）浮遊培養結果
ＣＮＣを含む培地中で細胞を１日間、培養した際の培養液中の顕微鏡像を図３に示す。１日後も細胞は沈降することなく培養液中に観察されたことから、ＣＮＣを含む培地を用いることで、細胞を培養液中に三次元的に保持し、培養できることがわかった。
ＣＮＣを含む培地中で細胞を１日間、培養した際の培養液中の顕微鏡像を図３に示す。１日後も細胞は沈降することなく培養液中に観察されたことから、ＣＮＣを含む培地を用いることで、細胞を培養液中に三次元的に保持し、培養できることがわかった。
上記のとおり２日毎に培地交換しながら、ＣＮＣを含む培地中で５日間、細胞培養した際の培養液中の顕微鏡像を図４に示す。細胞が増殖してスフェロイド（細胞の凝集塊）を形成している様子が観察されたことから、細胞が浮遊した状態で増殖していることがわかった。また、この５日間培養したものについて、細胞の生死判定として、生細胞と死細胞をそれぞれ緑色、赤色に染色して観察した結果、ほとんどの細胞は生存しており、ＣＮＣが顕著な細胞毒性をもたないことがわかった。
以上の結果から、ＣＮＣの分散液が細胞の浮遊培養に利用できることが明らかとなった。
（５）培養細胞の回収結果
培養したＨｅＬａ細胞のスフェロイドを回収した後の顕微鏡像を図５に示す。図５は、回収後、プレート底面に沈降したスフェロイドの顕微鏡像である。培養後の分散液は、希釈し、ピペット操作により分散させることで自然濾過することができた。そのため、培養したスフェロイドよりも小さく、かつＣＮＣよりも大きな孔径（４０μｍ）をもつメッシュフィルターを用いて濾過することで、スフェロイドのみをフィルター上に分離し、回収することができた。
培養したＨｅＬａ細胞のスフェロイドを回収した後の顕微鏡像を図５に示す。図５は、回収後、プレート底面に沈降したスフェロイドの顕微鏡像である。培養後の分散液は、希釈し、ピペット操作により分散させることで自然濾過することができた。そのため、培養したスフェロイドよりも小さく、かつＣＮＣよりも大きな孔径（４０μｍ）をもつメッシュフィルターを用いて濾過することで、スフェロイドのみをフィルター上に分離し、回収することができた。
以上、本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これら実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその省略、置き換え、変更などは、発明の範囲や要旨に含まれると同様に、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれるものである。
Claims (2)
- 細胞を浮遊させて培養できる浮遊培養用培地組成物であって、セルロースのウィスカー状結晶であるセルロースナノクリスタルを含み、
前記培地組成物におけるセルロースナノクリスタルの濃度が０．５～２％（ｗ／ｖ）であり、
前記セルロースナノクリスタルは水分散液における動的光散乱法により測定される最大強度の粒子径が０．８～３．０μｍである、浮遊培養用培地組成物。 - 請求項１に記載の培地組成物中で細胞を浮遊させて培養することを含む、細胞の培養方法。
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