JP4838594B2 - セルアレイソータ、その製造方法及びそれを用いた細胞ソート方法 - Google Patents
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Description
第1の方法により、金属膜スポット12の表面に刺激応答性ポリマーを固定化する方法について説明する。
金属膜スポット12の表面を酸化処理剤等で洗浄したのち、金属膜スポット12の表面とアルキルチオール又はチオコレステロール等のチオール化合物と反応させて金属膜スポット12の表面のみに有機薄膜を形成する。有機薄膜と金属膜スポット12とを反応させる際には、エタノール等の溶剤に溶解させたチオール化合物を溶解させた溶液として反応させればよい。反応終了後、未反応のチオール化合物を溶剤により除去し、真空乾燥する。
以下に、第1の方法により金属膜スポット12に刺激応答性ポリマーを固定化する具体的な実施例を示す。
以下に、第2の方法により刺激応答性ポリマーを金属膜スポット12の表面に固定化する方法について具体的な実施例を説明する。
次に、低温プラズマ装置のチャンバ内に有機薄膜を形成した基板(10mm×10mm)を置き、酸素の流量を調節してチャンバ内の圧力を1.3Paとした。高周波の負荷には容量負荷型を用い、高周波電源(日本電子製JRF−300型、周波数13.56MHz)を使用して20Wの照射パワーで120秒間プラズマを照射した。
以下に、セルアレイソータへの細胞の接着及びセルアレイソータからの細胞の遊離について実験を行った結果を説明する。以下の実験においては、第1の実施例及び第2の実施例において形成したセルアレイソータを用い、比較のために、基板の上に金属膜スポットの形成を行っただけの未処理のセルアレイソータについても実験を行った。
セルアレイソータは、光学フィルム固定用透明両面テープCS−9611(日東電工)を全面に貼り付け、24ウェルマイクロプレート(FALCON社)のウェル底面に固定した。滅菌灯を用いてUV光を30min照射して滅菌した後、リン酸緩衝液(pH7.4、PBS)にて3回洗浄した。続いて、MEM培地に入れた細胞浮遊液1mL(HeLa細胞理研セルバンク:細胞濃度3.0×104個/mL)を播種し、37℃で6時間、5%CO2雰囲気のインキュベータ中で培養した。
次に、MEM培地を取り除き、溶液温度を26℃としたMEM培地ウェルに注入し、26℃で濃度が5%のCO2雰囲気において2h静置した。続いて、上澄みを回収し、ウェルをPBSで2回洗浄した後、セルアレイソータ上に残った接着細胞数を蛍光顕微鏡で計測し遊離細胞数を見積もった。図11(a)〜(c)は細胞を遊離させた後の傾向顕微鏡写真を示している。(a)及び(b)に示すように、第1の実施例及び第2の実施例において得たP(HPMA−co−MMA)が固定されたセルアレイソータの表面からは細胞が遊離し、ほとんど残存していない。一方、(c)に示す未処理のセルアレイソータの表面には多数の細胞が残存している。図12は顕微鏡視野内の平均接着細胞数及び温度刺激による遊離細胞数を示している。P(HPMA−co−MMA)が固定されたセルアレイソータからは、未処理の場合と比べて、多くの細胞が遊離していることが明らかである。
12 金属膜スポット
13 刺激応答性ポリマー
Claims (17)
- 基板の上に互いに間隔をおいて行列状に形成された複数の金属膜スポットと、
前記各金属膜スポットの表面に固定され、外部からの刺激に応答して疎水性の強さが変化する刺激応答性ポリマーとを備え、
前記基板と前記金属膜スポットとは互いに異なる材料により形成され、
前記刺激応答性ポリマーは、前記各金属膜スポットの表面に選択的に固定され、前記各金属膜スポットの表面以外の部分には固定されておらず、
外部から刺激に応じて、前記各金属膜スポットへの細胞の接着と、前記各金属膜スポットからの細胞の遊離とを行うことを特徴とするセルアレイソータ。 - 前記刺激応答性ポリマーの表面は、細胞を特異的に認識する機能を有する機能性分子により修飾されており、
前記各金属膜スポットには、前記機能性分子により認識された細胞が接着されることを特徴とする請求項1に記載のセルアレイソータ。 - 前記刺激応答性ポリマーは、N−2−ヒドロキシプロピルメタクリルアミド及びメタクリル酸メチルをコモノマーとして含む共重合体であることを特徴とする請求項1又は2に記載のセルアレイソータ。
- 前記各金属膜スポットの径は、0.1μm以上且つ300μm以下であることを特徴とする請求項1から3のいずれか1項に記載のセルアレイソータ。
- 前記各金属膜スポットは、金からなり、
前記刺激応答性ポリマーは、末端にチオール基を有するポリマーであり、
前記刺激応答性ポリマーは、前記金属膜スポットの表面と共有結合していることを特徴とする請求項1から4のいずれか1項に記載のセルアレイソータ。 - 前記各金属膜スポット表面にそれぞれ形成されたチオール基を有する有機薄膜をさらに備え、
前記刺激応答性ポリマーは、前記有機薄膜の表面からグラフト重合により成長させたグラフトポリマーであることを特徴とする請求項1から4のいずれか1項に記載のポリマー。 - 前記刺激応答性ポリマーは、温度に応答するポリマーであることを特徴とする請求項1から6のいずれか1項に記載のセルアレイソータ。
- 前記刺激応答性ポリマーは、光に応答するポリマーであることを特徴とする請求項1から6のいずれか1項に記載のセルアレイソータ。
- 前記基板は、複数の凹部を有し、
前記各金属膜スポットは、前記凹部に形成されていることを特徴とする請求項1〜8のいずれか1項に記載のセルアレイソータ。 - 細胞を接着した後、接着した細胞を遊離して回収するセルアレイソータの製造方法であって、
基板の上に金属膜を形成した後、形成した金属膜をフォトリソエッチングすることにより前記基板の上に、前記金属膜から複数の金属膜スポットを行列状に形成する工程(a)と、
外部からの刺激に応答して疎水性の強さが変化する刺激応答性ポリマーを前記各金属膜スポットの表面に選択的に固定する工程(b)とを備え、
前記基板と前記金属膜スポットとは互いに異なる材料により形成されていることを特徴とするセルアレイソータの製造方法。 - 前記刺激応答性ポリマーの表面を、細胞を特異的に認識する機能を有する機能性分子により修飾する工程(c)をさらに備えていることを特徴とする請求項10に記載のセルアレイソータの製造方法。
- 前記工程(a)において、前記金属膜は、真空蒸着法、スパッタリング法又はメッキ法により形成することを特徴とする請求項10又は11に記載のセルアレイソータの製造方法。
- 前記各金属膜スポットは金からなり、
前記前記工程(a)よりも前に、前記基板の表面にニッケル及びクロムの少なくとも一方からなる中間層を形成する工程(d)をさらに備えていることを特徴とする請求項10から12のいずれか1項に記載のセルアレイソータの製造方法。 - 前記各金属膜スポットは金からなり、
前記工程(a)よりも後に、前記基板の表面を不活性ガス、酸素、一酸化炭素及び二酸化炭素のうちの1つ又は少なくとも2つからなる混合ガスを用いてプラズマ処理する工程(e)をさらに備えていることを特徴とする請求項10から12のいずれか1項に記載のセルアレイソータの製造方法。 - 前記工程(b)は、前記刺激応答性ポリマーの末端にチオール基を導入する工程と、チオール基を導入した前記刺激応答性ポリマーを前記各金属膜スポットの表面と反応させる工程とを含むことを特徴とする請求項10から14のいずれか1項に記載のセルアレイソータの製造方法。
- 前記工程(b)は、前記各金属膜スポットの表面にチオール基を有する化合物からなる有機薄膜をそれぞれ形成した後、形成した有機薄膜をプラズマ処理して活性化する工程と、活性化した前記有機薄膜の表面にグラフト重合により前記刺激応答性ポリマーを形成する工程とを含むことを特徴とする請求項10から14のいずれか1項に記載のセルアレイソータの製造方法。
- 基板の上に互いに間隔をおいて行列状に形成された複数の金属膜スポットと、前記各金属膜スポットの表面に固定され、外部からの刺激に応答して疎水性の強さが変化し且つ表面が細胞を特異的に認識する機能性分子表面により修飾された刺激応答性ポリマーとを備えたセルアレイソータを用い、
複数種類の細胞が含まれる細胞浮遊液と前記セルアレイソータとを接触させることにより、前記機能性分子が認識する細胞を、前記各金属膜スポットの表面に選択的に接着する工程と、
細胞が接着された前記セルアレイソータに対して外部から刺激を与えることにより、前記セルアレイソータから細胞を遊離させて回収する工程とを備え、
前記基板と前記金属膜スポットとは互いに異なる材料により形成され、
前記刺激応答性ポリマーは、前記各金属膜スポットの表面以外の部分には固定されていないことを特徴とする細胞ソート法。
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