DE102006000775A1

DE102006000775A1 - Bildgebendes Diagnoseverfahren

Info

Publication number: DE102006000775A1
Application number: DE200610000775
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Prof.Dr. Kiefer; Bernd Dipl.-Chem. Küstner; Alexander Prof.Dr. Marx; Sebastian Dr. Schlücker; Carsten Prof.Dr. Schmuck; Philipp Dr. Ströbel
Original assignee: Julius Maximilians Universitaet Wuerzburg
Current assignee: Julius Maximilians Universitaet Wuerzburg
Priority date: 2006-01-04
Filing date: 2006-01-04
Publication date: 2007-07-12

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein bildgebendes Diagnoseverfahren von immobilisierten Zellen zur Darstellung der räumlichen und gegebenenfalls zeitlichen Verteilung des Auftretens von Substanzen in den immobilisierten Zellen, wobei die immobilisierten Zellen mit mindestens einer Substanz versetzt werden, wobei an die Substanz ein Marker für die oberflächenverstärkte Schwingungsspektroskopie gebunden ist und räumlich aufgelöst die immobilisierten Zellen schwingungsspektroskopisch vermessen werden.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein bildgebendes Diagnoseverfahren zur Darstellung des Auftretens und der Verteilung von Stoffen bzw. Substanzen in immobilisierten Zellen, beispielsweise in einem Gewebe. Derartige Verfahren werden insbesondere in der medizinischen Diagnostik verwendet. Bildgebende schwingungsspektroskopische Verfahren, wie z.B. FT-IR- und Raman-Mikrospektroskopie, werden außer in der Gewebediagnostik auch in weiteren Bereichen von der Biologie bis zu den Materialwissenschaften zur Lösung vielfältiger Fragestellungen eingesetzt. Die durch diese bildgebenden Diagnoseverfahren erhaltenen Daten werden beispielsweise durch chemometrische Auswertemethoden, wie z.B. die Clusteranalyse ausgewertet.

Beispielsweise werden mittels Fourier-Transform-Infrarot(FTIR)-Mikrospektroskopie Proben Punkt für Punkt abgerastert (Mapping). Die Erfassung der spekt ralen Information erfolgt dabei punkt- oder linienweise, was mit einem hohen Zeitbedarf für die Datenaufnahme verbunden ist. Alternativ zu den Rasterverfahren ist es auch möglich, an einem Michelson-Interferometer ein mit einem Focal Plane Array(FPA)-Detektor ausgestattetes IR-Mikroskop anzukoppeln, so dass Tausende von Spektren simultan aufgenommen werden können. Bei dieser Detektion im Fernfeld ist jedoch das räumliche Auflösungsvermögen auf nur ca. 5 bis 25 μm begrenzt. Eine laterale Auflösung von ca. 1 μm lässt sich nur durch Kombination mit einem Synchrotron als Strahlungsquelle erzielen. Nachteilig sind hier jedoch die sehr hohen Kosten und die limitierten Zugangsmöglichkeiten zu einem Synchrotron.

Bei der Nahfeldmikroskopie wird die Beugungsgrenze unterschritten und es werden chemische Informationen auf einer Nanometerskala erhalten. Nahfeld-Raman- und Nahfeld-IR-Spektroskopie erfordern jedoch spezielle, kostenintensive Versuchsaufbauten und operieren zudem im zeitaufwendigen Rastermodus. Sie ermöglicht jedoch die Generierung von IR-Bildern mit extrem hoher Ortsauflösung von bis zu 30 nm, aufgrund der Verwendung schmalbandiger Infrarotlaserstrahlung als Anregungslichtquelle jedoch nur an einer vorgegebenen Wellenzahlposition. Sie ist somit nicht geeignet, um Gewebebiopsien mit subzellulärer Auflösung flächendeckend vollständig spektroskopisch zu charakterisieren.

Gegenüber der IR-Mikrospektroskopie besitzt die Raman-Mikrospektroskopie wegen der Verwendung von Laserlicht mit Wellenlängen vom ultravioletten bis in den nahinfraroten Spektralbereich ein deutlich höheres räumliches Auflösungsvermögen von einigen μm bis wenigen 100 nm. Aufgrund des geringen Streuquerschnittes vieler Substanzen, insbesondere biologi scher Proben, sind die Messzeiten bei der Raman-Mikrospektroskopie jedoch erheblich länger. Als bildgebende Verfahren (ortsaufgelöste Techniken) stehen hier zum einen die Punkt- und Linienbeleuchtung bei im Rastermodus operierenden Verfahren sowie die direkte Raman-Bildgebung zur Verfügung. Die ortsaufgelöste konventionelle Raman-Mikrospektroskopie eignet sich zusammenfassend jedoch aus Zeitgründen nicht für eine großflächige Charakterisierung von Gewebebiopsien mit subzellulärer Auflösung.

1 stellt die Verfahren der Infrarot- und Raman-Mikrospektroskopie gemäß dem Stand der Technik mit ihren Vor- und Nachteilen dar. Während, wie in den Teilbildern 1A und 1B beschrieben, mittels IR-Imaging eine komplette Gewebebiopsie in wenigen Minuten mit einer räumlichen Auflösung von ca. 10 μm vermessen werden kann, ist die Auflösung bei der Raman-Mikrospektroskopie (1A und 1C) mit ca. 1 μm erheblich besser, es kann jedoch mit begrenztem Zeitaufwand (mehrere Stunden) lediglich ein kleiner Ausschnitt der Biopsie vermessen werden.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren und Label hierfür anzugeben, mit dem bildgebende Diagnose an immobilisierten Zellen, wie beispielsweise substratgebundene Zellkulturen oder Geweben mit vertretbarem Zeitaufwand und sehr hoher Signalqualität durchgeführt werden kann.

Diese Aufgabe wird durch das bildgebende Diagnoseverfahren nach Anspruch 1 sowie das Label nach Anspruch 17 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen des erfindungsgemäßen Diagnoseverfahrens werden in den jeweiligen abhängigen Ansprüchen gegeben. Erfindungsgemäß wird ausgehend von den im Stand der Technik vorhande nen bildgebenden schwingungsspektroskopischen Verfahren vorgeschlagen, dass darzustellende Gewebe bzw. die darzustellende Zellkultur mit einer Substanz, beispielsweise einem Antikörper, zu versetzen, wobei an die Substanz ein Marker für die oberflächenverstärkte Schwingungsspektroskopie gebunden ist. Anschließend wird dann das Gewebepräparat oder die Zellkultur schwingungsspektroskopisch ortsaufgelöst vermessen.

Im Folgenden wird die Erfindung anhand eines Gewebepräparates beispielhaft erläutert. Sie ist jedoch gleichermaßen für jede Form von immobilisierten Zellen, beispielsweise auch für eine Zellkultur auf einem Trägermedium anwendbar.

Mittels derartigen gekoppelten, schwingungsspektroskopischen Markern ist es möglich, in Geweben die Verteilung bzw. das Auftreten der mit dem Marker versehenen Substanz ortsaufgelöst und auch in zeitlicher Auflösung nachzuweisen. Damit ist es dann auch möglich, die Verteilung bzw. das Auftreten von Bindungsstellen für die Substanz, beispielsweise im Falle eines Antikörpers von Epitopen, Peptiden oder Haptenen oder im Falle von Oligonukleotiden das Auftreten von RNA, insbesondere mRNA oder DNA und dergleichen nachzuweisen.

Das erfindungsgemäße Verfahren hat dabei den Vorteil, dass durch die Spezifität der einzelnen schwingungsspektroskopischen Marker es möglich ist, mehrere verschiedene Substanzen, d.h. Substanzen verschiedener Art, beispielsweise verschiedene chemische Verbindungen oder Antikörper mit verschiedenen Bindungsspezifitäten, mit jeweils einem anderen Marker zu versehen. Dadurch ist ein Multiplexing (zeitgleicher Nach weis mehrerer verschiedener Substanzen) möglich.

Als Substanzen können beispielsweise Antikörper zum Nachweis von Proteinen, Peptiden, Epitopen und/oder Haptenen, Oligonukleotide zum Nachweis von Nukleinsäuren oder auch Substanzen, wie Hormone, Proteine, Peptide, RNA, Kohlehydrate oder Wirksubstanzen, wie Arzneimittel, in Frage, deren Aufnahme in die Zellen, Verbleib in den Zellen und Abbau oder Ausscheidung in oder aus den Zellen mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erfasst werden kann.

Der Unterschied zur Fluoreszenz-Mikroskopie ist beispielsweise in 2 erläutert, wo in 2A die spektroskopischen Banden einer fluoreszenzmarkierten Probe dargestellt sind. Die Halbwertsbreiten von Fluoreszenzemissionen sind derart groß, dass nur eine limitierte Anzahl verschiedener Fluoreszenzmarker (Fluorophore) gleichzeitig eingesetzt werden können. Im Gegensatz hierzu ist die in 2B zu erkennende Halbwertsbreite der Spektrallinien in der Raman-Spektroskopie derart gering, dass eine Vielzahl von einzelnen Markern gleichzeitig eingesetzt werden können. In 2B ist das Raman-Spektrum von Benzol dargestellt, während in 3 das Raman-Spektrum von insgesamt fünf Raman-Markern in fünf verschiedenen Wellenzahlenbereichen (I bis V) dargestellt wird. Es ist zu erkennen, dass jeder dieser Raman-Marker sehr spezifische Schwingungsbanden aufweist, die eine Unterscheidung zwischen den einzelnen Raman-Markern ohne weiteres ermöglicht.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht also zeitgleich eine Vielzahl von verschiedenen Substanzen nachzuweisen (Multiplexierung).

Zum Nachweis der Marker für die oberflächenverstärkte Schwingungsspektroskopie eignet sich zum einen die Raman-Mikrospektroskopie, jedoch sind auch weitere schwingungsspektroskopische Techniken, wie die oberflächenverstärkte Infrarot-Absorption sowie die oberflächenverstärkte kohärente Anti-Stokes-Raman-Streuung (CARS) anwendbar.

Bei Einsatz der oberflächenverstärkten Infrarotabsorption ist es erforderlich, das Gewebe zuerst ohne Marker als Referenz und dann mit Markern zu vermessen. Aus der Differenz erhält man dann die Information über die oberflächenverstärkten IR-Banden.

Als Marker für die oberflächenverstärkte Schwingungsspektroskopie werden herkömmlicherweise Moleküle verwendet, die an Metallpartikel durch Adsorption, kovalente bzw. ionische chemische Bindungen oder andere Wechselwirkungen gebunden sind. Zwar ist eine Vielzahl von Partikeln, also Metallen und Metall-Legierungen, insbesondere Edelmetallen, möglich, jedoch ist es besonders vorteilhaft, hierzu Gold- oder Silber-Nanopartikel zu verwenden. Diese können beispielsweise über ein Schwefelatom an den schwingungsspektroskopischen Marker gebunden werden. Für biomedizinische Anwendungen besitzt Gold den Vorteil einer hohen chemischen Inertheit. Um eine möglichst hohe Oberflächenverstärkung zu ermöglichen, sollte die verwendete Anregungswellenlänge bzw. das Stokes-Streulicht im Maximum der Plasmonenresonanz der Partikel liegen.

Die Wellenlänge des Maximums der Plasmaresonanz lässt sich über verschiedene Parameter kontrollieren: bei Vollkugeln z.B. durch Einstellung des Durchmessers, bei Hohlkugeln u.a. auch durch das Kern/Schale- Verhältnis. Der Einsatz von Hohlkugeln beispielsweise ermöglicht die Anregung mit Nahinfrarotstrahlung (beispielsweise 785 nm), wodurch die zugleich auftretende Fluoreszenzemission minimiert wird. Auch die Gestalt der Metallpartikel kann frei gewählt und an die jeweiligen Bedürfnisse angepasst werden. So sind beispielsweise auch zylinder- oder prismenförmige Partikel möglich, die eine hohe SERS-Verstärkung zeigen.

Für eine Quantifizierung der Substanzkonzentration über die gemessenen Signalintensitäten ist es wichtig, möglichst monodisperse Metallpartikel herzustellen, da eine schmale Verteilung des Partikeldurchmessers beispielsweise bei der oberflächenverstärkten Raman-Spektroskopie über die einheitliche Lage der Plasmonenresonanz eine sehr ähnliche SERS-Verstärkung sicherstellt. Zudem sollte ein gleichförmiger Bedeckungsgrad der Nanopartikel mit Raman-Labeln vorliegen.

Als schwingungsspektroskopische Marker, insbesondere für die oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie, eignen sich bifunktionelle Markermoleküle, die zum einen eine Gruppe aufweisen, die zur Anbindung an Metallpartikel, insbesondere Goldpartikel, geeignet ist. Eine derartige Gruppe kann beispielsweise eine Thiolgruppe bzw. ein Disulfid sein, die eine sulfidische Bindung zu dem Metallpartikel ermöglicht. Im Falle der Verwendung eines Antikörpers als Substanz kann der bifunktionelle Marker eine Gruppe aufweisen, die sich zur Konjugation mit dem Antikörper eignet, beispielsweise durch Ausbildung einer Amidbindung zwischen dem Marker und dem Antikörper.

Für die oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie sind als Marker insbesondere Triazole und deren Derivate, ggf. jedoch nicht Benzotriazole, geeignet. Weitere Raman-Marker entstammen der Gruppe der Aromaten oder Heteroaromaten mit mindestens einem Thiolrest.

Besonders vorteilhaft werden Benzolderivate eingesetzt, die eine erste Gruppe aufweisen, die mit einem Antikörper über eine Amidbindung konjugiert sowie einen Thiolrest bzw. ein Disulfid als weitere Gruppe, die der Anbindung eines Metallpartikels über ein Schwefelatom dient.

Für die Auswahl geeigneter schwingungsspektroskopischer Marker, insbesondere von Raman-Markern, sind bei dem vorgeschlagenen, erfindungsgemäßen bildgebenden Verfahren einige Kriterien zu beachten bzw. hilfreich. Diese sind im folgenden als Liste hierarchisch angeordneter Kriterien dargestellt.

1. Eindeutigkeit der Beziehung zwischen Substanz und Label: jeder Label muss mindestens eine spektrale Komponente aufweisen, die eine eindeutige Unterscheidung von allen anderen Labeln erlaubt. Hierbei kann es sich um spektrale Beiträge einzelner Schwingungsbanden oder um Parameter aus multivariaten bzw. chromatischen Verfahren, wie z.B. der Hauptkomponenten-Analyse (PCA: principal component analysis) handeln.
2. Die Möglichkeit der Konjugation mit Metallpartikeln, wie Gold- oder Silber-Nanopartikeln, und Substanz: die als Vorstufen eingesetzten Label müssen bifunktionell sein, um sich mit Metall-Nanopartikeln und Substanzen in Label transformieren zu lassen.
3. Das Potential für eine Ausdehnung auf eine möglichst große Anzahl von nebeneinander einsetzbaren Labeln: die spektrale Dichte der lokal durch die (Nano)Partikel verstärkten Schwingungen bzw. Normalmoden darf nicht zu hoch sein, um eine Überlagerung der Schwingungsbanden und damit eine Beeinträchtigung des Multiplexing-Vorteils zu vermeiden.
4. Der differentielle Streuquerschnitt der zum Nachweis eingesetzten Raman-Banden sollte möglichst hoch sein: aromatische Komponenten eignen sich daher z.B. sehr gut für den Einsatz als Raman-Label.
5. Vermeidung von Kreuzreaktivitäten: die Label dürfen keine reaktiven Funktionalitäten wie z.B. Aminogruppen besitzen, die zu unerwünschten Konkurrenzreaktionen bei der Konjugation mit der Substanz, beispielsweise dem Antikörper, führen könnten.
6. Die Löslichkeit in wässriger Lösung sollte für die Umsetzung mit den Metall-Kolloiden und den Substanzen, beispielsweise Antikörpern, nicht zu gering sein.

Im Folgenden werden einige Beispiele erfindungsgemäßer Verfahren und erfindungsgemäßer Marker dargestellt.
Es zeigen
1 einen Vergleich zwischen herkömmlicher Infrarot- und herkömmlicher Raman-Mikrospektroskopie hinsichtlich Zeitaufwand (A) und Orts-Auflösungsvermögen (B, C);
2 einen Vergleich der Linienbreiten in der Fluoreszenz- (A) und Raman-Spektroskopie (B) im Hinblick auf das Potential für eine Multiplex-Detektion;
3 die charakteristischen Banden in den Spektren von fünf verschiedenen Raman-Labeln, Demonstration der Multidetektionskapazität anhand dieses Modellsystems;
4 Messungen an einem Marker für die oberflächenverstärkte Raman-Mikrospektroskopie konjugiert an ein Modellsystem;
5 Schematische Darstellung der Herstellung des entsprechenden Labels aus 4;
6 Messungen mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens im Epithel von Prostata-Gewebeschnitten;
7 die Darstellung einer ortsaufgelösten Multiplex-Mikrospektroskopie.
4 zeigt die Messung der Oberflächenverstärkung für goldkonjugierte Raman-Marker bei Nahinfrarotanregung.
4A zeigt dabei die Strukturformel des SERS-Labels; 4B ein TEM-Bild hohler Goldnanopartikel; 4C ein lichtmikroskopisches Bild von Polystyrolmikrokugeln; und 4D das NIR-Raman-Spektrum einer monomolekularen Schicht des SERS-Labels aus 4A, das auf die Polystyrolmikroku geln aus 4C aufgebracht wurde.
Bei der Messung zu 4 wurde Nahinfrarotanregung bei 785 nm gewählt, da hierdurch auftretende Fluoreszenz minimiert werden kann. Die Anregung kann aber auch im UV- oder im sichtbaren Spektralbereich erfolgen, da die Fluoreszenz bei SERS häufig gequencht (gelöscht) wird.
Es wurden Goldnanopartikel hergestellt, deren Plasmonenresonanz möglichst weit im nahinfraroten Spektralbereich liegt. Die in 4B dargestellten Partikel wurden ausgehend von Silber-Nanopartikeln hergestellt. Das Maximum ihrer Plasmonenresonanz liegt bei 700 nm.
Als SERS-Label dient der in 4A dargestellte Succinimidester. Dieses aromatische Raman-Label wurde durch Umsetzung von kommerziell erhältlicher 5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure) mit N-Hydroxysuccinimid (NHS) und Dicyclohexylcarbodiimid (DCD) in trockenem THF erhalten. Die weitere Umsetzung des Disulfid-Succinimidesters aus 4A mit den in 4B gezeigten hohlen Goldnanopartikeln erfolgte wie in 5 dargestellt und führte zur Bindung der Goldnanopartikel an das Label über ein Schwefelatom. Die so an Goldpartikel gekoppelten SERS-Label wurden durch anschließendes Zentrifugieren abgetrennt.
Als Modellreaktion für die weitere Konjugation dieses goldgekoppelten SERS-Labels an eine freie Aminogruppe von beispielsweise Lysinresten eines Antikörpers, wie sie in 5 dargestellt ist, dient in 4 die Anbindung an Polystyrolmikrokugeln. Diese besitzen eine monomolekulare Schicht eines Spacers mit freien terminalen Aminogruppen. Die Reaktion des SERS-Labels aus 4A mit diesen freien Aminogruppen auf den Polystyrolmikrokugeln aus 4C erfolgt durch einfache Zugabe bei Raumtemperatur. Die erfolgreiche Umsetzung ist an einer Farbänderung der Mikrokugeln zu erkennen. Damit wird dann das SERS-Label über eine Amidbindung an die Mikrokugeln gebunden.
In 4D ist das mittels Nahinfrarotanregung bei 785 nm erhaltene Raman-Spektrum dieses an die Polystyrolmikrokugeln gebundenen oberflächenverstärkten SERS-Labels dargestellt. Bei 1330 cm^–1 tritt eine dominante Raman-Bande auf, die sich der Streckschwingung der Nitrogruppe zuordnen lässt. Aufgrund der Abstandsabhängigkeit des oberflächenverstärkten Raman-Effekts werden nur Banden des Raman-Labels selektiv verstärkt, nicht jedoch diejenigen des Antikörpers oder der Mikrokugeln. In dem Raman-Spektrum in 4D sind folglich lediglich Beiträge einer monomolekularen Schicht von SERS-Labeln zu finden, während keinerlei Polystyrolbanden beobachtet werden. Dies ermöglicht die erfindungsgemäß hohe Sensitivität und Selektivität der Methodik und über die Auswahl geeigneter Reste R statt der Nitrogruppe in 4A auch den Nachweis einer Vielzahl von verschiedenen Antigenen im Gewebe (Multiplexingkapazität), sofern Label mit verschiedenen Resten R mit jeweils Antikörpern verschiedener Spezifität gekoppelt werden.
Die Herstellung der sowohl Metallpartikel gekoppelten als auch Antikörper konjugierten schwingungsspektroskopischen Labeln erfolgt also in zwei verschiedenen Schritten für die bispezifischen Marker (Label).
Zum einen werden die Label mit geeigneten Goldnanopartikel durch einfaches Rühren bei Raumtemperatur umgesetzt. Um die Reaktion der Disulfide mit dem kol loidalen Gold zu beschleunigen, kann die Reaktionsmischung jedoch auch erhitzt werden. Durch Zentrifugation lassen sich die Label vom Reaktionsgemisch trennen, wobei eine Kombination aus Waschen und erneutem Zentrifugieren vorteilhafterweise mehrmals hintereinander durchgeführt wird, um die Label zu reinigen.
Anschließend erfolgt die Konjugation der Label mit den Antikörpern über eine Amidbindung zwischen der Aminogruppe von Lysinresten des Antikörpers mit dem Carbonylkohlenstoff des Labels.
Eine Reinigung des Immun-SERS-Labels kann durch Abtrennen evtl. noch vorhandener Verunreinigungen, z.B. durch chromatographische Methoden, wie HPLC, CE, Affinitätschromatographie o.ä. erfolgen.
Im Ergebnis befindet sich an der Oberfläche von ca. 20 bis 80 nm großen Goldpartikeln, die besonders vorteilhaft eingesetzt werden können, da sie NIR-Anregung ermöglichen, viele dieser Label. Diese garantieren eine entsprechend hohe Signalverstärkung.
6 zeigt einen in-situ-Nachweis von Immun-SERS-Labeln im Epithelgewebe der Prostata gemäß dem vorliegenden Verfahren. Hierzu wurde ein Mikroskop verwendet, dem ein Gitterspektrometer mit CCD-Detektor nachgeordnet war.
Hierzu wurde der SERS-Label aus 5 mit einem Antikörper für das prostataspezifische Antigen (PSA) bei Raumtemperatur umgesetzt, abzentrifugiert und in PBS-Puffer aufgenommen. Das paraffinierte Gewebe eines Patienten wurde mit Hilfe von Standardprotokollen vom Pathologischen Institut für die Immun-Histochemie vorbereitet. Nach der Deparaffinierung des Gewebe schnittes mit Xylol, einer Serie von Ethanol/Wasser-Mischungen und abschließend reinem Wasser zur Rehydratisierung, wurde das Antigen-Retrieval mittels Citrat-Puffer durchgeführt. Die Inkubation des Antikörpers erfolgte über 90 min, anschließend wurde mehrmals gründlich mit PBS-Puffer gewaschen. Die Raman-mikrospektroskopischen Experimente wurden an Epithelgewebe mit einer Anregungswellenlänge von 632,8 nm, einer Belichtungszeit von 20 sec und einem 50x-Mikroskop-Objektiv durchgeführt. In 6 sind die Struktur des Immun-SERS-Labels (6A), das in-situ im Epithel-Gewebe detektierte Raman-Spektrum des Labels (6B) und das dazugehörige Lichtmikroskopbild des Schnittes (6C) dargestellt. Die intensive und charakteristische Raman-Bande bei ca. 1330 cm^–1 in 6B lässt sich der Nitrogruppierung zuordnen; die Stelle im Epithel, an welcher dieses Raman-Spektrum erhalten wurde, ist in 6C mit einem Pfeil markiert. Dieses Ergebnis wurde durch Messungen an weiteren Epithelregionen experimentell verifiziert.
7 zeigt zusammenfassend nochmals das Konzept der vorliegenden Erfindung. Demgemäß werden verschiedene Bindungseinheiten, beispielsweise Peptide, Proteine, Epitope oder auch Haptene mittels eines SERS-Label-konjugierten Antikörpers auf einem Gewebeschnitt oder dergleichen markiert. Nunmehr wird, beispielsweise in 7 im Falle von insgesamt 15 oder mehr verschiedenen Antikörpern mit 15 oder mehr verschiedenen SERS-Labeln, ortsaufgelöst das Raman-Spektrum bestimmt. Es ergeben sich damit 15 oder mehr verschiedene Bilder, wie sie in 7 dargestellt sind, welche die räumliche Verteilung bzw. das entsprechende Auftreten der jeweiligen Bindungsstelle zum jeweiligen Antikörper darstellen. Es ist damit also möglich, eine Multiplex-Schwingungsspektroskopie mit einer Vielzahl von Markern durchzuführen und so zeitgleich eine Vielzahl von Informationen über die Verteilung eines Stoffes in einem Gewebe bzw. in Zellen zu erhalten.

Claims

Bildgebendes Diagnoseverfahren von immobilisierten Zellen zur Darstellung der räumlichen und gegebenenfalls zeitlichen Verteilung des Auftretens von Substanzen in den immobilisierten Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass die immobilisierten Zellen mit mindestens einer Substanz versetzt werden, wobei an die Substanz ein Marker für die oberflächenverstärkte Schwingungsspektroskopie gebunden ist, und räumlich aufgelöst die immobilisierten Zellen schwingungsspektroskopisch vermessen werden.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die immobilisierten Zellen mit Substanzen mehrerer verschiedener Arten versetzt werden, wobei an Substanzen verschiedener Arten jeweils verschiedene Marker für die oberflächenverstärkte Schwingungsspektroskopie gebunden sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Marker für die oberflächenverstärkte Schwingungsspektroskopie jeweils einen schwingungsspektroskopischen Marker aufweisen, an den zumindest ein Metallpartikel gekoppelt ist.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Marker für die oberflächenverstärkte Schwingungsspektroskopie Partikel aus Metall oder Metall-Legierungen, bevorzugt Gold (Au) oder Silber (Ag), aufweisen.
Verfahren nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Metallpartikel Nanopartikel sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Metallpartikel eine monodisperse Größenverteilung bzw. eine schmale Verteilung der Partikeldurchmesser und/oder einen einheitlichen Bedeckungsgrad mit Raman-Labeln aufweisen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die schwingunsgspektroskopischen Marker über ein Schwefelatom bzw. eine sulfidische Bindung oder ein Triazol an die Metallpartikel gekoppelt sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die schwingunsspektroskopischen Marker Benzolderivate, Aromate, Heteroaromate und/oder Triazolderivate sind.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die schwingungsspektroskopischen Marker Triazolderivate, nicht jedoch Benzotriazolderivate sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine, mehrere oder alle Substanzen Hormone, Proteine, Peptide, kleine Peptide, Nukleinsäuren, DNA, RNA, mRNA, Kohlehydrate, Wirkstoffe, Arzneimittel oder dergleichen sind oder diese enthalten.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine, mehrere oder alle Substanzen Bindungsstellen für Zellbestandteile aufweisen und aus dem Auftreten der Zellbestandteile das räumliche und/oder zeitliche Auftreten der Zellbestandteile bestimmt wird.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanzen Antikörper oder Oligonukleotide sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die immobilisierten Zellen mittels oberflächenverstärkter Raman-Streuung (SERS) und/oder oberflächenverstärkter kohärenter Anti-Stokes-Raman-Streuung (CARS) vermessen wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die immobilisierten Zellen mittels oberflächenverstärkter Infrarotabsorption (SEIRA) vermessen wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die immobilisierten Zellen unter Anregung im ultravioletten (UV) und/oder sichtbaren (VIS) Wellenlängenbereich und/oder im nahen Infrarot(NIR)-Wellenlängenbereich vermessen wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die immobilisierten Zellen Gewebepräparate, Gewebeschnitte oder auf Trägern oder Substraten befindliche Zellkulturen sind.
Label für die bildgebende Diagnose von immobilisierten Zellen, gekennzeichnet durch eine Substanz, an die ein Marker für die oberflächenverstärkte Schwingungsspektroskopie gebunden ist, der einen schwingungsspektroskopischen Marker aufweist, an den zumindest ein Metallpartikel gebunden ist.
Marker nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Marker für die oberflächenverstärkte Schwingungsspektroskopie Partikel aus Metall oder Metall-Legierungen, bevorzugt Gold (Au) oder Silber (Ag), aufweisen
Marker nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Metallpartikel Nanopartikel sind.
Marker nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Metallpartikel eine monodisperse Größenverteilung bzw. eine schmale Verteilung der Partikeldurchmesser und/oder einen einheitlichen Bedeckungsgrad mit Raman-Labeln aufweisen.
Marker nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die schwingunsgspektroskopischen Marker über ein Schwefelatom bzw. eine sulfidische Bindung oder ein Triazol an die Metallpartikel gekoppelt sind.
Marker nach einem der Ansprüche 17 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die schwingunsspektroskopischen Marker Benzolderivate, Aromate, Heteroaromate und/oder Triazolderivate sind.
Marker nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die schwingungsspektrosko pischen Marker Triazolderivate, nicht jedoch Benzotriazolderivate sind.
Marker nach einem der Ansprüche 17 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine, mehrere oder alle Substanzen Hormone, Proteine, Peptide, kleine Peptide, Nukleinsäuren, DNA, RNA, mRNA, Kohlehydrate, Wirkstoffe, Arzneimittel oder dergleichen sind oder diese enthalten.
Marker nach einem der Ansprüche 17 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine, mehrere oder alle Substanzen Bindungsstellen für Zellbestandteile aufweisen und aus dem Auftreten der Zellbestandteile das räumliche und/oder zeitliche Auftreten der Zellbestandteile bestimmt wird.
Marker nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanzen Antikörper oder Oligonukleotide sind.