CN103906848B - 用于检测等位变体的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于区分不同等位基因之间序列变异的组合物、方法和试剂盒。更具体地，在一些实施方案中，本发明提供了以高灵敏度和/或特异性确定稀有(例如，突变)等位变体(如单核苷酸多态性(SNP)或核苷酸插入或缺失)在包含丰富(例如，野生型)等位变体的样品中的存在和/或水平(例如，定量)的组合物、方法和试剂盒。由此，在某些实施方案中，本发明提供了用于例如与非常低水平的突变等位基因相比，在含有丰富水平的野生型等位基因的样品中检测体细胞突变的高度选择性方法。

Description

用于检测等位变体的组合物和方法
相关申请的交互引用
本申请要求2011年8月18日提交的美国临时申请号61/525,137和2012年1月18日提交的美国临时申请号61/588,151的优先权，所述申请的公开内容在此通过引用的方式完整并入用于全部目的。
发明背景
单核苷酸多态性(SNP)是人类基因组中最常见类型的遗传多样性，在人类基因组DNA中以1,000个核苷酸中约一个SNP或更低的频率出现(Kwok,Ann.Rev.Genom.Hum.Genet.,2:235-258(2001))。SNP已经涉及遗传病、对不同疾病的易感性、药物不良反应素质，并用于法医研究中。因此，SNP(或稀有突变)检测在诊断早期疾病方面提供巨大潜力，如检测血液中的循环型肿瘤细胞，用于出生前诊断以及用于检测混合细胞群体中疾病相关性突变。
已经基于涉及杂交、连接或DNA聚合酶的方法开发了用于SNP基因分型的众多方案(Chen等人,PharmacogenomicsJ.,3:77-96(2003))。例如，等位基因特异性聚合酶链反应(AS-PCR)是广泛使用的用于检测DNA序列变异的策略(Wu等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:2757-2760(1989))。如其名称提示的那样，AS-PCR是基于PCR的方法，其中将一条或两条引物设计成在序列变异位点处复性，这允许在同一基因的不同等位基因之间区分的能力。AS-PCR利用DNA聚合酶的忠实性，其中与具有匹配3'碱基的引物相比，所述DNA聚合酶以低得多的效率延伸具有错配3'碱基的引物，效率低100至100,000倍(Chen等人,PharmacogenomicsJ.,3:77-96(2003))。延伸错配引物的困难导致削弱了本可以轻易检测到的PCR扩增。
然而，AS-PCR的特异性和选择性很大程度上依赖于PCR指数扩增性质，这使得等位基因区分能力快速衰减。即使将引物设计成匹配特定变体以选择性地仅扩增该变体，实际上，显著的错配扩增经常出现。另外，AS-PCR区分等位变体的能力可能受突变类型或包围该突变或SNP的序列(Ayyadevara等人,Anal.Biochem.,284:11-18(2000))、样品中存在的等位变体的量以及备选的等位基因之间的比率影响。总体上，这些因素经常是假阳性结果频繁出现的原因，导致许多研究者试图增加AS-PCR的可靠性(Orou等人,Hum.Mut.,6:163-169(1995)；Imyanitov等人,Biotechniques,33:484-490(2002)；McKinzie等人,Mut.Res.,517:209-220(2002)；Latorra等人,Hum.Mut.,22:79-85(2003))。
用于区分等位变异的涉及探针杂交方法的另一项技术是基因分型。然而，如同AS-PCR，使用这种方法的选择性有限并且不适于检测混合样品中的稀有(≥1,000中的1个)等位基因或突变。
由此，本领域需要以增加的灵敏度和特异性针对千倍或更多过量的野生型等位基因背景检测单一点置换(例如，SNP)、插入或缺失的改进组合物和方法。本发明满足这种需要并且还提供相关优点。
发明概述
本发明提供用于区分不同等位基因之间序列变异的组合物、方法和试剂盒。更具体地，在一些实施方案中，本发明提供了以高灵敏度和/或特异性确定稀有(例如，突变)等位变体(如单核苷酸多态性(SNP)或核苷酸插入或缺失)在包含丰富(例如，野生型)等位变体的样品中的存在和/或水平(例如，定量)的组合物、方法和试剂盒。由此，在某些实施方案中，本发明提供了用于例如与非常低水平的突变等位基因相比，在含有丰富水平的野生型等位基因的样品中检测体细胞突变的高度选择性方法。
在一个方面，本发明提供用于鉴定和/或定量核酸样品中等位变体的组合物。在某些实施方案中，本发明的组合物可以包含以下一种、两种、三种或更多种：(a)等位基因特异性引物；(b)等位基因特异性阻断探针；(c)检测探针；和/或(d)基因座特异性引物。
在一些实施方案中，等位基因特异性引物包含靶特异性部分和等位基因特异性核苷酸部分。在一些实施方案中，等位基因特异性引物还可以包含尾。在一些示例性实施方案中，该尾位于等位基因特异性引物的5'末端处。在其他实施方案中，等位基因特异性引物的尾具有重复的鸟嘌呤和胞嘧啶残基(“富含GC”)。在一些实施方案中，整个等位基因特异性引物的解链温度(“Tm”)是从约50℃至约67℃。在一些实施方案中，等位基因特异性引物浓度在约20-900nM之间。
在一些实施方案中，等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分位于3'末端处。作为非限制性例子，当检测和/或定量其中“A”是突变等位基因的多态性位点时，使用“T”作为等位基因特异性引物的3'等位基因特异性核苷酸部分。作为另一个非限制性例子，当检测和/或定量其中“G”是突变等位基因的多态性位点时，使用“C”作为等位基因特异性引物的3'等位基因特异性核苷酸部分。
在一些实施方案中，等位基因特异性阻断探针在3'末端包含不可延伸性阻断部分。阻断部分可以包含对寡核苷酸的核糖环3'-OH的任何修饰，所述修饰防止由聚合酶添加其他碱基至寡核苷酸序列的3'末端。在一些示例性实施方案中，不可延伸性阻断部分包括但不限于任选取代的C1-C24烷基二醇(例如，3'-己二醇修饰)，任选取代的C2-C24烯基二醇，任选取代的C2-C24炔基二醇、小沟结合物(MGB)、胺(NH2)、生物素、PEG、PO4及它们的组合。在优选的实施方案中，不可延伸性阻断部分包含任选取代的C1-C24烷基二醇(例如，3'-己二醇修饰)。在某些情况下，等位基因特异性阻断探针的等位基因特异性核苷酸部分远离等位基因特异性阻断探针的阻断部分约5个至约15个或约5个至约10个核苷酸，如约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸存在。在某些其他情况下，等位基因特异性阻断探针在PCR扩增期间不被切割。在另外的情况下，等位基因特异性阻断探针的Tm是约58℃至约66℃。
在某些实施方案中，不可延伸性阻断部分不包含或不包括小沟结合物(MGB)。在某些其他实施方案中，不可延伸性阻断部分不包含或不包括PO4基团。在其他实施方案中，不可延伸性阻断部分基本上由任选取代的C1-C24烷基二醇(例如，3'-己二醇修饰)、任选取代的C2-C24烯基二醇或任选取代的C2-C24炔基二醇组成或由其组成。
在一些实施方案中，等位基因特异性阻断探针和/或等位基因特异性引物包含至少1、2、3、4、5或6个(例如，不连续)碱基、糖和/或主链修饰。在某些情况下，所述修饰可以增加匹配和错配的靶序列之间的Tm差异和/或降低错配引发效率，因而改善测定法特异性和/或选择性。这类修饰的非限制性例子包括锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、苏糖核酸(TNA)、拉链核酸(ZNA)、三唑核酸、5'甲基-脱氧胞苷、2'-氟修饰的核酸、8-氮杂-7-去氮杂-dA(ppA)、8-氮杂-7-去氮杂-dG(ppG)、2'-脱氧假异胞苷(异dC)、5-氟-2'-脱氧尿苷(fdU)和2'-O,4'-C-亚乙基桥接的核酸(ENA)修饰以及这些修饰的组合。在优选的实施方案中，在等位基因特异性阻断探针和/或等位基因特异性引物上存在的修饰包含一个或多个LNA修饰。在某些实施方案中，该修饰位于(a)3'末端处、(b)5'末端处、(c)内部位置处或在等位基因特异性阻断探针和/或等位基因特异性引物内部的(a)、(b)或(c)的任何组合处。在一些优选的实施方案中，修饰(例如，LNA)位于等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分处，从而所修饰残基的核苷包含用来在等位变体之间区分的核碱基。在其他优选实施方案中，修饰(例如，LNA)位于等位基因特异性阻断探针的等位基因特异性核苷酸部分处，从而所修饰残基的核苷包含用来在等位变体之间区分的核碱基。
在一些实施方案中，检测探针包含基于序列的或基因座特异的检测探针。在其他实施方案中，检测探针包含5'核酸酶探针。在一些示例性实施方案中，检测探针包含MGB部分、报道分子部分(例如，FAMTM、TETTM、JOETM、VICTM或Green)、猝灭剂部分(例如，黑洞猝灭剂TM或TAMRATM)和/或被动参比(例如，ROXTM)。在一些实施方案中，根据美国专利号6,727,356中描述的方法和原理设计检测探针，所述文献的公开内容通过引用的方式完整并入本文。在具体的实施方案中，检测探针包含探针(AppliedBiosystems，FosterCity，CA)。
在一些实施方案中，本发明的组合物还可以包含聚合酶；脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)；适于扩增的其他试剂和/或缓冲剂；和/或模板序列或核酸样品。在一些实施方案中，聚合酶可以是DNA聚合酶。在一些其他实施方案中，聚合酶可以是热稳定性的，如TaqDNA聚合酶。在其他实施方案中，模板序列或核酸样品可以是DNA，如基因组DNA(gDNA)或互补性DNA(cDNA)。在其他实施方案中，模板序列或核酸样品可以是RNA，如信使RNA(mRNA)。
在另一个方面，本发明提供用于扩增等位基因特异性序列的方法。这些方法中的一些可以包括以下一种或多种：(a)将等位基因特异性引物与包含第一等位基因(等位基因-1)的第一核酸分子杂交；(b)将等位基因特异性阻断探针与包含第二等位基因(等位基因-2)的第二核酸分子杂交，其中等位基因-2对应与等位基因-1相同的基因座；(c)将检测探针与第一核酸分子杂交；(d)将基因座特异性引物与等位基因特异性引物的延伸产物杂交；和(e)PCR扩增包含等位基因-1的第一核酸分子。
在又一个方面，本发明提供用于检测和/或定量包含其他等位基因的汇集或混合样品中等位变体的方法。这些方法中的一些可以包括以下一种或多种：(a)将第一等位基因特异性引物与包含第一等位基因(等位基因-1)的第一核酸分子在第一反应混合物中杂交并且将第二等位基因特异性引物与包含第二等位基因(等位基因-2)的第一核酸分子在第二反应混合物中杂交，其中等位基因-2对应与等位基因-1相同的基因座；(b)将第一等位基因特异性阻断探针与包含等位基因-2的第二核酸分子在第一反应混合物中杂交并且将第二等位基因特异性阻断探针与包含等位基因-1的第二核酸分子在第二反应混合物中杂交；(c)将第一检测探针与第一核酸分子在第一反应混合物中杂交并且将第二检测探针与第一核酸分子在第二反应混合物中杂交；(d)将第一基因座特异性引物与第一等位基因特异性引物的延伸产物在第一反应混合物中杂交并且将第二基因座特异性引物与第二等位基因特异性引物的延伸产物在第二反应混合物中杂交；(e)PCR扩增第一核酸分子以形成扩增子第一集合或样品并PCR扩增第二核酸分子以形成扩增子第二集合或样品；和(f)将扩增子第一集合与扩增子第二集合比较以定量包含等位基因-2的样品中的等位基因-1和/或包含等位基因-1的样品中的等位基因-2。
在一些实施方案中，第一和/或第二等位基因特异性引物包含靶特异性部分和等位基因特异性核苷酸部分。在一些实施方案中，第一和/或第二等位基因特异性引物还可以包含尾。在一些实施方案中，整个第一和/或第二等位基因特异性引物的Tm是从约50℃至约67℃。在一些情况下，第一和/或第二等位基因特异性引物的浓度在约20-900nM之间。
在一些实施方案中，第一等位基因特异性引物的靶特异性部分和第二等位基因特异性引物的靶特异性部分包含相同序列。在其他实施方案中，第一等位基因特异性引物的靶特异性部分和第二等位基因特异性引物的靶特异性部分是相同序列。
在一些实施方案中，尾位于第一和/或第二等位基因特异性引物的5'末端处。在一些实施方案中，第一等位基因特异性引物的5'尾和第二等位基因特异性引物的5'尾包含相同序列。在其他实施方案中，第一等位基因特异性引物的5'尾和第二等位基因特异性引物的5'尾是相同序列。在其他实施方案中，第一和/或第二等位基因特异性引物的尾富含GC。
在一些实施方案中，第一等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分是对SNP的第一等位基因(等位基因-1)特异的并且第二等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分是对相同SNP的第二等位基因(等位基因-2)特异的。在一些实施方案中，第一和/或第二等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分位于3'-末端处。在一些实施方案中，选择第一和/或第二等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分涉及高度区分性碱基的使用。
在某些其他实施方案中，第一和/或第二等位基因特异性阻断探针独立地在3'末端包含不可延伸性阻断部分。阻断部分可以包含对寡核苷酸的核糖环3'-OH的任何修饰，所述修饰防止由聚合酶添加其他碱基至寡核苷酸序列的3'末端。在示例性实施方案中，不可延伸性阻断部分包括但不限于任选取代的C1-C24烷基二醇(例如，3'-己二醇修饰)，任选取代的C2-C24烯基二醇，任选取代的C2-C24炔基二醇、小沟结合物(MGB)、胺(NH2)、生物素、PEG、PO4及它们的组合。在优选的实施方案中，不可延伸性阻断部分包含任选取代的C1-C24烷基二醇(例如，3'-己二醇修饰)。在某些情况下，第一和/或第二等位基因特异性阻断探针的等位基因特异性核苷酸部分远离第一和/或第二等位基因特异性阻断探针的阻断部分约5个至约15个或约5个至约10个核苷酸，如约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸存在。在某些其他情况下，第一和/或第二等位基因特异性阻断探针在PCR扩增期间不被切割。在另外的情况下，第一和/或第二等位基因特异性阻断探针的Tm是约58℃至约66℃。
在某些实施方案中，第一和/或第二等位基因特异性阻断探针中的不可延伸性阻断部分不包含或不包括小沟结合物(MGB)和/或PO4基团。在某些其他实施方案中，第一和/或第二等位基因特异性阻断探针中的不可延伸性阻断部分基本上由任选取代的C1-C24烷基二醇(例如，3'-己二醇修饰)、任选取代的C2-C24烯基二醇或任选取代的C2-C24炔基二醇组成或由其组成。
在一些实施方案中，第一和/或第二等位基因特异性阻断探针和/或第一和/或第二等位基因特异性引物包含至少一个核酸修饰。在一些实施方案中，所述修饰可以增加匹配和错配的靶序列之间的Tm差异和/或降低错配引发效率，因而改善测定法特异性和/或选择性。这类修饰的例子包括但不限于修饰的碱基、核酸类似物和本文所述的核糖修饰核酸如锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、苏糖核酸(TNA)、拉链核酸(ZNA)和三唑核酸(TzNA)。在具体的实施方案中，一个或多个(例如，2至6个，或2、3、4、5或6个)核酸修饰如LNAs存在于等位基因特异性阻断探针和/或等位基因特异性引物上。在优选的实施方案中，探针或引物上的多个修饰是不连续的或不接续的，例如，两个修饰如LNAs不是在探针或引物序列中彼此相邻的。在某些实施方案中，核酸修饰位于(a)3'末端处、(b)5'末端处、(c)内部位置处或在第一或第二等位基因特异性阻断探针和/或第一或第二等位基因特异性引物内部的(a)、(b)或(c)的任何组合处。在一些优选的实施方案中，一个修饰(例如，LNA)位于第一和/或第二等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分处，从而该修饰包含用来在等位变体之间区分的核碱基。在其他优选的实施方案中，一个修饰(例如，LNA)位于第一和/或第二等位基因特异性阻断探针的等位基因特异性核苷酸部分处，从而该修饰包含用来在等位变体之间区分的核碱基。
在一些实施方案中，与使用未修饰的等位特异性引物或阻断探针相比，通过在第一或第二等位基因特异性引物和/或第一和/或第二等位基因特异性阻断探针中包含核酸修饰而改善等位基因区分的特异性。在一些实施方案中，特异性的改善是至少约2倍(例如，至少约2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍等)。
在其他实施方案中，等位基因区分的特异性至少约2倍(例如，至少约2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍等)好于使用Morlan等人,PloSONE,4:e4584(2009)中所述的采用阻断试剂的等位基因特异性PCR(ASB-PCR)方法的等位基因区分特异性。
在一些实施方案中，所述方法还包括2阶段循环方案。在一些实施方案中，2阶段循环方案的第一阶段中的循环数目包含比第二阶段中所用循环数目更少的循环。在其他实施方案中，第一阶段中的循环数目是比第二阶段中循环数目少约90%的循环。在另外的其他实施方案中，第一阶段中的循环数目在3-7个循环之间并且第二阶段中的循环数目在42-48个循环之间。
在一些实施方案中，在2阶段循环方案的第一循环阶段期间使用的复性/延伸温度低于第二阶段期间使用的复性/延伸温度约1-3℃之间。在某些实施方案中，在2阶段循环方案的第一循环阶段期间使用的复性/延伸温度在56-59℃之间并且在第二阶段期间使用的复性/延伸温度在60-62℃之间。
在一些实施方案中，所述方法还包括预扩增步骤。在某些实施方案中，预扩增步骤包括使用至少两整套等位基因特异性引物和基因座特异性引物的多重扩增反应，其中每套适用于或可操作用于扩增特异性目的多核苷酸。在其他实施方案中，多重扩增反应的产物分成次级单重扩增反应，其中每种单重反应含有至少一个先前在多重反应中使用的引物集合。在另外的其他实施方案中，多重扩增反应还包含多个等位基因特异性阻断探针。在一些实施方案中，将多重扩增反应实施适合保持反应处于线性扩增阶段范围内的许多个循环。
在一些实施方案中，第一和/或第二检测探针是相同的。在一些实施方案中，第一和/或第二检测探针是不同的。在一些实施方案中，第一和/或第二检测探针是基于序列的或基因座特异的检测探针。在其他实施方案中，第一和/或第二检测探针是5'核酸酶探针。在一些示例性实施方案中，第一和/或第二检测探针包含MGB部分、报道分子部分(例如，FAMTM、TETTM、JOETM、VICTM或Green)、猝灭剂部分(例如，黑洞猝灭剂TM或TAMRATM)和/或被动参比(例如，ROXTM)。在一些实施方案中，根据美国专利号6,727,356中描述的方法和原理设计第一和/或第二检测探针，所述文献的公开内容通过引用的方式完整并入本文。在具体的实施方案中，第一和/或第二检测探针包含探针(AppliedBiosystems，FosterCity，CA)。
在一些实施方案中，第一基因座特异性引物和第二基因座特异性引物包含相同序列。在一些实施方案中，第一基因座特异性引物和第二基因座特异性引物是相同序列。
在一些实施方案中，第一和/或第二反应混合物还可以包含聚合酶；dNTP；适于PCR扩增的其他试剂和/或缓冲剂；和/或模板序列或核酸样品。在一些实施方案中，聚合酶可以是DNA聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶可以是热稳定性的，如TaqDNA聚合酶。在一些实施方案中，模板序列或核酸样品可以是DNA，如gDNA或cDNA。在其他实施方案中，模板序列或核酸样品可以是RNA，如mRNA。
在一些实施方案中，第一等位基因特异性阻断探针结合至与第二等位基因特异性引物相同的链或序列，而第二等位基因特异性阻断探针结合至与第一等位基因特异性引物相同的链或序列。在一些实施方案中，第一和/或第二等位基因特异性阻断探针分别用来减少从第二等位基因和/或第一等位基因产生的背景信号的量。在一些实施方案中，第一和/或第二等位基因特异性阻断探针是不可延伸的并且偏好地分别与第二等位基因或第一等位基因复性，因而阻断例如可延伸性第一等位基因特异性引物与第二等位基因的复性和/或可延伸性第二等位基因特异性引物与第一等位基因的复性。
在一些示例性实施方案中，第一等位基因是稀有(例如，少数)或突变等位基因。在其他示例性实施方案中，第二等位基因是丰富(例如，主要)或野生型等位基因。
在另一个方面，本发明提供了用于检测或定量包含第二等位变体的样品中的第一等位变体的试剂盒，所述试剂盒包含以下一种或多种：(a)第一等位基因特异性引物；(b)第二等位基因特异性引物；(c)第一基因座特异性引物；(d)第二基因座特异性引物；(e)第一等位基因特异性阻断探针；(f)第二等位基因特异性阻断探针；(g)第一基因座特异性检测探针；和(h)第二基因座特异性检测探针。
在一些实施方案中，第一和/或第二等位基因特异性引物包含靶特异性部分和等位基因特异性核苷酸部分。在一些实施方案中，第一和/或第二等位基因特异性引物还可以包含尾。上文就相对于本发明试剂盒中的第一或第二等位基因特异性引物描述了其他实施方案。
在一些实施方案中，本发明的组合物、方法和试剂盒提供高的等位基因区分特异性和选择性。在一些实施方案中，特异性和/或选择性的定量性确定包括比较扩增子第一集合和扩增子第二集合之间的Ct值。在一些实施方案中，选择性处于这样的水平，因而可以在另一个等位基因或多个等位基因的约1百万个拷贝中检出给定等位基因的单个拷贝。
在具体的实施方案中，使用一种、两种、三种或更种以下组分，本发明的组合物、方法和试剂盒提供改进的等位变体检测和区分：(a)在区分碱基的位置处包含核酸修饰如锁核酸(LNA)的等位基因特异性引物(例如，在多态性位点含有3'末端LNA的等位基因特异性引物)；(b)等位基因特异性阻断探针，其在3'末端包含不可延伸性阻断部分如C1-C24烷基二醇(例如，己二醇)修饰和在区分碱基的位置处包含核酸修饰如锁核酸(LNA)(例如，在3'末端处含有己二醇化学基团和在距离阻断部分约5-15个(例如，约10个)核苷酸的位置(例如，在阻断探针的中部)处的多态性位点包含单一LNA的阻断寡核苷酸)；(c)检测探针，如探针(例如，MGBFAM探针)；和(d)基因座特异性引物，如反向引物。在某些情况下，阻断部分包含借助亚磷酰胺键与等位基因特异性阻断寡核苷酸序列的3'末端缀合的C1-C24烷基二醇(例如，己二醇)。在某些其他情况下，本发明的测定方法在ABI7900HT实时PCR仪上进行，不过可以使用本领域普通技术人员已知的任何类型的实时PCR仪。在具体的实施方案中，反应特征包括以下：阶段1：95.0℃持续10:00分钟；阶段2：重复：40次95.0℃持续0:20分钟60.0℃持续0:45分钟。
本领域技术人员将从以下详述和附图中显而易见本发明的其他目的、特征和优点。
附图简述
图1描述本发明的体细胞突变检测测定法的一个实施方案。
图2显示使用在3'末端包含锁核酸(LNA)修饰(在“G12SASP-LNA”中的“+A”)的等位基因特异性引物和包含在寡核苷酸序列中部的LNA修饰(在“G12S阻断物-LNA”中的“+G”)和3'己二醇修饰(在“G12S阻断物-LNA”中的“C6”)的等位基因特异性阻断探针改善了对KRASG12SSNP处等位变体的区分。
图3显示使用在3'末端包含LNA修饰(在“G12RASP-LNA”中的“+C”)的等位基因特异性引物和包含在寡核苷酸序列中部的LNA修饰(在“G12R阻断物-LNA”中的“+G”)和3'-己二醇修饰(在“G12R阻断物-LNA”中的“C6”)的等位基因特异性阻断探针改善了对KRASG12RSNP处等位变体的区分。
图4显示使用在3'末端包含LNA修饰(在“H1047RASP-LNA”中的“+G”)的等位基因特异性引物和包含在寡核苷酸序列中部的LNA修饰(在“H1047R阻断物-LNA”中的“+A”)和3'-己二醇修饰(在“H1047R阻断物-LNA”中的“C6”)的等位基因特异性阻断探针改善了对PIK3CAH1047RSNP处等位变体的区分。
图5显示使用本发明的LNA修饰的等位基因特异性引物和探针时，在EGFRT790M多态性位点处改善的等位变体区分。
图6显示使用本发明的LNA修饰的等位基因特异性引物和探针时，在EGFRL858R多态性位点处改善的等位变体区分。
图7显示来自全血的丰富量的野生型DNA干扰在H1047R阳性KPL4细胞中检测PIK3CAH1047R变异等位基因的作用。
图8显示来自全血的丰富量的野生型DNA干扰在G12R阳性PSN1细胞中检测KRASG12R变异等位基因的作用。
图9显示对150份CRC组织样品的筛选表明不存在从阴性样品观察到的干扰并且可以通过滴定验证对弱信号的检测。
图10显示DxS/QiagenScorpion测定法仅可以在用SW1116(G12A阳性)细胞的系列稀释物掺入的全血混合物中检测到1000个细胞。
图11显示InosticsBEAM测定法作出不正确回应并且将15份突变样品中的14份鉴定为野生型样品。
图12显示本发明的体细胞突变基因分型测定法具有低至全血混合物中50至100个阳性细胞的可检测信号。
图13显示使用本文所述方法选择性地扩增稀有等位基因并且不扩增野生型等位基因的本发明示例性实施方案。野生型等位基因不产生扩增产物，因为具有LNA(图13中的C)和己二醇修饰的阻断探针与野生型等位基因杂交，因此妨碍实时PCR扩增。具有LNA修饰(图13中的T)的等位基因特异性引物优选地与突变等位基因而非阻断探针杂交，并且因此促进实时PCR扩增产物的产生。
图14还显示等位基因特异性引物可以扩增野生型(阴性对照)和突变(阳性对照)等位基因。扩增曲线显示采用等位基因特异性LNA引物的测定法具有高灵敏性。具有LNA的引物选择性扩增突变等位变体。
图15显示在等位基因特异性引物上策略性布置的LNA修饰可以改善扩增并降低Ct值。可以通过使用多于一个LNA改善测定法的表现。
图16显示在等位基因特异性引物上连续布置的三个或更多个LNA修饰不产生扩增产物。
图17显示可以在本发明中使用的示例性LNA分子和其他修饰的LNA。本发明的等位基因特异性引物可以包含2至6个LNA。
图18显示了示例性PNA-DNA双链体(左)和具有PNA修饰的示例性等位基因特异性引物(图18中的T；右)。
图19显示了示例性含有TNA的寡核苷酸(左)和具有TNA修饰的示例性等位基因特异性引物(图19中的T；右)。
图20显示了示例性ZNA寡核苷酸(左)和示例性ZNA修饰的等位基因特异性引物(右；图20中的T)。
图21显示了示例性TzDNA分子(左)和示例性具有TzDNA修饰的等位基因特异性引物(右；图21中的T)。
图22显示了用于本发明G12AKRAS测定法的示例性阻断探针。将该阻断探针(寡核苷酸)专门设计成与野生型等位基因杂交并且高效且选择性抑制对污染性野生型基因组DNA的扩增，而不影响对等位变体的扩增。
图23显示包含LNA引物和具有己二醇的阻断探针的KRASG12A测定法特异性扩增等位变体(A)并抑制对野生型等位基因(G)的扩增。通过采用阻断物，连同等位基因特异性引物上存在LNA一起，改善了测定法的选择性。
图24显示在具有己二醇修饰(3'碳尾)的阻断探针和具有磷酸酯基团的一种阻断探针之间的比较。与磷酸化阻断物的Ct为31.2相比，阻断物己二醇探针表现为更好进行，Ct(为28.4)更低。
图25显示与没有LNA修饰的一个阻断探针相比，具有LNA修饰的阻断探针具有更低的Ct值。图25还显示了本发明的方法，所述方法使用具有LNA的阻断探针并且有效地和选择性地扩增突变变体，并显示优异的等位基因区分作用。
图26显示了使用含有LNA的等位基因特异性引物和含有LNA的阻断探针的本发明方法对突变等位基因具有高的特异性并且产生特异性扩增产物。图26还显示不扩增野生型等位基因。
图27显示在具有相同序列和3'己二醇修饰、但是阻断物序列上LNA位置不同的两种阻断探针之间解链温度(Tm)和Ct值的差异。这显示LNA在阻断物序列中的位置怎样影响测定法的表现。与远离等位变体核苷酸布置LNA的阻断物相比，置于等位变异的碱基处的LNA改善测定法的表现。
图28A显示阻断探针Tm对测定法表现的影响。图28B还显示在没有LNA的阻断物和具有两个LNA的阻断物之间的Tm和Ct值差异。因存在LNA所致的Tm增加因此改善本发明测定法的灵敏度和选择性。随着Tm更高，阻断探针在延伸期间保持与其靶复性，因而有效阻断野生型等位基因干扰扩增并允许偏好地和选择性地扩增变体。在添加两个LNA的情况下，相同阻断序列的Tm从59.9℃增加至68℃。
图29显示在阻断探针上放置6个相邻LNA修饰(包括位于等位基因特异性核苷酸位置处的LNA)在PCR循环期间完全阻止扩增。
图30显示ΔCt值可以用来确定测定法的可行性及其选择性。用含有LNA的引物和探针所获得的更高ΔCt值显示本发明测定法的可行性和选择性。
图31显示怎样从来自各种体细胞突变基因分型测定法的Ct值计算出ΔΔCt值。用含有LNA的引物和阻断物设计的本图测定法A表现得比含有具相邻LNA的引物和探针的其他测定法更好。
图32显示使用本发明的PIK3CAE545K测定法定量未知样品中存在的突变变体的百分数。图32A显示PIK3CAE545K等位变体和MCF7细胞系的标准曲线。使用本文所述的方法产生它。图32B显示来自结肠直肠癌患者的两份未知样品(样品A和B)和使用基因分型测定法产生的阳性对照(MCF7细胞系)的扩增曲线。图32C显示通过计算图表确定的样品中存在的突变变体E545K的量和百分数(突变百分数)。
图33显示使用本发明的KRASG12D测定法定量未知样品中存在的突变变体的百分数。图33A显示KRASG12D基因分型测定法和LS174T细胞系的扩增曲线和标准曲线。图33B显示来自胰腺癌患者的两份未知样品(样品A和B)和使用本发明方法产生的阳性对照(LS174T细胞系)的扩增曲线。图33C显示相对于阳性对照，使用计算图表确定在表达突变变体的样品A中的DNA量是3.25ng或9.6%。
图34显示使用本发明的EGFRE746-A750缺失EGFＲ测定法定量未知样品中存在的突变变体的百分数。图34A显示H1650细胞系的EGFR基因E746-A750缺失的扩增曲线和标准曲线。图34B显示来自肺癌患者的未知样品(样品A)和使用本发明方法产生的阳性对照(H1650细胞系)的扩增曲线。图34C显示相对于阳性对照，使用计算图表确定在表达EGFR缺失变体的样品A中的DNA量是3.25ng或9.6%。
图35显示使用本发明的V600EBRAF测定法定量未知样品中存在的等位变体的百分数。图35A显示HT29细胞系的BRAFV600E等位变体的扩增曲线和标准曲线。图35B显示来自肺癌患者的未知样品(样品A)和使用本发明方法产生的阳性对照(H1650细胞系)的扩增曲线。图35C显示相对于阳性对照，计算在表达BRAF的V600E变体的样品A中的DNA量是0.18ng或1.2%。
图36显示非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤样品的H&E染色冷冻切片。图36A显示具有高肿瘤细胞百分数的切片(白色箭头指示肿瘤细胞)。图36B显示包含肿瘤细胞(白色箭头)、基质伴随血管(黑色箭头)、炎性细胞(例如，淋巴细胞；红色箭头)和充有巨噬细胞的肺泡(绿色箭头)的混合物的切片。
图37显示胃肿瘤样品或胰腺肿瘤样品中细胞角蛋白(CK)水平和等位变体表达之间的关系。图37A显示在胃肿瘤样品#1、2和4中EGFRT790M、KRASG12V、KRASQ61H或PIK3CAE545K等位变体是高水平的CK和低突变百分数。这些结果显示在样品#1、2和4中，少数肿瘤细胞可能携带EGFRT790M、KRASG12V、KRASQ61H或PIK3CAE545KSNP。然而，在样品#5中KRASG12D突变是高水平的CK和高突变百分数(例如，90%)。这个结果显示样品#5中的大部分肿瘤细胞可能携带G13D突变。图37B显示在胰腺肿瘤样品#1中KRASG12D变体是高水平的CK和高突变百分数(100%)，因此这表明大部分肿瘤细胞可能携带突变等位基因。相反地，在胰腺肿瘤样品#3中存在高水平的CK，但是存在KRASG12DSNP的低突变百分数(例如，5%)。样品#3的少数肿瘤细胞可能携带G12D突变。
图38显示与LifeTechnologies的castPCRTM突变测定法相比，本发明的体细胞突变基因分型测定法(例如，KRASG12A测定法)的灵敏度。图38A显示本发明的基因分型测定法的扩增曲线。图38B显示在相同试样上进行的LifeTechnologies的castPCRTM突变测定法的扩增曲线。图38C显示当试样含有少至250个阳性肿瘤细胞时，本发明的测定法检测到G12A突变。通过比较，使用LifeTechnologies的castPCRTM突变测定法时，需要较多数目的肿瘤细胞以检测突变。
图39显示与LifeTechnologies的castPCRTM突变测定法相比，本发明的体细胞突变基因分型测定法(例如，KRASG12A测定法)的灵敏度。图39A显示使用本发明的基因分型测定法时试样的扩增曲线。图39B显示LifeTechnologies的castPCRTM测定法的扩增曲线。图39C显示本发明的测定法在少至100个阳性肿瘤细胞中检测到G12SKRAS等位变体，而LifeTechnologies的castPCRTM突变测定法不能检出。
图40显示通过使用本发明的方法在乳腺癌样品中检测(例如，存在或不存在)和/或定量(例如，突变百分数)以下SNP所获得的结果：PIK3CAE542K、E545D、E545K、H1047R；EGFRT790M、L858R；KRASG12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V和G13D；以及BRAFV600E。该图显示PIK3CAH1047RSNP以不同的百分数在乳腺癌样品中表达。
图41显示还在额外的乳腺癌样品集合中检测和定量(例如，突变百分数)PIK3CASNP(E542K、E545D、E545K和H1047R)。对45份乳腺癌样品筛查PIK3CAE542K、E545D、E545K和H1047R等位变体。
图42显示可以使用本发明的方法对肺肿瘤样品筛查SNP。在这个实施方案中，在25份肺肿瘤样品中确定各种SNP的存在和突变百分数。SNP包括PIK3CAE542K、E545D、E545K和H1047R；EGFRT790M、L858R和E746缺失；KRASG12C、G12R、G12S、G12D、G12A、G12V、G13C、G13D和Q61H；以及BRAFV600E。
图43显示使用本发明的方法对额外32份人肺肿瘤样品所获得的结果。SNP包括PIK3CAE542K、E545D、E545K和H1047R；EGFRT790M、L858R和E746缺失；KRASG12C、G12R、G12S、G12D、G12A、G12V和G13D；以及BRAFV600E。
图44显示可以使用本发明的方法对胃肿瘤样品筛查以检测各种SNP的存在和突变百分数。SNP包括PIK3CAE542K、E545D、E545K和H1047R；EGFRT790M、L858R和E746缺失；KRASG12C、G12R、G12S、G12D、G12A、G12V、G13D和Q61H；以及BRAFV600E。在这个实施方案中，用40ng样品(例如，DNA)进行每种测定法。
图45显示使用本发明方法对异种移植样品检测各种SNP的存在和突变百分数所获得的结果。SNP包括PIK3CAE542K、E545D、E545K和H1047R；EGFRT790M、L858R和E746缺失；KRASG12C、G12R、G12S、G12D、G12A、G12V、G13C、G13D和Q61H；以及BRAFV600E。EGFRE746缺失存在于样品#585-588中并且预测在所述样品中的100%细胞中存在。在样品#581-584中分别以3.4%、1.2%、1%和1.8%的突变百分数检测到PIK3CAH1047R等位基因。
图46显示可以使用本发明的方法在结肠直肠癌样品中检测到并定量KRAS、BRAF和PIK3CA等位变体(例如，突变百分数)。SNP包括PIK3CAE542K、E545D、E545K和H1047R；KRASG12C、G12R、G12S、G12D、G12A、G12V和G13D；以及BRAFV600E。
图47显示可以使用本发明的方法在额外的结肠直肠癌样品中检测到并定量KRAS、BRAF和PIK3CA等位变体。
图48显示可以使用本发明的方法对来自结肠直肠癌患者的肝脏肿瘤组织和结肠肿瘤组织筛查KRAS、BRAF和PIK3CA等位变体。结果显示一些样品具有多种SNP。
图49显示可以对来自胰腺癌患者的样品筛查SNP并且可以根据本发明的方法确定突变百分数。在这个实施方案中，从患者获得并且使用本文所述的SNP基因分型测定法筛查细针抽吸物样品。在测试的胰腺癌样品中，检测到各种KRAS突变，但是未检测到PIK3CA(例如，E542K、E545D、E545K、H1047R)、EGFR(例如，T790M、L858R)和BRAF(例如，V600E)突变。
发明详述
I.介绍
选择性扩增目的等位基因经常因多种因素复杂化，所述因素包括在备选等位基因上错误引发和延长错配的等位基因特异性引物。这种错误引发和延长可能在检测存在于充满过量的另一种等位变体的样品中的稀有等位基因时特别成问题。当充分过量时，其他等位变体的错误引发和延长可以模糊对目的等位基因的检测。当使用基于PCR的方法时，对含有备选等位变体的样品中特定等位基因的区分依赖于选择性扩增目的等位基因，同时最小化或防止样品中存在的其他等位基因的扩增。
已经确定了单独或组合下有助于增强等位基因特异性PCR的区分能力的许多因素。如本文中公开，错配的和匹配的等位基因特异性引物之间提供更大ΔCt值的因素表示等位变体之间更大的区分能力。被发现使用本发明的方法时改善等位变体区分作用的这类因素例如包括使用以下一者或多者：(a)加尾的等位基因特异性引物；(b)低等位基因特异性引物浓度；(c)设计成具有较低Tm的等位基因特异性引物；(d)设计成靶向区分碱基的等位基因特异性引物；(e)设计成防止从样品中备选的和潜在地更丰富的等位变体扩增的等位基因特异性阻断探针；和(f)设计成包含核酸修饰的等位基因特异性阻断探针和/或等位基因特异性引物，所述核酸修饰例如是修饰的碱基、核酸类似物和/或修饰核糖的核酸，以便增加匹配的和错配的靶序列之间的ΔTm。
上述因素，特别在组合使用时，可以影响等位基因特异性PCR区分样品中存在的不同等位基因的能力。因此，本发明总体上涉及新扩增方法，所述方法利用上文描述的一种或多种因素来改善PCR期间等位变体的区分作用，例如，通过增加ΔCt值。
在某些方面，本发明基于使用具有阻断寡核苷酸的等位基因特异性实时PCR的锁核酸(LNA)化学，所述阻断寡核苷酸含有己二醇3'修饰以防止野生型等位基因扩增。本发明方法的检测限有利地是2-10个DNA拷贝。本发明还提供对一组大的体细胞突变的选择性和稳健检测。作为非限制性例子，本发明使得在全血背景下检测拷贝数非常低的突变等位基因(例如，0.01%-0.1%)成为可能。在一些情况下，用于本文所述的突变测定法中的备选的样品包括但不限于血液、血清、血浆、组织(例如，FNA、CTC、中心活组织检查样品、FFPE组织)和它们的混合物。
在特定方面，本发明的突变测定法基于等位基因特异性PCR。在某些实施方案中，该检测是使用TaqMan探针技术的实时方法。在优选的实施方案中，在其3'末端含有单个LNA碱基突变的等位基因特异性引物(ASP)可以用来特异性检测突变等位基因。在这些实施方案中，与野生型序列互补的阻断寡核苷酸(阻断物)可以用来抑制野生型等位基因的任何非特异性扩增。这种阻断物可以含有位于野生型核苷酸位置处的单个LNA变体。在一些情况下，该阻断物在3'末端包含己二醇化学基团以防止任何延长。在其他情况下，本发明还包括完成反应的反向引物。不受限于任何具体理论约束，LNA修饰碱基的存在增加野生型和突变等位基因之间的区分作用，使得更大的靶等位基因特异性和阻断功效成为可能。在具体的实施方案中，LNA是用来增加PCR探针的特异性和双链体的热稳定性的修饰碱基。LNA修饰碱基能够区分单核苷酸，因而使AS引物和野生型等位基因之间的可能错配最小化。在某些实施方案中，等位基因特异性引物和/或阻断寡核苷酸在等位变体的位置处包含LNA修饰碱基并且在5'末端包含1、2、3、4、5、6、7个或更多个额外的不相邻或不连续LNA修饰和/或LNA修饰碱基。
因此，本发明的组合物和方法有利地使得可以在样品中检测到十分低水平的突变(体细胞)DNA，所述样品包括血液、血浆、血清和/或组织(FNA、CTC、中心活组织检查样品、FFPE组织等)。具体而言，通过使用与新型阻断寡核苷酸设计组合的LNA化学，本发明的测定法在前述的等位特异性PCR突变检测方面显著改善。就这一点而论，本发明以比本领域已知的检测技术如BEAM(珠、乳液、扩增和磁体)测定法(Inostics)、Scorpions/ARMS反应(Qiagen)和castPCR测定法(LifeTechnologies)高10倍至100倍的灵敏度提供突变分析。此外，本发明提供能够检测致癌抗性突变体如EGFRT790M、EGFRE746-A750缺失、KRASG12A、KRASG12D、KRASG12S、E545KPIK3CA和V600EBRAF的方法。
II.定义
如本文所用，除非另外指明，否则以下术语具有归属于它们的意思。
如本文所用，术语“等位基因”包括在DNA区段上，例如在同源染色体上相同的物理基因座处的备选DNA序列。等位基因可以指在单个细胞或生物内部同源染色体上存在的相同物理基因座之间不同或在多种细胞或生物中的相同物理基因座处不同(“等位变体”)的DNA序列。在一些情况下，等位基因可以对应于特定物理基因座处的单核苷酸差异。在其他情况下，等位基因可以对应于核苷酸(单个或多个)插入或缺失。
术语“等位基因特异性引物”包括与包含目的等位基因的序列杂交并且在PCR中使用时可以被延长以实现第一链cDNA合成的寡核苷酸序列。等位基因特异性引物是对给定的靶DNA或基因座的特定等位基因特异的并可以设计成检测靶序列中少至一个核苷酸的差异。等位基因特异性引物可以包含等位基因特异性核苷酸部分、靶特异性部分和/或尾。
如本文所用，术语“等位基因特异性核苷酸部分”或“等位基因特异性靶核苷酸”包括等位基因特异性引物中这样的一个核苷酸或多个核苷酸，所述核苷酸可以选择性杂交给定基因座处的一个等位基因(例如，次要或突变等位基因)并且从该一个等位基因延长以排除相同基因座处的其他等位基因(例如，相应的主要或野生型等位基因)。
术语“靶特异性部分”包括等位基因特异性引物的与靶多核苷酸序列杂交的区域。在一些实施方案中，等位基因特异性引物的靶特异性部分是引发区段，所述引发区段在待检测的等位变体的引发区段5'处与靶序列互补。等位基因特异性引物的靶特异性部分可以包含等位基因特异性核苷酸部分。在其他情况下，等位基因特异性引物的靶特异性部分与3'等位基因特异性核苷酸部分毗邻。
如本文所用，术语“尾”或“5'-尾”包括引物的非3'末端。虽然并非必须，但是该区域一般将含有与待分析的靶多核苷酸序列不互补的序列。5'尾可以具有约2-30、2-5、4-6、5-8、6-12、7-15、10-20、15-25或20-30个核苷酸长度或其间任何核苷酸长度范围中的任一长度。
术语“等位基因特异性阻断探针”或“阻断探针”或“阻断物”包括与包含特定等位变体的DNA链结合的寡核苷酸序列并且减少或防止该特定等位变体的扩增，其中所述特定等位变体存在于与等位特异性引物所结合的链相同、相对或互补的链上。如本文中讨论，等位基因特异性阻断探针通常包含修饰，例如，在核糖环的3'-OH处，所述修饰防止引物由聚合酶延长。等位基因特异性阻断探针可以设计成与等位基因特异性引物对其复性的链相同或相对的链复性并且可以在其3'末端用阻断基团(例如，“不可延伸性阻断部分”)修饰。因此，阻断探针可以例如如此设计，从而与野生型等位基因紧密结合(例如，丰富等位变体)，以便抑制野生型等位基因的扩增，同时通过延长等位基因特异性引物，允许扩增在包含突变等位基因(例如，稀有等位变体)的相同或相反链上发生。在说明性的实例中，等位基因特异性阻断探针不包括标记物，如荧光标记物、放射性标记物或化学发光标记物。
如本文所用，术语“不可延伸性阻断部分”或“阻断部分”包括在寡核苷酸序列如探针和/或引物上的修饰，所述修饰造成例如在PCR反应中与其互补序列杂交时不能够由聚合酶延长。阻断部分的例子包括但不限于对寡核苷酸的核糖环3'-OH的修饰，所述修饰防止由聚合酶添加其他碱基至寡核苷酸序列的3'末端。在具体的实施方案中，不可延伸性阻断部分包括但不限于任选取代的C1-C24烷基二醇(例如，3'-己二醇修饰)，任选取代的C2-C24烯基二醇，任选取代的C2-C24炔基二醇、小沟结合物(MGB)、胺(NH2)、生物素、PEG、PO4及它们的组合。MGB的例子包括CC1065类似物、来红菌素(lexitropsin)类、偏端霉素、纺锤菌素、贝尼尔(berenil)、倍癌霉素(duocarmycin)、戊脘脒、4,6-二氨基-2-苯基吲哚和吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮和DPI3。
如本文所用，术语“修饰的碱基”包括对核酸中碱基或碱基化学键的任何修饰，所述修饰在结构方面不同于天然存在核酸中发现的修饰。这类修饰可以包括核酸中或核酸主链结构中碱基的化学结构或碱基的化学键改变。见例如Latorra等人,Hum.Mut.,2:79-85(2003)；Nakiandwe等人,PlantMethod,3:2(2007)。
术语“锁核酸”或“LNA”包括其中核糖环被连接2'-O原子和4'-C原子的亚甲基桥“锁定”的一类核酸类似物。LNA核苷含有常见的核碱基(T、C、G、A、U和mC)并且能够根据标准的Watson-Crick碱基配对法则形成碱基对。然而，通过用亚甲基桥“锁定”该分子，将LNA约束处在用于Watson-Crick结合的理想构象。
术语“肽核酸”、“肽质核酸”或“PNA”包括非天然存在的和人工合成的核酸类似物或模拟物，其包含多种天然存在的或非天然存在的核碱基，所述核碱基由酰胺键连接至N-(2-氨基乙基)-甘氨酸重复单元的主链。嘌呤碱基和嘧啶碱基经亚甲基羰基键与不带电荷的主链连接。如同DNA，Watson-Crick碱基配对法则适用于肽核酸。
术语“拉链核酸”或“ZNA”包括与一个或多个阳离子精胺部分缀合的寡核苷酸，所述阳离子精胺部分降低与靶核酸链的静电排斥作用并增加寡核苷酸对其靶的亲和力。
术语“三唑核酸”、“TzNAs”、“三唑脱氧核酸”、“TzDNA”、“三唑连接的脱氧核糖核酸类似物”或“TLDNA”包括一种包含非天然存在的三唑键接的寡核苷酸。
术语“(3'-2')α-L-苏糖核酸”、“苏糖核酸”或“TNA”包括在研究服从Watson-Crick碱基配对法则并与交替性糖-磷酸酯主链结合的核酸期间所发现的非天然存在的核酸(见例如，Ichida等人,NucleicAcidsRes.,33:5219-5225(2005))。TNA具有比天然核酸短一个原子的重复单元，然而它们可以与DNA、RNA和与自身发生碱基配对。尽管不想受具体理论约束，但是认为TNA强烈地与DNA杂交并且甚至更强烈地与RNA杂交，因为TNA是A形式DNA和A形式RNA的良好模拟物。与类似的DNA-DNA复合物相比，TNA-DNA双链体增加的稳定性导致改善的等位变体错配区分作用。
如本文所用，术语“检测探针”包括指示扩增的多种信号传导分子的任一种。例如，Green和其他DNA结合染料是检测探针。一些检测探针可以是基于序列的(在本文中也称作“基因座特异性检测探针”)，例如，5'核酸酶探针。多种检测探针是本领域已知的并且包括但不限于本文所述的探针(也见，美国专利号5,538,848)、多种茎-环分子信标(见例如，美国专利号6,103,476和5,925,517；Tyagi等人,NatureBiotech.,1996,14:303-308)、无茎或线型信标(见例如，PCT公开号WO99/21881)、PNA分子信标TM(见例如，美国专利号6,355,421和6,593,091)、线型PNA信标(见例如，Kubista等人,2001,SPIE4264:53-58)、非FRET探针(见例如，美国专利号6,150,097)、探针(见例如，美国专利号6,548,250)、茎-环和双链体ScorpionTM探针(见例如，Solinas等人,2001,Nucl.AcidsRes.,29:E96；美国专利号6,589,743)、凸环探针(见例如，美国专利号6,590,091)、伪结探针(见例如，美国专利号6,589,250)、环状体(cyclicon)(见例如，美国专利号6,383,752)、MGBEclipseTM探针(EpochBiosciences)、发夹探针(见例如，美国专利号6,596,490)、肽核酸(PNA)发光探针，自装配纳米粒子探针和二茂铁修饰的探针，如在例如以下文献中所述那样：美国专利号6,485,901；Mhianga等人,2001,Methods,25:463-471；Whitcombe等人,1999,NatureBiotechnol.,17:804-807；Isacsson等人,2000,MolecularCellProbes,14:321-328；Svanvik等人,2000,AnalBiochem.,281:26-35；Wolffs等人,2001,Biotechniques,766:769-771；Tsourkas等人,2002,NucleicAcidsResearch,30:4208-4215；Riccelli等人,2002,NucleicAcidsResearch,30:4088-4093；Zhang等人,2002Shanghai,34:329-332；Maxwell等人,2002,J.Am.Chem.Soc.,124:9606-9612；Broude等人,2002,TrendsBiotechnol.,20:249-56；Huang等人,2002,ChemRes.Toxicol.,15:118-126；和Yu等人,2001,J.Am.Chem.Soc.,14:11155-11161。检测探针可以包含报道染料，例如，6-羧基荧光素(6-FAM)或四氯荧光素(TET)。检测探针也可以包含猝灭剂部分，如四甲基罗丹明(TAMRA)、黑洞猝灭剂(Biosearch)、爱荷华黑(IDT)、QSY猝灭剂(MolecularProbes)和Dabsyl及Dabcel磺酸酯/羧化物猝灭剂(EpochBiosciences)。在一些实施方案中，检测探针可以包含两种探针，其中例如荧光剂(fluor)在一种探针上，并且猝灭剂在另一种探针上，其中两个探针一起在靶上的杂交使信号猝灭，或其中在靶上的杂交通过荧光的变化改变信号特征标识。检测探针也可以包含SO3替代羧酸酯基团的荧光素染料的磺酸酯衍生物、亚磷酰胺形式的荧光素、亚磷酰胺形式的CY5(AmershamBiosciences-GEHealthcare)。
术语“基因座特异性引物”包括一种寡核苷酸序列，其与源自PCR反应中第一引物(如等位基因特异性引物)延长的产物杂交并且可以实现该产物的第二链cDNA合成。因此，在一些实施方案中，等位基因特异性引物充当正向PCR引物并且基因座特异性引物充当反向PCR引物，或反之亦然。在一些优选的实施方案中，与等位基因特异性引物相比，基因座特异性引物以更高浓度存在。
如本文所用，术语“稀有等位变体”包括与备选的等位变体相比，在样品中以更低水平存在的靶多核苷酸。稀有等位变体也可以称作“次要等位变体”和/或“突变等位变体”。例如，稀有等位变体可以与给定SNP或基因的另一种等位变体相比，以小于约1/10、1/100、1/1,000、1/10,000、1/100,000、1/1,000,000、1/10,000,000、1/100,000,000或1/1,000,000,000的频率存在。备选地，稀有等位变体可以例如是每1、10、100或1,000微升样品或反应体积小于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、75、100、250、500、750、1,000、2,500、5,000、7,500、10,000、25,000、50,000、75,000、100,000、250,000、500,000、750,000或1,000,000个拷贝。
术语“丰富等位变体”包括与备选的等位变体相比，在样品中以更高水平存在的靶多核苷酸。丰富等位变体也可以称作“主要等位变体”和/或“野生型等位变体”。例如，丰富等位变体可以与给定SNP或基因的另一种等位变体相比，以大于约10×、100×、1,000×、10,000×、100,000×、1,000,000×、10,000,000×、100,000,000×或1,000,000,000×的频率存在。备选地，丰富等位变体可以例如是每1、10、100、1,000微升样品或反应体积大于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、75、100、250、500、750、1,000、2,500、5,000、7,500、10,000、25,000、50,000、75,000、100,000、250,000、500,000、750,000、1,000,000个拷贝。
在某些实施方案中，术语“第一”和“第二”用来区分第一反应(例如，“第一”反应；“第一”等位基因特异性引物)和第二反应(例如，“第二”反应；“第二”等位基因特异性引物)的组分。按常规，第一反应扩增第一(例如，稀有)等位变体并且第二反应扩增第二(例如，丰富)等位变体或反之亦然。
如本文所用，“第一等位变体”和“第二等位变体”可以涉及来自相同生物的给定基因座的等位基因。例如，如包含野生型等位基因的人类样品(例如，细胞)中情况可能如此，其中一些已经突变以形成次要或稀有等位基因。在一些情况下，第一和第二等位变体指来自不同生物的等位基因。例如，第一等位基因可以是基因修饰生物的等位基因，并且第二等位基因可以是野生型生物的相应等位基因。在某些情况下，第一和第二等位变体可以包含于gDNA以及mRNA和cDNA上，并通常含于显示出因例如SNP或核苷酸插入和/或缺失突变所致的序列变异性的任何靶核酸上。
术语“热稳定的”或“热稳定的聚合酶”包括热稳定或耐热并且催化脱氧核糖核苷酸聚合以形成与核酸链互补的引物延伸产物的酶。当在PCR扩增期间实现单链核酸去稳定化或双链核酸变性所必需的时间经受升高的温度时，本文中有用的热稳定性DNA聚合酶并未不可逆地失活。酶的不可逆性变性指酶活性的基本上丧失。优选地，热稳定性DNA聚合酶将在约90℃-100℃在如PCR扩增一般所要求的条件下并非不可逆地变性。
如本文所用，术语“进行PCR扩增”或“PCR扩增”包括使用与互补链杂交的引物时聚合酶介导循环性核酸指数扩增，如在例如Innis等人,PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications,AcademicPress(1990)中所述那样。已经开发了多种装置，所述装置可以用含有荧光指示剂的组合物进行热循环反应、读取该荧光染料的强度并在每个循环后显示荧光强度，其中所述荧光指示剂能够发出指定波长的光束。包含热循环仪、光束发射体和荧光信号检测器的装置已经例如在美国专利号5,928,907；6,015,674；6,174,670；和6,814,934中描述，并且包括但不限于ABI序列检测系统(AppliedBiosystems，FosterCity，CA)、ABI序列检测系统(AppliedBiosystems)、ABI序列检测系统(AppliedBiosystems)、ABI序列检测系统(AppliedBiosystems)、StepOneTM实时PCR系统(AppliedBiosystems)和ABI序列检测系统(AppliedBiosystems)。
术语“预扩增(pre-amplification)”或“预扩增(pre-amplify)”包括在多重PCR扩增反应中包括多个引物对的方法，并且该多重扩增反应经历有限数目的循环，从而基于PCR的预扩增反应在PCR平台期和/或试剂耗尽之前结束。术语“基于PCR的预扩增”可以视为表示随后进行次级扩增反应，其复合水平(plexylevel)一般比基于PCR的预扩增反应更低。这种次级扩增反应，一般是多个独立的次级扩增反应，可以采用由基于PCR的多重预扩增反应中所用的引物编码的引物对。然而，每种次级扩增反应一般包含单个或少数引物对。基于PCR的预扩增方案的其他例子可以例如在美国专利号6,605,451中并在美国申请号10/723,520中找到，所述文献的公开内容通过引用的方式完整并入本文用于全部目的。
如本文所用，术语寡核苷酸的“Tm”或“解链温度”包括这样的温度(以摄氏度为单位)，在所述温度，单链寡核苷酸群体中50%的分子与其互补序列杂交并且该群体中50%的分子不与所述互补序列杂交。可以借助解链曲线经验地确定引物或探针的Tm。在一些实施方案中，Tm也可以使用本领域熟知的公式算出(见例如，Maniatis等人,Molecularcloning:alaboratorymanual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY:1982)。
如本文所用，术语“灵敏度”包括可以由给定测定法检测到的模板最低量(拷贝数或质量)。
如本文所用，术语“特异性”包括测定法在来自匹配模板与来自错配模板的扩增之间区分的能力。经常地，特异性表示为ΔCt=Ct错配-Ct匹配。特异性的改善或“特异性改善”或“倍数差异”在本文中表示为2(ΔCt_条件1–ΔCt_条件 2)。
术语“选择性”包括AS-PCR测定法可以用来在不存在来自主要(经常是野生型)等位基因的干扰情况下确定混合物中次要(经常是突变)等位基因的程度。选择性经常表述为比率或百分数。例如，将可以在100个野生型模板存在的情况下检出1个突变模板的测定法称为具有选择性1:100或1%。如本文所用，测定法选择性也可以计算为1/2ΔCt或使用(1/2ΔCtx100)计算为百分数。
术语“Ct”或“Ct值”包括阈循环并且表明PCR扩增测定法的下述循环，其中来自报道分子的表示扩增子产生的信号(例如，荧光)首次变得高于背景水平可检测。在一些实施方案中，阈循环或“Ct”是PCR扩增变为指数性时的循环次数。
如本文所用，术语“ΔCt”包括信号在两个不同样品或反应之间超过固定阈值的数值循环次数的差异。在一些实施方案中，ΔCt是在两个不同样品或反应之间达到指数型扩增时数值循环次数的差异。在一些实施方案中，ΔCt可以用来确定匹配的引物针对相应靶核酸序列和错配引物针对相同的相应靶核酸序列之间的特异性。
在一些实施方案中，使用错配引物和匹配引物之间的ΔCt值的计算作为等位基因特异性PCR区分能力的一种尺度。通常而言，下述任何因素将导致更大的等位基因区分能力，所述因素增加使用与靶序列(例如，包含目的等位变体的序列)匹配的引物的扩增反应的Ct值和错配引物的Ct值之间的差异。
根据多种实施方案，可以使用PCR曲线的导数确定Ct值。例如，可以在PCR曲线上进一阶、二阶或n阶导数法以确定Ct值。在多种实施方案中，导数的特征可以用于确定Ct值。这类特征可以包括但不限于二阶导数的正拐点、二阶导数的负拐点、二阶导数的零交点或一阶导数的正拐点。在一些实施方案中，可以使用阈值和基线法确定Ct值。例如，可以使用导数法建立PCR曲线指数期的上界，同时可以确定PCR曲线的基线以建立PCR曲线指数期的下界。从PCR曲线的上界和下界，可以建立从其中确定Ct值的阈值。本领域已知的用于确定Ct值的其他方法例如但不限于拟合点方法的多种实施方案和Sigmoidal方法的多种实施方案。见例如，美国专利号6,303,305；6,503,720；6,783,934、7,228,237和美国公开号2004/0096819；所述文献的公开内容通过引用的方式完整并入本文用于全部目的。
如本文所用的术语“样品”包括从患者获得的任何生物标本。样品包括但不限于全血、血浆、血清、红细胞、白细胞(例如，外周血单个核细胞)、导管灌洗液、乳头抽吸物、淋巴液(例如，淋巴结的弥散肿瘤细胞)、骨髓抽吸物、腹水、胸膜流出物、唾液、尿、粪便(即，粪)、痰、支气管灌洗液、泪、细针头抽吸物(FNA)(例如，通过随机乳晕细针头抽吸法收获)、任何其他体液、组织样品(例如，肿瘤组织)如肿瘤的活组织检查(例如，针头活组织检查)或淋巴结的活组织检查(例如，前哨淋巴结活组织检查)的组织样品、组织样品(例如，肿瘤组织)如肿瘤的手术切除物和其细胞提取物。在一些实施方案中，样品是全血或其分级组分如血浆、血清或细胞沉淀物。在其他实施方案中，通过使用本领域已知的任何技术从全血或其细胞级分中分离实体瘤循环型细胞，获得样品。在另外的其他实施方案中，样品是福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)的肿瘤组织样品，例如，来自实体瘤。
术语“受试者”或“患者”或“个体”一般包括人，但是也可以包括其他动物，例如，其他灵长类、啮齿类、犬科动物、猫科动物、马、羊、猪等。
III.实施方案的描述
在一个方面，本发明提供用于鉴定和/或定量核酸样品中等位变体的组合物。这些组合物中的一些可以包含：(a)等位基因特异性引物；(b)等位基因特异性阻断探针；(c)检测探针；(d)基因座特异性引物；和(e)它们的任意组合。在一些实施方案中，组合物还可以包含聚合酶、dNTP、适于PCR扩增的试剂和/或缓冲剂和/或模板序列或核酸样品。在一些情况下，聚合酶可以是热稳定性的。
在另一个方面，本发明提供用于鉴定和/或定量核酸样品中等位变体的组合物，其中所述组合物可以包含：(i)等位基因特异性引物，其中所述等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分与靶序列的第一等位变体互补并包含核酸修饰；和/或(ii)等位基因特异性阻断探针，其中所述等位基因特异性阻断探针的等位基因特异性核苷酸部分与靶序列的第二等位变体互补并且包含核酸修饰，并且其中所述等位基因特异性阻断探针在3'末端包含不可延伸性阻断部分。
在一些说明性实施方案中，组合物还可以包含与第一等位变体3’的靶序列区域互补并在相反链上的基因座特异性引物。在另外的其他实施方案中，组合物还包含检测探针。
在另一个方面，本发明提供用于扩增等位基因特异性序列的方法。这些方法中的一些可以包括：(a)将等位基因特异性引物与包含靶等位基因的第一核酸分子杂交；(b)将等位基因特异性阻断探针与包含备选的等位基因的第二核酸分子杂交，其中所述备选的等位基因对应与靶等位基因相同的基因座；(c)将基因座特异性检测探针与第一核酸分子杂交；(d)将基因座特异性引物与等位基因特异性引物的延伸产物杂交；和(e)PCR扩增靶等位基因。在具体的实施方案中，等位基因特异性阻断探针在3'末端包含不可延伸性阻断部分。在其他具体实施方案中，等位基因特异性引物和等位基因特异性阻断探针独立地分别在靶等位基因和备选的等位基因的位置处包含核酸修饰，例如，修饰的碱基(例如，LNA、PNA、TNA、ZNA和TzDNA)、核酸类似物或修饰核糖的核酸。
A.用于引物和/或探针的寡核苷酸的LNA、PNA、TNA、ZNA或TzNA修饰
在一个方面，本发明提供寡核苷酸组合物，其中所述寡核苷酸在3'末端包含至少一个核酸修饰和/或不可延伸性阻断部分。
核酸修饰的非限制性例子包括锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、苏糖胞核酸(TNA)、拉链核酸(ZNA)、三唑核酸(TzNA)和它们的组合。
在优选的实施方案中，本发明包括一种包含至少一种锁核酸(LNA)的寡核苷酸。LNA包括其中核糖环被连接2'-O原子和4'-C原子的亚甲基桥“锁定”的一类核酸类似物。LNA核苷含有常见的核碱基(T、C、G、A、U和mC)并且能够根据标准的Watson-Crick碱基配对法则形成碱基对。当掺入DNA寡核苷酸中时，LNA使得与互补性核苷酸链配对更快并且增加所产生的双链体的稳定性。掺入LNA单体至寡核苷酸中的亲和力增强效应由双链体解链温度增加2-8℃/LNA单体展示。在一些情况下，LNA指LNA的修饰，如，但不限于氧基-LNA、硫代-LNA和氨基-LNA。见例如，Johnson等人,Nucl.AcidRes.,2004,32,e55；Latorra等人,Hum.Mut.,2003,22,79；Chou等人,Biotech.,2005,39,644。
在一些实施方案中，本发明包括一种包含至少一种肽核酸(PNA)的寡核苷酸。PNA是非天然存在的和人工合成的核酸类似物或模拟物，其包含多种天然存在的或非天然存在的核碱基，所述核碱基由酰胺键连接至N-(2-氨基乙基)-甘氨酸重复单元的主链。本领域技术人员知晓，与类似的DNA-DNA双链体相比，PNA-DNA双链体以更大强度、更高稳定性、更迅速地并且以更大特异性结合，原因在于PNA链和DNA链之间缺少静电排斥作用。更大的稳定性由PNA-DNA双链体相对于类似DNA-DNA双链体的更高Tm反映。PNA复合物是更为热稳定的并且更不易遭核酸酶、蛋白酶和肽酶降解。已经显示PNA-DNA双链体的Tm部分地与盐浓度无关。此外，更可能的是，可以用PNA/DNA杂交确定单碱基错配，因为相对于降低DNA/DNA15聚双链体的熔点4℃-16℃而言，PNA/DNA15聚体中的单个错配降低熔点(Tm)8°-20℃。这具有改善匹配序列和错配序列之间区分作用的效果。见例如，Nielsen,P.E.和Egholm,M.,CurrentIssuesMolec.Biol.1;89-104(1999)；Orum等人“PeptideNucleicAcid”.LaboratoryMethodsfortheDetectionofMutationsandPolymorphismsinDNAed.GrahamR.Taylor.CRCPress,1997；Nielsen,P.E.和Egholm,M.,CurrentIssuesMolec.Biol.1;89-104(1999)；Gaylord等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,102:34-39(2005).
PNA可以在不干扰具错配碱基的模板上的反应的情况下，特异性阻断完全匹配的模板上引物复性和链延伸。PNA可以用来在SNP分析如但不限于非对称PCR夹紧、解链曲线分析中，通过抑制野生型等位基因扩增改善突变检测，(见例如，Oh等人J.Mol.Diagn.,12:418-424(2010)；Orum等人,NucleicAcidsRes,21:5332-5336(1993)；Luo等人,NucleicAcidsRes,34:e12(2006)；Karkare等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.,71:575-586(2006))。
在一些实施方案中，本发明可以包括一种包含至少一种拉链核酸(ZNA)的寡核苷酸。ZNA是与一个或多个阳离子精胺部分缀合的寡核苷酸。这种结构降低与其靶核酸链的静电排斥作用并增加寡核苷酸对其靶的亲和力。在寡核苷酸的任何位置连接的阳离子单元的数目可以调节分子的总体电荷，这可以按线性和可预测方式升高ZNA双链体(例如，ZNA-ZNA双链体、ZNA-DNA双链体和ZNA-RNA双链体)的相应Tm。它们在低镁浓度和在高复性温度是有效的，这可以有利于精确检测等位变体。ZNA可以是用荧光部分和荧光猝灭剂单标记的或双标记的。ZNA是从例如Sigma-Aldrich可商业获得的。见例如，Voirin等人,Nat.Protoc.,2:1360-1367(2007),Noir等人,J.Am.Chem.Soc.,130;13500-13505(2008),Moreau等人,NucleicAcidsRes.,37:e130(2009)；Paris等人,NucleicAcidsRes.,38:e95(2010)。
在其他实施方案中，本发明包括一种包含至少一种三唑核酸(TzNA)的寡核苷酸。可以使用点击化学(clickchemistry)(例如，铜催化的叠氮化物-炔环加成反应)合成TzNA寡核苷酸。含有基于AZT的三唑键的寡核苷酸可以在采用多种聚合酶扩增的情况下用作PCR模板(El-Sagheer等人,J.Am.Chem.Soc.,131:3958-3964(2009))。含有三唑接头的基因也可以在大肠杆菌(Escherichiacoli)中有功能(El-Sagheer等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,108:11338-11343(2011))。见例如，Isobe等人,Org.Lett.,10:3729-3732(2008)；Fujino等人,TetrahedronLett.,50:4101-4103(2009)；vonMatt等人,Bioorg.Med.Chem.Letts.,7:1553-1556(1997)。
在另外的其他实施方案中，本发明包括一种包含至少一种苏糖核酸(TNA)的寡核苷酸。TNA具有比天然核酸短一个原子的重复单元，然而它们可以与DNA、RNA和与自身发生碱基配对。尽管不想受具体理论约束，但是认为TNA强烈地与DNA杂交并且甚至更强烈地与RNA杂交，因为TNA是A形式DNA和A形式RNA的良好模拟物。与类似的DNA-DNA复合物相比，TNA-DNA双链体增加的稳定性导致改善的等位变体错配区分作用。见例如，Ichida等人,NucleicAcidsRes.,33:5219-5225(2005)。
修饰的碱基认为是因添加或删除一个或多个官能团、杂环结构上的差异(即，将碳替换为杂原子或反之亦然)和/或连接一个或多个接头臂结构至碱基，从而与天然存在碱基不同的那些碱基。在一些实施方案中，也可以在本发明的寡核苷酸引物和探针中包含天然存在碱基、修饰碱基和碱基类似物的全部互变异构形式。
在其他实施方案中，修饰的糖或糖类似物可以存在于本发明的寡核苷酸的一个或多个核苷酸亚单位中。糖修饰包括但不限于，取代基与糖的2'、3'和/或4'碳原子接合，糖的不同差向异构形式、糖苷键的α-或β-构型差异和其他异头变化。糖部分包括但不限于戊糖、脱氧戊糖、己糖、脱氧己糖、核糖、脱氧核糖、葡萄糖、阿拉伯糖、五呋喃糖、木糖、来苏糖和环戊基。
在某些实施方案中，一种或多种修饰的核苷酸间键或主链键可以存在于本发明的寡核苷酸中。这类修饰的键包括但不限于肽、磷酸酯、磷酸二酯、磷酸三酯、烷基磷酸酯、烷基膦酸酯、硫代硫酸酯(thiophosphate)、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、磷酰胺酯、取代的磷酰胺酯等。本领域技术人员将显而易见与在充当探针和/或引物的寡核苷酸中的用途相容的碱基、糖和/或核苷酸间键的额外修饰。
不可延伸性阻断部分可以包含对阻断探针的核糖环3'-OH的任何修饰，所述修饰防止由聚合酶添加其他碱基至寡核苷酸序列的3'末端。在一些实施方案中，阻断部分可以包括但不限于任选取代的C1-C24烷基二醇(例如，3'-己二醇修饰)、任选取代的C2-C24烯基二醇、任选取代的C2-C24炔基二醇、小沟结合物(MGB)、胺(NH2)、生物素、PEG、PO4及其混合物。在具体的实施方案中，任选取代的C1-C24烷基二醇包含对等位基因特异性阻断探针3'末端的甲二醇、乙二醇、1,3-丙二醇、1,4-丁二醇、1,5-戊二醇、1,6-己二醇、1,7-庚二醇或1,8-辛二醇修饰。在一些实施方案中，不可延伸性阻断部分包含任选取代的C1-C20、C1-C12、C2-C20、C2-C12、C4-C12、C4-C10、C4-C8、C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11或C12烷基二醇。在其他实施方案中，不可延伸性阻断部分包含任选取代的C2-C20、C2-C12、C4-C12、C4-C10、C4-C8、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11或C12烯基二醇或炔基二醇。
在某些实施方案中，不可延伸性阻断部分不包含或不包括小沟结合物(MGB)和/或PO4基团。在某些其他实施方案中，不可延伸性阻断部分基本上由以下组成或由以下组成：任选取代的C1-C24烷基二醇(例如，甲二醇、乙二醇、1,3-丙二醇、1,4-丁二醇、1,5-戊二醇、1,6-己二醇、1,7-庚二醇或1,8-辛二醇修饰或者任选取代的C1-C20、C1-C12、C2-C20、C2-C12、C4-C12、C4-C10、C4-C8、C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11或C12烷基二醇修饰)、任选取代的C2-C24烯基二醇或任选取代的C2-C24炔基二醇(例如，任选取代的C2-C20、C2-C12、C4-C12、C4-C10、C4-C8、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11或C12烯基二醇或炔基二醇修饰)或它们的混合物。
术语“任选取代的”包括用取代基取代至少一个氢原子。在“氧代”取代基(=O)的情况下，替换两个氢原子。取代基的非限制性例子包括氧代、卤素、杂环、-CN、-ORx、-NRxRy、-NRxC(=O)Ry、-NRxSO2Ry、-C(=O)Rx、-C(=O)ORx、-C(=O)NRxRy、-SOnRx和-SOnNRxRy，其中n是0、1或2，其中Rx和Ry是相同或不同的并独立地是氢、烷基或杂环，并且其中每个烷基和杂环取代基可以进一步用本文所述的一种或多种取代基取代。在一系列取代基之前使用时，术语“任选取代的”意指该系列中的每个取代基可以如本文所述那样任选地取代。
在某些实施方案中，等位基因特异性阻断探针的等位基因特异性核苷酸部分远离等位基因特异性阻断探针的阻断部分约5个至约15个或约5个至约10个核苷酸，如约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸存在。在某些其他情况下，等位基因特异性阻断探针在PCR扩增期间不被切割。在另外的情况下，等位基因特异性阻断探针的Tm是约58℃至约66℃。
在一些实施方案中，等位基因特异性阻断探针和/或等位基因特异性引物包含至少约1，2、3、4、5或6个(例如2至6个)核酸修饰。在某些情况下，一个或多个修饰可以增加匹配和错配的靶序列之间的Tm差异和/或降低错配引发效率，因而改善测定法特异性和/或选择性。在某些其他情况下，一个或多个修饰改善循环型肿瘤细胞样品的等位基因区分作用。这类修饰的非限制性例子包括锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、苏糖核酸(TNA)、拉链核酸(ZNA)、三唑核酸(TzNA)、5'甲基-脱氧胞苷、2'-氟修饰的核酸、8-氮杂-7-去氮杂-dA(ppA)、8-氮杂-7-去氮杂-dG(ppG)、1H-吡唑并[4,4-d]嘧啶-4(5H)-6(7H)-二酮(ppX)、2'-脱氧假异胞苷(异dC)、5-氟-2'-脱氧尿苷(fdU)和2'-O,4'-C-亚乙基桥接的核酸(ENA)修饰以及这些修饰的组合。在某些实施方案中，在等位基因特异性阻断探针和/或等位基因特异性引物上存在的LNA修饰的是不相邻或不连续的，从而两个LNA碱基在序列中彼此不毗邻。
在优选的实施方案中，在等位基因特异性阻断探针和/或等位基因特异性引物上存在的核酸修饰包含一个或多个LNA核苷酸。在某些实施方案中，该修饰位于(a)3'末端处、(b)5'末端处、(c)内部位置处或在等位基因特异性阻断探针和/或等位基因特异性引物内部的(a)、(b)或(c)的任何组合处。在一些优选的实施方案中，一个修饰(例如，LNA)位于等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分处，从而该修饰包含用来在等位变体之间区分的核碱基。在其他优选的实施方案中，一个修饰(例如，LNA)位于等位基因特异性阻断探针的等位基因特异性核苷酸部分处，从而该修饰包含用来在等位变体之间区分的核碱基。在其他优选的实施方案中，不将核酸修饰(例如，LNA)置于等位基因特异性引物和/或阻断探针的相邻或连续位置中。
在一些实施方案中，存在于等位基因特异性阻断探针和/或等位基因特异性引物上的核酸修饰独立地包含一个或多个(至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或全部)PNA、ZNA、TNA和/或TzDNA核苷酸。
可以在本发明中使用的核酸修饰的其他例子例如在美国专利号7,517,978中描述，所述文献的公开内容通过引用的方式完整并入本文用于全部目的。
许多修饰的核酸部分，包括例如LNA、PNA、ZNA、TNA、TzDNA、ppA、ppG和5-氟-dU(fdU)，是市售的并且可以用于领域熟知的寡核苷酸合成本方法中。在一些实施方案中，可以使用本领域也熟知的标准化学手段实施修饰的引物和探针的合成。例如，可以通过使用(a)修饰的核苷作为DNA合成支持物、(b)使用修饰的核苷作为亚磷酰胺、(c)使用DNA合成(例如，向DNA序列中掺入时可转化的亚酰胺化物的苄胺处理)期间的试剂或(d)通过合成后修饰引入修饰的部分或碱基。
此外，在一些实施方案中，掺入本发明等位基因特异性引物和/或等位基因特异性阻断探针的寡核苷酸中的核苷酸单元可以具有与一个或多个碱基(例如，借助连接臂)共价结合的交联功能(烷基化剂)。
在又一个方面，本发明提供用于检测和/或定量混合样品中等位变体的方法。这些方法中的一些可以包括：(a)将第一等位基因特异性引物与包含第一等位基因(等位基因-1)的第一核酸分子在第一反应混合物中杂交并且将第二等位基因特异性引物与包含第二等位基因(等位基因-2)的第一核酸分子在第二反应混合物中杂交，其中等位基因-2对应与等位基因-1相同的基因座；(b)将第一等位基因特异性阻断探针与包含等位基因-2的第二核酸分子在第一反应混合物中杂交并且将第二等位基因特异性阻断探针与包含等位基因-1的第二核酸分子在第二反应混合物中杂交；(c)将第一检测探针与第一核酸分子在第一反应混合物中杂交并且将第二检测探针与第一核酸分子在第二反应混合物中杂交；(d)将第一基因座特异性引物与第一等位基因特异性引物的延伸产物在第一反应混合物中杂交并且将第二基因座特异性引物与第二等位基因特异性引物的延伸产物在第二反应混合物中杂交；(e)PCR扩增第一核酸分子以形成扩增子第一集合或样品并PCR扩增第二核酸分子以形成扩增子第二集合或样品；和(f)将扩增子第一集合与扩增子第二集合比较以定量包含等位基因-2的样品中的等位基因-1和/或包含等位基因-1的样品中的等位基因-2。
在又一个方面，本发明提供在疑似包含至少靶序列的第二等位变体的核酸样品中检测靶序列的第一等位变体的方法。这类方法的非限制性例子包括通过合并以下一种或多种组分形成反应混合物：(i)核酸样品；(ii)等位基因特异性引物，其中所述等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分与靶序列的第一等位变体互补并且包含如本文所述的核酸修饰；(iii)与包含第二等位变体的靶序列区域互补的等位基因特异性阻断探针，其中所述区域覆盖与等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分的结合位置相对应的位置，并且其中所述等位基因特异性阻断探针包含如本文所述的不可延伸性阻断部分和核酸修饰；(iv)与第一等位变体3’的靶序列区域互补并在相反链上的基因座特异性引物；和/或(v)检测探针。在某些情况下，第一等位变体包含突变等位基因并且第二等位变体包含野生型等位基因。
接下来，使用基因座特异性引物和等位基因特异性引物对该反应混合物实施扩增反应，一般是PCR扩增反应，以形成扩增子。随后，通过与扩增子结合时检测探针的可检测特性的变化检测该扩增子，因而检测核酸样品中靶基因的第一等位变体。说明性实施方案中的检测探针是5'核酸酶探针并且说明性实施方案中的可检测特性是荧光。
在一些实施方案中，等位基因特异性引物的5'靶区域的3'核苷酸位置是等位基因特异性核苷酸位置。在其他实施方案中，等位基因特异性阻断探针的等位基因特异性核苷酸部分位于等位基因特异性阻断探针的中心。
在某些实施方案中，通过评价检测探针的可检测特性变化确定第一等位变体的量。
在一些实施方案中，在核酸样品中检测靶序列中等位变体的本发明方法包括以下循环方案：
(a)形成包含以下一种或多种组分的反应混合物：
(i)核酸样品；
(ii)等位基因特异性引物，其中等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分与靶序列的第一等位变体互补并且在如本文所述的第一等位变体的位置处包含核酸修饰；
(iii)与包含第二等位变体的靶序列区域互补的等位基因特异性阻断探针，其中所述区域覆盖与等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分的结合位置相对应的位置，并且其中所述等位基因特异性阻断探针在如本文所述的第二等位变体的位置处包含阻断部分和核酸修饰；
(iv)与第一等位变体3’的靶序列区域互补并在相反链上的基因座特异性引物；和
(v)检测探针；
(b)使用在复性/延伸温度运行的包含许多个循环轮次的循环方案扩增靶序列的PCR；和
(c)检测由步骤(b)产生的靶序列扩增产物中检测探针的可检测特性变化。
本发明方法有几个主要优点。首先，本文所述的基因分型测定法通过降低匹配的靶或等位基因的Ct值，改善检测灵敏度。其次，本文所述的基因分型测定法通过增加匹配序列和错配序列的Ct值之间的ΔCt，改善特异性。此外，本文所述的基因分型测定法改善多种测定法之间的效率一致性。
在其他实施方案中，本发明的方法可以包括一个2阶段循环方案。在一些实施方案中，在核酸样品中检测靶序列中等位变体的方法包括：
(a)形成包含以下一种或多种组分的反应混合物：
(i)核酸样品；
(ii)等位基因特异性引物，其中等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分与靶序列的第一等位变体互补并且在如本文所述的第一等位变体的位置处包含核酸修饰；
(iii)与包含第二等位变体的靶序列区域互补的等位基因特异性阻断探针，其中所述区域覆盖与等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分的结合位置相对应的位置，并且其中所述等位基因特异性阻断探针在如本文所述的第二等位变体的位置处包含阻断部分和核酸修饰；
(iv)与第一等位变体3’的靶序列区域互补并在相反链上的基因座特异性引物；和
(v)检测探针；
(b)使用一个2阶段循环方案将靶序列PCR扩增，所述2阶段循环方案包括：
(i)第一扩增步骤，所述第一扩增步骤包括在第一复性/延伸温度运行的第一循环次数；和
(ii)第二扩增步骤，所述第二扩增步骤包括在第二复性/延伸温度运行的第二循环次数；和
(c)检测由步骤(b)产生的靶序列扩增产物中检测探针的可检测特性变化。
在一些情况下，步骤b)中的第一循环次数少于第二循环次数并且第一复性/延伸温度低于第二复性/延伸温度。在一些实施方案中，在该循环方案的第一阶段中使用的循环次数是在第二阶段中使用的总循环次数的约2%-20%、4%-18%、6%-16%、8%-14%、10%-12%或其之间的任何百分数。在其他实施方案中，第一阶段采用约1至10个循环、2至8个循环，3至7个循环，4至6个循环或其之间的任何循环次数，例如，2、3、4、5、6或7个循环。
在一些实施方案中、在该循环方案的第二阶段中使用的循环次数约5倍、6倍、8倍、10倍、12倍、18倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍于第一阶段中使用的循环次数。在一些实施方案中，第二阶段采用约30至50个循环、35至48个循环、40至46个循环或其之间的任何循环次数，例如，35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45或46个循环。
在一些实施方案中，在第一循环阶段期间使用的较低复性/延伸温度比第二循环阶段期间使用的复性/延伸温度低约1℃、约2℃、约3℃、约4℃或约5℃。在一些情况下，第一阶段的复性/延伸温度是在约50℃至60℃、52℃至58℃或54℃至56℃之间，例如，53℃、54℃、55℃或55℃。在某些其他实施方案中，第二阶段的复性/延伸温度是在约56℃至66℃、58℃至64℃或60℃至62℃之间，例如，58℃、60℃、62℃或64℃。
在另一个方面，本发明提供包含以下组分的反应混合物：(i)核酸分子；(ii)等位基因特异性引物，其中所述等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分与靶序列的第一等位变体互补并且包含核酸修饰；(iii)等位基因特异性阻断探针，其中所述等位基因特异性阻断探针的等位基因特异性核苷酸部分与靶序列的第二等位变体互补并且包含核酸修饰，并且其中所述等位基因特异性阻断探针在寡核苷酸序列的3'末端处包含阻断部分；(iv)与第一等位变体3’的靶序列区域互补并在相反链上的基因座特异性引物；和/或(v)检测探针。
在一些实施方案中，本发明的方法用来检测第一等位变体，所述第一等位变体以小于给定SNP或基因的第二等位变体约1/10、1/100、1/1,000、1/10,000、1/100,000、1/1,000,000、1/10,000,000、1/100,000,000或1/1,000,000,000和其之间任何分数范围的频率存在。在其他实施方案中，本发明的方法用来检测第一等位变体，所述第一等位变体以小于每1、10、300、500或1,000微升样品或反应体积约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、250、500、750、1,000、2,500、5,000、7,500、10,000、25,000、50,000、75,000、100,000、250,000、500,000、750,000或1,000,000个拷贝和其之间任何分数范围存在。
在某些实施方案中，第一等位变体是突变等位基因并且第二等位变体是野生型等位基因。在一些实施方案中，本发明的方法可以涉及在至少约1,000至1,000,000个野生型分子，如约1,000至10,000、约10,000至100,000、或约100,000至1,000,000个野生型分子，或其之间任何分数范围的背景下检测一个突变体分子。在一些实施方案中，所述方法可以提供至少与基于的测定法可比较的高灵敏度和效率。
在另一个方面，本发明提供在包含备选的第二等位变体的样品中定量第一等位变体的试剂盒，所述试剂盒包含：(a)等位基因特异性引物；(b)等位基因特异性阻断探针；(c)基因座特异性引物；(d)检测探针；和/或(e)聚合酶。
在又一个方面，本发明提供包含两个或更多个容器的试剂盒，所述容器包含独立分布在两个或更多个容器之一中的以下组分：(i)等位基因特异性引物，其中所述等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分与靶序列的第一等位变体互补并且包含如本文所述的核酸修饰；和(ii)与包含第二等位变体的靶序列区域互补的等位基因特异性阻断探针，其中所述区域覆盖与等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分的结合位置相对应的位置，并且其中所述等位基因特异性阻断探针包含如本文所述的不可延伸性阻断部分和核酸修饰。在具体的实施方案中，等位基因特异性阻断探针包含与靶序列的第二等位变体互补的等位基因特异性核苷酸部分，其中所述等位基因特异性核苷酸部分包含核酸修饰，并且其中所述等位基因特异性阻断探针在寡核苷酸序列的3'末端包含阻断部分。
在一些实施方案中，试剂盒还可以包含与第一等位变体3’的靶序列区域互补并在相反链上的基因座特异性引物。在其他实施方案中，试剂盒还可以包含检测探针。在另外的其他实施方案中，试剂盒还可以包含用于预扩增的额外组分。
在一些实施方案中，本发明的组合物、方法和/或试剂盒可用于检测样品如血液或细针抽吸物(FNA)中的肿瘤细胞以便早期诊断癌症。在其他实施方案中，本发明的组合物、方法和/或试剂盒可用于检测和验证癌症或疾病相关性遗传性变异或体细胞突变。在另外的其他实施方案中，所述组合物、方法和/或试剂盒可以用于二等位、三等位或四等位SNP的基因分型。在其他实施方案中，本发明的组合物、方法和/或试剂盒可以用于鉴定单个或多个核苷酸插入或缺失突变。在一些实施方案中，本发明的组合物、方法和/或试剂盒可以用于来自混合DNA样品的DNA分型、用于QC和人类鉴定测定法、用于针对细胞污染的细胞系QC、等位基因表达分析、病毒分型/稀有病原体检测、从汇集样品检测突变、检测血液中循环型肿瘤细胞和/或出生前诊断。
B.等位基因特异性引物
在一些实施方案中，等位基因特异性引物是短的寡聚物，其长度范围是约15-30、如约16-28、约17-26、约18-24或约20-22个核苷酸或其之间任何范围的核苷酸。在一些实施方案中，等位基因特异性引物的Tm范围是约50℃至70℃，如约52℃至68℃、约54℃至66℃、约56℃至64℃、约58℃至62℃或其之间的任何温度(例如，53℃、54℃、55℃、56℃)。在其他实施方案中，等位基因特异性引物的Tm比扩增期间使用的PCR循环条件的复性/延伸温度高约3℃至6℃。在某些情况下，设计具有低Tm的等位基因特异性引物增加等位变体的区分作用。
在本发明的一些实施方案中，低等位基因特异性引物浓度改善选择性。在某些情况下，等位基因特异性引物的浓度降低至900nM以下增加匹配序列和错配序列之间的ΔCt。在一些实施方案中，等位基因特异性引物的浓度是约20nM至900nM，如约50nM至700nM、约100nM至500nM、约200nM至400nM、约200nM至300nM、约400nM至500nM或其之间的任何范围。
在一些实施方案中，本发明的等位基因特异性引物可以包含对靶目的等位基因特异的等位基因特异性核苷酸部分。等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分与某基因的一个等位基因互补，但是与该基因的另一个等位基因不互补。换句话说，该等位基因特异性核苷酸部分与基因的一个或多个可变核苷酸位置结合，所述可变核苷酸位置是已知对于基因的不同等位变体而言包括不同核苷酸的核苷酸位置。该等位基因特异性核苷酸部分是至少一个核苷酸长度。在示例性实施方案中，该等位基因特异性核苷酸部分是一个核苷酸长度。在一些实施方案中，等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分位于该等位基因特异性引物的3'末端处。在其他实施方案中，等位基因特异性核苷酸部分位于相距该等位基因特异性引物的3'最末端约1-2、3-4、5-6、7-8、9-11、12-15或16-20个核苷酸。
设计成靶向区分碱基的等位基因特异性引物也可以改善等位变体的区分作用。在一些实施方案中，该等位基因特异性核苷酸部分的核苷酸靶向高度区分性碱基(例如，用于检测A/A、A/G、G/A、G/G、A/C或C/A等位基因)。区分作用较低的碱基例如可以涉及检测C/C、T/C、G/T、T/G、C/T等位基因。在一些实施方案中，例如，当待检测的等位基因涉及A/G或C/TSNP时，A或G可以用作等位基因特异性引物的3'等位基因特异性核苷酸部分(例如，如果A或T是主要等位基因)，或C或T可以用作等位基因特异性引物的3'等位基因特异性核苷酸部分(例如，如果C或G是主要等位基因)。在其他实施方案中，当检测和/或定量A/TSNP时，A可以用作等位基因特异性引物3'末端处的核苷酸特异性部分(例如，等位基因特异性核苷酸部分)。在另外的其他实施方案中，当检测和/或定量C/GSNP时，G可以用作等位基因特异性引物3'末端处的核苷酸特异性部分。
在一些实施方案中，等位基因特异性引物可以包含对目的多核苷酸序列(或基因座)特异的靶特异性部分。在其他实施方案中，靶特异性部分与目的靶多核苷酸序列互补约75-85%、85-95%、95-99%或100%。在一些实施方案中，等位基因特异性引物的靶特异性部分可以包含等位基因特异性核苷酸部分。在其他实施方案中，靶特异性部分位于等位基因特异性核苷酸部分的5'。靶特异性部分可以是约4-30、约5-25、约6-20、约7-15或约8-10个核苷酸长度。在一些实施方案中，靶特异性部分的Tm低于用于PCR循环的复性/延伸温度约5℃。在一些实施方案中，等位基因特异性引物的靶特异性部分的Tm是约53℃至60℃、约52℃至59℃、约53℃至58℃、约54℃至57℃、约55℃至56℃或约50℃至约60℃。
在使用两个等位基因特异性引物的实施方案中，第一等位基因特异性引物的靶特异性部分和第二等位基因特异性引物的靶特异性部分包含相同的序列或是相同的序列。
在一些实施方案中，等位基因特异性引物可以包含一个或多个与天然存在碱基(即，腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶)不同的修饰核碱基或核苷碱基。在一些实施方案中，修饰的碱基仍能够有效地与含有腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶部分的核酸单元杂交。在一些实施方案中，修饰的碱基可以增加匹配和错配的靶序列之间的Tm差异和/或降低错配引发效率，因而改善测定法特异性、选择性和重现性。在一些实施方案中，修饰的碱基可以增加等位基因特异性引物对其互补性DNA靶的结合亲和力。
在具体的实施方案中，等位基因特异性引物包含至少一个、两个或更多个修饰的碱基。修饰的碱基的例子包括但不限于锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、苏糖核酸(TNA)、拉链核酸(ZNA)和三唑DNA(TzDNA)、8-氮杂-7-去氮杂-dA(ppA)、8-氮杂-7-去氮杂-dG(ppG)、2'-脱氧假异胞苷(isodC)、5-氟-2'-脱氧尿苷(fdU)、2'-O,4'-C-亚乙基桥接的核酸(ENA)碱基及它们的组合。
在一些实施方案中，等位基因特异性引物包含2至6个LNA、PNA、TNA、ZNA或核糖修饰的核酸。这些修饰的碱基显示出针对互补性DNA和RNA的热稳定性，这允许在本发明的方法中优异的错配区分作用。这些修饰碱基的高结合亲和力可以用于需要高特异性，选择性和/或重现性的杂交测定法中。
在一些实施方案中，等位基因特异性引物上存在的修饰碱基包含一个或多个LNA修饰。在这些实施方案中，不将LNA修饰置于等位基因特异性引物上的相邻位置中。在某些实施方案中，修饰的碱基位于(a)3'末端处、(b)5'末端处、(c)内部位置处或在等位基因特异性引物内部的(a)、(b)或(c)的任何组合处。在一些实施方案中，修饰的碱基(例如，LNA核苷)位于等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分处，从而LNA核苷包含用来在等位变体之间区分的核碱基。
在优选的实施方案中，LNA修饰位于等位基因特异性引物的3'末端处。在LNA处于等位变体的3'末端处情况下，等位基因特异性引物的解链温度(Tm)增加，因而增强本发明的测定法针对等位变体的选择性。此外，等位变体的选择性扩增可以在PCR循环期间以较高的扩增温度发生。在一些情况下，LNA在3'末端的存在也可以帮助减缓DNA聚合酶的3'→5'校对核酸外切酶活性。在其他情况下，LNA在倒数第二位置处的存在可以提供对抗DNA聚合酶3'→5'核酸外切酶活性的保护(见例如，Giusto,D和King,G,NucleicAcidsRes.,32:3,e32,1-8(2004))。
在一些实施方案中，多个LNA存在于引物中并且在任何位置距3'末端间隔5至10个碱基。在其他实施方案中，该引物可以含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个LNA、所述LNA在任何位置距3'末端间隔2、3、4、5、6、7、8、9或10个之间的碱基。在另外的其他实施方案中，LNA修饰位于相对于引物3'末端的倒数第二位置处、位于3'末端处、位于5'末端处及它们的组合。在这些实施方案中，一般不将LNA修饰置于引物序列的相邻位置中。
寡核苷酸中的LNA修饰增加对互补性DNA靶的结合亲和力。较高的亲和力关联于核糖锁定的3'内部构象的构象柔性降低。类似于DNA碱基，LNA碱基由相同的磷酸酯主链连接，从而允许LNA-DNA引物与其互补性DNA有效结合，因此导致该双链体的较高Tm。该区分作用依赖于引物与基因组DNA结合并在PCR循环期间保持结合的能力。这因LNA-DNA引物的高结合亲和力实现。LNA-DNA双链体的较高Tm与其更好的结合亲和力相关。与具有较低Tm的非LNA引物相比，具有LNA的等位基因特异性引物允许PCR循环期间较高的反应温度，这增强基因分型测定法的特异性。
在一些实施方案中，等位基因特异性引物、阻断探针和/或检测探针包含PNA修饰。等位基因特异性引物上的PNA修饰提供针对其DNA靶的高特异性和高灵敏度。PNA的较高结合亲和力和较高Tm为本文所述的方法提供高的特异性和重现性。
本领域技术人员知晓，与DNA-DNA双链体相比，PNA-DNA双链体以更大强度、更高稳定性、更迅速地并且更大特异性结合，原因在于PNA链和DNA链之间缺少静电排斥作用。更大的稳定性由PNA-双链体相对于类似的DNA-DNA双链体而言的更高Tm反映。PNA复合物是更为热稳定的并且更不易遭核酸酶、蛋白酶和肽酶降解。已经显示PNA-DNA双链体的Tm部分地与盐浓度无关。在一些实施方案中，尽管存在二级结构，具有PNA的等位基因特异性引物和/或阻断探针可以在不存在盐的情况下结合其核酸靶。见例如，Nielsen,P.E.和Egholm,M.,CurrentIssuesMolec.Biol.1;89-104(1999)；Gaylord等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,102:34-39(2005))，所述每篇文献的公开内容通过引用方式完整并入本文用于全部目的。
在一些实施方案中，等位基因特异性引物包含一个或多个拉链核酸(ZNA)分子。ZNA引物具有对其互补性靶DNA增加的亲和力，原因在于核酸链之间的静电排斥作用减少。一个或多个ZNA修饰在等位基因特异性引物上的存在可以增加ZNA-DNA双链体的Tm并在本发明的方法中改善等位基因区分作用。
在一些实施方案中，等位基因特异性引物包含一个或多个(3'-2')α-L-苏糖核酸(TNA)。TNA可以牢固地与DNA杂交并且是A型DNA和RNA的良好模拟物。与类似的DNA-DNA复合物相比，归因于TNA-DNA双链体增加的稳定性，在本发明的方法中使用TNA等位基因特异性引物可以改善等位变体的错配区分作用。
在其他实施方案中，等位基因特异性引物包含一个或多个三唑连接的DNA(TzDNA)分子。与类似的DNA引物相比，由于TzDNA针对其匹配的DNA靶具有增加的热稳定性，所以TzDNA等位基因特异性引物可以用于本发明的方法中以改善等位变体区分作用。
在一些实施方案中，等位基因特异性引物包含尾。在一些情况下，包含尾的等位基因特异性引物使得减少引物的总体长度成为可能，因而在不显著影响测定法灵敏度的情况下降低Tm。在一些情况下，该尾在等位基因特异性引物的5'末端。在其他情况下，该尾位于等位基因特异性引物的靶特异性部分和/或等位基因特异性核苷酸部分的5'。在一些实施方案中，尾不互补于目的靶多核苷酸序列约65-75%、约75-85%、约85-95%、约95-99%或约100%。在一些实施方案中，尾可以是约2-40，如约4-30、约5-25、约6-20、约7-15或约8-10个核苷酸长度。在一些实施方案中，尾富含GC。例如，在一些实施方案中，尾序列包含约50-100%、约60-100%、约70-100%、约80-100%、约90-100%或约95-100%G和/或C核苷酸。
等位基因特异性引物的尾可以按众多不同的方式形成，所述方式包括但不限于，其中尾区域在引物延长后可用于与引物延伸产物中的互补序列(如果存在的话)杂交的构型。作为非限制性例子，等位基因特异性引物的尾可以与因基因座特异性引物延长产生的延伸产物中的互补序列杂交。
在使用两个等位基因特异性引物的实施方案中，第一等位基因特异性引物的尾和第二等位基因特异性引物的尾包含相同的序列或是相同的序列。
C.等位基因特异性阻断探针
在一些实施方案中，将本发明的等位基因特异性阻断探针专门设计成与第一等位基因杂交并有效地和选择性地抑制第一等位基因扩增，而不影响第二变体的扩增。在本发明的一些方面，将阻断探针专门设计成与野生型等位基因杂交并抑制其扩增，而不影响突变等位基因的扩增。
等位基因特异性阻断探针可以设计为短的寡聚物，所述寡聚物是单链并且具有约100个核苷酸或更少、约50个核苷酸或更少、约30个核苷酸或更少、约20个核苷酸或更少或约5-20个核苷酸长度。
在一些实施方案中、阻断探针的Tm是58℃至70℃、61℃至69℃、62℃至68℃、63℃至67℃、64℃至66℃或约60℃至约63℃或者其之间的任何范围。在另外的其他实施方案中，等位基因特异性阻断探针的Tm比扩增期间使用的PCR循环条件中的复性/延伸温度高约3℃至6℃。
在一些实施方案中，阻断探针在PCR扩增期间未遭切割。在一些实施方案中，阻断探针在它们的3'末端处包含不可延伸性阻断部分。在其他实施方案中，阻断探针还在其3'末端、5'末端和/或其之间的任何内部位置包含其他部分，包括但不限于，额外的不可延伸性阻断部分、猝灭剂部分、荧光部分等。在某些其他实施方案中，当杂交至它们的靶序列时，等位基因位置远离等位基因特异性阻断探针的不可延伸性阻断部分约5-15个，如约5-11、约6-10、约7-9、约7-12或约9-11个核苷酸，如约6、约7、约8、约9、约10或约11个核苷酸存在。在一些实施方案中，不可延伸的阻断部分可以包括但不限于任选取代的C1-C24烷基二醇(例如，3'-己二醇修饰)，任选取代的C2-C24烯基二醇或C2-C24炔基二醇、小沟结合物(MGB)、胺(NH2)、生物素、PEG、PO4及其混合物。如本文中公开，在等位基因特异性阻断探针中使用不可延伸性阻断部分(例如，3'-己二醇修饰)可以增加等位基因特异性PCR的特异性。用于使不可延伸性阻断部分缀合至等位基因特异性阻断探针的适合方法是本领域普通技术人员已知的。例如，包含C1-C24烷基二醇(例如，己二醇)的阻断部分可以借助亚磷酰胺键与等位基因特异性阻断探针的3'末端缀合。
在一些方面，具有己二醇修饰的阻断探针比具有磷酸化的阻断探针表现得更好。碳链的灵活性和疏水性允许阻断物与其野生型靶杂交，而不遭遇空间位阻。虽然在3'末端的磷酸酯基团与靶野生型序列结合，但是效率可能因磷酸酯基团的庞大和离子本质削弱。
在某些实施方案中，不可延伸性阻断部分不包含或不包括小沟结合物(MGB)。在某些其他实施方案中，不可延伸性阻断部分不包含或不包括PO4基团。在其他实施方案中，不可延伸性阻断部分基本上由任选取代的C1-C24烷基二醇(例如，3'-己二醇修饰)、任选取代的C2-C24烯基二醇或任选取代的C2-C24炔基二醇组成或由其组成。
在一些实施方案中，阻断探针具有双脱氧胞苷(ddC)部分，所述双脱氧胞苷部分是防止由DNA聚合酶3'延长的3'链终止物。
在一些实施方案中，等位基因特异性阻断探针可以包含一个或多个与天然存在碱基(即，腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶)不同的修饰核碱基或核苷碱基。在一些实施方案中，修饰的碱基仍能够有效地与含有腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶部分的核酸单元杂交。在一些实施方案中，修饰的碱基可以增加匹配和错配的靶序列之间的Tm差异和/或降低错配引发效率，因而改善测定法特异性和选择性。
本领域那些技术人员知晓，探针的错配区分能力依赖于匹配和错配的探针-靶双链体之间解链温度(ΔTm)的差异。当探针尺寸缩减时，ΔTm一般增加，因为错配对双链体具有更大的去稳定化作用。通常而言，更好区分匹配序列和错配序列的等位基因特异性探测器具有更大的ΔTm值。
在具体的实施方案中，本发明的等位基因特异性阻断探针包含至少一个、两个或更多个修饰的碱基。修饰碱基的非限制性例子包括锁核酸(LNA)、8-氮杂-7-去氮杂-dA(ppA)、8-氮杂-7-去氮杂-dG(ppG)、2'-脱氧假异胞苷(isodC)、5-氟-2'-脱氧尿苷(fdU)、2'-O,4'-C-亚乙基桥接的核酸(ENA)碱基及它们的组合。在优选的实施方案中，在等位基因特异性阻断探针上存在的修饰碱基包含一个或多个LNA修饰。在某些实施方案中，修饰的碱基位于(a)3'末端处、(b)5'末端处、(c)内部位置处或在等位基因特异性阻断探针内部的(a)、(b)或(c)的任何组合处。在一些优选的实施方案中，修饰的碱基(例如，LNA核苷)是位于等位基因特异性阻断探针的等位基因特异性核苷酸部分处，从而LNA核苷包含用来在等位变体之间区分的核碱基。
在一些实施方案中，阻断探针的抑制作用随阻断探针的Tm增加而增加。取决于LNA在阻断物中的位置，Tm可以增加1-8℃(见例如Koshkin等人,Tetrahedron,54:3607-3630(1998)，Obika等人,TetrahedronLett.,39:5401-5404(1998)，Wang等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.,9:1147-1150(1999))。Tm较高的阻断物可以在延伸期间保持与野生型等位基因复性，因而抑制有效的PCR扩增。双链体形成的动力学研究已经显示与天然DNA的双链体相比，含有LNA的DNA双链体具有较慢解离速率。还已经显示，LNA的刚性结构影响其与TaqDNA聚合酶相互作用(Larotta等人,MolecularandCellularProbes,17:253-259(2003))。
在本发明的一些方面，阻断探针可以拥有一个或多个LNA修饰。在一些实施方案中，将LNA置于阻断物序列的中间位置、倒数第二位置、5'末端、阻断序列的不同间隔和/或它们的组合。在一些实施方案中，将LNA置于与野生型变体互补的变异核苷酸处。在其他实施方案中，阻断探针不含相邻的LNA。
在使用两个等位基因特异性阻断探针的实施方案中，第一等位基因特异性阻断探针结合至与第一等位基因特异性引物相同的链或序列，而第二等位基因特异性阻断探针结合至与第一等位基因特异性引物相对的链或互补的序列。
在一些实施方案中，等位基因特异性引物和阻断探针均包含LNA。修饰碱基同时在引物和阻断探针上的存在增强本发明测定法的特异性。已经在双链体形成的动力学研究中显示含有LNA的复合物的较慢解离速率归因于与天然DNA相比，其杂交性能的差异。LNA分子的刚性结构可能改变它与TaqDNA聚合酶相互作用的方式(Larotta等人,Mol.Cell.Probes,17:253-259(2003))。
D.检测探针
在一些方面，本发明的方法需要使用具有高解链温度的短检测探针长度。具有高Tm的较短长度探针是良好等位基因区分作用必需的，尤其当处理困难突变如G→A或G→T时。检测探针的例子包括但不限于小沟结合(MGB)探针、Zen探针(IDT，Coralville，IA)、拉链核酸(ZNA)探针和蛋白质核酸(PNA)探针。
在一些实施方案中，将检测探针设计为具有约15-30个核苷酸，如约16、约18、约22、约24、约30个或其之间任何数目个核苷酸的短寡聚物。在一些实施方案中，检测探针的Tm是约60℃至70℃、约61℃至69℃、约62℃至68℃、约63℃至67℃、约64℃至66℃或其之间的任何温度。
在一些实施方案中，检测探针是基因座特异性检测探针(LST)。在其他实施方案中，检测探针是5'核酸酶探针。在一些实施方案中，检测探针可以包含MGB部分、报道分子部分(例如，FAMTM、TETTM、JOETM、VICTM或Green)、猝灭剂部分(例如，黑洞猝灭剂TM或TAMRATM)和/或被动参比(例如，ROXTM)。在一些示例性实施方案中，根据美国专利号6,727,356中描述的方法和原理设计检测探针，所述文献的公开内容通过引用的方式完整并入本文用于全部目的。
在具体的实施方案中，检测探针是探针(AppliedBiosystems，FosterCity，CA)。设计Taqman探针为具有MGB配体(见例如，Afonina等人,NucleicAcidRes.,25:2657-2660(1997))以帮助该探针与其互补性DNA靶形成超稳定的双链体。该双链体的增加的稳定性与较高的Tm相关。例如，带有MGB的12聚Taqman探针的Tm(65℃)几乎与没有MGB的27聚DNA探针的Tm(66℃)相同。已经显示对于较短探针，MGB更多有助于探针的总体稳定性。已经显示3'-MGBDNA探针增加PCR循环期间的序列特异性(Kutyavin等人,NucleicAcidRes.,28:655-661(2000))。将本发明的MGB探针设计成检测对等位变体特异的、等位变体附近的或远离等位变体的基因组序列。例如，MGB探针可以检测由使用等位基因特异性引物和阻断探针的PCR循环所产生的扩增产物的3'末端。
在其他实施方案中，检测探针是Zen探针(IDT，Coralville，IA)。ZEN双重猝灭的探针包含寡核苷酸探针、5'FAM荧光团、3'IBFq猝灭剂和内部ZEN猝灭剂。ZEN猝灭剂降低背景并且与常规的染料-猝灭剂探针(例如，5'FAM-3'TAMRA、5'FAM-3'IBFQ、5'FAM-3'Eclipse、5'FAM-3'BHQ-1)相比，产生更高的信号。内部ZEN猝灭剂减少染料和猝灭剂之间的长度至仅9个碱基对，这显著地减少背景荧光并提供更彻底的猝灭。ZEN探针的灵敏度随着终点信号增加和Ct(阈循环；其中荧光增加高于阈值的分数循环次数)值减少而增加。
在另外的其他实施方案中，检测探针包含一个或多个拉链核酸(ZNA)和/或肽核酸(PNA)修饰。归因于ZNA探针的增加稳定性的阳离子电荷，本发明的方法可以包括短的双标记ZNA探针。ZNA探针具有超过标准检测探针的增强的靶识别作用、更大灵敏度、高特异性和增加的Tm。在另一个实施方案中，检测探针是PNA探针。因为PNA修饰以单碱基水平提供高水平的区分，所以本发明的短PNA探针可以提供高特异性。
在一些实施方案中，检测探针使用具有修饰碱基或核酸类似物的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含2至6个LNA、PNA、TNA、ZNA或核糖修饰的核酸。这些修饰的碱基显示出针对互补性DNA和RNA的热稳定性，这允许在本发明的方法中优异的错配区分作用。
在其他实施方案中，根据美国专利号6,727,356中描述的原理和方法设计基因座特异性检测探针，所述文献的公开内容通过引用的方式完整并入本文用于全部目的。例如，可以制备猝灭剂在DNA单链3'末端和荧光团在5'末端的荧光性探针。在这个例子中，TaqDNA聚合酶的5'-核酸酶活性可以切割该DNA链，因而使荧光团与猝灭剂分离并释放荧光信号。在一些实施方案中，检测探针在PCR扩增的引物延伸步骤期间与模板链杂交(例如，在60℃－65℃)。在其他实施方案中，MGB与基因座特异性检测探针的猝灭剂部分(例如，通过接头)共价连接。
在其中使用两种检测探针的实施方案中，第一和第二检测探针是相同的和/或包含相同的序列或是相同的序列。
E.基因座特异性引物
在一些实施方案中，将基因座特异性引物设计为具有约15-30个核苷酸，如约16、约18、约22、约24、约30个或其之间任何数目个核苷酸的寡聚物。在一些实施方案中，基因座特异性引物的Tm是约60℃至70℃、约61℃至69℃、约62℃至68℃、约63℃至67℃或约64℃至66℃，或者其之间的任何范围。
在使用两个基因座特异性引物的实施方案中，第一基因座特异性引物和/或第二基因座特异性引物包含相同的序列或是相同的序列。
F.额外组分
适于实施本发明的聚合酶是本领域熟知的并且可以源自许多来源。热稳定性聚合酶可以例如从使用本领域普通技术人员熟知的方法可商业获得的多种嗜热细菌(例如，从美国典型培养物保藏中心，Rockville，Md.)获得。见例如，美国专利号6,245,533。可以根据标准微生物技术，使用本领域普通技术人员熟知的适于培育特定物种的活性培养物的培养基和温育条件培育细菌细胞。见例如，Brock等人,J.Bacterid.,98(1):289-297(1969);Oshima等人,Int.J.Syst.Bacteriol.,24(1):102-112(1974)。适合用作热稳定性聚合酶的来源是水生栖热菌(Thermusaquaticus)、嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)、附岸热球菌(Thermococcuslitoralis)、激烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)、沃氏火球菌(Pyrococcuswoosii)和火球菌属其他物种、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobusacidocaldarius)、嗜酸热原体(Thermoplasmaacidophilum)、黄栖热菌(Thermusflavus)、Thermusruber、布氏栖热菌(Thermusbrockianus)、新阿波罗栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)、热海栖热袍菌(Thermotogamaritima)和栖热袍菌属其他物种，和嗜热自养甲烷杆菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum)、和这些物种每一种的突变体。优选的热稳定性聚合酶可以包括但不限于TaqDNA聚合酶、TneDNA聚合酶、TmaDNA聚合酶、或其突变体、衍生物或片段。
G.等位变体的定量
在某些方面，定量核酸样品中靶序列的等位变体的方法包括使用从等位变体阳性细胞系建立的标准曲线确定样品中存在的等位变体的量和/或百分数。在具体的实施方案中，使用Ct值从标准曲线计算样品中存在的DNA的量(例如，以纳克(ng)计或任何其他重量单位计)(例如，携带等位变体的核酸的量)。在一些情况下，标准曲线是基于携带等位变体的100%突变的细胞系。在其他情况下，基于细胞系，源自标准曲线的DNA的量(例如，样品中携带等位变体的核酸的量)换算成等位变体的突变百分数。
本发明的测定法具有高度选择性并且可以从野生型等位基因中区分并定量稀有变异等位基因。来自所述测定法的数据还是线性的并且可以用来导出等位变体的定量性信息，例如，以检测、确定或计算样品中存在的等位变体的量或百分数。
在一些方面，对来自变体阳性细胞系的等位变体产生标准曲线。在一些实施方案中，对来自以下阳性细胞系的KRAS等位变体产生标准曲线：来自SW1116细胞系的G12A；来自NCI-H23细胞系的G12C；来自LS174T细胞系的G12D；来自PSN1细胞系的G12R；来自A549细胞系的G12S；来自SW403细胞系的G12V；来自H1734细胞系的G13C、来自T84细胞系的G13D；和/或来自H460细胞系的Q61H。在其他实施方案中，对来自以下阳性细胞系的PIK3CA等位变体产生标准曲线：来自SW948细胞系的E542K；来自SupT1细胞系的E545D；来自MCF7细胞系的E545K；和/或来自KPL4细胞系的H1047R。在另外的其他实施方案中，对来自以下阳性细胞系的EGFR等位变体产生标准曲线：来自H1975细胞系的T790M和L858R和/或来自H1650细胞系的E746-A750缺失(E746del)。在另外的其他实施方案中，对来自HT29细胞系的BRAFV600E变体产生标准曲线。在一些情况下，通过对来自阳性细胞系的DNA的一系列稀释物(例如，100、10、1、0.1和/或0.01ng)实施本发明测定法产生标准曲线。
在其他方面，定量核酸样品中靶序列的等位变体的方法包括基于从等位变体阳性细胞系建立的标准曲线，使用计算图表确定样品中存在的等位变体的量和/或百分数。在某些实施方案中，对等位变体特异性的突变百分数计算图表从等位变体的标准曲线建立。该计算图表可以用来从获自本发明方法的Ct值计算核酸样品中的突变量。在一些情况下，可以基于以下假设计算等位变体的突变百分数：阳性细胞系具有等位变体的100%突变百分数。
在具体的实施方案中，可以通过确定对获自样品的核酸进行本文描述的基因分型测定法时所获得的Ct值，对样品中存在的等位变体的量或百分数定量。可以通过对来自该等位变体阳性的细胞系的核酸样品的系列稀释物进行本文所述的基因分型测定法，产生该等位变体的标准曲线。该标准曲线随后可以用来确定阳性对照(例如，细胞系)样品中存在的核酸的特定量的Ct值。当将针对阳性对照样品所获得的Ct值作为每个阳性对照反应的DNA量的函数作图时，该标准曲线也可以用来确定线斜率值和/或线截距值。
图32-35提供了基于从标准曲线和/或扩增曲线获得的信息，对样品中存在的等位变体的量和百分比(例如，突变百分数)定量的标准曲线图(例如，对于阳性对照样品)、扩增曲线(例如，对于未知(试验)样品和阳性对照样品)和计算图表的非限制性例子。在某些实施方案中，相对于样品中核酸(例如，DNA)的起始量从突变的量计算突变百分数。样品中核酸(例如，DNA)的起始量可以表述为log10值(例如，以纳克计)。在其他实施方案中，基于从使用本文所述的基因分型测定法产生的标准曲线和/或扩增曲线获得的信息如Ct值、线斜率值和/或线截距值，计算图表定量样品中存在的等位变体的量和/或百分比(例如，突变百分数)。在其他实施方案中，对未知(测试)样品中存在的等位变体计算的突变百分数是相对于阳性对照的(例如，与等位变体的突变百分数为100%的阳性细胞系相比较)。
IV.示例性实施方案
在一个方面，本发明提供一种用于检测或定量疑似至少具有靶序列的第二等位变体的核酸样品中靶序列的第一等位变体的方法，所述方法包括：
(a)通过合并以下而形成反应混合物：
(i)核酸样品；
(ii)等位基因特异性引物，其中等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分与靶序列的第一等位变体互补，并且其中等位基因特异性引物包含至少一个核酸修饰(例如，一个或多个核酸修饰)；
(iii)与包含第二等位变体的靶序列区域互补的等位基因特异性阻断探针，其中等位基因特异性阻断探针包含不可延伸性阻断部分和至少一个核酸修饰(例如，一个或多个核酸修饰)；
(iv)检测探针；和
(v)与第一等位变体3’的靶序列区域互补并在相反链上的基因座特异性引物；和
(b)使用基因座特异性引物和等位基因特异性引物，对反应混合物实施扩增反应以形成扩增子；和
(c)通过检测检测探针的可检测特性的变化检测所述扩增子，因而检测核酸样品中靶基因的第一等位变体。
在一些实施方案中，等位基因特异性引物中的核酸修饰位于等位基因特异性核苷酸部分处，等位基因特异性引物的5'末端处和/或等位基因特异性引物的3'末端处。在某些实施方案中，等位基因特异性引物包含两个或多个不相邻核酸修饰。在一些实施方案中，等位基因特异性引物中的核酸修饰选自锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、苏糖核酸(TNA)、拉链核酸(ZNA)、三唑核酸(TzNA)和它们的组合。
在其他实施方案中，等位基因特异性阻断探针中的核酸修饰位于等位基因特异性核苷酸部分处和/或等位基因特异性阻断探针中的内部位置处。在某些实施方案中，等位基因特异性阻断探针包含两个或多个不相邻核酸修饰。在一些情况下，等位基因特异性阻断探针中的核酸修饰选自锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、苏糖核酸(TNA)、拉链核酸(ZNA)、三唑核酸(TzNA)和它们的组合。
在一些实施方案中，不可延伸性阻断部分包含对等位基因特异性阻断探针3'末端的修饰，所述修饰防止由聚合酶添加其他碱基至3'末端。在具体的实施方案中，不可延伸性阻断部分选自任选取代的C1-C24烷基二醇、任选取代的C2-C24烯基二醇、任选取代的C2-C24炔基二醇和它们的组合。在一个优选实施方案中，不可延伸性阻断部分包含对等位基因特异性阻断探针的3'-己二醇修饰。
在某些实施方案中，不可延伸性阻断部分不包含或不包括小沟结合物(MGB)。在某些其他实施方案中，不可延伸性阻断部分不包含或不包括PO4基团。在其他实施方案中，不可延伸性阻断部分基本上由任选取代的C1-C24烷基二醇(例如，3'-己二醇修饰)、任选取代的C2-C24烯基二醇或任选取代的C2-C24炔基二醇组成或由其组成。
在一些实施方案中，检测探针包含探针。在某些实施方案中，核酸样品选自血液、血清、血浆、细针抽吸物、肿瘤组织和它们的组合。在其他实施方案中，第一等位变体是突变等位基因并且第二等位变体是野生型等位基因。在具体的实施方案中，该方法减少扩增反应期间第二等位变体的背景信号。
在某些实施方案中，可以通过确定其中检测探针的可检测特性的变化首次变得高于背景水平可检测的阈循环或Ct值，定量靶基因的第一等位变体。在一些实施方案中，可以通过对来自该等位变体阳性的细胞系的核酸样品的系列稀释物进行本发明的方法，产生第一等位变体的标准曲线。在一些情况下，通过比较对该样品获得的Ct值与来自标准曲线的Ct值，将第一等位变体定量。在具体的实施方案中，该标准曲线用来确定一个或多个Ct值(例如，相对于阳性对照样品中核酸的起始量)、线斜率值和/或线截距值，所述值通过对来自该等位变体阳性的细胞系的核酸样品的系列稀释物进行本发明方法来获得。在其他实施方案中，基于以下至少一种、两种、三种或四种计算样品中存在的第一等位变体的量和/或百分比(例如，突变百分数)：样品中核酸的起始量(例如，每个反应的DNA，其可以表述为以ng计或任何其他重量单位计的log10值)；Ct值；线斜率值(例如，来自标准曲线)；线截距值(例如，来自标准曲线)；及它们的组合。
在另一方面，本发明提供一种反应混合物，其包含：
(a)核酸分子；
(b)等位基因特异性引物，其中等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分与靶序列的第一等位变体互补，并且其中等位基因特异性引物包含至少一个核酸修饰(例如，一个或多个核酸修饰)；
(c)与包含第二等位变体的靶序列区域互补的等位基因特异性阻断探针，其中等位基因特异性阻断探针包含不可延伸性阻断部分和至少一个核酸修饰(例如，一个或多个核酸修饰)；
(d)检测探针；和
(e)与第一等位变体3’的靶序列区域互补并在相反链上的基因座特异性引物。
在一些实施方案中，等位基因特异性引物中的核酸修饰位于等位基因特异性核苷酸部分处，等位基因特异性引物的5'末端处和/或等位基因特异性引物的3'末端处。在某些实施方案中，等位基因特异性引物包含两个或多个不相邻核酸修饰。在一些实施方案中，等位基因特异性引物中的核酸修饰选自锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、苏糖核酸(TNA)、拉链核酸(ZNA)、三唑核酸(TzNA)和它们的组合。
在其他实施方案中，等位基因特异性阻断探针中的核酸修饰位于等位基因特异性核苷酸部分处和/或等位基因特异性阻断探针中的内部位置处。在某些实施方案中，等位基因特异性阻断探针包含两个或多个不相邻核酸修饰。在一些情况下，等位基因特异性阻断探针中的核酸修饰选自锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、苏糖核酸(TNA)、拉链核酸(ZNA)、三唑核酸(TzNA)和它们的组合。
在一些实施方案中，不可延伸性阻断部分包含对等位基因特异性阻断探针3'末端的修饰，所述修饰防止由聚合酶添加其他碱基至3'末端。在具体的实施方案中，不可延伸性阻断部分选自任选取代的C1-C24烷基二醇、任选取代的C2-C24烯基二醇、任选取代的C2-C24炔基二醇和它们的组合。在一个优选实施方案中，不可延伸性阻断部分包含对等位基因特异性阻断探针的3'-己二醇修饰。
在某些实施方案中，不可延伸性阻断部分不包含或不包括小沟结合物(MGB)。在某些其他实施方案中，不可延伸性阻断部分不包含或不包括PO4基团。在其他实施方案中，不可延伸性阻断部分基本上由任选取代的C1-C24烷基二醇(例如，3'-己二醇修饰)、任选取代的C2-C24烯基二醇或任选取代的C2-C24炔基二醇组成或由其组成。
在一些实施方案中，检测探针包含探针。在某些实施方案中，核酸分子从选自血液、血清、血浆、细针抽吸物、肿瘤组织和其组合的样品获得。在其他实施方案中，第一等位变体是突变等位基因并且第二等位变体是野生型等位基因。
在又一个方面，本发明提供一种组合物，其包含：
(a)等位基因特异性引物，其中等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分与靶序列的第一等位变体互补，并且其中等位基因特异性引物包含至少一个核酸修饰(例如，一个或多个核酸修饰)；和
(b)与包含第二等位变体的靶序列区域互补的等位基因特异性阻断探针，其中等位基因特异性阻断探针包含不可延伸性阻断部分和至少一个核酸修饰(例如，一个或多个核酸修饰)。
在一些实施方案中，该组合物还包含：(c)检测探针；和/或(d)与第一等位变体3’的靶序列区域互补并在相反链上的基因座特异性引物。
在一些实施方案中，等位基因特异性引物中的核酸修饰位于等位基因特异性核苷酸部分处，等位基因特异性引物的5'末端处和/或等位基因特异性引物的3'末端处。在某些实施方案中，等位基因特异性引物包含两个或多个不相邻核酸修饰。在一些实施方案中，等位基因特异性引物中的核酸修饰选自锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、苏糖核酸(TNA)、拉链核酸(ZNA)、三唑核酸(TzNA)和它们的组合。
在其他实施方案中，等位基因特异性阻断探针中的核酸修饰位于等位基因特异性核苷酸部分处和/或等位基因特异性阻断探针中的内部位置处。在某些实施方案中，等位基因特异性阻断探针包含两个或多个不相邻核酸修饰。在一些情况下，等位基因特异性阻断探针中的核酸修饰选自锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、苏糖核酸(TNA)、拉链核酸(ZNA)、三唑核酸(TzNA)和它们的组合。
在一些实施方案中，不可延伸性阻断部分包含对等位基因特异性阻断探针3'末端的修饰，所述修饰防止由聚合酶添加其他碱基至3'末端。在具体的实施方案中，不可延伸性阻断部分选自任选取代的C1-C24烷基二醇、任选取代的C2-C24烯基二醇、任选取代的C2-C24炔基二醇和它们的组合。在一个优选实施方案中，不可延伸性阻断部分包含对等位基因特异性阻断探针的3'-己二醇修饰。
在某些实施方案中，不可延伸性阻断部分不包含或不包括小沟结合物(MGB)。在某些其他实施方案中，不可延伸性阻断部分不包含或不包括PO4基团。在其他实施方案中，不可延伸性阻断部分基本上由任选取代的C1-C24烷基二醇(例如，3'-己二醇修饰)、任选取代的C2-C24烯基二醇或任选取代的C2-C24炔基二醇组成或由其组成。
在其他实施方案中，第一等位变体是突变等位基因并且第二等位变体是野生型等位基因。
在另一个方面，本发明提供一种试剂盒，其包含两个或更多个含有独立分布在两个或更多个容器之一中的以下组分的容器：
(a)等位基因特异性引物，其中等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分与靶序列的第一等位变体互补，并且其中等位基因特异性引物包含至少一个核酸修饰(例如，一个或多个核酸修饰)；和
(b)与包含第二等位变体的靶序列区域互补的等位基因特异性阻断探针，其中等位基因特异性阻断探针包含不可延伸性阻断部分和至少一个核酸修饰(例如，一个或多个核酸修饰)。
在一些实施方案中，该试剂盒还包含：(c)检测探针；和/或(d)与第一等位变体3’的靶序列区域互补并在相反链上的基因座特异性引物。
在一些实施方案中，等位基因特异性引物中的核酸修饰位于等位基因特异性核苷酸部分处，等位基因特异性引物的5'末端处和/或等位基因特异性引物的3'末端处。在某些实施方案中，等位基因特异性引物包含两个或多个不相邻核酸修饰。在一些实施方案中，等位基因特异性引物中的核酸修饰选自锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、苏糖核酸(TNA)、拉链核酸(ZNA)、三唑核酸(TzNA)和它们的组合。
在其他实施方案中，等位基因特异性阻断探针中的核酸修饰位于等位基因特异性核苷酸部分处和/或等位基因特异性阻断探针中的内部位置处。在某些实施方案中，等位基因特异性阻断探针包含两个或多个不相邻核酸修饰。在一些情况下，等位基因特异性阻断探针中的核酸修饰选自锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、苏糖核酸(TNA)、拉链核酸(ZNA)、三唑核酸(TzNA)和它们的组合。
在一些实施方案中，不可延伸性阻断部分包含对等位基因特异性阻断探针3'末端的修饰，所述修饰防止由聚合酶添加其他碱基至3'末端。在具体的实施方案中，不可延伸性阻断部分选自任选取代的C1-C24烷基二醇、任选取代的C2-C24烯基二醇、任选取代的C2-C24炔基二醇和它们的组合。在一个优选实施方案中，不可延伸性阻断部分包含对等位基因特异性阻断探针的3'-己二醇修饰。
在某些实施方案中，不可延伸性阻断部分不包含或不包括小沟结合物(MGB)。在某些其他实施方案中，不可延伸性阻断部分不包含或不包括PO4基团。在其他实施方案中，不可延伸性阻断部分基本上由任选取代的C1-C24烷基二醇(例如，3'-己二醇修饰)、任选取代的C2-C24烯基二醇或任选取代的C2-C24炔基二醇组成或由其组成。
在一些实施方案中，第一等位变体是突变等位基因并且第二等位变体是野生型等位基因。在其他实施方案中，该试剂盒还包含用于检测或定量疑似具有靶序列的第二等位变体的核酸样品中靶序列的第一等位变体的等位基因特异性引物和等位基因特异性阻断探针的使用说明书。
V.实施例
将通过具体实施例以更多细节描述本发明。以下的实施例出于说明目的而提供并且不意在以任何方式限制本发明。本领域技术人员将轻易地认识到可以进行改变或调整以产生基本上相同结果的多种非关键参数。
实施例1.体细胞突变基因分型测定方法学。
图1描述本发明的体细胞突变检测测定法的一个实施方案。将等位基因特异性引物和等位基因特异性阻断探针用于样品如血液或细针抽吸物(FNA)样品中待分析的每种单核苷酸多态性(SNP)。等位基因特异性引物可以在3'末端包含对变异(例如，突变)等位基因特异的锁核酸(LNA)，而等位基因特异性阻断探针可以包含在3'末端处的己二醇阻断部分和在阻断部分5'约5-15个核苷酸之间位置处(例如，在寡核苷酸序列的中部)对野生型等位基因特异的LNA。
本发明的测定方法可以在ABI7900HT实时PCR仪上进行，不过可以使用本领域技术人员已知的任何类型的实时PCR仪。示例性反应条件包括以下：阶段1：95.0℃持续10:00分钟；阶段2：重复：40次，95.0℃持续0:20分钟并且60.0℃持续0:45分钟。
如图1中所示，等位基因特异性阻断探针(例如，“LNA己二醇阻断寡核苷酸”)与野生型等位基因的杂交防止野生型等位基因的扩增，而等位基因特异性引物(例如，“等位基因特异性LNA引物”)与突变等位基因的杂交使得以高灵敏度和低背景选择性扩增突变等位基因成为可能。在具体的实施方案中，LNA核苷的使用改善信噪比并且实质地降低野生型背景信号。
实施例2.用于检测SNP的示例性体细胞突变基因分型测定法。
该实施例显示使用含有修饰碱基的等位基因特异性引物和等位基因特异性阻断探针改善了等位变体的区分作用。
具体而言，图2显示使用在3'末端包含LNA修饰(在“G12SASP-LNA”中的“+A”)的等位基因特异性引物和包含在寡核苷酸序列中部的LNA修饰(在“G12S阻断物-LNA”中的“+G”)和3'己二醇修饰(在“G12S阻断物-LNA”中的“C6”)的等位基因特异性阻断探针改善了对KRASG12S多态性位点处等位变体的区分。使用不含LNA修饰的等位基因特异性引物和阻断探针所进行的等位基因特异性实时PCR不正确地检测到KRASG12S突变等位基因在突变等位基因阴性的全部8个细胞系(即，H1975、H1993、U87MG、A375、PC3、A431NS、#28和#29细胞系)中存在。相反地，使用包含LNA和己二醇修饰的本发明等位基因特异性引物和阻断探针所进行的等位基因特异性实时PCR正确地鉴定这些细胞系为KRASG12S突变阴性。虽然不含LNA修饰的等位基因特异性引物和阻断探针在KRASG12S阳性A549细胞系中鉴定出KRASG12S突变，但是ΔCt值是9(相对于A549，比较#29的“Ct”值)，该值显著低于采用本文所述的含有LNA和己二醇修饰的引物和探针所观察到的ΔCt值12。不受任何具体理论约束的情况下，ΔCt值增加表示PCR期间等位变体的区分作用改善。此外，本发明的修饰引物和探针的使用实质降低野生型背景信号，甚至在含有丰富野生型等位基因的样品中也是如此。
类似地，图3显示使用在3'末端包含LNA修饰(在“G12RASP-LNA”中的“+C”)的等位基因特异性引物和包含在寡核苷酸序列中部的LNA修饰(在“G12R阻断物-LNA”中的“+G”)和3'-己二醇修饰(在“G12R阻断物-LNA”中的“C6”)的等位基因特异性阻断探针改善了对KRASG12R多态性位点处等位变体的区分。使用不含LNA修饰的等位基因特异性引物和阻断探针所进行的等位基因特异性实时PCR不正确地检测到KRASG12R突变等位基因在突变等位基因阴性的几个细胞系中存在。相反地，使用包含LNA和己二醇修饰的本发明等位基因特异性引物和阻断探针所进行的等位基因特异性实时PCR正确地鉴定全部这些细胞系为KRASG12R突变阴性。
同样地，图4显示使用在3'末端包含LNA修饰(在“H1047RASP-LNA”中的“+G”)的等位基因特异性引物和包含在寡核苷酸序列中部的LNA修饰(在“H1047R阻断物-LNA”中的“+A”)和3'-己二醇修饰(在“H1047R阻断物-LNA”中的“C6”)的等位基因特异性阻断探针改善了对PIK3CAH1047R多态性位点处等位变体的区分。不含LNA修饰的等位基因特异性引物和阻断探针在PIK3CAH1047R阳性KPL4细胞系中鉴定到PIK3CAH1047R突变。然而，基于比较PCR在没有LNA修饰情况下约4-6的ΔCt值与PCR在具有LNA修饰情况下大于10的ΔCt值，本发明LNA和己二醇修饰的引物和探针的使用实质地增加ΔCt值，其中通过从H1975、H1993、U87MG、A375、PC3、A431NS、#28或#29细胞系中任一者的Ct值扣减KPL4细胞系的Ct值计算出ΔCt值。如本文中讨论，ΔCt值增加表示PCR期间等位变体的区分作用改善。此外，本发明的修饰引物和探针的使用实质降低野生型背景信号，甚至在含有丰富野生型等位基因的样品中也是如此。
图5和图6分别显示使用本发明的LNA修饰的等位基因特异性引物和探针时，在EGFRT790M和EGFRL858R多态性位点处改善的等位变体区分的例子。等位基因特异性实时PCR使用不含LNA修饰的等位基因特异性引物和阻断探针所进行的等位基因特异性实时PCR不正确地检测到两种EGFR突变均在突变等位基因阴性的全部7个细胞系(即，H1993、U87MG、A375、PC3、#29、#31和#32细胞系)中存在。相反地，使用包含LNA和己二醇修饰的本发明等位基因特异性引物和阻断探针所进行的等位基因特异性实时PCR正确地鉴定全部这7个细胞系均相对于两种EGFR突变为阴性，并且正确地鉴定EGFRT790M和EGFRL858R阳性H1975细胞系为含有这两种突变等位基因。
图7显示来自全血的丰富量的野生型DNA干扰在H1047R阳性KPL4细胞中检测目的突变等位基因如PIK3CAH1047R变异等位基因的作用。图8显示来自全血的丰富量的野生型DNA干扰在G12R阳性PSN1细胞中检测目的突变等位基因如KRASG12R变异等位基因的作用。如图8中所示，在全血样品中掺入低至100个G12R阳性PSN1细胞(这代表全血计数的0.01%)时，G12R信号仍是可检测的。
实施例3.用体细胞突变基因分型测定方法学筛选结肠直肠癌样品
这个实施例显示使用含有修饰碱基(包括LNA修饰)的本发明等位基因特异性引物和等位基因特异性阻断探针，对结肠直肠癌(CRC)组织样品筛选PIK3CAH1047R变异等位基因的存在。
图9显示对150份CRC组织样品的筛选表明不存在从阴性样品观察到的干扰并且可以通过滴定验证对弱信号的检测。通过滴定验证H1047R阳性样品#532和#528，而在测试的全部浓度，H1047R阴性样品#94、#95和#96具有不可检测水平的H1047R变异等位基因。
总之，这个实施例表明本发明的体细胞突变基因分型测定法是高度灵敏的、非常特异的、高度选择性的和稳健的，并且可以用来检验临床样品以检测和/或定量基因如KRAS、PIK3CA和EGFR中的等位变体。
实施例4.体细胞突变基因分型测定方法学与Scorpion和BEAM测定法的比较。
这个实施例显示了本发明的体细胞突变基因分型测定法和来自Qiagen的Scorpion测定法或来自Inostics的BEAM测定法之间在全血中检测KRASG12A方面的比较，所述全血掺入有不同量的SW1116(G12A阳性)细胞。
图10显示DxS/QiagenScorpion测定法仅可以在用SW1116(G12A阳性)细胞的系列稀释物掺入的全血混合物中检测到1000个细胞。在100个细胞时失去灵敏度。相反地，采用本发明的基因分型测定法(“发明的测定法”)，在全血混合物中低至10个至100个SW1116阳性细胞情况下，G12A信号仍是可检测的。100个细胞代表全血计数的0.01%。甚至在1000个细胞时，对于DxS/QiagenScorpion测定法，Ct曲线不是紧贴的。
图11显示全血(WB)中掺入了10、50、100、250和500个KPL4(H1047R)、A549(G12S)和PSN1(G12R)细胞的系列稀释物。值得注意地，InosticsBEAM测定法作出不正确回应并且将15份突变样品中的14份鉴定为野生型样品。实际上，Inostics测定法仅在全血中存在1000个细胞时检测到突变并且在500个或更少细胞时不显示灵敏度。相反地，图12显示本发明的体细胞突变基因分型测定法(“发明的测定法”)在WB混合物中低至50个至100个阳性细胞时具有可检测信号。100个细胞代表全血计数的0.01%。
总之，这个实施例表明与来自Qiagen的Scorpion测定法或来自Inostics的BEAM测定法相比，本发明的体细胞突变基因分型测定法显著改善等位PCR测定法。具体而言，可以通过滴定验证弱信号并且本发明的测定法可以在具有丰富水平的野生型等位基因的全血背景下检测低至0.01%具有突变等位基因的细胞。因此，在样品如全血的样品中，本文描述的方法学优于Scorpion和BEAM测定法。
实施例5.使用核酸修饰的体细胞突变基因分型测定方法学。
这个实施例显示本发明的体细胞突变检测测定法的多个实施方案。对于这个实施例，选择KRASG12A测定法作为用于说明本发明方法的示例性测定法。具体而言，本文所述的实验阐述了该测定法的以下组分：(1)具有和没有LNA的等位基因特异性引物；(2)在阻断探针上的3'末端修饰；(3)具有不同Tm的阻断探针；(4)具有和没有LNA的阻断探针；和(5)具有和没有LNA的等位基因特异性引物和阻断探针的组合。
本实施例中描述的方法基于与基因座特异性引物、等位基因特异性引物、阻断探针和检测探针组合的实时等位基因特异性PCR。该方法设计成在自野生型等位基因区分突变等位基因的存在和定量突变等位基因方面是高度选择性和灵敏的。具体而言，使用来自AppliedBiosystems的GTXpressTMMasterMix(FosterCity，CA)进行示例性测定法。对于实时PCR反应，使用以下循环条件：阶段1：95.0℃持续10:00分钟；和阶段2：重复：40次，95.0℃持续0:20分钟并且60.0℃持续0:45分钟。
实验#1显示本发明的KRASG12A测定法以高度选择性和灵敏度成功地用包含具有LNA的等位基因特异性引物扩增出突变等位基因。在本发明的这个实施方案中，等位基因特异性引物的变异核苷酸(T)是锁核酸(LNA)并位于引物的3'末端处。阻断探针具有LNA和3'末端的己二醇修饰。检测探针是Taqman探针(LifeTechnologies)。实时PCR测定法的结果显示阻断探针与野生型等位基因杂交并阻断其扩增(图13)。此外，通过该测定法以高灵敏度选择性地扩增突变等位基因(图13)。
实验#2显示当等位基因特异性引物包含锁核酸(LNA)时，本发明的SNP基因分型测定法对等位基因区分作用具有改善的选择性和灵敏度。图14显示在等位基因特异性引物和阻断探针上无LNA的KRASG12A测定法产生来自阳性对照(突变等位基因)样品和阴性对照(野生型等位基因)样品的扩增产物。本发明的这个实施方案没有针对等位变体显示出足够的选择性。然而，等位基因特异性引物和阻断探针上具有LNA修饰的KRASG12A测定法能够选择性地扩增阳性对照样品并且不扩增阴性对照。图14显示在变异核苷酸(T)处具有LNA的测定法以高灵敏度扩增突变等位基因。
实验#3显示SNP基因分型测定法中两个LNA在等位基因特异性引物上的存在改善测定法的表现。在本发明的这个实施方案中，比较两个等位基因特异性引物的设计。一个引物在变异核苷酸(T)处具有LNA。另一个引物具有位于变异核苷酸5'的第二LNA(A)。包含具有2个策略性布置的LNA的等位基因特异性引物的测定法显示较好的扩增和较低的Ct值(图15)。LNA可以置于等位基因特异性引物的3'末端处和距3'末端2、3、4、5或6个碱基处。LNA可以置于等位基因特异性引物的5'末端处和3'末端处。
实验#4显示本发明等位基因特异性引物上的相邻LNA在测定法中不产生扩增产物。图16描述了具有相邻LNA(GAT)的等位基因特异性引物，其中T是变异核苷酸，并且显示它未能扩增出KRASG12A突变等位基因。图16还描述了具有六个相邻LNA(变异核苷酸的T和T上游与突变等位基因互补的5个LNA)的等位基因特异性引物。这种引物在测定法中未能检出样品中的突变等位基因并且未产生扩增产物。
这个实施例显示本发明的等位基因特异性引物、阻断探针和检测探针可以包含修饰的碱基，如锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、α-L-苏糖核酸(TNA)、拉链核酸(ZNA)和三唑DNA(TzDNA)。图17显示示例性LNA分子和其他修饰的LNA。图18显示示例性PNA-DNA双链体(左)和具有PNA的示例性等位基因特异性引物(图18中的T；右)。图19显示了示例性含有TNA的寡核苷酸(左)和具有TNA的示例性等位基因特异性引物(图19中的T；右)。图20显示了示例性ZNA寡核苷酸(左)和示例性ZNA修饰的等位基因特异性引物(右；图20中的T)。图21显示了示例性TzDNA分子(左)和示例性具有TzDNA的等位基因特异性引物(右；图21中的T)。
实验#5显示在3'末端具有己二醇修饰的阻断探针改善本发明测定法的选择性。当测定法在无阻断探针的情况下进行时，野生型等位基因和突变等位基因均类似地扩增并且不能区分(第I部分，图22)。在采用阻断探针的本发明实施方案中，己二醇阻断探针与KRASG12ASNP的野生型等位基因杂交并妨碍实时PCR扩增(第II部分，图22)。在这个测定法中，选择性地扩增突变等位基因(第III部分，图22)。
实验#6显示本发明的KRASG12A测定法产生对突变等位基因(阳性对照)特异性的扩增产物并且不产生野生型等位基因的扩增产物，所述测定法包含具有LNA的等位基因特异性引物、具有己二醇的阻断探针、Taqman探针和反向引物。图23的第I部分显示突变等位基因特异性引物扩增KRASG12ASNP的野生型等位基因和突变等位基因。图23的第II部分显示在位于引物3'末端的变异核苷酸处具有单个LNA的突变等位基因特异性引物扩增突变等位基因并且不扩增野生型。
实验#7表明在寡核苷酸的3'末端处具有己二醇(C6)修饰的阻断探针比具有3'-磷酸酯基团(PO4)的探针在本发明的KRASG12A测定法中表现得更好，其中所述测定法包含在变异核苷酸处具有LNA的等位基因特异性引物。图24显示采用己二醇阻断探针的测定法比采用PO4阻断探针的测定法表现得更好，Ct较低(相比较于Ct31.2而言，为Ct28.4)。碳链疏水性的灵活性允许己二醇阻断物良好杂交，而无空间位阻。虽然在阻断探针3'末端的磷酸酯基团也可以结合野生型等位基因，但是效率可能因磷酸酯基团的庞大和离子本质削弱。
实验#8表明与没有LNA的阻断探针相比，具有LNA的阻断探针在本发明的测定法中表现得更好。图25显示LNA阻断探针比没有LNA的阻断探针具有较低Ct值。包含具有LNA和己二醇修饰的阻断探针的本发明方法可以导致等位变体的有效和选择性扩增，因而改善等位基因区分作用。
实验#9显示本发明突变等位基因特异性引物和阻断探针中的LNA导致KRASG12ASNP的突变等位基因的高度特异性扩增。图26显示采用LNA引物和LNA阻断物的测定法扩增出突变等位基因(阳性对照)并且未扩增出野生型等位基因(阴性对照)。
实验#10显示LNA可以策略地置于阻断探针序列上以改善本发明SNP测定法的表现。图27A显示本实验中测试的测定法的组分。如图27B中所示，阻断物.1.LNA和阻断物.4.LNA具有相同的阻断物序列，但是LNA修饰的位置不同。阻断物.1.LNA在5'末端处及等位变体核苷酸处具有LNA，而阻断物.4.LNA在序列5'末端处及3'末端处具有LNA。与采用阻断物.4.LNA的测定法相比，采用阻断物.1.LNA的测定法显示更好的等位基因区分作用和更低的Ct(图27C)。
图28A显示阻断探针的Tm对测定法表现的影响。阻断物.1.LNA具有59.9℃的Tm。阻断物.4.LNA具有68℃的Tm。图28B还显示在没有LNA的阻断物和具有两个LNA的阻断物之间的Tm和Ct值差异。在本发明的测定法中，具有LNA和更高Tm的阻断探针具有更好的等位变体特异性、更好的灵敏度和有效抑制野生型变体。
实验#11显示本发明阻断探针上的相邻LNA完全阻断突变变体的扩增，因而显著地降低该测定法的表现。图29显示在阻断探针上放置6个相邻LNA(与野生型变体(G)互补的胞嘧啶(C)和上游5个与野生型等位基因互补的碱基)在PCR循环期间完全阻止扩增。
图30显示ΔCt值可以用来确定测定法的可行性及其选择性。用含有LNA的引物和探针所获得的更高ΔCt值显示增加的本发明测定法可行性和选择性。图31显示怎样从源自各种体细胞突变基因分型测定法的Ct值计算出ΔΔCt值。用含有LNA的引物和阻断物设计的本图测定法A表现得比含有具相邻LNA的引物和探针的其他测定法更好。
总之，这个实施例显示在等位基因特异性引物和阻断探针中使用核酸修饰如修饰的碱基(例如，LNA)改善了本发明的基因分型测定法的表现。同样地，等位变体区分的选择性和灵敏度增加。
实施例6.使用体细胞突变基因分型测定法定量未知样品中存在的等位变体的百分数。
这个实施例显示使用含有修饰碱基的等位基因特异性引物、等位基因特异性阻断探针和检测探针定量PIK3CA基因的E545K、KRAS基因的G12D、EGFR基因的E746-A750缺失或BRAF基因的V600E的等位变体。这个实施例还显示本发明的方法在区分和定量突变变体与野生型变体方面具有高度选择性。另外，该实施例显示本发明的测定法是线性的并且可以用来确定等位变体的定量信息。
使用本文所述的方法进行体细胞突变基因分型测定法。将含有修饰碱基、核酸类似物和/或阻断部分的本发明等位基因特异性引物和等位基因特异性阻断探针用来检测PIK3CA、EGFR、KRAS和BRAF基因的各种等位变体的存在。表1列出在前述基因上的突变。
表1.1
基因 突变 阳性细胞系 来源
PIK3CA E542K SW948 ATCC
E545D Sup T1 ATCC
E545K MCF7 ATCC
H1047R KPL4 ATCC
EGFR T790M H1975 ATCC
L858R H1975 ATCC
E746-A750缺失 H1650 ATCC
KRAS G12A SW1116 ATCC
G12C NCI-H23 ATCC
G12D LS174T ATCC
G12R PSN1 ATCC
G12S A549 ATCC
G12V SW403 ATCC
G13C H1734 ATCC
G13D T84 ATCC
BRAF Q61H H460 ATCC
V600E HT29 ATCC
为了定量给定样品中存在的等位变体的量，产生标准曲线。对来自每个突变为阳性的细胞系的特定突变产生标准曲线。因为标准曲线是线性的，所以它可以用来定量未知样品中的等位变体。表1显示用来产生标准曲线的等位变体和阳性细胞系。使用Qiagen的DNeasy血液和组织试剂盒提取来自所述细胞系的DNA。制备来自每个阳性细胞系的DNA的系列稀释物(例如，100、10、1、0.1和0.01ng)以产生等位基因特异性标准曲线。在这个例子中，产生PIK3CA的E545K、KRAS的G12D、EGFR的E746-A750缺失和BRAF的V600E的标准曲线。
从产生的标准曲线并假设阳性细胞系具有100%突变百分数来建立等位基因特异性计算图表(例如，数学分析)。对于一些细胞系，通过使用偏好地与野生型等位基因杂交的等位基因特异性引物确定%突变。
为了确定未知样品中突变的量，使用本发明的方法分析样品。随后，使用突变百分数计算图表分析样品的等位变体的Ct值以确定样品中存在的变体的量和百分比。
图32A显示PIK3CAE545K等位变体和MCF7细胞系的标准曲线。使用本文所述的方法产生它。Ct值对DNA量的标准曲线图在log10标尺下是线性的。图32B显示来自结肠直肠癌患者的两份未知样品(样品A和B)和使用基因分型测定法产生的阳性对照(MCF7细胞系)的扩增曲线。图32C显示样品中存在的突变变体E545K的量和百分数(突变百分数)。使用计算图表确定样品中存在的等位变体的量和百分比(突变百分数)(图32C)。具体而言，从突变的量相对于样品中DNA的起始量来计算突变百分数。确定相对于阳性对照，样品A具有PIK3CAE545K变体的15%突变百分数。相对于阳性对照，样品B具有相同变体的7.3%突变百分数。值得注意地，在来自样品B的20ngDNA中检出突变等位基因。
图33显示使用本发明的KRASG12D测定法定量未知样品中存在的突变变体的百分数。标准曲线图在log10标尺下是线性并且用来定量未知样品的量和突变百分数。图33A显示KRASG12D基因分型测定法和LS174T细胞系的扩增曲线和标准曲线。图33B显示来自胰腺癌患者的两份未知样品(样品A和B)和使用本发明方法产生的阳性对照(LS174T细胞系)的扩增曲线。图33C显示相对于阳性对照，在表达突变变体的样品A中的DNA量经计算是3.25ng或9.6%。
图34显示使用本发明的EGFRE746-A750缺失EGFR测定法定量未知样品中存在的突变变体的百分数。图34A显示H1650细胞系的EGFR基因E746-A750缺失的扩增曲线和标准曲线。图34B显示来自肺癌患者的未知样品(样品A)和使用本发明方法产生的阳性对照(H1650细胞系)的扩增曲线。图34C显示相对于阳性对照，在表达EGFR缺失变体的样品A中的DNA量经计算是3.25ng或9.6%。
图35显示使用本发明的V600EBRAF测定法定量未知样品中存在的等位变体的百分数。图35A显示HT29细胞系的BRAFV600E等位变体的扩增曲线和标准曲线。图35B显示来自肺癌患者的未知样品(样品A)和使用本发明方法产生的阳性对照(H1650细胞系)的扩增曲线。图35C显示相对于阳性对照，使用计算图表计算在表达BRAF的V600E变体的样品A中的DNA量是0.18ng或1.2%。
这个实施例显示本发明的测定法(例如，PIK3CAE545K、KRASG12D、EGFRE746-A750缺失和BRAFV600E基因分型测定法)在log10标尺下是线性的并且可以用来确定患者组织样品中关于等位变体的定量信息。
实施例7.确定肿瘤遗传异质性。
这个实施例显示癌生物标志物的水平和致癌基因的特定等位变体的突变百分数之间的相关性。在胃肿瘤样品中，使用协作酶增强反应性(CEER)免疫测定法检测到的高水平细胞角蛋白(CK)对应于KRASG13D等位变体的高突变百分数。在胰腺肿瘤样品中，高CK水平与KRASG12D等位变体的100%突变百分数相关。这个实施例显示可以使用本发明的基因分型测定法和CEER免疫测定法(也称作COPIA；见例如，PCT专利公开号WO2008/036802和WO2009/108637，所述文献的公开内容通过引用的方式完整并入本文用于全部目的)评估组织样品的肿瘤含量。
肿瘤组织样品经常是肿瘤细胞和非肿瘤细胞(例如，血液或相邻的非肿瘤组织)的混合物。可以通过苏木精和伊红(H&E)染色评估实体癌组织样品中的肿瘤细胞。图36显示非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤样品的H&E染色的冷冻切片。图36A显示具有高肿瘤细胞百分数的切片(白色箭头指示肿瘤细胞)。图36B显示包含肿瘤细胞(白色箭头)、基质伴随血管(黑色箭头)、炎性细胞(例如，淋巴细胞；红色箭头)和充有巨噬细胞的肺泡(绿色箭头)的混合物的切片。
使用细胞角蛋白作为检测肿瘤细胞的生物标志物。在肿瘤样品中观察到高CK水平，而在相邻的正常组织中检测到较低水平。我们评价了多个胃肿瘤样品和胰腺肿瘤样品中的CK水平和KRAS、EGFR和PIK3CA等位变体的突变百分数以确定较高的CK水平是否与特定突变等位基因的较高突变百分数相关。
图37A显示在胃肿瘤样品中，高CK水平和EGFRT790M、KRASG12V、KRASQ61H或PIK3CAE545K变体的低突变百分数均表明不是全部肿瘤细胞均可能携带该SNP。图37A还显示高CK水平伴随高KRASG13D突变百分数(例如，90%)表明样品中的大部分肿瘤细胞可能携带该突变。图37B显示高水平CK与胰腺肿瘤样品中KRASG12D变体的高突变百分数(100%)相关。
总之，这个实施例显示本发明的基因分型测定法可以用来计算患者的肿瘤样品的突变百分数。这个实施例进一步显示致癌基因的特定等位变体的突变百分数能与癌生物标志物的表达水平相关。
实施例8.体细胞突变基因分型测定法在区分全血样品中的肿瘤细胞方面的灵敏度。
在这个实施例中，通过对掺入了携带突变的肿瘤细胞的全血样品进行KRAS的G12A或G12S突变测定法确定本发明的体细胞突变基因分型测定法的灵敏度。将含有修饰碱基如LNA修饰的本发明等位基因特异性引物和等位基因特异性阻断探针用来检测KRASG12A或G12S变异等位基因的存在。这个实施例还比较了本发明的体细胞突变基因分型测定法和LifeTechnologies的castPCRTM突变测定法的灵敏度。
通过确定为检测全血样品中KRAS突变所需的阳性肿瘤细胞(例如，SW116细胞系)的最小量，测试本发明的KRASG12A测定法(例如，“发明的体细胞突变基因分型测定法”)的灵敏度。试样由掺入了SW116细胞系细胞(例如，每份样品100,000；10,000；1,000；500；250；100；50；10或0个肿瘤细胞)的全血组成。使用Qiagen的DNeasy血液和组织试剂盒提取来自试样的基因组DNA。使用本文中所示的方法进行本发明的测定法。图38A显示从本发明的KRASG12A测定法产生的扩增曲线。图38B显示来自对相同试样所进行的LifeTechnologies的castPCRTM突变测定法的扩增曲线。
如图38C中所示，当试样含有少至250个阳性肿瘤细胞时，本发明的基因分型测定法检测到G12A突变。通过比较，castPCRTM测定法需要样品中最少1,000个肿瘤细胞。结果显示对于检测全血样品中的G12AKRAS突变，本发明的测定法具有比castPCRTM测定法更大的灵敏度。
为评价本发明的KRASG12S测定法，将全血样品掺入了A549细胞系的细胞(例如，全血试样中掺入100,000；10,000；1,000；500；250；100；50；10；或0个阳性肿瘤细胞)。使用Qiagen的DNeasy血液和组织试剂盒，提取试样的基因组DNA。使用本发明的测定法和LifeTechnologies的castPCRTM测定法检测到KRASG12S变体的存在。比较各测定法的灵敏度。图39A显示使用本发明测定法时试样的扩增曲线。图39B显示LifeTechnologies的castPCRTM测定法的扩增曲线。
本发明的测定法在具有低至100个肿瘤细胞的样品中检出G12S突变(图39C)。CastPCRTM的灵敏度低10倍；该测定法在含有1,000或更多个阳性肿瘤细胞的受试样品中检出该突变。图39C显示对于检测全血样品中的G12SKRAS突变，本发明的基因分型测定法具有比castPCRTM更大的灵敏度。
总之，这个实施例表明与来自LifeTechnologies的castPCRTM测定法相比，本发明的体细胞突变基因分型测定法显著改善等位PCR测定法。
实施例9.用于检测样品中的等位变体和确定变体百分数的示例性体细胞突变基因分型测定法。
这个实施例显示了用于检测样品中致癌性单核苷酸多态性(SNP)和定量样品中SNP突变百分数的本发明方法。这个实施例还显示用含有修饰碱基的本发明等位基因特异性引物和等位基因特异性阻断探针对样品(例如，癌细胞系和来自癌症患者的组织)筛选稀有(例如，突变)变异等位基因的存在。具体而言，等位基因特异性引物在3'末端包含对变异(例如，突变)等位基因特异的锁核酸(LNA)，并且等位基因特异性阻断探针包含在3'末端处的己二醇阻断部分和在寡核苷酸序列的中部对野生型等位基因特异的LNA。在这个实施例中，检测到的等位变体包括PIK3CAE542K、E545D、E545K和H1047R；EGFRT790M、L858R和E746缺失；KRASG12C、G12R、G12S、G12D、G12A、G12V、G13C、G13D和Q61H；以及BRAFV600E。这个实施例还显示本发明的方法能够用于来自癌症和肿瘤如乳腺癌、结肠直肠癌、肺肿瘤、胃肿瘤、肝脏肿瘤、结肠肿瘤、和胰腺肿瘤；细胞系(例如，结肠直肠癌细胞系)和异种移植组织的多种样品。
使用本发明的方法，如等位基因特异性实时PCR测定法，从对表达变体的细胞系进行的测定法建立标准曲线并产生针对每种变体的突变百分数计算图表，确定各种SNP的存在，和对样品中被检测的变体的百分数定量。简而言之，为了建立等位变体的标准曲线，使用该等位变体阳性的细胞系的系列稀释物进行本发明的SNP检测测定法。测定法的结果用来产生标准曲线，并且随后产生该等位变体的突变百分数计算图表，其中基于从SNP检测测定法对该样品所获得的数据，所述突变百分数计算图表可以预测样品中存在的等位变体的量。
图40显示通过使用本发明的方法在乳腺癌样品中检测(例如，存在或不存在)和/或定量(例如，突变百分数)以下SNP所获得的结果：PIK3CAE542K、E545D、E545K、H1047R；EGFRT790M、L858R；KRASG12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V和G13D；以及BRAFV600E。确定了PIK3CAH1047RSNP在样品中以不同的百分数表达。例如，试验#1以12%表达H1047R等位基因，而试验#33以41%表达相同的SNP。试验#2以1%表达突变变体。试验#34以100%表达另一种PIK3CASNP(例如，E545K)，这预测试样中的全部细胞具有E545K变体。
图41显示在另一个乳腺癌样品集合中也检测到并定量PIK3CASNP(E542K、E545D、E545K和H1047R)。对45份乳腺癌样品筛查PIK3CAE542K、E545D、E545K和H1047R等位变体。使用上文和实施例6中描述的方法定量变体的突变百分数。结果显示样品#744以非常低的百分数(例如，0.13%)表达E542K并且样品#743以100%的高百分数表达H1047R。表达E542K变体的其他样品是以2%表达该变体的样品#762和以3.55%表达该变体的样品#767。表达H1047R变体的其他样品是具有89%突变的样品#746、具有51.8%突变的样品#775、具有6.8%突变的样品#740和具有5.9%突变的样品#769。
图42显示可以使用本发明的方法对肺肿瘤样品筛查SNP。在这个实施方案中，在25份肺肿瘤样品中确定多种SNP的存在和突变百分数。SNP包括PIK3CAE542K、E545D、E545K和H1047R；EGFRT790M、L858R和E746缺失；KRASG12C、G12R、G12S、G12D、G12A、G12V、G13C、G13D和Q61H；以及BRAFV600E。样品#352-355均以100%表达PIK3CAE545K，这表明这些样品中的全部细胞均具有突变变体。样品#371-375和381均以100%表达EGFRL848R。在两份样品(#164和#381)中以非常低的比率(分别是0.1%和0.2%)检测到EGFRE746缺失变体。该集合中表达BRAFV600E变体的唯一样品是具有突变百分数0.2%的样品#213。
图43显示使用本发明的方法对额外32份人肺肿瘤样品所获得的结果。SNP包括PIK3CAE542K、E545D、E545K和H1047R；EGFRT790M、L858R和E746缺失；KRASG12C、G12R、G12S、G12D、G12A、G12V和G13D；以及BRAFV600E。这个集合的样品#9以0.3%表达KRAS突变G12S，以2%表达G12V和以0.3%表达G13D。样品#3和#12以100%表达PIK3CAE545K变体。样品#25以0.2%表达PI3KCAE545D并且样品#6以0.06%表达PIK3CAH1047R。样品#13和#19以100%具有KRASG12C，而样品#22以仅2%具有相同的变体。样品#22还以54%表达BRAFV600E变体。KRASG12V变体以100%百分数存在于样品#14中并以0.1%百分数存在于样品#15中。样品#4和#31中分别以47%和34%检测到BRAFV600E变体。
图44显示可以使用本发明的方法筛查胃肿瘤样品。SNP包括PIK3CAE542K、E545D、E545K和H1047R；EGFRT790M、L858R和E746缺失；KRASG12C、G12R、G12S、G12D、G12A、G12V、G13D和Q61H；以及BRAFV600E。在这个实施方案中，用40ng样品(例如，DNA)进行每种测定法。对于17份分析的样品，样品#233表达4种KRAS突变，如以0.001%表达G12R，以2.3%表达G12V，以“低”百分数表达G13D并且以0.5%表达Q61H。在样品#241中以“低”百分数检测到KRASG12C变体。在样品#253中以0.6%检测到PIK3CAE542K等位基因并且在样品#223中以0.2%检测到EGFRT790M等位基因。与其他肿瘤样品如乳腺癌和肺肿瘤相比，对于筛查的任何等位变体，测试的胃肿瘤样品中SNP的突变百分数不高于100%。
图45显示使用本发明方法对异种移植样品获得的结果。SNP包括PIK3CAE542K、E545D、E545K和H1047R；EGFRT790M、L858R和E746缺失；KRASG12C、G12R、G12S、G12D、G12A、G12V、G13C、G13D和Q61H；以及BRAFV600E。EGFRE746缺失存在于样品#585-588中并且预测在所述样品的细胞中以100%存在。在样品#581-584中分别以3.4%、1.2%、1%和1.8%突变百分数检测到PIK3CAH1047R等位基因。
图46显示可以使用本发明的方法在结肠直肠癌样品中检测到并定量KRAS、BRAF和PIK3CA等位变体。SNP包括PIK3CAE542K、E545D、E545K和H1047R；KRASG12C、G12R、G12S、G12D、G12A、G12V和G13D；以及BRAFV600E。数据显示样品#121以6%表达KRASG13D变体并且以58%表达PIK3CAE545K。数据显示样品#130以54%表达KRASG13V变体并且以5%表达PIK3CAE542K。
图47还显示可以使用本发明的方法在额外的结肠直肠癌样品中检测到并定量KRAS、BRAF和PIK3CA等位变体。数据显示样品#147以100%表达KRASG12D变体和PIK3CA变体，这表明该样品中的全部细胞预测均表达所述变体。样品#149以24%表达KRASG13D变体并且以0.1%表达PIK3CAH1047R。样品#163以34%表达KRASG12D变体并且以3%表达PIK3CAE542K。
图48显示可以使用本发明的方法对来自结肠直肠癌患者的肝脏肿瘤组织和结肠肿瘤组织筛查KRAS、BRAF和PIK3CA等位变体。结果显示一些样品具有多种SNP。例如，样品#207和#208表达KRASG12S和PIK3CAE545K。使用本发明的方法，还确定样品#207以22%表达G12S并且样品#208以63%表达相同的变体。样品#207以40%表达E545K变体并且样品#208以79%表达相同的变体。样品#215以1%具有BRAFV600E并且以5%具有PIK3CAE545K。样品#216以9%具有BRAFV600E并且以23%具有PIK3CAE545K。样品#217以2%表达KRASG12V并且以5%表达PIK3CA545K。样品#217以4%具有KRASG12V并且以9%具有PIK3CA545K。
图49显示可以对来自胰腺癌患者的样品筛查SNP并且可以根据本发明的方法确定突变百分数。在这个实施方案中，从患者获得并且使用本文所述的SNP基因分型测定法筛查细针抽吸物样品。在测试的胰腺癌样品中，检测到各种KRAS突变，但是未检测到PIK3CA(例如，E542K、E545D、E545K、H1047R)、EGFR(例如，T790M、L858R)和BRAF(例如，V600E)突变。样品#28表达KRASG12C变体。KRASG12V变体在样品#19、21、26、27和35中分别以63%、0.2%、4%、1%和3%的突变百分数存在。样品#9和#11以100%表达KRASG12D变体。这种变体还在样品#2、6、12、23、24、37、39和40中分别以1.1%、29%、7.4%、5%、5%、32%、5.4%和0.9%表达。未在该集合的其他胰腺肿瘤样品中检出被筛查的SNP。
总之，这个实施例表明本发明的体细胞基因分型测定法可以用来检测和/或定量基因如KRAS，PIK3CA，EGFR和BRAF中的等位变体。这些实施例显示本发明的方法可以用来检测来自患者的癌和肿瘤组织样品中的多个等位变体。另外，可以确定样品中等位变体的百分数。
尽管出于清晰理解的目的，已经通过说明和实施例相当详细地描述前述发明，但是本领域技术人员将理解，可以在所附权利要求书的范围内实施某些变化和修改。此外，本文提供的每篇参考文献通过引用的方式完整并入至相同程度，如同每篇参考文献通过引用的方式独立并入。

Claims (37)

1.反应混合物，其包含：
(a)核酸分子；
(b)等位基因特异性引物，其中等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分与靶序列的第一等位变体互补，并且其中等位基因特异性引物包含至少一个核酸修饰；
(c)与包含第二等位变体的靶序列区域互补的等位基因特异性阻断探针，其中等位基因特异性阻断探针包含不可延伸性3'-己二醇阻断部分和至少一个核酸修饰；
(d)检测探针；和
(e)与靶序列的区域互补的基因座特异性引物，其中与基因座特异性引物互补的靶序列的区域是第一等位变体的3’并在相反链上。
2.权利要求1的反应混合物，其中等位基因特异性引物中的至少一个核酸修饰之一位于等位基因特异性核苷酸部分处。
3.权利要求1的反应混合物，其中等位基因特异性引物中的至少一个核酸修饰之一位于等位基因特异性引物的5'末端和/或3'末端处。
4.权利要求1的反应混合物，其中等位基因特异性引物包含两个或多个不相邻核酸修饰。
5.权利要求1的反应混合物，其中等位基因特异性引物中的核酸修饰选自锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、苏糖核酸(TNA)、拉链核酸(ZNA)、三唑核酸(TzNA)和它们的组合。
6.权利要求1的反应混合物，其中等位基因特异性阻断探针中的至少一个核酸修饰之一位于等位基因特异性核苷酸部分处。
7.权利要求1的反应混合物，其中等位基因特异性阻断探针中的至少一个核酸修饰之一位于等位基因特异性阻断探针中的内部位置处。
8.权利要求1的反应混合物，其中等位基因特异性阻断探针包含两个或多个不相邻核酸修饰。
9.权利要求1的反应混合物，其中等位基因特异性阻断探针中的核酸修饰选自锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、苏糖核酸(TNA)、拉链核酸(ZNA)、三唑核酸(TzNA)和它们的组合。
10.权利要求1的反应混合物，其中检测探针包含探针。
11.权利要求1的反应混合物，其中核酸分子从选自血液、血清、血浆、细针抽吸物、肿瘤组织和其组合的样品获得。
12.权利要求1至11中任一项所述的反应混合物，其中第一等位变体是突变等位基因并且第二等位变体是野生型等位基因。
13.权利要求1至12中任一项所述的反应混合物的用途，用于制备检测或定量疑似至少具有靶序列的第二等位变体的核酸样品中靶序列的第一等位变体的试剂盒。
14.组合物，其包含：
(a)等位基因特异性引物，其中等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分与靶序列的第一等位变体互补，并且其中等位基因特异性引物包含至少一个核酸修饰；和
(b)与包含第二等位变体的靶序列区域互补的等位基因特异性阻断探针，其中等位基因特异性阻断探针包含不可延伸性3'-己二醇阻断部分和至少一个核酸修饰。
15.权利要求14的组合物，其还包含：(c)检测探针；和/或(d)与靶序列的区域互补的基因座特异性引物，其中与基因座特异性引物互补的靶序列的区域是第一等位变体的3’并在相反链上。
16.权利要求14的组合物，其中等位基因特异性引物中的至少一个核酸修饰之一位于等位基因特异性核苷酸部分处。
17.权利要求14的组合物，其中等位基因特异性引物中的至少一个核酸修饰之一位于等位基因特异性引物的5'末端和/或3'末端处。
18.权利要求14的组合物，其中等位基因特异性引物包含两个或多个不相邻核酸修饰。
19.权利要求14的组合物，其中等位基因特异性引物中的核酸修饰选自锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、苏糖核酸(TNA)、拉链核酸(ZNA)、三唑核酸(TzNA)和它们的组合。
20.权利要求14的组合物，其中等位基因特异性阻断探针中的至少一个核酸修饰之一位于等位基因特异性核苷酸部分处。
21.权利要求14的组合物，其中等位基因特异性阻断探针中的至少一个核酸修饰之一位于等位基因特异性阻断探针中的内部位置处。
22.权利要求14的组合物，其中等位基因特异性阻断探针包含两个或多个不相邻核酸修饰。
23.权利要求14的组合物，其中等位基因特异性阻断探针中的核酸修饰选自锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、苏糖核酸(TNA)、拉链核酸(ZNA)、三唑核酸(TzNA)和它们的组合。
24.权利要求14至23中任一项所述的组合物，其中第一等位变体是突变等位基因并且第二等位变体是野生型等位基因。
25.权利要求14至24中任一项所述的组合物的用途，用于制备检测或定量疑似至少具有靶序列的第二等位变体的核酸样品中靶序列的第一等位变体的试剂盒。
26.试剂盒，其包含两个或更多个含有独立分布在两个或更多个容器之一中的以下组分的容器：
(a)等位基因特异性引物，其中等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分与靶序列的第一等位变体互补，并且其中等位基因特异性引物包含至少一个核酸修饰；和
(b)与包含第二等位变体的靶序列区域互补的等位基因特异性阻断探针，其中等位基因特异性阻断探针包含不可延伸性3'-己二醇阻断部分和至少一个核酸修饰。
27.权利要求26所述的试剂盒，其还包含：(c)检测探针；和/或(d)与靶序列的区域互补的基因座特异性引物，其中与基因座特异性引物互补的靶序列的区域是第一等位变体的3’并在相反链上。
28.权利要求26所述的试剂盒，其中等位基因特异性引物中的至少一个核酸修饰之一位于等位基因特异性核苷酸部分处。
29.权利要求26所述的试剂盒，其中等位基因特异性引物中的至少一个核酸修饰之一位于等位基因特异性引物的5'末端和/或3'末端处。
30.权利要求26所述的试剂盒，其中等位基因特异性引物包含两个或多个不相邻核酸修饰。
31.权利要求26所述的试剂盒，其中等位基因特异性引物中的核酸修饰选自锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、苏糖核酸(TNA)、拉链核酸(ZNA)、三唑核酸(TzNA)和它们的组合。
32.权利要求26所述的试剂盒，其中等位基因特异性阻断探针中的至少一个核酸修饰之一位于等位基因特异性核苷酸部分处。
33.权利要求26所述的试剂盒，其中等位基因特异性阻断探针中的至少一个核酸修饰之一位于等位基因特异性阻断探针中的内部位置处。
34.权利要求26所述的试剂盒，其中等位基因特异性阻断探针包含两个或多个不相邻核酸修饰。
35.权利要求26所述的试剂盒，其中等位基因特异性阻断探针中的核酸修饰选自锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、苏糖核酸(TNA)、拉链核酸(ZNA)、三唑核酸(TzNA)和它们的组合。
36.权利要求26所述的试剂盒，其中第一等位变体是突变等位基因并且第二等位变体是野生型等位基因。
37.权利要求26至36中任一项所述的试剂盒，其还包括用于检测或定量疑似具有靶序列的第二等位变体的核酸样品中靶序列的第一等位变体的等位基因特异性引物和等位基因特异性阻断探针的使用说明书。
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Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102447139B1 (ko) 2010-05-14 2022-09-23 더 제너럴 하스피톨 코포레이션 종양 특이적 신생항원을 확인하는 조성물 및 방법
KR101501826B1 (ko) * 2013-04-05 2015-03-13 연세대학교 산학협력단 위암에 대한 예후 예측 모형의 제조방법
CN103215361A (zh) * 2013-04-18 2013-07-24 深圳联合医学科技有限公司 等位基因变体检测方法、试剂盒及组合物
KR101830700B1 (ko) 2013-11-11 2018-02-21 주식회사 파나진 클램핑 프로브 및 검출 프로브를 이용한 다중 표적핵산 검출방법
WO2015077717A1 (en) 2013-11-25 2015-05-28 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for diagnosing, evaluating and treating cancer by means of the dna methylation status
US11725237B2 (en) 2013-12-05 2023-08-15 The Broad Institute Inc. Polymorphic gene typing and somatic change detection using sequencing data
NZ721908A (en) 2013-12-20 2022-12-23 Massachusetts Gen Hospital Combination therapy with neoantigen vaccine
CN106715723B (zh) * 2014-08-07 2021-03-30 法马西斯特有限责任公司 测定样品中pik3ca突变状态的方法
JP6766037B2 (ja) * 2014-09-26 2020-10-07 ヤンセン ファーマシューティカ エヌ．ベー． Ｆｇｆｒ阻害剤による治療に応答性であるがん患者を同定する際の、ｆｇｆｒ変異遺伝子パネルの使用
CN105441533B (zh) * 2014-11-29 2019-07-05 上海赛安生物医药科技有限公司 Pik3ca基因突变检测体系及其试剂盒
CN104372102A (zh) * 2014-12-05 2015-02-25 武汉友芝友医疗科技有限公司 一种用于检测pik3ca基因突变的试剂盒
US9840702B2 (en) * 2014-12-18 2017-12-12 Integrated Dna Technologies, Inc. CRISPR-based compositions and methods of use
EP3757211A1 (en) 2014-12-19 2020-12-30 The Broad Institute, Inc. Methods for profiling the t-cell-receptor repertoire
US10975442B2 (en) 2014-12-19 2021-04-13 Massachusetts Institute Of Technology Molecular biomarkers for cancer immunotherapy
CN105986017A (zh) * 2015-02-06 2016-10-05 上海赛安生物医药科技有限公司 Pdgfra基因突变检测体系及其试剂盒
US10835585B2 (en) 2015-05-20 2020-11-17 The Broad Institute, Inc. Shared neoantigens
US9657353B2 (en) 2015-06-26 2017-05-23 Great Basin Scientific, Inc. Specific detection of organisms derived from a sample
WO2017070281A1 (en) * 2015-10-21 2017-04-27 Admera Health LLC Blocker-based enrichment system and uses thereof
CN105463111B (zh) * 2016-01-13 2019-04-23 武汉海吉力生物科技有限公司 用于检测人类pik3ca基因5种突变的探针、引物及试剂盒
CN105463112B (zh) * 2016-01-13 2019-04-23 武汉海吉力生物科技有限公司 用于检测人类pdgfra基因d842v突变的引物、探针及试剂盒
CN105463115B (zh) * 2016-01-15 2019-04-23 武汉海吉力生物科技有限公司 用于检测人类ret基因7种突变的探针、引物及试剂盒
CN105463114B (zh) * 2016-01-15 2019-05-14 武汉海吉力生物科技有限公司 用于检测人类tp53基因5种突变的探针、引物及试剂盒
US20190284581A1 (en) * 2016-08-12 2019-09-19 Nexuspiral Inc. Genome editing method
WO2018140391A1 (en) * 2017-01-24 2018-08-02 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for detecting a mutant variant of a polynucleotide
CN108624662A (zh) * 2017-03-23 2018-10-09 陈汉奎 稀有基因突变的检测
CN106978495A (zh) * 2017-04-24 2017-07-25 元码基因科技（北京）有限公司 检测样品中kras基因的突变的方法
WO2019126186A1 (en) 2017-12-18 2019-06-27 Neon Therapeutics, Inc. Neoantigens and uses thereof
GB201801255D0 (en) * 2018-01-25 2018-03-14 Univ Nottingham Detection of mutant nucleic acid sequences
JP7325039B2 (ja) * 2019-07-24 2023-08-14 公立大学法人福島県立医科大学 一塩基の識別方法
CN110438210B (zh) * 2019-08-13 2021-07-16 复旦大学 非小细胞肺癌靶向药物相关低频突变的多重富集检测方法
CN115335701A (zh) * 2019-09-09 2022-11-11 泽普托生命技术有限责任公司 用于检测核酸中基因变异的系统和方法
US11060141B1 (en) 2019-12-23 2021-07-13 Stilla Technologies Multiplex drop-off digital polymerase chain reaction methods
CN113444778A (zh) * 2020-03-27 2021-09-28 广州达安基因股份有限公司 具有高杂交性能的寡核苷酸缀合物及其应用
KR102543156B1 (ko) * 2020-11-24 2023-06-14 주식회사 파나진 높은 특이도의 표적핵산 증폭방법 및 이를 이용한 표적핵산 증폭용 조성물
WO2022149575A1 (ja) * 2021-01-06 2022-07-14 東洋鋼鈑株式会社 Ｍｌｈ１メチル化修飾及びｂｒａｆ変異を検出するためのキット
CN114703288B (zh) * 2022-06-06 2022-09-13 珠海圣美生物诊断技术有限公司 用于扩增EGFR-T790M基因变异的blocker探针、引物组及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US554516A (en) * 1896-02-11 Piano-chair
WO2005017181A2 (en) * 2003-05-20 2005-02-24 Investigen, Inc. System for detecting polynucleotides
WO2010111682A2 (en) * 2009-03-27 2010-09-30 Life Technologies Corporation Methods, compositions, and kits for detecting allelic variants

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5994056A (en) 1991-05-02 1999-11-30 Roche Molecular Systems, Inc. Homogeneous methods for nucleic acid amplification and detection
AU681082B2 (en) * 1992-05-06 1997-08-21 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid sequence amplification method, composition and kit
US5767259A (en) 1994-12-27 1998-06-16 Naxcor Oligonucleotides containing base-free linking groups with photoactivatable side chains
US5925517A (en) 1993-11-12 1999-07-20 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits
US5538848A (en) 1994-11-16 1996-07-23 Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe
CA2159830C (en) 1994-04-29 2001-07-03 Timothy M Woudenberg System for real time detection of nucleic acid amplification products
EP0892808B1 (en) 1996-04-12 2008-05-14 PHRI Properties, Inc. Detection probes, kits and assays
EP1179600B1 (en) 1996-06-04 2005-05-11 University Of Utah Research Foundation Monitoring hybridization during PCR
US5861295A (en) 1997-01-02 1999-01-19 Life Technologies, Inc. Nucleic acid-free thermostable enzymes and methods of production thereof
US6485901B1 (en) 1997-10-27 2002-11-26 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions pertaining to linear beacons
AU1366299A (en) 1997-10-27 1999-05-17 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions pertaining to pna molecular beacons
US6303305B1 (en) 1999-03-30 2001-10-16 Roche Diagnostics, Gmbh Method for quantification of an analyte
US6383752B1 (en) 1999-03-31 2002-05-07 Hybridon, Inc. Pseudo-cyclic oligonucleobases
US6528254B1 (en) 1999-10-29 2003-03-04 Stratagene Methods for detection of a target nucleic acid sequence
US6727356B1 (en) 1999-12-08 2004-04-27 Epoch Pharmaceuticals, Inc. Fluorescent quenching detection reagents and methods
US6783934B1 (en) 2000-05-01 2004-08-31 Cepheid, Inc. Methods for quantitative analysis of nucleic acid amplification reaction
US6605451B1 (en) 2000-06-06 2003-08-12 Xtrana, Inc. Methods and devices for multiplexing amplification reactions
US6596490B2 (en) 2000-07-14 2003-07-22 Applied Gene Technologies, Inc. Nucleic acid hairpin probes and uses thereof
US6350580B1 (en) 2000-10-11 2002-02-26 Stratagene Methods for detection of a target nucleic acid using a probe comprising secondary structure
US6593091B2 (en) 2001-09-24 2003-07-15 Beckman Coulter, Inc. Oligonucleotide probes for detecting nucleic acids through changes in flourescence resonance energy transfer
US6589250B2 (en) 2001-11-20 2003-07-08 Stephen A. Schendel Maxillary distraction device
US7228237B2 (en) 2002-02-07 2007-06-05 Applera Corporation Automatic threshold setting and baseline determination for real-time PCR
US7517978B1 (en) 2004-04-14 2009-04-14 Applied Biosystems, Llc Modified oligonucleotides and applications thereof
EP2064549B1 (en) 2006-09-21 2012-10-24 Prometheus Laboratories, Inc. Antibody-based arrays for detecting multiple signal transducers in rare circulating cells
WO2009108637A1 (en) 2008-02-25 2009-09-03 Prometheus Laboratories, Inc. Drug selection for breast cancer therapy using antibody-based arrays
EP2488664A4 (en) * 2009-10-13 2014-04-09 Syntezza Molecular Detection Israel Ltd METHOD AND COMPOSITIONS FOR REINFORCING TARGET SEQUENCES FROM NUCLEIC ACID SAMPLES
US20110129832A1 (en) * 2009-10-27 2011-06-02 Swift Biosciences, Inc. Polynucleotide Primers and Probes
EP2496712A1 (en) * 2009-11-06 2012-09-12 Enzymatics Inc. Composition and method for synthesizing a deoxyribonucleotide chain using a double stranded nucleic acid complex with a thermostable polymerase

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US554516A (en) * 1896-02-11 Piano-chair
WO2005017181A2 (en) * 2003-05-20 2005-02-24 Investigen, Inc. System for detecting polynucleotides
WO2010111682A2 (en) * 2009-03-27 2010-09-30 Life Technologies Corporation Methods, compositions, and kits for detecting allelic variants

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