CN115885157A - 荧光增强的光热红外光谱学和共聚焦荧光成像 - Google Patents
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Abstract
所公开的实施方式包括用于荧光增强的光热红外(FE‑PTIR)光谱学和化学成像的方法和设备，该方法和设备使得能够利用同时共聚焦荧光成像对IR吸收进行高灵敏度和高空间分辨率测量。在各种实施方式中，FE‑PTIR技术利用组合/同时的OPTIR和荧光成像，与之前的工作相比，该FE‑PTIR技术通过同时使用同一光学检测器对IR吸收和共聚焦荧光两者同时进行检测而提供了显著的改进和益处。
Description
技术领域
本文所公开的实施方式总体涉及使用光学系统即使用红外光、可见光或紫外光对材料进行研究或分析。本文所描述的实施方式涉及成像和光谱学，并且更具体地，涉及对用于获取指示样品的光学性质和/或材料或化学成分的光谱信息(例如与结合同时并置的荧光成像的红外(IR)吸收光谱相关的信息)的光热成像和光谱学系统以及技术的增强。
背景技术
红外(IR)光谱学是用于材料的化学表征和分析的强大技术，其包括在复杂环境例如生物材料中对化学物种进行绘制和识别。红外光谱学通过用红外辐射的光束照射样品，并且然后对从样品吸收、透射、反射和/或散射的光的量进行测量来工作。红外光特别是中红外光(波长为2.5μm至20μm)的频率与分子键中的振动频率对应。因此，当样品被中IR光照射时，其将吸收与样品中的化学物种的特定分子振动相对应的IR辐射频率下的光。通过测量根据IR频率的样品对IR光的吸收(即IR吸收光谱)，吸收峰的图案提供了可以用于表征和/或识别样品中的化学物种的“指纹”。
光学光热红外(OPTIR)光谱学是使用具有比常规的傅里叶变换红外(FTIR)光谱学精细十倍或更多倍的空间分辨率的红外光谱学来提供化学分析的新兴领域。OPTIR通过使用较短波长“探测光束”感测样品的红外吸收区域中的光热畸变来实现比常规IR光谱学更高的空间分辨率。例如，在美国专利第9,091,594号、第9,841,324号和第10,677,722号以及美国公开专利申请第US 2020-0025677 A1号和第US 2019-0120753 A1号和美国申请序列第16/366,982号中描述了各种OPTIR技术。
共聚焦荧光显微术是基于激光的技术，其中，一个波长的辐射激发在第二波长或波长范围处检测到的样品中的荧光响应。针对生物材料(例如细胞、组织和有机体)的不同的功能元素和结构元素，已经开发了大量的荧光染料库。荧光显微术使得研究人员和临床医生能够对样品的显微照片进行创建、可视化和分析，在样品的显微照片中每个颜色表示生物材料内的特定目标结构的分布。例如，在Renz，“Fluorescence Microscopy-Ahistorical and Technical Perspective”Cytometry Part A，第83卷，第767页至第779页(2013)中和Sanderson等人，“Fluorescence Microscopy”Cold Spring Harb Protoc.2014(10)：pdb.top071795.doi:10.1101/pdb.top071795.中描述了各种荧光显微术技术。
迄今为止，OPTIR光谱学和荧光显微术尚不能在同一分析仪器上可用。
发明内容
所公开的实施方式包括用于荧光增强的光热红外(FE-PTIR)光谱学和化学成像的方法和设备，该方法和设备使得能够利用同时共聚焦荧光成像对IR吸收进行高灵敏度和高空间分辨率测量。在各种实施方式中，FE-PTIR技术利用组合的/同时的OPTIR和荧光成像，与之前的工作相比，该FE-PTIR技术通过同时使用同一光学检测器对IR吸收和共聚焦荧光两者同时进行检测而提供了显著的改进和益处。
在各种实施方式中，所述技术提供IR吸收测量和荧光测量的搭配，使得能够对通过荧光测量被可视化的结构元素与通过红外光谱学进行的化学分析进行鲁棒的相关比较。在各种实施方式中，所述技术将IR吸收测量仅定位到由特定荧光染料荧光标记的区域，从而提供了IR测量的极端定位以及比可以通过常规OPTIR测量获得的更好的空间分辨率。在一些实施方式中，所述技术将光热信号的百分数强度增强了大约100倍。在一些实施方式中，所述技术提供了从样品收集的背景探测辐射量的显著减少，使得OPTIR测量中的噪声降低。
在实施方式中，一种从样品获得荧光测量和光热红外测量以表征样品的化学成分的方法包括：用红外光束照射样品以产生样品的红外照射区域，并且然后至少部分地与样品的红外照射区域交叠地用探测光束照射样品的区域，其中，探测光束包括比红外光短的激发波长。对由探测光束与样品相互作用引起的包括来自样品的探测光束照射区域的荧光发射的光进行收集和滤波以基本上阻挡在激发波长处的光，并且至少部分地透射来自样品的探测光束照射区域的荧光发射。检测器对来自样品的探测光束照射区域的荧光发射进行检测，并且响应于样品的红外吸收来确定所检测到的荧光发射的调制的量。确定所检测到的荧光发射的调制的量以便产生指示样品的IR吸收的信号，其中，指示IR吸收的信号基于样品的化学成分。
在实施方式中，一种从样品获得荧光测量和光热红外测量以表征样品的化学成分的方法，所述方法：用经调制的红外光的光束照射样品以产生样品的红外照射区域，并且然后至少部分地与样品的红外照射区域交叠地用探测光束照射样品，其中，探测光束包括比红外光短的激发波长，并且其中，在激发波长处的光激发样品中的荧光发射。对从样品的被红外光束和探测光束两者照射的区域发射的荧光进行检测，并且与经调制的红外光的光束的周期同步地对所检测到的荧光的变化进行解调。经解调的变化用于产生指示样品的IR吸收的信号。
上面的发明内容并非旨在对本文主题的每个示出的实施方式或每个实现方式进行描述。随后的附图和具体实施方式更具体地例示了各种实施方式。
附图说明
结合附图参照以下具体实施方式对本文所提供的实施方式的方面和优点进行了描述。贯穿附图，可以重复使用附图标记来指示引用的元素之间的对应关系。附图被提供以示出本文所描述的示例实施方式，而并非旨在对本公开内容的范围进行限制。
图1A是用于荧光增强的光热红外光谱学和同时共聚焦荧光成像的显微镜系统的概念上的简化框图。
图1B是图1A的一部分的放大视图。
图2是用于采用反向传播几何结构的荧光增强的光热红外光谱学和同时共聚焦荧光成像的显微镜系统的概念上的简化框图。
图3是用于采用反向传播几何结构和透射检测的荧光增强的光热红外光谱学和同时共聚焦荧光成像的显微镜系统的概念上的简化框图。
图4是用于采用具有倒置光学显微镜配置的反向传播几何结构的荧光增强的光热红外光谱学和同时共聚焦荧光成像的显微镜系统的概念上的简化框图。
图5是用于具有多线激光激发和多线荧光检测的荧光增强的光热红外光谱学和同时共聚焦荧光成像的显微镜系统的概念上的简化框图。
虽然各种实施方式适合于各种修改和替选形式，但是其细节已经通过附图中的示例示出并且将被详细描述。然而，应当理解，意图并非是将所要求保护的发明限制于所描述的特定实施方式。相反，意图是涵盖落入权利要求书所限定的主题的精神和范围内的所有修改、等同物和替选方案。
具体实施方式
定义
出于本说明书的目的，将以下术语具体定义如下：
“分析器/控制器”是指促进双探头系统的数据获取和控制的系统。分析器/控制器可以是单个集成电子外壳，或者可以包括多个分布式元件。控制元件可以提供用于对光纤探头和/或样品进行定位和/或扫描的控制。控制元件还可以收集关于探测光束偏转、运动或其他响应的数据，提供对激发和/或探测功率、偏振、转向、聚焦和/或其他功能的控制。控制元件等可以包括计算机程序方法或数字逻辑方法，并且可以使用各种计算装置(计算机、个人电子装置)、模拟和/或数字分立电路部件(晶体管、电阻器、电容器、电感器、二极管等)、可编程逻辑、微处理器、微控制器、专用集成电路或其他电路元件的任何组合来实现。被配置成存储计算机程序的存储器可以与分立电路部件一起实现以执行本文所描述的处理中的一个或更多个处理。
“光束组合器”意指可以将两个光束组合到同一光路上的光学元件。在一种配置中，光束组合器可以是以相反方向使用的分束器，即，将从分束器界面反射的一束光束与透射通过分束器界面的另一光束进行组合。例如，分束器立方体可以用作分束器和光束组合器两者。即使作为分束器销售的光学元件不用于将光分到两条路径上，其也可以用作光束组合器。例如，马赫-曾德尔干涉仪使用一个分束器将入射光分到两条路径上，并且使用第二分束器将两个光束重新组合。在这种情况下，第二分束器被用作光束组合器。在迈克尔逊干涉仪中，单个分束器既用于将入射光分割还用于然后将其重新组合。因此，迈克尔逊干涉仪中的分束器被用作分束器和光束组合器两者。光束组合器还可以是例如将来自两个输入光纤的光组合到一个输出光纤中的基于光纤的装置，例如1x2光纤耦合器。单个1x2光纤耦合器可以用作分束器和光束组合器两者。
“分束器”是指可以将光分割到至少两条路径上的光学元件。分束器可以包括板、立方体和/或棱镜或可以分割光束的其他形状/配置。分束器可以包括在感兴趣的波长下部分反射使得入射光束的一部分被反射并且另一部分被透射的薄膜。分束器可以是偏振的，其中，基本上透射一种偏振的光并反射正交偏振的光。例如在分束器是诺马斯基(Nomarski)棱镜或沃拉斯顿(Wollaston)棱镜的情况下，分束器还可以基于偏振沿着两条透射路径来分割光。分束器还可以是非偏振的，其中，在基本上不依赖于入射光的偏振的情况下，在两条路径之间分割光。分束器还可以是例如将来自一个输入光纤的光分离到至少两个输出光纤中的基于光纤的装置，例如1x2光纤耦合器。分束器可以是其中基本相等部分的光被引导到两条不同的路径上的50:50分束器。分束器也可以是不平衡的，例如将90％的光引导到一条路径上并且将10％的光引导到另一路径上的90:10分束器、或者将70％的光引导到一条路径上并且将30％的光引导到另一路径上的70:30分束器或类似的分束器。
“摄像装置”是指包括多个光敏像素的基于阵列的光电检测器。摄像装置可以包括一种或更多种技术，包括但不限于CCD、EM-CCD、CMOS、s-CMOS和/或其他光敏阵列技术。摄像装置可以支持从每秒几帧、每秒数百帧、或者甚至每秒数千帧或更高的帧速率。
“收集探测光”和“收集探测辐射”是指对已经与样品相互作用的探测光束的辐射进行收集。可以在反射、散射、透射、倏逝波耦合和/或透射通过孔径探测器之后收集探测光。
“准直光学器件”是指以使辐射总体准直的方式布置的以上光学元件中的任何光学元件。在一些实施方式中，同一光学器件可以用作例如在一个传播方向上使光聚焦并且然后在相反的传播方向上使光重新准直的聚焦光学器件和准直光学器件两者。
“共聚焦显微术”是指如下形式的光学显微术，其中，在检测器处收集的光被限制为通过样品上的光学物镜的3D聚焦体积内的小体积的光。共聚焦显微术通常通过在与样品的焦平面等效的焦平面处放置“共聚焦孔径”从而阻挡未通过样品上的聚焦体积的杂散光来执行。
“检测器”是指产生指示入射到检测器表面上的光/辐射的功率、强度和/或能量的信号的装置。该信号通常将是电信号，例如电压、电流和/或电荷。检测器可以是光电二极管、光电晶体管、电荷耦合装置(CCD)。在一些情况下，检测器可以是半导体检测器，例如硅PIN光电二极管。检测器还可以是雪崩光电二极管、光电倍增管或者在光入射时产生电流、电压、电荷、电导率等的变化的任何其他装置。检测器可以包括单个元件、多个检测器元件，例如双单元或四单元、线性或二维阵列的检测器元件，包括基于摄像装置的检测器。
光束的“衍射极限”意指可以通过检测器区分的两个光源的最小间距。具有数值孔径NA并且在波长λ下工作的显微镜的阿贝衍射极限d被定义为d＝λ/(2·NA)。对显微镜的数值孔径的物理限制禁止非常大的数值孔径，并且因此显微镜的衍射极限强烈依赖于用于检测的工作波长，其中大波长对应于相对较差的分辨率，以及高波长对应于提高的精度。
“进行解调(demodulate)”或“解调(demodulation)”是指通常但不一定以特定频率从总体信号中提取信息承载信号。例如，在本申请中，在光电检测器处收集的所收集的探测光表示总体信号。解调处理挑选出被由样品吸收的红外光干扰的部分。解调可以通过锁定放大器、快速傅里叶变换(FFT)、期望频率下的离散傅里叶分量的计算、谐振放大器、窄带带通滤波器或极大地增强了感兴趣的信号同时对与调制不同步的背景信号和噪声信号进行抑制的任何其他技术来完成。
“解调器”是指执行解调的装置或系统。
“品质因数”是指信号或测量的相对质量的任何度量或指标。例如，品质因数可以是测量灵敏度、信号强度、噪声水平、信噪比、背景水平、信号背景比、这些的任何组合、或使得能够对信号和/或测量的相对质量进行分级的其他度量。
“聚焦光学器件”是指一个或更多个具有使光聚焦的能力的光学元件。聚焦光学器件可以包括一个或更多个折射透镜、曲面镜、衍射光学器件、菲涅耳透镜、体积全息图、超材料或其任何组合、或者能够使辐射聚焦的任何其他装置或部件。
“荧光”是指由于在一个波长处的激发而在另一波长处从样品发射光。荧光激发和发射过程是入射光的非弹性散射的形式，并且可以用于通过基于入射光的特定强度和光谱提供关于荧光发射类型的信息(发射的光子的数量和发射的光子的波长)来表征样品。
“照射(illuminate)”、“照亮(illuminating)”和“照明(illumination)”意指将辐射引导到对象处，例如样品的表面、探针尖端和/或探针-样品相互作用的区域。照射可以包括红外波长范围、可见光和从紫外到毫米或更长的其他波长中的辐射。照射可以包括辐射源、反射元件、聚焦元件和任何其他的光束控制元件或光束调节元件的任意配置。
“红外吸收光谱”是指与样品的红外吸收系数、吸光度或IR吸收性质的类似指示相关的与波长成比例的光谱。红外吸收光谱的示例是由傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)产生的吸收测量，即FTIR吸收光谱。通常，红外光将被吸收(即，红外吸收光谱的一部分)、透射(即，红外透射光谱的一部分)或反射。在与探测光源中的每个波长下的强度相比时，所收集的探测光的反射光谱或透射光谱可以在该波长下具有不同的强度。注意，IR测量通常被绘制为示出透射的光的量作为示出吸收的光的量的替代。出于该定义的目的，IR透射光谱和IR吸收光谱被视为等同的两个数据集，因为两个测量之间存在简单的关系。
“红外源”和“红外辐射源”是指在红外波长范围内、通常在2微米至25微米之间生成或发射辐射的一个或更多个光源。辐射源可以是以下大量源中的一种源，这些源包括热源或碳化硅棒光源、超连续谱激光源、频率梳、差频发生器、和频发生器、谐波发生器、光学参量振荡器(OPO)、光学参量发生器(OPG)、量子级联激光器(QCL)、带间腔激光器(ICL)、同步辐射红外辐射源、纳秒、皮秒、飞秒和阿秒激光系统、CO2激光器、显微加热器、电或化学生成的火花和/或产生红外辐射的发射的任何其他源。在优选实施方式中，源发射红外辐射，但是其还可以在其他波长范围(例如从紫外到THz)内进行发射。源可以是窄带的(例如光谱宽度<10cm-1或<1cm-1)或者可以是宽带的(例如光谱宽度>10cm-1、>100cm-1或大于500cm-1)。可以利用滤波器、单色仪和其他装置将宽带源制成窄带。红外源还可以由离散发射线之一组成，例如被调谐至目标物种的特定吸收带。
在与样品相互作用的上下文中的“相互作用”意指照射样品的光被样品、通过样品和/或从样品散射、折射、吸收、畸变、转向、衍射、透射和反射中的至少一种。
“锁定放大器”是(上面所定义的)“解调器”的一个示例，并且是以一个或更多个参考频率对系统的响应进行解调的装置、系统和/或算法。锁定放大器可以是包括模拟电子器件、数字电子器件以及两者的组合的电子组件。锁定放大器还可以是在数字电子装置如微处理器、现场可编程门阵列(FPGA)、数字信号处理器和个人计算机上实现的计算算法。锁定放大器可以产生指示振荡系统的的各种度量的信号，这些度量包括振幅、相位、同相(X)分量和正交(Y)分量或上面的任何组合。在该上下文中，锁定放大器还可以以参考频率、参考频率的高次谐波和/或参考频率的边带频率产生这样的测量。
在涉及入射到样品上的辐射的情况下的“进行调制”或“调制”是指周期性地改变某一位置处的红外激光强度。对光束强度进行调制可以通过光束的机械斩波、受控激光脉冲和/或使激光束偏转来实现，例如，通过利用用于使镜倾斜或变形的压电致动器或其他装置而被静电地、电磁驱动的倾斜镜或者高速旋转镜装置来使激光束偏转。调制还可以利用提供时变透射的装置如声光调制器、电光调制器、光弹性调制器、普克尔斯盒(pockelcell)等来实现。调制还可以利用衍射效应来实现，例如通过衍射的基于MEMS的调制器或者通过高速快门、衰减器或对入射到样品上的激光强度的强度、角度和/或相位进行改变的其他机制来实现。
“近红外光”通常是指对应于0.75μm至2μm的红外(IR)光的波长范围。
“窄带光源”是指具有窄带宽或窄线宽的光源，例如线宽小于8cm-1的光，但是通常其可以是线宽窄到足以使得线宽不覆盖样品的感兴趣的光谱范围的光源。
“光学性质”是指样品的光学性质，包括但不限于折射率、吸收系数、反射率、吸收率、折射率的实部和/或虚部、样品介电函数的实部和/或虚部和/或从这些光学性质中的一个或更多个中数学可推导的任何性质。
“光学响应”是指辐射与样品相互作用的结果。光学响应与上面所定义的一个或更多个光学性质有关。光学响应可以是辐射的吸收、温度升高、热膨胀、光诱导力、光的反射和/或散射或由于与照射辐射相互作用而引起的材料的其他响应。
“光热畸变”是指由于光能的吸收例如红外辐射的吸收而导致的样品性质的变化。光热畸变可以指折射率的变化、反射率的变化、热膨胀、表面畸变或可以用探测光束检测到的其他效应。
“探测源”、“探测光源”或“探测辐射源”是指可以用于感测样品的光学性质的辐射源。探测光源可以用于感测样品对来自红外光源的光的入射的响应。例如，辐射源可以包括气体激光器、激光二极管、超发光二极管(SLD)、近红外激光器、经由和频或差频生成而生成的UV和/或可见激光束。辐射源还可以包括可以聚焦至范围小于2.5微米和/或甚至小于1微米以及可能小于0.5微米的光斑的近红外、UV和/或可见光中的任何源或其他源。在一些实施方式中，探测光源可以在红外光源的调谐范围或发射范围之外的波长下工作，但是探测光源还可以是在实际上与红外光源的调谐范围交叠的选定波长下的固定波长源。“探测光束”或“感测光束”是最初从探测光源发出的光束。
“探测光束”是指被引导到样品上以检测由IR辐射与样品的相互作用而造成的光热畸变或其他光学变化(例如检测样品对IR辐射的吸收)的光束或辐射。
“拉曼”是指由于拉曼散射而在与激发波长不同的一个或更多个波长处从样品非弹性散射的光。“拉曼光谱学”是指测量拉曼散射光的光谱内容(拉曼光谱)，例如根据拉曼位移的拉曼散射光的强度。“拉曼光谱仪”是用于检查从样品收集的光中的拉曼位移并且产生拉曼光谱和/或拉曼图像的装置。
“延迟器”是指在光路中引起相对光学相位延迟的光学元件。延迟器的示例是波片，例如半波片、四分之一波片和八波片。一个或更多个延迟器/波片可以用于在光的两种偏振之间引入光学相位差，例如在正交干涉仪的两个路径之间引入相位差。
“指示……的信号”是指与感兴趣的性质在数学上相关的信号。信号可以是模拟信号、数字信号和/或存储在计算机或其他数字电子装置中的一个或更多个数字。信号可以是电压、电流或可以容易地进行转换和记录的任何其他信号。信号可以与被测量的性质在数学上相同，例如明确地绝对相位信号或吸收系数。信号还可以是与一个或更多个感兴趣的性质在数学上相关(例如包括线性或其他缩放、偏移、反演或更加复杂的数学操作)的信号。
“光谱”是指根据波长或者等效地(并且更常见地)根据波数的样品的一个或更多个性质的测量。
术语“大约”或“近似”等是同义词，并且用于指示由该术语修饰的值具有与其相关联的已知范围，其中，范围可以是±20％、±15％、±10％、±5％或±1％。
术语“基本上”用于指示结果(例如，测量值)接近于目标值，例如，其中接近可以意指结果在该值的80％以内、在该值的90％以内、在该值的95％以内或在该值的99％以内。
荧光增强的IR光谱学与同时共聚焦荧光成像
图1A示出了用于荧光增强的IR光谱学与同时共聚焦荧光成像的显微镜的简化示意图。红外源100发射指向二向色镜104或指向朝向聚焦光学器件106的其他光束组合器的红外(IR)辐射光束102。聚焦光学器件106可以是显微镜物镜106，例如施瓦茨希尔德(Schwarzschild)或相关设计的反射物镜。聚焦光学器件106还可以是离轴抛物面镜、折射物镜或能够聚焦IR光的任何其他光学组件。聚焦光学器件106在样品110上产生IR辐射的聚焦光斑或聚焦区域108。样品110可以可选地安装在样品基底111上。取决于实施方式，样品基底可以对IR光或UV/可见光中的至少一种光而言是可穿透的，或者在图1的实施方式中，样品基底还可以是反射的或不透光的。样品110可以包括一个或更多个生物样本，例如生物细胞、组织和/或有机体。在实施方式中，样品11包括使用一种或更多种荧光染料和/或标签进行荧光标记的区域。样品110可以可替选地包括自发荧光的区域，即在不添加人工荧光标记的情况下天然地发出荧光的区域。直接使用脉冲化/经调制的IR源或经由外部斩波器/调制器对IR光束102进行周期性地调制。在各种实施方式中，调制控制器101可以生成脉冲序列、正弦曲线或者用于对来自IR源100的IR光束102进行同步或选通的其他调制控制信号。
IR源100可以是可调谐的IR源或宽带IR源。在由IR源100发射的光束包含与样品内的吸收带对应的至少一个波长的情况下，样品的IR吸收区域将随着每个IR脉冲或者在每个IR调制周期内升温。探测光束用于通过检测样品中由于来自样品/样本的IR吸收区域的温度升高而导致的光热畸变来读出样品的IR吸收。具体地，UV/VIS源112发射包括比IR光束的波长短的至少一个波长的一个或更多个探测光束102。UV/VIS源112可以被配置成同时和/或顺序地在例如被选择用于激发样品/样本中的不同荧光团的多个UV波长和/或可见波长处进行发射。探测光束102从二向色镜114反射并且可选地被引导至聚焦光学器件106，即用于聚焦IR光束的同一显微镜物镜。可以替选地例如在反向传播几何结构中使用单独的聚焦光学器件(未示出)将探测光束从样品的其他侧引导到样品处。例如，在美国专利第10,677,722B2号中描述了这种反向传播方法，该美国专利的内容通过引用整体并入本文。如美国公开申请第US 2019-0120753 Al号中所描述的，还可以使用在样品的同一侧的替代聚焦光学器件将探测光束引导至样品，该美国专利的内容通过引用整体并入本文。
样品/样本的IR吸收区域可能由于IR吸收区域的局部升温而造成样品中的光热畸变。样品中的这些光热畸变可能导致探测光束在其与样品的红外吸收区域相互作用之后的强度、相位、角度分布或其他光学性质。通过在探测光已经与样品相互作用(例如从样品反射和/或散射和/或透射穿过样品)之后对探测光的至少一部分进行收集和检测，可以构建指示样品/样本被探测光照射的部分的IR吸收的信号。
由于探测光束具有比IR光束更短的波长，因此探测光束可以被聚焦到比对应的IR光斑尺寸108小得多的探测光束光斑116。与单独使用IR光束来测量IR吸收的情况相比，探测光束光斑116的较小尺寸导致更好的IR吸收的空间分辨率。在实践中，与利用在中-IR中工作的传统红外显微镜将实现的分辨率相比，使用UV或可见探测光束可以实现空间分辨率的至少一个数量级的提高。例如，在相同数值孔径聚焦光学器件的情况下，使用633nm的探测光束将实现比6.33μm的中-IR波长好10倍的空间分辨率。使用较短的可见波长(如532nm或488nm)或UV波长(如405nm或355nm)甚至可以实现更高的空间分辨率益处。
然而，图1A中所示出的实施方式为通过荧光定位进一步提高空间分辨率提供了附加益处。从样品收集的探测光115可以包含多个波长，例如原始探测激发波长处的光(通过粗箭头指示)，并且还包括由于样品荧光或由于拉曼散射而导致的波长偏移光。波长偏移光通过虚线箭头指示。可更换的阻挡滤波器118被放置在光束路径中以阻挡原始激发波长处的探测光束，使波长偏移光的至少一部分通过。
光热IR吸收测量的荧光定位
图1B中示出了使用阻挡滤波器118的益处。图1B示出了包括样品(sample)110、样本(specimen)111、IR光束108和探测光束116的图1A的区域的放大图。考虑具有已经用不同荧光团标记的不同内部成分(例如细胞器)的样本111(例如生物细胞)。这些不同荧光团由荧光标记体150和荧光标记体152示意性地指示，其中阴影的差异指示用于标识不同体的荧光团的差异。从这些体150和体152发射的光将包括(由黑色箭头指示的)原始探测光束波长下的探测光和由较浅虚线箭头指示的波长偏移光两者。如果将探测光束波长选择为与荧光团标记体150的激发波长对应，但是不与荧光团标记体152的激发波长对应(或者如果体152未被标记)，则荧光将基本上仅从体150发射。在从样品110收集探测光的情况下，探测光将包含从样本的被探测光束116照射的体积所反射/散射/发射的光，并且因此使用来自该区域的未经滤波的探测光束执行的任何IR吸收测量将是探测光束的聚焦体积中的所有对象的IR吸收的混合。所以如果使用未经滤波的探测光束来生成指示探测光束照射光斑116的IR吸收的信号，则得到的IR吸收测量将是体150和体152以及任何周围的细胞壁和细胞介质的IR吸收的叠加。
然而，阻挡滤波器118的包括提供了光热测量的空间分辨率的显著提高，因为阻挡滤波器118将仅允许波长偏移的荧光119通过。因此，在图1B的示例中，滤波器118将仅通过从体150发射的荧光。但是从体150发射/收集的荧光仍然还包含来自体150的IR吸收的印记。即，体150的周期性IR吸收将导致从体150发射的荧光的强度、角度分布和/或相位的对应周期性变化。因此，通过对所收集的荧光的周期性变化进行分析，可以在甚至小于聚焦探测光束116的尺寸的长度范围上执行IR吸收测量。
也就是说，图1A和图1B中所示出的系统的益处是该系统利用分辨率比先前可能的分辨率更精确的荧光检测系统的化学化合物表征来实现OPTIR系统的空间分辨率。
一种或更多种机制可能导致荧光波长偏移光中存在光热信号。首先，来自IR吸收的升温可能引起IR吸收对象的物理尺寸的小变化以及折射率的偏移，从而改变了从荧光对象散射的光的强度和/或角度分布。
荧光染料的发射效率可能具有较大的温度依赖性
此外，生命科学中常用的荧光染料的量子产率还具有温度依赖性，并且可以随着红外引起的升温在所测量的荧光强度中生成较大变化。例如，参见Liu等人在《应用和环境微生物学》(Applied and Environmental Microbiology)，2005年10月，第6453页至第6457页(doi:10.1128/AEM.71.10.6453-6457.2005)中发表的“Emission Characteristics ofFluorescent Labels with Respect to Temperature Changes and Subsequent Effectson DNA Microchip Studies”和C.Paviolo等人在《显微技术期刊》(Journal ofMicroscopt)，2013年3月22日(https://doi.org/10.1111/jmi.12033)中发表的“Temperature measurement in the microscopic regime:a comparison betweenfluorescence lifetime-and intensity-based methods”以及Kuzkova等人在《国际生物医学成像杂志》(International Journal of Biomedical Imaging)，2014年11月(https://doi.org/10.1155/2014/243564)中发表的“Application of Temperature-Dependent Fluorescent Dyes to the Measurement of Millimeter Wave Absorptionin Water Applied to Biomedical Experiments”。作为附录A并入本文的Liu的出版物和Kuzkova的出版物两者示出了特定荧光染料可能在发射效率方面具有非常大的温度依赖性。例如，两份出版物示出了若丹明红在室温附近的10℃温度变化的情况下具有大致10％的发射效率的变化。这大致与大约0.01/℃的强度的百分数变化对应。针对随着温度的热膨胀和折射率的变化，该因子比大约10-4/℃的传统光热变化高约两个数量级。在实施方式中，与单独的光热测量相比，荧光增强的OPTIR可以提供约100倍的灵敏度提高。还可以通过围绕室温或体温设计染料的转变温度来对荧光染料进行设计以增强这种效应。在组织的自发荧光发射中还观察到显著的温度效应。例如，参见范德比尔特大学(VanderbiltUniversity)的丹尼尔·巴顿(Daniel Barton)硕士的硕士论文“Variation OfFluorescence With Temperature In Human Tissue”，2010年5月，该硕士论文也被包括在附录A中。
同时分辨率增强的IR和荧光成像
返回参照图1A和图1B，然后以两种不同的方式对通过阻挡滤波器118到达检测器124的所收集的荧光进行分析以提供荧光和IR吸收的同时和并置测量。来自检测器124的信号被发送到第一路径126上，在第一路径126上该信号由解调器128进行解调以产生指示所收集的荧光的AC调制的信号130。在一个实施方式中，例如，解调器128可以是锁定放大器，并且AC信号130可以是幅度信号、相位信号、同相信号或正交信号，或者是荧光的AC调制的任何同步测量结果。例如，使用来自调制器101的参考信号130，可以与IR光束102的调制同步地执行荧光信号的AC调制的高灵敏度测量。
荧光的这种AC调制是由于IR光的吸收导致的荧光发射的变化。因此，该AC调制是指示从其收集荧光的样品区域的IR吸收量的信号。通过对根据IR光束102的波数的指示IR吸收的信号进行测量，可以创建IR吸收光谱132，其可以用于在化学上表征样品中的化学成分。通过绘制根据样品上的位置的指示IR吸收的信号，可以创建IR化学图/图像133，其示出了在一个或更多个IR吸收带处(即，在IR光束的一个或更多个波数下)进行吸收的化学物种的分布和相对密度。荧光发射中IR引起的调制的解调可以利用其他同步方法和异步方法来实现，所述同步方法和异步方法包括如具有整流的高通/陷波滤波器、RMS到DC转换器、谐振放大器的技术或用于产生指示从样品的IR吸收和荧光发射区域收集的荧光的调制的信号的其他技术。该经解调的信号又将指示样品的既(1)吸收IR辐射又(2)发射荧光的区域的IR吸收。该组合向IR吸收测量提供极大的特异性和定位性以及相对信号强度的显著增强。可以通过测量根据IR光束102的波长的所检测的荧光辐射的AC调制(例如通过对IR源100的中心波长进行调谐)来创建荧光增强的IR吸收光谱132。或者，如果IR源是宽带IR源例如超连续光谱激光器或热IR源，则可以使用干涉技术(例如，傅里叶变换红外(FTIR)光谱仪中所使用的干涉技术)来获得IR光谱。
来自检测器124的信号也被发送到平行路径134上，该平行路径134用于对在一个或更多个荧光发射带上的荧光发射强度进行测量。例如，可以通过低通滤波器136或其他用于产生指示从样品的被探测光束照射的区域收集的时间平均荧光的“DC”信号的滤波技术可选地对来自光电检测器124的信号进行滤波。通过绘制根据样品上的位置的该DC荧光信号，可以制作样品的荧光标签和/或自发荧光区域的分布的图或图像140。可以利用多个激发波长和/或发射波长来执行DC荧光强度的测量，以产生示出例如不同荧光团的分布从而对例如生物样本中的不同结构元素的分布进行绘制的叠加荧光图像。
荧光图像140可以具有与IR化学图像133的基本类似性，因为两者都可以绘制不同化学物种的分布。但是对比机制是不同的——荧光图像对样品的被给定激发刺激的区域中的荧光标签或自发荧光的相对浓度进行绘制，而IR图像对样品的荧光区域在给定波数下的红外吸收的强度进行绘制。注意，还可以将滤波器118从收集光束路径移除以制作也将包括来自非荧光区域的信号的IR吸收图像/光谱。还可以例如使用脉冲化UV/VIS源来执行荧光的时间相关的测量，例如用于荧光寿命测量或时间相关的漂白测量等。在这种情况下，荧光信号不是“DC”信号，而将与UV/VIS光源的脉冲同步地被解调。IR源和UV/VIS源可以以不同的频率被调制以提供关于荧光强度变化源的清楚分离。例如，可以以IR源调制的整数倍对UV/VIS源调制进行设置，或者可以以UV/VIS源调制的整数倍对IR源调制进行设置。可替选地，可以在基本不同的频率范围内执行所述两种调制，例如在100kHz范围内对IR源进行调制，以及在几十MHz范围内对UV/VIS源进行调制。
可以通过对多个样品位置处的荧光信号和IR吸收信号进行测量来制作根据样品位置的荧光强度图像140和IR吸收图像133，例如通过移动静止的IR光束和UV/VIS光束下方的样品和/或通过扫描静止样品上的至少UV/VIS光束的位置或通过其组合来进行制作。例如，UV/VIS光束的扫描可以使用激光扫描共聚焦显微镜中常见的检流计扫描仪或者甚至旋转圆盘共聚焦扫描仪来完成。
阻挡滤波器118可以是荧光发射滤波器、带通滤波器和边缘滤波器、与狭缝组合的衍射光栅、声光可调谐滤波器或被配置成基本上阻挡探测光束的原始激发波长的至少大部分同时使波长偏移光的至少一部分通过的任何其他无源或有源光学元件。在荧光的情况下，例如，荧光的波长将被偏移成更长的波长，因此可以使用长通滤波器或覆盖比探测光束更高波长范围的带通滤波器。可以将可更换的阻挡滤波器选择成最佳地通过由特定目标荧光团发射的光，或者选择成最佳地通过特定范围的自发荧光。可以容易地更换阻挡滤波器以选择与样本的荧光标记中所使用的不同荧光团相对应的不同波长范围。例如，多个阻挡滤波器118和118a可以被放置在滤波器更换器121中以提供不同荧光团的测量之间的简单交换。例如，滤波器更换器121可以是滤波器滑道、滤波器轮、转盘或使得能够随时更换阻挡滤波器的任何其他机构。可以期望使滤波器更换器121中的一个槽保持打开，使得可以根据先前的OPTIR仪器对未衰减的探测光进行测量。如果需要，还可以同时使用多个二向色/阻挡滤波器和多个检测器来同时记录来自多个荧光染料的荧光响应(见图5)。
还可以在时域中确定荧光发射中的IR引起的调制的测量，例如在IR光束打开的情况下与IR光束关闭的情况下测量检测器124处的荧光强度。在这种情况下，IR打开相对IR关闭的差信号将是指示样品的IR吸收的信号。还可以简单地测量根据IR光束波长的DC荧光强度，因为将存在根据与每个波长下的IR吸收量相关联的样品温度而产生的荧光强度的DC变化。
当对探测光束进行脉冲化、选通、斩波或以其他方式进行调制时，时域中的测量可以是特别有用的。例如，这可以是可期望的以对潜在的荧光团漂白进行限制。在这种情况下，可以期望使探测光束脉冲化，使得探测光束仅在接近来自IR源的脉冲定时的短暂时间段内撞击样品。例如，可以期望使探测光束脉冲化为刚好在IR脉冲结束处开始，或者与IR脉冲开启的时间的一部分交叠。
图2示出了使用反向传播几何结构的荧光增强的光热红外光谱学的实施方式的简化示意图。图2基于图1A和图1B，并且当使用相同的附图标记时，与图1A和图1B相关联的描述适当地适用。然而，在图2中，IR光束102和探测光束113从样品110的相反侧入射(即，IR光束102和探测光束113是“反向传播”)。
在图2所示的实施方式中，IR光束102从IR源100发射，并且可选地从镜或二向色镜200反射，在镜或二向色镜200处然后通过聚焦光学器件202被聚焦到样品110上。在这种情况下，聚焦光学器件202可以被选择成优化以聚焦IR光，而聚焦光学器件106可以被优化用于对可见光并且具体地UV/VIS源112的波长和从样品110/样本111得到的荧光发射进行聚焦/收集/成像。例如，聚焦光学器件202可以是施瓦茨希尔德或类似设计的反射物镜、离轴抛物面镜、由IR可穿透材料制成的折射物镜或能够聚焦IR光的任何类似光学器件。聚焦光学器件204用于聚焦和收集包括入射探测光113的UV/可见光以及来自样品的任何荧光发射。聚焦光学器件204可以是高质量、高数值孔径折射物镜，例如通常用于荧光显微术的折射物镜。特别地，聚焦光学器件204可以被选择成在与荧光激发波长和荧光发射波长对应的波长下具有良好的性能，并且因此可以包括UV透射(在折射物镜的情况下)或UV反射(在反射物镜的情况下)的光学部件。在该配置中，如果采用样品基底111，则可以期望选择具有高IR透射率的材料，尽管由于在反向散射配置中收集荧光发射，基底不需要对UV/可见光是可透射的。光学器件200可以是简单的固定镜、可调节镜、电子可控镜(如检流计或快速转向镜)以提供可见光与IR光束的焦点之间的交叠的相对调节。另外地或可替选地，光学器件200可以是二向色镜以允许来自样品下方的可见光照射，即，对IR光是反射的，并且对至少期望范围的可见光是透射的。
图3示出了使用反向传播几何结构和透射检测的荧光增强的光热红外光谱学的实施方式的简化示意图。图3基于图1至图2，并且当使用相同的附图标记时，与图1至图2相关联的描述适当地适用。除了荧光发射和荧光增强的IR吸收的检测是在探测光已经通过样品110/样本111之后执行的之外，图3与图1A、图1B和图2类似。在样品或样本对可见光具有较低反射率的情况下和/或在前向散射路径对于荧光收集更有效的情况下，这种布置可以是期望的。在所示实施方式中，二向色镜300被选择为对IR波长是反射的并且对于与样品的荧光发射相对应的波长是透射的，并且可选地对探测光束也是透射的。二向色镜300还可以被选择为对探测光束源的激发波长是反射的或吸收的，从而消除了对阻挡滤波器118的需要。在这种情况下，聚焦光学器件204可以被优化用于UV/可见光的聚焦，并且聚焦光学器件106既用于聚焦IR光还用于收集来自样品110的荧光发射。
图2至图3所示的实施方式具有来自样品下方的IR光和来自样品上方的UV/VIS探测光、类似于其中折射显微镜物镜放置在样品上方的传统直立光学显微镜的配置。该配置可以容易地被反转，使得UV/VIS光来自样品下方，并且IR光来自样品上方。图4示出了这样的反转配置，该反转配置然后可以与细胞生物学和其他生物学研究中通常采用的常规反转光学显微镜的设置兼容。图4基于图1至图3，并且当使用相同的附图标记时，与图1至图3相关联的描述适当地适用。在图4的实施方式中，来自IR源100的IR光102从样品上方经由聚焦光学器件202传送至样品110，而UV/可见光113从样品下方经由聚焦光学器件204传送至样品。
出于一些原因，该布置是有利的。首先，样品基底111不需要是IR可穿透的，并且事实上可以是如细胞生物学中通常使用的常规的载玻片、盖玻片或培养皿。然而，样品基底111应当对UV/VIS源112的感兴趣的波长以及样品的感兴趣的任何荧光发射波长是透射的。还可以在样品在流体(例如水缓冲溶液)下的情况下执行荧光增强的光热IR光谱学的测量。这可以通过在其间具有薄层液体402的样品110和样品基底111的顶部使用薄IR可穿透覆盖玻璃400来实现。还可以支持较大厚度的液体，例如通过将样本粘附至覆盖玻璃400的底部，从而消除使IR光透射通过液体的需要，并且避免任何与IR吸收相关联的损失。还可以将样品/样本安装在密封的流体细胞中来防止液体蒸发和/或灌流细胞中以使得能够更换流体/营养物质等。
图5示出了采用同时或顺序的多线荧光和荧光增强的光热IR测量的实施方式。图5基于图1，并且当使用相同的附图标记时，与图1相关联的描述适当地适用。在图5中，UV/VIS源112包括多个UV/VIS源500、502、504，所述多个UV/VIS源在与感兴趣的荧光标签和/或固有自发荧光的不同激发波长相对应的不同中心波长λ1、λ2和λ3等下进行发射。可替选地，UV/VIS源可以是在波长范围内发射光的超连续谱激光器，并且可以与包括可变的可调谐滤波器的一个或更多个窄带滤波器组合。在所示分立UV/VIS源的情况下，可以使用二向色镜506和二向色镜508将来自源500、502、504的光束组合到同一光路上(元件510可以是简单的镜)。注意，分立UV/VIS源还可以远离显微镜系统并光纤耦接到显微镜中，在这种情况下，二向色镜506和二向色镜508对来自光纤的输出而不是直接来自如激光二极管的光生成源的光束进行组合。可以可选地将组合的UV/VIS光束引导至光束调节/扫描单元512，在光束调节/扫描单元512中可以根据需要对光束进行扩展、滤波和/或衰减。单元512还可以包含光学机构以提供光束扫描，例如一个或更多个检流计扫描仪、扫描透镜等。UV/VIS源112还可以包括快门和/或翻转镜以允许/禁止来自各个UV源500、502、504中的一个或更多个UV源的发射离开集成UV/VIS光源112。
在一个或更多个UV/VIS光束离开光束调节/扫描单元512之后，除了可以一次在多于一个的波长下对样品进行激发之外，该设备以如图1中所描述的类似的方式工作。进而，荧光发射可以在多个不同波长上发生。为适应此，提供了多个检测器514、516和518与适当的二向色滤波器520和522以使期望波长范围的荧光转向检测器516和检测器518、以及可选的阻挡滤波器524以进一步对通过滤波器520、滤波器522的不在检测器514处的测量感兴趣的范围内的任何光进行滤波。如果期望，则二向色滤波器520和二向色滤波器522以及阻挡滤波器524可以是可互换的和/或可调谐的以适应来自不同荧光染料的荧光。与图1A和图1B一样，来自检测器514、516和518的输出在两条平行路径上行进，在一种情况下，如上面所描述的，在到解调器的路径上行进以提取指示IR吸收的AC信号，并且在替选路径上行进以用于荧光检测。这种布置使得能够在多个激发波长和发射波长处同时或顺序地对荧光和荧光增强的光热IR信号进行测量。注意，虽然在三个激发/发射波长下示出了三个发射波长，但是该设备可以适于适应所期望的多个同时激发/发射波长。
其他形式的非弹性光散射
本文所描述的技术还可以应用于其他形式的非弹性光散射，即，产生波长偏移光子的任何其他技术，例如拉曼散射、布里渊散射和康普顿散射，在这些散射中，对于散射效率存在温度依赖性。例如，已知某些拉曼波段的中心频率是高度温度敏感的。通过对响应于样品的IR照射的特定拉曼波段的强度变化进行测量，可以测量位于样品中负责拉曼散射光发射的区域的IR光谱。
超分辨率
存在基于荧光的各种超分辨率光学技术。这些超分辨率光学技术又可以用于提供超分辨率IR吸收测量，因为提高荧光检测的空间分辨率的任何超分辨率技术还可以提高从荧光测量得到的IR吸收测量的空间分辨率。例如，多光子技术、结构化照射、空间图案化照射、受激发射损耗显微术以及相关技术可以与本文所描述的设备结合以进一步提高空间分辨率。
本文所描述的实施方式是示例性的。可以对这些实施方式进行修改、重新布置、替代处理、替选元件等，并且仍然包括在本文所阐述的教导内。本文所描述的步骤、处理或方法中的一个或更多个步骤、处理或方法可以由一个或更多个适当编程的处理装置和/或数字装置执行。
宽视场测量
检测器124还可以是阵列检测器，例如线性阵列、2D阵列或者甚至基于宽视场摄像装置的检测器。在这种情况下，可以一次在样品上的多个位置处同时对荧光发射的IR引起的变化的检测进行测量。这样的测量可以使用时域测量(例如，对在IR光束打开与关闭的情况下测量的荧光的摄像装置帧进行相减)和/或利用锁定摄像装置来执行。在宽视场测量的情况下，可以期望使用非相干探测光束源例如发光二极管、卤素灯或其他非相干源来避免相干伪影。
在实施方式中，如上面所描述的操作系统的方法可以用于从样品获得非弹性光散射的测量和光热红外测量。
在一个实施方式中，这样的方法可以包括用红外光束照射样品以产生样品的红外照射区域。该方法还可以包括至少部分地与样品的红外照射区域交叠地在交叠区域处用探测光束单独地照射样品。激发波长下的光经由荧光效应激发来自样品的非弹性散射，荧光效应可以是自发荧光或预先已经对样品进行标记的结果。所使用的探测光束可以是具有比红外光的激发波长短的激发波长的光束，并且如上面所更详细描述的，激发波长引起激发和来自样品的非弹性光散射。
该方法还可以包括使用合适的检测器对从样品的交叠区域(即，样品被红外光束和探测光束两者照射的区域)发射的非弹性散射光进行检测。
然后，该方法可以包括响应于样品的红外吸收来确定已经接收到的所检测到的非弹性散射光的调制的量。然后，可以使用该调制的量来检测非弹性散射光以产生指示样品的红外吸收的信号。
取决于实施方式，本文所描述的方法步骤中的任何方法步骤的特定动作、事件或功能可以以不同的顺序执行，可以对其进行添加、合并或完全省略(例如，针对算法的实践并非所有描述的动作或事件都是必需的)。此外，在某些实施方式中，可以同时执行而不是顺序地执行本文所描述的动作或事件。
可以将结合本文所公开的实施方式所描述的各种说明性逻辑块、光学元件和控制元件以及方法步骤实现为电子硬件、计算机软件或两者的组合。为了清楚地说明硬件和软件的这种可互换性，上面已经总体上就其功能而言描述了各种说明性部件、块、模块和步骤。这样的功能是实现为硬件还是软件取决于施加在整个系统上的设计约束和特定应用。可以针对每个特定应用以不同的方式来实现所描述的功能，但是这样的实现决定不应被解释为导致脱离本公开内容的范围。
结合本文所公开的实施方式描述的各种说明性逻辑块和模块可以由机器例如配置有特定指令的处理器、数字信号处理器(DSP)、专用集成电路(ASIC)、现场可编程门阵列(FPGA)或其他可编程逻辑装置、分立门或晶体管逻辑、分立硬件部件或被设计为执行本文所描述的功能的其任何组合实现或执行。处理器可以是微处理器，但是在替选方案中，处理器可以是控制器、微控制器或状态机、其组合等。还可以将处理器实现为计算装置的组合，例如，DSP和微处理器的组合、多个微处理器、与DSP核结合的一个或更多个微处理器或任何其他这样的配置。
结合本文所公开的实施方式描述的方法、处理或算法的元素可以直接包含在硬件中、由处理器执行的软件模块中或两者的组合中。软件模块可以驻留在RAM存储器、闪存、ROM存储器、EPROM存储器、EEPROM存储器、寄存器、硬盘、可移动磁盘、CD-ROM或本领域已知的任何其他形式的计算机可读存储介质中。示例性存储介质可以耦接至处理器，使得处理器可以从存储介质读取信息，并且可以向存储介质写入信息。在替选方案中，存储介质可以是处理器的一部分。处理器和存储介质可以驻留在ASIC中。软件模块可以包括使得硬件处理器执行计算机可执行指令的计算机可执行指令。
本文所使用的条件语言，例如“能够”、“可能”、“可以”、“例如”等，除非另有特别说明，或者在所使用的上下文中以其他方式理解，否则通常旨在传达特定实施方式包括某些特征、元素和/或状态而其他实施方式不包括某些特征、元素和/或状态。因此，这样的条件语言通常并非旨在暗示对于一个或更多个实施方式而言以任何方式需要特征、元素和/或状态，或者一个或更多个实施方式必须包括用于在具有或没有作者输入或提示的情况下决定这些特征、元素或状态是否被包括在任何特定实施方式或者要在任何特定实施方式中执行的逻辑。术语“包括”、“包含”、“具有”、“涉及”等是同义词并且以开放式方式包括性地使用，并且不排除附加元素、特征、行为、操作等。此外，术语“或”以其包括性含义使用(而不是以其排他性含义使用)，使得例如当使用术语“或”来连接元素列表时，其意指列表中的元素中的一个、一些或全部。
除非另有明确说明，否则析取语言例如短语“X、Y或Z中的至少一个”在上下文中被理解为通常用于表示项目、术语等可以是X、Y、Z或其任何组合(例如，X、Y和/或Z)。因此，这样的析取语言通常并非旨在并且不应暗示特定实施方式要求X中的至少一个、Y中的至少一个或Z中的至少一个均存在。
除非另有明确说明，否则冠词例如“一”或“一个”通常应解释为包括一个或更多个所描述的项目。因此，短语例如“被配置成……的装置”旨在包括一个或更多个叙述的装置。这样的一个或更多个叙述的装置还可以被共同配置成执行所述的叙述。例如，“被配置成执行叙述A、B和C的处理器”可以包括被配置成执行叙述A的第一处理器与被配置成执行叙述B和C的第二处理器协同工作。
对通过引用上面文献的任何并入进行限制，使得不并入与本文明确的公开内容相反的主题。对通过引用上述文献的任何并入进一步进行限制，使得文献中包括的权利要求书不通过引用并入本文。对通过引用上述文献的任何并入再进一步进行限制，使得除非本文明确地包括，否则文献中所提供的任何定义不通过引用并入本文。
出于解释权利要求的目的，除非权利要求中叙述了特定术语“用于……的装置”或“用于……的步骤”，否则明确地旨在不援引35U.S.C第112节、第6段的规定。
虽然上面的具体实施方式已经示出、描述并指出了应用于说明性实施方式的新颖特征，但是将理解，在不脱离本公开内容的精神的情况下，可以对所示出的装置或方法的形式和细节进行各种省略、替换和改变。如将认识到的，因为一些特征可以与其他特征分开使用或实践，所以本文所描述的某些实施方式可以在不提供本文所阐述的所有特征和益处的形式内体现。落入权利要求书的等效含义和范围内的所有改变应包括在其范围内。
Claims (28)
1.一种从样品获得荧光测量和光热红外测量以表征所述样品的化学成分的方法，所述方法包括：
(a)用红外光束照射所述样品以产生所述样品的红外照射区域；
(b)至少部分地与所述样品的所述红外照射区域交叠地用探测光束照射所述样品的区域，其中，所述探测光束包括比所述红外光短的激发波长；
(c)对由所述探测光束与所述样品相互作用引起的包括来自所述样品的探测光束照射区域的荧光发射的光进行收集；
(d)对所收集的光进行滤波以基本上阻挡在所述激发波长处的光，并且至少部分地透射来自所述样品的所述探测光束照射区域的所述荧光发射；
(e)在检测器处对来自所述样品的所述探测光束照射区域的荧光发射进行检测；
(f)响应于所述样品的红外吸收来确定所检测到的荧光发射的调制的量；以及
(g)使用所检测到的荧光发射的调制的量来产生指示所述样品的IR吸收的信号，其中，所述指示IR吸收的信号基于所述样品的化学成分。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述红外源是能够在多个红外波长处发射红外光的宽带源。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述红外源能够被调谐成在多个红外波长处发射红外光。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述确定所检测到的荧光的调制的量包括锁定放大器、陷波滤波器、RMS到DC转换器和谐振放大器中的至少一个。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，用一个或更多个荧光标签对所述样品进行标记。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述样品包括在所述探测光束的照射下自发荧光的至少一种成分。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，通过测量有所述IR光束照射所述样品的情况与没有所述IR光束照射所述样品的另一情况之间的所检测到的荧光的量的差来确定所检测到的荧光的调制的量。
8.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述样品包括生物细胞、生物组织和生物有机体中的至少一种。
9.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，用小于1微米的空间分辨率对所述指示红外辐射的吸收的信号进行测量。
10.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所检测到的荧光的调制具有每摄氏度至少0.1％、或更优选地每摄氏度至少0.5％、或甚至更优选地每摄氏度至少1％的百分数变化。
11.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所检测到的荧光的调制具有增强的灵敏度，所述增强的灵敏度是在不使用与荧光对应的数据的情况下实现常规光热光谱学的系统的灵敏度的至少10倍高。
12.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，还包括创建所述样品的区域的IR吸收图和荧光发射图的步骤。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，基本上同时获得IR吸收图和荧光发射图。
14.根据权利要求1所述的方法，还包括以下步骤：在多个红外波长处对所述指示IR吸收的信号进行测量以产生指示所述样品的区域的红外吸收光谱的信号。
15.一种从样品获得荧光测量和光热红外测量以表征所述样品的化学成分的方法，所述方法包括：
(a)用经调制的红外光的光束照射所述样品以产生所述样品的红外照射区域；
(b)至少部分地与所述样品的所述红外照射区域交叠地用探测光束照射所述样品，其中，所述探测光束包括比所述红外光短的激发波长，并且其中，在所述激发波长处的光激发所述样品中的荧光发射；
(c)对从所述样品的被所述红外光束和所述探测光束两者照射的区域发射的荧光进行检测；
(d)与所述经调制的红外光的光束的周期同步地对所检测到的荧光的变化进行解调；
(e)使用经解调的变化来产生指示所述样品的IR吸收的信号。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述红外源是能够在多个红外波长处发射红外光的宽带源。
17.根据权利要求15所述的方法，其中，所述红外源能够被调谐成在多个红外波长处发射红外光。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中，所述确定所检测到的荧光的调制的量包括锁定放大器、陷波滤波器、RMS到DC转换器和谐振放大器中的至少一个。
19.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中，用一个或更多个荧光标签对所述样品进行标记。
20.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中，所述样品包括在所述探测光束的照射下自发荧光的至少一种成分。
21.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中，通过测量有所述IR光束照射所述样品的情况与没有所述IR光束照射所述样品的另一情况之间的所检测到的荧光的量的差来确定所检测到的荧光的调制的量。
22.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中，所述样品包括生物细胞、生物组织和生物有机体中的至少一种。
23.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中，用小于1微米的空间分辨率对所述指示红外辐射的吸收的信号进行测量。
24.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中，所检测到的荧光的调制具有每摄氏度至少0.1％、或更优选地每摄氏度至少0.5％、或甚至更优选地每摄氏度至少1％的百分数变化。
25.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中，所检测到的荧光的调制具有增强的灵敏度，所述增强的灵敏度是在不使用与荧光对应的数据的情况下实现常规光热光谱学的系统的灵敏度的至少10倍高。
26.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，还包括创建所述样品的区域的IR吸收图和荧光发射图的步骤。
27.根据权利要求25所述的方法，其中，基本上同时获得IR吸收图和荧光发射图。
28.根据权利要求26所述的方法，还包括以下步骤：在多个红外波长处对所述指示IR吸收的信号进行测量以产生指示所述样品的区域的红外吸收光谱的信号。
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