ES2199172T3 - Compensacion de color para ganancias electronicas y de temperatura. - Google Patents

Compensacion de color para ganancias electronicas y de temperatura.

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ES2199172T3 ES00953997T ES00953997T ES2199172T3 ES 2199172 T3 ES2199172 T3 ES 2199172T3 ES 00953997 T ES00953997 T ES 00953997T ES 00953997 T ES00953997 T ES 00953997T ES 2199172 T3 ES2199172 T3 ES 2199172T3
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Abstract

Método para la determinación de la presencia de, por lo menos, dos analitos en una muestra, que comprende: proporcionar por lo menos dos entidades detectoras, comprendiendo cada una de ellas un marcaje fluorescente distinto del marcaje fluorescente de cualquiera de las otras entidades detectoras, y siendo capaz cada una de dichas entidades de unirse específicamente con sus respectivos analitos, contactar la muestra con las entidades detectoras para permitir la unión específica de los analitos y de las entidades detectoras, excitar cada una de dichas entidades marcadas con luz de una longitud de onda apropiada para inducir fluorescencia, determinar los valores de fluorescencia de las entidades marcadas en por lo menos dos canales espectrales distintos a través de un intervalo térmico, y compensar dichos valores para el solapamiento espectral, en el que la etapa de compensación incluye la corrección de la dependencia de la temperatura de los valores de la fluorescencia.

Description

Compensación de color para ganancias electrónicas y de temperatura.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un método para el análisis simultáneo, por lo menos, de dos analitos, utilizando como mínimo dos entidades detectoras fluorescentes. Más particularmente, la presente invención se refiere a la utilización de sondas de hibridación marcadas fluorescentemente para identificar los genotipos en más de un locus de un ácido nucleico corrigiendo el solapamiento espectral dependiente de la temperatura de las sondas fluorescentes.
Antecedentes y resumen de la invención
El continuo descubrimiento de nuevos genes proporciona recursos de material genético para estudiar la asociación entre genotipo y enfermedad. Véase Kononen, J., y otros, (1998) Nat. Med. 4, páginas 844-847. La mayoría de las enfermedades genéticas se deben a alteraciones únicas de las bases que pueden encontrarse en múltiples lugares en el interior de uno o varios genes. Véase Cooper, D.N., y Krawczak, M. (1990) Hum. Genet. 85, páginas 55-74; Neufeld, E.J. (1998) Hematol. Oncol. Clin. North Am. 12, páginas 1193-1209. Por esta razón, las técnicas para el análisis de los ácidos nucleicos requieren a menudo el análisis de múltiples loci y variantes secuenciales. Por conveniencia, es preferible llevar a cabo este análisis en una reacción única.
Distintos colorantes fluorescentes coloreados se utilizan frecuentemente para aumentar la cantidad de información obtenida a partir de una muestra de ácido nucleico. Mansfield, E.S., y otros (1997) J.Chromatogr. A. 781, páginas 295-305; Samiotaki, M., y otros (1997) Anal. Biochem. 253, páginas 156-161. Estos colorantes pueden unirse a iniciadores o sondas, y los productos pueden ser analizados durante la amplificación PCR o mediante métodos de detección posteriores a la amplificación. Pritham, G.H., y Wittwer, C.T. (1998), J. Clin. Lig. Assay, 21, páginas 1-9. Aunque el análisis después de la amplificación aumenta el tiempo del ensayo, dicho análisis proporciona un segundo nivel de investigación que multiplica la potencia del ensayo. Por ejemplo, la detección fluorescente multicolor en combinación con la clasificación por el tamaño del producto ha tenido éxito para tipificar (o "tipar") la identidad utilizando repeticiones cortas en tándem, el tipado genotípico de cambios únicos de las bases mediante minisecuenciación, el tipado genotípico mediante cebado competitivo. Mansfield, E.S., y otros (1997) J. Chromatogr. 781, páginas 295-305; Pritham, G.H., y Wittwer, C.T. (1998) J. Clin. Lig. Assay, 21, páginas 1-9; Pastinen, T y otros, (1996) Clin. Chem. 42, páginas 1391-1397.
Las sondas de hibridación proporcionan un sistema elegante para la amplificación PCR homogénea y el tipado genotípico. Véase Lay, M.J., y Wittwer, C.T. (1997) Clin. Chem. 43, páginas 2262-2267; Bernard, P.S., y otros (1998) Anal. Biochem. 255, páginas 101-107; Bernard, P. S., y otros (1998) Am. J. Pathol. 153, páginas 1055-1061. En un sistema de este tipo, se utilizan dos sondas oligonucleótidas que hibridizan a regiones adyacentes de una secuencia de ADN, en el que cada sonda oligonucleótida se marca con un miembro respectivo de un par de transferencia energética fluorescente. En este sistema, un colorante fluorescente donante es excitado y transfiere energía a un colorante fluorescente aceptante si ambos colorantes están muy próximos, como lo estarían cuando se hibridizarán a regiones adyacentes de la secuencia del ADN. El análisis después de la amplificación de la curva de fusión permite identificar por lo menos a dos alelos utilizando estas sondas de hibridación de par único. Esto se debe a que variaciones en las secuencias de ADN crean desemparejamientos con la sonda, dando lugar a cambios de T_{m} característicos que se miden controlando los cambios en la transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia durante el calentamiento lento.
Se puede hacer que las sondas que tienen distintas T_{m} con diversos alelos puedan transmitir varias señales simultáneamente para aumentar la potencia de esta técnica (Bernard, P.S. y otros, (1998) Am. J. Pathol 153, páginas 1055-1061); sin embargo, esta transmisión múltiple simultánea de varias señales está limitada en última instancia por el número de T_{m} que pueden diferenciarse con respecto al conjunto de temperaturas de fusión de las sondas. La presente invención se refiere a la ampliación de la potencia de la transmisión múltiple simultánea de varias señales de las sondas de hibridación, utilizando el color, así como las T_{m} para la tipificación genotípica de distintos alelos al mismo tiempo. Se utilizan múltiples sondas con distintos colorantes aceptantes. A causa de que el colorante aceptante emite a distintas longitudes de onda, tales análisis multicolor pueden utilizarse para ampliar el número de alelos que pueden estudiarse al mismo tiempo.
Aunque el análisis multicolor puede utilizarse para ampliar la cantidad de información obtenida en una curva de fusión única, el análisis multicolor requiere la utilización de técnicas de compensación de interferencias para corregir el solapamiento de la fluorescencia entre los canales. Estos métodos se desarrollaron originariamente para el control fluorescente multiparamétrico de células, utilizando la citometría de flujo. Bagwell, C.B. y Adams, E.G. (1993) Ann. N.Y. Acad. Sci. páginas 677, 167-184. Aunque estas técnicas han probado su utilidad, en la citometría de flujo la temperatura permanece constante, y estos métodos no corrigen por cambios en los efectos de entrecruzamiento dependientes de la temperatura. Con el análisis de la curva de fusión, la temperatura oscila entre 40 y 95ºC, y pueden surgir errores significativos si los efectos de entrecruzamiento dependientes de la temperatura no son corregidos. Con objeto de adaptar el análisis multicolor para su utilización con las sondas de hibridación, son necesarias concesiones algorítmicas para distintos ajustes de ganancia y para los efectos térmicos sobre el solapamiento de la fluorescencia entre los canales.
La Solicitud de Patente Internacional No. WO 97/46714 da a conocer métodos para controlar la hibridización durante una reacción polimerásica. Los métodos implican el rápido ciclado térmico y la utilización de colorantes de ADN bicatenario o de sondas de hibridación específicas. Particularmente, se utiliza un par de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia y la cuantificación/determinación de la pureza del ADN amplificado es conseguido mediante el análisis de las curvas Tm.
El presente planteamiento consiste en llevar a cabo un procesamiento de calibración durante una subida de temperatura para definir la dependencia térmica de cada fluoróforo. Esta dependencia térmica se aproxima entonces con polinomios de tercer grado. Entonces, se utiliza la temperatura de adquisición para el valor de fluorescencia durante los procesamientos consecutivos del ensayo, para interpolar los coeficientes de calibración de la fluorescencia a esa temperatura. Sin esta corrección, los valores de fluorescencia serían incorrectos debido al solapamiento espectral térmico-dependiente.
Además, también se desea la corrección para la ganancia del amplificador, ya que los procesamientos experimentales pueden conseguirse con varias ganancias. A causa de que no es práctico realizar los procesamientos de calibración para todas las combinaciones de ganancias, el archivo de compensación deberá trabajar con los procesamientos experimentales obtenidos con cualquier ajuste de ganancia. La corrección para la ganancia puede alcanzarse multiplicando las curvas de calibración fluorescente por la proporción de ganancia del procesamiento con respecto a la ganancia de calibración para cada canal.
Por lo tanto, un aspecto de la presente invención se refiere a un método para la determinación de la presencia de, por lo menos, dos analitos, utilizando como mínimo dos entidades detectoras fluorescentes específicas para sus analitos respectivos. Las entidades fluorescentes son excitadas con luz que presenta la longitud de onda apropiada; la fluorescencia se determina en por lo menos, dos canales espectrales; y los valores de fluorescencia son corregidos con respecto al solapamiento espectral y a la dependencia de la temperatura de los valores fluorescentes.
En una forma preferente de realización de la presente invención, los analitos son loci de ácidos nucleicos, y las entidades fluorescentes son específicas para sus loci respectivos. Las entidades fluorescentes son excitadas con luz que presenta una longitud de onda apropiada; la fluorescencia se mide a través de una gama de temperaturas; y los valores de señal se compensan con respecto a la dependencia térmica. En una forma de realización preferente, las entidades fluorescentes se fijan a oligonucleótidos que tienen secuencias complementarias a sus loci respectivos; los oligonucleótidos se hibridizan a los loci; y la etapa de medición incluye el control de la fluorescencia durante el calentamiento para fundir los oligonucleótidos de sus loci respectivos.
El gen de la apolipoproteína ("Apo E") sirve como un sistema modelo para la presente invención. Alteraciones de bases únicas en el interior de los codones 112 y 158 del gen Apo E explican los tres alelos comunes (\in2, \in3 y \in4) y los seis fenotipos de Apo E. Mahley, R.W. (1988) Science 240, páginas 622-630. Se sintetizaron dianas oligonucleótidas para proporcionar el tipado genotípico de la sonda de hibridación adyacente de los alelos Apo E. Utilizando matrices artificiales, los efectos de la concentración de dianas, de la competencia de las cadenas complementarias, de la concentración de sondas, de la concentración de Mg^{++}, y de las condiciones de hibridación previas al análisis de la curva de fusión, podrían ser estudiados sistemáticamente independientemente de la técnica de amplificación. De este modo, una forma de realización adicional de la presente invención incluye la optimización de la concentración de las dianas y de las condiciones de hibridación, y la reducción de la competencia de las cadenas complementarias para proporcionar mediciones fluorescentes compensadas óptimas.
Características adicionales de la presente invención quedarán evidentes a los técnicos en la materia a partir de la consideración de la siguiente descripción detallada de realizaciones preferentes que ejemplifican la mejor forma de llevar a cabo la invención, tal como ésta se percibe actualmente.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es una representación esquemática del análisis de la curva de fusión fluorescente para el tipado genotípico;
la figura 1A muestra el equilibrio entre la hibridación y la fusión en las T_{m} de dúplex emparejados y no emparejados;
la figura 1B es un gráfico del tiempo con respecto a la temperatura durante la fase de fusión de la reacción;
la figura 1C es un gráfico de la fluorescencia con respecto a la temperatura para la sonda LC Red 640; y
la figura 1D es un gráfico de la derivada negativa de la fluorescencia de la figura 1C con respecto al tiempo.
La figura 2 muestra el efecto de distintos protocolos de hibridación sobre la simetría del pico de las curvas derivadas de la fusión para un heterocigoto de muestra en el codon 158 del gen Apo E;
la figura 2A ilustra un protocolo de enfriamiento rápido (20º C/s) hacia una temperatura 8º por debajo de la T_{m} de un dúplex desemparejado;
la figura 2B ilustra el protocolo de enfriamiento rápido interrumpido durante 20 segundos que se mantiene a temperaturas 8ºC inferiores a la T_{m} para el dúplex emparejado y por lo tanto desemparejado;
la figura 2C ilustra una velocidad de transición térmica más lenta (1º C/s) hacia una temperatura 8ºC inferior a la T_{m} de un dúplex desemparejado;
las figuras 2D-F son gráficos de las curvas de fusión derivadas negativas (-dF/dT) (0,1º C/s) para los protocolos de hibridación de las figuras 2A-C, respectivamente.
La figura 3 ilustra la optimización de las concentraciones de los oligonucleótidos diana y de Mg^{++} para el tipado genotípicode los codones 112 y 158 del gen Apo E utilizando el protocolo de hibridación de la figura 2C;
la figura 3A es un gráfico -dF/dT que mide LC Red 705 (codon 112) en 1 mM de MgCl_{2};
la figura 3B muestra LC Red 705 (codon 112) en 3 mM MgCl_{2};
la figura 3C muestra LC Red 640 (codon 158) en 1 mM MgCl_{2}; y
la figura 3D muestra LC Red 640 (codon 158) en 3 mM MgCl_{2}. Las concentraciones de las dianas fueron de 0,05 \mugM (---) o 0,2 \muM (- -), las de las sondas de fluoresceína fueron de 0,1 \muM, y las de las sondas aceptoras fueron de 0,2 \muM, y las cadenas de competencia no estaban presentes.
La figura 4 ilustra la competencia durante el tipado genotípico de las sondas Apo E en presencia de las cadenas complementarias, utilizando el protocolo de hibridación de la figura 2C y graficada como la derivada de la fluorescencia (-dF/dT) con respecto a la temperatura;
la figura 4A muestra los picos de fusión heterocigótica para los alelos \in3/\in4 (codon 112) y
la figura 4B muestra los picos de fusión heterocigótica para los alelos \in2/\in3 (codon 158), en presencia (---) o ausencia (- -) de cadenas de competencia. Cada reacción incluyó 0,1 \muM de sonda marcada con fluoresceína, 0,2 \muM de sonda aceptora, 0,05 \muM de la sonda heterocigótica con o sin 0,05 \muM de competidor, y 1 mM MgCl_{2} (codon 112) o 3 mM MgCl_{2} (codon 158).
La figura 5 muestra la calibración y la aplicación de la compensación de color para el solapamiento espectral con compensación de un caso extremo del vertido de LC Red 640 sobre el canal LC Red 705; las ganancias del instrumento fueron de 1, 30, y 50 para la fluoresceína, y los canales LC Red 640 y LC Red 705, respectivamente; la concentración de las sondas marcadas fue de 0,1 \muM de fluoresceína (-o-), 2 \muM de LC Red 640 (-X-), y 2 \muM de LC Red 705 (---) en 50 mM de Tris, pH 8,5 (25ºC), 1 mM de MgCl_{2} y 250 \muM/ml de albúmina sérica bovina, e incluyéndose una muestra que contenía tampón sin sondas (-\Delta-) como un blanco;
la figura 5A muestra los datos de calibración del color original;
la figura 5B muestra los datos de calibración después de la compensación del color; y
la figura 5C muestra la corrección de la temperatura a 50ºC después de la compensación del color; los algoritmos de compensación y de corrección se aplicaron entonces al canal LC Red 705 en un ensayo de color multipléxico, y en las figuras 5D-F se muestran las curvas de fluorescencia con respecto a temperatura; los genotipos que se muestran son homocigóticos \in4/homocigóticos \in3 (....), homocigóticos \in3/homocigóticos \in3 (- - -), y homocigóticos \in3/heterocigóticos \in2/\in3 (---).
La figura 6 muestra el tipado genotípico multipléxico de color de los codones 112 y 158 sin cadena competidora, utilizando el protocolo de hibridación de la figura 2C; las curvas de fusión derivadas (-dF/dT con respecto a la temperatura) compensadas (figura 6B) y no compensadas (figura 6A) se muestran para el canal LC Red 705 utilizado para el análisis del codon 112;
la figura 6A muestra la purga a partir de LC Red 640;
la figura 6B muestra sólo los genotipos en el codon 112; los genotipos que se muestran son homocigóticos \in4/homocigóticos \in3 (....), homocigóticos \in3/homocigóticos \in3 (---), y homocigóticos \in3/heterocigóticos \in2/\in3 
\hbox{(-  -  -).}
la figura 7 muestra el efecto de una temperatura de hibridación más baja sobre el área de los picos para los desemparejamientos \in3 en el tipado genotípico de la muestra heterocigótica \in2/\in3;
la figura 7A muestra el tipado genotípico después de enfriar en 1ºC/s a 42ºC, la temperatura utilizada para la transmisión múltiple simultánea de varias señales en la figura 6; y
la figura 7B muestra el tipado genotípico después de enfriar en 1ºC/s a 48ºC la temperatura utilizada para la optimización del tipado genotípico en el codon 158.
Descripción detallada de la invención
En la descripción y reivindicaciones de la invención, se utilizará la siguiente terminología según las definiciones que se exponen a continuación.
Tal como se utiliza en la presente memoria, "ácido nucleico", "ADN", y términos similares incluyen también análogos de ácidos nucleicos, es decir, análogos que tienen estructuras distintas a las de tipo fosfodiéster. Por ejemplo, los denominados "ácidos nucleicos peptídicos", que se conocen en la técnica y poseen enlaces peptídicos en vez de enlaces fosfodiéster en su estructura, se consideran incluidos dentro del alcance de la presente invención.
Tal como se utilizan en la presente memoria, "par de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia" o "par FRET" se refiere a un par de fluoróforos que incluyen un fluoróforo donante y un fluoróforo aceptor, en el que el fluoróforo donante es capaz de transferir energía de resonancia al fluoróforo aceptor. En otras palabras, el espectro de emisión del fluoróforo donante se solapa con el espectro de absorción del fluoróforo aceptor. En los pares preferentes de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia, el espectro de absorción del fluoróforo donante no se solapa sustancialmente con el espectro de absorción del fluoróforo aceptor.
Tal como se utiliza en la presente memoria, "una sonda oligonucleótida donantea" se refiere a un oligonucleótido que se marca con un fluoróforo donante de un par de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia.
Tal como se utiliza en la presente memoria, "una sonda oligonucleótida aceptora" se refiere a un oligonucleótido que se marca con un fluoróforo aceptor de un par de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia.
Tal como se utiliza en la presente memoria, "un par oligonucleótido FRET" se refiere al par de la sonda oligonucleótida donantea y de la sonda oligonucleótida receptora que conforman una relación de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia cuando la sonda oligonucleótida donantea y la sonda oligonucleótida aceptora se hibridizan ambas a sus secuencias ácido nucleicas diana complementarias.
La presente invención se refiere a un método para la utilización de, por lo menos, dos entidades detectoras fluorescentes para la determinación de la presencia de, como mínimo, dos analitos. Aunque esta técnica puede utilizarse ampliamente, una forma de realización preferente de la presente invención es un método para el rastreo de loci múltiples de secuencias ácido nucleico con respecto a la presencia de mutaciones o polimorfismos. Más particularmente, la presente invención permite un método rápido que puede llevarse a cabo enteramente en el interior de un recipiente reactivo único, para la detección de mutaciones y polimorfismos en loci múltiples de una muestra de ADN genómico preparada a partir de un organismo individual. Aunque el método puede utilizarse en cualquier muestra apropiada de ácido nucleico, el método puede llevarse a cabo sobre productos de amplificación PCR y puede realizarse dentro del mismo vaso reactivo único que el utilizado para la amplificación PCR. El método preferente de la presente invención comprende las etapas de combinación de una muestra biológica que incluye las secuencias de ácido nucleico con dos o más pares oligonucleótidos FRET, la iluminación de la muestra biológica con la longitud de onda apropiada, el control de la fluorescencia como función de la temperatura durante el calentamiento, y la compensación de los valores de fluorescencia.
Las sondas fluorescentes para utilización en la detección y control del ADN incluyen colorantes específicos para el ADN bicatenario y sondas específico-secuenciales. La figura 1 muestra un esquema de hibridación basado en la transferencia de energía de resonancia entre fluoróforos situados en dos sondas adyacentes. Tal como se define más adelante en la Tabla 1, este método es específico secuencial y permite el análisis con curvas de fusión. Cuando las dos sondas marcadas se hibridizan con la misma cadena matriz, los dos componentes del par FRET se comprometen en una vecindad cercana y la transferencia energética puede ocurrir (figura 1A). A causa de un desemparejamiento entre uno de los alelos y una de las sondas oligonucleótidas, se producirá la fusión a una temperatura inferior para aquel alelo, separando de este modo los elementos del par FRET. El alelo que contiene el desemparejamiento mostrará una T_{m} más baja característica que el alelo que se empareje con la sonda (figuras 1B-D).
Las sondas de hibridación específicas para los distintos alelos y marcadas con diferentes colores aceptores pueden utilizarse simultáneamente para obtener curvas multipléxicas de fusión fluorescente para el tipado genotípico. Dos pares oligonucleótidos FRET separados, siendo específico cada uno para un locus e incluyendo cada uno un colorante aceptor distinto, pueden utilizarse al mismo tiempo. Pares aceptables de fluoróforos, para utilización como pares de transferencia energética de resonancia fluorescente, son bien conocidos por los expertos en la materia e incluyen, pero no están limitados a fluoresceína/rodamina, ficoeritrina/Cy7, fluoresceína/Cy5, fluoresceína/Cy5,5, fluoresceína/LC Red 640, y fluoresceína/LC Red 705.
La muestra nucleótida a analizar puede consistir en productos de amplificación PCR proporcionados utilizando las técnicas de ciclación rápida descritas en la patente US No 5.455.175. La ciclación a temperatura rápida, comparada con la ciclación térmica convencional, muestra que 30 ciclos de amplificación pueden completarse en 15 minutos y que los productos PCR resultantes contienen muchos menos productos secundarios. De este modo, con una ciclación rápida, los tiempos requeridos para la amplificación se reducen aproximadamente 10 veces, mejorando la especificidad.
El control en tiempo real de las curvas de fusión durante el calentamiento lento puede realizarse utilizando colorantes fluorescentes y sondas marcadas fluorescentes. La utilización del control fluorescente en tiempo real de las reacciones de los ácidos nucleicos se ha descrito en la patente US No 5.455.175 publicada el 3 de octubre de 1995, y en las Solicitudes de Patente US Números de Serie 08/869.275 y 08/869.276, cada una presentada el 4 de junio de 1997.
El análisis de las curvas de fusión fluorescente constituye un método efectivo y rápido para el tipado genotípico. Véase, por ejemplo, Lay, M.J., y Wittwer, C.T. (1997) Clin. Chem. 43, páginas 2262-2267; Bernard, P. S., y otros (1998) Anal. Biochem. 255, páginas 101-107; Bernard, P. S., y otros (1998) Am. J. Pathol. 153, páginas 1055-1061; Lyon, E. y otros (1988) Mol. Diag. 3, páginas 203-210. La PCR de ciclo rápido y el tipado genotípico de base única puede realizarse en un único tubo de ensayo y sin la intervención de etapas en un tiempo de 40 minutos. Los algoritmos y métodos de la presente invención demuestran que la transmisión múltiple simultánea de varias señales coloreadas en solución es posible con cicladores térmicos capaces de fluorescencia tal como el LightCycler™. Véase Wetmur J.G.(1995) en "Molecular Biology and Biotechnology" (Meyers, R.A. ed.) páginas 605-608, VCH Publishers, Inc., Nueva York, NY. La tecnología multipléxica podría aplicarse también a métodos de cuantificación, tales como los que utilizan controles internos para PCR competitiva. Sidhu, M.K. y otros (1998) en "Gene Quantification" (Ferre, F.,Ed., páginas 265-276, Birkhauser, Boston, MA.
El gen Apo E sirve como un sistema modelo para la presente invención. Alteraciones de base única en el interior de los codones 112 y 158 del gen Apo E explican los tres alelos comunes (\in2, \in3 y \in4) y los seis fenotipos de Apo E. Mahley, R.W. (1988) "Science" 240, 622-630. Se sintetizaron dianas oligonucleótidas para proporcionar el tipado genotípico de la sonda de hibridación adyacente de los alelos de Apo E. Los pares FRET utilizados son fluoresceína/LC Red 640, y fluoresceína/LC Red 705. Las secuencias se muestran a continuación en la Tabla I. Además de la compensación para la dependencia térmica de los colorantes fluorescentes, los efectos de la concentración de dianas, de la competencia de las cadenas complementarias, de la concentración de sondas, de la concentración de Mg^{++}, y de las condiciones de hibridación previas al análisis de la curva de fusión son estudiados y optimizados.
TABLA I Oligonucleótidos y sondas utilizados para el tipado genotípico de las secuencias del Locus de la Apolipoproteína E Modelo para el tipado genotípico del codon 112
Diana \in3 GGCGCAGGCCCGGCTGGGCGCGGACATGGAGGACGTGTGCG
GCCGCCTGGTGCAGT^{a}[SEQ ID NO:1]
Diana \in4 GGCGCAGGCCCGGCTGGGCGCGGACATGGAGGACGTGCGC
GGCCGCCTGGTGCAGT^{a}[SEQ ID NO:2]
Sondas fluo- CCAGGCGGCCGCACACG-fluoresceína[SEQ ID NO:3]
rescentes LCT705-CCTCCATGTCCGCGCCCAGCCGGGCCTGCG[SEQ ID NO:4]
Secuencias para el tipado genotípico del codon 158
Diana \in2 GCGGCTCCTGCCCGATGCCGATGACCTGCAGAAGTGCCTGG
CAGTGTACCA^{a}[SEQ ID NO:5]
Diana \in3 GCGGCTCCTGCCCGATGCCGATGACCTGCAGAAGCGCCTGG
CAGTGTACCA^{a}[SEQ ID NO:6]
Sondas ACACTGCCAGGCACTTC-fluoresceína[SEQ ID NO:7]
fluorescentes LCR640-GCCAGGTCATCGGCATCGGGGCAGGAGCC[SEQ ID NO:8]
^{a} El área subrayada indica la región diana de la sonda de fluoresceína; la superficie en negrita indica la localización
del desemparejamiento.
La tasa sonda oligonucleótida/hibridación de la diana puede determinarse mediante una etapa única de nucleación. Sin embargo, (el cociente) sonda/hibridación de la diana está influenciado por la concentración salina, temperatura, y estructura secundaria. Wetmur, J. G. (1995) en "Molecular Biology and Biotechnology" (Meyers, R.A., Ed.), páginas 605-608, VCH Publishers, Inc., Nueva York, NY. Se cree que estas mismas condiciones influencian la calidad del tipado genotípico durante la fusión sonda/diana. Por ejemplo, áreas equivalentes de los picos de fusión fluorescente de una muestra heterocigótica requerirían tener casi las mismas concentraciones de sondas hibridizadas a cada diana antes de la fusión. De este modo, para el tipado genotípico, las temperaturas de hibridación son seleccionadas para optimizar las tasas sonda/hibridación de la diana. Empíricamente, las máximas tasas sonda/hibridación de la diana tuvieron lugar a 5-10ºC por debajo de la T_{m} del duplex. Actualmente, como temperatura de la diana se utiliza una temperatura de aproximadamente 8ºC por debajo de la T_{m} del dúplex.
Utilizando temperaturas de hibridación específicas de la diana para cada sitio, una tasa de transición gradual antes de la fusión proporcionó el mejor tipado genotípico (figura 2C). Además, las concentraciones de MgCl_{2} y de la diana afectan la calidad del tipado genotípico en cada sitio. Una concentración alta de MgCl_{2} produce una escasa diferenciación de los picos para el tipado genotípico heterocigótico en el codon 112, pero un tipado genotípico óptimo en el codon 158 en presencia de una concentración baja de la diana. El tipado genotípico en el codon 158 depende de una concentración escasa de la diana para que el dúplex desemparejado quede mejor representado. Una explicación posible para esto es que la proporción más alta sonda/diana puede asegurar mejor la saturación de ambas cadenas de la diana antes de la fusión.
El hallazgo de que los sitios optimizan a distintas concentraciones de la matriz sugiere que el ciclo en el cual la amplificación se detiene y la investigación del principio de la secuencia son importantes. El análisis de la curva de fusión empieza habitualmente después de que la fase de meseta de la amplificación se alcance. Véase Bernard, P.S., y otros (1998) Anal. Biochem. 255, páginas 101-107; Bernard, P.S., y otros (1998) Am. J. Pathol. 153, páginas 1055-1061. Sin embargo, este punto puede representar un retraso excesivo para el tipado genotípico en los sitios tales como el codon 158. Como alternativa, el análisis de la curva de fusión puede programarse para que se inicie en cualquier ciclo con objeto de proporcionar un tipado genotípico óptimo.
Para la transmisión múltiple simultánea de varias señales de las sondas de hibridación mediante el color, se escogió una concentración salina y una concentración de la diana única. Se escogió una concentración salina baja debido al codon 112 y debido al codon 158, una concentración matricial baja. La concentración más baja de MgCl_{2} disminuyó el área del pico desemparejado en el codon 158. Sin embargo, este efecto se corrigió parcialmente haciendo descender la temperatura de hibridación para que la transmisión múltiple simultánea de varias señales tuviera lugar en una cuantía superior a 8ºC por debajo de la T_{m}, la temperatura inicialmente seleccionada. La temperatura de hibridación más baja utilizada para la transmisión múltiple simultánea de varias señales no fue necesaria para el análisis en un único sitio en el codon 158, ya que podrían producirse picos heterocigóticos equivalentes con una concentración más alta de MgCl_{2}. En general, puede ser necesario utilizar temperaturas de hibridación inferiores a 8ºC por debajo de T_{m} para aumentar la hibridación sonda/diana bajo concentraciones bajas de MgCl_{2}.
La fase de meseta de la amplificación se debe en gran parte a las cadenas de producto complementarias que se acumulan compitiendo por los sitios de hibridación de los iniciadores. Wittwer, C.T. y otros (1997) "BioTechniques" 22, páginas 130-138. Esto estaría de acuerdo con la competición con respecto a la diana que se observa entre la cadena complementaria y las sondas de hibridación, durante el tipado genotípico. Aunque esta competición no evita el análisis de la curva de fusión de las mutaciones de la progenie germinal, puede limitar la sensibilidad de la detección de las mutaciones somáticas dentro del producto antecedente de tipo salvaje. Se han desarrollado varias técnicas para evitar la competición a partir de la cadena no diana durante el análisis. Por ejemplo, las sondas ácido nucleicas peptídicas (PNA) compiten efectivamente contra la cadena complementaria formando un dúplex extraordinariamente estable con la diana. Egholm, M., y otros (1993) "Nature" 365, páginas 566-658. Otra alternativa es unir la sonda a un soporte sólido y eliminar entonces la cadena competidora. Pastinen, T., y otros (1996) Clin. Chem. 42, páginas 1391-1397. La tipificación genotípica mediante amplificación PCR asimétrica previa a la curva de fusión reduciría la competición, manteniendo al mismo tiempo un ensayo homogéneo. Además, otras técnicas producen directamente un producto monocatenario, tal como la amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA) o la amplificación mediante círculo rodante. Reitsma, P. H., y otros (1996) Blood Coagul. Fibrinolysis 7, páginas 659-663; Lizardi, P. M., y otros (1998) Nat. Technol. 19, páginas 225-232.
Algoritmos de compensación de color de la técnica anterior, desarrollados para la citometría de flujo, no compensan con respecto a cambios en las ganancias de señal o en los efectos de entrecruzamiento dependiente de la temperatura. El cambio en los coeficientes de entrecruzamiento con la temperatura no constituye una ventaja cuando la temperatura permanece constante. Sin embargo, con el análisis de la curva de fusión, la temperatura varía de 40 a 95ºC y surgen errores significativos si los datos de calibración utilizados para derivar los coeficientes de entrecruzamiento se obtienen a una temperatura diferente que los datos a ser evaluados. El planteamiento de la presente invención es conseguir un procesamiento de calibración con respecto a una subida lenta de la temperatura y el cálculo de coeficientes de entrecruzamiento específicos de la temperatura para cada temperatura, interpolando un polinomio de tercer grado. Esto es, se calcula una matriz de entrecruzamiento térmico específica para la temperatura de cada punto de datos que va a ser evaluado. De modo similar, la corrección de la ganancia es posible calculando una nueva matriz a partir de los valores de fluorescencia que se multiplican por la proporción de la ganancia del punto de datos con respecto al procesamiento de calibración. Mientras las ganancias de la señal electrónica estén aseguradas, la nueva matriz del coeficiente de entrecruzamiento casa con los datos experimentales.
La compensación de color para el solapamiento espectral de los colorantes fluorescentes se ha modificado a partir de las técnicas de citometría de flujo. Véase Bagwell, C.B. y Adams, E.G. (1993) Ann. N.Y. Acad. Sci. páginas 677, 167-184. El software del análisis de costumbre se elaboró en LabView (National Instruments, Austin, TX). En resumen, se obtuvo en primer lugar un procesamiento de calibración de cada oligonucleótido fluorescente puro y control de autofluorescencia con valores de fluorescencia conseguidos en cada canal. A partir de estos valores se calculan constantes de entrecruzamiento de señales y se utilizan para convertir la fluorescencia observada (o) a la fluorescencia de la señal actual (s) mediante álgebra matricial.
Varias modificaciones para los algoritmos de compensación de color desarrolladas para la citometría de flujo fueron necesarias para utilización en los datos de tipado genotípico. Siguiendo la notación dada en Bagwell, C.B., y Adams, E.G. (1993) Ann. N.Y. Acad. Sci. 677, páginas 167-184, que se incorporan en la presente invención como referencia, y eliminando la consecución de sucesos múltiples (relacionada con la citometría de flujo pero no con la fluorescencia de la solución), las constantes de entrecruzamiento son:
k(i,j)= \frac{o(i,j)-a(j)}{\sum\limits^{N}_{n=1}[o(i,n)-a(n)]}
en donde:
k(i,j) = señal de entrecruzamiento del colorante i en el canal j
o(i,j) = señal observada del colorante i en el canal j
a(j) = autofluorescencia en el canal j
n = índice del canal
N = canal máximo
Experimentos preliminares han mostrado que la fluorescencia de algunos de los colorantes, y las constantes de entrecruzamiento de algunas combinaciones de colorante/canal, dependen de la temperatura sobre el intervalo deseado del análisis (40-95ºC). Por lo tanto, los procesamientos de calibración se obtuvieron consiguiendo valores de fluorescencia continuamente durante una subida de temperatura de 0,2ºC/s entre 40 y 95ºC. Las curvas de temperatura con respecto a la fluorescencia fueron casi lineales, pero se aproximaron mejor mediante polinomios de tercer grado. Los coeficientes polinómicos de tercer grado para las curvas de temperatura con respecto a la fluorescencia de cada una de las combinaciones colorante/canal y los controles de autofluorescencia de cada canal se almacenaron para la interpolación de la temperatura.
Para compensar los datos de la fluorescencia del color, la temperatura de cada adquisición se utilizó para interpolar la fluorescencia térmico-específica a partir de las curvas de calibración. Estos valores se ajustaron entonces para cualquier cambio en la ganancia electrónica entre la calibración y el procesamiento de los datos de la manera siguiente:
o(i,j) = [w(i,j)T^{3} + x(i,j)T^{2} + y(i,j)T + z(i,j)] [G_{D}(j)/G_{C} (j)]
a(j) = [m(j)T^{3} + n(j)T^{2} + p(j)T + q(j)][G_{D} (j)/G_{C} (j)]
en donde:
w(i,j), x(i,j), y(i,j) y z(i,j) son coeficientes polinómicos de tercer grado para las curvas de temperatura con respecto a fluorescencia del colorante i en el canal j, y m(j), n(j), p(j) y q(j) son coeficientes polinómicos de tercer grado para la curva de temperatura con respecto a la de fluorescencia autofluorescencia en el canal j
T = temperatura de adquisición
G_{D}(j) = ganancia del canal (j) durante el procesamiento de d datos
G_{C}(j) = ganancia del canal j durante el procesamiento de calibración
La fluorescencia de la señal real de cada colorante se calcula mediante la ecuación matricial:
S = K^{-1}[O-A]
en donde:
S = fluorescencia de la señal real de cada colorante
K = constante de entrecruzamiento de cada colorante en cada canal
O = fluorescencia observada en cada canal
A = autofluorescencia observada en cada canal
Si se desea la corrección de la temperatura, así como la compensación del color, los datos de calibración compensan el color mediante el método anterior y las curvas de temperatura con respecto a la fluorescencia de la señal real se adecuan a los polinomios de tercer grado y los coeficientes se conservan para la interpolación térmica. El procesamiento de los datos compensa el color, y la fluorescencia de cada colorante durante cada adquisición corrige la temperatura de la forma siguiente:
s_{TC} = s[s_{C}(T_{s})/s_{C}(T_{D})]
en donde:
s_{TC} = fluorescencia de la señal corregida para la temperatura
s = fluorescencia de la señal
s_{C}(T_{s}) = fluorescencia de la señal interpolada a partir del procesamiento de calibración a una
temperatura estándar (seleccionada por el usuario)
s_{C}(T_{D}) = fluorescencia de la señal interpolada a partir del procesamiento de calibración a la
temperatura de adquisición de los datos
Un ejemplo de los resultados de la compensación de color y de la corrección de la temperatura se muestra en la figura 5.
Ejemplo 1 Preparación de los oligonucleótidos
La secuencia del gen de la apolipoproteína E humana (número de registro K00396 de GenBank) se utilizó para diseñar cadenas diana no marcadas, cadenas (complementarias) competitivas no marcadas, y sondas marcadas fluorescentemente. Las secuencias se muestran anteriormente en la Tabla 1. Todos los oligonucleótidos se sintetizaron mediante la química de la fosforamidita estándar (Pharmacia Biotech Gene Assembler Plus, Piscataway, NJ). Las sondas aceptoras LC Red 640 (LightCycler Red 640) y LC Red 705 (LightCycler Red 705) marcadas en el extremo 5' se sintetizaron utilizando un modificador C6dT amino (Glen Research, Sterling, VA) y fosforamidita LC Red 705 (Roche Molecular Biochemicals), respectivamente. El éster LC Red 640N-hidroxisuccinimídico (Roche Molecular Biochemicals) se conjugó manualmente a una concentración equimolar de oligonucleótido en tampón borato 0,1 M, pH 9,0. La incubación se llevó a cabo durante dos horas en la oscuridad. Ambas sondas aceptoras se sintetizaron con un reactivo de fosforilación químico (Glen Research) en el extremo 3'. Las sondas marcadas con 3'-fluoresceína se sintetizaron sobre casetes de vidrio poroso controlados por fluoresceína (BioGenex, San Ramón, CA).
Se conservó un grupo 5'-tritilo durante la síntesis sobre la diana oligonucleótida y las cadenas competidoras, la sonda LC Red 640 pre-conjugada y las sondas marcadas con fluoresceína. Las secuencias de longitud completa para todos los oligonucleótidos y las sondas se purificaron mediante cromatografía líquida de alta presión C18 de fase inversa (HPLC) utilizando una columna Waters Symmetry 4,6 x 150 mm de 3,5 \mu (Waters, Milford, MA). La fase móvil consistía en 0,1 mol/acetato de trietilamonio, pH 7,0, y un gradiente de acetonitrilo (1 ml/minuto) de 10 a 30% (sonda de fluoresceína) o de 10 a 80% (oligonucleótidos no marcados y sonda LC Red 705). El eluado se controló con absorbancia tándem y detectores de fluorescencia (Waters 486 y 474, Milford, MA). Para las sondas, se recuperaron fracciones con A_{260} coincidentes y picos de fluorescencia. La destritilación final se llevó a cabo en una columna Polypack (Glen Research, Sterling, VA) y los productos se eluyeron con acetonitrilo al 50%.
Los oligonucleótidos y sondas se secaron al vacío, se volvieron a suspender en 1 mM de Tris-HCl, 0,1 mM de EDTA, pH 8,0 y entonces, fueron cuantificados. Se utilizaron oligonucleótidos no marcados con valores A_{260}/A_{280} entre 1,6 y 1,8. La proporción de la concentración de fluoróforo a oligonucleótido se calculó para cada sonda. Las sondas con proporciones fuera del intervalo 0,9 - 1,1 se purificaron posteriormente sobre un gel de poliacrilamida al 15% desnaturalizado que contenía 7M de urea, seguido por HPLC para eliminar la urea.
Se utilizó una sonda de 17 unidades isoméricas marcada con 3'-fluoresceína en cada codon para el tipado genotípico. Aunque estas sondas eran distintas secuencialmente, ambas formaban un desemparejamiento A:C flanqueado por pares C:G cuando se hibridizaron a la diana no complementaria (Tabla 1). El desemparejamiento en ambos dúplex se situó en un lugar situado 5 pares de bases a partir del extremo 3' de la sonda.
El tipado genotípico en cada sitio se optimizó para concentraciones de reactivo y condiciones de hibridación previas al análisis de la curva de fusión (véanse Ejemplos 2 y 3 a continuación). Las concentraciones de MgCl_{2}, cadena diana, cadena competitiva, y sonda de fluoresceína variaron. Las concentraciones de MgCl_{2} variaron entre 1 y 5 mM. Las concentraciones de oligonucleótidos diana variaron entre 0,05 y 0,2 \muM, y los oligonucleótidos competitivos se encontraban en una concentración equimolar con respecto a la cadena diana. Las sondas marcadas con fluoresceína variaron entre 0,1 y 0,2 \muM. Cada 10 \muL de reactivos contenía también 50 mM Tris, pH 8,5 (25ºC), 250 \mug/ml albúmina sérica bovina y 0,2 \muM de la sonda aceptora (LC Red 640 o LC Red 705). La figura 2 muestra las distintas condiciones térmicas utilizadas para la hibridación de las sondas antes del tipado genotípico. Las muestras heterocigóticas se utilizaron para determinar las condiciones ópticas para el tipado genotípico, evaluadas como curvas de Gauss de forma similar y áreas de pico equivalentes.
Para el tipado genotípico de la transmisión múltiple simultánea de varias señales se necesitaron reactivos habituales y un protocolo de temperatura única. Los reactivos utilizados fueron 1 mM de MgCl_{2}, 0,05 \muM de oligonucleótidos diana para cada sitio, 0,2 \muM de la sonda aceptora para cada sitio, 0,1 \muM de la sonda marcada con fluoresceína que comprende el codon 112 y 0,2 \muM de la sonda marcada con fluoresceína que comprende el codon 158. El protocolo térmico para el tipado genotípico de la transmisión múltiple simultánea de varias señales se proporciona en la figura 2C.
Las muestras se cargaron en cubetas capilares compuestas por plástico/vidrio, se taparon, se centrifugaron brevemente y se cargaron en el dispositivo rotatorio de 32 muestras de un ciclador térmico con una capacidad de control de la fluorescencia de 3 colores (LightCycler™, Roche Molecular Biochemicals). Se incluyeron doce muestras en cada procesamiento analítico de la curva de fusión. Durante la fase de calentamiento lento (0,1ºC/s) del protocolo de tipado genotípico, se controló continuamente la fluorescencia con adquisiciones de 100 ms. Los valores de fluorescencia de la fluoresceína, LC Red 640 y LC Red 705 se adquirieron en una coincidencia temporal exacta, utilizando una disposición lineal de los filtros de paso de banda dicroico. Véase Wittwer, C.T., y otros (1997) BioTechniques 22, páginas 176-181. Los datos se mostraron como gráficas fluorescencia (F) con respecto a temperatura (T) y como derivada de la fluorescencia (-dF/dT) con respecto a la temperatura, tal como se muestra en las figuras 1C y 1D.
Ejemplo 2 Optimización de las condiciones de hibridación
La calidad del análisis de la curva de fusión depende no sólo del protocolo de fusión, sino también de las condiciones de hibridación antes de la obtención de la curva de difusión. La figura 2 muestra que los protocolos de hibridación con una temperatura que cambia lenta y gradualmente dan lugar a picos de fusión heterocigótica más simétricos que la hibridación que utiliza una única transición térmica rápida. Este resultado se observó incluso aunque los tiempos totales de hibridación fueran aproximadamente los mismos (compárense las figuras 2A, B, y C) sugiriendo que el enfriamiento lineal a través de las T_{m} de cada dúplex favorece la formación idéntica de cada dúplex.
La Tabla 2 muestra una comparación de los cambios de T_{m} creados por el mismo desemparejamiento en dos sitios, utilizando distintas concentraciones de MgCl_{2}. Los desemparejamientos desestabilizan los dúplex sonda/diana en cada sitio en aproximadamente la misma magnitud. Además, la \DeltaT_{m} entre los dúplex emparejados y desemparejados aumentó con una concentración más alta de MgCl_{2}, mientras que el aumento de la concentración de la sonda de fluoresceína incrementó las T_{m} de ambos dúplex sin afectar a \DeltaT_{m} (datos que no se muestran).
TABLA II Temperaturas empíricas de fusión para los dúplex sonda de fluoresceína/diana tipado genotípico de pares de bases
[MgCl_{2}] codon sonda: diana T_{m} del dúplex \DeltaT_{m}
1 mM 112 A:T 70,0
5,9
A:C 64,1
158 A:T 62,4
6,6
A:C 55,8
3 mM 112 A:T 71,2
6,5
A:C 64,7
158 A:T 64,2
7,0
A:C 57,2
La resolución clara de un heterocigoto en el codon 112 (incluido en un 82% de la sonda GC) dependió de una concentración baja de MgCl_{2} (figura 3A con respecto a 3B). En contraste, el tipado genotípico del heterocigoto en el codon 158 (incluido en un 59% de la sonda GC) fue más simétrico con una concentración más alta de MgCl_{2} y una concentración baja de la diana (figura 3C con respecto a 3D).
El tipado genotípico a partir de un producto bicatenario (es decir, concentraciones iguales de diana y cadena complementaria) se muestra en la figura 4. En presencia del competidor (cadena complementaria), el tipado genotípico optimizó a los mismos parámetros mostrados en la figura 3, pero con una reducción en la señal de fluorescencia de aproximadamente el 60% en cada sitio.
Ejemplo 3 Compensación de color y corrección de la temperatura
La figura 5 muestra el efecto de la compensación del color y de la corrección de la temperatura aplicados a un procesamiento de calibración y a la transmisión múltiple simultánea de varias señales del color del locus Apo E. La dependencia térmica de LC Red 705 es sustancial, mientras que la fluorescencia de LC Red 640 es casi constante con la temperatura (figura 5A). Tal como se esperaba, sólo la muestra de calibración LC Red 705 muestra fluorescencia después de la compensación del color (figura 5B) y la dependencia de la temperatura se elimina después de la corrección de la temperatura (figura 5C). Las huellas de la fluorescencia original con respecto a la temperatura para el canal LC Red 705 (codon 112) son complejas y no interpretables, debido al solapamiento de la fluorescencia de LC Red 640 (figura 5D). Sin embargo, las transiciones únicas de temperatura se distinguen después de la compensación del color (figura 5E). Después de la corrección de temperatura (figura 5F), la pendiente de línea de base fuera de la región de transición de la fusión aumenta.
La transmisión múltiple simultánea de varias señales por el color y la T_{m} proporciona la identificación simultánea de variantes en los codones 112 y 158 en un tubo de ensayo único a los diez minutos. La figura 6 muestra los picos de fusión fluorescente no compensados (A) y compensados (B) para el tipado genotípico del codon 112. Sin compensación, existe un vertido sustancial desde el colorante aceptor LC Red 640 al canal para el control del colorante aceptor LC Red 705 (figura 6A). Esto da lugar a productos evidentes con T_{m} de 55ºC y 62ºC. Sin embargo, estos picos adicionales desaparecen después de la compensación, revelando los genotipos homocigóticos verdaderos en el codon 112. La totalidad de los genotipos para las 6 isoformas de la proteína Apo E que se encuentran naturalmente podrían distinguirse utilizando este método. Además, los otros 3 posibles genotipos que no se encuentran normalmente en las poblaciones humanas se construyeron utilizando matrices sintetizadas y se analizaron correctamente (datos que no se muestran).
El tipado genotípico de la transmisión múltiple simultánea de varias señales se mostró óptimo utilizando concentraciones bajas tanto de la diana como de MgCl_{2}. Utilizando la concentración más baja de MgCl_{2} para el tipado genotípico del codon 158, disminuyó el área del pico del dúplex desemparejado. Sin embargo, la asimetría resultante en los picos heterocigóticos podría compensarse parcialmente disminuyendo la temperatura de la diana de hibridación (desde 48ºC a 42ºC) antes de la fusión (figura 7).
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<110> Fundación para la Investigación de la Universidad de Utah
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<120> Compensación de color para ganancias térmicas y electrónicas
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<130> 7475-66797
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<140>
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<141>
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<150> 09/374,422
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<151> 1999-08-13
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<160> 8
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<170> PatentIn Ver. 2.0
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<210> 1
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<211> 56
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<400> 1
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\dddseqskip
ggcgcaggcc cggctgggcg cggacatgga ggacgtgtgc ggccgcctgg tgcagt 
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56 
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<210> 2
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<211> 56
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<400> 2
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ggcgcaggcc cggctgggcg cggacatgga ggacgtgcgc ggccgcctgg tgcagt 
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56 
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<210> 3
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<211> 17
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<400> 3
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ccaggcggcc gcacacg 
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17 
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<400> 4
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cctccatgtc cgcgcccagc cgggcctgcg 
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30 
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<210> 5
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<211> 51
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acactgccag gcacttc 
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<210> 8
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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Claims (17)

1. Método para la determinación de la presencia de, por lo menos, dos analitos en una muestra, que comprende:
proporcionar por lo menos dos entidades detectoras, comprendiendo cada una de ellas un marcaje fluorescente distinto del marcaje fluorescente de cualquiera de las otras entidades detectoras, y siendo capaz cada una de dichas entidades de unirse específicamente con sus respectivos analitos,
contactar la muestra con las entidades detectoras para permitir la unión específica de los analitos y de las entidades detectoras,
excitar cada una de dichas entidades marcadas con luz de una longitud de onda apropiada para inducir fluorescencia,
determinar los valores de fluorescencia de las entidades marcadas en por lo menos dos canales espectrales distintos a través de un intervalo térmico, y
compensar dichos valores para el solapamiento espectral, en el que la etapa de compensación incluye la corrección de la dependencia de la temperatura de los valores de la fluorescencia.
2. Método, según la reivindicación 1, en el que la corrección con respecto a la dependencia térmica se lleva a cabo calculando un coeficiente de solapamiento específico de la temperatura.
3. Método, según la reivindicación 1, en el que los analitos son productos de amplificación de ácidos nucleicos.
4. Método, según la reivindicación 3, que comprende además la etapa de determinar el tipado genotípico de cada uno de los productos de amplificación de ácido nucleico.
5. Método, según la reivindicación 1, que comprende además la etapa de compensación de dichos valores con respecto a la ganancia del amplificador.
6. Método, según la reivindicación 1, en el que:
la muestra es una muestra de ácido nucleico,
los analitos comprenden un primer locus y un segundo locus del ácido nucleico y las entidades detectoras comprenden,
una primera entidad detectora que comprende un primer marcador fluorescente que es específico para el primer locus, y
una segunda entidad detectora que comprende un segundo marcador fluorescente que es específico para el segundo locus, y
en el que la etapa de determinación incluye la medición de una primera señal fluorescente de la primera entidad detectora en un primer canal espectral y una segunda señal fluorescente de la segunda entidad detectora en un segundo canal espectral.
7. Método, según la reivindicación 6, en el que la etapa de compensación se lleva a cabo calculando un coeficiente dependiente de la temperatura.
8. Método, según la reivindicación 7, que comprende además la etapa de compensación con respecto a la ganancia del amplificador.
9. Método, según la reivindicación 6, en el que la primera entidad detectora comprende además una secuencia de ácido nucleico complementaria de, por lo menos, una parte del primer locus, y la segunda entidad detectora comprende además una secuencia de ácido nucleico complementaria de, por lo menos, una parte del segundo locus.
10. Método, según la reivindicación 9, en el que la etapa de contacto incluye la hibridación de la primera y segunda entidades detectoras a sus loci respectivos, y la etapa de determinación incluye el control de señales fluorescentes en los canales espectrales durante el calentamiento para fundir las entidades detectoras de sus loci respectivos.
11. Método, según la reivindicación 10, en el que la etapa de contacto se realiza disminuyendo la temperatura 1ºC/s.
12. Método, según la reivindicación 6, en el que el primer locus posee un primer alelo, el primer marcaje fluorescente comprende un primer colorante donante, un primer colorante aceptor, y un primer par de oligonucleótidos, unido cada uno de ellos a uno de los colorantes, y siendo cada uno de ellos complementario a regiones vecinas del primer alelo del primer locus.
13. Método, según la reivindicación 12, en el que el segundo locus posee un primer alelo, el segundo marcaje fluorescente comprende un segundo colorante donante, un segundo colorante aceptor, y un segundo par de oligonucleótidos, unido cada uno de ellos a uno de los colorantes, y siendo cada uno de ellos complementario a regiones vecinas del primer alelo del segundo locus.
14. Método, según la reivindicación 13, en el que el primer colorante donante es fluoresceína y el primer colorante aceptor es LC Red 705.
15. Método, según la reivindicación 14, en el que el segundo colorante donante es fluoresceína y el segundo colorante aceptor es LC Red 640.
16. Método, según la reivindicación 12, en el que el primer locus posee múltiples alelos y la concentración de Mg^{++} es optimizada para producir picos de fusión simétricos para los alelos, cuando los valores compensados de las señales se grafican como -dF/dT con respecto a temperatura.
17. Método, según la reivindicación 12, en el que el primer locus posee múltiples alelos, y la concentración del ácido nucleico que comprende el primer locus es optimizada para producir picos de fusión simétricos para los alelos, cuando los valores compensados de las señales se grafican como -dF/dT con respecto a temperatura.
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