ES2315397T3 - Oligonucleotidos para obtener el genotipo del gen de timidilato sintasa. - Google Patents
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Abstract
Un oligonucleótido que consiste en la SEC ID Nº: 1.
Description
Oligonucleótidos para obtener el genotipo del
gen de timidilato sintasa.
La presente invención se refiere a la obtención
del genotipo del gen de timidilato sintasa. La presente invención
también se refiere a la predicción de la respuesta de un sujeto
frente a un agente antitumoral basado en el genotipo de timidilato
sintasa.
El 5-fluorouracilo
(5-FU) es un compuesto que ha sido utilizado como
agente antitumoral durante mucho tiempo (Heidelberger C, Chaudhuri
NK, Danenberg PV, Mooren D, y col. (1957) Fluorinated pyrimidines: a
new class of tumor inhibitory compounds. Nature 179:
663-666). Se han demostrado efectos antitumorales
del 5-FU frente a varios tumores.
El efecto citotóxico del 5-FU se
basa en la inhibición de la síntesis de ADN en las células. El
5-FU inhibe incluso la síntesis de ADN en tejido no
tumoral, y no sólo en el tejido tumoral. Sin embargo, puesto que
normalmente se produce una síntesis de ADN mucho más activa en los
tejidos tumorales en comparación con los tejidos no tumorales, se
cree que la influencia manifestada de la acción inhibidora mediada
por 5-FU es comparativamente mayor en los tejidos
tumorales. Es a través de este mecanismo que el 5-FU
ejerce una acción inhibidora sobre tejidos tumorales.
Por otro lado, la administración de
5-FU, que es un agente citotóxico, a menudo viene
acompañada de efectos adversos que no pueden ser ignorados. El
efecto citotóxico del 5-FU no solo afecta a los
tejidos tumorales, sino también a los tejidos no tumorales. Se
considera que la sensibilidad de 5-FU en pacientes a
los que se administra 5-FU está estrechamente
relacionada con la magnitud de los efectos adversos del fármaco.
El 5-FU es un inhibidor de la
síntesis de ADN que se dirige a la timidilato sintasa. La timidilato
sintasa cataliza la conversión intracelular de desoxiuridilato en
desoxitimidilato. El desoxitimidilato es la única fuente nueva de
timidilato, un precursor esencial para la síntesis de ADN (Danenberg
PV (1997) Thymidylate synthase, a target enzyme in cancer
chemotherapy, Biochim Biophys Acta 473: 73-92).
Se ha demostrado que el promotor del gen de
timidilato sintasa es polimórfico (Nobuyuki H, Masahiko C, Ryushi
N, Keiichi T (1993) Characterization of the regulatory sequences and
nuclear factors that function in cooperation with the promoter of
the human thymidylate synthase gene, Biochim Biophys Acta 1216:
409-416). Además, se ha demostrado que el
polimorfismo del promotor de gen de timidilato sintasa está
relacionado con la respuesta de un sujeto frente al
5-FU. El gen humano de timidilato sintasa presenta
un polimorfismo que comprende dos o tres repeticiones combinadas de
una secuencia de 28 pb en su región reguladora. Marsh y col. 1999
(Genomics 58: 310-312) evaluaron la influencia de
la etnia sobre el genotipo de región potenciadora de promotor de
timidilato sintasa (TSER), describiendo que tanto el genotipo de
TSER como la frecuencia de alelo eran casi idénticas en poblaciones
caucásicas y del suroeste asiático, mientras que, por el contrario,
el genotipo TSER era significativamente diferente en sujetos chinos
y caucásicos. Kawakami y col. 1999 (Anticancer Research 19:
3249-3252) investigaron la asociación del genotipo
de timidilato sintasa (TS) con su expresión proteica en especimenes
clínicos a través de la determinación de la relación entre el
polimorfismo de TS y el número de posición de unión de
5-fluoro-dUMP usando tejidos
cancerosos gastrointestinales frescos, describiendo que la aparición
de repeticiones polimórficas combinadas en el gen de timidilato
sintasa está asociada a su expresión proteica en cánceres
gastrointestinales en humanos. El documento WO 01/36686 se refiere
al uso de polimorfismo genético para proporcionar regímenes
terapéuticos individualizados para tratar pacientes que padecen
enfermedades tales como cáncer, y describe en particular métodos
para escrutar regímenes terapéuticos, que comprenden la
determinación del genotipo de un paciente en una región de 28 pares
base en la región 5' no traducida del gen de timidilato sintasa. La
Patente EP 1 207 210 se refiere a un método para el análisis de un
ácido nucleico diana que consiste en secuencias repetitivas y no
repetitivas y que está presente en una muestra, en donde el número
de secuencias repetidas se determina por medio de un análisis de
temperatura de fusión.
El nivel de expresión del gen de timidilato
sintasa que es homocigoto para tres repeticiones combinadas es 3,6
veces el del gen de timidilato sintasa que es homocigoto para dos
repeticiones combinadas. Como consecuencia, los sujetos que portan
las tres repeticiones combinadas tienen significativamente menos
efectos adversos (Pullarkat, ST, Stoehlmacher J, Ghaderi V, Xiong
Y, y col. (2001) Thymidylate synthase gene polymorphism determines
clinical outcome of patients with colorectal cancer treated with
fluoropyrimidine chemotherapy. Pharmacogenomics J 1:
65-70).
La timidilato sintasa es una diana importante no
sólo para el 5-FU, sino también para otros agentes
antitumorales. Por ejemplo, la capecitabina, que se desarrolló como
profármaco oral del 5-FU, también ataca a la
timidilato sintasa. Esto sugirió que el polimorfismo de la región
reguladora del gen humano de timidilato sintasa es un marcador útil
para determinar la capacidad de respuesta de un sujeto frente a
agentes antitumorales.
Un objetivo de la presente invención es
proporcionar un método para obtener el genotipo del gen de
timidilato sintasa.
Especialmente, se proporciona el oligonucleótido
que consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 1
adecuado para obtener el genotipo del gen de timidilato sintasa.
Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un método
para predecir la capacidad de respuesta de un sujeto frente a un
agente antitumoral que ataca la timidilato sintasa en base al
genotipo de timidilato sintasa.
Se ha demostrado que el polimorfismo de
repeticiones combinadas en la región promotora del gen de timidilato
sintasa está relacionado con la capacidad de respuesta de un sujeto
frente a agentes antitumorales que atacan a la timidilato sintasa.
Por lo tanto, la eficacia o el grado de efectos adversos de un
agente antitumoral pueden predecirse analizando dicho polimorfismo.
Generalmente, el polimorfismo se determina amplificando ADN
genómico y analizando el tamaño de la ampliación. El tamaño de las
ampliaciones amplificadas mediante PCR se analiza mediante
electroforesis de gel. Sin embargo, la electroforesis de gel es una
técnica analítica laboriosa y que consume tiempo. Los agentes
antitumorales que atacan timidilato sintasa son fármacos importantes
en la quimioterapia del cáncer. Por tanto, es deseable obtener un
método que aporte información de forma más conveniente respecto a
la capacidad de respuesta de un sujeto frente a un agente
antitumoral que ataque la timidilato sintasa.
Los presentes inventores han llevado a cabo una
investigación extensa para obtener un método para identificar el
número de repeticiones combinadas en la región promotora del gen de
timidilato sintasa. Como consecuencia, han descubierto que el
número de repeticiones combinadas en el ADN genómico puede
identificarse usando un oligonucleótido que tenga una secuencia de
nucleótidos específica tal como una sonda, y detectando las
diferencias. Adicionalmente, los presentes inventores han
confirmado que el genotipo del sujeto podría determinarse en base
al número de repeticiones combinadas obtenidas con el método
anterior. Además, los presentes inventores han descubierto que es
posible diseñar una estrategia para tratar un cáncer en un paciente
relacionando el genotipo de timidilato sintasa, que se determina
mediante la presente invención, con la capacidad de respuesta del
sujeto frente a agentes antitumorales que atacan la timidilato
sintasa.
A saber, la presente invención proporciona el
oligonucleótido aislado que consiste en la secuencia de
oligonucleótidos de la SEC ID Nº: 1 que:
(a) es complementaria a una región que consta
de:
- (i)
- la unidad de repetición central de tres unidades de repetición combinadas que compone una repetición combinada en la región promotora del gen de timidilato sintasa, y
- (ii)
- la unidad de repetición localizada hacia el extremo 3' de la unidad de repetición central, y
(b) se hibrida con la región de (a) en
condiciones de hibridación altamente restrictivas.
Tal como se ha mencionado antes, la repetición
combinada de la región de promotor del gen de timidilato sintasa es
polimórfica. Es decir, se ha determinado la presencia de dos tipos
de repeticiones combinadas, constando una repetición combinada de
dos unidades de repetición, y constando una repetición combinada de
tres unidades de repetición. "Repetición combinada", tal como
se menciona en la presente memoria, se refiere a una región en la
que dos o más secuencias de nucleótidos se repiten sucesivamente.
Las secuencias de nucleótidos que se repiten similares se denominan
unidades de repetición. Generalmente, el número de repeticiones es 2
ó más. En la presente invención, el número de repeticiones que van
a identificarse es 2 y 3. A partir de aquí, una forma polimórfica
en la que tres unidades de repetición componen una repetición
combinada se denominará 3R. Además, una forma polimórfica en la que
dos unidades de repetición componen una repetición combinada se
denominará 2R. Estas secuencias de nucleótidos de forma polimórfica
pueden encontrarse en una base de datos de ADN (3R: número de
acceso GenBank AF279906, 2R: número de acceso GenBank AF279907). El
oligonucleótido de esta invención tiene la secuencia de nucleótidos
de la SEC ID Nº: 1 que es complementaria a la secuencia de
nucleótidos que constituye una región que comprende dos unidades de
dichas formas polimórficas, que son la unidad de repetición central
de 3R, y la unidad de repetición localizada hacia el extremo 3' de
la unidad de repetición central. Más específicamente, los
nucleótidos 132-193 de la secuencia de nucleótidos
descrita en el Nº de Acceso de GenBank AF279906 es la región
indicada en el apartado (a) anterior. Las secuencias de nucleótidos
complementarias descritas también en la presente memoria incluyen
específicamente las dos siguientes secuencias de nucleótidos:
(1) una secuencia de nucleótidos que ha sido
determinada complementaria a una determinada secuencia de
nucleótidos de acuerdo con la regla de
Watson-Crick, o
(2) una secuencia de nucleótidos que tiene una
homología del 80% o más con la secuencia de nucleótidos de (1).
Preferiblemente, (2) incluye una secuencia de
nucleótidos que tiene una homología del 90% o más, más
preferiblemente de 95% o más, e incluso más preferiblemente de 97%
o más con la secuencia de nucleótidos de (1). Los algoritmos para
determinar la homología de secuencias de nucleótidos son bien
conocidos. Por ejemplo, los programas para calcular la homología de
secuencia de nucleótidos usando BLAST son de uso práctico. Estos
programas pueden usarse a través de Internet.
Los presentes inventores han completado esta
invención descubriendo que las dos formas polimórficas pueden
distinguirse cuando el oligonucleótido que consiste en la secuencia
de nucleótidos de la SEC ID Nº: 1 que tiene dicha secuencia de
nucleótidos se hibrida con ADN genómico en las mismas condiciones.
Es decir, el oligonucleótido se hibrida con una repetición
combinada 3R, pero no se hibrida con 2R en las mismas
condiciones.
Además, el oligonucleótido que consiste en la
SEC ID Nº: 1 proporcionada por esta invención se hibrida con la
región en condiciones de hibridación altamente restrictivas. En la
presente invención, las "condiciones de hibridación altamente
restrictivas" se alcanzan cumpliendo simultáneamente las
siguientes condiciones de (1) y (2). A este respecto, la expresión
"no se hibrida sustancialmente" significa que no se detecta
hibridación en las mismas condiciones que en (1), descrito a
continuación:
(1) el oligonucleótido que consiste en la SEC ID
Nº: 1 se hibrida a la región de (a), y
(2) el oligonucleótido que consiste en la SEC ID
Nº: 1 no se hibrida sustancialmente con la repetición combinada que
consiste en dos unidades de repetición, que es otra forma
polimórfica del gen.
\vskip1.000000\baselineskip
En la presente invención, el oligonucleótido que
consiste en la SEC ID Nº: 1 se hibrida con la unidad de repetición
del extremo 3' de las dos unidades de repetición que componen una
unidad de repetición de la región promotora del gen de timidilato
sintasa, en las condiciones de hibridación que son menos
restrictivas que (b). El oligonucleótido que consiste en la SEC ID
Nº: 1 es útil para el análisis de curva de fusión de la presente
invención.
El oligonucleótido que consiste en la SEC ID Nº:
1 que cumple las anteriores condiciones es denominado algunas veces
en esta invención sonda de mutación. Las unidades de repetición que
constituyen el promotor del gen de timidilato sintasa no son
completamente idénticas. A continuación se muestra la secuencia de
nucleótidos de cada una de las tres unidades de repetición que
componen la repetición combinada de la región promotora del gen de
timidilato sintasa.
Por tanto, un oligonucleótido que se hibrida con
una unidad de repetición específica no puede hibridarse con las
otras unidades de repetición. El oligonucleótido que consiste en la
SEC ID Nº: 1 proporcionada en esta invención fue diseñado
utilizando dicho fenómeno. Un oligonucleótido preferible de esta
invención es un oligonucleótido que comprende la secuencia de
nucleótidos de la SEC ID Nº: 1. Los especialistas en la técnica
conocen un método para sintetizar un oligonucleótido que tiene una
secuencia de nucleótidos de interés.
El oligonucleótido que consiste en la SEC ID Nº:
1 proporcionada por esta invención puede usarse para identificar el
número de repeticiones combinadas de la región promotora del gen de
timidilato sintasa. Es decir, la presente invención se refiere a un
método para identificar el número de repeticiones combinadas de la
región promotora del gen de timidilato sintasa que comprende las
etapas de:
(a) amplificar un ADN genómico que comprende
repeticiones combinadas en al menos la región promotora del gen de
timidilato sintasa,
(b) hibridar el oligonucleótido que consiste en
la SEC ID Nº: 1 con el ADN genómico amplificado de la etapa (a) en
condiciones restrictivas,
(c) detectar una hibridación entre el
oligonucleótido y el ADN genómico, y
(d) identificar el número de repeticiones
combinadas como "dos" cuando no se detecta una hibridación,
identificando el número de repeticiones combinadas como "tres"
cuando se detecta una hibridación.
Preferiblemente, el método de la presente
invención comprende además:
(e) la hibridación del oligonucleótido que
consiste en la SEC ID Nº: 1 con el ADN genómico amplificado de la
etapa (a) en condiciones de hibridación que son menos restrictivas
que en (b),
(f) detectar una hibridación entre el
oligonucleótido y el ADN genómico, y
(g) identificar el número de repeticiones
combinadas como "dos" cuando no se detecta hibridación en (c)
pero sí en (f).
En la presente invención, el ADN genómico se
puede obtener a partir de una muestra biológica de un sujeto cuyo
número de repeticiones combinadas en la región promotora del gen de
timidilato sintasa se desea identificar. Por ejemplo, se conoce
bien un método para obtener ADN genómico a partir de células
sanguíneas extraídas de un sujeto. Se puede utilizar cualquier
método que pueda amplificar ADN de un modo específico de secuencia
de nucleótidos para amplificar ADN genómico. Cuando se amplifica
ADN, es suficiente con amplificar una región arbitraria que
contenga repeticiones combinadas en al menos la región promotora del
gen de timidilato sintasa. Más específicamente, se puede
seleccionar ADN genómico de al menos 90 pb que contiene repeticiones
combinadas como región para ser amplificada. Por ejemplo, cuando se
detecta la hibridación mediante análisis de curva de fusión usando
LightCycler como se describe más adelante, la longitud del ADN que
va a amplificarse normalmente es de 700 pb o menos.
El método de esta invención para identificar el
número de repeticiones combinadas en la región promotora del gen de
timidilato sintasa incluye la etapa de hibridar la sonda de mutación
al ADN genómico amplificado en condiciones restrictivas. Entre las
formas polimórficas en la región promotora del gen de timidilato
sintasa, la sonda de mutación se hibrida con 3R pero no con 2R. Por
tanto, usando la hibridación de la sonda de mutación como índice se
puede determinar el número de repeticiones combinadas. Para detectar
la hibridación de la sonda de mutación se puede usar un método
arbitrario de detección de hibridación de ADN.
En la presente invención, el análisis de curva
de fusión es el método preferido para detectar diferencias en las
secuencias de nucleótido usando hibridación de ADN. Determinados
oligonucleótidos se hibridan con polinucleótidos que tienen
secuencias complementarias. Aunque la hibridación de ADN es
específica de secuencia, es difícil excluir completamente
hibridaciones hacia secuencias de nucleótidos muy similares. El
análisis de curva de fusión es un método para detectar cambios en
la hibridación en base a los cambios en la temperatura de fusión
(Tf). El ADN de doble cadena (ADN cd) formado mediante hibridación
de secuencias de nucleótidos que son complementarias unas a otras,
se disocian gradualmente y se convierten en ADN de cadena sencilla
(ADN cs) cuando se eleva la temperatura. Si se representa
gráficamente la relación entre el cambio de ADN cd a ADN cs y el
cambio de temperatura, el cambio a ADN cs no es lineal, y se
produce bruscamente a una temperatura determinada. La temperatura a
la que se produce este cambio brusco a ADN cs es Tf. Tf cambia en
función de varios factores tales como la secuencia de nucleótidos y
la composición de la disolución en la que está el ADN. Sin embargo,
en condiciones específicas, Tf cambia claramente dependiendo de la
secuencia de nucleótidos, cuando existe una diferencia en una
secuencia de nucleótidos. Por tanto, las diferencias en la Tf de un
determinado oligonucleótido hacia una secuencia diana puede
detectarse fácilmente, incluso si la diferencia en la secuencia
diana es pequeña. El análisis de curva de fusión es un método que
facilita la detección sensible de pequeñas diferencias en las
secuencias de nucleótidos en base a diferencias en la Tf detectada
como se ha indicado antes.
Para llevar a cabo el método de esta invención
en base al análisis de la curva de fusión, se puede detectar la
diferencia en las Tfs de la sonda de mutación hacia 3R y 2R. En el
análisis de la curva de fusión debe observarse la hibridación de
una sonda de mutación hacia una secuencia diana. No hay limitaciones
en el método para observar la hibridación. En la presente
invención, un método preferido para observar la hibridación incluye
la aplicación de transferencia de energía de resonancia de
fluorescencia (FRET). La FRET es un método para detectar
hibridación utilizando el hecho de que dos oligonucleótidos que se
hibridan a regiones adyacentes sobre una secuencia diana se ponen
en estrecha proximidad uno respecto del otro debido a la
hibridación. Los extremos de los dos oligonucleótidos adyacentes
están etiquetados con diferentes fluoróforos que funcionan como un
dador o como un aceptor. Cuando los dos entran en estrecha
proximidad debido a la hibridación, se puede detectar una emisión
característica de fluorescencia debida a la transferencia de energía
entre los fluoróforos.
Para aplicar la FRET a los métodos de esta
invención, se necesita un segundo oligonucleótido que se hibride
con la región adyacente a la sonda de mutación que consiste en la
SEC ID Nº: 1 para detectar la hibridación de la sonda de mutación.
Los presentes inventores han descubierto que cuando se usa como
sonda de mutación el oligonucleótido que consiste en la SEC ID Nº:
1 que tiene las propiedades (a) y (b) mencionadas anteriormente, un
oligonucleótido que puede hibridarse con el lado 5' del mismo es
útil como segundo oligonucleótido. Más específicamente, también se
describe en la presente memoria un oligonucleótido aislado que se
hibrida con la región adyacente al lado 5' del oligonucleótido que
consiste en la SEC ID Nº: 1 que:
(a) es complementario a una región que consiste
en:
- (i)
- la unidad de repetición central de las tres unidades de repetición que componen la repetición combinada de la región promotora del gen de timidilato sintasa, y
- (ii)
- la unidad de repetición localizada hacia el extremo 3' de la unidad de repetición central, y
(b) se hibrida con la región de (a).
Dicho segundo oligonucleótido se aplica en los
métodos de la presente invención. En la presente invención, la
expresión "la región adyacente al lado 5' del oligonucleótido"
se refiere al lado 5' de la región con la que se hibrida el
oligonucleótido en el nucleótido diana. La expresión "adyacente
a" incluye el caso en el que los extremos del oligonucleótido y
del segundo oligonucleótido están separados por 1-10
bases, y preferiblemente por 0-5 bases. En la
presente invención, cuando se usa el segundo oligonucleótido para la
FRET, a veces es denominado sonda de anclaje. Es preferible que la
Tf de la sonda de anclaje sea la misma o superior a la Tf de la
sonda de mutación hacia una repetición combinada 3R. La relación
entre el ADN genómico y cada sonda está indicada en la Figura
1.
La hibridación de la sonda de mutación se puede
observar mediante FRET a la vez que se lleva a cabo la PCR. Es
decir, la hibridación de la sonda de mutación puede detectarse a la
vez que se amplifica el ADN genómico. Para detectar la hibridación
de la sonda de mutación durante la PCR, es preferible diseñar la Tf
de la sonda de mutación y de la sonda de anclaje de tal modo que la
hibridación con la ampliación se produzca durante la fase de
maduración de la PCR. Para ajustar la Tf a un intervalo apropiado se
pueden incluir bases no coincidentes en las secuencias de
nucleótidos de la sonda de mutación y de la sonda de anclaje.
Además, se prefiere que el extremo 3' de cada sonda se modifique
para evitar que la polimerasa de ADN extienda las sondas. Por
ejemplo, un oligonucleótido marcado en su extremo 5' con un
fluoróforo puede ser modificado en su extremo 3' mediante
fosforilación.
Existe disponible comercialmente un instrumento
que usa la FRET para detectar la hibridación de la sonda de
mutación durante la PCR. Por ejemplo, el LightCycler ^{TM} está
equipado con el mecanismo y el software necesario para analizar una
ampliación de PCR mediante FRET. La presente invención puede
llevarse a cabo usando dicho instrumento. A continuación se
describe un protocolo específico para llevar a cabo el método de
esta invención mediante un LightCycler ^{TM} usando la sonda de
mutación y la sonda de anclaje.
El ADN genómico que comprende repeticiones
combinadas en al menos la región promotora del gen de timidilato
sintasa se amplifica con cebadores específicos de ADN genómico
humano. La ampliación se detecta mediante fluorescencia usando la
sonda de mutación y la sonda de anclaje como un par específico de
Sondas de Hibridación. Las Sondas de Hibridación constan de dos
oligonucleótidos cortos diferentes que se hibridan con una secuencia
interna del fragmento amplificado durante la fase de maduración del
ciclo de PCR. Una sonda (sonda de mutación) es marcada en el
extremo 5' con LightCycler-Red 640, y para evitar la
extensión, se modifica en el extremo 3' mediante fosforilación. La
segunda sonda (sonda de anclaje) es marcada en el extremo 3' con
fluoresceína. Sólo después de la hibridación con la plantilla de
ADN las sondas quedan en estrecha proximidad, dando como resultado
una transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) entre
los dos fluoróforos. Durante la FRET, la fluoresceína, el
fluoróforo dador, es excitada por la fuente de luz del Instrumento
LightCycler, y parte de la energía de excitación es transferida a
LightCycler-Red 640, el fluoróforo aceptor.
Entonces, se mide la fluorescencia emitida del
LightCycler-Red 640 empleando el Instrumento
LightCycler.
El oligonucleótido que consiste en la secuencia
de nucleótidos de la SEC ID Nº: 1 proporcionada por la presente
invención también se usa para determinar el genotipo aplicando el
análisis de curva de fusión después de que se completen los ciclos
de amplificación y se haya producido la ampliación.
Los oligonucleótidos marcados con fluoresceína,
descritos también en la presente memoria, se hibridan con una parte
de la secuencia diana que no ha mutado y que actúa como una sonda de
anclaje.
El otro oligonucleótido, marcado con
LightCycler-Red 640, expande la unidad de repetición
(sonda de mutación). Esta última sonda tiene una menor temperatura
de fusión (Tf) que la sonda de anclaje, con lo que se asegura que
la señal fluorescente generada durante el análisis de curva de
fusión está determinada únicamente por la sonda de mutación. La Tf
no depende solo de la longitud y del contenido de G+C, sino que
también depende del grado de homología entre la sonda de mutación y
la plantilla de ADN. Cuando hay presente una repetición combinada
de tipo 2R, la falta de coincidencia entre la sonda de mutación y la
diana desestabiliza el híbrido. Con una repetición combinada de
tipo 3R, no hay falta de coincidencia y el híbrido presenta una
mayor Tf. La temperatura es aumentada lentamente y cuando la sonda
de mutación se funde y los dos colorantes fluorescentes ya no están
en estrecha proximidad, la fluorescencia disminuye. Para los
genotipos mutados, esto se producirá a una temperatura inferior a
la del genotipo natural. Recientemente se ha publicado la repetición
combinada de tipo 5R de la timidilato sintasa (Luo HR, Lu XM, Yao
YG, Oiré N, Takeishi K, Jorde LB, Zhang YP (2002) Length
polymorphism of thymidylate synthase regulatory region in chinese
populations and evolution of the novel alleles, Biochem Genet 40
(1-2): 41-51). La sonda de mutación
que consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 1
proporcionada por la presente invención se hibridará con la
repetición combinada de tipo 5R además de con la del tipo 3R. Sin
embargo, el hecho de que la sonda pueda distinguir entre el tipo 3R
y el tipo 5R no supone una diferencia significativa. La obtención
del genotipo y la predicción de la capacidad de respuesta de la
presente invención pueden llevarse a cabo siempre que la sonda pueda
distinguir el tipo 2R que posee una elevada capacidad de respuesta
respecto a otros tipos polimórficos.
Tal como se ha descrito anteriormente, el
genotipo del gen de timidilato sintasa se determina en base al
número de repeticiones combinadas obtenido mediante la presente
invención. Más específicamente, la presente invención proporciona
un método para obtener el genotipo del gen de timidilato sintasa de
un sujeto, comprendiendo dicho método:
(a) identificar el número de repeticiones
combinadas en la región promotora del gen de timidilato sintasa
empleando el método de la presente invención, y
(b) determinar que el genotipo de timidilato
sintasa del sujeto es "homocigoto 2R/2R" cuando el número de
repeticiones combinadas se identifica como sólo dos, "homocigoto
3R/3R" cuando el número de repeticiones combinadas se identifica
como solo tres, o "heterocigoto 2R/3R" cuando el número de
repeticiones combinadas se identifica como "dos" y como
"tres".
Existe un informe que usó el LightCycler para
obtener el genotipo de otros genes (Nicolas Von Ahsen y col.
Clinical Chemistry 46: 12, 1939-1945 (2000), DNA
base bulge vs unmatched end formation in probe-based
diagnostic insertion/deletion genotyping: Genotyping the UGT1A1
(TA)n polymorphism by real-time fluorescence
PCR). Sin embargo, el LightCycler no se ha usado para obtener el
genotipo del gen de timidilato sintasa antes de la presente
invención.
En base al genotipo de timidilato sintasa
elucidado se puede predecir la capacidad de respuesta de un sujeto
frente a un agente antitumoral que ataca la timidilato sintasa. Más
específicamente, la presente invención proporciona un método para
predecir la capacidad de respuesta de un sujeto frente a un agente
antitumoral que ataca timidilato sintasa, comprendiendo dicho
método:
(a) determinar el genotipo de timidilato sintasa
del sujeto mediante el método de la invención, y
(b) asociar el genotipo de timidilato sintasa
con la capacidad de respuesta del sujeto frente a un agente
antitumoral que ataca timidilato sintasa.
En la presente invención, la expresión
"predecir la capacidad de respuesta de un sujeto frente a un
agente antitumoral que ataca timidilato sintasa" se refiere a la
predicción del grado de actividad citotóxica de un agente
antitumoral que ataca timidilato sintasa en un determinado paciente
y/o en un tejido tumoral obtenido de un paciente. Tal como se ha
mencionado previamente, el genotipo de timidilato sintasa es un
factor fundamental que determina el nivel de expresión de
timidilato sintasa. Además, el nivel de expresión de timidilato
sintasa está relacionado con la capacidad de respuesta de un sujeto
frente a un agente antitumoral que ataca timidilato sintasa. Es
decir, el nivel de expresión de timidilato sintasa se correlaciona
inversamente con la capacidad de respuesta. Específicamente, en
base a la presente invención, se predice que un sujeto cuyo genotipo
de timidilato sintasa ha sido determinado como homocigoto 2R/2R
tiene una alta capacidad de respuesta. Es decir, en este sujeto se
predice que la actividad citotóxica del agente antitumoral que ataca
la timidilato sintasa es elevada. Por otro lado, se predice que un
sujeto cuyo genotipo ha sido determinado como heterocigoto 2R/3R u
homocigoto 3R/3R tiene una capacidad de respuesta normal. Es decir,
en este sujeto se predice que el agente antitumoral que ataca
timidilato sintasa tendrá una actividad citotóxica normal. La
expresión "actividad citotóxica normal" se refiere a una
condición en la que la posibilidad de tener efectos adversos graves
del fármaco no es elevada cuando el fármaco se administra de
acuerdo con un protocolo de administración normal. Alternativamente,
se refiere a una condición en la que no puede esperarse una acción
inhibidora de un fármaco sobre los tejidos tumorales a menos que la
dosis esté basada en un protocolo de administración normal.
En la presente invención, el agente antitumoral
que ataca timidilato sintasa incluye un agente antitumoral que
tiene una acción para ajustar la actividad de la timidilato sintasa
directa o indirectamente. Uno de los modos de acción de un agente
antitumoral de tipo 5-FU es inhibiendo la actividad
de la timidilato sintasa mediante su metabolito, FdUMP. La
timidilato sintasa es la enzima diana directa de los agentes
antitumorales tipo 5-FU. Por otro lado, también se
cree que la capacidad de respuesta frente al Metotrexato usado para
tratar la leucemia y similares está relacionada con el genotipo de
la timidilato sintasa (The Lancet Vol. 359,
1033-1034, 23 de Marzo de 2002). El Metotrexato es
un inhibidor de la dihidrofolato reductasa. Por otro lado, la
reacción catalizada por la timidilato sintasa requiere la reducción
de dihidrofolato. Es decir, el Metotrexato es un agente antitumoral
que inhibe indirectamente la timidilato sintasa. El método de esta
invención permite la predicción de la capacidad de respuesta frente
a dichos agentes antitumorales que presentan acciones inhibidoras
indirectas sobre la timidilato sintasa. Los ejemplos de agentes
antitumorales para los cuales la capacidad de respuesta puede
predecirse mediante el método de esta invención son
5-FU, Carmofur, Tegafur, UFT, S-1,
Doxifluridina, Capecitabina, Fludarabina, Metotrexato, Leucovorina y
Levofolinato.
En base a la capacidad de respuesta determinada
de este modo, se puede diseñar un método de quimioterapia para el
cáncer. Más específicamente, la presente invención se refiere a un
método para determinar la dosis y/o el tipo de un agente
antitumoral que ataca la timidilato sintasa para el tratamiento de
un paciente con cáncer, comprendiendo dicho método:
(a) determinar el genotipo de timidilato sintasa
del paciente mediante el método de la presente invención, y
(b) para un paciente "homocigoto 2R/2R"
decidir si: (i) administrar una dosis de agente antitumoral que sea
inferior a la dosis usada normalmente, ó (ii) usar un agente
antitumoral que tiene una diana diferente.
Para los pacientes que se ha predicho que tienen
una elevada capacidad de respuesta frente a un agente antitumoral
que ataca la timidilato sintasa, se recomienda disminuir la dosis
del agente antitumoral o seleccionar un agente antitumoral que
tenga una diana diferente. Como consecuencia puede disminuirse el
peligro de exponer al paciente a efectos adversos del fármaco.
Adicionalmente, la presente invención
proporciona un kit para identificar el número de repeticiones
combinadas en la región promotora del gen de timidilato sintasa,
kit que comprende:
(a) el oligonucleótido que consiste en la
secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 1, y
(b) un oligonucleótido que se hibrida con la
región adyacente al lado 5' del oligonucleótido de SEC ID Nº:
1.
Como se ha mencionado anteriormente, los
oligonucleótidos que constituyen el kit de esta invención pueden
marcarse con un fluoróforo para FRET. Además, se pueden combinar
factores adicionales con el kit de esta invención. Los ejemplos de
factores adicionales son:
tampón de hibridación,
muestra de control que da lugar al resultado de
2R y/o de 3R, y
polimerasa de ADN y sustancias para PCR.
La Figura 1 muestra la relación entre
repeticiones combinadas de 2R y 3R, y dos sondas que se hibridan con
las repeticiones combinadas. Las secuencias de nucleótidos de la
figura indican la sonda de anclaje (arriba), las repeticiones
combinadas de ADN genómico (en medio), y la sonda de mutación
(abajo). Las secuencias de las unidades de repetición están en
cursiva. Cada unidad de repetición está separada por un espacio.
Todas las secuencias se muestran como la secuencia de la cadena
sentido para facilitar la verificación de las secuencias. En
realidad, el ADN genómico y cada una de las sondas son secuencias
antisentido.
El ADN genómico se purificó a partir de 100
\muL de sangre humana entera. Para la purificación, se usó un Kit
de Purificación de ADN Genómico de Sangre GFX^{TM} (Amersham
Pharmacia Biotech).
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de Cebador Directo de PCR:
5'-GTG GCT CCT GCG TTT CCC C-3'
Secuencia de Cebador Inverso de PCR:
5'-TCC GAG CCG GCC ACA GGC AT-3'
Secuencia de Sonda de Hibridación (Anclaje):
5'-CGC GGA AGG GGT CCT GCC ACC GCG CCA CTT GGC CTG
CCT CGG TCC GCG CG-FITC-3'
Secuencia de Sonda de Hibridación (Mutación):
5'-LCRed640-CTT GGC CTG CCT CCG TCC
CGC CGC GCC-fosforilación-3'
Los cebadores fueron sintetizados por SAWADY
Technology Co., Ltd., y las sondas fueron sintetizadas por Nihon
Gene Research Laboratories, Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó el Kit
LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green I (Roche
Diagnostics). La mezcla de PCR se prepare a partir de las
siguientes composiciones:
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis se llevó a cabo usando el programa
de curvas de fusión de LightCycler. La fluorescencia se fijó en
F2/F1. El "Método de Cálculo" de la "Etapa 1: Picos de
Fusión" se fijó en "Lineal con Corrección de Fondo". Para
ajustar la línea base, el cursor del lado de baja temperatura
(Verde) se fijó alrededor de 62ºC y el cursor del lado de alta
temperatura se fijo en torno a 83ºC. Para calcular el área del pico
de fusión se selección "Etapa 2: Áreas de Picos", y se eligió
el número de picos para cada muestra para obtener el valor de Tf, el
área de pico y la desviación estándar.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó que una secuencia cuyo valor Tf de
pico era tan solo de 68-70ºC era homocigota 2R/2R, y
una secuencia cuyo valor Tf de pico era tan solo de
76-79ºC era homocigota 3R/3R. Se determinó que una
secuencia que tenía ambos valores Tf era heterocigota 2R/3R.
Se proporciona un oligonucleótido para obtener
el genotipo del gen de la timidilato sintasa. El número de
repeticiones combinadas de la región promotora del gen de timidilato
sintasa puede identificarse en base a la hibridación del
oligonucleótido que consiste en la SEC ID Nº: 1 con el ADN genómico.
La identificación basada en la hibridación es simple y rápida
comparada con la electroforesis de gel. Usando el oligonucleótido
que consiste en la SEC ID Nº: 1 proporcionada por esta invención, se
puede identificar fácilmente el número de repeticiones combinadas
usando las faltas de coincidencia como índices.
Por lo tanto, se puede determinar el genotipo
del gen de timidilato sintasa en base al número de repeticiones
combinadas. El genotipo se refiere a la capacidad de respuesta de un
sujeto frente a un agente antitumoral que ataca timidilato sintasa.
Por tanto, en base a la presente invención, es posible predecir la
capacidad de respuesta frente a un agente antitumoral que ataca
timidilato sintasa. Además, en base a la capacidad de respuesta
predicha de acuerdo con la presente invención, se puede diseñar un
método de quimioterapia contra el cáncer. Más específicamente, para
pacientes en los que se ha predicho que tienen una elevada capacidad
de respuesta frente a un agente antitumoral que ataca timidilato
sintasa, se recomienda disminuir la dosis del agente antitumoral o
seleccionar un agente antitumoral que tenga una diana diferente.
Como resultado, se puede reducir el peligro de exponer a un
paciente a los efectos adversos del fármaco.
<110> F Hoffmann-La Roche
AG
\vskip0.400000\baselineskip
<120> OLIGONUCLEOTIDE FOR GENOTYPING
THYMIDYLATE SYNTHASE GENE
\vskip0.400000\baselineskip
<130> RCJ-A0213P
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> ()..()
\vskip0.400000\baselineskip
<223> una secuencia de sonda sintetizada
artificialmente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> marcada con Red640
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttggcctgc ctccgtcccg ccgcgcc
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> ()..()
\vskip0.400000\baselineskip
<223> una secuencia de sonda sintetizada
artificialmente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (50)..(50)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> marcada con FITC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcggaaggg gtcctgccac cgcgccactt ggcctgcctc ggtcccgccg
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> ()..()
\vskip0.400000\baselineskip
<223> una secuencia de cebador sintetizada
artificialmente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtggctcctg cgtttcccc
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> ()..()
\vskip0.400000\baselineskip
<223> una secuencia de cebador sintetizada
artificialmente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccgagccgg ccacaggcat
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (11)
1. Un oligonucleótido que consiste en la SEC ID
Nº: 1.
2. Un método in vitro para identificar el
número de repeticiones combinadas en la región promotora del gen de
timidilato sintasa, método que comprende:
(a) amplificar un ADN genómico que comprende
repeticiones combinadas en al menos la región promotora del gen de
timidilato sintasa;
(b) hibridar el oligonucleótido de la
reivindicación 1 con el ADN genómico amplificado de la etapa (a) en
condiciones restrictivas;
(c) detectar una hibridación entre el
oligonucleótido y el ADN genómico; y
(d) identificar el número de repeticiones
combinadas como "dos" si no se detecta hibridación, e
identificar el número de repeticiones combinadas como "tres"
si se detecta la hibridación.
3. El método de la reivindicación 2, que además
comprende;
(e) hibridar el oligonucleótido de la
reivindicación 1 con el ADN genómico amplificado de la etapa (a) en
condiciones de hibridación que son menos restrictivas que las de la
etapa (b);
(f) detectar una hibridación entre el
oligonucleótido y el ADN genómico; y
(g) identificar el número de repeticiones
combinadas como "dos" si no se detecta hibridación en la etapa
(c), pero sí se detecta en la etapa (f),
(h) identificar el número de repeticiones
combinadas como "tres" si se detecta hibridación en la etapa
(c), pero no en la etapa (f),
(i) identificar el número repeticiones
combinadas como "dos" y "tres" si se detecta hibridación
en la etapa (c) y se detecta hibridación en la etapa (f).
4. El método de las reivindicaciones 2 ó 3, en
el que la hibridación se detecta mediante análisis de curva de
fusión.
5. El método de la reivindicación 4, que
comprende la etapa de detectar transferencia de energía de
resonancia fluorescente usando
(i) el oligonucleótido de la reivindicación 1,
en el que el extremo 5' del oligonucleótido está marcado con un
colorante fluorescente; y
(ii) un segundo oligonucleótido que se hibrida
con la región adyacente al lado 5' del oligonucleótido de (i), en
donde el extremo 3' del segundo oligonucleótido está marcado con un
colorante fluorescente diferente que transfiere energía de
resonancia fluorescente al colorante fluorescente del extremo 5' del
oligonucleótido de (i).
6. El método de la reivindicación 5, en el que
el colorante fluorescente que marca el oligonucleótido de (i) es
RED640 ó RED705, y el colorante fluorescente que marca el
oligonucleótido de (ii) es FITC.
7. Un método in vitro para obtener el
genotipo del gen de timidilato sintasa de un sujeto, método que
comprende:
(a) identificar el número de repeticiones
combinadas en la región promotora del gen de timidilato sintasa
mediante el método de la reivindicación 3; y
(b) determinar que el genotipo de timidilato
sintasa del sujeto es "homocigoto 2R/2R" si el número de
repeticiones combinadas se identifica como sólo "dos",
"homocigoto 3R/3R" si el número de repeticiones combinadas se
identifica como sólo "tres", ó "heterocigoto 2R/3R" si el
número de repeticiones combinadas se identifica como ambos,
"dos" y "tres".
8. Un método in vitro para predecir la
capacidad de respuesta de un sujeto frente a un agente antitumoral
que ataca a timidilato sintasa, método que comprende:
(a) determinar el genotipo de timidilato sintasa
del sujeto mediante el método de la reivindicación 7; y
(b) asociar el genotipo de timidilato sintasa a
la capacidad de respuesta del sujeto frente a un agente antitumoral
que ataca a la timidilato sintasa.
9. Un método in vitro para determinar la
dosis y/o el tipo de agente antitumoral que ataca a timidilato
sintasa para tratar a un paciente de cáncer, método que
comprende:
(a) determinar el genotipo de timidilato sintasa
del paciente mediante el método de la reivindicación 7; y
(b) para un paciente "homocigoto 2R/2R"
decidir si
- (i)
- administrar una dosis de agente antitumoral que sea inferior a la dosis usada normalmente; o
- (ii)
- usar un agente antitumoral que tenga una diana diferente.
10. Un kit para identificar el número de
repeticiones combinadas en la región promotora del gen de timidilato
sintasa, kit que comprende:
(i) el oligonucleótido de la reivindicación 1;
y
(ii) un segundo oligonucleótido que se hibrida
con la región adyacente al lado 5' del oligonucleótido de (i).
11. El kit de la reivindicación 10, en el que el
extremo 5' del oligonucleótido de (i) está marcado con el colorante
fluorescente RED640 ó RED705, y el extremo 3' del oligonucleótido de
(ii) está marcado con el colorante fluorescente FITC.
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