JP4401416B2 - Pcr中のハイブリダイゼーションのモニタリング - Google Patents
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- Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
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Description
前記標的配列の隣接領域にハイブリダイゼーションする2種類の核酸プローブの存在下でポリメラーゼ連鎖反応法により前記標的配列を増幅し、前記プローブの一方はアクセプターフルオロフォアで標識し前記プローブの他方は蛍光エネルギー転移対のドナーフルオロフォアで標識して前記2種類のプローブと前記標的配列とのハイブリダイゼーション時に前記ドナーフルオロフォアとアクセプターフルオロフォアは互いに25核酸以内にあり、前記ポリメラーゼ連鎖反応には前記標的核酸配列に対する熱安定性ポリメラーゼ及びプライマーを前記生物学的サンプルに添加するステップと、少なくとも変性温度と伸長温度との間で前記生物学的サンプルを熱サイクルするステップとを含む増幅ステップと、
前記ドナーフルオロフォアによって吸収される波長の光で前記生物学的サンプルを励起して前記蛍光エネルギー転移対からの発光を検出するステップと、
を含むことを特徴とする。
前記標的配列の隣接領域にハイブリダイゼーションする2種類の核酸プローブの存在下でポリメラーゼ連鎖反応法により前記標的配列を増幅し、前記プローブの一方はアクセプターフルオロフォアで標識し前記プローブの他方は蛍光エネルギー転移対のドナーフルオロフォアで標識して前記2種類のプローブと前記標的配列とのハイブリダイゼーション時に前記ドナーフルオロフォアとアクセプターフルオロフォアは互いに25核酸以内にあり、前記ポリメラーゼ連鎖反応には前記標的核酸配列に対する熱安定性ポリメラーゼ及びプライマーを前記生物学的サンプルに添加するステップと、少なくとも変性温度と伸長温度との間で前記生物学的サンプルを熱サイクルするステップとを含む増幅ステップと、
前記ドナーフルオロフォアによって吸収される波長の光で前記生物学的サンプルを励起するステップと、
前記蛍光エネルギー転移対からの温度依存性蛍光をモニタするステップと、
を含むことを特徴とする。
(a)前記生物学的サンプルに2種類の核酸プライマーと核酸プローブとの有効量を添加し、前記プライマーの一方と前記プローブは各々がアクセプターフルオロフォアとドナーフルオロフォアとを含む蛍光エネルギー転移対の一方の構成要素で標識され、前記標識されたプローブは前記標識されたプライマーの15ヌクレオチド以内の標的核酸配列の増幅コピーとハイブリダイゼーションするステップと、
(b)ポリメラーゼ連鎖反応により前記標的核酸配列を増幅するステップと、
(c)前記ドナーフルオロフォアによって吸収される選択波長の光で前記生物学的サンプルを照射するステップと、
(d)前記サンプルの蛍光発光を検出するステップと、
を含むことを特徴とする。
(a)前記生物学的サンプルに核酸結合性蛍光体の有効量を添加するステップと、
(b)ポリメラーゼ連鎖反応を用いて前記標的核酸配列を増幅するステップであって、初期の所定温度と時間パラメータを用いて前記生物学的サンプルを熱サイクルし、さらに、
(i)前記ポリメラーゼ連鎖反応中の蛍光体によって吸収される光の選択波長で前記生物学的サンプルを照射するステップと、
(ii)前記サンプルからの蛍光をモニタして前記ポリメラーゼ連鎖反応の最適温度及び時間パラメータを決定するステップと、
(iii)前記蛍光により前記初期温度及び時間を調節するステップと、
を含むことを特徴とする。
(a)前記生物学的サンプルに前記標的核酸配列とハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチド・プローブの対の有効量を添加し、前記プローブの一方はアクセプターフルオロフォアで標識され、他方のプローブは蛍光エネルギー転移対のドナーフルオロフォアで標識され、前記ドナーフルオロフォアの発光スペクトルと前記アクセプターフルオロフォアの吸収スペクトルは25%未満で重なり合い、前記アクセプターフルオロフォアは100,000M-1cm-1より大きいピーク減衰係数を有し2種類のプローブのハイブリダイゼーション時には前記ドナーフルオロフォアとアクセプターフルオロフォアは互いに25ヌクレオチド以内にあるステップと、
(b)前記ドナーフルオロフォアによって吸収される光の選択波長で前記生物学的サンプルを照射するステップと、
(c)前記生物学的サンプルの発光を検出するステップと、
を含むことを特徴とする。
前記標的配列の隣接領域とハイブリダイゼーションする2種類の核酸プローブの存在下でポリメラーゼ連鎖反応により前記標的配列を増幅し、前記プローブの一方はアクセプターフルオロフォアで標識され前記他方のプローブは蛍光エネルギー転移対のドナーフルオロフォアで標識されて、前記2種類のプローブと前記標的配列のハイブリダイゼーション時に、前記ドナーフルオロフォアと前記アクセプターフルオロフォアは互いに25ヌクレオチド以内にあり、前記ポリメラーゼ連鎖反応は前記標的核酸配列の熱安定性ポリメラーゼとプライマーを前記生物学的サンプルに添加するステップと、少なくとも変性温度と伸長温度の間で前記生物学的サンプルを熱サイクルするステップとを含むステップと、
前記ドナーフルオロフォアにより吸収される波長の光で前記生物学的サンプルを励起して前記生物学的サンプルからの発光を検出するステップと、
前記蛍光エネルギー転移対からの温度依存性蛍光をモニタするステップと、
を含むことを特徴とする。
SYBRTMグリーンIの存在下にポリメラーゼ連鎖反応により前記標的配列を増幅し、前記ポリメラーゼ連鎖反応は前記標的核酸配列の熱安定性ポリメラーゼとプライマーとを前記生物学的サンプルに添加するステップと、少なくとも変性温度と伸長温度の間で前記生物学的サンプルを熱サイクルするステップを含むステップと、
前記SYBRTMグリーンIによって吸収される波長の光で前記生物学的サンプルを励起して前記生物学的サンプルからの発光を検出するステップと、
前記SYBRTMグリーンIからの温度依存性蛍光をモニタするステップと、を含むことを特徴とする。望ましくは、前記モニタするステップは前記増幅された標的配列の解離プロファイルを決定するステップを含む。
(a)2種類の核酸プライマーと核酸プローブとの有効量を前記生物学的サンプルに添加し、前記プライマーの一方と前記プローブは各々がアクセプターフルオロフォアとドナーフルオロフォアからなる蛍光エネルギー転移対の一方の構成要素で標識され、前記標識されたプローブは前記標識されたプライマーから15ヌクレオチド以内の前記標的核酸配列の増幅コピーとハイブリダイゼーションするステップと、
(b)ポリメラーゼ連鎖反応により前記標的核酸配列を増幅するステップと、
(c)前記ドナーフルオロフォアによって吸収される選択波長の光で前記生物学的サンプルを照射して前記サンプルの蛍光発光を検出するステップと、を含むことを特徴とする。別の図示した実施例において、本方法はさらに、望ましくは前記増幅した標的配列の解離温度を決定することによって、前記サンプルの温度依存性蛍光をモニタするステップを含む。
(a)ポリメラーゼ連鎖反応により、前記第1の核酸の選択したセグメントと前記第2の核酸のこれに対応するセグメントとを増幅するように構成したオリゴヌクレオチド・プライマーの対を提供し、前記選択したセグメントとこれに対応するセグメントは各々が前記選択した遺伝子座を含み、前記選択した遺伝子座のコピーを含む増幅生成物が得られるようにするステップと、
(b)オリゴヌクレオチド・プローブの対を提供し、前記プローブの一方はアクセプターフルオロフォアで標識し前記プローブの他方は蛍光共鳴エネルギー転移対のドナーフルオロフォアで標識しておき前記2種類のプローブと前記増幅生成物のハイブリダイゼーション時に前記ドナーフルオロフォアとアクセプターフルオロフォアが共鳴エネルギー転移の関係にあるようにし、前記プローブの一方は前記増幅生成物とハイブリダイゼーションするように構成されて前記プローブの前記一方が前記選択された遺伝子座に広がり前記第1の核酸において前記第2の核酸の解離プロファイルとは識別可能な差が存在する場合に解離プロファイルを示すようにするステップと、
(c)前記第1の核酸の前記選択したセグメントと前記第2の核酸の前記これに対応するセグメントとを有効量のプローブの存在下にポリメラーゼ連鎖反応によって増幅し、増幅された選択セグメントと増幅された対応セグメントが得られるようにし、その少なくとも一部分は共鳴エネルギー転移関係にある蛍光共鳴エネルギー転移対でこれらにハイブリダイゼーションされた両方のプローブを有するステップと、
(d)ハイブリダイゼーションされたプローブを有する前記増幅された選択セグメントと前記増幅された対応セグメントとを選択された波長の光で照射して前記蛍光共鳴エネルギー転移対による蛍光を照射させるステップと、
(e)温度の関数として蛍光発光を測定して第1の核酸の前記増幅選択セグメントから解離する前記一方のプローブの第1の解離プロファイルと第2の核酸の前記増幅対応セグメントから解離する前記一方のプローブの第2の解離プロファイルにおいて決定するステップと、
(f)前記第1の解離プロファイルを前記第2の解離プロファイルと比較し、ここでの相違が前記サンプル核酸における相違の存在を示すようにするステップと、
を含むことを特徴とする。
(a)ポリメラーゼ連鎖反応により、前記第1の核酸の選択されたセグメントと前記第2の核酸のこれに対応するセグメントとを増幅するように構成したオリゴヌクレオチド・プライマーの対を提供し、前記選択セグメントと対応セグメントの各々が前記選択された遺伝子座を含み、前記選択された遺伝子座のコピーを含む増幅生成物を得るようにするステップと、
(b)オリゴヌクレオチド・プローブを提供し、前記プライマーの一方と前記プローブとが各々ドナーフルオロフォアとアクセプターフルオロフォアとを含む蛍光エネルギー転移対の一方の構成要素で標識され、前記標識されたプローブと標識されたプライマーは前記増幅生成物とハイブリッド化して前記ドナーフルオロフォアとアクセプターフルオロフォアとが共鳴エネルギー転移関係に置かれるようにし、前記プローブは前記増幅生成物とハイブリッド化するように構成されて前記プローブは前記選択された遺伝子座に広がり前記第2の核酸の解離プロファイルから識別できる前記第1の核酸に相違が存在する場合には解離プロファイルを示すステップと、
(c)前記第1の核酸の選択セグメントと前記第2の核酸のこれに対応するセグメントとをポリメラーゼ連鎖反応により有効量のプライマー及びプローブの存在下にて増幅し増幅された選択セグメントと増幅された対応セグメントを得るようにし、その少なくとも一部分は共鳴エネルギー転移関係にある前記蛍光共鳴エネルギー転移対によりこれらにハイブリダイゼーションされた標識プライマー及びプローブを有するステップと、
(d)前記標識プライマー及びプローブがハイブリッド化された前記増幅選択セグメントと前記増幅対応セグメントを選択した波長で照射して前記蛍光共鳴エネルギー転移対による蛍光を照射するステップと、
(e)前記第1の核酸の前記増幅選択セグメントから解離する前記プローブの第1の解離プロファイルと前記第2の核酸の前記増幅対応セグメントから解離する前記プローブの第2の解離プロファイルとを決定するステップと、
(f)前記第1の解離プロファイルと前記第2の解離プロファイルとを比較して、相違が前記サンプル核酸に置ける相違の存在を表わすステップと、
を含むことを特徴とする。
(a)前記個人からサンプルとなるゲノムDNAを採得するステップと、
(b)ポリメラーゼ連鎖反応により前記突然変異対立遺伝子の第1の選択したセグメントと前記これに対応する基準対立遺伝子の第2の選択したセグメントを増幅するように構成されたオリゴヌクレオチド・プライマーの対を提供し、前記第1と第2の選択されたセグメントとの両方ともが前記選択された遺伝子座を含むステップと、
(c)オリゴヌクレオチド・プローブの対を提供し、前記プローブの一方はアクセプターフルオロフォアで標識し前記プローブの他方は蛍光共鳴エネルギー転移対のドナーフルオロフォアで標識して前記増幅した第1と第2の選択セグメントと前記2種類のプローブのハイブリダイゼーション時に前記プローブの一方は前記選択された遺伝子座に広がり前記増幅された第2の選択セグメントによる第2の解離プロファイルから識別可能な前記増幅された第1の選択セグメントによる第1の解離プロファイルを示すようにするステップと、
(d)ポリメラーゼ連鎖反応により有効量のプローブの存在下でサンプル・ゲノムDNAの前記第1と第2の選択セグメントを増幅して増幅された第1と第2の選択セグメントを得るようにし、少なくともその一部分が両方とも共鳴エネルギー転移関係にある蛍光共鳴エネルギー転移対によりこれらにハイブリダイゼーションされたプローブを有するステップと、
(e)選択した波長の光によりハイブリダイゼーションされたプローブを有する前記増幅された第1と第2の選択セグメントを照射して、前記ドナーとアクセプターによる蛍光を照射するステップと、
(f)温度の関数として蛍光発光を測定して、前記増幅した第1の選択セグメントから解離する前記一方のプローブの第1の解離プロファイルと前記増幅した第2の選択セグメントから解離する前記一方のプローブの第2の解離プロファイルとを決定するステップと、
(g)前記第1の解離プロファイルと前記第2の解離プロファイルとを比較して、識別可能な解離プロファイルが前記サンプル・ゲノムDNAのヘテロ接合性を表わすようにするステップと、
を含むことを特徴とする。
(a)前記個人からサンプル・ゲノムDNAを採得するステップと、
(b)ポリメラーゼ連鎖反応によって前記突然変異対立遺伝子の第1の選択されたセグメントと前記これに対応する基準対立遺伝子の第2の選択されたセグメントを増幅するように構成されたオリゴヌクレオチド・プライマーの対を提供し、前記第1と第2の選択セグメントにはどちらも前記選択された遺伝子座を含むステップと、
(c)オリゴヌクレオチド・プローブを提供し、前記プライマーの一方と前記プローブは各々ドナーフルオロフォアとアクセプターフルオロフォアとを含む蛍光エネルギー転移対の一方の構成要素で標識され、前記標識されたプローブと標識されたプライマーは前記増幅された第1と第2の選択セグメントにハイブリダイゼーションして前記プローブの一方が前記選択された遺伝子座に広がり前記増幅された第2の選択セグメントによる第2の解離プロファイルから識別可能な前記増幅された第1の選択セグメントによる第1の解離プロファイルを示すようにするステップと、
(d)有効量のプライマー及びプローブの存在下でポリメラーゼ連鎖反応によりサンプル・ゲノムDNAの第1と第2の選択されたセグメントを増幅して増幅された第1と第2の選択セグメントを得るようにし、少なくともその一部分は共鳴エネルギー転移関係にある蛍光共鳴エネルギー転移対によりこれらにハイブリダイゼーションされた標識プライマー及びプローブを有するようにするステップと、
(e)前記標識したプライマーとプローブがハイブリダイゼーションされている前記増幅した第1と第2の選択セグメントを選択した波長の光で照射して前記ドナー及びアクセプターによる蛍光を照射するステップと、
(f)温度の関数として蛍光発光を測定して前記増幅した第1の選択セグメントから解離する前記プローブの第1の解離プロファイルと前記増幅した第2の選択セグメントから解離する前記プローブの第2の解離プロファイルとを決定するステップと、
(g)前記第1の解離プロファイルと前記第2の解離プロファイルを比較し、識別可能な解離プロファイルは前記サンプル・ゲノムDNAのヘテロ接合性を表わすステップと、
を含むことを特徴とする。
(a)前記混合物に(1)蛍光共鳴エネルギー転移対の共鳴エネルギー転移ドナー又は共鳴エネルギー転移アクセプターで標識され、選択された温度条件と単価イオン強度で前記増幅生成物にハイブリダイゼーションするように構成された有効量のオリゴヌクレオチド・プローブと、(2)前記ドナー又は前記アクセプターで標識され、前記プローブと基準オリゴヌクレオチドの間で一方が前記ドナーで標識され他方が前記アクセプターで標識され、前記基準オリゴヌクレオチドは前記選択された温度及び単価イオン強度の条件下で前記増幅生成物にハイブリダイゼーションするように構成されて前記プローブと前記基準オリゴヌクレオチドが両方とも前記増幅生成物にハイブリダイゼーションする場合前記ドナー及び前記アクセプターが共鳴エネルギー転移関係にあるようにする有効量の基準オリゴヌクレオチドとを添加するステップと、
(b)前記核酸の選択セグメントをポリメラーゼ連鎖反応によって増幅して前記増幅生成物を得るようにし、少なくともその一部分は共鳴エネルギー転移関係にある蛍光共鳴エネルギー転移対によりこれらにハイブリダイゼーションされた前記プローブと前記基準オリゴヌクレオチドの両方を有するようにするステップと、
(c)選択した波長の光でハイブリダイゼーションされたプローブと基準オリゴヌクレオチドとを有する前記増幅生成物を照射して前記蛍光共鳴エネルギー対による蛍光を照射させ、蛍光発光をモニタして、前記蛍光発光が前記反応の完了を表わすプラトー・フェーズに達した時点でサイクルを決定するステップと、
を含むことを特徴とする。
(a)前記混合物に有効量の核酸結合蛍光染料を添加するステップと、
(b)前記核酸結合蛍光染料が添加された前記混合物でポリメラーゼ連鎖反応により前記選択した核酸セグメントを増幅して核酸結合蛍光染料が結合した前記増幅生成物を得るステップと、
(c)核酸結合蛍光染料が結合している増幅生成物に選択した波長の光を照射してここからの蛍光を照射し、蛍光発光をモニタして、前記蛍光発光が前記反応の完了を表わすプラトー・フェーズに達した時点でサイクルを決定するステップと、
を含むことを特徴とする。望ましくは、核酸結合蛍光染料はSYBRTMグリーンI、臭化エチジウム、ピコグリーン、アクリジン・オレンジ、チアゾール・オレンジ、YO−PRO−1、クロモマイシンA3から構成されるグループから選択した構成要素とし、さらに望ましくはSYBRTMグリーンIとする。
(a)選択した波長の光で前記反応を照射して前記蛍光染料からの蛍光を照射させ前記反復アニーリング、伸長、変性フェーズの間に蛍光を連続モニタするステップと、
(b)少なくとも、
(i)前記伸長フェーズの間に蛍光が増加を停止する持続時間、又は
(ii)前記変性フェーズの間に前記蛍光が基線レベルまで減少する持続時間、又は、
(iii)前記伸長フェーズの間に前記蛍光が所定のレベルに達した回数
を決定するステップと、
(c)前記伸長フェーズの間に蛍光が増加を停止する時間の長さに基づいた前記伸長フェーズの長さ、前記変性フェーズの間に蛍光が前記基線レベルまで減少した時間の長さに基づいた前記変性フェーズの長さ、又は前記伸長フェーズの間に蛍光が前記所定レベルに達したサイクル数に基づくサイクル数を調節するステップと、
を含むことを特徴とする。
(a)前記増幅生成物の既知の濃度のハイブリダイゼーションのレートをモニタすることにより選択した温度と反応条件での前記増幅生成物での2次速度定数を決定するステップと、
(b)前記増幅生成物の未知の濃度でのアニーリング速度を決定するステップと、
(c)前記アニーリング速度と前記2次速度定数から前記増幅生成物の濃度を計算するステップと、
を含むことを特徴とする。望ましくは、アニーリング速度は多数の増幅サイクルの後で決定される。2次速度定数を決定する1つの代表的な方法は、既知の濃度の前記増幅生成物と有効量の二重鎖特異性蛍光染料とを含む第1のポリメラーゼ連鎖反応混合物の温度を、前記増幅生成物の変性温度以上に上昇して変性増幅生成物を得るステップと、
前記既知の量の変性増幅生成物を含む前記第1のポリメラーゼ連鎖反応混合物の温度を、前記増幅生成物の変性温度以下の選択した温度まで急冷すると同時に時間の関数として前記第1のポリメラーゼ連鎖反応混合物の蛍光を連続モニタするステップと、
極大蛍光、極小蛍光、極小蛍光の時間、及び増幅生成物の既知の濃度での2次速度定数を決定するため、式:
(ただし、Fは蛍光、Fmaxは極大蛍光、Fminは極小蛍光、kは2次速度定数、t0はFminでの時間、[DNA]は前記増幅生成物の既知の濃度である)から時間の関数として蛍光をプロットするステップと、
を含むことを特徴とする。
(a)(i)ポリメラーゼ連鎖反応において前記選択したテンプレートの選択したセグメントと相補的テンプレートのこれに対応する選択したセグメントを増幅してこれらの増幅生成物を得るように構成したオリゴヌクレオチド・プライマーの対の各々の有効量と、
(ii)蛍光共鳴エネルギー転移対の共鳴エネルギー転移ドナー又は共鳴エネルギー転移アクセプターで標識された有効量のオリゴヌクレオチド・プローブであって、前記プローブが前記競合的テンプレートの増幅生成物から解離する解離温度から識別可能な解離温度での前記選択したテンプレートの増幅生成物から解離するように前記増幅生成物にハイブリダイゼーションするように構成されている前記プローブと、
(iii)前記プローブと転移オリゴヌクレオチドの間で一方が前記ドナーにより標識され他方が前記アクセプターにより標識されているとして、前記ドナー又は前記アクセプターで標識された有効量の基準オリゴヌクレオチドであって、前記基準オリゴヌクレオチドは前記プローブと前記基準オリゴヌクレオチドの両方が前記増幅生成物にハイブリダイゼーションする場合に前記ドナーと前記アクセプターが共鳴エネルギー転移関係になるように前記増幅生成物にハイブリダイゼーションするよう構成されたオリゴヌクレオチドと、
を含む反応混合物において、
ポリメラーゼ連鎖反応により、未知の量の選択したテンプレートと既知の量の前記競合的テンプレートを増幅して前記増幅生成物を得るステップと、
(b)前記反応混合物を選択した波長の光で照射して蛍光共鳴エネルギー転移対による蛍光を照射させ、反応混合物の温度が変化して前記選択したテンプレートの前記増幅生成物から解離する前記プローブの第1の解離曲線と前記競合的テンプレートから解離する前記プローブの第2の解離曲線とを得る場合に温度の関数として蛍光発光を決定するステップと、
(c)前記第1と第2の解離曲線から第1と第2の解離ピークに変換して当該解離ピークから前記選択したテンプレートと前記競合的テンプレートの相対量を決定するステップと、
(d)前記既知の量の前記競合的テンプレートと、前記選択したテンプレート及び競合的テンプレートの相対量とに基づいて前記選択したテンプレートの濃度を計算するステップと、
を含むことを特徴とする。
(a)(i)ポリメラーゼ連鎖反応において前記選択したテンプレートの選択した第1のセグメントを増幅して増幅した第1の生成物を得るように構成された第1のオリゴヌクレオチド・プライマー対の各々の有効量と、
(ii)ポリメラーゼ連鎖反応において基準テンプレートの選択した第2のセグメントを増幅して増幅した第2の生成物を得るように構成された第2のオリゴヌクレオチド・プライマー対の各々の有効量と、
(iii)核酸結合蛍光染料の有効量と、
を含む反応混合物において、
ポリメラーゼ連鎖反応により、未知の量の前記選択したテンプレートを増幅して前記増幅した第1の生成物を得る及び既知の量の前記基準テンプレートを増幅して前記増幅した第2の生成物を得るステップと、
(b)選択した波長の光で前記反応混合物を照射して核酸結合蛍光染料による蛍光を照射させ、温度の関数として発光された蛍光を連続的にモニタして第1の生成物と第2の生成物が異なる温度で解離するような前記増幅生成物の解離曲線を得るステップと、
(c)前記解離曲線を解離ピークに変換して当該解離ピークから前記選択したテンプレートと前記基準テンプレートの相対量を決定するステップと、
(d)前記既知の量の前記基準テンプレートと選択したテンプレート及び基準テンプレートの相対量とに基づいて前記選択したテンプレートの濃度を計算するステップと、
を含むことを特徴とする。
(a)(i)ポリメラーゼ連鎖反応において前記選択したテンプレートの選択した第1のセグメントを増幅して増幅された第1の生成物を得るように構成された第1のオリゴヌクレオチド・プライマー対の各々の有効量と、
(ii)ポリメラーゼ連鎖反応において、陽性対照テンプレートの選択された第2のセグメントを増幅して増幅された第2の生成物を得るように構成された第2のオリゴヌクレオチド・プライマー対の各々の有効量と、
(iii)有効量の核酸結合蛍光染料と、
を含む反応混合物において、
前記選択したテンプレートと前記陽性対照テンプレートをポリメラーゼ連鎖反応によって増幅するための条件に前記選択したテンプレートと前記陽性対照テンプレートをさらすステップと、
(b)前記反応混合物を選択した波長の光で照射して核酸結合蛍光染料による蛍光を照射し、前記ポリメラーゼ連鎖反応の増幅サイクル中に温度の関数として発光される蛍光を連続的にモニタして前記選択したテンプレートが増幅される場合前記増幅された第1の生成物の第1の解離ピークを、また前記陽性対照テンプレートが増幅される場合前記増幅された第2の生成物の第2の解離ピークを取得するステップとを含み、
前記第2の解離曲線の取得はポリメラーゼ連鎖反応が作用したことを表わし、前記第1の解離曲線の取得は前記選択した第1のセグメントが増幅可能であることを表わし、前記第1の解離曲線が欠如していることは前記選択した第1のセグメントが増幅不可能であることを表わすことを特徴とする。
(a)前記個人からサンプル・ゲノムDNAを採得するステップと、
(b)対照として野生型ゲノムDNAを提供するステップと、
(c)前記サンプル・ゲノムDNAと前記野生型ゲノムDNAの選択したセグメントをポリメラーゼ連鎖反応によって増幅するように構成されたオリゴヌクレオチド・プライマーの対を提供し、前記選択したセグメントは第V因子ライデン変異遺伝子座を含み、第V因子ライデン変異遺伝子座のコピーを含む増幅生成物を得るステップと、
(d)蛍光共鳴エネルギー転移対の共鳴エネルギー転移ドナー又は共鳴エネルギー転移アクセプターで標識されたオリゴヌクレオチド・プローブを提供し、前記プローブは前記増幅された生成物にハイブリダイゼーションするように構成されて前記プローブが前記変異遺伝子座に広がり前記サンプル・ゲノムDNAに前記野生型ゲノムDNAの解離プロファイルから区別できる第V因子ライデン変異が存在する場合解離プロファイルを示すステップと、
(e)共鳴エネルギー転移ドナー又は共鳴エネルギー転移アクセプターで標識された転移オリゴヌクレオチドを提供し、前記プローブと転移オリゴヌクレオチドの間で一方が共鳴エネルギー転移ドナーで標識され他方が共鳴エネルギー転移アクセプターで標識されているとして、前記転移オリゴヌクレオチドは前記増幅生成物にハイブリダイゼーションするように構成して前記プローブと前記転移オリゴヌクレオチドの両方が前記増幅生成物にハイブリダイゼーションする場合に共鳴エネルギー転移ドナーと共鳴エネルギー転移アクセプターが共鳴エネルギー転移関係にあるようにするステップと、
(f)有効量のオリゴヌクレオチド・プローブと転移オリゴヌクレオチドの存在下でサンプル・ゲノムDNAと野生型ゲノムDNAの前記選択したセグメントをポリメラーゼ連鎖反応により増幅して、増幅された選択セグメントを得るようにし、少なくともその一部分は共鳴エネルギー転移関係にある蛍光共鳴エネルギー転移対によりこれらにハイブリダイゼーションされた前記プローブと前記転移オリゴヌクレオチドの両方を有するようにするステップと、
(g)前記ポリメラーゼ連鎖反応の増幅サイクルの間の温度の関数として蛍光を測定してサンプル・ゲノムDNAの前記増幅セグメントから解離する前記プローブの解離プロファイルと前記野生型ゲノムDNAの増幅セグメントから解離する前記プローブの解離プロファイルとを取得するステップと、
(h)前記サンプル・ゲノムDNAについての前記解離プロファイルを前記野生型ゲノムDNAについての前記解離プロファイルと比較し、これらの差が前記サンプル・ゲノムDNAにおける第V因子ライデン変異の存在を表わすステップと、
を含むことを特徴とする。
(a)分析すべき核酸サンプルと核酸結合蛍光体とを含む混合物を提供するステップと、
(b)温度を≧毎秒0.1℃の速度で変化させながら蛍光をモニタするステップと、
を含むことを特徴とする。
(a)ポリメラーゼ連鎖反応により既知の濃度の少なくとも一つの標準を、前記標準と核酸結合蛍光体とを含む混合物中で増幅するステップと、
(b)サイクル数の関数として蛍光を測定して一組のデータ点を得るステップと、
(c)初期核酸濃度とサイクル数の関数として蛍光を記述する任意の所定の式に前記データ点を当てはめるステップと、
(d)前記サンプルと前記核酸結合蛍光体とを含む混合物中で未知の量の核酸を含む前記サンプルを増幅してこれの蛍光をモニタするステップと、
(e)ステップ(c)で求めた式から初期核酸濃度を決定するステップと、
を含むことを特徴とする。
核酸結合蛍光体の存在下でポリメラーゼ連鎖反応により前記標的配列を増幅し、前記ポリメラーゼ連鎖反応には前記標的とされる核酸配列に対する熱安定性ポリメラーゼ及びプライマーを前記生物学的サンプルに添加して少なくとも変性温度と伸長温度の間で前記生物学的サンプルを熱サイクルするステップを含むステップと、
前記核酸結合蛍光体により吸収される波長の光によって前記サンプルを励起するステップと、
前記サンプルの温度が変化する際に前記核酸結合蛍光体からの温度依存性蛍光をモニタするステップと、を含むことを特徴とする。望ましくは、核酸結合蛍光体には二重鎖核酸結合蛍光染料たとえばSYBRTMグリーンI等を含む。温度依存性蛍光は、望ましくは解離曲線分析によって、増幅生成物を識別するために使用できる。2種類又は3種類以上の増幅生成物の相対量を解離曲線の分析で求めることができる。たとえば、解離曲線より下の領域は多重ガウス分布の和の非線形最小二乗回帰で見付けられる。
自動ポリメラーゼ連鎖反応装置と題する1990年6月4日付米国特許出願第07/534,029号(現在は放棄されている)の一部継続出願である高速熱サイクル装置と題する1992年1月2日付米国特許出願第07/815,966号(現在は放棄されている)の一部継続出願である高速熱サイクル装置と題する1994年1月10日付米国特許出願第08/179,969号(現在の米国特許第5,455,175号)の一部継続出願である生物学的サンプルの高速熱サイクルのための方法と題する1995年10月2日付米国特許出願第08/537,612号の一部継続出願であるPCR処理をモニタするためのシステム及び方法と題する1996年6月4日付米国特許出願第08/658,993号の一部継続出願である第V因子ライデン変異を検出するための方法と題する1997年3月17日付米国特許出願第08/818,267号。上記出願の各々はその全体で本明細書において参照として個別に各々含まれる。生物学的処理を実施しモニタするためのシステム及びその方法と題し、ユタ大学研究財団が出願人でカール・T・ウィットワー、カーク・M・ライリー、ランディ・P・ラスムッセン、デビッド・R・ヒルヤードを米国における発明者兼出願人とする同時出願中の1997年6月4日付米国事務局(RO/US)受付PCT出願番号PCT/US97/もその全体を本明細書の参照に含む。
図4は4種類の異なる温度/時間プロファイル(A〜D)の結果と30サイクル後にそれらで得られた増幅生成物(A〜D)を示す。図4のプロファイルAとBは従来技術の微量遠沈管を使用する従来技術の加熱ブロック装置を用いて得られた。図4から分かるように、温度間の遷移はゆっくりでプロファイルAとBには多数の非特異性バンドが存在する。プロファイルBは各々のサンプルが各々の温度に留まる時間を制限することによって非特異性バンド(プロファイルAとは対照的に)の幾つかを排除する点で改善を示している、つまり短時間ではさらに望ましい結果が発生することを表わしている。
蛍光技術に臭化エチジウムを用いるのが当業者には馴染み深いであろう。二重鎖特異性蛍光染料が増幅中に存在する場合、二重鎖生成物が多く作られる程蛍光は一般に増加する。R.ヒグチら、特定DNA配列の同時増幅と検出、(R. higuchi et al., Simultaneous amplification anddetection of specific DNA sequences, 10 Bio/Technology 413-417 (1992))参照。インターカレータYO−PRO−1を用いたhepatitis C(C型肝炎)RNAの蛍光PCRアッセイも従来技術で公知である。T.イシグロら、蛍光インターカレータ存在下のポリメラーゼ連鎖反応によるhepatitis CウィルスRNAの均質定量アッセイ(T. Ishiguro et al., Homogenenous quantitative assay ofhepatitis C virus RNA by polymerase chain reaction in the presence of a fluorescent intercalater, 229 Anal. Biochem. 207 - 213 (1995))参照。従来技術で公知であり、米国オレゴン州ユージーンにあるモレキュラー・プローブズ社(Molecular Probes of Eugene, Oregon)から入手できるSYBRTMグリーンIを二重鎖特異性染料として使用するのが好適である。この染料の分子構造は企業秘密であるが、ゲル上でのDNA検出用にさらに高感度の二重鎖特異性染料としてメーカーから推奨されている。SYBRTMグリーンIは熱安定性が悪いが、しかしそのために長い時間間隔にわたって反応混合物の温度が解離温度に維持されるような従来方によるポリメラーゼ連鎖反応の蛍光モニタリングには有用ではない。この熱不安定性のため、解離温度が長時間にわたって維持されない場合、即ちPCRが前述した速度論の典型例にしたがって高速サイクルにより行なわれる場合に、SYBRTMグリーンIがPCR反応をモニタするために使用できることが発見されたのは予想外だった。
10,000テンプレートコピーからのヒトβグロビン遺伝子のPCO3/PCO4プライマー対からの110塩基対断片の増幅をモニタすることにより異なった二重鎖特異性DNA染料を比較した。プライマーは従来技術で公知の通りに標準的ホスホラミダイト化学によって、即ちファルマシア・バイオテック遺伝子アセンブラ・プラス(Pharmacia Biotech Gene Assembler Plus)(ニュージャージー州ピスカタウェイ)を使用して合成された。ヒトβグロビン・プライマーPC03/PC04(110塩基対)はC.T.ウィットワーら、熱気による毛細管内自動ポリメラーゼ連鎖反応 (C. T. Wittwer et al., Automated polymerase chain reaction in capillary tubes with hot air, 17 Nucl. Acids. Res. 4353 - 4357 (1989))に説明されており、本明細書で参照に含まれる。DNA増幅は、以下の実施例で特に記載していない限り、50mMトリス、pH8.5(25℃),3mMMgCl2,500μg/mlウシ血清アルブミン、0.5μMの各プライマー、0.2mMの各デオキシヌクレオシド三リン酸、5μlサンプルあたり0.2単位のTaqポリメラーゼで行なった。精製した増幅生成物をDNAテンプレートとして使用し、フェノール/クロロホルム抽出とエタノール沈殿法で得られた。D.M.ウォーレス、核酸の大規模及び小規模フェノール抽出及び沈殿法 (D. M. Wallace, Large- and Small-scale phenol extractions and precipitation of nucleic acids, 152 Methods in Enzymology 33-48 (1987))参照。これに続けてセントリコン30マイクロコンセントレータによる反復洗浄でプライマーの除去を行なった(アミコン社、マサチューセッツ州ダンバース)。テンプレート濃度は260ナノメートルの吸光度で求めた。テンプレートのA(260):A(280)比は1.7以上だった。
蛍光共鳴エネルギー転移は2つの蛍光物質が物理的に接近し一方の蛍光物質の発光スペクトルが他方の励起スペクトルとオーバラップしている場合に発生し得る。蛍光共鳴エネルギー転移の導入理論は多くの最近の紹介論文に見ることができる。共鳴エネルギー転移のレートは:
(8.785E−5)(t-1)(k2)(n-4)(qD)(R-6)(JDA)
ただし、
t=アクセプター欠如時のドナーの励起状態寿命
k2ドナーとアクセプターの間の指向性係数
n=介在する媒体の可視光反射率
qD=アクセプター欠如時のドナー量子効率
R=ドナーとアクセプターの間の距離(オングストローム単位)
JDA=オーバラップする全波長に対して(FD)(eA)(W4)の積分
ここでFD=ドナーのピーク正規化蛍光スペクトル
またeA=アクセプターの分子減衰係数(Mー1cm-1)
W=波長(ナノメートル)とする。
直接励起されたD分子数=(K)(eD)
直接励起されたA分子数=(K)(eA)
ここでKは比例定数である。ドナーの脱励起は、蛍光、共鳴エネルギー転移、その他の熱的消光と要約される過程によって発生する。PF=共鳴エネルギー転移の確率、PTD=ドナーの熱的消光の確率、とすると、ドナー蛍光の確率は、
1−PF−PTD
また蛍光を発するドナー分子数は、
(K)(eD)(1−PF−PTD)
である。ドナー発光ウィンドウ(たとえばバンドパスフィルタ・ウィンドウ)内でのドナー発光を検出する確率をPDDとすると、観察されるドナー発光個数は、
(PDD)(K)(eD)(1−PF−PTD)
ここで、励起されたアクセプターフルオロフォア数が直接励起されたアクセプターと共鳴エネルギー転移により励起されたアクセプターの和であるので、
(K)(eA)+(K)(eD)(PF)
PTA=アクセプターの熱的消光の確率とすると、アクセプター蛍光の確率は、
1−PTA、
また蛍光を発するアクセプター分子の個数は、
[(K)(eA)+(K)(eD)(PF)][1−(PTA)]
またアクセプター発光ウィンドウ内でアクセプター発光を検出する確率をPAAとすると、観察されるアクセプター発光の個数は、
(PAA)[(K)(eA)+(K)(eD)(PF)][1−(PTA)]
最後に、アクセプター発光ウィンドウ内でドナー発光を観察する確率をPDAとした場合に、アクセプター発光ウィンドウ内で観察される(DとAの両方の)発光の個数は、
(PAA)[(K)(eA)+(K)(eD)(PF)][1−(PTA)]+
(PDA)(K)(eD)(1−PF−PTD)
蛍光測定は相対的でありKが全ての項で存在することから、Kを除外して式を組み立て直すと、ドナーウィンドウで観察される強度は(ドナー励起)−(エネルギー転移)に比例し:
1)(eD)(pDD)(1−PTD)−(eD)(PDD)(PF)
またアクセプターウィンドウで観察される強度は(アクセプター励起)+(エネルギー転移)+(アクセプターウィンドウでのドナー発光)に比例するから、
2)(eA)(PAA)(1−PTA)+(eD)(PDD)(PF)(1−PTA)
+(eD)(PDA)(1−PTD−PF)
共鳴エネルギー転移が増加すると、ドナーシグナルが減少してアクセプターシグナルが増加する。百分率シグナル変化は各ウィンドウ内のバックグラウンド光強度に依存する。プローブの濃度が高いと、バックグラウンド光強度が高い。PCR中、標的(生成物)濃度変化をモニタする必要がある場合、ドナー濃度を標的濃度と一致させることは可能ではない。過剰なドナー分子がドナー及びアクセプターウィンドウの両方でのバックグラウンド光強度に関係し部分的にエネルギー転移現象を隠蔽する。アクセプターウィンドウでのバックグラウンド光はアクセプターウィンドウ内でのドナー発光だけではなくアクセプターの直接励起からも発生する。このバックグラウンドはeAが低くPDAも低いと最少にできる。
内部プローブCAAACAGACA CCATGGTGCA CCTGACTCCT GAGGAフルオレセイン(配列ID No. 3)とCy5−GAAGTCTGCC CTTACTGCCC TGTGGGGCAA G−p(配列ID No.18)それぞれ0.2μモルと0.8単位KlenTaq1ポリメラーゼ(Taqポリメラーゼの5’−エクソヌクレアーゼ欠損変異体──米国特許第5,436,149号)を10μl反応で用いた実施例2の手順にしたがって、110bpβグロビンフラグメントを50ngヒトゲノムDNAから増幅した。プローブは同一鎖でプライマーに内部ハイブリダイゼーションし何らかの介在塩基なしにすぐ隣接していた。
2重標識フルオレセイン/Cy5プローブCy5−CTGCCG−F−TACT GCCCTGTGGG GCAAGGp(配列ID No.19)を標準ホスホラミダイト化学で合成した。ここでpは末端3’リン酸(化学的リン酸化剤、グレン・リサーチ社)、Fは2−アミノブチル−1,3−プロパンジオール骨格を有するアミダイトとして自然の3炭素ヌクレオチド間リン酸ジエステル距離を保つために導入したフルオレセイン残基(クロンテック社、カリフォルニア州パロアルト)、Cy5はアミダイトとして添加(ファルマシア社)した。0.1MトリスpH8.0でのフルオレセイン蛍光に対するCy5の比はホスホジエステラーゼ(シグマ、モンタナ州セントルイス)による完全加水分解の前後に得られた。蛍光比の変化は加水分解後に220倍だった。2重標識フルオレセイン/ローダミン・プローブF−ATGCCCT*CCC CCATGCCATC CTGCGTp(配列ID No.20)をパーキン・エルマー社(カリフォルニア州フォスターシティ)から購入した。ここでFはフルオレセイン、*はアミノ・リンカー腕で改変T残基に付着させたローダミンである。蛍光比の(フルオレセインに対するローダミンの)変化はホスホジエステラーゼによる加水分解後に22倍だった。
PCR中のフルオレセイン及びCy5で標識した隣接ハイブリダイゼーション・プローブの比率、濃度、間隔の影響について研究した。βグロビン遺伝子座と実施例3のプローブ対の増幅を用いCY5のフルオレセインに対する蛍光比の最大変化を観察した。極大シグナルはCy5のフルオレセイン標識プローブに対する比が2:1の場合に発生した(図10)。2:1の比では、最良のシグナルは、フルオレセイン・プローブ濃度0.2μモル、Cy5標識プローブ濃度0.4μモルで発生した(図11)。PCR中に隣接ハイブリダイゼーション・プローブの間で最適な介在塩基数も決定した。長さが同じでハイブリダイゼーション位置が僅かに変移している数種類のプローブを実施例3にしたがって合成し、βグロビン標的にハイブリダイゼーションした場合に、プローブ間に0,1,2,3,4,又は6塩基が残るようにした。PCR中で最高のシグナルは介在塩基数1で発生した(図12)。ある程度の共鳴エネルギー転移が15塩基の間隔又25塩基でも検出されたが、もっと良好な転移は0〜5塩基で発生した。
標的に隣接してハイブリダイゼーションする2つのプローブを合成し各々を共鳴エネルギー転移対の一方の蛍光物質で標識した場合、共鳴エネルギー転移はハイブリダイゼーションが起こった場合に増加する(図5C)。フルオレセイン/ローダミン対は核酸検出でもっとも共通に使用されている。
110bpβグロビンフラグメントを、実施例3に記載した隣接フルオレセイン及びCy5標識プローブを用いてゲノムDNAから増幅した。10μl反応に0.4U(Taq)又は0.8U(Stoffelフラグメント、パーキン・エルマー社、又はKlenTaq1)いずれか一方の酵素を使用した。特に示していない限り、温度サイクルはプログラム式アプローチ速度20℃/毎秒で94℃0秒、アプローチ速度20℃/毎秒で60℃20秒、アプローチ速度1℃/毎秒で75℃0秒とした。図13は30サイクルにわたってテンプレートを増幅した直後での2種類の隣接ハイブリダイゼーション・プローブによる蛍光の発生を示す。短時間の94℃での変性後、温度を60℃まで下げ約20秒にわたり蛍光が増加した。シグナル強度は5’−エクソヌクレアーゼ活性を含む自然のTaqポリメラーゼよりもエクソヌクレアーゼ欠乏ポリメラーゼ(Stoffelフラグメント)のほうが大きかった。約20秒後、ポリメラーゼがプローブを移動および/または加水分解すると蛍光は低下する。蛍光の相対的低下は、ポリメラーゼが5’−エクソヌクレアーゼ活性を有する場合(TaqDNAポリメラーゼ)のほうがこの活性を欠く場合(Stoffelフラグメント)より僅かに早い。
ゲル電気泳動によるDNA増幅における従来のエンドポイント分析では生成物のサイズを同定して純度を推定している。しかし、増幅は、最初は確率論的に、次に指数関数的に、最後には停滞的に行なわれるので、エンドポイント分析の使用は定量に限られる。本発明の1つの側面には、ハイブリダイゼーション・プローブによる初期テンプレートのコピー数の定量のためのサイクル毎のモニタリングが含まれる。当業者には理解されるように、DNA増幅を行なっている多数サンプルのサイクルあたり1回のモニタリングは強力な定量ツールである。サイクル毎モニタリングは各サイクルの伸長又はアニーリング/伸長組み合わせフェーズの間に蛍光を観察し蛍光を生成物濃度と相関することによって実現される。
3種類の異なる蛍光技術によりPCRのサイクル毎モニタリングを行なった。蛍光は、(i)二重鎖特異性染料であるSYBRTMグリーンI、(ii)2重標識加水分解プローブのエクソヌクレアーゼ開裂後のローダミンによるフルオレセイン消光の減少、(iii)隣接ハイブリダイゼーション・プローブによるフルオレセインからCy5への共鳴エネルギー転移、によりモニタした。増幅試薬及び条件は実施例2に記載した通りとした。ヒトβグロビン・プライマーであるRS42/KM29(536塩基対)とPC03/PC04(110塩基対)についてはC.T.ウィットワーら、熱気による毛細管内自動ポリメラーゼ連鎖反応(C. T. Wittwer et al., Automated polymerase chain reaction in capillary tubes with hot air, 17 Nucl. Acids. Res. 4353 - 4357 (1989))に説明されており、本明細書で参照に含まれる。βグロビンの温度サイクルは最高95℃、最低61℃、72℃15秒間で温度間の平均レートは5.2℃/秒だった。βアクチン・プライマーとフルオレセイン/ローダミン2重標識プローブはパーキン・エルマー(番号N808−0230)から入手した。βアクチンの温度サイクルは最高94℃、60℃15秒間で温度間平均レートは6.2℃/秒だった。単一標識プローブである5’−CAAACAGACA CCATGGTGCA CCTGACTCCT GAGGA−フルオレセイン−3’(配列ID No.3)と5’−Cy5−AAGTCTGCCG TTACTGCCCT GTGGGGCAAGp(配列ID No.4)を実施例3の通りに合成した。これらの隣接プローブは同一DNA鎖のPC03/PC04βグロビン・プライマー対と内部ハイブリダイゼーションし塩基対1個で隔てられる。温度サイクルは最高94℃、59℃20秒間で温度間平均レートは7.0℃/秒だった。ハイブリダイゼーション・プローブ(βアクチンとβグロビン)は各々0.2μモルで使用した。
Cy5標識プライマーとフルオレセイン標識ハイブリダイゼーション・プローブの間の共鳴エネルギー転移によるPCRのサイクル毎モニタリングを行なった。これを、隣接Cy5/フルオレセイン・ハイブリダイゼーション・プローブによるモニタリングと比較した。Cy5標識プライマーはCAACTTCATC CACGT*TCACC(配列ID No.21)、ただしT*はCy5を付着させた改変T塩基、またこれに対応するプローブはGTCTGCCGTT ACTGCCCTGT GGGGCAA−フルオレセイン(配列ID No.22)だった。隣接ハイブリダイゼーション・プローブはCCTCAAACAG ACACCATGGT GCACCTGACTCC−フルオレセイン(配列ID No.23)、及びCy5−GAAGTCTGCC GTTACTGCCC TGTGGGGCAAp(配列ID No.24)だった。ハイブリダイゼーション・プローブは実施例3にしたがって合成し0.2μモルで使用した。Cy5標識プライマーは2ステップで合成した。自動合成を用いて所望するT位置にアミノ・モディファイアC6dT(グレン・リサーチ社)を組み込んだ。次に、Cy5の1価N−ハイドロキシサクシニミド・エステル(図6)をメーカー指示(アマシャム)にしたがってアミノ・リンカに用手的に結合した。HPLC精製は実施例3に説明した通りに行なった。
3種類の異なる蛍光モニタリング方の各々について実施例2にしたがってDNA増幅を実施した。プライマーKM29とPC04からの205塩基対ヒトβグロビンフラグメントの増幅においてSYBRTMグリーンIを1:10,000倍希釈で使用した。加水分解プローブと条件は実施例7に指定したものである。ハイブリダイゼーション・プローブTCTGCCGTTA CTGCCCTGTG GGGCAAG−フルオレセイン(配列ID No.5)をKM29、またCy5標識プライマーCAACTTCATCCACGTT*CACC(配列ID No.6)と用い、ここでT*は実施例8と同様に合成したCy5標識T塩基とした。全ての増幅は15,000テンプレート・コピーによる10複製(ヒトゲノムDNA50ng/10μl)で行なった。温度サイクルは長さ31秒(最高94℃、60℃20秒間、温度間平均レート6.2℃/秒)だった。蛍光はアニーリング/伸長フェーズの15秒目から20秒目の間で各サンプルについて観測した。
定量PCRは医生物学的研究と臨床検査の双方で重要な技術となった。定量処理は標的配列の既知のコピー数を含むサンプルの標準曲線を作ることを含む。未知のサンプルのコピー数は既知の値の間に外挿することで決定される。完全な増幅曲線が存在するDNA量に比例したシグナルをもたらす蛍光、放射線、又は何らかの他の方法を用いてサイクル毎にモニタされる場合、分析には多くのデータ点を利用でき、標準又は未知を表わすのにどの値を選択するかは明確ではない。従来技術ではシグナルの「閾値」を選択して標準又は未知が代表的な値としてその閾値と交差する時のサイクル数を使用している(ヒグチ&ワトソンのEPA0 640 828 A1出願を参照)。このアプローチは増幅曲線で利用可能なデータのうちの非常に少ない量を使用するものである。さらに、閾値の割り当ては非常に主観的であり意識的又は無意識的な偏倚を受ける。非線形カーブフィッティング技術を増幅曲線のデータに適用することによりもっと多くの利用可能なデータを客観的に使用することができる。望ましくは、基本となる過程の要因をモデル化することによって増幅曲線の形状を記述する式を見付けるのが良い。
y=A*[DNA]*(1+E)n
ここでAはシグナルの単位をDNAの単位に変換する倍率係数、[DNA]は反応におけるDNAの開始濃度、Eは反応の効率、nはサイクル数である。
y={(as*x+ab)−(ds*x+db)}/(1+(x/c)^b)+(ds*x+db)
ここで「as」は傾斜線のバックグラウンド、「ab」はバックグラウンド線のy切片、「ds」はプラトー線の傾き、「db」は傾斜線のy切片、「c」はサイクル数で、反応はバックグラウンドからプラトーの中央(A50)である。また「b」は増幅の対数線形部分の傾きである。
y=(((as*x+ab)−(dmax*x/dd+x)/(1+(x/c)^b))+(dmax*x/dd+x)
これは最初の6パラメータの式と似ているが直線ではなく双曲線によってプラトーが定義されている点が異なっている。図28はこの式についてのA50が開始コピー数に良く相関することを示す。
本発明の特徴である連続モニタリング、即ち各PCRサイクル内での多数回モニタリングについてここで議論する。PCR中の蛍光モニタリングは一定温度で各サイクル中に1回ずつ行なうことができるが、本発明はPCRサイクル全体を通しての連続モニタを提供することの重要な利点を提供する。蛍光が温度変化につれて変化することから温度は重要である。図29Aと図29BはSYBRTMグリーンIについて温度と蛍光の間の逆比例関係を示している。これは温度サイクル中の困惑するような作用で、一定の伸長温度でサイクルあたり1回蛍光を考慮することで通常なら排除される。しかし、本発明によれば、温度変化中の蛍光をモニタするのは非常に情報量が豊富である。本発明以前には、各サイクル1回ずつに対向する各サイクル内の連続的な蛍光モニタリングは実施されていない。本発明によれば、時間、温度と蛍光を毎秒、200ミリ秒毎、100ミリ秒毎、又はもっと高頻度で取得する。このようなデータからは生成物の変性、アニーリング、伸長についてと従来利用できた方法では入手できなかった高速サイクル中のプローブ・アニーリング及び解離についての細かな詳細を見つけ出すことができる。
プライマー5’−CGTGGTGGAC TTCTCTCAAT−3’(配列ID no.1)及び5’−AGAAGATGAG GCATAGCAGC−3’(配列ID no.2)(ジーンバンク配列HVHEPB)を使用して精製PCR生成物の10の6乗個コピーからhepatitis BB型肝炎ウィルス表面抗原遺伝子の180塩基対フラグメントを増幅した。実施例2の増幅条件にしたがったが、反応には1:20,000倍希釈したSYBRTMグリーンIと2ミリモルのMgCl2を含んでいた点が異なる。各温度サイクルは長さ27秒(最高92℃、最低59℃、70℃5秒間、温度間平均レート3.0℃/秒)とした。時間、温度、2チャンネルの蛍光を200ミリ秒毎に測定し蛍光対サイクル数及び蛍光対温度プロットとして連続表示した。図30はサイクル10からサイクル34までの温度、時間、蛍光の三次元プロットを示す。またこの3D曲線は温度対時間、蛍光対時間、蛍光対温度の2次元プロットとして図30に投影されている。図30の温度対時間投影図は各サイクル毎に反復して基本的に図3で説明したのと同じ情報を提供する。蛍光が温度に逆比例して変化しているので、図30に図示してある初期サイクルでの蛍光対時間投影は温度対時間プロット(図29参照)を伸縮した鏡像になっている。生成物が蓄積してくると、二重鎖生成物により蛍光が全ての温度で増加する。しかし変性温度では一重鎖DNAしか存在していないため蛍光は基線レベルに戻る。図30に図示した二重鎖染料の蛍光対温度投影は時間軸を省いてありDNA増幅中の鎖の状態の温度依存性を示している。
ヒトβグロビン遺伝子の536塩基対フラグメントを5μl容量で25ngのゲノムDNAと1:10,000希釈SYBRTMグリーンIから増幅した。各温度サイクルは長さ28秒(最高95℃、最低61℃、72℃15秒間、温度間平均レート5.2℃/秒)だった。他の条件は図30において説明したのと同じである。サイクル15からサイクル40を表示した。PCR中の生成物鎖状態の温度依存性は図31に図示してあるように蛍光対温度プロットを用いて明らかにした。図示した初期サイクルは同一に見え、低い温度での蛍光の非線形的増加があった。増幅が進むにつれ、温度サイクルはアニーリング及び変性温度の間のループが上昇するように見える。サンプルを加熱すると、変性が起こるまで蛍光は強い。サンプルが冷えると、蛍光が増加し、生成物アニーリングを反映している。温度が伸長中に一定の時、蛍光の増加は追加DNA合成と相関する。
2重標識加水分解プローブ(βアクチン)及び隣接ハイブリダイゼーション・プローブ(βグロビン)を実施例7と同様に用いて200ミリ秒毎の増幅連続モニタリングを実施した。図32Aには、加水分解プローブでモニタした反応のサイクル20〜サイクル45を図示してある。加水分解プローブは多くのプローブが加水分解されるにつれて温度による蛍光比の線形変化、及び蛍光の平行的な増加を示す。これとは対照的に、ハイブリダイゼーション・プローブからの蛍光比は温度でラジカルに変化する(図32B、サイクル20〜サイクル40)。アニーリング/伸長フェーズでは、プローブは一本鎖生成物にハイブリダイゼーションし、蛍光比(Cy5/フルオレセイン)が増加する。生成物変性温度までの加熱中に、プローブは約70℃で解離し、バックグラウンド・レベルまで蛍光比が戻る。
110塩基対βグロビンフラグメントを10μl容量で50ngのゲノムDNAから増幅した。実施例3の増幅条件と隣接ハイブリダイゼーション・プローブにしたがい0.4単位のTaqポリメラーゼ又は0.8単位のKlenTaq1どちらかを用いた。蛍光は100ミリ秒毎にモニタした。KlenTaq1(図33)とTaq(図34)を用いた蛍光対温度プロットは約70℃でのプローブ解離を示している。Taqのエクソヌクレアーゼ活性のため、KlenTaq1での極大シグナルはTaqのシグナルより大きい。Taqを用いた後の方のサイクルでは、未反応プローブの濃度が減少するにつれて各サイクルの蛍光が減少し始める。温度、時間、蛍光の三次元プロットを図35(KlenTaq1)と図36(Taq)について示してある。
3種類の異なるPCR生成物について、SYBRTMグリーンI蛍光用の光学系(ライトサイクラLC24、アイダホ・テクノロジー社製、アイダホ州アイダホ・フォールズ)を備えた24サンプル熱サイクラに組み込まれた微量蛍光計によりDNA解離曲線を取得した。180塩基対のhepatitis BB型肝炎ウィルス表面抗原遺伝子増幅のためのプライマーは5’−CGTGGTGGAC TTCTCTCAAT−3’(配列ID no.1)及び5’−AGAAGATGAG GCATAGCAGC−3’(配列ID no.2)とした。292塩基対前立腺特異性抗原(PSA)遺伝子増幅のためのプライマーは5’−CTGTCCGTGA CGTGGATT−3’(配列ID no.7)と5’−AAGTCCTCCG AGTATAGC−3’(配列ID no.8)とした。536塩基対ヒトβグロビン遺伝子増幅は実施例7と同様に行なった。PCRは実施例2に記載した通りに実施した。増幅生成物はフェノール/クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって精製した後、セントリコン30マイクロコンセントレータ(マサチューセッツ州ダンバースのアミコン社から入手)により反復洗浄した。テンプレート濃度は260ナノメートルの吸光度で決定し、1.7以上のA(260)/A(280)比を有していた。
536βグロビン遺伝子フラグメントの増幅を、実施例7と同様の1:30,000倍希釈したSYBRTMグリーンIで、条件を変化させて実施した。反応A(図40)では、テンプレートを添加せず反応は94℃0秒、60℃0秒、72℃10秒で30サイクルにわたり反復して小さい非特異性増幅生成物を作成した。Bでは、低いストリンジェンシーで精製テンプレートの初期コピー10の6乗個(94℃0秒、50℃0秒、72℃10秒)を55サイクルして、ゲル電気泳動上で増幅生成物が広い範囲を示し、広い温度範囲にわたって解離する。Cでは、10の6乗個の精製テンプレート初期コピーを94℃0秒、60℃0秒、72℃10秒で30回サイクルしており、単一の明るいバンドを示し、シャープな遷移で解離する。温度遷移レートは0.2℃/秒だった。λファージDNA(M)のHindIII消化をマーカとして使用している。
実施例14の精製hepatitis B及びβグロビン遺伝子フラグメントを個別にまた一緒に温度変化レート0.2℃/秒で解離し、他の条件は実施例14で指定した通りとした(図41)。解離曲線(上部)からの幾らか主観的なTmの決定は解離ピーク(下部)から目視で簡単に行なえる。解離ピークより下の領域も曲線より下の面積の積分によって定量できる。基線の大きさが曲線より下の範囲として変化するものと仮定して、最初に蛍光基線を−dF/dT対Tプロットから減算する。次に、カーブフィッティング・パラメータとしてピークの平均、標準偏差、高さを用いてガウス曲線への非線形最小二乗回帰により当てはめた。各々のガウス曲線より下の領域はピーク領域として取った。全ての計算はLabViewプログラミング環境(ナショナル・インストルメント社、テキサス州オースチン)で実施した。図41は解離曲線から解離ピークへの変換の一例を示す。これらの計算のためのコードが付録Aに含めてある。
本発明による生成物純度決定のアプローチを用いて二重鎖特異性DNA染料蛍光のサイクルあたり1回モニタリングに基づく定量PCRを改良した。蛍光は精製βグロビン・テンプレートの初期濃度を変化させた一連の反応について(図42A参照)生成物のポリメラーゼ伸長後に各サイクル毎1回計測した。βグロビン・テンプレートと増幅条件は実施例7に示した通りとした。バックグラウンド蛍光以上の対数直線性増加は初期テンプレート濃度によって変化するサイクル数で始まった。反応あたり10の6乗から10の2乗コピーまでの5種類の反応のプロットがおよそ4サイクルだけ隔たっている。反応あたり平均10の2乗個のコピーのサンプルは反応効率の低下を示し、初期コピー数100未満の反応はあまり有用でない蛍光プロファイルを示した。10及び1(平均)コピーを含む反応での蛍光プロファイルは逆の順番で増加し、陰性対照は約30サイクル後に増幅を示した。これはプライマー・ダイマーの増幅やその他非特異性増幅生成物に由来するもので二重鎖特異性DNA染料のサイクルあたり1回の蛍光モニタリングでは意図した生成物から識別することができない。
本実施例では、ゲノムDNAから2種類の遺伝子フラグメントを同時に増幅しSYBRTMグリーンI蛍光でモニタした。各増幅サイクルの間、異なった増幅生成物が生成物の長さ、GC比、及びその他従来技術で周知の要因に依存する解離温度で変性する。各生成物が解離する温度は二重鎖特異性DNA染料であるSYBRTMグリーンIでモニタできる。嚢胞性線維症遺伝子からの81塩基対フラグメントは本明細書で配列ID No.14及び配列ID No.15として記載したプライマーを用いて増幅し、これに併せて本明細書で配列ID No.16及び配列ID No.17として記載したプライマーを用いたc−erbB−2(HER2/neu)オンコジーンの98塩基対フラグメントを増幅した。
本実施例では、実施例18の手順にしたがうが95℃30分でのポリメラーゼ活性化後に、94℃0秒(傾き=20)、55℃0秒(傾き=20)、70℃10秒(傾き=20)で20サイクル、これに続けて94℃0秒(傾き=1)、55℃0秒(傾き=20)、70℃20秒(傾き=20)で15サイクルにわたりサンプルをサイクルした。サイクル26〜31では、70℃から94℃までの1℃/秒の各遷移中に蛍光を連続的に計測した。解離曲線は解離ピークに変換して表示した(図44)。CFTRフラグメントの増幅効率がneuフラグメントより大きく見えることに注意されたい。増幅効率は解離ピークデータを実施例16と同様に積分することで厳密に決定できる。
実施例18の嚢胞性線維症遺伝子及びHER−2−neu遺伝子フラグメントを実施例2と同様に増幅精製し、175μg/mlに調製した。サンプルを様々な比率(合計8μl)で混合しバッファ(1μl)とSYBRTMグリーンI(1μl)に添加した。終濃度は50mMトリスpH8.3、3mMMgCl2、250μg/mlウシ血清アルブミン、1:30,000倍希釈SYBRTMグリーンIだった。解離曲線は0.2℃/秒で計測し背景蛍光を減算しピークは実施例16で説明したように積分した。結果を図45に示す。解離ピークの下の相対面積と2種類の生成物の相対量の間には優れた相関が見られた。
第V因子ライデン変異はアミノ酸基506(R506Q)でグルタミン基をアルギニン基に置換する単一塩基変化(GからA)である。さらに詳しくは、R.M.バーティナら、活性タンパクC抵抗性の関与する血液凝固第V因子突然変異(R. M. Bertina et al., Mutation in Blood Coagulation Factor V Associatedwith Resistance to Activated Protein C, 369 Nature 64-67 (1994))及びJ.ヴォアベルグら、特発性静脈塞栓症と第V因子Arg506の単一の点突然変異の関連性(J. Voorberg et al., Association of Idiopathic VenousThromboembolism with a Single Point-Mutation at Arg 506 of Factor V, 343Lancet 1535-36 (1994))を参照されたい。どちらも本明細書で参照に含まれる。本明細書で用いられる「第V因子ライデン変異部位」は野生型のグアニン塩基が第V因子ライデン変異種ではアデニン塩基で置き換えられている第V因子遺伝子のヌクレオチド位置を表わす。配列IDno. 9は野生型第V因子遺伝子、配列IDno. 10は第V因子ライデン遺伝子の対応する部分を示し、各々の場合で31番目に関連ヌクレオチドがある。第V因子遺伝子の完全なヌクレオチド配列は、本発明で参照に含まれるR.J.ジェニーらヒト第V因子の完全なcDNAと誘導アミノ酸配列順序(R. J. Jenny et al., Complete cDNA and DerivedAmino Acid Sequence of Human Factor V, 84 Proc. Nat'l Acad. Sci. USA4846-50 (1987))に記載されており、配列はジーンバンク遺伝子座HUMF10で得ることもできる。突然変異第V因子タンパクのアミノ酸変化はこの凝固因子を分解抵抗性にし凝固及び血栓の傾向を増加させる。先天性血栓症のもっとも共通の原因として、この突然変異が臨床分子遺伝学研究室で行なわれる共通のラボテストの標的である。
実施例21の第V因子遺伝子座を前出の通りだがプライマーをCy5の代わりにCy5.5で標識して増幅した。Cy5.5の発光は683ナノメートル・ロングパス・ダイクロイックと683〜703ナノメートル・バンドパス干渉フィルタを介して観察した。Cy5.5のフルオレセインに対する比はほぼサイクル30でバックグラウンド以上に増加し非対称増幅の50サイクルでおよそ比率が2倍になった。野生型DNAで増幅した場合、プローブTmは解離ピークで判定すると65〜66℃だった。
単一塩基突然変異を検出する別の実施例を掲載する。
アラニンをバリン残基に変換し易熱性酵素が得られるメチレンテトラハイドロ葉酸(MTHFR)レダクターゼ遺伝子(C677T)のよくみられる点突然変異が存在する。この突然変異はMTHFR活性を減少し、従来技術で公知の通り若年性血管障害や血栓症の独立した危険因子であるとされてきたホモシステイン血漿レベルを増加させることがある。プライマーの一方をCy5で標識した(TGAAGGAGAAGGTGTCT*GCGGGA)(配列ID no.25)。ここでT*はCy5に結合した改変T残基を表わす(合成と精製については実施例9を参照)。プローブ配列はフルオレセイン−CCTCGGCTAAATAGTAGTGCGTCGA(配列ID no.26)また他方のプライマーはAGGACGGTGCGGTGAGAGTG(配列ID no.27)だった。MTHFR遺伝子の198塩基対フラグメントを、10μlあたり50mMトリスpH8.3、2mMMgCl2、500μg/mlウシ血清アルブミン、各200μMのdNTP、0.5μMのCy5標識プライマー、0.1μM対立プライマー、0.1μMフルオレセイン標識プローブ、0.4単位Taqポリメラーゼ、でヒトゲノムDNA50ngから増幅した。各サイクルは長さ30秒で94℃での変性に続けて20秒60℃での組み合せアニーリング/伸長ステップから構成された。60サイクル後、次のように解離曲線を測定した:0.5℃/秒で50〜65℃、0.1℃/秒で65〜75℃、0.5℃/秒で75〜94℃まで加熱した。基線減算と解離ピークへの変換後に、全ての考えられる遺伝子型が容易に識別された(図48)。
生成物濃度の決定はまた本発明を用いると有利に実施される。二重鎖DNA形成の連続モニタリングによりアニーリング速度論による増幅の全てのサイクルでのDNA定量ができる。サンプル温度を変性温度から急速に低下させ、もっと低いがプライマーのアニーリングを防止するのには未だ充分に高い温度で一定に維持する(図2)。生成物アニーリング速度は秒単位速度論にしたがう(本明細書で参照に含めるB.ヤング&M.アンダーソン、溶液ハイブリダイゼーションの定量分析(B. Young & M. Anderson, Quantitative analysis of solution hybridization, In: Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach 47-71, (B. Hames, S. Higgins eds.,1985))参照)。何らかの任意のPCR生成物と温度について、二次速度定数を測定できる。速度定数が分かると、未知のDNA濃度は実験的アニーリング・データから求めることができる。冷却は瞬間的になることはなく、一定温度に到達する前に何らかのアニーリングが発生する。急冷は速度定数とDNA濃度決定に利用できるデータ量を最大化する。本技術は純粋なPCR生成物を要求するが、これは本発明を用いる温度サイクル中にも得られる解離曲線によって保証できる。本発明によるこの定量法はサンプル間のあらゆるシグナル強度変化とは有利にも無関係である。
βグロビン遺伝子の536塩基対フラグメントをヒトゲノムDNA(実施例7)から増幅して精製(実施例2参照)した。異なる量の精製DNAを5μlの50mMトリスpH8.3、3mMのMgCl2中の1:30,000倍希釈SYBRTMグリーンIに混和した。サンプルは94℃で変性させた後85℃まで急冷した。520〜550ナノメートルの蛍光を時間経過に併せて85℃でモニタした。異なる濃度のDNAを調べた時、アニーリング曲線の形状はDNA濃度に特徴的だった(図49参照)。任意のPCR生成物と温度で、二次速度定数を決定できる。図50は5μl中の536塩基対フラグメント100ngについて85℃での二次アニーリング速度定数の決定を示す。図50に図示した二次速度式を用い、曲線はFmax、Fmin、t0及びkを浮動パラメータとして非線形最小二乗回帰により適合させた。この種の曲線適合のための分析プログラムは従来技術で周知である(たとえば、カリフォルニア州モントレーのデルタポイント社製DeltaGraphのユーザ定義曲線適合)。速度定数が分かると、未知のDNA濃度は実験的アニーリング・データから求めることができる。
エンドポイント分析やサイクル毎分析とは対照的に、本発明では各温度サイクル全体を通しての蛍光もモニタできる。連続蛍光モニタリングは温度サイクル・パラメータの制御に使用できる。本発明はリアルタイム制御と増幅最適化のために蛍光フィードバックを使用する。二重鎖特異性DNA染料又は蛍光標識オリゴヌクレオチド・プローブを含むPCRサンプルの連続蛍光モニタリングは、個別の増幅サイクル中のハイブリダイゼーション及び解離をモニタするために使用できる。この情報を温度サイクル装置内部の温度制御アルゴリズムで使用して熱サイクル条件を改善しカスタマイズすることができる。従来のPCRは増幅前に全てのサイクル・パラメータをプログラミングして実施している。連続モニタリングでは、アニーリング、伸長、変性の連続観察に基づいて、熱サイクル条件の決定を増幅中に行なうことができる。ハイブリダイゼーション情報を用いて温度サイクルを制御することで考えられる利益としては:
1.各サイクルでPCR生成物の完全な変性を保証でき、同時に、
a.過剰に高い変性温度への暴露を最小限に抑さえる、つまり増幅生成物及びポリメラーゼの熱による損傷を回避できる。生成物が変性温度に暴露される時間を制限するのは長い生成物の増幅でとくに有用である。
b.変性温度を最小限に抑さえることにより反応特異性が増加する。これは意図している増幅生成物よりTmが高い生成物に対抗して選択する。
a.ある程度の効率でプライマー・アニーリングに達するのに必要とされる以上に長引かせないことにより増幅に必要な時間量を最小限に抑さえる。
b.アニーリング温度での時間を最小限に抑さえることにより反応特異性を拡大する。
a.生成物伸長を完了するのに必要とされる以上に長引かせないことにより増幅に必要とされる時間量を最小限に抑さえる。
b.意図した増幅生成物より長い生成物に対抗して選択することにより反応特異性を拡大する。
市販の蛍光モニタリング熱サイクラ(ライトサイクラLC24、アイダホ・テクノロジー社製、アイダホ州アイダホ・フォールズ)を変更してソフトウェアが温度/時間セットポイントでプログラムされず、蛍光値を測定してからこれらの値を熱サイクラ制御に使用するようにした。
意図したPCR生成物についての解離ピークを測定し、基線レベル蛍光は生成物が完全に解離した温度で反応カクテルを含むサンプルで測定した。
次に反応の各サイクルではこの蛍光値を目標として使用した。生成物変性へのアプローチは2段階で行ない蛍光値を遠隔計算機へ分析のために送信し値に到達したことの指示が返される要件によるタイムラグを克服した。各生成物の解離ステップでは、蛍光が中間値に達するまで温度を増加し、次いで加熱出力を低減しておよそ3℃/秒の温度傾斜速度とすることで、蛍光を分析する時間と生成物変性が発生したことを熱サイクラに通知する時間を計算機に与えるようにした。
得られた温度/時間プロット(図52)は増幅生成物の濃度が上昇するとサイクル20以降で解離温度における特徴的増加を示している。生成物Tmは生成物濃度の関数である。
アニーリング/伸長を組み合せた温度での伸長維持中に蛍光をモニタし、この情報を使用して充分だが過剰にならない時間が生成物伸長に与えられることを保証するようにした。蛍光は10秒間隔でモニタし、蛍光が設定可能な比率(代表的には1.00〜1.05)以上で増加した場合にはアニーリング/伸長ステップが継続された。それ以外の場合には次の生成物解離ステップを開始した。10秒の間隔はアニーリング/伸長温度に最小限20秒の時間を与えられるように選択した。
得られた蛍光/時間プロット(図52)は増幅生成物の濃度が増加するとアニーリング/伸長組み合せ温度でのドエル時間における特徴的増加を示している。プライマー濃度とポリメラーゼが制限因子になると各サイクルで生成物伸長を完了するのにはさらに多くの時間が必要とされる。
各アニーリング/伸長ステップの終りで、蛍光値を計測して格納した。この値が最低のエンドサイクル蛍光値の1.2倍に増加してからユーザ設定可能な比率(代表的には1.00〜1.05)未満で増加が停止した時点で、熱サイクルを終了した。これに代わり、生成物Tmによるゆっくりした0.1〜0.2℃/秒の温度傾斜を入力してサンプル蛍光を連続モニタすることにより解離曲線取得ステップを開始した。
得られた蛍光/時間プロット(図52)では25サイクルの増幅後にサイクル毎蛍光比の増加が1.00未満に落ち反応が終了したことを示している。
1.増幅生成物とSYBRTMグリーンIを含む無反応サンプル。
2.Tmが最低のプライマーと等しいTmを有し前述の濃度の相補的に蛍光標識したプライマーを含む無反応サンプル。
3.増幅すべきサンプルとSYBRTMグリーンI。
前述の議論から、ハイブリダイゼーションをモニタするためのDNA増幅中の連続蛍光モニタリングがきわめて強力な分析技術であることが理解されよう。本明細書に記載した方法を使用し存在する初期テンプレート・コピー数に依存すると生成物の同定及び定量は温度サイクルの開始後5乃至20分で実現できる。本発明は従来技術においてこれまで利用できなかった幾つかの利点を実現する。たとえば、本発明は生成物純度、多重PCR又は競合的PCRによる相対的定量、アニーリング速度論による絶対生成物定量をモニタするための単色蛍光法と蛍光体サイクル数プロットによる初期テンプレート定量法の改良とを提供するものである。本発明はまた、配列変化検出、多重PCR又は競合的PCRによる相対的定量、プローブ・アニーリング速度論による生成物定量、蛍光体サイクル数プロットによる初期テンプレート定量のための2色配列特異的方法も提供する。
Claims (3)
- 増幅された核酸のハイブリダイゼーションを分析するための方法であって、
(a)分析すべき核酸のサンプルと、
核酸結合蛍光体と、
ポリメラーゼと、
デオキシリボヌクレオシド三リン酸と、
前記核酸を増幅するように構成したオリゴヌクレオチド・プライマーの対と、を含む混合物を提供する工程と、
(b)前記混合物中で前記核酸を増幅して、増幅された核酸を生じる工程と、
(c)前記増幅された核酸を、温度を0.1〜10℃/毎秒の範囲から選ばれる速度で上昇させる直線的温度変化に付しながら蛍光をモニターする工程と、
を含むことを特徴とする方法。 - 前記核酸結合蛍光体がSYBRTMグリーンIであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記核酸結合蛍光体は、1対のオリゴヌクレオチド・プローブを含み、
前記プローブの一方が蛍光共鳴エネルギー転移対の供与体で標識され、
前記プローブの他方が蛍光共鳴エネルギー転移対の受容体で標識される
ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
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