CN108700507B - 固体荧光标准品 - Google Patents

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Abstract

一种固体荧光标准品，可用于校准和/或标准化被构造用于产生和收集荧光数据的装置(例如科学仪器)。本文公开的荧光标准品包括粘合剂(例如低粘度、大体上光学透明、无溶剂、可辐射固化的粘合剂，例如但不限于可UV固化的粘合剂)；以及分散在粘合剂中的选定量的荧光颗粒(例如量子点)。粘合剂和荧光颗粒被混合在一起并置于样品孔中。然后粘合剂固化和凝固，其在孔中产生固体荧光标准品。

Description

固体荧光标准品
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年12月18日提交的题为“固体荧光标准品(SolidFluorescence Standard)”的美国专利第62/269,206号的权益和优先权，其全部内容通过引用并入本文。
背景技术
荧光是指在被一较短波长的光激发时另一波长的光的短持续时间的自发发射。发射荧光的物质通常称为荧光团(fluorophores)。有许多天然和合成的荧光团，包括但不限于化学染料和矿物质。
常规荧光标准品或荧光染料通常由具有延长的芳族pi键结构的有机化合物组成。这些染料中的荧光基础是分子吸收给定波长范围的光(例如UV或可见光)并以已知的不同波长(通常是更长的波长)重新发射一部分吸收的能量。光的吸收通常导致pi结构中的电子被激发到更高的能量状态；当电子弛豫到其基态时发生再发射。这些染料用于各种不同的生物测定，例如，其发出的荧光信号可以提供正在研究的系统的相关信息。
还已知许多矿物质发荧光。然而，大多数矿物质在纯净时不会发出荧光。需要一定量的某些杂质才能使矿物发出荧光。这些杂质被称为“活化剂”。不同的活化剂可以使相同的矿物质发出不同颜色的荧光。有些矿物质在纯净时会发出荧光。这些矿物质被称为“自活化”矿物，包括白钨矿、钼钨钙矿和几种铀矿。其他常见的荧光矿物包括方解石(含有各种活化剂)、红宝石和蓝宝石。
然而，许多化学荧光标准品和荧光染料具有以下一个或多个缺点：(A)它们在零时刻良好，但在长期内不稳定。也就是说，染料在经受光漂白(特别是在长时间照射下和高强度照射时)的情况下快速衰变；(B)它们仅能在窄光谱范围内使用(额外的激发/发射组合通常需要额外的染料)；(C)它们很昂贵；以及(D)它们呈现机械、热或化学不稳定，并且可能老化或变干，这导致荧光强度的变化。通常认为矿物标准品(例如铀玻璃)优于染料，因为其是化学稳定的。然而，一些矿物标准品可能在其松散材料中具有不佳的均匀性，并且它们可能是脆弱的(例如铀玻璃容易破碎)。
发明内容
本文公开了一种固体荧光标准品，其可用于校准和/或标准化被构造以产生和收集荧光数据的装置(例如科学仪器)。固体荧光标准品具有长期稳定性，荧光标准品中包含的荧光材料是化学稳定的并且不容易被光漂白(photobleaching)，并且适用于宽光谱范围。此外，固体荧光标准品易于制备，使其在标准到标准之间以及在多孔(well，井)形式中是均匀的，且标准品在物理上是稳固的。
在一个实施例中，公开了一种荧光标准品。荧光标准品包括粘合剂(即，可用于在液体介质、凝胶介质等中制备荧光标准品的材料，其可允许被固化以形成固体基质)；以及选定量的大体上非光漂白荧光颗粒(例如量子点)，其分散在粘合剂中。在一个实施例中，粘合剂可以是低粘度、大体上光学透明、无溶剂、可辐射固化的粘合剂(例如可UV固化的粘合剂)。在实践中，将粘合剂和大体上非光漂白荧光颗粒混合在一起并置于样品孔中。粘合剂在被置于样品孔中后固化和凝固，其在孔中产生固体荧光标准品。
在另一个实施例中，公开了一种多孔荧光标准品。多孔荧光标准品包括：粘合剂(例如低粘度、大体上光学透明、无溶剂、可辐射固化的粘合剂)；选定量的大体上非光漂白荧光颗粒，其分散在粘合剂中；以及具有多个样品孔的多孔形式板，其中多孔形式板的至少一个样品孔具有设置在其中的选定量的粘合剂和大体上非光漂白荧光颗粒。如在上文的示例中，粘合剂在被置于至少一个样品孔中之后固化和凝固。在一个实施例中，多孔形式板是96孔板。在另一个实施例中，多孔形式板包括被认为是用于
Figure BDA0001770316330000021
系统(BioFireDiagnostics，Salt Lake City，UT)的袋的自给式生物分析的第二级(stage)。
在又一个实施例中，描述了一种设备。该设备包括：热循环系统，该热循环系统包括：样品块，被构造为接收多孔形式板；光学系统，其包括光学激发系统和光学观察系统，其中光学系统被定位在设备中以便照明和观察被插入样品块中的多孔形式板的内容物；以及具有多个样品孔的多孔形式板，其中多孔形式板的至少一个样品孔具有设置在其中的固体荧光标准品。固体荧光标准品包括大体上光学透明、无溶剂、可辐射固化的粘合剂，以及分散在粘合剂中的选定量的大体上非光漂白荧光颗粒。粘合剂在被置于至少一个样品孔中后固化。
在又一个实施例中，公开了一种校准设备的方法。该方法包括将样品容器(例如，样品比色皿、反应管或多孔形式板)放入包括样品保持器的设备中，所述样品保持器被构造为接收样品容器，其中样品容器具有被置于其中的固体荧光标准品。在一个实施例中，荧光标准品包括粘合剂(例如大体上光学透明、无溶剂、可辐射固化的粘合剂)和分散在粘合剂中的选定量的大体上非光漂白荧光颗粒；粘合剂在被置于至少一个样品孔中后固化。
校准方法还包括使用光学系统照射其中具有荧光标准品的样品容器，测量来自多孔形式板的荧光发射，并基于光学系统的荧光信号调节光学系统的特征。在一个实施例中，光学系统的特征是激发光源的对准或激发光源的光强度中的一个或多个。
在又一个实施例中，公开了一种荧光标准品。荧光标准品包括粘合剂(例如低粘度、大体上光学透明、无溶剂、可辐射固化的粘合剂)；选定量的大体上非光漂白荧光颗粒，其分散在粘合剂中；以及片材，其由粘合剂和荧光颗粒组成。在一个实施例中，其中分散有大体上非光漂白荧光颗粒的粘合剂在被置于片材中后固化和凝固。在另一个实施例中，将其中分散有大体上非光漂白荧光颗粒的粘合剂固化以形成片材。在一个实施例中，片材可被修剪以适合需要校准的器械。
根据以下描述和所附权利要求，本发明的以上和其他目的和特征将变得更加明显，或者可以通过下文所述的本发明的实践来获知。
附图说明
为了进一步阐明本发明的上述和其他优点和特征，将通过参考在附图中示出的本发明的特定实施例来呈现本发明的更具体的描述。应理解，这些附图仅描绘了本发明的所示实施例，因此不应视为限制其范围。通过使用附图，将通过附加的特征和细节来描述和解释本发明，附图中：
图1示出了根据本发明一个实施例的固体荧光标准品；
图2A示出了在每个孔中具有固体荧光标准品的多孔形式板(例如96孔板)；
图2B示出了图2A的多孔形式板的侧剖视图；
图3示出了膜阵列袋(FilmArray pouch)多孔形式第二级；
图4是根据本公开的方案的热循环系统的示例性实施例的框图；
图5示出了比较几种荧光标准品随时间的荧光响应的数据；
图6示出了比较单独的多孔板与孔中具有粘合剂的多孔板的荧光随时间的数据。
图7示出了比较储存在黑暗中和光照下的几种荧光标准品随时间的荧光响应的数据；以及
图8示出了几种膜阵列标准品和校准数据；
图9示出了用于校准仪器的可修剪片材；
图10示出了根据本公开的一个实施例的储存容器和多孔形式板(例如96孔板)中的固体荧光标准品。
具体实施方式
本文公开了一种固体荧光标准品，其可用于校准和/或标准化被构造用于产生和收集荧光数据的装置(例如科学仪器)。固体荧光标准品具有长期稳定性，荧光标准品中包含的荧光材料是化学稳定的并且不容易被光漂白，并且适用于宽光谱范围。此外，固体荧光标准品易于制备，使其在标准到标准之间以及在多孔形式中是均匀的，且标准品在物理上是稳固的。
本文描述了各种部件、组件、子组件和方法。虽然参考具体附图和具体实施例描述了这些部件、组件和子组件中的许多，但是可以预期，本文描述的各种部件、组件、子组件和方法是可互换的并且可以与其他部件、组件、子组件、以及方法或其他仪器一起使用。本文考虑了所有兼容的组合。
在一个实施例中，本文公开的荧光标准品包括粘合剂，其示例性地为光学透明的粘合剂和分散在粘合剂中的选定量的荧光颗粒(例如量子点，quantum dots)。在一个实施例中，粘合剂可以是低粘度、大体上光学透明、无溶剂、可辐射固化的粘合剂(例如可UV固化的粘合剂)。在实践中，将粘合剂和荧光颗粒混合在一起并置于样品孔中。粘合剂在置于样品孔中后固化和凝固，其在孔中产生固体荧光标准品。在一个实施例中，在将混合物置于样品孔中之前和/或在固化之前，可以在真空下对粘合剂/荧光颗粒混合物进行脱气，以防止在荧光标准品中形成气泡。
因为固化的粘合剂是固体并且可以不包含挥发性成份，所以粘合剂的体积大体上不随时间改变，因此，荧光活性结晶材料(例如量子点)的浓度大体上不会随着时间的推移而变化。这意味着一旦制作标准品，其可以反复使用数周、数月甚至数年。这可以为仪器用户节省大量时间，因为每次仪器需要校准时，用户不需要制作新的标准品。同样，因为标准品在长期内是稳定的，所以一旦制成标准品，其就可以用于在数周、数月甚至长达数年的时间内校准一个或多个仪器。同样，由于标准品可以反复使用且标准品的响应是稳定的，因此可以比较和标准化不同日、不同周、甚至不同年份所收集的、来自一个或多个仪器的数据。
此外，荧光颗粒大体上不易受化学分解或光漂白的影响，因此荧光颗粒提供随时间稳定的荧光信号。在给定的激发波长和强度下，来自荧光颗粒的荧光信号应该大体稳定并且随时间大体相同。例如，来自荧光颗粒的荧光在至少六个月的时间内不应减少超过约0.01％、0.1％、1％、2％、5％或10％。这与化学染料易受化学分解和光漂白的影响形成鲜明对比。还值得注意的是，荧光颗粒(例如量子点)可用于在UV、可见光和IR光谱内的几乎无限范围中的吸收和发射。其结果是，可以选择单个颗粒类型和荧光颗粒的混合物来制备吸收和发射任何选定波长的荧光标准品，以便测试不同的激发和发射组合。
此外，荧光颗粒可以非常小(例如直径为1nm-10nm)，因此，其容易分散并且保持均匀地悬浮在粘合剂中——例如，荧光颗粒可以足够小以至于它们形成胶体悬浮液。其结果是，来自标准品的荧光在给定的标准品内以及在由给定的粘合剂和荧光颗粒的混合物制成的多个标准品上通常是高度均匀的。此外，因为示例性粘合剂具有低粘度，所以如果制造许多单独的标准品，则可以将含有荧光颗粒的选定体积的粘合剂可重复地移液到(例如，在多孔形式板中的)多个孔中。同样地，由于低粘度，示例性粘合剂在移液时不倾向于粘附或爬附在样品孔的侧面。例如，如果粘合剂沿样品孔的侧面连起来(streak up)，则可能导致异常和/或不一致的荧光读数。通常可以使用低粘度粘合剂来避免这种情况。
本文所述的荧光标准品的前述优点代表了相对于现有技术的显著进步。
现在参考图1，其示出了荧光标准品10的实施例。荧光标准品10包括其中置有荧光材料13的样品孔12。样品孔可以是本领域已知的任何样品容器，例如但不限于试管、微量离心管(Eppendorf tube)、PCR反应管、比色皿等。在一个实施例中，样品孔12是单个样品孔。在另一个实施例中，样品孔12可以是多孔形式板(例如96孔板)或多孔形式条(例如8孔条)的一部分。如本文所使用的，术语“样品孔”可以指用于容纳样品、反应混合物等的任何容器、比色皿、管等。除了多孔板形式外，管、袋和其他形式也是合适的，只要其适用于需要校准的仪器。还应理解，可以使用校准器材料的其他构造来代替样品孔。例如，可以使用荧光材料的固体板代替含有荧光材料的离散孔板。类似地，荧光材料可以作为片材提供，其中片材可以代替用于校准仪器的板，或者荧光材料可以被提供为设置在可修剪材料上，可以在使用之前将该可修剪材料修剪到适当的尺寸。
荧光标准品10的荧光材料13包括粘合剂14(例如，低粘度、大体上光学透明、无溶剂、可辐射固化的粘合剂)，以及分散在粘合剂14中的选定量的荧光颗粒16。将粘合剂14和荧光颗粒16混合，然后使粘合剂14在样品孔12中固化。所示实施例示意性地示出均匀分散在粘合剂14中的荧光颗粒16。优选地，在固化之前和之后，荧光颗粒16均匀地分散在粘合剂14中。
在优选的实施例中，荧光颗粒16是量子点。术语“一个量子点”或“多个量子点”(QD)是指具有各种形状(点、棒条、纤维、四足和其他几何形状)并且尺寸范围为约1nm至100nm的荧光活性半导体或金属晶体。诸如胶体半导体纳米晶体的小量子点可以小至1纳米至10纳米，对应于10个至50个原子直径，并且在量子点体积内总共有100至100,000个原子。自组装量子点的尺寸通常在10nm到50nm之间。QD的一个特征是其通过称为量子限制的过程将激发子(exciton)限制在所有三个空间维度中而发荧光。其结果是，量子点的光学和电子性质取决于颗粒尺寸和形状，因此可以在很大范围内控制。QD越大，其荧光光谱越红(能量越低)。相反，较小的QD发出更蓝(更高能量)的光。定量地说，决定荧光的能量(以及因此决定荧光的颜色)的带隙能量与QD的尺寸成反比。较大的QD具有更高的能量水平，其间距也更紧密。证据还表明，QD的形状也可能是着色的一个因素。
在一些实施例中，与常规分子染料相比，QD被认为是优越的(例如，用作生物标记和成像中的染料)。其中最直观的一项是QD的亮度，因为其高消光系数和与荧光染料相当的量子产率结合。此外，与化学染料相比，量子点受光漂白的影响要小得多。据估计，示例性量子点比传统荧光染料亮20倍，稳定100倍。
量子点可以由许多材料制成。硒化镉和硒化铅QD通常是最常见的类型。其他类型的QD包括镉硫属元素化物、铅硫属元素化物、锌硫属元素化物和汞硫属元素化物。“硫属元素化物”是包括至少一种硫属元素阴离子和至少一种另外的正电性元素的化合物。尽管元素周期表中的所有16族元素都被定义为硫属元素，但硫属元素化物一词更常用于硫化物、硒化物和碲化物、而不是氧化物。金属磷化物、氮化物和砷化物在QD类型中也是常见的。
QD可以用许多表面稳定配体进行表面稳定化。表面稳定配体包括但不限于烷基羧酸、烷基胺、烷基膦和烷基硫化物。还可以通过在QD核周围生长壳来稳定QD。硫酸锌是常见的壳材料。
市售的QD包括但不限于CdSe、CdS、CdTe、PbS、PbSe和CdSe/ZnS(CdSe核和ZnS壳)。由于Cd和Pb是有毒重金属并且在许多应用中受到限制，因此需要无重金属的QD。磷化铟(InP)是市售的无重金属QD的一个示例。可以获得有或没有ZnS壳的InP量子点。对于给定的尺寸，每种QD类型将具有略微不同的发射特性，这取决于用于制造QD的一种或多种材料的电子特性。
在另一个实施例中，荧光颗粒16可包括荧光玻璃的研磨颗粒。许多天然存在的玻璃(例如红宝石和蓝宝石)和掺杂的玻璃(例如掺杂有诸如但不限于U、Mn、Eu(II)、Co、Eu(III)、V、Tb、Sn、Ce和Cu的元素的玻璃)在某些波长的光(即UV和可见光)下发荧光。可将这些材料研磨成细颗粒(例如10nm-10μm)并与选定的粘合剂组合以制备本文所述的荧光标准品。根据对天然存在的玻璃或掺杂玻璃中掺杂剂的选择，可选择这种玻璃以吸收和发射各种选定的UV和可见波长。
在另一个实施例中，荧光颗粒16是荧光塑料的研磨颗粒。许多塑料(例如丙烯酸类)在某些波长的光(即UV和可见光)下发荧光。可将这些材料研磨成细颗粒(例如10nm-10μm)并与选定的粘合剂组合以制备本文所述的荧光标准品。根据荧光塑料的选择，可以选择这种塑料以吸收和发射各种选定的UV和可见波长。塑料(例如聚苯乙烯微球)也可以掺杂或浸渍有诸如但不限于化学染料和金属螯合物(例如铕(II)和铕(III)螯合物)的材料，其可以产生UV和可见光下的多种多样的颜色。这种已掺杂或浸渍材料可以被认为优于化学染料，因为荧光体与其环境的大量化学物质是分离的，并且塑料(例如塑料球体)的化学性质可以被选择为与各种水性、有机、极性和非极性环境相容。
如本文所使用的，术语“粘合剂”是指允许荧光颗粒悬浮在液体介质中的材料，所述液体介质可以固化以形成固体的塑料状基质。适当的粘合剂包括但不限于单组分和双组分粘合剂，包括硅树脂、聚酯、环氧树脂和聚氨酯基粘合剂。在一个优选的实施例中，粘合剂是光学清澈和透明的，这意味着这种粘合剂可以传输(transmit，透射)可见光光谱中的至少95％、97％、99％或高达100％的光。同样，在优选的实施例中，适当的粘合剂具有低的固有荧光。粘合剂的荧光是波长依赖性的，只要粘合剂可以在某些波长处吸收和再发射，而不是在其他波长处吸收和再发射。然而，优选的是，粘合剂向从粘合剂和荧光颗粒的组合观察到的总荧光信号贡献低且可预测的荧光量，所述粘合剂和荧光颗粒被组合以制备本文所述的荧光标准品。例如，在选定的波长下，粘合剂可以贡献小于50％、小于45％、小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％、小于0.5％、小于0.1％或小于0.01％的荧光标准品的总观察到荧光。
在荧光标准品的一个实施例中，粘合剂14可以是低粘度、大体光学透明、无溶剂、可辐射固化的粘合剂。在一个实施例中，这种粘合剂可以是可UV固化粘合剂。许多光学透明、无溶剂的可UV固化粘合剂在本领域中是已知的，因为其常用于制造光学装置，例如用于相机镜头、望远镜等的复合镜片。这种粘合剂通常是光学清澈和透明的(例如其可以传输可见光谱中至少95％、97％、99％或高达100％的光)。在优选的实施例中，低粘度、大体上光学透明、无溶剂、可辐射固化的粘合剂是低荧光粘合剂。也就是说，粘合剂具有低的固有荧光。
除了其所需的光学性质之外，这种液体粘合剂还可具有低挥发性，这是因为高达100％的粘合剂的体积可由可固化部分组成。同样地，这种粘合剂在固化时可具有非常低的收缩率，并且由于不存在挥发性溶剂组分，其体积不会随时间而改变。低挥发性和低收缩率可以增加本文所述的荧光标准品的稳定性，因为粘合剂基质的体积和化学组成大体上不随时间变化。
如本文所述，荧光标准品10中使用的粘合剂14是低粘度粘合剂。在一个实施例中，粘合剂在约15℃-25℃下的粘度为约10厘泊-100厘泊。优选地，粘合剂在15℃-25℃下的粘度为12厘泊-30厘泊。更优选地，粘合剂在15℃-25℃下的粘度为约15厘泊-25厘泊。在该粘度范围内(例如10厘泊-100厘泊、12厘泊-30厘泊或15厘泊-25厘泊)的粘合剂相对较薄并且可以容易地与量子点混合并且可以可重复地移液。相比之下，水在室温下的粘度为1厘泊，浓缩苹果汁在室温下的粘度约为30厘泊，普通植物油(大豆油、玉米油和棉籽油)的室温粘度约为30厘泊-80厘泊。
在一个具体实施例中，粘合剂是诺兰光学粘合剂NOA 89(新泽西州，克兰伯里，诺兰产品公司)。NOA 89是一种清澈、无色的液体光聚合物，当暴露在紫外线和/或可见光(蓝紫色)下时会固化。由于其是单组分体系和100％固体，因此具有低挥发性和低收缩率。应理解，可以使用其他粘合剂，特别是光学清澈、透明和低荧光粘合剂。除了上述特定粘合剂之外，诺兰产品公司是可适用于制备本文所述的荧光标准品的许多大体上光学透明的粘合剂的供应商。
在荧光标准品10的一个实施例中，荧光粒子16(例如量子点)以适合在选定波长和激发强度上提供限定的发射强度的浓度被包含在粘合剂14中。在一个实施例中，量子点可以以约0.01μg/ml至约10μg/ml的浓度、优选约0.05μg/ml至约1μg/ml的浓度、更优选地约0.075μg/ml至约0.2μg/ml的浓度被包含在粘合剂中。在一个实施例中，量子点可以以约0.01μg/ml、0.02μg/ml、0.03μg/ml、0.04μg/ml、0.05μg/ml、0.06μg/ml、0.07μg/ml、0.08μg/ml、0.09μg/ml、0.1μg/ml、0.11μg/ml、0.12μg/ml、0.13μg/ml、0.14μg/ml、0.15μg/ml、0.16μg/ml、0.17μg/ml、0.18μg/ml、0.19μg/ml、0.2μg/ml、0.21μg/ml、0.22μg/ml、0.23μg/ml、0.24μg/ml、0.25μg/ml、0.26μg/ml、0.27μg/ml、0.28μg/ml、0.29μg/ml、0.3μg/ml、0.35μg/ml、0.4μg/ml、0.45μg/ml、或0.5μg/ml的低端浓度，10μg/ml、9.5μg/ml、9μg/ml、8.5μg/ml、8μg/ml、7.5μg/ml、7μg/ml、6.5μg/ml、6μg/ml、5.5μg/ml、5μg/ml、4.5μg/ml、4μg/ml、3.5μg/ml、3μg/ml、2.5μg/ml、2μg/ml、1.5μg/ml、1μg/ml、0.9μg/ml、0.8μg/ml、0.7μg/ml、0.6μg/ml、或0.55μg/ml的高端浓度，或前述高端数值与低端数值或其间任何浓度的任何结合被包含在粘合剂中。
虽然前述内容旨在提供用于理解适于在选定波长和激发强度下提供限定的发射强度的浓度的数值框架，但是将理解的是，因为量子点的质量和强度可能因供应商而异，并且仪器可以具有不同的激发和检测效率，所以在选定波长和激发强度下提供限定的发射强度所需的QD浓度可以根据应用而变化。
在一个实施例中，包含在荧光标准品中的荧光颗粒(例如量子点)吸收和发射约350nm至850nm范围内的光。这表示从柔光(soft)UV(350nm)到短波长IR(850nm)的范围。使用标准品QD可以容易地获得这样的范围。
在一个实施例中，荧光标准品10中包含的荧光颗粒至少包括具有绿色的第一量子点。在另一个实施例中，荧光标准品10中包含的荧光颗粒至少包括具有红色的第二量子点。
在一个实施例中，荧光标准品10中包含的荧光颗粒至少包括第一量子点，其在约450nm至约550nm的范围内吸收并且在约500nm至630nm的范围内发射。在另一个实施例中，荧光标准品10中包含的荧光颗粒至少包括第二量子点，其在约550nm至约650nm的范围内吸收并且在约630nm至720nm的范围内发射。
现在参考图2A-图3，其中示出了多孔荧光标准品。在一个实施例中，多孔荧光标准品包括粘合剂(例如，低粘度、大体上光学透明、无溶剂、可辐射固化的粘合剂)，分散在粘合剂中的选定量的荧光颗粒(例如量子点)，以及具有多个样品孔的多孔形式板。在多孔板中，至少一个样品具有选定量的粘合剂和设置在其中的量子点。粘合剂在置于至少一个样品孔中后固化和凝固。
参考图2A的实施例，多孔形式板是96孔板20。在96孔板20中，孔24中的至少一个包括粘合剂和荧光粒子的组合。在一个实施例中，96孔板20可以仅具有一个包括荧光标准品的孔。在另一个实施例中，所有96孔可包括荧光标准品。在又一个实施例中，仅选定的孔的子集(例如圆圈22中的孔)可包括荧光标准品。
参考图2B，其示出了图2A的96孔板20的孔24沿线2B的剖视图。每个孔24包括选定量的粘合剂26和荧光颗粒28。样品孔24中包括的荧光颗粒28可以是一种类型的(例如一种颜色)或者可以是多种类型的(例如至少两种颜色)，样品孔24中的每个可以具有相同的一种或多种类型的荧光颗粒28，或者某些样品孔可以具有其他类型的荧光颗粒28。在一个实施例中，每个孔包括约1μl-100μl(例如，5μl-10μl)的已组合的粘合剂26和荧光颗粒28。然而，粘合剂26和荧光颗粒28的体积可以根据应用和96孔板中的孔的尺寸而变化。
现在参考图3，其中示出了多孔形式分析板的另一个示例。多孔形式分析板是称为袋30的独立分析阵列的一部分。袋30包括多个试剂储存器32、细胞裂解区34、核酸纯化区36、第一PCR区38和第二PCR区40。通过多个试剂储存器32的端口将怀疑含有未知微生物(例如病原体)的样品注入袋30中，并且通过多个试剂储存器32的其他端口添加用于制备样品的试剂。样品在膜阵列仪器中被自动制备并进行PCR扩增。在第二级PCR区40中，已制备的细胞裂解物经受PCR循环并在第二级PCR区40中进行可能的扩增(其对于选定的微生物(例如可能的病原体)组(panel)是独特的)。第二级PCR区40中的孔42中的每个具有一组引物(primer)，其可以扩增DNA(对于该微生物组的一种微生物来说是独特的)。如果来自样品的未知微生物在该组中，则一个或多个孔42中的引物将扩增来自该微生物的DNA，并且可以荧光检测该扩增。
可以在美国专利第8,394,608号、第8,940,526号和第9,102,911号、以及美国专利公开第2015/0099291号中找到膜阵列系统的更多论述、其如何操作以及如何使用，其全部内容通过引用并入本文。
因为膜阵列系统中的扩增产物被荧光检测，所以理想的是具有用于校准荧光激发和检测系统的标准品。在一个实施例中，可以通过用一定量的粘合剂26和荧光颗粒28填充第二级PCR区40的孔42来制备标准品。可以填充第二PCR区的孔42，使得每个孔包括大体上相同体积的粘合剂和大体上相同量的荧光颗粒。然而其他构造也是可行的。
再次参见图2A，圆圈22表示多孔板的中心。许多荧光仪器包括单个灯或光源、光束扩散器和用于激发荧光的滤光器。期望的是均匀地扩散光，但实际上，如果光源正确对准，则板中心的孔将比周边的孔更强烈地被照射。因此，本文所述的荧光标准品可用于检查光源的对准，并且如果需要，可用于调节光源的对准。在一个实施例中，多孔形式板的每个孔可以适于在选定的波长和激发强度下提供大体上相同的发射强度。也就是说，多孔形式板中的每个孔可以设置有大体上相同的体积、大体上相同的量和大体上相同类型的荧光颗粒。在其他实施例中，多孔形式板的一个或多个选定的孔可以适于在选定的波长和激发强度下提供不同的发射强度。
本文所述的荧光标准品可用于本领域已知的各种荧光仪器中。在一个优选的实施例中，本文所述的荧光标准品被构造用于在PCR仪器中使用，所述PCR仪器被设计用于PCR扩增和融化的实时荧光监测。因此，本公开的一个实施例包括一种设备，其包括热循环系统，该热循环系统包括：样品块，其被构造为接收多孔形式板；光学系统，其包括光学照明系统和光学观察系统，其中光学系统被定位在该设备中以便照射和观察插入样品块中的多孔形式板(例如96孔板)的内容物；以及多孔形式板，其具有多个样品孔，其中多孔形式板的至少一个样品孔中具有本文描述的固体荧光标准品。
荧光标准品包括粘合剂(例如，大体上光学透明、无溶剂、可辐射固化的粘合剂)，分散在粘合剂中的选定量的荧光颗粒(例如量子点)。粘合剂在被置于至少一个样品孔中后固化。在一个实施例中，荧光标准品被包含在96孔板的每个孔中。
图9示出了荧光标准品110的替代实施例。在该实施例中，多孔板形式是片材形式，其包括支撑材料112。支撑材料可以是大体上光学透明的柔性或半柔性片材，示例性地是塑料或其他易于切割或修剪的材料。在支撑材料112上提供粘合剂114(例如大体上光学透明、无溶剂、可辐射固化的粘合剂)，以及分散在粘合剂114中的选定量的荧光颗粒116。粘合剂114和荧光颗粒116可以类似于上文所讨论的粘合剂14和颗粒16。粘合剂114和颗粒116混合，然后粘合剂114在支撑材料112上固化。在该实施例中，片材可以是特定尺寸或可以被修剪尺寸，以示例性地适合各种尺寸的仪器，或者可以根据特定仪器的校准需要来修剪。剪刀189、刀具或其他切割工具可用于修剪荧光标准品110。在替代实施例(未示出)中，可选择具有以下特性的粘合剂：例如通过在可以从其上剥离粘合剂层的层上固化，允许省去支撑材料。这种荧光标准品将包括由粘合剂制成的柔性或半柔性片材，以及分散在粘合剂中的选定量的荧光颗粒。
在一个实施例中，荧光标准品110中包含的荧光颗粒(例如量子点)吸收并发射约350nm至850nm范围内的光。这表示从柔光UV(350nm)到短波长IR(850nm)的范围。使用标准品QD可以容易地获得这样的范围。
在一个实施例中，荧光标准品中包含的荧光颗粒(参见例如标准品10或标准品110)可至少包括具有绿色的第一量子点。在另一个实施例中，荧光标准品中包含的荧光颗粒(参见例如标准品10或标准品110)可至少包括具有红色的第二量子点。但是应理解，可以使用用于荧光检测的任何染料颜色。示例性地，可以使用具有类似于FAM、HEX、ROX、Cy5、VIC、JOE或其他常用荧光团的颜色的量子点，对应于绿色、黄色、橙色、红色、紫色和蓝色。
在一个示例性实施例中，量子点的混合物可用于匹配特定荧光团的发射光谱。在一个非限制性示例中，仪器可以主要与FAM一起使用，并且量子点可以以一颜色比使用，以大体上匹配FAM的发射光谱。在一个这样的示例性示例中，可以使用不同量子点的线性组合来近似(approximate)有机荧光染料的发射光谱，其中可以通过使用普通最小二乘法为超定(over-determined)方程组求解，来确定量子点的最佳浓度。示例性地，对于超定系统：
Y＝AX
使用最小二乘法求解X：
X＝(ATA)-1ATY
其中：
T表示矩阵转置，
X是矢量解，表示每个量子点染料的光学浓度，
Y是要近似的有机染料的光谱矢量，以及
A是由每种量子点染料的基础矢量组成的矩阵。每个量子点的光谱可以竖向排列以形成矩阵。
上述系统的给定解——即模拟所选染料的发射光谱所需的量子点的特定混合物——可能根据许多因素而变化，上述因素包括但不限于量子点质量和寿命(取决于实际寿命和储存条件)。例如，因为上述系统的给定解是混合以模拟染料的QD的发射光谱的函数，并且因为QD群体的发射光谱是批次中QD的尺寸分布的函数，所以系统的解可能会根据QD供应商和从销售商获得的QD质量而变化。因此，虽然上述系统描述了寻找模拟给定染料的发射光谱所需的QD混合物的过程，但是当购买新批次的QD时、当更换供应商时、或者当之前购买的QD过期时，该过程可能例如需要重复。
在一个实施例中，荧光标准品中包含的荧光颗粒(例如参见标准品10或标准品110)至少包括第一量子点，其在约450nm至约550nm的范围内吸收且在约500nm至630nm的范围内发射。在另一个实施例中，荧光标准品10中包含的荧光颗粒至少包括第二量子点，其在约550nm至约650nm的范围内吸收且在约630nm至720nm的范围内发射。
参考图4，示出了适于PCR和样品的实时荧光监测的热循环设备700的框图。设备700包括控制系统702、热循环系统708和光学系统710。光学系统710与热循环系统708可操作地关联。在一个实施例中，光学系统710包括样品块(例如样品块716)。样品块包括顶表面和多个样品孔，其被构造为接收多孔形式板(例如96孔板)。
光学系统710还可以包括相机和激发光源，每个相机和激发光源相对于样品块位于光路中的固定位置。样品块、照明光源和相机相对于彼此定位和布置，使得照明光源可以激发样品块中的多个样品或一个或多个荧光标准品中的荧光，并且相机可以观察并记录荧光信号
在光学系统710的一个实施例中，照明光源还可以包括一个或多个滤光器，其可以用于选择各种激发波长以激发形成各种染料和量子点的荧光。例如，滤光器可用于选择激发波长，所述激发波长选自但不限于470nm、530nm、586nm和630nm。同样地，相机可以配备有滤光轮和滤光器，其可以用于过滤各种荧光信号，例如510nm、555nm、620nm、640nm、665nm和710nm的荧光信号。例如，本文所述的荧光标准品可包括使用可同时发荧光的多个QD。可以从标准品中选择许多激发波长和发射波长用于仪器的校准和标准化。
在一个示例中，照明光源可以包括多色光源，并且滤光器可以是所谓的双带滤光器。例如，照明光源可以包括一个或多个灯，每个灯配备有具有至少两种不同颜色的若干LED；还可以包括聚焦光学器件，其能够聚焦和扩散来自LED的光，使得这些聚焦光学器件提供示例性的大体上高斯式(gaussian)的输出。双带滤光器可以各自配备成使得它们可以从不同的LED通过一个发射带。例如，第一滤光器能够通过以470nm和586nm为中心的光带，第二滤光器能够通过以530nm和630nm为中心的光带。使用这样的照明光源和滤光器，光学系统710可以被构造为仅从两个灯产生多达四个不同的激发波长。在其他实施例中，滤光器可以是例如三带通滤光器，并且照明光源可以包括例如两个灯，且每个灯能够产生三个离散的光色范围。这种系统可以被构造为仅从两个灯产生多达六个不同的激发波长。
设备700还可包括：加热系统718和冷却系统720，其可操作地联接到样品块716；控制系统702，其用于操作且可操作地连接到加热系统718和冷却系统720；以及温度感测系统728和734，其被构造为感测样品块中的温度。温度感测系统728和734可操作地连接到加热和冷却系统和控制系统，使得响应于温度感测系统感测到的温度，设置在样品块中的多个样品的温度可以通过加热和冷却系统快速且可控地增加和减少，使得多个样品可以经受快速热循环。在一个实施例中，控制系统702包括外部计算装置，其可操作地联接到热循环系统708、光学系统710、加热和冷却系统718、720、控制系统702或温度感测系统728、734中的至少一个。
进一步参考图4，样品714(即，包括待扩增的核酸或荧光标准品的样品)可以放置在温度受控的样品块716中，并且可以被加热盖712覆盖。样品714可以被保持在样品保持器中(例如，在多孔孔板、管条或单个样品管等中)，其被构造为置于样品块716中。样品块716可以是例如从诸如铜或铝的导热金属而构造的金属块。
用户可以经由终端704提供限定期望的PCR协议的时间和温度参数(例如，时间-温度曲线)的数据。例如，终端704可以包括外部计算装置，该外部计算装置包括键盘、显示器、和一个或多个控制、存储器或编程模块(其允许编程和控制热循环参数)，或者可以被整合到该设备。用户终端704经由数据总线705联接到控制器706(有时称为中央处理单元或CPU)。控制器706可包括存储器，其存储期望的控制程序、定义期望的PCR协议的数据和某些校准常数。基于控制程序，控制器706可以控制样品块716和/或容纳样品714的保持器的温度循环，并实现用户界面，该用户界面向用户提供特定显示并且接收用户经由用户终端704输入的数据。同样地，控制器706可以包括存储器，其存储用于控制或管理经由光学系统710从样品收集荧光数据的期望程序。基于控制程序，控制器706可以控制光学系统参数，例如光学数据收集的时间、波长数据等，并实现用户界面，该用户界面向用户提供某些显示并接收用户输入的数据。应理解，控制器706和相关的外围电子器件控制各种加热器、光学系统710和热循环系统708的其他机电系统以及读取各种感测器，上述控制器706和相关的外围电子器件可以包括例如适当地编程的个人计算机或微型计算机的任何通用计算机。
控制器706可包括适当的电子器件以感测加热盖712的温度并控制其中的电阻加热器以将盖712保持在预定温度。通过温度感测器(未示出)和数据总线724实现对加热盖712的温度感测和对其中的电阻加热器的控制。
冷却系统720可以提供样品714的精确温度控制。根据一些方案，可以操作冷却系统720以实现样品714的快速、有效和/或均匀的温度控制。根据一些方案，可以操作冷却系统720以快速和/或有效地在各种样品之间实现期望的温度梯度。例如，冷却系统720可以被构造为将样品714的温度从高温变性温育(incubation)降到低温退火和延伸温育温度。例如，冷却系统720可以降低样品块716的温度，或者可以用于直接降低容纳样品714的保持器的温度。
加热系统718可以由控制器706通过数据总线730控制，以将样品块716和/或样品保持器的温度从较低的温育温度快速升高到较高的温育温度。加热系统718还可以在温育期间的温度追踪和控制期间校正沿向上方向的温度误差。
加热系统718可包括但不限于薄膜加热器、电阻加热器、加热空气、红外加热、对流加热、感应加热(例如盘绕线)、基于珀耳帖的热电加热、以及本领域技术人员已知的其他加热机构。根据各种示例性实施例，冷却系统和加热系统可以是单个系统，其被构造为直接增加和降低块712和/或样品保持器的温度。
在图4的示例性实施例中，控制器706通过经由温度感测器728和数据总线726感测样品块716的温度并通过经由总线732和冷却系统720中的温度感测器734感测冷却系统720的温度来控制样品块716的温度。仅作为示例，可以感测冷却系统720的温度，但是也可以感测与冷却系统相关联的其他温度。
本文讨论的荧光标准品可用于校准和标准化仪器，比如参照图4描述的设备的仪器。另外，因为量子点的荧光在一定程度上受温度影响，所以本文描述的荧光标准品可用于监测仪器的热动态响应。在具有例如96个孔的样品块中，可能的是，一些样品孔在它们在循环中和在静态温度控制中的温度响应方面剧烈下降(drastically off)。监测热动态响应将显示哪些样品的温度过调或振荡，但不能显示其程度。
在PCT/US2011/063005(公布号为WO2012/075360)中可以找到可用于本文公开的装置和设备中的热循环系统的进一步讨论，其全部内容通过引用并入本文。在美国专利第7,670,832号中可以找到关于样品、特别是PCR样品的荧光监测的论述，其全部内容通过引用并入本文。
现在将参考某些非限制性示例。
示例1
参考图5，其示出的数据说明了荧光标准品在大约三个月的时间内的稳定性。用于收集图5数据的荧光标准品包括96孔板的8个孔，并且标准品包括嵌入本文所述的可UV固化粘合剂中的单色(即绿色)QD。数据显示荧光标准品在三个月的研究期间是稳定和可用的。虽然荧光响应有一些下降，但这可能是因为仪器校准问题。重新校准仪器，其后荧光数据返回接近其原始响应。
示例2
示例1的标准品中使用的QD的响应应该是稳定的。然而，已知板和粘合剂提供一些背景荧光。为了确定示例1中荧光响应的缓慢下降的可能来源，研究了板和粘合剂的荧光响应作为时间和在黑暗和光照下的储存的函数。图6示出了板和粘合剂的数据。
可以发现板(上面图框，upper panel)的背景荧光不随时间变化并且不受在黑暗或光照下储存的影响。相反，发现由粘合剂贡献的背景荧光可能受到暴露于环境光的影响。在下面图框(lower panel)中，显示的数据说明了这一点。具有储存在黑暗中的粘合剂的板的荧光不随时间改变，但是暴露于环境光的粘合剂的荧光有一些下降。
基于这些数据，发明人确定最好保护荧光标准品免受环境光的影响，例如通过在不使用时将板储存在不透明的容器(例如袋子、盒子等)中。例如，荧光标准品可以储存在不透光的袋子(例如由镀铝的聚酯薄膜制成的袋子)中。这种储存容器还具有保护荧光标准品以免不使用时灰尘和污垢可能沉积在标准品上的优点。图10中示出了这种储存容器的一个示例。在图10中，包括本文所述荧光标准品的具有一个或多个孔的96孔板20可以储存在不透光的袋子200中。这种袋子200可以由镀铝的聚酯薄膜、不透明的塑料等制成。
示例3
参考图7，示出了比较储存在环境光和黑暗中的荧光标准品的响应的数据。结果发现，对于光照和黑暗储存的标准品的响应彼此一致。注意：重新校准仪器后执行最后一个数据点。
示例4
膜阵列袋的第二级用类似于示例1中所使用的混合物填充并允许其固化。将该第二级置于膜阵列袋中以产生校准器袋。参考图8，示出的数据说明校准器袋可以用粘合剂和QD填充，并且这种标准品可以用于校准膜阵列器械的响应。校准器袋在三个膜阵列仪器(顶行)上运行，一个仪器上三次运行的结果如下方所示。
在不脱离本发明的精神或基本特征的情况下，本发明可以以其他特定形式实施。所描述的实施例在所有方面都应被视为仅是说明性的而非限制性的。因此，本发明的范围由所附权利要求书表示，而非前文的描述。在权利要求的含义和等同范围内的所有变化都包含在其范围内。

Claims (48)

1.一种荧光标准品，包括：
粘合剂；
选定量的非光漂白荧光颗粒，其分散在所述粘合剂中；以及
样品孔，其具有所述粘合剂和所述非光漂白荧光颗粒，其中所述粘合剂在置于所述样品孔中后固化和凝固，
其中，所述非光漂白荧光颗粒是量子点，而且所述非光漂白荧光颗粒在固化前和固化后均匀悬浮在所述粘合剂中，从而使得所述非光漂白荧光颗粒在固化前和固化后胶状地悬浮在所述粘合剂中，
其中，所述非光漂白荧光颗粒是至少两种不同颜色的不同非光漂白荧光颗粒的混合物，使得所述混合物具有匹配所选荧光团的发射光谱的组合发射光谱，
其中，所述混合物是通过求解一超定方程组来确定的，其中，
Y＝AX
通过使用最小二乘法求解X来确定X：
X＝(ATA)-1ATY
其中：
T表示矩阵转置；
X是矢量解，表示每种不同的非光漂白荧光颗粒的光学浓度；
Y是要近似的所述非光漂白荧光颗粒的光谱的矢量；以及
A是由每种不同的非光漂白荧光颗粒的基础矢量组成的矩阵。
2.根据权利要求1所述的荧光标准品，其中，所述粘合剂是一种低粘度、光学透明、无溶剂、能辐射固化的粘合剂。
3.根据权利要求1或2所述的荧光标准品，其中，所述粘合剂是能UV固化的粘合剂。
4.根据权利要求1或2所述的荧光标准品，其中，所述粘合剂在15℃-25℃下的粘度为10厘泊-100厘泊。
5.根据权利要求1或2所述的荧光标准品，其中，所述粘合剂在15℃-25℃下的粘度为15厘泊-25厘泊。
6.根据权利要求1所述的荧光标准品，其中，所述非光漂白荧光颗粒以适于在选定波长和激发强度下提供限定的发射强度的浓度被包括在所述粘合剂中。
7.根据权利要求1所述的荧光标准品，其中，所述非光漂白荧光颗粒以0.01μg/ml至10μg/ml的浓度被包括在所述粘合剂中。
8.根据权利要求1所述的荧光标准品，其中，所述非光漂白荧光颗粒吸收和发射350nm至850nm范围内的光。
9.根据权利要求8所述的荧光标准品，其中，所述非光漂白荧光颗粒至少包括具有绿色发射波长的第一量子点。
10.根据权利要求9所述的荧光标准品，其中，所述非光漂白荧光颗粒至少包括具有红色发射波长的第二量子点。
11.根据权利要求1所述的荧光标准品，其中，所述非光漂白荧光颗粒至少包括第一量子点，其在450nm至550nm的范围内吸收并且在500nm至630nm的范围内发射。
12.根据权利要求1所述的荧光标准品，其中，所述非光漂白荧光颗粒至少包括第二量子点，其在550nm至650nm的范围内吸收并且在630nm至720nm的范围内发射。
13.根据权利要求1所述的荧光标准品，其中，所述样品孔是包括所述样品孔和多个附加样品孔的多孔板的一个孔，并且所述附加样品孔中的每个孔也包括粘合剂和被置于其中的所述非光漂白荧光颗粒，其中，所述粘合剂在被置于所述附加样品孔中后固化和凝固。
14.一种多孔荧光标准品，包括：
粘合剂；
选定量的非光漂白荧光颗粒，其分散在所述粘合剂中；以及
具有多个样品孔的多孔形式板，其中，所述多孔形式板的至少一个样品孔具有选定量的所述粘合剂和被置于其中的所述非光漂白荧光颗粒，其中，所述粘合剂在被置于所述至少一个样品孔中后固化和凝固，
其中，所述非光漂白荧光颗粒是量子点，而且所述非光漂白荧光颗粒在固化前和固化后均匀悬浮在所述粘合剂中，从而使得所述非光漂白荧光颗粒在固化前和固化后胶状地悬浮在所述粘合剂中，
其中，所述非光漂白荧光颗粒是至少两种不同颜色的不同非光漂白荧光颗粒的混合物，使得所述混合物具有匹配所选荧光团的发射光谱的组合发射光谱，
其中，所述混合物是通过求解一超定方程组来确定的，其中，
Y＝AX
通过使用最小二乘法求解X来确定X：
X＝(ATA)-1ATY
其中：
T表示矩阵转置；
X是矢量解，表示每种不同的非光漂白荧光颗粒的光学浓度；
Y是要近似的所述非光漂白荧光颗粒的光谱的矢量；以及
A是由每种不同的非光漂白荧光颗粒的基础矢量组成的矩阵。
15.根据权利要求14所述的多孔荧光标准品，其中，所述粘合剂是一种低粘度、光学透明、无溶剂、能辐射固化的粘合剂。
16.根据权利要求14或15所述的多孔荧光标准品，其中，所述粘合剂是能UV固化的粘合剂。
17.根据权利要求14所述的多孔荧光标准品，其中，所述多孔形式板是96孔板。
18.根据权利要求14所述的多孔荧光标准品，其中，所述多孔形式板是独立分析阵列或袋的第二级阵列。
19.根据权利要求14所述的多孔荧光标准品，其中，所述非光漂白荧光颗粒以适于在选定的波长和激发强度下提供限定的发射强度的浓度被包括在所述多孔形式板的每个孔中的粘合剂中。
20.根据权利要求19所述的多孔荧光标准品，其中，所述多孔形式板的每个孔包括相同体积的所述粘合剂和相同量的所述非光漂白荧光颗粒。
21.根据权利要求19所述的多孔荧光标准品，其中，所述多孔形式板的每个孔适于在选定的波长和激发强度下提供相同的发射强度。
22.根据权利要求14所述的多孔荧光标准品，其中，所述非光漂白荧光颗粒吸收和发射350nm至850nm范围内的光。
23.根据权利要求22所述的多孔荧光标准品，其中，所述非光漂白荧光颗粒至少包括具有绿色发射波长的第一量子点。
24.根据权利要求23所述的多孔荧光标准品，其中，所述非光漂白荧光颗粒至少包括具有红色发射波长的第二量子点。
25.根据权利要求14所述的多孔荧光标准品，其中，所述非光漂白荧光颗粒至少包括第一量子点，其在450nm至550nm的范围内吸收并且在500nm至630nm的范围内发射。
26.根据权利要求25所述的多孔荧光标准品，其中，所述非光漂白荧光颗粒至少包括第二量子点，其在550nm至650nm的范围内吸收并且在630nm至720nm的范围内发射。
27.一种适于PCR和样品的实时荧光监测的热循环设备，包括：
热循环系统，其包括被构造为接收多孔形式板的样品块；
光学系统，其包括光学激发系统和光学观察系统，其中，所述光学系统位于所述设备中，用于照射和观察插入所述样品块中的多孔形式板的内容物；以及
固体荧光标准品，其被置于样品孔中，所述样品孔设置在所述样品块的至少一个孔中，其中，所述荧光标准品包括：
粘合剂；以及
选定量的非光漂白荧光颗粒，其分散在所述粘合剂中，
所述样品孔具有所述粘合剂和所述非光漂白荧光颗粒，其中所述粘合剂在置于所述样品孔中后固化和凝固，
其中，所述粘合剂在被置于所述样品孔中后固化，所述非光漂白荧光颗粒是量子点，而且所述非光漂白荧光颗粒在固化前和固化后均匀悬浮在所述粘合剂中，从而使得所述非光漂白荧光颗粒在固化前和固化后胶状地悬浮在所述粘合剂中，
其中，所述非光漂白荧光颗粒是至少两种不同颜色的不同非光漂白荧光颗粒的混合物，使得所述混合物具有匹配所选荧光团的发射光谱的组合发射光谱，
其中，所述混合物是通过求解一超定方程组来确定的，其中，
Y＝AX
通过使用最小二乘法求解X来确定X：
X＝(ATA)-1ATY
其中：
T表示矩阵转置；
X是矢量解，表示每种不同的非光漂白荧光颗粒的光学浓度；
Y是要近似的所述非光漂白荧光颗粒的光谱的矢量；以及
A是由每种不同的非光漂白荧光颗粒的基础矢量组成的矩阵。
28.根据权利要求27所述的设备，其中，所述样品孔是包括所述样品孔和多个附加样品孔的多孔板的一个孔，并且所述附加样品孔中的每个孔也包括粘合剂和被置于其中的所述量子点，其中，所述粘合剂在被置于所述附加样品孔中后固化和凝固。
29.根据权利要求28所述的设备，其中，所述多孔形式板是96孔板。
30.根据权利要求29所述的设备，其中，所述荧光标准品被包括在所述96孔板的每个孔中。
31.根据权利要求27所述的设备，其中，所述非光漂白荧光颗粒以适于在选定的波长和激发强度下提供限定的发射强度的浓度被包括在所述多孔形式板的每个孔中的粘合剂中。
32.根据权利要求27所述的设备，其中，所述多孔形式板的每个孔包括相同体积的粘合剂和相同量的非光漂白荧光颗粒。
33.根据权利要求32所述的设备，其中，所述多孔形式板的每个孔适于在选定的波长和激发强度下提供相同的发射强度。
34.根据权利要求27所述的设备，其中，所述荧光标准品的非光漂白荧光颗粒吸收和发射350nm至850nm范围内的光。
35.根据权利要求27所述的设备，其中，所述非光漂白荧光颗粒至少包括具有绿色发射波长的第一量子点。
36.根据权利要求35所述的设备，其中，所述非光漂白荧光颗粒至少包括具有红色发射波长的第二量子点。
37.根据权利要求27所述的设备，其中，所述热循环系统还包括：
加热和冷却系统，其能操作地联接到所述样品块；
控制系统，其用于操作并能操作地联接到所述加热和冷却系统；以及
温度感测系统，其被构造为用于检测所述样品块中的温度，所述温度感测系统能操作地连接所述加热和冷却系统和所述控制系统，使得响应于所述温度感测系统感测到的温度，被置于所述样品块中的多个样品的温度能够通过所述加热和冷却系统快速且受控地增加和减少，使得所述多个样品能够经受快速热循环。
38.根据权利要求37所述的设备，其中，所述控制系统包括外部计算装置，所述外部计算装置能操作地联接到所述热循环系统、所述光学系统、所述加热和冷却系统、所述控制系统或所述温度感测系统中的至少一个。
39.根据权利要求27所述的设备，其中，所述光学激发系统包括带通滤光器，所述带通滤光器能够传输来自光学照射系统的至少两个不同光带，以激发来自设置在所述多孔形式板的样品孔中的两个或更多个荧光体的荧光，并且光学记录系统是定位为收集来自所述两个或更多个荧光体的荧光的相机。
40.根据权利要求39所述的设备，其中，所述相机配备有一个或多个滤光器，所述滤光器被构造为分离来自两个或更多个荧光团的信号。
41.根据权利要求40所述的设备，其中，所述光学照射系统的带通滤光器被构造为传输以470nm、530nm、586nm或630nm为中心的两个或更多个光带，并且所述相机的一个或多个滤光器分别能够传输以510nm、555nm、620nm、640nm、665nm或710nm为中心的光带。
42.根据权利要求40所述的设备，其中，所述光学系统包括两个照明光源和相应数量的带通滤光器，使得所述光学系统能够同时传输来自两个照明光源的至少四种不同波长的光。
43.根据权利要求27所述的设备，其中，所述光学系统还包括聚焦光学器件，所述聚焦光学器件包括能够聚焦和扩散来自照明光源的光。
44.一种荧光标准品，包括：
粘合剂；
选定量的非光漂白荧光颗粒，其分散在所述粘合剂中，所述非光漂白荧光颗粒是量子点；以及
片材，其包括所述粘合剂和所述量子点，其中，所述粘合剂在被置于所述片材中后固化和凝固，
其中，所述非光漂白荧光颗粒在固化前和固化后均匀悬浮在所述粘合剂中，从而使得所述非光漂白荧光颗粒在固化前和固化后胶状地悬浮在所述粘合剂中，
其中，所述非光漂白荧光颗粒是至少两种不同颜色的不同非光漂白荧光颗粒的混合物，使得所述混合物具有匹配所选荧光团的发射光谱的组合发射光谱，
其中，所述混合物是通过求解一超定方程组来确定的，其中，
Y＝AX
通过使用最小二乘法求解X来确定X：
X＝(ATA)-1ATY
其中：
T表示矩阵转置；
X是矢量解，表示每种不同的非光漂白荧光颗粒的光学浓度；
Y是要近似的所述非光漂白荧光颗粒的光谱的矢量；以及
A是由每种不同的非光漂白荧光颗粒的基础矢量组成的矩阵。
45.根据权利要求44所述的荧光标准品，其中，所述片材能够被修剪以适合需要校准的仪器。
46.一种荧光标准品，包括：
粘合剂；
选定量的非光漂白荧光颗粒，其分散在所述粘合剂中；
样品孔，具有置于其中的所述粘合剂和所述非光漂白荧光颗粒，其中，所述粘合剂在被置于所述样品孔中后固化和凝固；以及
储存容器，用于储存所述荧光标准品，其中，所述储存容器被构造为排除光，
其中，所述非光漂白荧光颗粒是量子点，而且所述非光漂白荧光颗粒在固化前和固化后均匀悬浮在所述粘合剂中，从而使得所述非光漂白荧光颗粒在固化前和固化后胶状地悬浮在所述粘合剂中，
其中，所述非光漂白荧光颗粒是至少两种不同颜色的不同非光漂白荧光颗粒的混合物，使得所述混合物具有匹配所选荧光团的发射光谱的组合发射光谱，
其中，所述混合物是通过求解一超定方程组来确定的，其中，
Y＝AX
通过使用最小二乘法求解X来确定X：
X＝(ATA)-1ATY
其中：
T表示矩阵转置；
X是矢量解，表示每种不同的非光漂白荧光颗粒的光学浓度；
Y是要近似的所述非光漂白荧光颗粒的光谱的矢量；以及
A是由每种不同的非光漂白荧光颗粒的基础矢量组成的矩阵。
47.根据权利要求46所述的荧光标准品，其中，所述储存容器包括镀铝的聚酯薄膜。
48.根据权利要求46所述的荧光标准品，其中，所述样品孔包括96孔板，并且所述荧光标准品被容纳在所述96孔板的多于一个孔中。
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