JP6221206B2 - 液充填器具及びその液充填器具を用いたキャピラリへの液充填方法 - Google Patents

Description

本発明は、オイルゲルを用いて試薬液を収容したキャピラリ内で磁性粒子を操作することにより行なう対象成分の抽出、精製、合成、溶出、分離、回収、分析に関するものである。具体的には、磁性粒子を操作するためのキャピラリに試薬液等を充填するための液充填器具及びその液充填器具を用いたキャピラリへの液充填方法に関するものである。

直径が十数μｍから０．５μｍで水に不溶な微粒子の表面に、種々の化学的な親和力を持たせることにより、対象成分の抽出・精製、分離、回収等を行なうことができる。また、特定細胞表面分子を認識して対象細胞の回収を行なうこともできる。このことから、対象に応じて機能性分子を粒子表面に導入した微粒子が市販されている。これら微粒子のうち、粒子材質が酸化鉄等の強磁性体であるものは、磁石による対象成分の回収が可能で、遠心操作が不要となるため、化学抽出・精製の自動化に有利な特長を持つ。

例えば、細胞からの核酸抽出及び遺伝子増幅反応による分析までを連続して一つのデバイスで行なうシステムが市販されている。例えば、米国Cepheid 社GeneXpert Systemでは、核酸抽出から遺伝子増幅反応による分析までをひとつのカートリッジ型デバイスで行なうことができ、同時処理検体数は最大１６である。（GeneXpert Systemの技術内容は、非特許文献１に記載されている。）また例えば、３Ｍ社のSimplexa（非特許文献２）では、核酸抽出からPCRまで一つの円盤形デバイスで行い、一つのディスクに１２検体を固定することができる。

一方、磁性粒子は、抽出・精製キットとしての試薬の一部として市販されている。キットは複数の試薬が別々の容器に入れられており、使用時はユーザーがピペット等で試薬を分取、分注する。自動化された装置の場合においても、現在市販されている装置では、液の分取はピペット操作を機械的に行っている。例えば、プレシジョン・システム・サイエンス社は、磁気粒子を用いて核酸抽出を行なうシステム（非特許文献３）を市販している。

一般的に、市販されている磁性粒子は、試料から対象成分又は特定細胞の分離回収を可能にするが、回収物の分析を行なう場合は、リアルタイムＰＣＲ装置、質量分析装置、フローサイトメトリーなどの別のシステムで行なう必要がある。

細胞からの核酸抽出及び遺伝子増幅反応による分析までを連続して一つのデバイスで行なう市販のシステムにおいては、同時処理検体数が少なく、またデバイス自体も複雑で製造コストが高く実用的ではない。例えば、米国Cepheid 社GeneXpert Systemでは、特にデバイスが複雑かつ高コスト（１検体４２米ドル）である。また、デバイスサイズも大型であるためシステム全体も大型となり、気軽に移動して利用できる製品ではない。特に、比較的検体数が少ない用途のPOCT（Point of Care Testing)になじむ製品でない。

また、例えば、３Ｍ社のSimplexaは、一つのディスクにおける検体数が１２検体に固定されてしまうため、任意の検体数を自由に設定できる仕様にはなっていない。

磁性粒子を試薬の一部として含む抽出・精製キットを使用する際に必須となるピペット操作はエアロゾルの発生を伴う。これは、分析の妨げとなるコンタミネーションの危険性を高める。自動化された装置において、液の分取をピペット操作で機械的に行なう場合も同様である。この場合、エアロゾルの発生によって汚染源が装置内に蓄積されるため、定期的な装置の洗浄が必要である。しかし、ピペット式分注機構で自動化された装置は構造が複雑で汚染源の完全除去は困難である。

プレシジョン・システム・サイエンス社によって市販されている、磁気粒子を用いて核酸抽出を行なうシステムにおいては、精製した核酸の回収までを行なうことができるが、遺伝子増幅反応などによる分析はリアルタイムＰＣＲ装置などの別のシステムで行わなければならない。さらに、このシステムはピペット型分注機による分注が開放系で行なわれるため、コンタミネーションの危険性が常につきまとう。

Clinical Chemistry 51: 882-890, 2005、２００５年３月３日 「FDA Issues Another Emergency Use Authorization for Commercial H1N1 Flu Test to Quest Diagnostics' Focus Diagnostics」、フォーカスダイアグノスティクス社、２００９年１０月１７日 「GC series Magtration Genomic DNA Whole Blood」、プレシジョンサイエンスシステム社、２００８年１２月

上記の問題を解決するために、本願出願人は、エアロゾルの発生を伴う分注機を用いることなく、密閉可能なキャピラリに、一以上の液体試薬を非水溶性ゲル物質で仕切って収容し、そのキャピラリ内の液体試薬中に磁性粒子を存在させたデバイスを作成し、そのデバイスの外部から磁場印加手段によってキャピラリ内の磁性粒子を操作することを提案している。

上記デバイスを作成するために試薬溶液やゲルをキャピラリ内に順に充填していく必要がある。キャピラリに試薬溶液やゲルを充填する作業は、注射器などの注入器具を用いて行なわれる。注入器具からキャピラリ内に試薬溶液やゲルを吐出する際は、注入器具の先端に取り付けられた細管（針）をキャピラリ内部に挿入してその底部や管壁に接触させ、所定量の液を吐出してから針をキャピラリから引き上げる。

注入器具の針をキャピラリから引き上げる際、針先に付着した液がキャピラリの内壁に接触することによって、又はキャピラリに充填された液が針とキャピラリ内壁との間を毛管現象によって上がることによって、キャピラリの内壁に試薬溶液やゲルが付着するという問題がある。キャピラリの内壁に粘度の高い液や冷却などによってゲル化又は固化する液が付着すると、キャピラリ内で操作する磁性粒子（磁気ビーズ）の通過を妨げたり、キャピラリ内を光学的に測定する際に測定感度の低下の原因となったりするなどの問題がある。

注入器具の針先に液が付着しないように液を吐出しながら針先を徐々に引き上げるようにしても、キャピラリの内壁に液が付着することがある。また、注入器具の針先をさらに細くし、針がキャピラリの中心を通るように垂直に引き上げるようにすれば、針先に付着した液がキャピラリの内壁に接触することを防止できるが、針先を細くすると液を吐出する際の圧力が上昇する上、針を正確にキャピラリの中心に位置決めして上下動させる機構を構築することは困難である。

そこで、本発明は、キャピラリに液を充填した後の充填器具の先端に付着した液が充填器具をキャピラリから引き抜く際にキャピラリの内壁に付着することを防止することを目的とするものである。

本発明にかかる液充填器具は、先端に液吐出口を有し液を充填するキャピラリの内径よりも小さい外径の注入針を先端部に備えるとともに、該注入針と導通し液吐出口から吐出する液を貯留する液貯留空間を内部に備えた注入筒と、注入筒の液貯留空間内で一方向に摺動して液貯留空間の容積を変化させる駆動部と、キャピラリの内径よりも小さい外径、注入針の外径よりも大きい内径及び注入針よりも短い長さを有し、注入筒の先端部に注入針の外周面を覆った状態で注入針に沿って注入針とは独立して移動可能に装着された外套管と、を備えたものである。

本発明にかかる液充填方法は、本発明の液充填器具を使用して以下のステップ（１）〜（５）をその順に行なうことを特徴とするものである。
（１）キャピラリに充填する液を注入筒の液貯留空間に吸入するステップ、
（２）注入針を外套管の先端から突出させた状態で、キャピラリ内で液を充填すべき位置に注入針の先端部を配置して液を吐出するステップ、
（３）注入針の先端がキャピラリ内の液面から出るまで液充填器具を引き上げるステップ、
（４）外套管を注入針の先端側へ移動させて外套管内に注入針の先端部を収容するステップ、及び
（５）注入針及び外套管をキャピラリから引き抜くステップ。

本発明の液充填器具では、キャピラリの内径よりも小さい外径、注入針の外径よりも大きい内径及び注入針よりも短い長さを有し、注入筒の先端部に注入針の外周面を覆った状態で注入針に沿って注入針とは独立して移動可能に装着された外套管を備えているので、液を吐出した後で外套管を注入針の先端側へ移動させることによって注入針の先端部を注入針の先端に付着した液滴とともに外套管内に収容することができ、注入針の先端に付着した液滴がキャピラリの内壁に付着することを防止することができる。

本発明の液充填方法では、キャピラリ内に液を充填した後、注入針の先端がキャピラリ内の液面から出るまで液充填器具を引き上げ、外套管を注入針の先端側へ移動させて外套管内に注入針の先端部を収容してから注入針及び外套管をキャピラリから引き抜くようにしたので、注入針の先端に付着した液滴がキャピラリの内壁に付着することを防止することができる。

液充填器具の一実施例を示す断面図であり、（Ａ）は注入針の先端部を外套管から突出させた状態、（Ｂ）は注入針の先端部を外套管内に収容した状態である。 液充填器具の他の実施例を示す断面図であり、（Ａ）は注入針の先端部を外套管から突出させた状態、（Ｂ）は注入針の先端部を外套管内に収容した状態である。 液充填器具のさらに他の実施例を示す断面図であり、（Ａ）は注入針の先端部を外套管から突出させた状態、（Ｂ）は注入針の先端部を外套管内に収容した状態である。 液充填器具のさらに他の実施例を示す断面図である。 液充填器具のさらに他の実施例を示す断面図である。 キャピラリへの液充填方法の手順を示す図である。 キャピラリへの液充填方法を説明するためのフローチャートである。 液充填方法により作成される磁性体操作用デバイスの一例を示す図である。

本発明の液充填器具において、外套管の内径は注入針の外周面との間に毛管力が作用する大きさの隙間が生じる大きさであることが好ましい。そうすれば、注入針の先端に付着した液滴を毛管力によって注入針と外套管との間の隙間に引き込むことができ、キャピラリの内壁に液を付着させることなく確実に注入針をキャピラリから引き抜くことができる。

本発明の液充填器具の好ましい実施態様は、外套管の基端部を保持しながら注入筒の先端側に注入針の長手方向に注入筒とは独立して移動可能に装着された外套管保持部を備えているものである。

上記実施態様において、外套管保持部は、一端が注入針と外套管との間の隙間に通じ他端が該外套管保持部の外部へ通じる引出し流路を備え、引出し流路の他端に注入針と外套管との間の隙間の液を吸入するための吸入機構が接続されていることが好ましい。そうすれば、注入針と外套管との間の隙間の液を除去する作業を別途行なうことなく、注入機構によって注入針と外套管との間の隙間の液を除去することができるので、キャピラリへの液充填作業の効率を向上させることができる。

本発明の液充填方法において上記実施態様の液充填器具を使用すれば、注入針と外套管との間の隙間の液を除去する作業を別途行なうことなく、注入機構によって注入針と外套管との間の隙間の液を除去することができるので、キャピラリへの液充填作業の効率を向上させることができる。

以下、図面を用いて本発明にかかる液充填器具及び液充填方法の実施例について説明する。まず、図１を用いて液充填器具の一実施例について説明する。
この液充填器具は、注入筒２、注入針４、駆動部６及び外套管８を備えている。注入筒２は一端側が開放しており、その一端側から注入筒２の内部の液貯留空間２ａ内に駆動部６が挿入されている。注入筒２の他端に注入針４の基端を保持するための注入針保持部７が設けられており、液貯留空間２ａは孔２ｂを通じて注入針４と通じている。注入針４は液を充填するキャピラリよりも小さい外径をもつ円筒部材であり、先端に液吐出口４ａを備えている。

駆動部６は液貯留空間２ａ内を一方向に摺動するように駆動される。駆動部６が一方向に駆動されることにより液貯留空間２ａの容積が変化し、それによって注入針４を介して液貯留空間２ａ内に液が吸入され又は液貯留空間２ａ内の液が注入針４の先端の液吐出口４ａから吐出される。

外套管８は注入針４の外周面を覆うように注入筒２の先端部に装着されている。外套管８の長さは注入針４よりも短くなっており、外套管８の基端部が注入針保持部７に接した状態で注入針４の先端が外套管８から突出する。注入針４の長さは例えば１２０ｍｍであり、外套管８の長さは例えば１１５ｍｍである。外套管８は注入針４の軸方向に独立してスライドさせることができ、図１の（Ｂ）に示されているように、注入針４の先端側へ外套管８をスライドさせることによって注入針４の先端を外套管８内に収容することができる。

外套管８の外径は液をこの充填器具により液を充填するキャピラリの内径よりも小さく設定されており、液を充填する際に注入針４とともに外套管８もキャピラリ内に挿入されるようになっている。外套管８の内径は注入針４の外周面との間に毛管力が作用する大きさの隙間が生じる大きさに設定されている。

外套管８を所望の位置で保持するために外套管保持部を設けてもよい。図２から図５は外套管８を保持する外套管保持部を設けた例を示すものである。図２の例では、外套管保持部１２が注入針保持部７に装着されている。外套管保持部１２は先端側で外套管８の基端部外周面を保持するとともに基端側で注入針保持部７の外周面を保持する構造となっている。外套管保持部１２は注入針保持部７の外周面に沿って注入針４の軸方向にスライド可能であり、外套管保持部１２のスライドに伴なって外套管８が注入針４の軸方向にスライドするようになっている。

図３の例では、外套管保持部１４が注入筒２の先端側外周面を覆うように装着されている。外套管保持部１４は先端側で外套管８の基端部外周面を保持するとともに基端側で注入筒２の先端側外周面を保持する構造となっている。外套管保持部１４は注入筒２の先端側外周面に沿って注入針４の軸方向にスライド可能であり、外套管保持部１４のスライドに伴なって外套管８が注入針４の軸方向にスライドするようになっている。

図４の実施例は図３の例と同様に、外套管保持部１６が注入筒２本体の先端側外周面を覆うように装着されており、外套管保持部１６は先端側で外套管８の基端部外周面を保持するとともに基端側で注入筒２の外周面を保持する構造となっている。注入針保持部９の外径は注入筒２の本体部分の外径よりも大きく注入筒２の本体部分から周囲方向へ突起している。外套管保持部１６の内径は注入針保持部９の外径よりも僅かに大きく設定されているが、外套管保持部１６の基端部の内径は注入針保持部９の外径よりも小さく注入筒２の本体部分の外径よりも僅かに大きく設定されている。これにより、外套管保持部１６を注入針４の先端側へスライドさせたときに外套管保持部１６の基端部が注入針保持部９に引っ掛かかって注入筒２から外れないようになっている。

図５の例は図４の例に吸入機構を取り付けたものである。この実施例では、外套管保持部１８に引出し流路２０が形成されている。引出し流路２０の一端は外套管８の基端部において注入針４の外周と外套管８との間の隙間に通じており、他端は外套管保持部１８の外部に通じている。引出し流路２０は、外套管８の基端部に設けられた切欠き、外套管保持部１８の注入針保持部９と対向する先端側内面に設けられた溝及び外套管保持部１８の側壁に設けられた貫通孔により構成されている。引出し流路２０の他端には気体や液体を吸入する吸入機構へと通じる流路２２が接続されている。
なお、図５の例は図４の例の外套管保持部１８に吸入機構を接続したものであるが、図２や図３の例の外套管保持部に吸入機構を接続してもよい。

次に、図６及び図７を用いて図１から図５のいずれかの充填器具を使用したキャピラリへの液充填方法について説明する。
まず、キャピラリ２３に充填すべき液を注入筒２内に吸入する。注入針４の先端部を外套管８から突出させた状態で注入針４と外套管８をキャピラリ２３内に挿入し、注入針４の先端部をキャピラリ２３内の所定の充填位置に配置する。駆動部６を注入筒２の先端側へ押し込んで液２４をキャピラリ２３内に吐出する（図６（Ａ）参照）。

注入針４の先端がキャピラリ２３内に充填された液２４の液面から出るまで充填器具を引き上げる（図６（Ｂ）参照）。このとき、注入針４の先端には液２４が液滴２４ａとして付着し、このまま注入針４をキャピラリ２３から引き抜こうとすると液滴２４ａがキャピラリ２３の内壁に付着することがあり得る。そこで、注入針４が外套管８内に収容されるように外套管８を注入針４の先端側へスライドさせる。注入針４の先端の液滴２４ａが外套管８の先端に接すると、毛管力が作用して液滴２４ａが注入針４と外套管８の間の隙間に引き込まれる（図６（Ｃ）参照）。外套管８をスライドさせて注入針４の先端を外套管８の先端から５〜１５ｍｍの位置まで引き入れた後（図６（Ｄ）参照）、充填器具を引き上げて注入針４及び外套管８をキャピラリ２３から引き抜く（図６（Ｅ）参照）。

その後、注入針４と外套管８との間の隙間の液を除去する処理を行なう。この処理の一例は、外套管８をこの充填器具から取り外して行なう外套管８の内面と注入針４の外周面のクリーニング処理である。図５の例のように注入針４と外套管８との間の隙間の液を吸入する吸入機構を備えている場合には、吸入機構によって注入針４と外套管８との間の隙間の液を吸入することで、毛管力が弱い場合でも、外套管先端に液が残ることを防止できる。また、外套管８をこの充填器具から取り外してクリーニング処理を行なうことを省略することができる。

注入針４の内部を洗浄した後、次にキャピラリ２３に充填すべき液がある場合にはその液を吸入して上記の動作を繰り返し実行する。

上記の充填方法により、図８に示されるようなデバイスを作成することができる。このデバイスはキャピラリ２８内に下層側から順に核酸用溶出液３０、ゲル（オルガノゲル）３２、核酸用洗浄液３４、ゲル３２、核酸用洗浄液３４及びゲル３２が充填されて作成されている。このデバイスでは、核酸用溶出液３０及び核酸用洗浄液３４が非水溶性のゲル３２によって仕切られており、核酸を保持させた磁性粒子（磁気ビーズ）を一端側（図において上端側）に配置し、磁場印加手段によってその磁性粒子をキャピラリ２８の外側から操作して他端側へ移動させることで、磁性粒子に保持された核酸の精製を行なうことができる。

材質がポリプロピレン、内径が２ｍｍであるキャピラリに、注入針４の材質がヒューズドシリカ、内径が０．２ｍｍ、外径が０．３５ｍｍ、外套管８の材質がポリエーテルエーテルケトン、内径が０．７５ｍｍ、外径が１．６ｍｍである充填器具を用いて上記充填方法によりゲルを充填したところ、キャピラリ内の試薬溶液の充填位置の内壁にゲルが付着していないことが確認できた。
また、材質がポリプロピレン、内径が３．１ｍｍであるキャピラリに、注入針４の材質がステンレス（ＳＵＳ３０４）、内径が０．６３ｍｍ、外径が１ｍｍ、外套管８の材質がポリテトラフルオロエチレン、内径が２ｍｍ、外径が３ｍｍである充填器具を用いて上記充填方法によりゲルを充填した場合にも、キャピラリ内の試薬溶液の充填位置の内壁にゲルは付着していないことが確認できた。

このように、磁性粒子を操作するデバイスの作成における少なくともゲルの充填工程において、外套管８を備えた充填器具を用いた液の充填を実行することにより、ゲルなどの充填液がキャピラリ２８の内壁面の意図しない位置に付着することを確実に防止することができ、磁性粒子の操作やキャピラリ２８の外部からの光学的検出の妨げとなるキャピラリ２８の内壁面の汚染を防止することができる。

２ 注入筒
２ａ 液貯留空間
２ｂ 孔
４ 注入針
４ａ 液吐出口
６ 駆動部
７，９ 注入針保持部
８ 外套管
１２，１４，１６，１８ 外套管保持部
２０ 引出し流路
２２ 吸入機構接続用流路
２３ キャピラリ
２４ 充填液

Claims (6)

1. 先端に液吐出口を有する注入針を先端部に備えるとともに、前記注入針と導通し前記液吐出口から吐出する液を貯留する液貯留空間を内部に備えた注入筒と、
   前記注入筒の前記液貯留空間内で一方向に摺動して前記液貯留空間の容積を変化させる駆動部と、
   前記注入針の外径よりも大きい内径及び前記注入針よりも短い長さを有し、前記注入筒の先端部に前記注入針の外周面を覆った状態で前記注入針に沿って前記注入針とは独立して移動可能に装着された外套管と、を備え、
   前記外套管の内径は前記注入針の外周面との間に毛管力が作用する大きさの隙間が生じる大きさである、液充填器具。
2. 前記外套管の基端部を保持しながら前記注入筒の先端側に前記注入針の長手方向に前記注入筒とは独立して移動可能に装着された外套管保持部をさらに備えている請求項１に記載の液充填器具。
3. 前記外套管保持部は、一端が前記注入針と前記外套管との間の隙間に通じ他端が該外套管保持部の外部へ通じる引出し流路を備え、前記引出し流路の他端に前記注入針と前記外套管との間の隙間の液を吸入するための吸入機構が接続されている請求項２に記載の液充填器具。
4. 前記液充填器具は、核酸用溶出液、核酸用洗浄液、前記核酸用溶出液と前記核酸用洗浄液との間を仕切るための非水溶性ゲル、及び核酸を保持させた磁性粒子を、前記キャピラリ内に注入するものである請求項１から３のいずれか一項に記載の液充填器具。
5. 請求項１から４のいずれか一項に記載の液充填器具を使用して以下のステップ（１）〜（５）をその順に行なうことを特徴とする液充填方法。
   （１）キャピラリに充填する液を前記注入筒の前記液貯留空間に吸入するステップ、
   （２）前記注入針を前記外套管の先端から突出させた状態で、前記キャピラリ内で液を充填すべき位置に前記注入針の先端部を配置して液を吐出するステップ、
   （３）前記注入針の先端が前記キャピラリ内の液面から出るまで前記液充填器具を引き上げるステップ、
   （４）前記外套管を前記注入針の先端側へ移動させて前記外套管内に前記注入針の先端部を収容するステップ、及び
   （５）前記注入針及び前記外套管を前記キャピラリから引き抜くステップ。
6. 請求項３に記載の液充填器具を使用して前記ステップ（５）の後、以下のステップ（６）を行なう請求項５に記載の液充填方法。
   （６）前記吸入機構により前記注入針と前記外套管との間の隙間の液を吸入するステップ。

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