JP2008022735A - 資料取込器用チップ - Google Patents

Abstract

【課題】単一の細胞等の微小の試料のサンプリングを行う場合、特別な破砕プロセスを介することなく、吸引と破砕を同時進行させる。
【解決手段】定量ピペット１０に着脱可能に取り付けられたピペットチップ１８において、試料である細胞に対峙させる先端口２０の近傍に破砕手段（刃部２６、突出部２８、くびれ部３２）を設けることで、吸引時の流動と同時進行で細胞の破砕が可能となり、例えば、チップ型反応器に投入して解析する場合に、このチップ型反応器内での破砕プロセスを省くことができ、全体として作業効率を向上することができる。また、単一の細胞等、極めて微小な試料に対しても破砕作用が確実に働くため、近年のニーズにあった破砕手段を提供することができる。
【選択図】図１

Description

本発明は、試料分析実験に使用される、試料を取り込む際のチップ、特に、試料を計量しながら内部に取り込む計量ピペットや、試料の一定量を内部に取り込む定量ピペットの先端に装着されるピペットなどの資料取込器用チップに関するものである。

バイオテクノロジーの発展により、微生物、植物の組織や種子類、動物の組織や細胞などの試料に含まれる内容物を分析することが必要になっている。このために、これら試料を破砕して、その内容物を抽出し、そして抽出物を分析評価することが行われる。

特に細胞の破砕のために、従来は、細胞破砕するための化学物質を用いながら細胞に振動を加えること（特許文献１、特許文献２参照）、或いは、細胞を細胞破砕用のボール等と共に容器に入れ、容器に振動を与えてながら力学的に擦り潰す（特許文献３参照）手法が提案されてきた。

次いで、破砕された細胞を含む試料を計測機器で計測するために、ピペットなどの試料取得手段に取り込むことが行われる。この際、試料取得手段先端にチップが取付けられる。試料取得手段が、試料を計量しながら取り込むピペットや試料の一定量を取り込むピペットの場合、チップはピペットの先端に取付けられる。このチップはピペットチップと呼ばれ、チップが使用される都度廃棄処理される、ディスポーザブルタイプのものが市場に提供されている。ピペット先端にピペットチップが装着され、実験者はピペットチップを介してピペット内に試料を吸引し、その後、ビーカーやシャーレに試料を吐出させる。

このピペットチップの改良体としては、例えば、プラスチック製ピペットチップ及びチューブの内表面に、直接、機能をもつ高分子鎖を付与することによって、液の吸引及び排出速度を大きく保ちながら、生体成分、例えば、タンパク質の捕集又は分離精製を高効率で行えるようにしたものが提案されている（特許文献４参照）。

また、高精度の定量分注を保証するため、チップ内に多孔質焼結樹脂フィルタ又は多孔質焼結樹脂体と不織布との複合体フィルタを装着したものもある（特許文献５参照）。さらに、ゲル電気泳動装置へのサンプル供給用に先端を細くしたものもある。
特開２００１−１７８４４４公報 特開２００６−４３５５４公報 特開２００４−６５２３０公報 特開２００４−３３９３８３公報 特開２００１−１２１００５公報

しかしながら、特許文献４及び特許文献５に示したようなピペットチップにおいて、単一の細胞を吸引することはできるが、細胞を破砕する機能を備えておらず、別途特別な破砕プロセスを経由しなければならず、作業効率が悪い。

このとき、上記特許文献１及び特許文献２に記載の破砕技術を用いた場合、原理的に大量の試料が必要である。試料が少量の場合、もともと試料が希少性の高い、特に単一の細胞のみである場合には、そもそも既述の破砕手段を用いることができない。

そこで、本発明は上記事実を考慮し、単一の細胞等微小試料の分析を行う場合、特別な破砕プロセスを介することなく、試料をチップ内に取り込むことが出来る、ピペットや注射器等の試料取込器ための各種チップを提供することを目的とするものである。

本発明は、この目的を達成するために、チップ内に細胞試料を取得する際にチップと細胞試料の流れとを干渉させ、この干渉の結果生まれる、前記細胞試料の流れに対するチップからの抵抗によって細胞自体を破砕して細胞内容物を試料取込器に提供しようとするものである。さらに、本発明は、細胞試料を前記チップ内に取り込む際に、チップ内部に設けた破砕手段が細胞試料の流れと接触して干渉し、細胞試料に与えられた干渉抵抗によって細胞そのものを破砕し、細胞内容物をチップ内で露出させることを特徴とするものである。したがって、細胞試料の細胞試料取得器への吸引動作の過程で細胞の破砕が達成されるために、別な細胞破砕のためのプロセスを必要としない。

破断手段の例は横切る刃部で構成され、細胞試料が刃部を通過する際に、刃部によって単一細胞自体が分断される。破砕手段として刃部を用いることで、細胞試料の取込に対する抵抗を小さくしつつ、細胞試料を確実に分断することができる。より効果的には、少なくとも２枚の刃を互いに交差させ（例えば、十文字に交差させ）ることで、細胞の外形や向きに関わらず、常に効果的な細胞の分断が可能である。なお、３枚以上の刃を星型に交差させるようにしてもよい。また、刃としては、薄板状のものが一般的であるが、ワイヤ状のものであってもよい。さらに、薄いた状、ワイヤ状に限らず、「交差」という文言の概念には、網状に織り込むことを含んでいる。

破砕手段の他の例は、チップの内周面から軸芯に向かって突出する突出部を備える。この突出部は、チップ内に吸引される試料と干渉して細胞を破砕することを狙っており、針状の突出であっても、凸状或いは山状の突出であってよい。また、突出部として、薄板状の刃を用いることで、細胞の破砕と細胞の分断（切断）とが同時に実行される。破砕手段の他の例は、チップ内をチップの内径がくびれるように狭くなるテーパ形状を備える。チップ内の狭くなった部分（くびれ部）を試料が通過する過程で、細胞試料が自身の直径以下に変形して細胞破壊に至る。

本発明によれば、単一の細胞等微小試料の分析を行う場合、特別な破砕プロセスを介することなく、試料をチップ内に取り込むことが出来る、ピペットや注射器等の試料取込器に使用されるチップを提供することができる。

図１（Ａ）には、本実施の形態に係る定量ピペット１０が示されている。この種の定量ピペット１０は、所謂ハンディタイプであり、オペレータ１２が把持し、所定の操作を行うことで、吸引口１４から試料を吸引する構造となっている。定量ピペット１０は、前記オペレータ１２が把持し、かつサンプリング指示等の操作を行う操作部、当該操作部の操作によって吸引動作を実行する吸引機構部を備えたピペット本体１６と、前記ピペット本体１６の吸引口１４に着脱可能に取り付けられたピペットチップ１８とで構成されている。

試料としては、微小物質が対象となり、定量ピペット１０は、例えば微生物、植物の組織や、種子類、動物の組織又は細胞を採取する。なお、以下では、単一の細胞を吸引することに特化して説明する。

吸引された単一の細胞は、後述する破砕手段によって破砕され、所定の溶液に溶解された状態で、例えば、本出願人が提案しているチップ型反応器の細胞導入槽へ投入する（特開２００６−０７８４７５公報参照）。なお、チップ型反応器の使用手順は、以下のとおりである。

チップ型反応器内の各溶液槽を作動流体で満たし、前記定量ピペット１０により細胞導入槽へ投入する。その後、細胞導入槽に繋がっている電極パターンと、廃液槽に繋がっている電極パターンとの間に電界を発生させ、作動流体に細胞導入槽から廃液槽に向かう流体の動きを発生させる。

この流れにより、細胞を細胞捕獲トラップへ誘導する。細胞内物質は細胞捕獲トラップを通過し、メイン流路の交点へと導入される。細胞内物質が交点に導入される過程で、細胞内物質はその流動特性によって分離され、核酸部分が交点を通過するタイミングで、抽出液槽に繋がっている電極パターンと抽出槽に繋がっている電極パターンとの間に電界を発生させ、抽出液槽から抽出槽に向かう流れを発生させ、抽出槽で核酸部分を抽出する。抽出槽へ抽出された核酸は溶液ごと回収し、必要に応じて精製、ＰＣＲなどの処理を加えて分析に供される。または、抽出槽へ着脱可能なマイカシートなどを設置しておき、そのまま分子間力顕微鏡などで可視化して分析することもできる。

ここで、上記チップ型反応器においては、細胞を細胞捕獲トラップに導入した後、電極パターンに電界を発生させ、細胞殻を破砕する工程が必要であった。

これに対して、本実施の形態では、定量ピペット１０に破砕手段を付加することで、上記のような破砕プロセスを省略することができる。本実施の形態における破砕手段は、図１（Ｂ）に示される如く、ピペットチップ１８の先端口２０の近傍に設けられている。図１（Ｂ）に示される如く、ピペットチップ１８は、前記吸引口１４から先端口２０にかけて徐々に小径となるテーパ形状の円筒状の筐体２２で構成されている。

この筐体２２は、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート等の高分子材料が適用可能である。なお、殺菌処理のためのオートクレープ処理（高温、高圧）に耐え得る材料が好ましい。

ピペットチップ１８の先端口２０の開口面積は、採取する単一の細胞の外形と近似しており、当該ピペットチップ１８の先端口２０を採取するべき細胞に対峙させ、前記ピペット本体の操作部によって採取指示を実行することで、単一の細胞を先端口２０へ吸引することができる。

図１（Ｃ）に示される如く、破砕手段は、本実施の形態では、十文字に交差した２枚の刃２４（十文字に組み合わされた状態を刃部２６という）が適用されている。刃部２６の交差点はピペットチップ１８の軸芯であり、これにより、ピペットチップ１８における刃部２６が取り付けられた箇所は、その開口面積が、均等に４分割されたことになる。

刃部２６が取り付けられた部位は、先端口２０の近傍であるため、前記４分割されたそれぞれの面積は、試料である単一の細胞の外形よりも小さくなっている。これにより単一の細胞が先端口２０から吸引されて刃部２６へ至ると、刃２４によって分断（破砕）されてピペットチップ１８へ内に存在することになる。すなわち、ピペットチップ１８内において、単一の細胞の吸引と破砕とが同時進行する構成である。

刃部２６は、前記ピペットチップ１８と同様に、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート等の高分子材料が適用可能であり、ピペットチップ１８と一体成型することで、工数も少なく、かつ安価に作製することができる。

なお、刃部２６は、ピペットチップ１８と同一材料であることに限定されるものではなく、金属やセラミッック等、別材質の材料で形成し、組み付けるようにしてもよい。この場合、試料（すなわち、採取する細胞）との適合性を配慮する必要がある。また、刃部２６の表面にシリコンコーティングを施す等、液切れを良くしておくと、細胞内部物質のピペットチップ１８の内周面への非特異的な付着を防止することができる。

以下に本実施の形態の作用を説明する。採取するべき試料のサイズ（ここでは、単一の細胞の外形）が決まると、これに併せてピペットチップ１８を選択する。選択されたピペットチップ１８は、ピペット本体１６の吸引口１４に装着される。

次に、オペレータ１２は、ピペット本体１６を把持し、操作部を操作して吸引の指示を行う。吸引指示が実行されると、ピペット本体１６内の吸引機構部が動作を開始する。オペレータ１２は、ピペット本体１６を把持した状態で、ピペットチップ１８の先端口２０を目的とする細胞へ近づける。当該細胞に所定の間隙で対峙すると、細胞は先端口２０に吸引される。吸引された細胞は、ピペットチップ１８内を流動することになるが、先端口２０の近傍において、破砕手段である刃部２６に到達する。

刃部２６は、十文字に組み合わされた刃２４が吸引されてくる細胞に向けられて、開口面積を均等に４分割しているため、細胞の流動はこの刃部２６が抵抗となる。言い換えれば、刃部２６が存在することで、吸引された細胞の外形ではこの刃部２６を通過することができない。しかし、刃部２６に細胞が当接すると、そのときの吸引による流動速度に応じて、細胞は分断される。分断された個々の細胞は、刃２４によって仕切られた４分割の開口のそれぞれを通過可能となり、刃部２６を通過してピペットチップ１８内に留まることになる。

すなわち、細胞の吸引と、細胞の破砕とを同時進行させることができるため、サンプリングした細胞を、例えばチップ型反応器に投入して解析する場合に、細胞を破砕するためのプロセスが不要となる。この結果、サンプリング解析（吸引、破砕、解析）の作業性を向上することができる。

なお、本実施の形態では、ピペット本体１６の吸引力を、電動としたが、例えば、注射器のような作用によって、手動で吸引する構造であってもよい。また、ピペット本体１６をオペレータ１２が把持して目的とする細胞へピペットチップ１８の先端口２０を対峙させるようにしたが、試料を所定の位置に載置（位置決め）し、Ｘ−Ｙ動作機構、マニピュレータ、ロボットハンド等に定量ピペット１０を取り付け、自動的或いは遠隔的に、目的とする細胞へピペットチップ１８の先端口２０を対峙させるようにしてもよい。

以下に本実施の形態の変形を示す。なお、以下は、ピペットチップ１８に設けた破砕手段に関する変形例であるため、上記実施の形態と同一構成部分については、同一の符号を付してその構成の説明を省略する。

（変形例１）
図２（Ａ）及び（Ｂ）に示される如く、変形例１に係る破砕手段としては、突出部２８が適用されている。突出部２８は、ピペットチップ１８の先端口２０の近傍における内周面から軸芯にむかって４個のリブ３０で構成されている。リブ３０は薄板状であり、先端口２０側端部は刃状に肉厚が薄くなっていることが好ましい。

各リブ３０の先端は、それぞれ軸芯にまでは至らず、この結果、ピペットチップ１８の軸芯部は空洞となっている。リブ３０は、主たる目的は先端口２０から吸引された細胞の流動を妨げる抵抗として機能する。すなわち、ピペットチップ１８の先端口２０から吸引された細胞が、所定の流動速度でリブ３０に至ると、このリブ３０によって流動が妨げられる。妨げられた細胞は、吸引力によってリブ３０を乗り越えようとして、自ら破砕していく。この結果、リブ３０を通過した細胞は、適度に破砕されることになる。

なお、このとき、吸引力との兼ね合いで、リブ３０の先端口２０側を刃状とすることで、円滑な分断がなされ、抵抗力によって細胞がリブ３０の近傍で目詰まりを起こすことを防止することができる。

（変形例２）
図３（Ａ）及び（Ｂ）に示される如く、変形例２に係る破砕手段としては、ピペットチップ１８内の吸引口１４から先端口２０に亘るテーパ形状に則した径変化から逸脱して、小径となるようにくびれ部３２を設けている（ピンチ構造）。このくびれ部３２によりピペットチップ１８の先端口２０から吸引された細胞は、その流動に抵抗が加えられ、このくびれ部３２を通過しようして、自ら破砕、或いはつぶれていく。

くびれ部３２のくびれ度合いは、吸引力との相関関係に基づいて設定すればよく、吸引力が大きければ、くびれ度合いを強く（通過開口径を小さく）することができ、より小さく破砕を可能とする。なお、このくびれ部３２を筋状に設けることで、破砕作用を増長することができる。また、筋状とする際、スパイラル状に形成するようにしてもよい。なお、くびれ部３２に臨む内壁を（Ａ）のように円弧状にする他、（Ｃ）のように三角状に形成しても良い。

以上説明したように本実施の形態では、定量ピペット１０に着脱可能に取り付けられたピペットチップ１８において、試料である細胞に対峙させる先端口２０の近傍に破砕手段（刃部２６、突出部２８、くびれ部３２）を設けることで、吸引時の流動と同時進行で細胞の破砕が可能となり、例えば、チップ型反応器に投入して解析する場合に、このチップ型反応器内での破砕プロセスを省くことができ、全体として作業効率を向上することができる。

また、単一の細胞等、極めて微小な試料に対しても破砕作用が確実に働くため、近年のニーズにあった破砕手段を提供することができる。なお、本実施の形態及び変形例１、２では、試料として単一の細胞を適用したが、微生物、植物の組織や、種子類、動物の組織等の微小物質であれば試料として適用可能である。また、従来の化学薬品を利用する、又は振動や電気刺激を利用する従来方法と組み合わせることによって、確実に細胞を破砕することもできる。

（Ａ）は本実施の形態に係る定量ピペットの外観図、（Ｂ）は図１（Ａ）のＩＢ矢視拡大断面図、（Ｃ）は図１（Ｂ）のＩＣ−ＩＣ線断面図である。 変形例１に係り、（Ａ）はピペットチップの断面図、（Ｂ）は図２（Ａ）のＩＩＢ−ＩＩＢ線断面図である。 変形例２に係り、（Ａ）はピペットチップの断面図、（Ｂ）は図３（Ａ）のＩＩＩＢ−ＩＩＩＢ線断面図であり、（Ｃ）は（Ａ）の変形例に係わるピペットチップの断面図である。

符号の説明

１０ 定量ピペット
１２ オペレータ
１４ 吸引口
１６ ピペット本体
１８ ピペットチップ
２０ 先端口
２２ 筐体
２４ 刃
２６ 刃部
２８ 突出部
３０ リブ
３２ くびれ部

Claims (11)

1. 中空筒状のボディーを備え、当該ボディー内部に当該ボディー内壁から中央に向かって突出する突出部を備えるように構成されてなる、試料取込器に装着されて使用される試料取込器用チップ。
2. 前記ボディー先端部が実質的に分析対象細胞の直径以下の内径から形成されている、請求項１記載のチップ。
3. 前記細胞が前記突出部に接触しながら前記ボディー内を流動する過程で当該細胞が破砕される、請求項１又は２記載のチップ。
4. 前記突出部が前記ボディー先端側に設けられている、請求項
   １乃至３の何れか１項に記載されたチップ。
5. 試料取得器の先端に請求項１乃至３のいずれか記載のチップを装着する工程と、このチップを介して前記試料である細胞を当該チップ内に取り込む工程と、当該チップ内に取り込んだ細胞試料を当該チップ外に吐き出す工程と、吐き出された試料を分析する工程とを含む、細胞試料の分析方法。
6. 試料取込器の試料吸引口に着脱可能に取り付けられ、前記試料吸引口側開口から試料を直接吸引する先端口までの筒状筐体で形成されたチップであって、
   前記筒状筐体の内方空間に設けられ、前記先端口から吸引された細胞試料を前記筒状筐体内に流動させる際に、前記細胞試料を破砕する破砕手段を有するチップ。
7. 前記筒状筺体の内径が、前記細胞試料の外形寸法と近似する前記先端口寄りの位置に、前記破砕手段が設けられている請求項６記載のチップ。
8. 前記破砕手段が、前記筒状筐体の軸直角断面の一部を横切る刃部で構成され、前記細胞試料が当該刃部を通過する際に、当該刃部によって分断される請求項６又は７記載のチップ。
9. 前記刃部は、前記筒状筐体内で互いに交差するように少なくも２枚の刃で構成されている、請求項８記載のチップ。
10. 前記破砕手段が、前記筒状筐体の軸直角断面の一部において、内周面から軸芯に向かって突出する複数の突出部で構成され、前記細胞試料が通過する際に、当該突出部の流動抵抗力によって破砕される、請求項６又は７記載のチップ。
11. 破砕手段が、前記筒状筐体の軸直角断面の一部において、試料流動開口が、前記テーパ形状としての径寸法変化から逸脱して狭くなるくびれ部である、請求項６又は７記載のチップ。

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