CN111378742A - microRNA生物标志物及其在制备自身免疫疾病检测试剂盒中的应用 - Google Patents

microRNA生物标志物及其在制备自身免疫疾病检测试剂盒中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一组可用于检测自身免疫疾病的microRNA生物标志物，其核苷酸序列如SEQ ID No.1～8任一所示。还提供了上述microRNA生物标志物在在制备自身免疫疾病检测试剂盒中的应用和一种自身免疫疾病检测试剂盒，包括反转录系统、扩增系统和引物系统，引物系统包括上述SEQ ID No.1～8任一所示核苷酸序列的茎环引物和扩增引物。本发明的microRNA生物标志物与自身免疫疾病的病例指标具有密切相关性，可作为生物标志物对具有自身免疫疾病的病人进行检测。本发明的microRNA生物标志物可与其他分子指标相结合，为自身免疫疾病的筛查、诊断、治疗与预后提供新的综合性试剂盒，方便临床应用。

Description

microRNA生物标志物及其在制备自身免疫疾病检测试剂盒中 的应用
技术领域
本发明涉及生物医药，具体涉及microRNA生物标志物及其在制备自身免疫疾病检测试剂盒中的应用。
背景技术
microRNAs(miRNAs)是一类非编码的长度为17～25nt的小RNA分子。它具有高度保守性、时序性和组织特异性，在细胞生长和发育的调节过程中起多种作用。约50％的已知人类miRNA基因定位于和免疫相关的染色体区域，而不断累积的研究成果也已充分证实miRNA的异常表达与免疫系统疾病的发生、发展密切相关。
外泌体是细胞经过“内吞-融合-外排”等一系列调控过程而形成的细胞外纳米级小囊泡。外泌体可以携带蛋白，运送RNA，在细胞间物质和信息转导中起重要作用。人体内多种细胞及体液均可分泌外泌体，包括内皮细胞、免疫细胞、血小板、平滑肌细胞等。当其由宿主细胞被分泌到受体细胞中时，外泌体可通过其携带的蛋白质、核酸、脂类等来调节受体细胞的生物学活性。外泌体介导的细胞间通讯主要通过以下三种方式：一是外泌体膜蛋白可以与靶细胞膜蛋白结合，进而激活靶细胞细胞内的信号通路。二是在细胞外基质中，外泌体膜蛋白可以被蛋白酶剪切，剪切的碎片可以作为配体与细胞膜上的受体结合，从而激活细胞内的信号通路。有报道称一些外泌体膜上蛋白在其来源细胞膜上未能检测出。三是外泌体膜可以与靶细胞膜直接融合，非选择性的释放其所含的蛋白质、mRNA以及microRNA。
体液、培养液和灌洗液是医学诊断中最常用的样本来源。当前对于血液的临床分析集中在一些蛋白因子中，因核酸获得困难且含量少、质量不高而很少涉及核酸。近年来有研究发现，体液、培养液和灌洗液中的外源RNA与细胞内RNA相比，很少存在核糖体RNA，多数为＜30nt、独立于细胞之外的miRNA分子，它在人体中普遍存在。人体组织、血液及各种体液，包括汗液、尿液、泪液、羊水等都存在小RNA。通常，体液、培养液和灌洗液中的miRNA以外泌体包涵物等形成颗粒存在，因而具有良好的抗RNase降解能力，有较高的稳定性，因此可作为新的分子生物学标志。
作为生物检测样本，血清具有取材方便，无创伤性，并可连续体外检测的优点，由于外泌体中miRNA特殊的稳定性，因此使基于miRNA定性和定量检测技术寻找癌症特异性的血清miRNA作为分子标记物的方法比传统的蛋白分子标记方法将更加有效，进而可以克服分子标记在抗体制备和定量分析上发展所遇到的瓶颈。因此，开发一种可辅助自身免疫疾病筛查和诊断的外泌体miRNA作为生物标记物，具有广泛的科研价值和临床应用前景。
发明内容
作为本发明的第一个方面，提供了一组可用于检测自身免疫疾病的microRNA生物标志物，其核苷酸序列如SEQ ID No.1～8任一所示。
作为本发明的第二个方面，提供了上述microRNA生物标志物在在制备自身免疫疾病检测试剂盒中的应用。
作为本发明的第三个方面，还提供了一种自身免疫疾病检测试剂盒，包括反转录系统、扩增系统和引物系统，引物系统包括上述SEQ ID No.1～8所示核苷酸序列中的至少一种的茎环引物和扩增引物。
进一步的，所述反转录系统包括M-MLV反转录酶、反转录体系5×M-MLV缓冲液和RNase抑制剂；所述扩增系统包括含Taq酶的miRNA表达定量检测混合液；所述SEQ ID No.1～8核苷酸序列的茎环引物和扩增引物具体包括：
SEQ ID No.1所示核苷酸序列茎环引物：
5’GGACTGATGCAAAGATGCATCCCTGGTACTCAAGCGCTCGCTGCAATGCATCAGTCCTCATAC
SEQ ID No.2所示核苷酸序列茎环引物：
5’GGACTGATGCAAAGATGCATCCCTGGTACTCAAGCGCTCGCTGCAATGCATCAGTCCCTACC
SEQ ID No.3所示核苷酸序列茎环引物：
5’GGACTGATGCAAAGATGCATCCCTGGTACTCAAGCGCTCGCTGCAATGCATCAGTCCTCAAC
SEQ ID No.4所示核苷酸序列茎环引物：
5’GGACTGATGCAAAGATGCATCCCTGGTACTCAAGCGCTCGCTGCAATGCATCAGTCCTCTAAAC
SEQ ID No.5所示核苷酸序列茎环引物：
5’GGACTGATGCAAAGATGCATCCCTGGTACTCAAGCGCTCGCTGCAATGCATCAGTCCCGCGTAC
SEQ ID No.6所示核苷酸序列茎环引物：
5’GGACTGATGCAAAGATGCATCCCTGGTACTCAAGCGCTCGCTGCAATGCATCAGTCCTTCCC
SEQ ID No.7所示核苷酸序列茎环引物：
5’GGACTGATGCAAAGATGCATCCCTGGTACTCAAGCGCTCGCTGCAATGCATCAGTCCCACTGG
SEQ ID No.8所示核苷酸序列茎环引物：
5’GGACTGATGCAAAGATGCATCCCTGGTACTCAAGCGCTCGCTGCAATGCATCAGTCCACCCC
SEQ ID No.1所示核苷酸序列PCR正向引物：5’-GCTCTTTGGTTATC-3’
SEQ ID No.1所示核苷酸序列PCR反向引物：5’-GTGATGCATCCCTGGT-3’
SEQ ID No.2所示核苷酸序列PCR正向引物：5’-GCCAAAGTGCTTAC-3’
SEQ ID No.2所示核苷酸序列PCR反向引物：5’-GTGATGCATCCCTGGT-3’
SEQ ID No.3所示核苷酸序列PCR正向引物：5’-GCTAGCTTATCAG-3’
SEQ ID No.3所示核苷酸序列PCR反向引物：5’-GTGATGCATCCCTGGT-3’
SEQ ID No.4所示核苷酸序列PCR正向引物：5’-GCGCTGGTTTCA-3’
SEQ ID No.4所示核苷酸序列PCR反向引物：5’-GTGATGCATCCCTGGT-3’
SEQ ID No.5所示核苷酸序列PCR正向引物：5’-GCCATTATTACT-3’
SEQ ID No.5所示核苷酸序列PCR反向引物：5’-GTGATGCATCCCTGGT-3’
SEQ ID No.6所示核苷酸序列PCR正向引物：5’-GCTGAGAACTGAA-3’
SEQ ID No.6所示核苷酸序列PCR反向引物：5’-GTGATGCATCCCTGGT-3’
SEQ ID No.7所示核苷酸序列PCR正向引物：5’-GCTCTCCCAACC-3’
SEQ ID No.7所示核苷酸序列PCR反向引物：5’-GTGATGCATCCCTGGT-3’
SEQ ID No.8所示核苷酸序列PCR正向引物：5’-GCTTAATGCTAATC-3’
SEQ ID No.8所示核苷酸序列PCR反向引物：5’-GTGATGCATCCCTGGT-3’
18S rRNA PCR正向引物：5’-AAGACGGACCAGAGCGAA-3’
18S rRNA PCR反向引物：5’-GGCGGGTCATGGGAAT-3’。
进一步的，所述试剂盒是用于类风湿性关节炎、红斑狼疮、狼疮肾病、银屑癣、系统性硬化、皮肌炎或白塞病检测的试剂盒。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明的microRNA生物标志物与自身免疫疾病的病例指标具有密切相关性，可作为生物标志物对具有自身免疫疾病的病人进行检测，从而将早期筛查和诊断提高至一个新的水平，进而提高治愈率和降低死亡率；
本发明的microRNA生物标志物可与其他分子指标相结合，为自身免疫疾病的筛查、诊断、治疗与预后提供新的综合性试剂盒，方便临床应用；
由于体液具有取材方便，无创伤性，通过本发明的检测试剂盒可以很方便的进行自身免疫疾病的早期筛查和诊断，减轻患者痛苦。
附图说明
图1是实施例3中的电泳结果照片；
图2是实施例3中的统计结果，其中，CNT为正常人样本，SLE为红斑狼疮样本，Active LN为狼疮肾病样本，SSc为系统性硬化样本，DM为皮肌炎样本；
图3是实施例4中8条miRNA在肝癌血清/正常血清样本中的Cq值比较图。
具体实施方式：
下面将结合附图和具体实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1生物标志物及检测引物和探针
参照现有的miRNA生物标志物筛选方法，发明人经过大量实验，筛选出来了一组miRNA生物标志物，包含hsa-miR-9、hsa-miR-17、hsa-miR-21、hsa-miR-29b、hsa-miR-126、hsa-miR-146a、hsa-miR-150和hsa-miR-155。该组生物标志物的具体序列如下：
hsa-miR-9:UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA
hsa-miR-17:CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG
hsa-miR-21:UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA
hsa-miR-29b:GCUGGUUUCAUAUGGUGGUUUAGA
hsa-miR-126:CAUUAUUACUUUUGGUACGCG
hsa-miR-146a:UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU
hsa-miR-150:UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG
hsa-miR-155:UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU
茎环引物法：用茎环引物法检测miRNA的表达，需要针对miRNA的具体序列涉及特异性茎环引物、及PCR引物。在PCR扩增过程中，用SYBR-green显色实时定量地检测目标miRNA的扩增情况。茎环引物和相应的PCR扩增引物的具体信息如下：
hsa-miR-9茎环引物：
5’GGACTGATGCAAAGATGCATCCCTGGTACTCAAGCGCTCGCTGCAATGCATCAGTCCTCATAC
hsa-miR-17茎环引物：
5’GGACTGATGCAAAGATGCATCCCTGGTACTCAAGCGCTCGCTGCAATGCATCAGTCCCTACC
hsa-miR-21茎环引物：
5’GGACTGATGCAAAGATGCATCCCTGGTACTCAAGCGCTCGCTGCAATGCATCAGTCCTCAAC
hsa-miR-29b茎环引物：
5’GGACTGATGCAAAGATGCATCCCTGGTACTCAAGCGCTCGCTGCAATGCATCAGTCCTCTAAAC
hsa-miR-126茎环引物：
5’GGACTGATGCAAAGATGCATCCCTGGTACTCAAGCGCTCGCTGCAATGCATCAGTCCCGCGTAC
hsa-miR-146a茎环引物：
5’GGACTGATGCAAAGATGCATCCCTGGTACTCAAGCGCTCGCTGCAATGCATCAGTCCTTCCC
hsa-miR-150茎环引物：
5’GGACTGATGCAAAGATGCATCCCTGGTACTCAAGCGCTCGCTGCAATGCATCAGTCCCACTGG
hsa-miR-155茎环引物：
5’GGACTGATGCAAAGATGCATCCCTGGTACTCAAGCGCTCGCTGCAATGCATCAGTCCACCCC
hsa-miR-9PCR正向引物：5’-GCTCTTTGGTTATC-3’
hsa-miR-9PCR反向引物：5’-GTGATGCATCCCTGGT-3’
hsa-miR-17PCR正向引物：5’-GCCAAAGTGCTTAC-3’
hsa-miR-17PCR反向引物：5’-GTGATGCATCCCTGGT-3’
hsa-miR-21PCR正向引物：5’-GCTAGCTTATCAG-3’
hsa-miR-21PCR反向引物：5’-GTGATGCATCCCTGGT-3’
hsa-miR-29b PCR正向引物：5’-GCGCTGGTTTCA-3’
hsa-miR-29b PCR反向引物：5’-GTGATGCATCCCTGGT-3’
hsa-miR-126PCR正向引物：5’-GCCATTATTACT-3’
hsa-miR-126PCR反向引物：5’-GTGATGCATCCCTGGT-3’
hsa-miR-146a PCR正向引物：5’-GCTGAGAACTGAA-3’
hsa-miR-146a PCR反向引物：5’-GTGATGCATCCCTGGT-3’
hsa-miR-150PCR正向引物：5’-GCTCTCCCAACC-3’
hsa-miR-150PCR反向引物：5’-GTGATGCATCCCTGGT-3’
hsa-miR-155PCR正向引物：5’-GCTTAATGCTAATC-3’
hsa-miR-155PCR反向引物：5’-GTGATGCATCCCTGGT-3’
18S rRNA PCR正向引物：5’-AAGACGGACCAGAGCGAA-3’
18S rRNA PCR反向引物：5’-GGCGGGTCATGGGAAT-3’。
实施例2实验材料及实验试剂
本实施例中使用6例红斑狼疮患者(其中3例狼疮肾病激活状态、3例红斑狼疮无肾病指证病人)、3例系统性硬化患者、3例特发性皮肌炎患者血清外泌体样本及3例临床正常血清外泌体样本。上述均为离体检测。
实验试剂均为常用的分子生物学试剂，主要有：Trizol试剂，氯仿，异丙醇，乙醇，DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂等常规生化试剂均购于上海生工公司。外泌体提取试剂盒购自世翱(上海)生物医学有限公司，M-MLV反转录酶与RNase抑制剂、反转录用dNTP混合物(各10mM，RNase-free)均购自TaKaRa公司。荧光定量PCR试剂盒为TOYOBO产品。
实施例3茎环引物法检测红斑狼疮病人及正常人血清外泌体中miRNA的表达
1、cDNA合成
病人按照1-40进行编号并收集血清按照外泌体提取手册指导提取外泌体，外泌体样本分别对应相同编号的40个pcr管，40个无RNase的0.2mL PCR管中分别加入100ng总RNA，上述若总体积不足13μL则加DEPC水补至总体积13μL，然后70℃变性8min后迅速置于冰上3min，再依次加入0.5μLRNase抑制剂(40U/μL)，1μL dNTP混合物(各10mM，RNase-free)，4μL5×M-MLV缓冲液，1μL实施例1所告知的茎环引物(2μM)和0.5μL M-MLV反转录酶(200U/μL)，使总体积至20μL，混匀后稍离心，在PCR仪中进行cDNA第一链合成，反应参数设置为16℃15min，42℃60min和85℃5min，得模板cDNA。
即，本发明的8个茎环引物分别各对应5个反应产物，因此对应的有120个模板cDNA。
2、将cDNA产物进行PCR扩增反应
取正常人cDNA产物一份，在9个0.2mL PCR管中依次加入2μL 10×PCR反应缓冲液，1.6μL dNTP混合物(各10mM)，0.1μLTaq DNA聚合酶(5U/μL)，对应的PCR正向和反向引物(10μM)各0.4μL，0.8μL模板cDNA(步骤1所得)和去离子水14.7μL，总体积为20μL。混匀后稍离心在PCR仪中进行扩增反应。反应参数为：94℃3min，循环条件为94℃15s，60℃30s，72℃1min，共35个循环。反应结束后取4μL反应液，进行12％DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结果如图1所示，其中，M代表20bp DNA Ladder。从图1中可得知经过RT-PCR定性检测及PCR产物序列测定和分析表明，能够检测到目标miRNA的特异性表达，说明hsa-miR-9、hsa-miR-17、hsa-miR-21、hsa-miR-29b、hsa-miR-126、hsa-miR-146a、hsa-miR-150和hsa-miR-155等8种RNA的存在，为后续实验提供基础。
3、将cDNA进行荧光定量PCR
在新的0.2mL PCR反应管中依次加入10μL real-time PCR Master Mix，0.4μL 50×ROXreference，相应的PCR正向和反向引物(10μM)各0.4μL，2μL模板cDNA(步骤1所得)和6.8μL去离子水。混匀后进行PCR反应，反应条件为：95℃1min，循环条件为95℃15s和60℃1min，共40个循环。通过该反应可得该8条基因在不同样本中的表达量，进而进行后续分析。
4、数据处理
荧光定量PCR定量检测miRNA的相对表达变化量时，表达量倍数的变化用公式其中ΔCT＝CTtreatment-CTcontrol。统计学分析采用SPSS16.0统计分析软件，Excel2003等数据分析工具，当相对标准误差(STDEV)＜0.5，p值≤0.05时，认为结果在统计学上有显著性差异。如图2所示，与正常人样本相对照，上述8种microRNA在不同自免疾病中表现出不同的含量关系，并具有组合性区分判断效果，例如：hsa-miR-21、hsa-miR-126升高结合hsa-miR-146a、hsa-miR-150下降可判断红斑狼疮，而hsa-miR-21升高结合hsa-miR-29b下降则对系统性硬化有明确的诊断意义。该结果说明miRNA在自免疾病筛查、诊断中具有良好的应用前景。miRNA在自免疾病血清外泌体中稳定存在，在血清中表达的个体差异性小且与性别不相关，可作为不同自免疾病筛查、诊断以及预后评价的生物标志物。
实施例4利用本发明提供的试剂盒检测样本中miRNA的表达
一种用于筛查和诊断自免疾病病人疗效与预后的试剂盒，扩增系统和引物系统组成。其中，反转录系统由反转录酶、反转录体系缓冲液和RNA酶抑制剂组成；
扩增系统由含Taq酶的miRNA表达定量检测混合液组成；
引物系统由hsa-miR-9、hsa-miR-17、hsa-miR-21、hsa-miR-29b、hsa-miR-126、hsa-miR-146a、hsa-miR-150和hsa-miR-155的茎环结构引物和扩增引物组成；
具体为：
反转录系统由M-MLV反转录酶、反转录体系5×M-MLV缓冲液和RNase抑制剂组成；
扩增系统由含Taq酶的miRNA表达定量检测混合液组成，包括real-time PCRMasterMix和50×ROX reference；
引物系统由hsa-miR-9、hsa-miR-17、hsa-miR-21、hsa-miR-29b、hsa-miR-126、hsa-miR-146a、hsa-miR-150和hsa-miR-155的茎环结构引物和扩增引物组成，同实施例1中的引物序列。
该实施例中，分别以10个健康人和10个红斑狼疮的血清为样本，分别用8种不同的microRNA生物标志物进行试验，从而获得图3所示的结果。具体如下：
1、cDNA合成
在无RNase的0.2mL PCR管中加入13μL正常/红斑狼疮患者血清外泌体，70℃变性8min后迅速置于冰上3min，再依次加入0.5μL RNase抑制剂(40U/μL)，1μL dNTP混合物(各10mM，RNase-free)，4μL 5×M-MLV缓冲液，1μL特异的茎环引物(2μM)和0.5μL M-MLV反转录酶(200U/μL)，使总体积至20μL，混匀后稍离心，在PCR仪中进行cDNA第一链合成，反应参数设置为16℃15min，42℃60min和85℃5min。得模板cDNA。
2、将cDNA进行荧光定量PCR
在新的0.2mL PCR反应管中依次加入10μL real-time PCR Master Mix，0.4μL 50×ROXreference，PCR正向和反向引物(10μM)各0.4μL，2μL模板cDNA和6.8μL去离子水。混匀后进行PCR反应，反应条件为：95℃1min，循环条件为95℃15s和60℃1min，共40个循环。通过该反应可得该8条miRNA在正常/红斑狼疮患者不同样本中的表达量，进而进行后续分析。
3、数据处理
荧光定量PCR定量检测所得miRNA的CT值，采用Excel 2003数据分析工具，当相对标准误(STDEV)＜0.5，时，认为结果可靠。如图3所示，可得8条miRNA在红斑狼疮病人血清/正常血清样本中的Cq值比较分析。
结果说明hsa-miR-17、hsa-miR-21、hsa-miR-146a、hsa-miR-150和hsa-miR-155miRNA在红斑狼疮病人血清有显著差异性表达，可作为红斑狼疮的生物标志组合物。因此，当检测样本所得的CT值显著差异于已知正常血清样本的CT值时，为红斑狼疮患者；当检测样本所得的CT值与已知正常血清样本的CT值差别不大时，为正常人。
上述实施例是对本发明的解释说明，而非对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
序列表
<110> 嘉兴程瑞医药科技有限公司
<120> microRNA生物标志物及其在制备自身免疫疾病检测试剂盒中的应用
<160> 34
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ucuuugguua ucuagcugua uga 23
<210> 2
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caaagugcuu acagugcagg uag 23
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
uagcuuauca gacugauguu ga 22
<210> 4
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcugguuuca uauggugguu uaga 24
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cauuauuacu uuugguacgc g 21
<210> 6
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ugagaacuga auuccauggg uu 22
<210> 7
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ucucccaacc cuuguaccag ug 22
<210> 8
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
uuaaugcuaa ucgugauagg ggu 23
<210> 9
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggactgatgc aaagatgcat ccctggtact caagcgctcg ctgcaatgca tcagtcctca 60
tac 63
<210> 10
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggactgatgc aaagatgcat ccctggtact caagcgctcg ctgcaatgca tcagtcccta 60
cc 62
<210> 11
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggactgatgc aaagatgcat ccctggtact caagcgctcg ctgcaatgca tcagtcctca 60
ac 62
<210> 12
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggactgatgc aaagatgcat ccctggtact caagcgctcg ctgcaatgca tcagtcctct 60
aaac 64
<210> 13
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggactgatgc aaagatgcat ccctggtact caagcgctcg ctgcaatgca tcagtcccgc 60
gtac 64
<210> 14
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggactgatgc aaagatgcat ccctggtact caagcgctcg ctgcaatgca tcagtccttc 60
cc 62
<210> 15
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggactgatgc aaagatgcat ccctggtact caagcgctcg ctgcaatgca tcagtcccac 60
tgg 63
<210> 16
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ggactgatgc aaagatgcat ccctggtact caagcgctcg ctgcaatgca tcagtccacc 60
cc 62
<210> 17
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gctctttggt tatc 14
<210> 18
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gtgatgcatc cctggt 16
<210> 19
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gccaaagtgc ttac 14
<210> 20
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gtgatgcatc cctggt 16
<210> 21
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gctagcttat cag 13
<210> 22
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gtgatgcatc cctggt 16
<210> 23
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gcgctggttt ca 12
<210> 24
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gtgatgcatc cctggt 16
<210> 25
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gccattatta ct 12
<210> 26
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gtgatgcatc cctggt 16
<210> 27
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gctgagaact gaa 13
<210> 28
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gtgatgcatc cctggt 16
<210> 29
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gctctcccaa cc 12
<210> 30
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gtgatgcatc cctggt 16
<210> 31
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gcttaatgct aatc 14
<210> 32
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gtgatgcatc cctggt 16
<210> 33
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
aagacggacc agagcgaa 18
<210> 34
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ggcgggtcat gggaat 16

Claims (5)

1.microRNA生物标志物，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.1～8任一所示。
2.权利要求1中所述miRNA生物标志物在制备自身免疫疾病检测试剂盒中的应用。
3.一种自身免疫疾病检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括反转录系统、扩增系统和引物系统，所述引物系统为权利要求1中所述SEQ ID No.1～8所示核苷酸序列的至少一种的茎环引物和扩增引物。
4.根据权利要求3所述的一种自身免疫疾病检测试剂盒，其特征在于，所述反转录系统包括M-MLV反转录酶、反转录体系5×M-MLV缓冲液和RNase抑制剂；所述扩增系统包括含Taq酶的miRNA表达定量检测混合液；所述SEQ ID No.1～8所示核苷酸序列的茎环引物和扩增引物具体包括：
SEQ ID No.1所示核苷酸序列茎环引物：
5’GGACTGATGCAAAGATGCATCCCTGGTACTCAAGCGCTCGCTGCAATGCATCAGTCCTCATAC
SEQ ID No.2所示核苷酸序列茎环引物：
5’GGACTGATGCAAAGATGCATCCCTGGTACTCAAGCGCTCGCTGCAATGCATCAGTCCCTACC
SEQ ID No.3所示核苷酸序列茎环引物：
5’GGACTGATGCAAAGATGCATCCCTGGTACTCAAGCGCTCGCTGCAATGCATCAGTCCTCAAC
SEQ ID No.4所示核苷酸序列茎环引物：
5’GGACTGATGCAAAGATGCATCCCTGGTACTCAAGCGCTCGCTGCAATGCATCAGTCCTCTAAAC
SEQ ID No.5所示核苷酸序列茎环引物：
5’GGACTGATGCAAAGATGCATCCCTGGTACTCAAGCGCTCGCTGCAATGCATCAGTCCCGCGTAC
SEQ ID No.6所示核苷酸序列茎环引物：
5’GGACTGATGCAAAGATGCATCCCTGGTACTCAAGCGCTCGCTGCAATGCATCAGTCCTTCCC
SEQ ID No.7所示核苷酸序列茎环引物：
5’GGACTGATGCAAAGATGCATCCCTGGTACTCAAGCGCTCGCTGCAATGCATCAGTCCCACTGG
SEQ ID No.8所示核苷酸序列茎环引物：
5’GGACTGATGCAAAGATGCATCCCTGGTACTCAAGCGCTCGCTGCAATGCATCAGTCCACCCC
SEQ ID No.1所示核苷酸序列PCR正向引物：5’-GCTCTTTGGTTATC-3’
SEQ ID No.1所示核苷酸序列PCR反向引物：5’-GTGATGCATCCCTGGT-3’
SEQ ID No.2所示核苷酸序列PCR正向引物：5’-GCCAAAGTGCTTAC-3’
SEQ ID No.2所示核苷酸序列PCR反向引物：5’-GTGATGCATCCCTGGT-3’
SEQ ID No.3所示核苷酸序列PCR正向引物：5’-GCTAGCTTATCAG-3’
SEQ ID No.3所示核苷酸序列PCR反向引物：5’-GTGATGCATCCCTGGT-3’
SEQ ID No.4所示核苷酸序列PCR正向引物：5’-GCGCTGGTTTCA-3’
SEQ ID No.4所示核苷酸序列PCR反向引物：5’-GTGATGCATCCCTGGT-3’
SEQ ID No.5所示核苷酸序列PCR正向引物：5’-GCCATTATTACT-3’
SEQ ID No.5所示核苷酸序列PCR反向引物：5’-GTGATGCATCCCTGGT-3’
SEQ ID No.6所示核苷酸序列PCR正向引物：5’-GCTGAGAACTGAA-3’
SEQ ID No.6所示核苷酸序列PCR反向引物：5’-GTGATGCATCCCTGGT-3’
SEQ ID No.7所示核苷酸序列PCR正向引物：5’-GCTCTCCCAACC-3’
SEQ ID No.7所示核苷酸序列PCR反向引物：5’-GTGATGCATCCCTGGT-3’
SEQ ID No.8所示核苷酸序列PCR正向引物：5’-GCTTAATGCTAATC-3’
SEQ ID No.8所示核苷酸序列PCR反向引物：5’-GTGATGCATCCCTGGT-3’
18S rRNA PCR正向引物：5’-AAGACGGACCAGAGCGAA-3’
18S rRNA PCR反向引物：5’-GGCGGGTCATGGGAAT-3’。
5.根据权利要求3所述的一种自身免疫疾病检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是用于类风湿性关节炎、红斑狼疮、狼疮肾病、银屑癣、系统性硬化、皮肌炎或白塞病检测的试剂盒。
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