CN109762896A - 一种多发性硬化症的标志物MiR-125a-5p - Google Patents

Abstract

本发明属于医学技术领域，公开了一种多发性硬化症的标志物MiR‑125a‑5p、检测多发性硬化症的试剂盒。本发明发现在自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型中腰段脊髓前角VDR表达下降，miR‑125a‑5p表达明显升高，予以miR‑125a‑5p抑制剂鞘内注射后，实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠维生素D受体表达也明显升高，临床评分下降和体重明显升高，临床症状明显缓解，而给予miR‑125a‑5p抑制剂具有良好的治疗效果。证实了miR‑125a‑5p作为多发性硬化症的标志物在实验性自身免疫性脑脊髓炎中调节维生素D受体生物学方面的关键作用，可作为潜在的新的治疗干预措施，诊断标志物和治疗靶点。

Description

一种多发性硬化症的标志物MiR-125a-5p

技术领域

本发明属于医学技术领域，公开了一种多发性硬化症的标志物MiR-125a-5p、检测多发性硬化症的试剂盒。

背景技术

多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是一种基因性、免疫性疾病，其特征是T淋巴细胞、单核细胞、炎症介质浸润，少突胶质细胞丢失，反应性星形胶质细胞形成，轴索损伤和丢失。多发性硬化的治疗干预措施非常有限，且效果不佳，导致病情反复发作。此外，人们对多发性硬化的分子机制知之甚少。因此，研究多发性硬化症的发病机制是十分必要的。实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠模型是一种有用的多发性硬化实验动物模型，可诱导炎症反应，引起类似于多发性硬化患者的神经和病理症状。

越来越多的证据表明，环境因素可能在多发性硬化中发挥重要作用。有研究表明，维生素D3的缺乏增加了实验性自身免疫性脑脊髓炎的发病率。最近报道了维生素D3对包括星形胶质细胞和小胶质细胞在内的中枢神经系统细胞的直接免疫调节作用，多种免疫细胞中的D3信号通过维生素D受体(VDR)介导。维生素D受体在适应性免疫应答中的调节作用还包括抑制树突状细胞的成熟和分化。维生素D类似物，如帕立骨化醇，可以减轻炎症过程，保护中枢神经髓鞘。然而，维生素D受体表达的调控及其在MS中的作用尚不清楚。

MicroRNA(miRNA)本质上是一种小的非编码RNA，调节基因表达和稳定的mRNA的翻译。它们参与许多生物学和病理学过程，如发育、功能失调、分化、再生、个体发生，以及包括多发性硬化在内的多种自身免疫性疾病。然而，在自身免疫性疾病中，miRNA用于治疗疾病的效果仍然受到严重限制。miRNA通过与靶mRNA的3’UTRS结合而表现出其功能，从而促进mRNA降解或抑制蛋白翻译。然而，miRNA在多发性硬化中对维生素D受体表达的调控尚不清楚。通过生物信息学分析(Targetscan和miRNA.org)，miR-125-5p可以与维生素D受体mRNA的3’UTR结合。MiR-125a-5p被证实与免疫细胞活化和炎症相关，尤其是在类风湿关节炎、神经炎症和自身免疫性疾病中，但MiR-125a-5p在MS中的作用尚不清楚。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种多发性硬化症的标志物及检测多发性硬化症的试剂盒。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

本发明构建实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠模型，从0到21天EAE小鼠临床平均得分升高，体重减轻。免疫后第21天，取各组小鼠腰骶脊髓，石蜡切片，苏木精、伊红染色显示EAE小鼠腰骶脊髓存在弥漫性炎性浸润和部分血管闭塞，表明EAE可引起腰骶脊髓炎性浸润。

本发明采用qPCR和Western blot检测脊髓腹角VDR表达，结果显示EAE小鼠VDRmRNA水平较CON组或Vehicle组小鼠明显降低，EAE小鼠VDR表达较CON组或Vehicle组小鼠明显降低。进一步采用qPCR检测miRNA在脊髓腹角(腰彭大)中的表达。结果表明miR-125a-5p在EAE中的表达增加，但未能改变miR-125b-5p或miR-351-5p在脊髓腹角的表达，即EAE可增强miR-125a-5p在脊髓腹角的表达。

本发明采用原位杂交对MiR-125a-5p的定位，结果显示MiR-125a-5p主要表达于脊髓腹角神经元。进一步的，通过原位杂交共定位检测发现miR-125a-5p主要表达在细胞质中。表明MiR-125a-5p和VDR共定位于同一细胞，主要在EAE小鼠细胞质中共表达。由此可见，自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型中腰段脊髓前角VDR表达下降，miR-125a-5p表达明显升高。

进一步予以miR-125a-5p拮抗剂鞘内注射后，实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠维生素D受体表达也明显升高，临床评分下降和体重明显升高，临床症状明显缓解，miR-125a-5p拮抗剂具有良好的治疗效果。表明抑制miR-125a-5p可以显著抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠维生素D受体的下降。

因此本发明提供了MiR-125a-5p在制备多发性硬化症的标志物中的应用。

作为优选，所述多发性硬化症为MOG35-55多肽诱发的实验性自身免疫性脑脊髓炎。

本发明还提供了MiR-125a-5p拮抗剂在制备治疗多发性硬化症的药物中的应用。

在一些实施方案中，所述MiR-125a-5p拮抗剂为MiR-125a-5p antagomir。MiR-125a-5p antagomir是一种大小约21-23个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成的非编码RNA。MiRNA通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体(RISC)降解mRNA或阻碍其翻译，可以调控基因的表达，其在免疫细胞中高表达。

本发明还提供了一种检测多发性硬化症的试剂盒，含有检测MiR-125a-5p的试剂。

在一些实施方案中，所述试剂包含MiR-125a-5p的引物和/或MiR-125a-5p的cDNA反转录引物。

在一些具体实施例中，所述引物的序列为：gcgtccctgagaccctttaac(SEQ ID NO:1)和agtgcagggtccgaggtatt(SEQ ID NO:2)。

在一些具体实施例中，所述cDNA反转录引物的序列为：gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgactcacag(SEQ ID NO:3)。

在一些实施方案中，所述试剂盒还包括总RNA提取试剂、反转录试剂、荧光定量Q-PCR反应的试剂、荧光检测试剂中至少一种。

由上述技术方案可知，本发明发现在自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型中腰段脊髓前角VDR表达下降，miR-125a-5p表达明显升高，予以miR-125a-5p抑制剂鞘内注射后，实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠维生素D受体表达也明显升高，临床评分下降和体重明显升高，临床症状明显缓解，而给予miR-125a-5p抑制剂具有良好的治疗效果。证实了miR-125a-5p作为多发性硬化症的标志物在实验性自身免疫性脑脊髓炎中调节维生素D受体生物学方面的关键作用，可作为潜在的新的治疗干预措施，诊断标志物和治疗靶点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示本发明实验设计流程图；

图2示实施例1EAE小鼠临床平均评分及体重、HE染色的变化结果图；比例尺＝50μm；

图3示实施例2EAE小鼠脊髓腹角维生素D受体蛋白和mRNA表达水平；

图4示实施例3免疫荧光染色检测EAE小鼠脊髓腹角VDR的定位图；比例尺＝50μm；

图5示实施例4miRNA在脊髓腹角中的表达；

图6示实施例5miR-125a-5p在脊髓腹角中的表达；比例尺＝50μm；

图7示实施例6MiR-125a-5p和VDR在脊髓中的细胞定位；比例尺＝25μm；

图8示实施例7维生素D受体或miR-125a-5p拮抗剂对EAE小鼠的影响；

图9示实施例8miR-125a-5p拮抗剂对VDR的mRNA和蛋白表达水平。

具体实施方式

本发明公开了一种多发性硬化症的标志物MiR-125a-5p、检测多发性硬化症的试剂盒。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。

下述实施例中实验材料为成年雌性C57BL/6小鼠(n＝60，年龄：8-12周，体重:18-20g)被饲养在一个恒定的温度24±2℃，相对湿度40-60％，12h光暗周期清洁级动物设施在苏州大学实验动物中心。动物由苏州大学动物保护与利用委员会提供。食物和水是随意供给的。动物用于行为实验和分子生物学变化的检测。所有的程序都是按照国际研究协会和苏州大学动物保护委员会的指导方针进行的。

下述实施例中分组及给药方法为：将小鼠分为以下各组(n＝60只，图1)：

1.对照组(CON，n＝10)：小鼠未注射任何药物；

2.溶媒组(Vehicle，n＝10):每只小鼠仅用0.1ml完全弗氏佐剂(CFA)处理，不用髓磷脂寡突胶质细胞糖蛋白(MOG)35-55多肽诱导；

3.实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)(n＝10)：每个老鼠免疫注射0.1ml MOG 35-55肽皮下注射，具体配方由8mg MOG 35-55肽在4ml CFA，乳化的最终浓度2mg/ml，装有4mg/ml的结核分枝杆菌。在MOG注射后1小时，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)腹腔注射0.1ml百日咳毒素(PTX，300ng/0.1ml)。免疫后48小时(腹腔注射)再注射相同剂量的百日咳毒素。在第二次注射计划中，每只小鼠注射等量的百日咳毒素。

4.EAE+帕里骨化醇(PC)组(n＝10):经MOG诱导成功后，每日腹腔给予帕立骨化醇治疗(帕里骨化醇1μg/ml，0.1ml/d腹腔注射)。

5.EAE+miRNA-125a-5p拮抗剂:经MOG诱导成功后，每日给予miR-125a-5p拮抗剂(n＝10)或拮抗剂NC(拮抗剂阴性对照组)(n＝10)，在EAE诱导后每日鞘内注射。

EAE的严重程度由体重和临床评分决定。每天记录体重和症状。临床分为0分(无临床症状)；1分(尾部麻痹)；2分(步态异常)；3分(后肢瘫痪)；4分(完全瘫痪)至5分(死亡)，得分区间为0.5，如前所述。诱导后的21天实验性自身免疫性脑脊髓炎，老鼠被处死和脊髓组织收集和储存在-80℃进行进一步的分析。

统计分析

所有的结果都表示为mean±SEM。分析前，对所有数据进行正态性检验。当比较只涉及两个平均值时，使用t检验。当涉及多个比较时，首先进行单因素方差分析(ANOVA)或弗里德曼方差分析(Friedman ANOVA)，以获得对原假设的全部检验。如果原假设检验的总p值(alpha值)为p<0.05，则采用Dunn后续检验对各组进行后续比较。当均值不正常时进行Mann-Whitney检验。当alpha值p<0.05时，认为比较有统计学意义。定量统计数据采用Prism(Version 8，GraphPad-Prism，San Diego，CA，USA)软件进行多组比较分析。

实施例1、EAE小鼠临床平均、体重评分及HE染色结果

从予以MOG诱导给药之日起，免疫当天记为第一天，免疫后第九天，EAE动物表现出较不活跃、反应较差、尾无力、毛粗且蓬乱。通过比较三组平均临床的分数，给药前一天算为0天，从0到21天CON组的临床评分平均值为0±0(n＝6)，体重逐渐升高，Vehicle组的临床评分在所有均为0±0，体重逐渐增加(n＝6)(图2A-B，双向方差分析)。EAE组平均临床的分数显著增高(n＝6，***p<0.001)，但他们的体重明显低于对照组和溶媒组(n＝6，**p<0.01,***p<0.001)。表明EAE小鼠临床平均得分升高，体重减轻。

免疫后第21天，取各组小鼠腰骶脊髓，石蜡切片，苏木精、伊红染色(图2C-D)。具体方法为对脊髓腰骶膨大组织灌流后新鲜取材置于4％多聚甲醛保存，部分制成石蜡切片进行HE染色，检测炎性细胞的浸润、脱髓鞘情况。根据研究统一评分标准，对中枢神经系统炎症进行半定量分析评分体系：0，无浸润；1、部分脊膜浸润；2、脊膜浸润明显；3、明显的脊膜及部分实质浸润。结果显示CON组小鼠腰骶脊髓无血管罩及炎性浸润(图2C，左)，但EAE小鼠腰骶脊髓存在弥漫性炎性浸润和部分血管闭塞(图2C，右)。统计学分析显示，各组HE染色病理评分差异有统计学意义，EAE小鼠的病理评分较CON组小鼠明显升高(n＝3，***P<0.001,Mann-Whitney test；图2D)。表明EAE可引起腰骶脊髓炎性浸润。

实施例2、EAE小鼠脊髓腹角VDR表达

采用qPCR和Western blot检测脊髓腹角VDR表达。具体方法为于免疫后第21天，对各组小鼠进行取材。断颈处死小鼠后，对小鼠脊髓及脑组织新鲜取材，切成两部分，液氮中快速冷冻，后置于-80℃冰箱保存，RT-qPCR方法检测脊髓VDR的表达水平，同时行蛋白免疫印迹方法检测VDR表达。其中VDRRT-qPCR反转录引物及扩增引物如表1所示。

表1 VDRRT-qPCR反转录引物及扩增引物

序列名称	序列
		VDR-RT	Oligo(dT)
VDR-F	5’-AGAGAAGATTAGCATGGCCCCTG-3’
		VDR-R	5’-AGGGGGTGTACAGATCAGAGTTTG-3’

结果表明，CON组mRNA水平的VDR是1.00±0.24(n＝4)，Vehicle组为0.97±0.16(n＝4)和EAE组为0.11±0.04(n＝4)。统计学分析显示EAE小鼠VDR mRNA水平较CON组或Vehicle组小鼠明显降低(n＝4，**p<0.01，单向方差分析；图3A)。免疫印迹法显示的CON组VDR蛋白质含量为0.83±0.07(n＝4)，溶媒组为0.67±0.02(n＝4)和EAE组为0.43±0.01(n＝4)。统计学分析显示EAE小鼠VDR表达较CON组或Vehicle组小鼠明显降低(n＝4，***p<0.001，单向方差分析；图3B)。

实施例3、EAE小鼠脊髓腹角VDR的定位

采用免疫荧光法测定EAE小鼠脊髓腹角VDR的定位。运用免疫荧光化学方法检测VDR在小鼠腰膨大脊髓神经元内的表达分布，结果见图4。

结果显示，神经元标记物NeuN染色为红色(图4A)，小胶质细胞标记物CD11b染色为红色(图4D)，星形胶质细胞标记物GFAP染色为红色(图4G)，VDR阳性细胞标记物(图4B、E、H)染色为绿色。合并图像显示，VDR主要与EAE小鼠脊髓腹角神经元(C)共表达于同一神经元细胞，但不与EAE小鼠脊髓腹角小胶质细胞(F)、星形胶质细胞(I)共表达。细胞被染色的红色NeuN(标记的神经元)，CD11b(小胶质细胞的标记)和GFAP(标记星形胶质细胞)(图4A、D和G)和VDR-阳性细胞染色在绿色(图4B、E和H)。表明VDR主要表达于脊髓腹角神经元。

实施例4、miRNA在脊髓腹角中的表达

通过生物信息学预测软件Targetscan和miRNA.org，发现miR-125a-5p、miR-125b-5p和miR-351-5p靶向VDR mRNA的3’UTR。为了验证这些筛选的microRNA是否参与EAE，采用qPCR检测miRNA在脊髓腹角(腰彭大)中的表达。其中miR-125a-5p、miR-125b-5p、miR-351-5p的RT-qPCR反转录引物及扩增引物如表2所示。

表2各miRNA的RT-qPCR反转录引物及扩增引物

序列名称	序列
		mmu-miR-125b-5p-RT	5’-gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgactcacaa-3’
mmu-miR-351-5p-RT	5’-gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactgcatacgaccaggct-3’
		mmu-miR-125a-5p-RT	5’-gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgactcacag-3’
mmu-miR-125b-5p-F	5’-cgcgtccctgagaccctaac-3’
		mmu-miR-351-5p-F	5’-gtccctgaggagccctttg-3’
mmu-miR-125a-5p-F	5’-gcgtccctgagaccctttaac-3’
		茎环下游的共同引物	5’-agtgcagggtccgaggtatt-3’

注：茎环下游的共同引物为miRNA下游通用引物。

miR-125a-5p的表达分别为CON组1.00±0.87(n＝4)，vehicle组1.32±1.04(n＝4)和EAE组4.76±0.54(n＝4)。统计学分析显示，与CON或vehicle小鼠相比，EAE小鼠miR-125a-5p水平显著升高(n＝4，**p<0.010，单向方差分析，图5A)。MiR-125b-5p分别为CON组1.00±0.50(n＝4)，vehicle组2.02±0.57(n＝4)和EAE组0.74±0.19(n＝4)。MiR-351-5p分别为CON组1.00±1.00(n＝4)，vehicle组1.78±0.34(n＝4)，EAE组1.97±0.25(n＝4)。经统计学分析，EAE小鼠miR-125b-5p、miR-351-5p水平与CON、vehicle小鼠相比无统计学意义[n＝4，p(miR-125b-5p)＝0.654；p(miR-351-5p)＝0.054，单向方差分析，图5B和C]。结果表明miR-125a-5p在EAE中的表达增加，但未能改变miR-125b-5p或miR-351-5p在脊髓腹角的表达，即EAE可增强miR-125a-5p在脊髓腹角的表达。

实施例5、MiR-125a-5p的定位

采用原位杂交对MiR-125a-5p的定位。结果见图6。

神经元标记物NeuN染色为绿色(图6A)，小胶质细胞标记物CD11b染色为绿色(图6E)，星形胶质细胞标记物GFAP染色为绿色(图6I)，miR-125a-5-p阳性细胞标记物(图4B、E、H)染色为红色(图6B、6F、6J)。DAPI代表细胞核蓝染色(图6C、6G、6K)。合并图像显示miR-125a-5p主要表达于神经元(图6A-D)，EAE小鼠脊髓腹角MiR-125a-5p未与脊髓腹角小胶质细胞(6H)、星形胶质细胞(6L)共表达。表明MiR-125a-5p主要表达于脊髓腹角神经元。

实施例6、MiR-125a-5p和VDR在脊髓中的细胞定位

MiR-125a-5p与VDR相互调控的前提是两种分子在同一个细胞中共表达。因此，我们进行原位杂交共定位检测。部分腰骶膨大组织则制成冰冻切片，荧光原位杂交(FISH)结合免疫荧光染色法检测VDR与miR-125a-5p在脊髓中的细胞定位。VDR阳性细胞用绿色染色(图7A)，miR-125a-5p阳性细胞用红色染色(图7B)，核染色用DAPI染成蓝色(图7C)。VDR与miR-125a-5p的合并结果显示它们在同一个神经元中共表达(图7D)。DAPI与miR-125a-5p合并结果显示，miR-125a-5p主要表达在细胞质中(图7E和F)。表明MiR-125a-5p和VDR共定位于同一细胞，主要在EAE小鼠细胞质中共表达。

实施例7、VDR或miR-125a-5p拮抗剂对EAE小鼠的影响

为了验证VDR在EAE小鼠中的作用，我们使用了一种有效的VDR激动剂帕里骨化醇(paricalcitol，PC)。PC治疗后第9天EAE小鼠临床平均评分较EAE小鼠降低(n＝6，***p<0.001，双向方差分析)(图8A)。EAE+PC组小鼠体重自PC治疗后第9天开始逐渐升高，EAE组小鼠体重逐渐下降(n＝6，***p<0.001，双向方差分析)(图8B)。这些数据表明VDR参与了EAE小鼠的MS。

为了进一步证实miR-125a-5p参与多发性硬化的发病，我们使用miR-125a-5p拮抗剂。EAE小鼠与拮抗miR-NC组比较，miR-125a-5p拮抗剂(鞘内注射)显著改善了临床评分，可降低EAE小鼠的平均临床评分，减轻麻痹症状(n＝6，*p<0.05，双向方差分析；图8C)，并可增加EAE小鼠体重(n＝6，**p<0.01，双向方差分析；图8D)。

上述结果表明VDR或miR-125a-5p拮抗剂可减轻EAE小鼠的症状。

实施例8、MiR-125a-5p拮抗剂可逆转EAE小鼠VDR下调的表达。

为了确定miR-125a-5p对VDR的调控，我们检测了miR-125a-5p拮抗剂或拮抗剂阴性对照鞘内注射后VDR的mRNA和蛋白表达水平。QPCR结果表明mRNA水平的VDR为1.00±0.92(n＝4，CON)，1.01±0.67(n＝4，antagomir-NC)和12.62±0.14(n＝4，miR-125a-5pantagomir)。统计分析显示，鞘内注射miR-125a-5p拮抗剂后，EAE小鼠VDRmRNA水平较拮抗剂NC组和EAE组明显升高(n＝4，**p<0.01，单向方差分析；图9A)。Western blot检测显示，鞘内注射miR-125a-5p拮抗剂后，EAE组VDR为0.45±0.09(n＝4)，Antagomir-NC组为0.39±0.07(n＝4)，EAE+miR-125a-5p antagomir组为1.53±0.41(n＝4)。EAE小鼠VDR蛋白表达较拮抗剂NC组或EAE组小鼠明显升高(n＝4，**p<0.01，单向方差分析；图9B)。结果表明，miR-125a-5p在实验性自身免疫性脑脊髓炎的小鼠模型可以调控VDR表达而改善其临床症状，参与EAE的发病机制，是EAE诊断和治疗的新靶点。

实施例9、MiRNA-125a-5p的检测方法

1、RNA的提取:

(1)将组织转移到1.5ml RNase free离心管中，加入300μl Trizol，用电动研磨器充分研磨至肉眼看不见沉淀(一般分多次匀浆，防止产热降解)，再加入200μl Trizol，室温静置5min；

(2)4℃12000rpm离心10min后吸取上清至新的1.5ml RNase free离心管中；

(3)加入200μl氯仿，剧烈震荡15s，室温静置5min；

(4)4℃12000rpm离心15min，小心吸取上清液至新的1.5ml RNase free离心管中；

(5)加入500μl异丙醇，上下颠倒轻轻混匀至液体澄清，室温静置10min；

(6)4℃12000rpm离心10min，弃去上清(能观察到白色沉淀)；

(7)加入1ml预先配好的75％乙醇(DEPC水配制)，轻轻震荡洗涤沉淀，4℃9000rpm离心5min，弃上清；

(8)晾干，加入适量DEPC水，65℃促溶15min；

(9)Nanodrop测RNA浓度和纯度。

2、Micro RNA 125a-5p RT-PCR具体步骤：

(1)用DEPC水将引物稀释40倍：取1μl miR-125a-5p-RT引物，加入39μl DEPC水，混合均匀；

(2)用DEPC水稀释RNA：记录RNA的浓度值，取4μl总RNA于1.5ml RNase free管中，加入与RNA浓度值相等量的DEPC水，混合均匀；

(3)配混合体系Mix，具体反应体系如下：

反应体系	2倍体积(μl)
		dNTP mix	0.15
10×RT	1.5
		RNase Inhibitor	0.19
RT enzyme	1
		Water	4.16

(4)取200μl RNase free离心管，分别加入稀释后的2.5μl RNA，1.5μl miR-125a-5p-RT引物，3.5μl Mix，混合均匀后进行PCR反应。

(5)反应程序：

16℃30min；42℃30min；85℃5min；4℃冷藏保存。

3、Micro RNA Real time-PCR过程

(1)实时定量PCR采用SYBR法，使用ABI 7500Real-time PCR仪，反应体系如下：

反应体系	体积(μl)
		2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix	5
Passive Reference DyeⅡ(50×)	0.2
		cDNA	1
mmu-miR-125a-5p-F(10μM)	2
		茎环下游的共同引物(10μM)	2

(2)反应程序：

每个样本重复3次，荧光信号在60.0℃收集，全程129min，反应结束后，根据设定的阈值，读取各个样本的扩增曲线所显示的Ct值，定量分析。

序列表

<110> 苏州大学

<120> 一种多发性硬化症的标志物MiR-125a-5p

<130> MP1901558

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcgtccctga gaccctttaa c 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agtgcagggt ccgaggtatt 20

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgactcacag 50

Claims (9)

1.MiR-125a-5p在制备多发性硬化症的标志物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，所述多发性硬化症为MOG35-55多肽诱发的实验性自身免疫性脑脊髓炎。

3.一种检测多发性硬化症的试剂盒，含有检测MiR-125a-5p的试剂。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，所述试剂包含MiR-125a-5p的引物和/或MiR-125a-5p的cDNA反转录引物。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，所述引物的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，所述cDNA反转录引物的序列如SEQ ID NO:3所示。

7.根据权利要求3所述的试剂盒，所述试剂盒还包括总RNA提取试剂、反转录试剂、荧光定量Q-PCR反应的试剂、荧光检测试剂中至少一种。

8.MiR-125a-5p拮抗剂在制备治疗多发性硬化症的药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，所述MiR-125a-5p拮抗剂为MiR-125a-5p antagomir。