KR20140007168A

KR20140007168A - ＳＩＲＴ7를 발현하는 암 치료를 위한 ＭｉＲ-125ａ-5ｐ의 용도

Info

Publication number: KR20140007168A
Application number: KR1020120074472A
Authority: KR
Inventors: 남석우; 김정규
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2012-07-09
Filing date: 2012-07-09
Publication date: 2014-01-17

Abstract

본 발명은 SIRT7 유전자의 발현이 간세포암의 발생 및 증식활성 또는 세포주기의 전이 활성에 대한 지표인 사실에 기초하여, 간세포암 및 간암 진단 마커로서의 SIRT7 유전자 용도 및, SIRT7 유전자 발현 억제에 의한 항암적 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 SIRT7 발현과 특정 miRNA와의 연관성에 기초하여, 특정 miRNA의 종양억제 기능을 이용한 SIRT7의 세포주기 조절능 및 이에 따른 종양 성장 저해능에 관한 것이다.

Description

ＳＩＲＴ7를 발현하는 암 치료를 위한 ＭｉＲ-125ａ-5ｐ의 용도{Use of target micro RNA-125a-5p for treatment of cancer expressing ＳＩＲＴ7}

본 발명은 SIRT7 유전자의 발현이 간세포암의 발생 및 증식활성에 대한 지표라는 사실으로부터 나아가 상기 SIRT7 발현을 조절하는 특정 내생성 miRNA에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 SIRT7 발현을 조절하는 miRNA인 miR-125a-5p 및 miR-125b의 세포주기 조절능 및 종양 성장 저해능에 따른 간세포암 타겟으로의 용도에 관한 것이다.

간세포암 (Hepatocellular carcinoma, HCC)은 해마다 50만명이 사망하는, 세계에서 5번째로 일반적인 종양이다 (Okuda 2000). HCC 환자의 생존률은 지난 20년에 걸쳐 개선되지 않았고, 사망율과 거의 동일한 발병률을 지니고 있다 (Marrero, Fontana et al. 2005). B형 간염 바이러스 또는 C형 간염 바이러스에 감염되어 발병하는 만성 간염 및 아플라톡신 B1 (aflatoxin B1)과 같은 발암물질에의 노출은 HCC에 대한 주요 위험 인자로 알려져 있다 (Thorgeirsson and Grisham 2002).

또한, 세포주기 기작에서 G1 단계로 진행하는 세포주기 조절물질들의 변화가 간암 형성에 관련되어 있다는 보고도 있다[Hui 등, Hepatogasteroenterology 45:1635-1642, 1998]. 이외에도 DNA 돌연변이와 유전자 발현의 유전적 변화(genetic alteration)등이 간암 환자조직에서 확인된다고 보고되고 있다[Park 등, Cancer Res. 59:307-310, 1999; Bjersing 등, J. Intern. Med. 234:339-340,1993; Tsopanomichalou 등, Liver 19:305-311, 1999; Kusano 등, Hepatology 29:1858-1862, 1999; Keck 등,Cancer Genet. Cytogenet. 111:37-44, 1999].

이와 같이, 간암의 발생과 진행은 몇몇 특정 유전자들에 의해 이루어지는 것이 아니라 암의 악성화가 진행되면서 발생하는 세포내 다양한 신호전달과 조절기작에 관여하는 많은 유전자들의 복합적인 상호작용에 의한 것임을 알 수 있다. 따라서, 몇몇 특정한 유전자들에 중점을 두고 간암의 형성 기작을 연구하는 것 보다 정상 간세포와 간암 세포주들 사이의 다량의 유전자 발현정도를 비교 분석하여 간암에 관련된 새로운 유전자들을 발굴하는 연구는 매우 중요한 의미가 있는 것이다.

이러한 최근의 분자적 고찰은, p53, 베타 카테닌, 및 AXIN1와 같은 종양 억제 유전자 또는 종양발생유전자의 유전자 변형이 HCC에 대한 진행과 연관되어 있을 가능성을 발견하였지만 (de La Coste, Romagnolo et al. 1998; Satoh, Daigo et al. 2000; Pang, Ng et al. 2003), 이러한 유전적 변화가 개개인의 종양에 대한 임상적 특징에 반영되는지도 불분명하다. 그러므로, 대부분의 환자에서 HCC의 기초를 이루는 유력한 분자적 기전에 대한 연구가 여전히 과제로 남아 있다 (Nam, Park et al. 2005).

이에, 본 발명자들은 간암 (HCC) 조직에서 SIRT7의 발현수준을 분석함과 더불어, SIRT7의 발현을 조절하는 기능을 가지는 특정 miRNA를 발견하고, 상기 miRNA의 세포주기 조절능 및 프로모터 메틸화에 따른 종양 성장 저해능을 확인함으로써, 간암 치료용 타겟으로의 특정 miRNA 용도에 관한 본 발명을 완성하였다.

대한민국 공개특허 2010-0084619

본 발명의 목적은 간암마커 SIRT7와 특정 miRNA MiR-125a-5p와의 관련성을 기초로 MiR-125a-5p의 간암 타겟으로서의 용도를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 MiR-125a-5p 발현 또는 작용 촉진제를 유효성분으로 포함하는, SIRT7를 발현하는 암에 대한 항암용 조성물 및 이를 이용하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 MiR-125a-5p 발현을 억제하는 간암 치료용 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 데 있다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 간암 마커 SIRT7 발현을 제어하는 특정 miRNA인 miR-125a-5p 신규 용도를 제공한다.

일 구체예로, SIRT7를 발현하는 암 발생 또는 예후의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, miR-125a-5p 발현 프로파일링을 확인하는 방법을 제공한다.

이때, 상기 SIRT7를 발현하는 암은 간세포암(HCC, hepatocellular carcinoma), 담도세포암 및 전이성 간암으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 간암일 수 있으며, 가장 바람직하게는 간세포암이다. 그리고 MiR-125a-5p는 5‘-ucccugagacccuuuaaccuguga-3’의 염기서열을 갖는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 MiR-125a-5p 발현 또는 작용 촉진제를 유효성분으로 포함하는, SIRT7를 발현하는 암에 대한 항암용 조성물을 제공한다.

상기 MiR-125a-5p 발현 또는 작용 촉진제는

MiR-125a-5p가 발현토록 도입된 벡터;

메틸화(hypermethylation) 억제 물질; 또는

p53 활성화 물질을 사용할 수 있다.

특히, 상기 조성물은 SIRT7를 발현하는 암세포를 형질 감염시켜 MiR-125a-5p가 SIRT7 mRNA 3'UTR과 결합하도록 함으로써 SIRT7 발현을 억제하는 효과를 가질 수 있다. 상기 조성물은 양이온성 지질 또는 양이온성 양친매성 물질을 포함하여 세포 내에 방출되는 것을 도울 수 있다.

상기 조성물은 세포주기를 G1/S 단계에 어레스팅(arresting)함으로서, 암세포의 성장을 지연시키는 효과를 가진다. 따라서 항암제로서 유용하다.

또한, 본 발명은 다른 관점에서 MiR-125a-5p의 miRNA를 이용하여 SIRT7 유전자의 발현을 조절하는 방법을 제공한다.

상기 방법은, SIRT7를 MiR-125a-5p의 miRNA와, 또는 SIRT7를 표적으로 하는 MiR-125a-5p를 암호화하는 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하여 이루어질 수 있다. 이 때, MiR-125a-5p의 과발현 또는 활성화를 통해 SIRT7 유전자 발현을 억제하는 방법을 통해 항암 효과를 발휘할 수 있다. 이를 위해, 프로모터 영역의 메틸화 억제 또는 p53 활성화를 꾀하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 간암 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:

(a) MiR-125a-5p을 발현하는 동물세포에 항암 후보 물질을 처리하는 단계; 및

(b) 상기 동물세포에서 항암 후보 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 MiR-125a-5p 발현이 촉진되는 경우의 물질을 간암 치료용 물질로 선택하는 단계.

이처럼, 본 발명은 간암 마커 SIRT7의 발현을 제어하는 miR-125a-5pb에 관한 간암 진단 및 치료용 타겟으로의 다양한 용도에 관한 것이다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 특정 miRNA MiR-125a-5p의 발현조절에 의하여 간암 세포에서 과발현되는 SIRT1의 발현을 조절함으로써 G1/S 단계에 세포들을 어레스팅(arresting)하고 세포주기에 영향을 끼쳐 종양 세포의 성장을 억제시킬 수 있다. 따라서 SIRT1의 발현을 조절하는 miRNA인 MiR-125a-5p를 간암 타겟용도로 활용하여 간암 치료제 개발에 이용할 수 있다.

도 1은 인간 간세포암종(HCC)과 SIRT 발현간의 연관성에 관련한 결과들에 대한 것이다.
도 2는 GEO 데이터베이스로부터의 HCC 환자에서 나타나는 SIRT의 비정상적 발현 조절에 관한 것이다.
도 3은 SIRT7가 세포 주기 탈조절(deregulating) 및 자가소화 관련 단백질에 의해 간세포암종(HCC) 성장을 조절하는 기작에 대한 것이다.
도 4 암화유전자 SIRT7에 대해 전사적으로 사일런싱 유전자 타겟을 찾는 전체 게놈 스캔 결과이다.
도 5 노코다졸 처리에 의한 세포 주기 프로파일 결과이다.
도 6 HCC에서 나타나는 상이한 miRNA 발현 프로파일링 및 SIRT7을 타겟팅하는 miRNA 확인 결과이다.
도 7 HCC 환자에서의 SIRT7 3'UTR 타겟팅 및 miRNA 발현 분석 결과이다.
도 8 miR-125a-5p 및 miR-125b이 간암 발생에 있어서, SIRT7 발현의 내생성 조절자임을 보여주는 결과이다.
도 9 miR-125a-5p 및 miR-125b이 간암 발생에 있어서, SIRT7 억제에 EKfms 종양 억제자임을 보여주는 결과이다.
도 10 HCC에서 miR-125a-5p 및 miR-125b 상 히스톤 탈아세틸라제 억제자(TSA, trichostatin)의 영향을 도시한 것이다.
도 11 간암 발생에 있어서 miR-125a-5p 및 miR-125b의 억제 메커니즘에 관한 결과이다.
도 12는 간암 발생에 있어서 종양 억제자인 miR-125a-5p 및 miR-125b의 불활성화 메커니즘에 관한 실험 결과이다.
도 13은 간암 발생에 있어서 내생성 miR-125a-5p 및 miR-125b를 조절하는 메커니즘에 관한 in vivo 평가 결과이다.

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

"진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 급성 심근경색 발병 여부를 확인하는 것이다. 그 중에서도 특히 급성 ST분절 상승 심근경색증 발병 여부에 유용하다.

"진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)란 급성 심근경색 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 허혈 질환을 가진 세포에서 증가양상을 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질 , 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 급성 심근경색 진단 마커는 MMP9, PGLYRP1, MANSCI, CA4, QPCT, IRAK3, VNN로 급성 심근경색 발병 4시간 이내 그 발현이 증가하는 유전자들이다.

"상향조절(up-regulation)"이라는 표현은, 정상조직세포에 비하여, 활성화된 세포에서 세포내 전사(gene transcription) 또는 번역(gene translation)에 의해서 특정 유전자의 mRNA로의 발현 또는 단백질로 발 현량이 현저하게 증가된 것을 의미한다.

"대상" 또는 "환자"는 인간, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다.

"조직 또는 세포 샘플"은 대상 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 또한 1차 또는 배양 세포 또는 세포주일 수 있다.

"핵산"은 임의의 DNA 또는 RNA, 예를 들어, 조직 샘플에 존재하는 염색체, 미토콘드리아, 바이러스 및/또는 세균 핵산을 포함하는 의미이다. 이중가닥 핵산 분자의 하나 또는 두개 모두의 가닥을 포함하고, 무손상 핵산 분자의 임의의 단편 또는 일부를 포함한다.

"유전자"는 단백질 코딩 또는 전사시에 또는 다른 유전자 발현의 조절시에 기능적 역할을 갖는 임의의 핵산 서열 또는 그의 일부를 의미한다. 유전자는 기능적 단백질을 코딩하는 모든 핵산 또는 단백질을 코딩 또는 발현하는 핵산의 일부만으로 이루어질 수 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종료 영역, 프로모터 서열, 다른 조절 서열 또는 유전자에 인접한 특유한 서열 내에 유전자 이상을 포함할 수 있다.

"유전자 발현"이란 용어는 일반적으로 생물학적 활성이 있는 폴리펩티드가 DNA 서열로부터 생성되고 세포에서 생물학적 활성을 나타내는 세포 과정을 의미한다. 그런 의미로, 유전자 발현은 전사 및 해독 과정을 포함할 뿐만 아니라, 유전자 또는 유전자 산물의 생물학적 활성에 영향을 끼칠 수 있는 전사후 및 해독후 과정을 포함한다. 상기 과정들은 RNA 합성, 가공 및 수송뿐만 아니라, 폴립펩티드 합성, 수송 및 폴리펩티드의 해독후 변형을 포함하지만, 이들에 국한되는 것은 아니다. 단백질 산물을 암호화하지 않는 유전자, 예컨대, miRNA 유전자의 경우에, "유전자 발현"이란 용어는 전구체 miRNA가 유전자로부터 생성되는 과정을 의미한다. 통상, 상기 과정은, 단백질 암호 유전자에 대해 RNA 폴리머라제 II에 의해 유도되는 전사와는 달리, miRNA 유전자의 전사 산물이 해독되어 단백질을 생성하지 않지만, 전사로 언급된다. 그럼에도 불구하고, miRNA 유전자로부터 성숙 miRNA의 생성은 그 용어가 본원에 사용되는 대로 "유전자 발현"이란 용어에 의해 포함된다

"코딩 영역" 또는 "코딩 서열"은, 통상적인 염기쌍과 코돈 용법 관계에 따라, 발현이 요구되는 특정 유전자 생성물 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산 서열, 이의 상보체, 또는 이들의 일부분을 지칭한다. 코딩 서열은 성숙 mRNA를 제공하기 위해 세포의 생화학 기구에 의해 함께 연결되는 게놈 DNA 또는 미성숙 1차 RNA 전사체에서의 엑손을 포함한다. 안티센스(antisense) 가닥은 상기 핵산의 상보체이고, 코딩 서열은 이들로부터 추정될 수 있다. 코딩 서열은, 적절한 길이의 전사체가 생성되고 적절한 리딩 프레임에서 번역되어 목적하는 기능 생성물이 생성되도록, 전사 조절 요소 및 번역 개시 및 종결 코돈과의 관계에 놓인다.

"프라이머"는 상보성 RNA 또는 DNA 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응에서 발생하는 뉴클레오티딜트랜스퍼라제의 작용에 의해 모노뉴클레오티드로부터 폴리뉴클레오티드의 단계적 합성을 위한 출발점으로 기능하는 올리고뉴클레오티드 서열을 의미한다.

"단백질"은 또한 기준 단백질과 본질적으로 동일한 생물 활성 또는 기능을 보유하는, 단백질의 단편, 유사체 및 유도체를 포함하는 것이다

"표지" 또는 "라벨"는 직접 또는 간접적으로 시약, 예를 들어 핵산 프로브 또는 항체에 컨쥬게이팅 되거나 융합되고 컨쥬게이팅 되거나 융합된 시약의 검출을 용이하게 하는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 표지는 그 자체가 검출될 수 있거나 (예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 효소 표지의 경우에, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매 할 수 있다.

"형질감염 또는 트랜스펙션"은 세포외부 DNA가, 수반물질이 있고 없는 상태로 숙주 세포로 들어가는 과정을 말한다. "트랜스펙션된 세포"란 세포 외부 DNA가 세포 내로 도입되어 세포 외부 DNA를 가지고 있는 세포를 가리킨다. DNA는 세포로 도입되어 핵산이 염색체에 삽입되거나 혹은 염색체 외 물질로 복제될 수 있다.

" 벡터" 라는 용어는 숙주 세포에 삽입되어 숙주 세포 게놈과 재조합되고 이에 삽입되거나, 또는 에피좀으로서 자발적으로 복제하는 컴피턴트 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 핵산을 의미한다. 이러한 벡터로는 선형 핵산, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, RNA 벡터, 바이러스 벡터 등이 있다.

"리포터 유전자 (reporter gene)"란 용어는 그 존재 또는 활성에 의해 쉽게 검출될 수 있는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 의미하는데, 그 예로는 루시퍼라제, 형광성 단백질 (예컨대, 녹색 형광 단백질), 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, β-갈락토시다제, 분비된 태반 알칼리 포스파타제, β-락타마제, 인간 성장 호르몬 및 기타 분비된 효소 리포터를 들 수 있으나, 이들에 국한되는 것은 아니다. 일반적으로, 리포터 유전자는 세포(들)의 분석에 의해, 예컨대, 세포(들)의 직접 형광 분석, 방사성 동위원소 분석 또는 분광 분석에 의해 신호 분석을 위해 그리고 통상적으로 세포들을 죽일 필요 없이 검출할 수 있는, 숙주 세포에 의해 생성되지 않는 폴리펩티드를 암호화한다.

"표적 유전자 (target gene)"란 용어는 본원에 개시되는 주제의 방법 및 조성물을 사용하여 조절하기 위해 표적으로 삼는 유전자를 의미한다. 그러므로, 표적 유전자는 그 발현 레벨이 mRNA 또는 폴리펩티드 레벨로 miRNA에 의해 하향 조절되는 핵산 서열을 포함한다. 유사하게, "표적 RNA" 또는 "표적 mRNA"란 용어는 miRNA가 결합하여 표적 유전자의 발현의 조절을 유도할 표적 유전자의 전사체를 의미한다

"전사 (transcription)"란 용어는 유전자의 암호 서열에 존재하는 구조 정보의 RNA로서 발현을 유도하는 유전자와 RNA 폴리머라제의 상호작용을 포함하는 세포 과정을 의미한다.

"조절자 (modulator)"란 용어는 폴리펩티드, 핵산, 거대 분자, 복합체, 분자, 소분자, 화합물, 종 등 (자연 발생적 또는 비자연 발생적), 또는 조절을 일으킬 수 있는 박테리아, 식물, 곰팡이, 또는 동물 세포 또는 조직과 같은 생물학적 물질로부터 만들어지는 추출물을 의미한다. 조절자는 분석에 포함되어 기능적 성질, 생물학적 활성 또는 과정의 억제제 또는 활성화제 (직접 또는 간접), 또는 그 조합물 (예컨대, 작동물질, 부분적 길항물질,부분적 작동물질, 역 작동물질, 길항물질, 항-미생물제, 미생물 감염 또는 증식의 억제제 등)로서의 잠재적인 활성에 대해 평가할 수 있다. 그러한 분석에서, 다수의 조절자는 한번에 구분될 수 있다. 조절자의 활성은 공지되었거나, 미지이거나 부분적으로 공지된 것일 수 있다.

조절자는 선택적 또는 비선택적일 수 있다. 본원에 사용된 "선택적"이란 용어는 조절자 (예컨대, 억제제)과 관련하여 사용할 때 조절자가 하나의 분자 (예컨대, 당해 표적 RNA) 대 또 다른 유사하나 동일하지 않은 분자 (예컨대, 당해 표적 RNA와 동일한 유전자군의 멤버로부터 유래된 RNA)와 상호작용하는 방식으로 측정 가능하거나 생물학적으로 관련된 차이를 의미한다.

"유효량"은, 이롭거나 바람직한 임상적 또는 생화학적 결과에 영향을 주는 적절한 양이다. 유효량은 한번 또는 그 이상 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 저해제 화합물의 유효량은 질병 상태의 진행을 일시적으로 완화, 개선, 안정화, 되돌림, 속도를 늦춤 또는 지연시키는데 적절한 양이다. 만약, 수혜동물이 조성물의 투여에 견딜 수 있거나, 조성물의 그 동물에의 투여가 적합한 경우라면, 조성물은 "약학적으로 또는 생리학적으로 허용 가능함"을 나타낸다. 투여된 양이 생리학적으로 중요한 경우에는 상기 제제는 "치료학적으로 유효량"으로 투여되었다고 말할 수 있다. 상기 제제의 존재가 수혜 환자의 생리학적으로 검출가능한 변화를 초래한 경우라면 상기 제제는 생리학적으로 의미가 있다.

"치료"는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감 (부분적이거나 전체적으로), 검출가능하거나 또는 검출되지 않거나의 여부를 포함한다. 또한, "치료"는 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존율과 비교하여 생존율을 늘이는 것을 의미할 수도 있다. 치료는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 "완화(Palliating)"하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.

"약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.

이하, 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.

우선, 본 발명은 SIRT7 유전자의 간암 마커로서의 용도에 기반한다. 구체적으로, SIRT7 유전자의 발현은 간암세포의 발생 및 증식활성, 암 전이의 활성, 또는 세포주기의 전이 활성에 대한 지표임을 특징으로 한다.

그러므로 본 발명은 SIRT7의 간암진단 마커로서의 용도 및 이의 발현수준을 측정하는 것을 포함하는 간암(간세포암) 진단 방법을 포함한다.

또한, 간암 관련 질환의 마커로서의 SIRT7의 기능에 기초하여 SIRT7 발현 또는 작용 억제제, 예를 들어 SIRT7 RNAi 또는 SIRT7 항체 등의 기능을 예측할 수 있고, 이에 의해 SIRT7 발현 또는 작용 억제제를 함유하는 간암에 대한 항암용도 포함한다.

< SIRT7 - miRNA 분자적 메커니즘>

한편, 본 발명자들은 간세포암(HCC, hepatocellular carcinomas) 조직에서 SIRT7가 상향-조절작용(up-regulating)을 나타내는, SIRT7의 간암 마커라는 신규 용도에 더하여, 간세포암에서의 SIRT7 발현 관련 그 내부 기작을 처음으로 규명하였다.

본 발명은 이러한 SIRT7 발현 관련 분자적 메커니즘을 포함한다.

- SIRT7 발현억제는 세포주기에 영향을 주어 G1/S 단계에 세포들을 유지시킴으로써 종양 성장을 억제한다.

- SIRT7 발현억제는 p21^WAF1 ^/ ^Cip1 의 유도 및 사이클린D1의 저해를 통해 세포 주기 조절 단백질을 탈조절(deregulating)시킨다.

- SIRT7 발현억제는 전-자가소화성(pro-autophagy) 요소 Beclin-1 및 LC3B-II 전환의 단백질 발현을 크게 유도한다.

상기와 같은 간암 조직에서 SIRT7 발현 조절 특징은 특정 miRNA에 의해 조절되고, 특히, 본 발명은 이러한 SIRT7 유전자의 발현을 조절할 수 있는 특정 miRNA 및 이의 용도에 관한 것이다.

miRNA(microRNA)는 21-25 뉴클레오티드(nt)의 단일 가닥 RNA 분자로써, 진핵생물의 유전자 발현을 제어하는 조절물질로서, miRNA는 두 단계의 프로세싱으로 이루어진다. 최초의 miRNA 전사체(primary miRNA)가 핵 안에서 Drosha라는 RNaseⅢ type 효소에 의해 70-90 nt 정도의 stem-loop 구조, 즉 pre-miRNA로 만들어지고, 이후 세포질로 이동하여 Dicer라는 효소에 의해 절단되어 21-25 nt의 mature miRNA로 만들어진다. 성숙(mature) miRNA는 더 긴 전사체로부터 가공되어 ~22개 뉴클레오티드 (nt)의 길이를 가진다. 1차-miRNA (pri-miRNA)는 독립 전사 단위로서 RNA Pol II에 의해 전사되거나 또는 숙주 유전자의 접속된 인트론으로부터 발생할 수 있다. 현재 300개가 넘는 인간 miRNA가 알려져 있지만, 어떤 할당된 생물학적 기능을 가진 것은 단지 몇 개밖에 안된다. 특정 miRNA의 연구는 발생 및 병리학에서 miRNA-매개의 조절의 유행 및 중요성을 이해하는 데 필요하다. 본 발명에서는 간암 형성 및 발달과 관계있는 SIRT7 유전자의 발현을 조절하는 특정 miRNA에 대한 역할을 최초로 제시한다. 본 발명의 일 실시예에서는 miRNA 발현 프로파일링 분석을 수행하여 인간 HCC 대상에서 비정상적으로 조절되는 miRNA를 확인하였다.

< miR -125a-5p와 miR -125b>

본 발명은 암화 유전자 SIRT7 유전자의 발현을 조절하는 특정 miRNA에 관한 것으로, 바람직하게는 miR-125a-5p, miR-125b, miR-148a 및 miR-152일 수 있고, 가장 바람직하게는 miR-125a-5p와 miR-125b이다.

본 발명에서의 miR-125a-5p와 miR-125b는 이들의 pri-miRNA, pre-miRNA, mature-miRNA 또는 기능적 등가물로부터 생성되는 약 17 내지 24개 뉴클레오티드의 핵산 분자를 포함한다.

상기 miRNA는 표적 mRNA에 상보적으로 결합하여 전사 후 유전자 억압자(post-transcriptional gene suppressor)로써 작용한다. 본 발명 miRNA, miR-125a-5p와 miR-125b는, SIRT7의 짧은 간섭 RNA (siRNA)와 대조될 수 있다. SIRT7 siRNA가 그랬던 것처럼, miR-125a-5p, miR-125b, miR-148a 및 miR-152는 내생성 SIRT7 발현을 억제할 수 있다.

본 발명의 microRNA miR-125a-5p와 miR-125b는 단백질로 번역되지 않는 3' 말단(3' untranslated region, 3'UTR)에 결합하여 mRNA의 안정성(stability)을 낮추거나 번역율(translation efficiency)을 낮추어 표적유전자 SIRT7의 발현을 억제한다.

구체적으로, 본 발명의 microRNA miR-125a-5p 및 miR-125b는 이하와 같은 기능을 가진다.

(1) miR -125a-5p 및 miR -125b는 세포주기의 G1 정지( arrest )를 유도한다.

특히, 본 발명의 miRNA는 세포 주기에 영향을 끼쳐 SIRT7 유전자 발현을 조절하고, 나아가 간암 세포의 성장을 조절한다.

'세포주기(cell cycle)'는 일정순서에 의하여 이루어지고 있고, 만약 이러한 순서가 뒤바뀐다면 세포주기의 유지는 어려워질 것이다. 이것을 바로잡고 순서를 잡아주는 것이 바로 Cyclin과 Cdk이다. 세포주기 G1기 초기에서는 세포의 종류에 따라서 Cdk4, 6, 8등이 활성화되어 작용하고 G1기 후기와 S기 초기에서는 Cdk2가 작용한다. G2에서 M으로의 진행에는 Cdk1 (Cdc2)의 작용이 필요하다. Cdk의 활성에는 Cyclin과의 결합이 필수적인데 Cdk4, 6, 8은 Cyclin D와의 결합에 의하여 활성화되며 Cdk2는 Cyclin A 및 E와 결합한다. Cdk1은 Cyclin B 및 A와 결합한다. 이외에도 Cyclin G, F 등이 알려져 있지만 세포주기 진행에 있어서의 역할은 아직 불분명하다. 세포주기의 각 시기에 특이적인 Cyclin-Cdk 복합체가 활성화되고 각각의 Cdk에 특이적으로 인산화되는 단백질들이 세포주기의 진행을 담당하게 되므로 세포주기를 Cdk 주기로 명명할 수도 있다. Cdk는 Cyclin활성에 필수적이다. 활성화된 Cdk-Cyclin은 Cyclin의 조절단위와 Cdk의 활성단위로 나뉘어 져있는 것이다. Cyclin의 Cdk조절방법은 두 가지로 볼 수 있는데 첫 번째가 Cyclin과 Cdk가 결합하여 단백질의 구조변화를 유도하여 ATP phosphate group의 배치가 substrate 단백질에 전달하기 쉽게 변한다. 또한 단백질 substrate가 Cdk에 접근할 수 없도록 막고 있는 T loop의 위치가 변하여 substrate의 접근이 용이해진다. Cdk의 활성이 세포주기의 특정 시기에만 활성화되는 것은 세포주기 특이적으로 일어나는 Cyclin에 합성 때문이다.

상기 Cyclin D는 주로 G1 중기에 합성이 최고조에 달하며 주로 세포성장인자 등의 mitogen에 의하여 유도된다. Cyclin D는 세 종류의 subtype (D1, 2, 3)이 있는데 세포의 종류에 따라서 발현되는 정도가 다르다. Cyclin D의 합성을 저해하면 세포주기 G1 정지가 일어나고 Cyclin D를 과발현하면 G1기가 짧아지고 mitogen 없이도 세포주기가 시작된다.

그 중에서도, 본 발명은 G1 정지(arrest)에 관여하는 p21^WAF1 ^/ ^Cip1의 유도 및 cyclin D1 단백질 저해 효과와 관련되어 있다. 관련 구체적인 기작은 이하와 같다.

(2) p53 의 활성에 의해 miR -125a-5p 및 miR -125b 의 발현이 증가하여 종양 성장을 억제한다.

p53은 약 53KDa의 인산화단백질로서 17번 염색체의 17q13에 위치한 11개 엑손(exon)에 의해 암호화되며 p63, p73과 더불어 잘 보존된 유전자군에 속한다. p53은 세포 내 DNA를 손상시키는 신호에 반응하여 다양한 하위 유전자의 발현을 조절함으로써 세포주기를 조절하고, 세포사멸을 유도함으로써 세포가 악성형질로 전환되지 않도록 보호한다.

정상세포의 경우 p53 단백질은 합성되자마자 HDM2(human double minute 2)에 결합하여 빠르게 분해되므로 매우 낮은 수준으로 존재한다. 그러나 세포에 DNA 손상이 가해지면 p53이 안정화되어 핵에서 p53이 축적되며 사량체를 형성하여 여러 유전자의 프로모터 상에 존재하는 5-PuPuPuC(A/T)(T/A)GPyPyPy-3'의 잘 보존된 염기서열을 지닌 p53 결합부위에 결합한다. DNA에 결합한 p53은 주로 세포주기 조절,DNA 손상회복, 세포사멸 조절에 관련된 여러 유전자의 전사를 활성화시키며, 타겟 유전자 발현을 억제하기도 한다.

정상세포의 세포 주기에서 G1/S 전환은 pRb-E2F 시스템에 의해 조절된다. 초기 G1 시기 동안 pRb는 p130, p107과 더불어 E2F 단백질에 결합함으로써 E2F의 전사활성을 억제하고 있다. 그러나 G1 말기에 이르면 pRb는 사이클린-CDK(cyclin-dependent kinase) 복합체에 의해 인산화되어 E2F가 pRb로부터 방출되며, 이렇게 활성화된 E2F는 S시기 동안 DNA 합성에 관여하는 여러 유전자의 발현을 활성화시킴으로써 세포주기를 G1에서 S시기로 진행시킨다.

세포에 DNA 손상이 가해지면 p53의 발현이 급격히 증가하며 그 결과 p53의 하위 타겟 유전자 중 하나인 p21^WAF1 ^/ ^CIP1의 발현이 유도된다. p21은 사이클린-CDK 복합체의 활성을 억제하여 pRb의 인산화를 억제하기 때문에 E2F는 불활성화된 상태로 계속 pRb에 결합되어있다. 따라서 세포주기는 G1시기에서 정지하게 된다. p21은 또한 DNA 중합효소 δ 및 ε의 보조인자로 작용하는 PCNA(proliferating cell nuclear antigen)의 활성을 억제하여 DNA 복제를 방해한다.

본 발명의 miR-125a-5p 및 miR-125b는 이러한 p53의 활성에 의해 그 발현이 증가되고, p21^WAF1 ^/ ^CIP1의 발현을 유도시킴으로써 세포주기를 G1에 정지시키고, DNA 복제를 방해하여 간암 세포의 성장 또한 억제한다.

(3) miR -125a-5p 및 miR -125b는 프로모터의 메틸화에 의해 발현이 감소된다 .

본 발명의 microRNA의 발현은 후성학적(epigenetic) 요소에 의해서도 조절되는데, 히스톤 변경(histone modification)보다는 DNA의 메틸화에 의해서 조절된다.

DNA의 메틸화(methylation)는 종양에서 발견되는 가장 흔한 유전자 변화 중 하나로서, 염기서열이 주로 사이토신과 구아닌으로 이루어진 CpG island에 잘 발생하며, 메틸기가 메틸전이효소에 의해 5사이토신에 붙음으로써 이루어진다.

이러한 DNA 메틸화은 프로모터 부위에서 유전자의 전사(transcription)를 억제하는 기능을 한다. 전사된 유전자는 mRNA의 안정성(stability)과 번역(translation)을 통한 전사후조절을 받는다.

즉, 본 발명의 miR-125a-5p 및 miR-125b는 프로모터 부위에서 과메틸화(methylation)에 의해 발현이 감소되므로, 상기 메틸화를 저해함으로써 miR-125a-5p 및 miR-125b의 발현을 촉진시킬 수 있다.

한편, 본 발명은 상기 miRNA miR-125a-5p 및 miR-125b가 SIRT7 유전자 발현 및 간암 세포의 성장을 조절하는 전사 회로에 참여하는 상기 분자 메커니즘 또한 제공한다.

또한, 이와 같은 분자적 메커니즘을 통해서, 본 발명의 miR-125a-5p 및 miR-125b이 간암형성에 있어 SIRT7에 대한 조절자임을 알 수 있고, 그러므로, miR-125a-5p 및 miR-125b 모두 내생성 SIRT7의 직접적 억제자이고 간암형성에서 종양 억제자로서 기능할 수 있음을 시사한다.

암의 발생에서 microRNA의 역할은 microRNA의 표적유전자에 따라서 결정되어지는데, 본 발명은 표적 유전자를 암을 유발하는 유전자(oncogene) SIRT7로 하는 종양억제 microRNA (tumor-suppressing microRNA)에 관한 것이다.

<진단 용도>

그러므로, 본 발명은 일 관점에서, SIRT7를 발현하는 암 발생 또는 예후의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 miR-125a-5p 또는 miR-125b 발현 프로파일링을 확인하는 방법에 관한 것이다.

즉, SIRT7를 발현과 miR-125a-5p 또는 miR-125b이 관련있다는 최초의 발견에 기초하여, miR-125a-5p 또는 miR-125b 발현 프로파일링을 검토함으로써 SIRT7를 발현하는 암, 예를 들어 간암에 대한 발생 또는 예후를 예측할 수 있다.

"SIRT7를 발현하는 암"은 SIRT7 유전자가 발현되는 암이라면 종류에 한정되지 않으나, 가장 바람직하게는 간암이다. 상기 간암은 원발성 간암 또는 전이성 간암을 모두 포함하는데, 원발성 간암으로는 간세포암, 담관(담도)세포암을 들 수 있다. 담관세포암은 담즙이 내려오는 통로인 담도에 생기는 암이고, 간세포암은 간경변과 같은 만성 간질환 환자에서 발생하는 간암으로서, 일반적으로 흔히 말하는 간암이 바로 간세포암이고, 간암 중에서 가장 많은 부분을 차지하고 있다. 또한, 이들의 암성 종양, 및 이들의 일차 종양일 수 있다.

miR-125a-5p 또는 miR-125b 발현 프로파일링을 통해 간암 발생 또는 진행을 모니터할 수 있다. 비교는 샘플에 존재하는 miRNA의 수 또는 양, 또는 그의 임의의 조합일 수 있다. 하향조절된 miRNA의 양을 확인함으로써 SIRT7를 과발현 정도를 알 수 있고, 이를 통해 간암의 발생 또는 예후를 예측할 수 있다.

그리고, 본 발명은 상기 간암 진단을 위해 수행할 수 있는 어떠한 분석 방법들과 키트 등의 장치를 포함한다.

<항암 용도>

또한, 본 발명은 다른 관점에서, miR-125a-5p 및 miR-125b 발현 또는 작용 촉진을 통해 SIRT7의 발현을 억제시킴으로써, SIRT7를 발현하는 암에 대한 항암적 용도에 관한 것이다.

일 구체예로서, SIRT7를 발현하는 암세포를 MiR-125a-5p 및/또는 MiR-125b; 또는 그들의 유사체로 형질감염시켜 이들이 SIRT7 mRNA의 3'-UTR과 결합하도록 하여, SIRT7 발현을 감소시킴으로써, 간암 등을 치료하는 방법을 제공한다.

"형질감염 또는 트랜스펙션"은 바이러스 벡터 또는 기타 전달 수단을 이용하여 외부물질을 진핵 세포 내로 도입하는 것을 의미한다. 동물 세포의 형질감염은 전형적으로 세포 원형질막 내 일시적인 구명 또는 "홀"을 개방하여 물질이 흡수되도록 하는 것을 수반한다. 유전자 물질 또는 항체와 같은 단백질을 형질감염시킬 수 있다. 전기천공법 외에, 양이온성 지질을 상기 물질과 혼합하여, 세포 원형질막과 융합하고 내부에 카르고를 침적하는 리포솜을 생산함으로써 형질감염을 수행할 수 있다.

일 예로, 인산 칼슘을 이용할 수 있다. 인산 이온을 함유하는 HEPES-완충 식염수(HeBS)를 형질감염될 물질을 함유하는 염화칼슘 용액과 혼합한다. 두 가지가 혼합되면, 양으로 대전된 칼슘과 음으로 대전된 인산염의 미세 침전이 형성되어 형질감염될 물질을 그 표면에 결합시킨다. 다음, 침전물의 현탁액을 형질감염될 세포에 첨가한다. 상기 세포는 침전물 일부와 함께 형질감염될 물질을 흡수한다. 다른 예로, 고도 분기된 유기 화합물(예를 들어, 덴드리머)을 이용하여 본 발명의 유전자 물질(miRNA)과 결합시키고 이를 세포 내로 들어가도록 한다. 다른 방법은 리포솜, 즉, 어떤 점에서는 세포의 구조와 유사하고 세포막과 실제로 융합할 수 있는 작은 막-결합체 내에 형질감염될 유전자 물질의 혼입, 세포 내로 유전자 물질을 배출시키는 것을 포함한다. 진핵세포의 경우, 지질-양이온에 근거한 형질감염이 보다 전형적으로 사용되는데, 이는 세포가 보다 민감성이기 때문이다. 또 다른 예로, DEAE-덱스트란 또는 폴리에틸렌이민과 같은 양이온성 폴리머를 [0040] 사용한다. 음으로 대전된 유전자 물질은 다양이온(polycation)에 결합하고, 그 복합체는 내표작용(endocytosis)을 통하여 세포에 의하여 흡수된다.

형질감염에 대한 직접적인 접근은 유전자 물질이 불활성 고체 (통상적으로 금) 나노입자와 커플링된 다음 표적세포의 핵 내로 직접적으로 "샷"되는 유전자 총(gene gun)이다. 유전자 물질은 또한 바이러스를 매개체로 이용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 이러한 경우, 그 기법은 바이러스 형질도입(transduction)으로 불리우며, 세포는 형질도입되는 것으로 말하여진다. 형질감염의 다른 방법은 뉴클레오펙션(nucleofection), 전기천공법(electroporation), 열충격(heat shock), 마그네토펙션(magnetofection) 및 Lipofectamine, Dojindo Hilymax,Fugene, jetPEI, Effectene 또는 DreamFect과 같은 등록상표의 형질감염 시약을 포함한다

형질감염된 세포 내에서, miRNA의 결합을 통한 이중 가닥 RNA의 형성은 RNA 간섭 (RNAi)과 유사한 과정을 통하여 mRNA 전사체의 분해를 유발하면서 단백질 번역 시스템을 블록킹하거나, 또는 mRNA의 분해를 야기하지 않으면서 단백질 번역을 억제함으로써, 궁극적으로 표적 유전자 SIRT7이 발현을 저해한다.

또한, 본 발명의 항암적 용도의 다른 구체예로서, MiR-125a-5p 또는 MiR-125b 발현 또는 활성 촉진제를 유효성분으로 포함하는, SIRT7를 발현하는 암에 대한 항암용 조성물을 제공할 수 있다.

"촉진제"는 목적 유전자의 발현 또는 활성을 촉진, 강화 또는 증가시키는 물질을 의미한다. 촉진제의 활성 메커니즘은 특별히 제한되지 않는다. 예로서는 유기 또는 무기 화합물, 단백질, 탄수화물, 지질과 같은 폴리머 화합물, 다양한 화합물의 컴포지트(composite)를 포함한다. 예를 들어, 'MiR-125a-5p 또는 MiR-125b' 촉진제'는 이들 miRNA의 발현 또는 활성을 촉진, 강화 또는 증가시키는 물질을 포함할 수 있다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 화학적으로 또는 생화학적으로 개질 될 수 있거나, 조성물로 제형화되어 표적 세포에 임의의 다수 수단으로 투여되거나 발현 구조체를 통해 투여될 수 있다.

일부 구현예에서, miRNA 분자 또는 miRNA 전구체 분자는 핵산 벡터 (일반적으로 재조합 벡터 또는 발현 벡터로 언급되기도 함) 내로 삽입된 전사 단위로부터 발현된다. 벡터를 사용하여 miRNA를 암호화하는 핵산 분자를 세포 내로 전달하여 특이 유전자를 표적화할 수 있다. 재조합 벡터의 예로는 DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 들 수 있다. 다양한 발현 벡터가 당해 분야에 공지되어 있다. 적합한 발현 벡터의 선택은 발현을 의도하는 세포 유형을 비롯하여 (이에 국한되는 것은 아님) 여러 인자에 근거하여 이루어질 수 있다.

이 외에도, 적합한 다수의 방법이 본 기술분야에서 공지되어 있다. 일반적으로, 표적 유전자를 발현하는 세포에 형질감염시키는데,형질감염을 위해서는 예를 들어, 일렉트로포레이션 (electroporation), 형질감염을 위한 헬퍼로서 양이온성 리피드 또는 양이온성 폴리머의 사용과 같은 다양한 방법이 사용될 수 있다. 그 후, 세포를 표적 유전자의 발현을 가능하게 하는 적합한 조건 하에서 배양한다. 이어서 표적 유전자의 발현을 예를 들어, RT-PCR 또는 리포터 유전자의 양의 측정과 같은 적합한 기술을 사용하여 측정한다. 기본적으로, 어떤 종류의 세포라도 형질감염전환을 위해서 사용될 수 있지만, 바람직한 구체예에서 세포는 진핵세포, 바람직하게는 동물 세포, 더욱 바람직하게는 포유동물 세포, 가장 바람직하게는 인간 세포이다.

본 발명에 따른 조성물은 SIRT7 발현이 하향 조절되도록 치료적 유효량의 MiR-125a-5p 및/또는 MiR-125b; 또는 이들의 미믹(mimics, 유사체)를 포함하여야 한다. 치료적 유효량은 공지의 투여 경로에 의하여 제공될 수 있다. 본 발명에 따른 구현예는 MiR-125a-5p 및/또는 MiR-125b; 또는 이들의 미믹을 SIRT7을 발현하는 간세포 내로 형질감염시킬 수 있도록 적용된다. 본 발명의 조성물은 이에 제한되지 않으나 유전자 물질을 표적 세포 내로 형질감염시키기 위한 상기한 수단들 중 임의의 것을 포함 또는 이용할 수 있다. 바람직하게는 상기 조성물은 양이온성 지질을 포함할 수 있고, 상기 miRNA 및 이들의 유사체가 SIRT7을 발현하는 세포 내로 방출될 수 있도록 양이온성 양친매성 물질을 추가로 포함할 수도 있다.

그리고, 본 발명의 핵산 분자 및 촉진제는 통상적인 약학 합성 기법에 따라 제조되는 항암용 약학 조성물로 제형화 될 수도 있다.

조성물은 활성 제제 또는 활성 제제의 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다. 상기 조성물은 동시적, 또는 연속적으로 투여될 수 있다. 이들 조성물은 하나의 활성 물질 이외에, 당업계에 잘 알려진 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 버퍼, 안정화제 또는 다른 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질들은 비독성이어야 하며 활성 성분의 효능을 방해해서는 안된다. 담체는 투여를 위해 바람직한 제제 형태, 예를 들어, 국소형, 정맥내, 경구, 뇌막, 신경상막 또는 비경구인지에 따라 다양한 형태를 취할 수 있다. 일반적으로 충진제, 확장제, 결합제, 습윤제(wetting agent), 붕해제(disintegrating agent), 계면 활성제와 같은 희석제, 부형제와 혼합함으로써 경구 또는 비경구 투여용으로 제조할 수 있다. 투여에 효과적인 투여량 및 계획은 경험적으로 결정할 수 있고, 당업자가 쉽게 결정할 수 있다. 단일 또는 다중 투여량을 사용할 수 있다.

나아가, 추가의 요법을 본 발명의 방법에 사용할 수 있음이 고려된다. 하나 이상의 다른 요법제는 당업계에 공지되고 특히 상기에서 추가로 정의된 방사선요법,수술요법, 면역요법, 사이토킨(들), 성장억제제(들), 화학요법제(들), 세포독성제(들), 티로신 키나제 억제제, ras파르네실 트랜스퍼라제 억제제, 혈관 형성 억제제, 및 사이클린 의존성 키나제 억제제를 포함할 수 있고, 이로 제한되지 않는다. 그 중에서 화학요법 약물은 알킬화제, 항대사화제, 식물 알칼로이드, 토포아이소머라아제 저해제, 및 항종양제로 나눌 수 있다. 이 모든 약물은 세포 분열 또는 DNA 합성 및 일부 경로에서의 기능에 영향을 준다. 일부 제제는 티로신 키나아제 억제제(Gleevec　)와 같이 DNA에 직접적으로 간섭하지 않는다.

본 발명의 용도는 SIRT7의 발현과 관련하는 MiR-125a-5p 또는 MiR-125b의 상향 조절 또는 하향 조절에 대한 유전적 접근까지 확장한다.

유사한 관점에서, 본 발명은 MiR-125a-5p 및/또는 MiR-125b을 이용하여 간암과 관련된 SIRT7 유전자의 발현을 조절하는 방법에 관한 것으로, 일 구현예에서, 상기 방법은 상기 miRNA 또는 SIRT7 유전자를 표적으로 하는 miRNA를 암호화하는 벡터와 접촉시키는 단계를 포함한다. SIRT7 유전자를 표적화함으로써 SIRT7 기능 또는 활성을 조작할 수 있게 된다.

상기 MiR-125a-5p 또는 MiR-125b는 SIRT7 유전자의 3-UTR 영역과의 직접적 상호작용을 통해 SIRT7 발현을 조절한다.

즉, SIRT7 RNA의 번역(translation)을 억제하거나 파괴시켜 전사후 조절(post-transciptional gene silencing)에 관여함으로써 표적 mRNA의 발현을 조절하므로 이들의 활성을 강화시킴으로써 SIRT7 발현을 억제시킬 수 있고, 이를 통해 간암 세포의 성장을 저해시킬 수 있다.

<스크리닝>

한편, 다른 관점에서 본 발명은 앞서 설명한 사실을 기반으로 하여, SIRT7의 발현을 억제시키는 간암 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다.

상기 방법은 일 구체예로,

MiR-125a-5p 또는 MiR-125b을 발현하는 동물세포로서는, 예를 들면 간세포암 세포(HCC 세포), 간암세포, 또는 인위적으로 제조한 암세포 등을 들 수 있고, 바람직하게는 인간 간세포암 세포(HCC 세포)이다. 배양은 당업자의 통상적인 지식에 따라서 선택할 수 있는 배지 및 배양 조건에서 배양한다.

본 방법에서, MiR-125a-5p 또는 MiR-125b의 발현을 측정하는 것은 이들과 관련된 RNA, DNA, 단백질 등 그 바이오마커 대상의 형태를 제한하지 않는다.

샘플에서 다양한 바이오마커의 발현은 면역조직화학적 및/또는 웨스턴 분석, 정량적 혈액기반 분석 (예를 들어 혈청 ELISA) (예를 들어 단백질 발현 수준을 조사하기 위해), 생화학적 효소 활성 분석, mRNA의 계내 혼성화, 노던 블럿 분석 및/또는 PCR 분석, 및 게놈 웨스턴 블럿 분석 (예를 들어 유전자 결실 또는 증폭을 조사하기 위해), 및 유전자 및/또는 조직 어레이 분석에 의해 수행될 수 있는 매우 다양한 분석 중의 임의의 하나를 포함하여 이로 제한되지 않는 많은 방법에 의해 분석할 수 있고, 상기 방법 중 많은 방법은 당업계에 공지되고 당업자에게 이해되고 있다.

예를 들어, 상기 방법은 조직 또는 세포 샘플에서 mRNA 발현을 조사하는 프로토콜을 포함할 수 있다. 세포 내의 mRNA의 평가 방법은 공지되어 있고, 예를 들어, 상보성 DNA 프로브를 사용하는 혼성화 분석 및 다양한 핵산 증폭 분석 (예를 들어 상보성 프라이머를 사용하는 RT-PCR 등)을 포함한다. 또한, 상기 방법은 마이크로어레이 기술에 의해 조직 또는 세포 샘플에서 mRNA를 조사 또는 검출하는 프로토콜을 포함할 수 있다. 마이크로어레이 기술은 단일 실험 내에서 수천개의 유전자의 mRNA 발현 프로필을 평가하기 위해서 핵산 혼성화 기술 및 컴퓨터 기술을 이용한다

이와 같이, 본 발명은 간암 마커 SIRT7의 발현을 제어하는 miR-125a-5p 및 miR-125b에 관한 것으로, 특히, 상기 miRNA의 간암 진단 및 치료용 타겟으로의 용도에 관한 것으로, 간암의 발생 및 증식활성, 암 전이의 활성, 또는 세포주기의 전이 활성 예측에 대한 정보를 제공받을 수 있는 주요한 분석 대상으로 활용할 수 있을 것이다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

각 분석들 결과는 평균±표준편차 값으로 계산하여 분석하거나, unpaired two tailed Student t test [Prism 4.00 (GraphPad Software)]를 이용하였다. P< 0.05은 통계학적으로 유의미한 것으로 간주하였다.

재료 및 방법

1. 세포 배양, 약물 처리 및 플라스미드

35 HCC 조직 및 27 비-암성 간조직을 연세대 의과 대학으로부터 수득하고, 모든 대상들로부터 동의서를 받고, 가톨릭 의과 대학 IRB(Institutional Review of Board) 승인 하 실험을 수행하였다(IRB 승인 넘버; CUMC09U111)

인간 간세포 암종 세포주(SNU-182, -354, -368, -387, -423, -449 및 -475)를 KCLB (Korean Cell Line Bank, Seoul, South Korea)로부터 구입하고, Hep3B, HepG2 PLC/PRF/5 및 정상 간세포 THLE-3를 ATCC (Manassas, VA, USA)로부터 구입하였다. 각 세포주들을, 10% FBS(fetal bovine serum; Sigma, St Louis, MO) 및, 각각 100 units/ml의 페니실린과 스트렙토마이신이 보충되어 있는 RPMI1640 배지에서 성장시켰다. 배양은 5% CO₂, 37℃ 하 습한 인큐베이터에서 이루어졌다.

유사분열 단계에서, 노코다졸 처리(100 ng/ml for 18 hours; Sigma)에 의해 전-중기에 Hep3B 및 SNU-449 세포들을 축적시켰다.

pME18S-HDAC1 및 pME18S-HDAC2 플라스미드를 Dr. Edward Seto (H. Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute)로부터 받았다. 와일드 타입 및 우성 음성(dominant negative)(R248W) p53 발현 플라스미드로 pCMVneo-bam wt-p53 (인간 와일드 타입 p53 코딩) 및 pCMV-Neo-Bam mt-p53를 사용하였다. HDAC6 및 SIRT1의 전체 길이 cDNA를 pcDNA3.1/His 및 pcDNA3.1/Myc-His에 각각 삽입하였다.

2. 루시퍼라제 리포터 분석

psiCHECK-2 벡터(Promega, Madison, WI, USA)를 SIRT7 mRNA의 3′ UTR에 클로닝에 사용하였다. 상기 벡터는 SV40 프로모터-유래 Renilla 루시퍼라제 유전자의 정지 코돈의 다중 클로닝 영역 다운스트림을 포함한다. Renilla 루시퍼라제 활성으로 전사 안정성 및 번역 효율성 상의 3′ UTR의 효과를 평가하였다. psiCHECK-2 벡터 역시 구성적으로 발현하는 개똥벌레 루시퍼라제 유전자를 포함한다. 개똥벌레 루시퍼라제를 사용하여 트랜스펙션을 표준화하였다.

SIRT7 리포터 벡터의 부위-특이적 변이를 위해 사용한 프라이머 서열을 이하 에 기재하였다

SIRT7-3UTR-F CCGCTCGAGCGGTCACGTGCTCGATGAAGAACAG

SIRT7-3UTR-R ATTTGCGGCCGCTTTAGCCAGTGCAGAAACGTTTAATAG

SIRT7-3UTR-125 mt-F CGCTCACCAGGCCAGTGAGTGCGCCTCACCGTATTTC

SIRT7-3UTR-125 mt-R GAAATACGGTGAGGCGCACTCACTGGCCTGGTGAGCG

SIRT7-3UTR-148 mt-F CCTTGAGGAAGCCCCTTCGTGTGCTGCGGTTGTACCC

SIRT7-3UTR-148 mt-R GGGTACAACCGCAGCACACGAAGGGGCTTCCTCAAGG

SIRT7-3UTR-193 mt-F CCTTTCCTCGCTCACCAGCGGTGTCTCAGGGCCTCACCG

SIRT7-3UTR-193 mt-R CGGTGAGGCCCTGAGACACCGCTGGTGAGCGAGGAAAGG

트랜스펙션 24시간 전에, Hep3B 세포들을 12-웰 플레이트의 웰에 씨딩하고, 각 웰에 250 ng 3′ UTR 루시퍼라제 리포터 벡터 및 200 nM miRNA 미믹들의 혼합물을 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 24시간 후에, 세포들을 용해하고 Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega)에 의해 luminometer (Victor3, PerkinElmer Inc., Foster City, CA, USA) 상에서 루시퍼라제 활성을 측정하였다.

개똥벌레 루시퍼라제에 대한 Renilla 루시퍼라제의 비율을 각 웰에 대해 계산하였다.

3.작은-간섭 RNA ( siRNA )에 의한 SIRT7 ( Sirtuin7 ) 유전자 사일런싱

SIRT7-특이적 siRNA를 고안하였고 Silencer　 Pre-designed siRNAs (www.ambion.com)를 통해 구입하여 Hep3B, SNU-368 및 SNU-449 세포에 SIRT7 유전자를 타겟으로 하는 siRNA로 트랜스펙션하였다.

상기 siRNA 서열은 이하와 같다.

si-SIRT7-sense ACGGGAACAUGUACAUUGAtt

si-SIRT7-anti sense UCAAUGUACAUGUUCCCGUgg

si-Cont-sense CCUACGCCACCAAUUUCGUtt

si-Cont-anti sense ACGAAAUUGGUGGCGUAGGtt

4. RNA 분리 및 RT PCR 분석

성숙 miRNA의 RT PCR 분석을 위해, 각 세포주의 전체 RNA를 트리졸 시약(Invitrogen)을 사용하여 분리하였다. Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems)을 이용하여, 0.1 Fg 전체 RNA 양을 cDNA로 역전사시켰다. Bio-Rad iQ5 real-time PCR 시스템 상에서 Qarta PCR Master Mix (qARTA Bio., Fremont, CA, USA)을 이용하여 비교 RT PCR을 트리플케이트에서 수행하였다. RT PCR을 위해 성숙 miRNA 미믹 및 성숙 miRNA-특이적 프라이머 서열을 이하에 기재하였다.

성숙 miRNA

hsa-miR-125a-5p (MIMAT0000443) UCCUGAGACCCUUUAACCUGUGA

hsa-miR-125b (MIMAT0000423) UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA

hsa-miR-148a (MIMAT0000243) UCAGUGCACUACAGAACUUUGU

hsa-miR-152 (MIMAT0000438) UCAGUGCAUGACAGAACUUGG

hsa-miR-193a-3p (MIMAT0000459) AACUGGCCUACAAAGUCCCAGU

Primer ( real time PCR )

U6 snRNA-RT GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAAATATGG

hsa-miR-125a-5p-RT GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCACAG

hsa-miR-125b-RT GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCACAA

hsa-miR-148a-RT GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAAAG

hsa-miR-152-RT GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCAAGT

hsa-miR-193a-3p-RT GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACTGGG

U6 snRNA-F GGCTGCCGAAGGATGACACGC

hsa-miR-125a-5p-F TCCTGAGACCCTTTAACCTGTGA

hsa-miR-125b-F TCCCTGAGACCCTAACTTGTGA

hsa-miR-148a-F TCAGTGCACTACAGAACTTTGT

hsa-miR-152-F TCAGTGCATGACAGAACTTGG

hsa-miR-193a-3p-F AACTGGCCTACAAAGTCCCAGT

Universal-R GTGCAGGGTCCGAGGT

Primer ( MSP )

miR-125b-U-F GGGAAAATGAGAGTTTTTAGTGTGT

miR-125b-U-R CAATCTCAAAATTTAATATATCACT

miR-125b-M-F GAAAATGAGAGTTTTTAGTGCGT

miR-125b-M-R CAATCTCGAAATTTAATATATCGCT

U6 snRNA 프라이머로 표준화(Normalization)를 수행하고, 성숙 miRNA 수준의 상대적 양을 x=2^-Δ ^Ct ^,로서 계산하였고, 이때 ΔC=Ct _Target _miRNA - Ct_U6 이다.

5. 전체 게놈 발현의 마이크로어레이 분석

각 실험 조건들을 위해, 전체 RNA를 상응하는 세포주의 독립적인 3개의 세트로부터 TRIzol 시약(Invitrogen)을 이용하여 추출하고 Ambion columns (Illumina Total-Prep RNA Amplification Kit, Ambion)상에서 클린-업하였다. 그 후, 각 독립적인 3개의 RNA 추출물로부터 동량의 전체 RNA를 혼합함으로써 RNA 풀을 수득하였다.

비오틴 표지된 cDNA 타겟들을 1.5 μg 전체 RNA로부터 합성하였다. 2중 가닥 cDNA 합성을 Illumina　 TotalPrep RNA Amplification Kit (Ambion)를 이용하여 수행하고, 비오틴-UTP-표지된 안티센스 RNA를 Ambions Kit를 이용하여 in vitro에서 전사하였다. 라벨링 프로토콜의 모든 스텝들을 Ambion (http://www.ambion.com/techlib/prot/fm_IL1791.pdf)에 설명되어 있는대로 수행하였다.

타겟들의 크기 및 정량의 정확도를, cRNA 정제 전후에 Experion (Biorad Laboratories., Hercules, CA) 전기영동 시스템에 의해 체크하였다. 정제 후, 타겟들을 240 ng/Fl 농도에서 혼성화 버퍼에 희석하고, 혼성화를 20시간 동안 58℃에서 수행하였다.

마이크로어레이 분석을 위해, Illumina HumanHT-12 v4 Sentrix Expression BeadChip(Illumina, San Diego, CA)을 사용하였다. BeadChip에서 표지된 cRNA의 혼성화, 세척 및 스캔을, Illumina BeadStation 500× 매뉴얼에 따라 수행하였다. 어레이 신호를 스트렙타비딘-Cy3으로 10-분 인큐베이션을 통해 발달시켰다. HumanHT-12 v4 Sentrix Expression BeadChip을 세척하고 이어서 4분동안 275 x g에서 원심분리하여 건조시켰다.상기 어레이들을 532 (Cy3) nm 레이저 일루미네이션으로 Illumina BeadArray reader, 공초점-타입 이미지 시스템 상에서 스캔하였다.

각 샘플로부터 데이터들을 default parameter를 사용하여 Genome Studio software (Illumina)로 추출하고 GenePix　 Pro 5.1 software (Axon Instruments., Union, CA)를 이용하여 분석하였다. GEO 데이터베이스 (GSE33234)에서 일차 마이크로어레이 데이터들을 이용하였다.

6. HCCs 의 Differential MicroRNA 발현 프로파일링 분석

8 정상 간 및 16 HCC 조직들의 miRNA 발현 프로파일링을, 공공 데이터베이스, miRBase v16로부터 선택된 1,371 miRNA 서열을 포함하는 GenoExplorer Microarray Platform (GenoSensor Corp., Tempe, AZ)을 이용하여 수행하였다.

10 μg의 전체 RNA를 정상 간 및 HCC 티슈로부터 분리하고, 라벨링하고 적합한 조건 하 분석을 위해 microRNA chip에 혼성화시켰다. 타겟들을 혼성화시킨 어레이들을 Axon scanner을 이용하여 스캔하고, 스캔한 이미지들을 GenePix　 Pro 5.0 software (Axon Instruments)을 이용하여 분석하고 visual inspection에 의해 결정되는 약한 스팟들을 추가의 분석으로부터 제거하였다. 각 어레이로부터 수집된 결과 데이터들, 각 프로브에 대한 3 평균 형광 신호 강도들의 평균을 GenePlex 3.0 (Istech Inc. Seoul, Korea) 데이터베이스에 제출하였다.

변위치 표준화(quantile normalization) 및 클래스-특이적 필터링의 방법을 이용하여 데이터들을 표준화시키고, 510 miRNA를 계층 클러스터링에 사용하였다. 클러스터 및 TreeView 프로그램(Stanford Univ.)을 이용하여 Pearson's 상관계수를 계산하였다

7. 세포 생존능에 대한 MTT 분석

Hep3B, SNU-368 및 SNU-449 세포들을 12-웰 플레이트에 5000 cells/well 밀도로 씨딩하고 24시간 동안 배양한 후, siRNAs로 트랜스펙션하였다.

세포 증식능을 MTT[methylthiazolyl blue tetrazolium bromide, (3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenytetrazolium, Calbiochem)]를 이용하여 비색분석(colorimetric dye assay)하였다. 각 시점에서, 각 세포들을 37℃에서 3시간 동안 MTT 염색시약 (5 mg/ml in 1 ml of RPMI1640)과 함께 배양하였다.

각 웰에서 500 Fl DMSO를 첨가하여 포마잔 결정들을 용해하였고, 흡광도를 570 nm에서 VICTOR3™ Multilabel Plate Readers (PerkinElmer Inc.,Foster City, CA, USA)에 의해 측정하였다. 모든 값은 트리플케이트에서 수행하였고, 각 실험은 적어도 3회 반복하였다.

8. 웨스턴 블럿 분석

전체-세포 추출물을, 프로테아제 억제제를 함유하는 RIPA(radio-immunoprecipitation) 용해 버퍼로 준비하고, 단백질 농도를 BCA 단백질 분석 키트에 의해 결정하였다. 10 μg 단백질을 함유하는 RIPA 용해물(lysates)을 SDS-PAGE에 의해 분리하고, PVDF(polyvinylidene difluoride) 멤브레인 상에 옮겼다.

세포주, 위암 및 상응하는 정상 조직으로부터 준비한 용해물을 다음 항체들을 이용하여 웨스턴 블럿 분석하였다: 항-HDAC2, -HDAC6, -SIRT1, -p53, -acetyl-p53, -CDK4, -GAPDH, -p16, -알파 튜블린, 및 아세틸-알파 튜블린(Santa Cruz Biotechnology Inc., CA), 항-p15, -p18, -p21, p27, -cyclin D1/D3/A/B1/E, -cdc2, -Beclin1, -LC3B, 및 -HDAC1 (Cell Signaling Technology Inc, Danvers, MA).

결합된 항체를 검출하기 위해, ECL plus Western blotting detection system (Amersham biosciences)을 사용하였다. 웨스턴 블럿 밴드의 강도를 LAS 3000 (Fuji Photo Film Co., Japan)를 이용하여 정량화하였다.

9. 아세포 분획물 ( Subcellular Fractionation ) 및 SIRT7 효소 분석

세포질 및 핵 분획물로의 Hep3B 세포 분별은 핵/세포질 분별 키트(BioVision)를 이용하여 수행되었다.

핵 분획물로부터 면역침전된 Sirt7 단백질의 탈아세틸화(Deacetylation) 활성을, 아세틸화된 p53 펩타이드 (p53-382/diAc) 및 Sirt1 Fluorometric Drug Discovery kit (AK-555)를 이용하여 제조자(BIOMOL)의 프로토콜에 따라 평가하였다.

10. 세포주기 분석

세포 주기 분포 분석을 위해, 4x10⁵ 세포들을 60-nm 디쉬에 플레이팅하고 일시적으로 대조군 siRNA 또는 SIRT7-특이적 siRNA 또는 성숙 miRNA 미믹으로 트랜스펙션하였다.

트랜스펙션 후, 상기 세포들을 트립신처리하고, 70% 에탄올로 고정한 후 PBS로 세척하고, 1 mg/ml RNase, 0.05% Triton X100 및 50 Fg/mL 프로피디움 아이오다이드 (BD biosciences, San Jose, CA, USA)을 함유하는 200 Fl의 PBS에 재현탁하였다. 그리고 상온에서 30분동안 암실 배양하고, 유세포 분석기(flow cytometer)를 이용하여 분석하였다. 데이터들은 CellQuest Pro software (BD Biosciences)을 이용하여 분석하였다.

11. 변이 분석

각 HCC 조직 및 상응하는 비-암성 간 조직으로부터의 게놈 DNA를, p53 유전자의 코딩 영역(엑손 4 ~ 9)을 커버하는 6 세트의 프라이머로 증폭시켰다.

각 PCR 반응은 20 ng 주형 DNA, 0.5 μmole의 각 프라이머, 0.2 μmole의 각 데옥시뉴클레오티드 삼인산염, 1.5 mM MgCl₂, Taq 폴리머라아제 04 유닛, 0.5 μCi의 dCTP (Ameroharm, Buckinghamshire, UK) 및 1 μl의 10X 버퍼를 함유하는, 10 Fl 반응 혼합물에서 표준 조건 하 수행되었다. 각 반응 혼합물은 94℃서 12분 동안 변성되고, 35 사이클 동안 인큐베이션되었다(94℃에서 40초동안 변μ성, 52~57℃에서 40초 동안 어닐링, 72℃에서 40초 동안 신장). 최종 신장은 72℃에서 5분동안 계속되었다.

증폭 후, PCR 산물들을 95℃에서 5분 동안 98% 포름아마이드/5 mmol/L NaOH를 함유하는 샘플 버퍼의 1:1 희석물에서 변성시켰다. 그리고 10% 글리세롤과 함께 SSCP(single strand conformation polymorphism) 겔 상에 로딩시켰다. 전기영동 후, 겔을 3 MM Whatman paper에 옮기고 건조시킨 후, Kodak X-OMAT film (Eastman Kodak,Rochester, NY)을 이용하여 방사능 사진을 찍었다.

직접적 서열 분석을 위해, PCR 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 PCR산물을mini-prep kit (Qiagen) 및 서열(Cosmogenetech, Seoul,Korea)에 의해 개별적으로 추출해냈다. 프라이머 서열들은 이하에 기재하였다

엑손	센스 프라이머 안티센스 프라이머	PCR 산물크기(bp)	어닐링 온도(℃)
5	GCTGCCGTGTTCCAGTTGCT CCAGCCCTGTCGTCTCTCCA	294	58
6	GGCCTCTGATTCCTCAGTGA GCCACTGACAACCACCCTTA	199	55
7	TGCCACAGGTCTCCCCAAGG AGTGTGCAGGGTGGCAAGTG	196	56
8	CCTTACTGCCTCTTGCTTCT ATAACTGCACCCTTGGTCTC	225	55

12. 메틸화-특이적 PCR ( MSP ).

DNA를 추출하고, EZ DNA 메틸화 키트(Zymo Research)를 이용하여 바이설페이트(bisulfate)로 처리하고, QiaQuick DNA 정제 키트(Qiagen,Valencia, CA)를 이용하여 정제하였다.

miR-125b 프로모터에 대한 타겟 영역 내 CpG 섬들을, 프로모터 스캔(http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/proscan/) 및 CpG Island Searcher (http://ccnt.hsc.usc.edu/cpgislands2/cpg.aspx)을 이용하여 결정하였다. 상기 영역은 miR-125b 전구체 전사 출발 포인트의 수백개 염기쌍 내에 존재하였다

메틸화-특이적 PCR (MSP)을 MethPrimer (Supplementary Table S2)에 의해 디자인된 메틸화된 또는 비메틸화된 DNA에 대한 프라이머 서열을 이용하여 수행하였다. 간략히 말하면, 2 μl의 바이설페이트-처리된 게놈 DNA를 증폭시켰다. PCR을 다음 조건 하 수행하였다: 10분동안 95℃, 이어서 30초 동안 95℃, 30초 동안 52℃ 및 30초 동안 60℃의 40 사이클. 수득 산물을 2% 아가로스 상에 로딩하였다. 각 샘플들은 이중으로 테스트하였다.

실시예 1 : HCC 에서의 SIRT7 발현 연관성 확인

HCC 집단에서 SIRT7 유전자 발현을 분석하였다. NCBI(National Center for Biotechnology Information) 유전자 발현 옴니버스(GEO) 데이터베이스, (accession numbers GSE25097, GSE14520, and GSE17856) 및 산포도로서 주어진 데이터에서 이용가능한 HCC 환자의 큰 집단으로부터 SIRT7 유전자 발현을 살펴보았다.

그 결과를 도 1 및 도 2에 도시하였다.

도 1A에 나타난 바와 같이, SIRT7발현은 전암(pre-malignant) 병변(낮은- 및 높은 이형결절)으로부터 명확한 암으로 점차적으로 증가하였다(Edmondson grades 1-3). SIRT7 유전자 발현은 모든 3개의 다른 HCC 집단에서 현저히 상향- 조절되었다(도 1B; 도 2A and B). 또한, SIRT7 단백질의 증가된 발현은 10개의 임의로 선택된 인간 HCC 조직의 웨스턴 블럿팅에 의해 확인되었다(도 1C). 인간 간암 세포주 역시, 불멸화된 정상 간세포 LO2, MiHA 및 THLE3와 비교하여 SIRT7 단백질의 높은 발현을 보였다(도 2C). 주목할 점으로, HCC 환자의 Kaplan-Meier 생존 곡선은 높은 SIRT7 발현을 가진 HCC 환자의 5년 이상 생존율이 낮은 SIRT7 발현을 가진 HCC 환자들보다 낮다는 점을 보여주었다(도 1D).

간에서의 암화 중 SIRT7의 분자적 기능을 알아보기 위해, SIRT7-녹다운을 RNA-간섭에 의해 유발하고 MTT 세포 증식능 분석으로 연구하였다. SIRT7 녹다운은 SIRT7 단백질 발현의 현저한 감소를 가져오고, Hep3B, SNU-368 및 SNU-449 간암 세포의 증식율 감소도 가져왔다(도 1E-G).

이러한 항-성장 효과는 SIRT7-타겟팅에서 세포주기 정지(as cell cycle arrest), 세포 노화 또는 세포사멸와 같은 세포 성장 조절의 파괴에 의해 부분적으로 설명될 수 있다. 그러므로, 세포주기 조절 및 세포죽음 메커니즘 상에서 SIRT7 억제의 효과를 알아보기로 하였다.

실시예 2 : 전체 게놈 스캔에 의한 SIRT7 에 의해 전사적으로 사일런싱되는 유전자 타겟 규명

2-1.세포주기 과정에서 SIRT7

암화유전자(Oncogeinc) SIRT7 활성과 관련한 분자적 타겟을 규명하기 위해, 전체 게놈 유전자 발현 분석을 Mock (empty vector) 및 SIRT7 shRNA 형질감염된 Hep3B 세포에 적용하였다.

이는 SIRT7 녹다운이 p21WAF1/Cip1 의 발현을 회복시킴을 보여주었고, 세포 성장 및 죽음 경로에 관여하는 유전자들의 발현에 영향을 미침을 보여주었다 (도 4A,C). 그리고, SIRT7 siRNA 형질감염된 Hep3B 세포에서 관찰되는 p21WAF1/Cip1 유도 및 G1/S 특이적 사이클린의 억제는 SIRT7이 세포 주기 조절 단백질을 탈조절함(deregulating)으로써 G1/S 단계를 방해함을 시사하였다.

세포주기 과정에서 SIRT7의 역할을 명확히 하기 위해, SIRT7 siRNA 형질감염된 Hep3B 및 SNU-449 세포들을 노코다졸로 처리하였다. 이러한 처리는 세포들을 G2/M 단계로 통합시킨다. 노코다졸 블록으로부터 분리한 후, G1-단계에서의 세포들 비율을 유세포 분석기로 측정하였다.

그 결과, 도 3A에 나타난 바와 같이, SIRT7 녹다운은 G1/S 단계에서 간암세포의 현저한 증가를 야기시키고, 세포주기 이행을 연기시켰다. 이는 SIRT7 녹다운에 의해, 적어도 부분적으로 세포주기 간섭으로 인해 간암세포의 증식저해 및/또는 성장지연이 일어남을 의미한다(도 5).

추가로, 본 발명자들은 Hep3B 세포에서 SIRT7 비활성이 선택적으로 p21WAF1/Cip1 발현을 유도하고, 동시에 G1/S 세포주기 조절 중 사이클린 D1의 발현을 억제함을 발견하였다(도 3B; 도 4B). 이러한 결과는 간암세포에서 SIRT7이 p21WAF1/Cip1 와 같은 세포주기 체크포인트를 과활성적으로 억제하고, 사이클린 D1의 활성을 조절하여 G1/S 이행을 촉진함을 나타낸다.

또한, 유전자 발현 분석에 근거하여, 자가소화성 세포 죽음의 요소들의 철폐를 알 수 있고 자가소화성 조절 단백질 Beclin-1 및 유전자, 즉 ATGs를 포함한다(도 4C). 도 3C에 나타난 바와 같이, Hep3B 세포에서 SIRT7 불활성은 전-자가소화성(pro-autophagy) 요소 Beclin-1 단백질 발현 및 LC3B-II 전환을 유도하였다.

종합적으로, SIRT7의 비정상적 조절은 간암화 중 세포주기 단백질의 탈조절 및 자가소화성 관련 단백질에 의한 유사 분열 자극을 야기함을 확인하였다.

2-2. 단백질 합성 시스템 상에서의 SIRT7

최근 연구들은 SIRT7가 RNA polymerase I 전사 시스템의 양성적 조절자가 될 수 있고 간, 비장, 고환, 암종 타입 등과 같은 대사적으로 활성화된 조직에서 높은 수준으로 나타남을 보여주었다. 리보좀 생성과 같은 단백질 합성 시스템의 변경이 악성암 진행에 의해 통제되는 필수적 세포성 과정이기 때문에, 간암세포의 단백질 합성 시스템에서 SIRT7의 생물학적 기능을 살펴볼 필요가 있다.

우선, Hep3B 핵 분획물에서 SIRT7 효소적 활성 및 배타적 발현을 검출함으로써, SIRT7이 간암세포의 핵인성 시르투인(nucleolar sirtuin)임을 확인하였다(도 3D).

기질로서 p53 상 SIRT7의 탈아세틸화 활성은 Hep3B 세포의 핵 분획물에 대한 SIRT7 항체의 면역침전물에서 현저히 증가함을 관찰하였다. 그리고 Hep3B 세포의 이소 단백질 합성의 정도를 평가하고, SIRT7 불활성 Hep3B 세포의 것과 비교하였다. 리보좀 유전자(rDNA) 전자가 세포의 번역능과 관련이 있기 때문이다. 그 후, Hep3B 세포를 pME18S-HDAC1 (HDAC1 발현 벡터), pME18S-HDAC2 (HDAC2 발현 벡터), pcDAN3.1_SIRT1 (SIRT1 발현 벡터) 및 pcMV-Neo-Bam p53 wt (와일드 타입 p53 발현 벡터)와 같은 다양한 발현 플라스미드로 트랜스펙션하였다

도 3E에 나타난 바와 같이, 모든 이소 플라스미드는 성공적으로 발현되었고 각 항체들로 면역 블럿팅함으로써 검출되었다. 그러나 SIRT7 불활성은 단백질 합성 시스템의 저해를 의미하는 이소 플라스미드의 단백질 발현을 억제하였다.

SIRT7 불활성 효과를 더 정확하게 알아보기 위해, HDAC6가 잠재적인 알파-튜블린 탈아세틸화제(deacetylases)이므로, HDAC6 발현 벡터 (pcDNA3.1_HDAC6)를 트랜스펙션하였다

도 3F에 도시한 바와 같이, HDAC6의 이소성 발현은 내생성 아세틸화된 알파-튜블린을 감소시켰고, 반면 SIRT7 불활성은 HDAC6 발현을 감소를 가져왔고 아세틸화된 알파-튜블린을 회복시켰다. 이는 Hep3B 세포의 단백질 합성 시스템에서 SIRT7의 양성적 역할을 시사한다.

실시예 3 : 간암에서 SIRT7 조절을 제어하기 위한 내생성 MicroRNAs

miRNA 기능의 손실 또는 수득은 각각 상향조절 및 사일런싱을 통해 암의 발달에 기여한다. 간암 세포에서 SIRT7 발현을 유도하는 메커니즘을 알아보기 위해, miRNA 발현 프로파일링 분석을 수행하여 인간 HCC 대상에서 비정상적으로 조절되는 miRNA를 확인하였다.

도 6A에 도시하고 있는 바와 같이, 8 비암성 간조직 및 16 HCCs의 1,371 miRNAs의 최소 필터링 기준에 의해 선별된 510 miRNAs의 자율 계층 클러스터링 분석(unsupervised hierarchical clustering analysis)으로 계통수 내 2개의 구별되는 클러스터 결과를 얻었고, 이는 간 암화, 특히 인간 HCC와 관련된 특징적인 miRNA 신호들을 암시하였다.

다음으로, 타겟 예측 프로그램, miRanda (http:// www.microrna.org)을 이용하여 가능한한 IRT7을 타겟팅하는 miRNA를 예측하고 확인하였다. 이로부터, HCC에서 현저히 하향-조절된 5 miRNAs (miR-125a-5p, 125b, 148a, 152 및 193a-3p)를 규명하였다(도 6B). 도 6C에 나타낸 바와 같이, miRNA 발현 어레이 데이터의 값은 HCC에서 비암성 간조직과 비교하여 현저히 낮았다.

HCC에서 miRNAs의 억제를 확인하기 위해서, Hep3B, SNU-449 세포에서 5 miRNAs 에 대해 정량-실시간 PCR (RT-PCR) 분석을 하고, 정상 간 세포주 THLE3의 결과와 비교하였다.

예상한 대로, Hep3B 및 SNU-449 모두에서 5 miRNAs 모두의 발현이 다소의 변이와 함께 THLE-3의 경우보다 현저히 낮게 나타났다(도 6D)

실시예 4 : MiR -125a-5p 및 MiR -125b 기능 확인

다음으로, 이러한 miRNAs에 의해 SIRT7 유전자의 3-UTR 영역과의 직접적 상호작용을 통해 SIRT7가 선택적으로 조절되는지 여부를 알아보기 위해, SIRT7의 3-UTR을 리포터 벡터 연결 루시퍼라제 오픈 리딩 프레임 내로 다운스트림에서 클로닝하여 psiCHECK2-SIRT7_3-UTR 와일드타입(psiCHECK2-SIRT7-wt)을 제조하였다. 또한, SIRT7 유전자의 임의의 변이 서열의 3-UTR을 클로닝하여 변이-타입(psiCHECK2-SIRT7-mt) 리포터 벡터를 제조하였다(도 7A). 각 벡터를, Hep3B 및 SNU-449 세포 각각에 5개의 상이한 miRNAs로 공동-트랜스펙션시켰다. 이러한 5 miRNAs를 가지는 psiCHECK2-SIRT7-wt 플라스미드의 이중-루시퍼라제 리포터 분석의 결과를 psiCHECK2-SIRT7-mt의 경우와 비교하고 그래프로 도시하였다.

그 결과, 8A,B에 도시한 바와 같이, miR-125a-5p, miR-125b, miR-148a 및 miR-152가 Hep3B 및 SNU-449 세포 모두에서 리포터 유전자 활성을 억제할 수 있음을 확인한 반면, miR-193a-3p는 아무런 효과가 없었다. 그러므로 이는 상기 4개의 miRNAs가 HCC 세포에서 in vitro SIRT7 발현을 조절할 수 있음을 시사한다.

또한, 간암 세포에서 이러한 5개 miRNA의 이소성 발현(ectopic expression)이, SIRT7를 향한 siRNA에 의한 SIRT7 불활성화의 효과와 닮아있는지 여부를 평가하였다.

그 결과, 도 8C 및 D에 나타낸 바와 같이, Hep3B 및 SNU-449 세포 모두에서 5 miRNAs의 이소 트랜스펙션 후 내생성 miRNA의 높은 수준이 검출되었다.

이는 루시퍼라제 분석의 결과와 일치하여, Hep3B 및 SNU-449 세포에서 SIRT7 siRNA가 그랬던 것처럼, miR-125a-5p, miR-125b, miR-148a 및 miR-152는 내생성 SIRT7 발현을 억제할 수 있음을 확인할 수 있었다(도 8 E,F). 그러나, 오직 miR-125a-5p, miR-125b가 선택적으로 p21WAF1/Cip1를 회복시켰고, Hep3B 및 SNU-449 세포에서 SIRT7 siRNA가 그랬던 것처럼 사이클린 D1을 억제하였다. 특히, GEO 데이터베이스 (GSE10694)로부터의 HCC 환자에서 miR-125a-5p 및 miR-125b의 발현 데이터를 평가할 때, miR-125a-5p 및 miR-125b 모두 HCC에서 비암성 간조직과 비교하여 현저한 하향-조절능을 보였다(도 7 도 7B,C).

비록 다른 miR-148a 및 miR-152가 이러한 세포주기 단백질 상에서 발현에 영향을 왜 미치지 않는지는 명확하지 않지만, 이러한 결과는 miR-125a-5p 및 miR-125b가 간암형성에 있어 SIRT7에 대한 조절자임을 시사한다.

또한, miR-125a-5p 및 miR-125b가 간암 세포에서 SIRT7의 내생성 조절자임을 명확히 확인하기 위해, miR-125a-5p 및 miR-125b의 이소성 발현이 SIRT7 불활성이 간암세포에서 그랬던것처럼, 세포주기 정지에 의해 성장 지연을 야기하는지 여부를 조사하였다.

이러한 miR-125a-5p 및 miR-125b 이소성 발현은 Hep3B 및 SNU-449 세포 모두에서 현저한 성장 억제를 보여줌을 MTT 분석에 의해 확인하였다 (도 9 도 9A,B). 나아가, 세포 주기 분포 상 상기 miRNAs의 영향을 평가한 결과, 상응하는 대조군(miRNA의 스크램블 서열) 또는 다른 miRNAs, miR-148a 및 miR-152과 비교하여 오직 miR-125a-5p 및 miR-125b가 G1 정지(arrest)를 유도하였다(도 9 도 9C,D). G1 단계의 정량 분석 또한, 대조군 또는 miR-148a 및 miR-152 발현하는 세포의 경우와 비교하여, 이소 miR-125a-5p 및 miR-125b를 발현하는 세포들이 G1 단계의 현저히 높은 비율을 보임을 확인하였다(도 9E).

종합적으로, 이러한 결과들은 miR-125a-5p 및 miR-125b 모두 내생성 SIRT7의 직접적 억제자이고 간암형성에서 종양 억제자로서 기능할 수 있음을 입증한다.

실시예 5 : HCC 에서 종양 억제자, MiR -125a-5p 및 MiR -125b의 불활성화 메커니즘

5-1. 전사과정에 미치는 영향

간암 형성 동안 후생적 사일런싱 및/또는 p53 활성이 miR-125a-5p 및 miR-125b의 전사적 발현에 영향을 미치는지 여부를 조사하였다. 간암세포에 DNA 메틸화 억제제 5-aza-dC(5-aza-2-deoxycytidine) 또는 히스톤 탈아세틸화 억제제 TSA(Trichostatin A)를 처리하여 DNA 메틸화 또는 히스톤 변경이 miR-125a-5p 및 miR-125b의 내생성 발현을 회복시키는지를 관찰하였다.

그 결과, Hep3B 및 SNU-449 세포에 5-aza-dC의 처리는 양 세포에서 miRNA-125b의 발현을 선택적으로 회복시킨 반면(도 12A,B), TSA 처리는 miR-125a-5p 및 miR-125b 발현에 아무런 영향을 끼치지 않았다(도 10)

나아가, 5-aza-dC에 의한 miR-125b 선택적 억제를 규명하기 위해, 상기 세포들의 프로모터 메틸화 위치를 조사하였다.

그 결과, 정상 간 세포주(THLE3) 및 HCC (Hep3B 및 SNU-449) 세포는 miR-125a-5p의 프로모터 영역에서 과메틸화(hypermethylation)를 보인 반면, miR-125b는 THLE3가 아닌, 오직 HCC세포에서 높게 메틸화되었음을 확인하였다(도 11 A).

그리고, 와일드-타입 p53 발현하는 플라스미드(pCMV-Neo-Bam-p53 wt)를 이용하여 HCC 세포에서 p53 활성을 회복시켰다. 이는 Hep3B 세포가 p53-null 및 SNU-449 세포가 오직 변이 p53을 발현하기 때문이다.

그 결과, Hep3B 및 SNU-449 세포에서 miR-125a-5p 및 miR-125b의 내생성 발현은 와일드-타입 p53의 이소성 발현에 의해 현저히 증가함을 확인하였다. 와일드-타입 p53의 이소성 발현은 SIRT7의 억제를 감소시키는 반면, 변이-타입 p53의 발현은 Hep3B 및 SNU-449 세포에서 웨스턴 블럿 분석에 의해 측정된 SIRT7 발현 수준에 영향을 미치지 않았다(도 12 E,F). 또한, 5-aza-dC 처리된 세포에서 SIRT7 억제가 관찰되었고, DNMT1 및 DNMT3의 타겟화된-파괴는 Hep3B 및 SNU-449 세포에서 SIRT7 발현 억제를 유도함을 발견하였다(도 12 도 12E,F).

추가로, Hep3B 및 SNU-449 세포에서, qRTPCR 분석을 통해 이소 p53 발현, 5-aza-dC 처리 및 DNMT1과 DNMT3b의 녹다운에 의해 miR-125a-5p 및 miR-125b의 내생성 발현의 유도를 확인하였다(도 11 B-E).

이러한 결과는 HCC에서 프로모터 메틸화 및/또는 p53 활성에 의한 내생성 miR-125a-5p 및 miR-125b 억제의 메커니즘을 보여준다.

5-2. 임상적 평가

이러한 발견의 임상적 중요성을 입증하기 위해, 인간 HCC 조직을 분석하였다.

우선, 인간 HCC의 다른 서브셋트에서 SIRT7 단백질 발현을 확인하였다. 모든 HCC에서 인접하는 비암성 간 조직과 비교하여 SIRT7가 현저히 높게 과발현함을 확인하였다(도 13 도 13A).

그리고, HCC의 동일 대상에서 qRT-PCR을 이용하여 내생성 miR-125a-5p 및 miR-125b를 분석하였다. 그 결과, 도 13 도 13B and C에 도시한 바와 같이, miR-125a-5p 및 miR-125b의 내생성 발현이 현저히 억제되었다.

이러한 HCC 샘플들을 SSCP(single-stranded conformational polymorphism) 및 직접적-시퀀싱을 이용하여 p53변이에 대해 조사하였다.

도 13D에 나타낸 바와 같이, p53 유전자의 DNA 결합 모티프, 즉, 엑손 5~8의 변이를 분석하여 9명의 환자 중 4명(patient number 11, 14, 16, and 19)이 상기 엑손에서 변이가 나타남을 확인하였다 (도 13D).

마지막으로, 동일 조직 샘플들을 miR-125b의 프로모터 메틸화에 대해 조사하였고, 17 환자 경우 miR-125b 프로모터 영역이 비암성 조직과 비교하여 매우 높은 메틸화가 일어났음을 확인하였다(도 13E). 메틸화 특이적 PCR 분석에 기초하여, 과메틸화가 miR-125b 억제의 공통의 메커니즘이 아님을 확인하였다. 결국 환자 12, 15, 18의 경우의 발견은 p53 유전자에서 변이가 나타나지 않거나 또는 miR-125b 프로모터 영역에서 과메틸화를 보이는 것처럼 복잡하게 나타났다

그럼에도 불구하고, 4HCC는 p53 유전자의 DNA 결합 도메인에서 변이를 가졌고, 1 HCC는 miR-125b 프로모터 영역의 과메틸화를 보였다.

환자 No.	발현			p53 위치		프로모터 메틸화
환자 No.	SIRT7	miR-125a-5p	miR-125b	변이	LOH	miR-125b
11	Up	Down	Down	exon7 G75T	No	N/C
12	Up	Down	Down	No	No	N/C
13	Up	Down	Down	No	No	N/C
14	Up	Down	Down	exon7 G71T	No	N/C
15	Up	Down	Down	No	No	N/C
16	Up	Down	Down	exon5 C191G	No	N/C
17	Up	Down	Down	No	No	Up
18	Up	Down	Down	No	No	N/C
10	Up	Down	Down	exon6 G113T	No	N/C

LOH: Loss of Heterozygosity

그러므로, 이를 통해, 간암형성 중 내생성 miR-125a-5p 및 miR-125b 조절을 위한 가능한 메커니즘을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

SIRT7를 발현하는 암 발생 또는 예후의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, miR-125a-5p 발현 프로파일링을 확인하는 방법.
제1항에 있어서,
SIRT7를 발현하는 암은 간세포암(HCC, hepatocellular carcinoma), 담도세포암 및 전이성 간암으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 간암인 것을 특징으로 하는 방법.
MiR-125a-5p 발현 또는 작용 촉진제를 유효성분으로 포함하는, SIRT7를 발현하는 암에 대한 항암용 조성물.
제3항에 있어서,
SIRT7를 발현하는 암은 간세포암(HCC, hepatocellular carcinoma), 담도세포암 및 전이성 간암으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 간암인 것을 특징으로 하는 조성물.
제3항에 있어서,
상기 MiR-125a-5p는 5‘-ucccugagacccuuuaaccuguga-3’로 이루어진 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
제3항에 있어서, 상기 MiR-125a-5p 발현 또는 작용 촉진제는
MiR-125a-5p가 발현토록 도입된 벡터; 메틸화(hypermethylation) 억제 물질; 또는 p53 활성화 물질인 것을 특징으로 하는 조성물.
제3항에 있어서,
상기 조성물은 SIRT7를 발현하는 암세포를 형질감염시켜 MiR-125a-5p가 SIRT7 mRNA 3'UTR과 결합하도록 함으로써 SIRT7 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제7항에 있어서,
상기 조성물은 양이온성 지질 또는 양이온성 양친매성 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제3항에 있어서,
상기 조성물은 세포주기를 G1/S 단계에 어레스팅(arresting)하는 것을 특징으로 하는 조성물.
SIRT7 유전자의 발현을 조절하는 방법에 있어서,
SIRT7를 MiR-125a-5p의 miRNA와, 또는 SIRT7를 표적으로 하는 MiR-125a-5p를 암호화하는 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 miRNA를 이용한 SIRT7 유전자 발현의 조절 방법.
제10항에 있어서,
상기 방법은 MiR-125a-5p의 과발현 또는 활성화를 통해 SIRT7 유전자 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 방법
제11항에 있어서,
상기 MiR-125a-5p의 과발현 또는 활성화는 프로모터 영역의 메틸화 억제 또는 p53 활성화를 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
다음 단계를 포함하는 간암 치료용 물질의 스크리닝 방법:
(a) MiR-125a-5p을 발현하는 동물세포에 항암 후보 물질을 처리하는 단계; 및
(b) 상기 동물세포에서 항암 후보 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 MiR-125a-5p 발현이 촉진되는 경우의 물질을 간암 치료용 물질로 선택하는 단계.
제13항에 있어서,
상기 MiR-125a-5p을 발현하는 동물세포는 간세포암(HCC, hepatocellular carcinoma), 담도세포암 및 전이성 간암으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 간암 세포인 것을 특징으로 하는 방법.