CN117248029A - 一种基于外泌体miRNA的肝癌诊断标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种肝癌的诊断或预后标志物、基于其的肝癌诊断试剂盒及其应用。本发明的肝癌诊断或预后标志物涉及具有生物学意义的、血清或血浆外泌体中的miRNA对，以所述miRNA对的表达量比值作为模型特征所构建的肝癌诊断模型对肝癌具有较高的诊断敏感性和特异性，并且，在早期肝癌的筛查上具有重大潜力，对于肝癌的早期诊断或预后预测具有重要的现实意义。
Description
技术领域
本发明属于医学检测技术领域，具体涉及一种基于外泌体miRNA的肝癌诊断标志物及其应用。
背景技术
肝癌是临床上最为常见的恶性肿瘤之一。
由于肝癌具有发病隐匿的特点，早期肝癌很难被发现，而晚期肝癌病情发展较快、治疗方法有限、治愈难、预后差，进而造成了我国肝癌生存率低的现状。据研究，诊断为早期肝癌的患者可通过肝移植、肿瘤手术切除或局部消融治疗等根治性治疗从而将5年存活率提高至70-75%。因此，除了需要进行疫苗接种等基本的防控之外，肝癌的早期筛查对降低其发病率和死亡率有着重要的意义。
目前，最常用且传统的肝癌诊断技术包括影像学和血清甲胎蛋白（AFP）。影像学诊断包括超声显像和CT等，然而，影像学通常用来诊断肝内占位病变，对于未发生实质性占位的早期肝癌或结节性肝硬化的检测是不具有敏感性和特异性的。此外，上述诊断方法都是主观的，取决于操作员的经验和设备的灵敏度。血清AFP是当前诊断肝癌和疗效监测常用且重要的指标。然而，AFP单独的敏感性只有40-65％，所以AFP作为早期诊断指标并不理想。GALAD模型利用了AFP、DCP等蛋白标志物开创了国内多指标联合建模的先河，提高了早期肝癌的敏感性和特异性。因此，分子诊断方法是对肝癌辅助诊断的有力补充。
外泌体是细胞分泌并进入体液或细胞外环境的小囊泡，直径只有30-100纳米，对细胞间的通讯发挥着重要作用。外泌体由于脂质双分子层的保护，能够在各种生物体液和细胞培养液中稳定存在。miRNA存在于外泌体内容物中，可以通过外泌体的包裹从癌细胞释放到体液中，不会受到核糖体酶的降解。已有研究表明，肝癌患者血清中过半的蛋白分子都存在岩藻糖基化现象，这些发生特定糖基化改变的蛋白与肝脏疾病发生发展的关系对于肝病的诊治及预后可能具有十分重要的作用。因此，分析岩藻糖基化外泌体中的miRNA与肝癌发生、发展的关系，将有助于开发更具有针对性的肝癌诊断标志物。
发明内容
发明目的
针对上述现有技术方法中所存在的问题，本发明旨在提供一种高敏感性和特异性的肝癌的诊断或预后标志物、基于其的试剂盒或其应用，包括：在构建用于肝癌诊断、疗效或预后评估的模型中的应用、或在制备用于肝癌诊断、疗效或预后评估的药物或试剂盒中的应用。
解决方案
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种肝癌的诊断或预后标志物，所述肝癌的诊断或预后标志物包含由以下任意两个miRNA组成的miRNA对，或所组成miRNA对的任意组合：
hsa-let-7a，hsa-miR-21，hsa-miR-125a，hsa-miR-150，hsa-miR-200a，hsa-miR-483，hsa-miR-199a，hsa-miR-200a，hsa-miR-429，hsa-miR-126，hsa-miR-381，hsa-miR-185，hsa-miR-215，hsa-miR-374a。
在优选实施方案中，所述肝癌的诊断或预后标志物包含选自以下的miRNA对：
hsa-miR-200a/hsa-miR-150；
hsa-miR-483/hsa-miR-199a；
hsa-miR-200a/hsa-miR-199a；
hsa-miR-150/hsa-miR-429；
hsa-miR-126/hsa-miR-200a；
hsa-miR-199a/hsa-miR-429；
hsa-miR-381/hsa-miR-200a；
hsa-miR-185/hsa-miR-429；
hsa-miR-215/hsa-miR-199a；
hsa-miR-125a/hsa-miR-215；
hsa-let-7a/hsa-miR-21；
hsa-miR-200a/hsa-miR-374a；
hsa-miR-125a/hsa-miR-21；
hsa-miR-21/hsa-miR-150；以及，
前述任意一项、几项或全部的组合。
在优选实施方案中，所述肝癌的诊断或预后标志物包含选自以下的miRNA对：
hsa-let-7a/hsa-miR-21；
hsa-miR-125a/hsa-miR-21；
hsa-miR-21/hsa-miR-150；
hsa-miR-200a/hsa-miR-150；以及，
前述任意一项、两项、三项或全部的组合。
在一些具体实施方案中，所述肝癌的诊断或预后标志物包含hsa-let-7a/hsa-miR-21、hsa-miR-125a/hsa-miR-21、hsa-miR-21/hsa-miR-150和hsa-miR-200a/hsa-miR-150的组合。
在另一些具体实施方案中，所述肝癌的诊断或预后标志物包含hsa-let-7a/hsa-miR-21、hsa-miR-200a/hsa-miR-150和hsa-miR-125a/hsa-miR-21的组合。
在另一些具体实施方案中，所述肝癌的诊断或预后标志物包含hsa-miR-125a/hsa-miR-21和hsa-miR-21/hsa-miR-150的组合。
作为优选，所述miRNA对中的miRNA为血清或血浆中的miRNA，优选为血清或血浆岩藻糖基化外泌体中的miRNA。
进一步优选地，所述肝癌的诊断或预后标志物还包含AFP、AFP-L3和DCP中的任意一种或多种；优选地，所述AFP、AFP-L3或DCP为血清、血浆或全血中的相应蛋白。
第二方面，本发明提供了如上述第一方面所述的肝癌的诊断或预后标志物在构建用于肝癌诊断、疗效或预后评估的模型中的应用。
在具体实施方案中，以所述miRNA对的表达量比值作为模型特征，并利用机器学习方法，进行建模。
所述机器学习方法可为建模领域常用的机器学习方法，例如，逻辑回归、支持向量机、树模型、神经网络等。
第三方面，本发明提供了如上述第一方面所述的肝癌的诊断或预后标志物或其检测试剂在制备用于肝癌诊断、疗效或预后评估的药物或试剂盒中的应用。
第四方面，本发明提供了一种用于肝癌诊断、疗效或预后评估的药物或试剂盒，所述药物或试剂盒包括如上述第一方面所述的肝癌的诊断或预后标志物或其检测试剂。
在肝癌患者中，其血清岩藻糖基化外泌体的上述miRNA对的表达量比值较健康人体具有显著性差异。
有益效果
本发明提供的肝癌的诊断或预后标志物涉及具有生物学意义的、血清或血浆外泌体中的miRNA对，以该miRNA对的表达量比值作为肝癌诊断模型特征，避免了单个miRNA表达量作为特征时的不稳定的现象，从而能够实现更准确的诊断或预后评估；以所述miRNA对的表达量比值作为模型特征所构建的肝癌诊断模型具有较高的诊断敏感性和特异性（分别在85%和90%以上），并且在早期肝癌的筛查上也具有重大潜力。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里，专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。在这里，作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
图1为实施例1中所筛选出的14个配对的miRNA的表达量比值在NGS样本上的热图。
图2为实施例1中所筛选出的14个配对的miRNA的表达量比值的组合在NGS样本的模型效果：其中，（a）图显示ROC曲线，（b）图显示混淆矩阵。
图3为实施例1中所筛选出的四个配对miRNA表达量比值在NGS数据上的箱线图，如实施例2中所记载的；其中，T和N分别代表肝癌组和非肝癌对照组。
图4为实施例1中所筛选出的三个配对miRNA的qPCR的CT值差值的箱线图，如实施例3中所记载的；其中，T和N分别代表肝癌组和非肝癌对照组。
图5显示基于配对miRNA的优选组合一所构建的肝癌诊断模型的肝癌诊断效果；其中，（a）图显示ROC曲线，（b）图显示混淆矩阵，（c）图显示阳性样本韦恩图。
图6显示肝疾病的不同分期样本在基于配对miRNA的优选组合一所构建的肝癌诊断模型上的效果；其中，（a）图显示ROC曲线，（b）图显示混淆矩阵。
图7显示基于配对miRNA的优选组合一和肝癌三联检指标所构建的肝癌诊断模型的肝癌诊断效果；其中，（a）图显示ROC曲线，（b）图显示混淆矩阵，（c）图显示阳性样本韦恩图。
图8显示肝疾病的不同分期样本在基于配对miRNA的优选组合一和肝癌三联检指标所构建的肝癌诊断模型上的效果；其中，（a）图显示ROC曲线，（b）图显示混淆矩阵。
图9为实施例1中所筛选出的两个配对miRNA的qPCR的CT值差值的箱线图，如实施例6中所记载的；其中，T和N分别代表肝癌组和非肝癌对照组。
图10显示基于配对miRNA的优选组合二所构建的肝癌诊断模型的肝癌诊断效果；其中，（a）图显示ROC曲线，（b）图显示混淆矩阵。
图11显示基于配对miRNA的优选组合二和肝癌三联检指标所构建的肝癌诊断模型的肝癌诊断效果；其中，（a）图显示ROC曲线，（b）图显示混淆矩阵。
图12显示基于配对miRNA的优选组合二和AFP所构建的肝癌诊断模型的肝癌诊断效果；其中，（a）图显示ROC曲线，（b）图显示混淆矩阵。
图13为160个肝癌样本在单独AFP指标（即，“AFP”）、基于配对miRNA的优选组合二的诊断模型（即，“miR”）和基于配对miRNA的优选组合二联合AFP的诊断模型（即，“miR+AFP”）的预测情况韦恩图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
以下实施例中所使用的试剂、试剂盒、原料和设备等，如无特殊说明，均可通过商业化途径购买获得。本发明中所涉及的实验或检测方法，如无特殊说明，均为本领域常规的实验或检测方法，或参照相应的试剂盒或产品说明书进行。
实施例1：基于血清外泌体数据，筛选肝癌的特征性miRNA对
1、临床资料和样本的采集与制备
采用回顾性分析，分别收集的肝癌患者、良性肝病患者、和健康人血清样本，样本信息见表1。
如表1所示，数据集共分为六个队列，NGS队列用于肝癌的特征性miRNA对的发现；五个PCR队列分别用于两个优选组合的建模及验证。
肝癌患者符合以下入选标准：以可根治性手术治疗的早期病例为主；病理学诊断明确其肿瘤病理(Edmoson)分期；所有病例基本信息均完整；排除其他原因引起的慢性肝病如酒精性脂肪性肝病和自身免疫性肝病等；排除妊娠、生殖胚胎源性肿瘤、其它器官恶性肿瘤、严重感染性疾病、其他重要脏器疾病等。良性肝病样本包括肝炎、肝硬化、肝内血管瘤等，排除肝癌术后、肝脏移植及其他器官恶性肿瘤。
表1入选病例统计表：
。
2、外泌体的分离纯化
将血液收集在5 mL真空采血管（促凝剂+分离胶）中，并在采样后2小时内于室温下以1800×g离心10分钟；将得到的血清在4℃下以3000×g离心10分钟，以去除任何细胞碎片和凋亡小体；然后，弃去沉淀，抽出上层血清并将其保存在-80℃，严禁反复冻融。使用GlyExo-Capture试剂盒分离外泌体，其中所用磁珠为本公司专利“一种用于分离临床样本中的糖基化外泌体的凝集素-磁性载体偶联复合物”。
3、外泌体miRNA的提取及NGS测序
使用miRNeasy® Mini Kit试剂盒，按照试剂盒说明书中的程序，提取细胞外囊泡的总RNA，并使用Qsep100全自动核酸分析系统的高灵敏度RNA试剂盒对其进行评估。然后，使用Illumina NEBNext small RNA文库制备试剂盒，将外泌体小RNA编译成cDNA文库，并使用E-Gel Power Snap电泳系统和E-Gel SizeSelect II凝胶来选择纯化目的大小片段的文库。检查cDNA文库的质量和浓度后，在Illumina NextSeq 550测序系统进行75 nt、单端测序，单个文库测序数据量大于10M reads。
4、构建miRNA互作网络，并对NGS测序数据进行分析，通过单因素筛选和遗传算法筛选，获得肝癌的特征性miRNA对
（1）miRNA互作网络的构建
1）从miRTarBase数据库中，获取miRNA的作用靶点；
2）基于步骤1）获得的miRNA的作用靶点信息，从人类转录因子数据库hTFtarget和AnimalTFDB中，筛选可作为miRNA的作用靶点的转录因子；
3）基于步骤2）所筛选到的转录因子，通过生物信息学方法或公共数据库，获取其进一步调控的miRNA，从而构建miRNA-TF-miRNA的作用关系，获得miRNA互作网络。
（2）分析NGS测序数据，准备miRNA定量数据
通过对上述NGS测序数据进行分析，获得包含疾病样本和对照样本的综合样本集内各样本的miRNA定量数据：
首先，需要fastq格式的原始测序文件以进行质控；针对质控结果，利用cutadapt软件进行去除接头和低质量的reads；针对质控合格的数据，使用exceRpt小RNA分析流程进行注释定量，从而获得表达矩阵；根据表达矩阵的表达水平，过滤掉counts过低的miRNA（需具体情况具体分析），获得校正的miRNA定量数据。
（3）miRNA对表达量比值特征构建
基于上述所构建的miRNA互作网络以及所准备的miRNA定量数据，计算各样本的、存在相互作用关系的miRNA对的表达量比值。
为了避免出现分母为0的现象，在计算miRNA对表达量比值的时候，统一对分母进行加“1”处理，计算公式如下：
miRNA_a/miRNA_b = countsa/(countb+1)
（4）特征性miRNA对的筛选
通过单因素筛选和遗传算法筛选，获得肝癌的特征性miRNA对，其流程基本如下：
i)单因素筛选：比较疾病生物样品组相对于正常生物样品组的各miRNA对的表达量比值，使用python的scipy.stats.ttest_ind计算p值，并使用statsmodels.stats.multitest.fdrcorrection对p值进行校正，针对校正后的p值p-adjusted，基于阈值0.05进行筛选；
ii)对筛选到的miRNA对，计算其在疾病生物样品组中的表达量比值相对于正常生物样品组中的表达量比值的变化倍数的对数值，即log2FoldChange，并根据实际情况对log2FoldChange选取合适的阈值，进一步筛选合适的靶标；
所述遗传算法筛选进行100次以上。
经过上述筛选程序，获得14个配对的miRNA，其详细信息如以下表2所示：
。
此外，绘制了这14个配对的miRNA的表达量比值在NGS队列上的热图，见图1；图1显示，该热图上，这14个配对的miRNA的表达量比值在NGS队列的癌症和非癌样本的分组聚类上表现良好。由此可推断，这14个miRNA对以及选自这14个miRNA对的任意组合均具有成为肝癌标志物的潜能。
为验证这一点，接下来，对这14个miRNA对的组合的模型性能进行示例性验证；具体地，在NGS队列上随机按照7:3划分训练集和测试集，在训练集上利用随机森林模型进行建模，并在测试集进行验证。根据上述14个miRNA对的组合所建模型的ROC曲线和混淆矩阵见图2；图2显示，训练集和验证集的AUC分别为0.98和0.93，敏感性、特异性分别为90.12%、96.04%和88.24%、90.91%，提示：所建模型具有良好的分类性能。
5、对肝癌的特征性miRNA对进一步筛选
对上述筛选到的14个配对miRNA表达量比值进行递归特征消除，最终得到交叉验证AUC最高的8个配对miRNA组合；利用qPCR确认队列的样本，对8个配对miRNA进行验证，挑选出4个趋势一致且在癌症与对照组间具有显著性差异的配对miRNA，如以下所示：
hsa-let-7a/hsa-miR-21；
hsa-miR-125a/hsa-miR-21；
hsa-miR-200a/hsa-miR-150；
hsa-miR-21/hsa-miR-150。
实施例2：使用NGS定量数据，进行四个配对miRNA的箱线图展示
测试并绘制实施例1所筛选出的四个配对miRNA在NGS队列上的箱线图，结果如图3所示。
由图3的箱线图可以看出，这四个配对miRNA的表达量比值在肝癌组和对照组之间存在显著差异（p<0.5），说明：这四个配对miRNA具有成为肝癌标志物的潜能。
实施例3：通过RT-qPCR，验证配对miRNA的优选组合一的肝癌诊断性能
在实施例1所筛选出的四个配对miRNA中，选取三个配对miRNAhsa-let-7a/hsa-miR-21、hsa-miR-125a/hsa-miR-21、hsa-miR-200a/hsa-miR-150，作为优选组合一；利用RT-qPCR，对其在中心内和多中心验证队列上分别进行了验证，样本信息见表1。
具体验证方法如下：
首先，进行第一链cDNA合成，反应体系和反应条件如下：
反应体系和体积：
| 反应体系 | 体积（μL） |
| 反转录引物（10 μM） | 2 |
| 5×缓冲液 | 2 |
| Poly A酶（5 U/μL） | 0.5 |
| 逆转录酶（200 U/μL） | 0.5 |
| ATP（10 mM） | 1 |
| dNTP（10 mM） | 1 |
| RNA模板（样本总RNA） | 3 |
| 总体积 | 10 |
反应条件和时间：
。
然后，在ABI 7500实时荧光定量PCR系统上进行miRNA qPCR反应，反应体系和反应条件如下：
反应体系和体积：
| 反应体系 | 体积（μL） |
| 2×qPCR反应液 | 12.5 |
| 正向引物（10 μM） | 2 |
| 反向引物（10 μM） | 2 |
| 探针（10 μM） | 1 |
| Rox | 0.5 |
| 无核酸酶水 | 2 |
| cDNA | 5 |
| 总体积 | 25 |
反应条件和时间：
。
上述RT-qPCR程序中，所用引物序列如下：
| 引物名称 | 序列(5' to 3') |
| hsa-let-7a正向引物 | GCGTGAGGTAGTAGGTTGTATAGT（SEQ ID NO:1） |
| hsa-miR-21正向引物 | GCTAGCTTATCAGACTGATGTT（SEQ ID NO:2） |
| hsa-miR-125a正向引物 | GCTCCCTGAGACCCTTT（SEQ ID NO:3） |
| hsa-miR-150正向引物 | GCATCTCCCAACCCTT（SEQ ID NO:4） |
| hsa-miR-200a正向引物 | CCACTTAACACTGTCTGGTAACG（SEQ ID NO:5） |
| 探针 | TCGGTATCGAGTCGCACT（SEQ ID NO:6） |
| 反向引物（上述miRNA共用） | CAGTCTCAGGGTCCGAGGTATTC（SEQ ID NO:7） |
| 反转录引物 | CGACTCGATCCAGTCTCAGGGTCCGAGGTATTCGATCCTAACCCTCTCCTCGGTATCGAGTCGCACTTTTTTTTTTTTTT（SEQ ID NO:8）-VN，该引物为兼并引物，其中，V=C或G或A，N=C或G或A或T |
。
结果如下：
在各个qPCR队列上，配对miRNA的qPCR的CT值差值的箱线图见图4；由图4可以看出，这三个配对miRNA无论是在中心内还是在其它中心上趋势均与NGS数据的趋势一致，且在不同中心上比较稳定；这表明：筛选出的三个配对miRNA在RT-qPCR队列上同样适用，其在肝癌组和非肝癌对照组之间具有显著性差异，没有检测方法的偏好性和明显的个体间差异。
实施例4：基于配对miRNA优选组合一构建肝癌诊断模型，并验证其诊断性能
为了检测由上述三个配对miRNA组成的优选组合一的肝癌诊断效果，本实施例利用逻辑回归在训练队列上进行建模，并在中心内验证集和多中心验证集上进行验证。具体方法如下：
所用的样本信息见表1：其中qPCR确认队列做为训练集，中心内验证队列和多中心验证队列分别做为验证集。针对训练集的三个配对miRNA建立逻辑回归模型，遵循训练集约登指数最大原则确定cutoff。通过ROC曲线的AUC及敏感性和特异性来评估模型的整体性能。利用韦恩图查看真实诊断结果为肝癌的样本分别在模型预测阳性和AFP阳性的交叉情况。根据以上方法，分别在整个队列和单独提取肝癌早期及良性肝病的样本进行了统计分析。
模型的诊断效果如图5所示；图5显示：训练集、中心内验证集和多中心验证集的AUC分别为0.996、0.951和0.944（图5（a）），特定cutoff下敏感性和特异性分别为94.34%、87.50%、86.76%和96.20%、93.48%、93.14%（图5（b））。这说明：3个配对miRNA的模型效果处于较高的水平且在不同中心数据的效果基本稳定。
同时，本实施例还检测了阳性样本的AFP，并与上述模型的预测效果进行了比较，发现：该模型预测肝癌的总敏感性能够达到88.54%，而AFP的敏感性只有61.26%（图5（c））。
此外，由图5（c）还可以得出：基于该三个配对miRNA的组合的肝癌诊断模型与AFP有很强的互补性，能够检测出87.76%的AFP未检测到的样本。这表明：基于上述3个配对miRNA的模型对肝癌有很强的预测效果，能够作为肝癌的诊断标志物。
由于肝癌早筛的目的在于从良性肝病患者中检测出肝癌早期病变，因此本实施例单独提取了肝癌早期和良性肝病的样本，并在模型上查看了预测效果，结果如图6所示；图6显示：早期肝癌样本与良性肝病样本的AUC为0.936，敏感性和特异性分别为84.29%和92.20%，均处于较高水平；由此可见，我们筛选出的3个配对miRNA的优选组合一在早期肝癌的筛查上具有重大潜力。
实施例5：基于配对miRNA优选组合一和肝癌三联检指标（AFP、AFP-L3和DCP），构建肝癌诊断模型
本实施例中，利用上述三个配对miRNA和肝癌三联检指标（AFP、AFP-L3和DCP）进行联合建模，其所采用的训练集和验证集的样本信息与实施例4一致。具体建模方法如下：
所用的样本信息见表1：其中qPCR确认队列做为训练集，中心内验证队列和多中心验证队列分别做为验证集。针对训练集的三个配对miRNA建立逻辑回归模型，遵循训练集约登指数最大原则确定cutoff。通过ROC曲线的AUC及敏感性和特异性来评估模型的整体性能。利用韦恩图查看真实诊断结果为肝癌的样本分别在模型预测阳性和AFP阳性的交叉情况。根据以上方法，分别在整个队列和单独提取肝癌早期及良性肝病的样本进行了统计分析。
模型的诊断效果如图7所示；由图7（a）的ROC曲线可以得出，训练集、中心内验证集和多中心验证集的AUC分别为1、0.983和0.969；由图7（b）的混淆矩阵可以得出，特定cutoff下敏感性和特异性分别为100%、92.19%、90.44%和97.47%、100%、95.67%；并且，由图7（c）的阳性样本韦恩图可以得出，本模型能够检测出95.48%的AFP阳性和88.78%的AFP阴性的癌症样本。表明：基于上述三个配对miRNA对和肝癌三联检指标的模型对肝癌有很强的预测效果。
此外，本实施例还检测了肝癌早期样本相对于良性肝病样本在模型上的效果，结果如图8所示；图8显示：早期肝癌样本与良性肝病样本的AUC为0.958，敏感性和特异性分别为91.43%和95.41%；这表明，我们筛选出的3个配对miRNA联合肝癌三联检指标在早期肝癌的筛查上具有重大潜力。
实施例6：通过RT-qPCR，验证配对miRNA的优选组合二的肝癌诊断性能
在实施例1所筛选出的四个配对miRNA中，选取两个配对miRNA（hsa-miR-125a/hsa-miR-21和hsa-miR-21/hsa-miR-150），作为优选组合二。利用RT-qPCR，对其在中心内和多中心验证队列上分别进行了验证，样本信息见表1。扩增引物与反应体系见实施例3，上述两个配对miRNA的qPCR的CT值差值的箱线图见图9；图9显示，由这两个配对miRNA组成的优选组合二的qPCR验证结果在肝癌组和非肝癌对照组之间具有显著性差异。
实施例7：基于配对miRNA的优选组合二构建肝癌诊断模型，并验证其诊断性能
为了检测由上述两个配对miRNA组成的优选组合二的肝癌诊断效果，本实施例利用逻辑回归在训练队列上进行建模，并在验证集上进行验证。具体方法如下：
所用的样本信息见表1：其中优选组合二qPCR训练队列做为训练集，优选组合二qPCR验证队列做为验证集。针对训练集的两个配对miRNA建立逻辑回归模型，遵循训练集约登指数最大原则确定cutoff。通过ROC曲线的AUC及敏感性和特异性来评估模型的整体性能。
模型的诊断效果如图10所示；图10显示：训练集和验证集的AUC分别为0.916和0.922（图10（a）），特定cutoff下敏感性和特异性分别为84.38%、84.38%和88.05%、91.59%（图10（b））。这说明：基于两个配对miRNA的模型的诊断效果处于较高的水平且在不同批次数据的效果基本稳定。
实施例8：基于配对miRNA优选组合二和肝癌三联检指标（AFP、AFP-L3和DCP）构建肝癌诊断模型，并验证其诊断性能
本实施例中，利用上述两个配对miRNA和肝癌三联检指标（AFP、AFP-L3和DCP）进行联合建模，其所采用的训练集和验证集的样本信息与实施例7一致。具体建模方法如下：
所用的样本信息见表1：其中优选组合二qPCR训练队列做为训练集，优选组合二qPCR验证队列做为验证集。针对训练集的两个配对miRNA和三联检建立逻辑回归模型，遵循训练集约登指数最大原则确定cutoff。通过ROC曲线的AUC及敏感性和特异性来评估模型的整体性能。
模型的诊断效果如图11所示；图11显示：训练集和验证集的AUC分别为0.968和0.959（图11（a）），特定cutoff下敏感性和特异性分别为91.67%、85.94%和94.34%、94.39%（图11（b））。这说明：基于这两个配对miRNA和肝癌三联检指标的模型对肝癌有很强的预测效果。
实施例9：基于配对miRNA优选组合二和肝癌指标（AFP）构建肝癌诊断模型，并验证其诊断性能
本实施例中，利用上述两个配对miRNA和肝癌指标（AFP）进行联合建模，其所采用的训练集和验证集的样本信息与实施例7一致。具体建模方法如下：
所用的样本信息见表1：其中优选组合二qPCR训练队列做为训练集，优选组合二qPCR验证队列做为验证集。针对训练集的两个配对miRNA和AFP建立逻辑回归模型，遵循训练集约登指数最大原则确定cutoff。通过ROC曲线的AUC及敏感性和特异性来评估模型的整体性能。
模型的诊断效果如图12所示；图12显示：训练集和验证集的AUC分别为0.966和0.942（图12（a）），特定cutoff下敏感性和特异性分别为90.63%、85.94%和91.20%、92.52%（图12（b））。这说明：基于这两个配对miRNA和肝癌指标AFP构建的模型对肝癌也具有很好的预测效果。
此外，本实施例中，还对基于上述两个配对miRNA所构建的模型、基于仅AFP的模型以及基于上述两个配对miRNA联合AFP所构建的模型的诊断性能进行了比较，结果如图13所示；图13显示：在160个肝癌样本中，AFP的敏感性仅为60.62%，而基于两个配对miRNA联合AFP的模型可以检测出97.94%的AFP阳性样本和74.60%的AFP阴性样本。这说明：配对miRNA优选组合二对临床常用肝癌指标AFP有很好的补充作用，基于配对miRNA联合AFP的模型对肝癌有更高的检出率。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (15)
1.一种肝癌的诊断或预后标志物，其特征在于，所述肝癌的诊断或预后标志物包含由以下任意两个miRNA组成的miRNA对，或所组成miRNA对的任意组合：
hsa-let-7a，hsa-miR-21，hsa-miR-125a，hsa-miR-150，hsa-miR-200a，hsa-miR-483，hsa-miR-199a，hsa-miR-200a，hsa-miR-429，hsa-miR-126，hsa-miR-381，hsa-miR-185，hsa-miR-215，hsa-miR-374a。
2.根据权利要求1所述的肝癌的诊断或预后标志物，其特征在于，所述肝癌的诊断或预后标志物包含选自以下的miRNA对：
hsa-miR-200a/hsa-miR-150；
hsa-miR-483/hsa-miR-199a；
hsa-miR-200a/hsa-miR-199a；
hsa-miR-150/hsa-miR-429；
hsa-miR-126/hsa-miR-200a；
hsa-miR-199a/hsa-miR-429；
hsa-miR-381/hsa-miR-200a；
hsa-miR-185/hsa-miR-429；
hsa-miR-215/hsa-miR-199a；
hsa-miR-125a/hsa-miR-215；
hsa-let-7a/hsa-miR-21；
hsa-miR-200a/hsa-miR-374a；
hsa-miR-125a/hsa-miR-21；
hsa-miR-21/hsa-miR-150；以及，
前述任意一项、几项或全部的组合。
3.根据权利要求2所述的肝癌的诊断或预后标志物，其特征在于，所述肝癌的诊断或预后标志物包含选自以下的miRNA对：
hsa-let-7a/hsa-miR-21；
hsa-miR-125a/hsa-miR-21；
hsa-miR-21/hsa-miR-150；
hsa-miR-200a/hsa-miR-150；以及，
前述任意一项、两项、三项或全部的组合。
4.根据权利要求3所述的肝癌的诊断或预后标志物，其特征在于，所述肝癌的诊断或预后标志物包含hsa-let-7a/hsa-miR-21、hsa-miR-125a/hsa-miR-21、hsa-miR-21/hsa-miR-150和hsa-miR-200a/hsa-miR-150的组合。
5.根据权利要求3所述的肝癌的诊断或预后标志物，其特征在于，所述肝癌的诊断或预后标志物包含hsa-let-7a/hsa-miR-21、hsa-miR-200a/hsa-miR-150和hsa-miR-125a/hsa-miR-21的组合。
6.根据权利要求3所述的肝癌的诊断或预后标志物，其特征在于，所述肝癌的诊断或预后标志物包含hsa-miR-125a/hsa-miR-21和hsa-miR-21/hsa-miR-150的组合。
7.根据权利要求1所述的肝癌的诊断或预后标志物，其特征在于，所述miRNA对中的miRNA为血清或血浆中的miRNA。
8.根据权利要求7所述的肝癌的诊断或预后标志物，其特征在于，所述miRNA对中的miRNA为血清或血浆岩藻糖基化外泌体中的miRNA。
9.根据权利要求1-8任一项所述的肝癌的诊断或预后标志物，其特征在于，所述肝癌的诊断或预后标志物还包含AFP、AFP-L3和DCP中的任意一种或多种。
10.根据权利要求9所述的肝癌的诊断或预后标志物，其特征在于，所述AFP、AFP-L3或DCP为血清、血浆或全血中的相应蛋白。
11.根据权利要求1-10任一项所述的肝癌的诊断或预后标志物在构建用于肝癌诊断、疗效或预后评估的模型中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，以所述miRNA对的表达量比值作为模型特征，并利用机器学习方法进行建模。
13.根据权利要求1-10任一项所述的肝癌的诊断或预后标志物或其检测试剂在制备用于肝癌诊断、疗效或预后评估的药物或试剂盒中的应用。
14.一种用于肝癌诊断、疗效或预后评估的药物或试剂盒，其特征在于，所述药物或试剂盒包括根据权利要求1-10任一项所述的肝癌的诊断或预后标志物或其检测试剂。
15.根据权利要求14所述的药物或试剂盒，其特征在于，在肝癌患者中，其血清岩藻糖基化外泌体的所述miRNA对的表达量比值较健康人体具有显著性差异。
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