CN110205382A - Gas5在重症哮喘诊断中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了GAS5在重症哮喘诊断中的应用，本发明首次发现了GAS5在重症哮喘中显著性上调，通过检测GAS5的表达水平可以判断受试者是否患有重症哮喘；本发明同时公开了GAS5在重症哮喘样本施用糖皮质激素类药物后表达水平显著下调，通过检测施用糖皮质激素类药物前后的GAS5的表达水平可以判断受试者是否患有重症哮喘，解决个体化差异的问题。

Description

GAS5在重症哮喘诊断中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及GAS5在重症哮喘诊断中的应用。

背景技术

支气管哮喘(简称哮喘)是一种在病因、发病机制、临床表现和结果上具有异质性特征的慢性气道炎症性疾病(De Ferrari,L.；Chiappori,A.；Bagnasco,D.,et al.,Molecular phenotyping and biomarker development:are we on our way towardstargeted therapy for severe asthma？Expert review of respiratory medicine2016,10(1),29-38.)。重症哮喘是哮喘的一个亚型，是哮喘致残致死的主要原因。我国流行病学调查显示14岁以上人群重症哮喘约占哮喘患者的5.99％，虽然比例不高，但导致患者频繁急诊或住院，严重影响患者生活质量和身心健康，占用巨额医疗资源(中华医学会呼吸病学分会哮喘学组,中国哮喘联盟.重症哮喘诊断与处理中国专家共识.中华结核和呼吸杂志.2017；40(11):813-829)。根据2014 ERS/ATS指南及我国专家共识(Bel,E.H.；Sousa,A.；Fleming,L.,et al.,Diagnosis and definition of severe refractory asthma:aninternational consensus statement from the Innovative Medicine Initiative(IMI).Thorax 2011,66(10),910-7)，重症哮喘(severe asthma)是指在哮喘诊断明确的情况下，按照哮喘全球防治创议(GINA)建议的第4级或第5级治疗之后才能控制或在上述治疗下仍不能达到控制的哮喘患者，另外还要排除可能导致相似症状的慢性阻塞性肺疾病、支气管炎、肿瘤、间质性肺疾病、胃食管反流并等诸多疾病，与哮喘紧密联系的疾病如阿司匹林加重性呼吸系统疾病和变应性支气管肺曲霉病、影响哮喘严重程度的疾病如睡眠相关呼吸疾病、慢性鼻炎、胃食管反流和心脏疾病也需在诊断重症哮喘时被考虑在内。重症哮喘的发病机制与普通哮喘不同，重症哮喘表现出拥有更加复杂多样的炎症反应，中性粒细胞参与的程度更高，更严重的肺功能损失和气道重塑，其原因目前仍不完全明确。

糖皮质激素抵抗是重症哮喘的一个重要特征，糖皮质激素正常发挥作用时，被糖皮质激素激活的糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)被磷酸化为GR^ser211转运至核内，GR^ser211二聚体的DNA结合结构域与糖皮质激素应答元件(glucocorticoidresponse element,GRE)结合激活糖皮质激素效应基因促进抗炎基因的转录、抑制炎症基因的转录而发挥抗炎作用(Petta,I.；Dejager,L.；Ballegeer,M.,et al.,TheInteractome of the Glucocorticoid Receptor and Its Influence on the Actionsof Glucocorticoids in Combatting Inflammatory and InfectiousDiseases.Microbiology and molecular biology reviews:MMBR 2016,80(2),495-522)。目前重症哮喘对糖皮质激素抵抗的机制尚不明了，如何预测和恢复患者对糖皮质激素的敏感性始终是重症哮喘研究的一个难题和热点。

长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一组长度大于200个核苷酸、无蛋白质编码功能的RNA，虽然lncRNA不编码蛋白，但其参与诸多细胞的生理过程，目前lncRNA与支气管哮喘的研究并不多，与重症哮喘的研究更少(Li,X.；Wu,Z.；Fu,X.,et al.,lncRNAs:insights into their function and mechanics in underlyingdisorders.Mutation research.Reviews in mutation research2014,762,1-21)。GAS5作为生长抑制因子，在卵巢癌、非小细胞肺癌等多种肿瘤以及心肌凋亡中的作用研究较多，但与哮喘特别是重症哮喘的研究较少(Cao,Q.；Wang,N.；Qi,J.,et al.,Long noncodingRNAGAS5 acts as a tumor suppressor in bladder transitional cell carcinoma viaregulation of chemokine(CC motif)ligand 1expression.Molecular medicinereports 2016,13(1),27-34)。

目前还没有成熟的评估哮喘患者对糖皮质激素敏感性的方法和生物标志物，寻找能对糖皮质激素敏感性评估的生物标志物对重症哮喘患者的早期诊断、治疗有重要意义。基于以上阐述，本研究拟通过体内、外实验深入阐明GAS5在重症哮喘激素抵抗中的作用以及具体调控机制，验证其能否作为重症哮喘生物分子标志物。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供与重症哮喘相关的标志物，使用标志物可以准确的判断受试者是否患有重症哮喘，从而针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施，提高生活质量。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了检测样本中GAS5的试剂在制备诊断重症哮喘的产品中的应用。

本发明中的“样本”是包含细胞或细胞物质的可从中获取核酸、多肽、或其它分析物的样本。生物样本的示例非限定性地包括：尿、血液、血清、血浆、脑脊髓液、胸膜液、支气管灌洗、痰、腹腔液、膀胱冲洗、分泌物、口腔冲洗、拭子、分离细胞、组织样本、触碰准备物、以及细针穿刺物。优选的，所述样本为人血液。

进一步，所述试剂包括通过核酸测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术检测GAS5的试剂。

核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。

核酸测序技术的另一示例性非限制性实例包括下一代测序(深度测序/高通量测序)，高通量测序技术是一种基于单分子簇的边合成边测序技术，基于专有的可逆终止化学反应原理。测序时将基因组的DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面，这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在玻璃表面形成数以亿计的簇，每个簇是具有数千份相同模板的单分子簇，然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性的边合成边测序技术对待测的模板DNA进行测序。

本发明中的核酸杂交技术包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。DNA ISH可用于确定染色体的结构。RNA ISH用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mRNA和其他转录本(例如，ncRNA)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ISH也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。

将Southern和Northern印迹分别用于检测特异性DNA或RNA序列。使从样本中提取的DNA或RNA断裂，在基质凝胶上通过电泳分离，然后转移到膜滤器上。使滤器结合的DNA或RNA与和所关注的序列互补的标记探针杂交。检测结合到滤器的杂交探针。该程序的一种变化形式是反向Northern印迹，其中固定到膜的底物核酸为分离的DNA片段的集合，而探针是从组织提取并进行了标记的RNA。

本发明可在检测前或与检测同时地对核酸进行扩增。核酸扩增技术的示例性非限制性实例包括但不限于：聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。本领域的普通技术人员将认识到，某些扩增技术(例如，PCR)需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(例如，RT-PCR)，而其他扩增技术则直接扩增RNA(例如，TMA和NASBA)。

通常，PCR使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；RT-PCR则将逆转录酶(RT)用于从mRNA制备互补的DNA(cDNA)，然后将cDNA通过PCR扩增以产生DNA的多个拷贝；TMA在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝，TMA任选地包括使用阻断，部分、终止部分和其他修饰部分，以改善TMA过程的灵敏度和准确度；LCR使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸在热变性、杂交和连接的重复多个循环中通过DNA连接酶共价连接，以产生可检测的双链连接寡核苷酸产物；SDA使用以下步骤的多个循环：引物序列对与靶序列的相反链进行退火，在存在dNTPαS下进行引物延伸以产生双链半硫代磷酸化的(hemiphosphorothioated)引物延伸产物，半修饰的限制性内切酶识别位点进行的核酸内切酶介导的切刻，以及从切口3'端进行的聚合酶介导引的物延伸以置换现有链并产生供下一轮引物退火、切刻和链置换的链，从而引起产物的几何扩增。

本发明中非扩增或扩增的核酸可通过任何常规的手段检测。

进一步，所述试剂包括：

特异性识别GAS5的探针；或

特异性扩增GAS5的引物。

本发明中“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

作为探针，可以使用荧光标记、放射标记、生物素标记等对疾病检测用多核苷酸进行了标记的标记探针。多核苷酸的标记方法本身是公知的。可通过如下方法检查试样中是否存在受试核酸：固定受试核酸或者其扩增物，与标记探针进行杂交，洗涤，以及然后测定与固相结合的标记。备选地，还可固定疾病检测用多核苷酸，使受试核酸与其杂交，然后应用标记探针等检测结合于固相上的受试核酸。在这种情况下，结合于固相上的疾病检测用多核苷酸也称为探针。使用多核苷酸探针测定受试核酸的方法在本领域也是公知的。可以如下进行该方法：在缓冲液中使多核苷酸探针与受试核酸在Tm或者其附近(优选在±4℃以内)接触用于杂交，洗涤，然后测定杂交的标记探针或者与固相探针结合的模板核酸。

在作为探针使用的多核苷酸的大小优选为18个或更多个核苷酸、更优选为20个或更多个核苷酸，以及编码区域的全长或更少。作为引物使用时，该多核苷酸大小优选为18个或更多个核苷酸，以及50个或更少核苷酸。这些探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PN、LNA、ENA、GNA、TNA等人工核酸置换得到的多核苷酸。

本发明中的“引物”表示寡核苷酸，不管是在纯化的限制性消化物中天然存在还是合成产生，当置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下，即在存在核苷酸和诱导剂如DNA聚合酶并在合适温度和pH下时它能作为合成起点。引物可以是单链或双链，并且必须足够长以在诱导剂存在下引发合成预期的延伸产物。引物的确切长度依赖于很多因素，其中包括温度、引物来源和使用方法。例如，对于诊断应用，依赖于靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常含有15-25个或更多核苷酸，尽管它可以含有更少核苷酸。参与确定引物适当长度的因素对于本领域技术人员容易知道。

进一步，未施用糖皮质激素类药物时，与普通哮喘相比，GAS5在重症哮喘中显著上调。

进一步，施用糖皮质激素类药物后，GAS5在重症哮喘中显著下调。所述糖皮质激素类药物包括但不限于有泼尼松、甲泼尼松、倍他米松、丙酸倍氯米松、得宝松、泼尼松龙、氢化可的松、地塞米松。

进一步，施用糖皮质激素类药物的方式为收集样本后在体外施用。

在本发明的具体实施方案中，施用糖皮质激素类药物的方式为将糖皮质激素类药物加入从血液样本中分离的PBMC中。

在本发明的具体实施方案中，糖皮质激素类药物为地塞米松。

本发明提供了一种诊断重症哮喘的产品，所述产品包括检测样本中GAS5的试剂。

进一步，所述产品试剂包括：

特异性识别GAS5的探针；或

特异性扩增GAS5的引物。

进一步，所述产品还包括糖皮质激素类药物，所述糖皮质类激素药物包括但不限于有泼尼松、甲泼尼松、倍他米松、丙酸倍氯米松、得宝松、泼尼松龙、氢化可的松、地塞米松。

在本发明的具体实施方案中，所述糖皮质激素类药物为地塞米松。

本领域技术人员明白，本发明的一个发明点在于发现了糖皮质激素(施用地塞米松)体外干预后，重症哮喘的GAS5的表达显著下调，而普通哮喘的GAS5的表达显著上调。因此作为一种排除个体化差异的有效的诊断重症哮喘的产品，糖皮质激素类药物是不可或缺的。

进一步，所述产品包括芯片、试剂盒。

本发明的试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对疾病发展进行判断、对治疗方案进行选择。

试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。

本发明提供了一种重症哮喘的检测系统，包含：

1)用于测定样本中标志物GAS5特征值的工具；

2)比较样本中标志物特征值的工具；

3)数据存储介质。

本发明中的数据存储介质存储数据集合，术语“数据集合”指在物理上和/或逻辑上集合的数据集合。因此，数据集合可落实到单个数据存储介质中或彼此有效连接的物理上分离的数据存储介质中。优选地，数据集合落实到数据库中。因此，如此处所用的数据库包含在合适的存储介质上的数据集合。此外，数据库优选还包含数据库管理系统。数据库管理系统优选为基于因特网的分级数据库管理系统或面对对象数据库管理系统。此外，数据库可以是联合数据库或集成数据库。更优选地，数据库将落实为分布式(联合)系统，例如Client-Server-System。更优选地，构造数据库以允许搜索算法来比较试验数据组和包含数据集合的数据组。尤其是，通过使用此类算法，可以搜索数据库(即查询搜索)得到指示哮喘或其严重性的相似或相同数据组。因此，如果可以在数据集合中鉴定到相同的或相似的数据组，试验数据组将与哮喘或其严重性相关。结果，从数据集合中获得的信息可以基于从受试者获得的试验数据组用于诊断哮喘或其严重性。更优选地，数据集合包含任何一组包含的标志物的特征值，如普通哮喘和重症哮喘的特征数据，地塞米松施用前后的标志物的特征数据。

术语“数据存储介质”包括基于单个物理实体如CD、CD-ROM、硬盘、光存储介质或磁盘的数据存储介质或者云盘。此外，所述术语还包括由物理分离实体组成的数据存储介质，所述物理分离实体以提供上述数据集合的方式，优选以查询搜索的合适方式彼此有效连接。

本发明中的“系统”涉及彼此有效连接的不同工具。所述工具可落实到单个装置中或可以是彼此有效连接的物理上分离的装置。用于比较标志物特征值的工具优选基于用于比较的算法而进行运作。数据存储介质优选包含上述数据集合或数据库，其中存储数据组的每一组指示断哮喘或其严重性。因此，本发明的系统允许鉴定存储在数据存储介质中数据集合是否包含试验数据组。结果，本发明的系统可用作诊断哮喘或其严重性的诊断工具。

在系统的优选实施方案中，包含用于测定样品标志物特征值的工具。

术语“用于测定标志物特征值的工具”优选涉及用于测定标志物的如核酸扩增装置、核酸杂交装置。

本发明提供了一种判断重症哮喘的方法，通过检测GAS5的表达水平来诊断重症哮喘，作为一种优选的实施方案，当直接比较样本中的GAS5的表达水平时，若与普通哮喘相比，GAS5的表达水平显著上调，则受试者患有重症哮喘；作为更为优选的一种实施方案，当施用糖皮质激素类药物如地塞米松时，与施用前相比，若GAS5的表达水平显著下调，则受试者患有重症哮喘。

进一步，施用糖皮质激素类药物的方式为体外施用。

进一步，施用糖皮质激素类药物的方式为提取样本中的PBMC进行培养，然后加入糖皮质激素类药物。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了GAS5基因表达与重症哮喘相关，通过检测受试者中GAS5的表达水平，可以判断受试者是否患有重症哮喘。

本发明提供了一种诊断重症哮喘的新手段，与普通哮喘相比，当GAS5的表达水平显著上调时，受试者患有重症哮喘。

本发明提供了一种诊断重症哮喘的新手段，当糖皮质激素体外干预后，GAS5的表达水平显著下调时，受试者患有重症哮喘，采用该法进行诊断，解决了个体差异带来的问题。

附图说明

图1是体外地塞米松干预后PBMC中GAS5表达量的变化图，SA：重症哮喘；SA+D：重症哮喘地塞米松干预；MA：普通哮喘；MA+D：普通哮喘地塞米松干预；***：P<0.001。

图2是体外地塞米松干预后PBMC中GR^ser226表达水平的比较图。

图3是组小鼠肺组织中GAS5表达水平比较图；对照组：普通对照组小鼠；SA：重症哮喘哮喘组小鼠；SA+D：地塞米松组小鼠。***：P<0.001。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选与哮喘相关的基因标志物

1、研究对象

a.重症哮喘组：5例，重症哮喘的诊断标准根据我国2017版重症哮喘诊断与处理中国专家共识。具体入组标准为：①入组前1月内无哮喘急性加重；②近1月内无因哮喘住院治疗；③FEV1≥45％预计值，使用支气管扩张剂后FEV1≥55％预计值；④每天口服泼尼松龙剂量<20mg；⑤近一月内无上、下呼吸道感染；⑥非吸烟患者。

b.普通哮喘组：20例，哮喘的诊断标准根据我国2016版支气管哮喘防治指南。支气管舒张试验阳性(FEV1％增加>12％，且FEV1绝对值增加>200ml)，或支气管激发试验阳性，或呼气流量峰值(PEF)平均每日昼夜变异率>10％，或PEF周变异率>20％，普通哮喘患者为达不到上述重症标准的哮喘患者，吸烟者排除在外。

c.正常对照组：20例健康志愿者，无哮喘病史，无其他过敏性及免疫系统疾病等，非吸烟者。

以上三组研究对象在年龄及性别上匹配，所有受试者均需排除合并感染、肺栓塞、慢阻肺、肺结核、血液系统疾病、恶性肿瘤及肝脏功能异常等疾病，均进行血常规、肝功能、肾功能、血糖、血脂以及心电图等检查以排除基础疾病。

2、样本收集与PBMC分离

清晨空腹，室温下用肝素抗凝管抽取10ml外周血，立即使用Ficoll分离，在4℃条件下2000g离心15min，分离出的PBMC用PBS清洗两遍后在添加了10μl的植物凝集素的含10％血清的RPMI 1640培养基培养瓶中37℃、5％CO₂温箱培养24h，然后添加100nmol/L的地塞米松至培养瓶中培养24h。

3、支气管上皮细胞培养

购买人支气管上皮细胞株(16HBE，上海雅吉生物科技有限公司)，将细胞接种于6孔板中，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养，接种后的第1～4天每日换液，之后每2～3天换液，当细胞生长达到90％饱和度时传代。传代时，枪头吸出培养液，PBS洗涤2次，加入0.25％胰酶/EDTA 37℃消化约5min，在显微镜下见大部分细胞变圆悬浮脱壁后加入含血清的RPMI 1640培养基终止消化枪头反复吹打六孔板使细胞脱壁均匀悬浮，取细胞悬液离心机1000r/min离心10min，弃上清，用RPMI 1640培养基混悬细胞。

4、激素不敏感哮喘小鼠的模型建立

实验选用6周龄SPF级BALB/c雌性小鼠，每组8只动物。哮喘组：即OVA+LPS组，分别第1和第14天，在小鼠腹腔注射致敏液0.1mL(内含20μg OVA的PBS液+2.25mg氢氧化铝)，第28天起连续3天用1％OVA溶液超声雾化激发，每次20min，每天1次，第27天，经鼻滴10μg(60μL)LPS溶液；阳性对照组:即OVA+LPS+DXM组，OVA致敏、激发及LPS激发同造模组，在第29天和第30天给小鼠皮下注射地塞米松(5mg/kg/d)；正常对照组：用PBS致敏和激发。第31天(末次激发后24h)收集小鼠肺组织样本液氮中保存。

5、qRT-PCR检测GAS5的表达水平和相关基因的转录水平

用1ml Trizol试剂进行裂解，将上述Trizol裂解液转入EP管中，在室温15-30℃下放置5min；在上述EP管中，按照每1ml Trizol加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15s，在室温下(15-30℃)放置2-3min后，12000g(2-8℃)离心15min；去上层水相置于新EP管中，按照每1ml Trizol加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下(15-30℃)放置10min后，12000g(2-8℃)离心10min，弃上清；按照每1ml Trizol加1ml 75％乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g(2-8℃)离心5min，弃上清；让沉淀的RNA在室温在自然干燥；用Rnase-free water溶解RNA沉淀，RNA浓度测定用紫外分光光度计检测OD280和OD260进行RNA纯度测定；cDNA合成采用cDNA Synthesis Kit试剂盒(Vazyme)合成，参照商品化试剂盒说明书设置定量PCR实验的具体参数；使用qPCR SYBR Green Master Mix(Vazyme)制备PCRreaction mix(在冰上操作)，人(或小鼠)的扩增基因引物由吉玛基因设计合成，U6作为内参；将8联管进行短暂离心，确保所有反应液在反应孔底部，采用标准的三步法程序进行PCR反应后，进行熔解曲线分析；定量PCR数据分析。

6.Western blotting检测蛋白表达水平

细胞或肺组织在冰上用0.5ml缓冲液A(10mM HEPES pH 7.8,1mM DTT,10mM KCl,2mM MgCl₂，0.1M EDTA,0.2mM NaF,0.2mM Na₃VO₄,1％NP-40,0.4mM PMSF,1μg/ml亮抑酶肽)匀浆化处理30min。匀浆2000rpm，4℃，离心30s，以去除细胞碎片。上清液移入1.5ml冰上预冷的Eppendorf管，13000rpm，4℃，离心30s，收集上清液为胞质抽提物。沉淀物用200μl缓冲液C(50mM HEPES pH 7.8,50mM KCl,300mM NaCl,0.1M EDTA,1mM DTT,10％甘油,0.2mMNaF,0.2mM Na₃VO₄,0.6mM PMSF)再悬浮，冷室置于旋转器30min后，13000rpm，4℃，离心5min，收集上清液作为胞核抽提物。细胞或肺组织用RIPA缓冲液(50mmol/L Tris-HCl PH8.0,150mmol/L NaCl,1mmol/L EDTA,0.25％脱氧胆酸盐,1mM Na₃VO₄，1mM NaF，1μg/ml亮抑酶肽,1μg/ml抑肽酶，1mM PMSF)匀浆化处理，冰上孵育15min，4℃，微离心10min，上清液为全细胞裂解产物。细胞裂解产物中的蛋白含量用BCA法测定，10～20μg蛋白用5％SDS-PAGE电泳分离并转移至PVDF膜上，与快速封闭液(5％BSA，TBS，0.1％Tween-20，碧云天)室温孵育1h，然后在5％BSA的TBS中与抗GR^ser226等抗体(1:1000稀释)4℃摇床孵育过夜，充分洗脱后，继续与接有辣根过氧化物酶的二抗(1:4000稀释，2.5％BSA，PBS，0.1％Tween-20)37℃孵育1h。蛋白定量用ECL Plus(碧云天)检测，GAPDH作为管家蛋白。

7、数据分析

采用SPSS 21.0统计软件分析，计量资料采用Kolmogorov-Smirnov检验进行正态性检验，采用方差分析进行比较，各组均数间用q检验进行两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。

8、结果

1)体外地塞米松(100nmol/L)干预24h后，普通哮喘组PBMC中GAS5的表达水平明显升高，达20倍(P<0.001，n＝20)，而重症哮喘组下降达15倍(P<0.001，n＝5)，且重症哮喘组的GAS5的表达水平显著高于普通哮喘(图1)。GR^ser226水平，重症哮喘组较普通哮喘组和正常对照组明显升高，说明GAS5表达水平的变化与GR ^ser226相关(图2)。

2)地塞米松干预的重症哮喘小鼠肺组织中GAS5的表达水平较重症哮喘组和对照组显著下降(P<0.001，n＝8)(图3)。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.检测样本中GAS5的试剂在制备诊断重症哮喘的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术检测GAS5的试剂。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，与普通哮喘相比，GAS5在重症哮喘中显著上调。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，施用糖皮质激素类药物后，GAS5在重症哮喘中显著下调；优选地，施用糖皮质激素类药物的方式为体外施用；更为优选地，施用糖皮质激素类药物的方式为将糖皮质激素类药物加入到从血液样样本中分离的PBMC中。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述糖皮质激素类药物为地塞米松。

6.一种诊断重症哮喘的产品，其特征在于，所述产品包括检测样本中GAS5的试剂。

7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述产品试剂包括：

特异性识别GAS5的探针；或

特异性扩增GAS5的引物。

8.根据权利要求7所述的产品，其特征在于，所述产品还包括糖皮质激素类药物，优选的，所述糖皮质激素类药物为地塞米松。

9.根据权利要求7或8所述的产品，其特征在于，所述产品包括芯片、试剂盒。

10.一种重症哮喘的检测系统，其特征在于，包含：

1)用于测定样本中标志物GAS5特征值的工具；

2)比较样本中标志物特征值的工具；

3)数据存储介质。