CN105002182A - LncRNA-GAS5在制备青光眼诊断试剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了LncRNA-GAS5在制备青光眼诊断试剂中的应用以及一种青光眼病变的诊断试剂盒。本发明的通过高通量测序和定量PCR验证,发现LncRNA-GAS5与青光眼发生呈现显著地相关性。本发明可以用于临床青光眼病人的筛选,为青光眼的早期干预提供理论依据。
Description
技术领域
本发明属于医学领域和分子诊断领域,具体涉及LncRNA-GAS5在制备青光眼诊断试剂中的应用,以及一种青光眼LncRNA-GAS5诊断试剂盒,可根据个体的LncRNA-GAS5表达水平进行人类青光眼病变的诊断及病情发展的判断。
背景技术
青光眼是一种常见的眼科疾病,以眼压升高或波动较大、视神经萎缩和视野缺损为特征。青光眼目前是导致人类失明的三大致盲眼病之一,总人群发病率为1%,45岁以后为2%。患者早期并没有明显的症状,直至开始出现明显视野缺损时,方才检查出青光眼,但此时的视力损害已不可逆。目前,青光眼的治疗方式包括药物、激光和手术等,这些方法虽然可以降低眼内压,延缓青光眼疾病的发生,但是视神经萎缩和视野缺损很难被逆转。因此亟待对青光眼的发生进行早期诊断,寻找出新型无创的、高灵敏度和特异性的生物标志物。
长链非编码RNA(LncRNA)是一类转录本长度超过200nt的RNA分子,它们虽然不编码蛋白产物,但是可以在多个层面(表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等)调控基因的表达。它们可以调节许多生物学过程,包括细胞分化、增殖和凋亡,而且其LncRNA表达异常与众多人类疾病发生密切相关,包括癌症、心血管系统和神经系统等疾病。
生长阻滞特异转录物5(Growth arrest-specific tran-script 5,Gas5,NCBI ReferenceSequence:NR_002578.2)是哺乳动物细胞凋亡和生长的关键调控因子。Gas5通过模拟糖皮质激素应答元件来结合糖皮质激素受体(Glucocorticoid receptor)的DNA结合结构域,阻止糖皮质激素受体与糖皮质激素应答元件的相互作用,从而抑制下游基因的表达,促进细胞凋亡的发生。目前,尚无LncRNA-CAS5作为青光眼诊断的生物学标记物的报道。
发明内容
本发明目的在于提供了LncRNA-GAS5的新的用途,可作为诊断试剂用于青光眼病变的早期诊断。
本发明具体技术方案如下:
核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的LncRNA-GAS5在制备诊断制备青光眼病变诊断试剂中的应用,特别是青光眼的早期诊断。
本发明的另一个目的在于提供一种青光眼病变诊断的LncRNA-GAS5检测试剂盒,试剂盒包括RNA抽提体系、RNA反转录反应体系和PCR反应体系,其中PCR反应体系含有特异性扩增SEQ ID NO:1基因序列的引物序列。
上述检测试剂盒中RNA抽提体系包括总RNA提取试剂、RNA逆转录反应体系包括反转录酶、反转录体系缓冲液和RNA酶抑制剂;PCR反应体系包括扩增系统和引物系统,所述扩增系统由SYBR Premix Ex TaqTM试剂组成;所述引物系统包括RNA反转录随机引物和GAS5特异性的qRT-PCR的引物,其中,
RNA反转录随机引物为GAPDH和/或Beta-tubulin的定量PCR引物序列,
GAPDH定量PCR引物序列,上游引物序列如SEQ ID NO:2所示,下游引物序列如SEQ IDNO:3所示;
GAS5特异性的qRT-PCR的上游引物如SEQ ID NO:4所示,下游引物如SEQ ID NO:5所示;Beta-tubulin定量PCR引物序列,上游引物序列如SEQ ID NO:6所示,下游引物序列如SEQ ID NO:7所示。
上述的检测试剂盒,包括:
(a)抽提体系
1)Trizol reagent,1管,2000μL/管;
2)氯仿,1管,500μL/管;
3)无水乙醇,1管,8000μL/管;
4)DEPC ddH2O,1管,1000μL/管;
5)ddH2O,1管,2000μL/管;
6)异丙醇,8000μL/管;
(b)反转录体系
1)总RNA反转录引物(包括Oligo dT和Random6mers),1管,浓度:50μM,50μL/管;
2)反转录酶(200U/μL)50μL;
3)dNTP Mixture(10mM each)50μL;
4)反转录buffer 50μL;
(c)PCR体系
1)SYBR Premix Ex Taq酶;
2)buffer 100μL;
3)GAS5特异性qRT-PCR的上游引物,1管,10μM,100μL/管;
GAS5特异性qRT-PCR的下游引物,1管,10μM,100μL/管;
GAPDH定量PCR上游引物,1管,10μM,100μL/管;
GAPDH定量PCR下游引物,1管,10μM,100μL/管;
和/或,Beta-tubulin定量PCR上游引物,1管,10μM,100μL/管;
Beta-tubulin定量PCR下游引物,1管,10μM,100μL/管;
4)dNTP Mixture(10mM each)50μL。
本发明确定了LncRNA-GAS5表达量的改变,与青光眼的发生存在显著地相关性。LncRNA-GAS5可以作为青光眼早期诊疗的生物标记物,定期评估青光眼的进展和手术后的复发情况。
本发明中确定LncRNA-GAS5作为青光眼诊断的生物标记物包括如下步骤:
第一步:样本准备:眼科青光眼手术后小梁网样本(实验组,n=20)和外伤病人的小梁网样本(对照组,n=20),RNA采用TRIzol(Invitrogen)试剂提取,并保存于-80℃备用。
第二步:差异表达lncRNA筛选:采用美国Aglient公司的lncRNA表达谱芯片,分析青光眼疾病发生相关的lncRNA。分析具体步骤为:采用标记酶将荧光基团标记lncRNA,得到用于与芯片杂交的荧光探针,在标注条件下使用MAUI杂交仪和芯片杂交;使用GenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度,并将实验结果转换成数值型数据进行保存;采用Genespring GX软件分析找出青光眼发生相关的lncRNA分子;这时会筛选出一系列的差异表达lncRNA,然后结合GO和KEGG信号通路分析,结合TRANSFAC和catRAPID数据库,最终确定LncRNA-GAS5作为靶点用于后续的测定。
第三步:采用定量PCR验证芯片分析的实验结果;
第四步:验证靶点LncRNA-GAS5在青光眼病人、正常人和手术治疗青光眼病人血浆和血细胞内的表达差异。
本发明的另一目的在于提供LncRNA-GAS5反义核苷酸在制备治疗青光眼药物中的应用,反义核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。。
LncRNA-GAS5反义核苷酸与靶LncRNA-GAS5互补,抑制或封闭基因的转换和表达,或诱导Rnase H识别或切割LncRNA-GAS5,使其丧失功能,因此可以作为药物用于治疗青光眼。
本发明为青光眼疾病的早期诊断、预后判断和早期干预治疗提供重要的参考依据,具有较大的实际临床价值,可以用于筛选出青光眼疾病的高危人群和复发人群,以期及早进行干预和治疗,减少非高危复发病人不必要的治疗和医疗花费。
附图说明
图1为lncRNA芯片分析筛选青光眼发生相关的lncRNA(图A为箱线图分析芯片的质量,其中每7个样本混合构成一个生物学重复,消除个体差异;图B为散点图从整体上显示青光眼和非青光眼样本的lncRNA表达差异;图C为聚类图从整体角度,分析青光眼和非青光眼样本的lncRNA表达差异;图D为火山图筛选青光眼相关的lncRNA;图E为定量PCR验证芯片分析结果。
图2为定量PCR分析LncRNA-GAS5在青光眼病人和健康人房水的表达差异。
图3为定量PCR分析LncRNA-GAS5在青光眼病人和健康人玻璃体的表达差异。
图4为定量PCR分析LncRNA-GAS5在青光眼病人血浆和血细胞内的表达变化。
具体实施方式
以下通过实施例说明本发明的具体步骤,但不受实施例限制。
在本发明中所使用的术语,除非另有说明,一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解,这些实施例只是为了举例说明本发明,而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中,未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
实施例1LncRNA-GAS5与青光眼病变相关性验证
(1)lncRNA芯片分析筛选青光眼疾病有关的lncRNA并进行验证
第一步:样本准备:青光眼手术过程收集病变的组织小梁网(实验组,n=21)和正常外伤人的小梁网(对照组,n=21),总RNA采用TRIzol(Invitrogen)试剂提取,并保存于-80℃备用。
第二步:差异表达lncRNA筛选:
采用美国Aglient公司的lncRNA表达谱芯片,分析青光眼疾病发生相关的lncRNA;分析具体步骤为:采用标记酶将荧光基团标记lncRNA,得到用于与芯片杂交的荧光探针,在标注条件下使用MAUI杂交仪和芯片杂交;使用GenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度,并将实验结果转换成数值型数据进行保存;各个样本的分布如图1A所示;各个样本的lncRNA整体表达分布如图1B和图1C所示,表明青光眼和非青光眼病理样本之间存在显著地lncRNA表达差异;采用Genespring GX软件分析找出青光眼发生相关的lncRNA分子,这时会筛选出一系列的差异表达lncRNA(如图1D所示);
第三步:采用定量PCR验证芯片分析的实验结果(如图1E所示);然后结合GO和KEGG信号通路分析,根据t-test unequal unpaired算法,将P<0.05且差异倍数在2倍以上的lncRNA确定为差异表达LncRNA,结果表明LncRNA-GAS5在青光眼病人和正常小梁网内表达差异最大,故而推测GAS5与青光眼疾病具有较大的相关性。
第四步:
收集青光眼病人和其他非青光眼病人的房水和玻璃体的临床样本;采用Trizol试剂提取总RNA,通过反转录PCR的方法得到总RNA的cDNA;通过定量PCR的方法,检测靶点LncRNA-GAS5的表达水平(如图2-4所示),图2为定量PCR分析LncRNA-GAS5在青光眼病人和健康人房水的表达差异,结果表明GAS-5在青光眼病人房水中表达下调;图3为定量PCR分析LncRNA-GAS5在青光眼病人和健康人玻璃体的表达差异,结果表明GAS5在青光眼病人玻璃体中表达下调;图4为定量PCR分析LncRNA-GAS5在青光眼病人血浆和血细胞内的表达变化,结果表明GAS5在青光眼病人血细胞内表达下调。结果表明GAS5在青光眼病人的房水、玻璃体以及血液内表达显著地下降。
实施例2制备本发明的试剂盒
LncRNA-GAS5的序列如SEQ ID:NO:1所示,其特异性定量PCR上下游引物以及内参GAPDH和/或Beta-tubulin的定量PCR上下游引物,通过Primer 5设计,由Invitrogen公司负责引物合成,纯度为PAGE级,合成后的引物采用DEPC H2O溶解,总浓度为10μM。
制备包括以下组成成分的试剂盒:
抽提体系
1)Trizol reagent,1管,2000μL/管;
2)氯仿,1管,500μL/管;
3)无水乙醇,1管,8000μL/管;
4)DEPC ddH2O,1管,1000μL/管;
5)ddH2O,1管,2000μL/管;
6)异丙醇,8000μL/管;
反转录体系
1)总RNA反转录引物(包括Oligo dT和Random6mers),1管,浓度:50μM,50μL/管;
2)反转录酶(200U/μL)50μL;
3)dNTP Mixture(10mM each)50μL;
4)反转录buffer 50μL;
PCR体系
1)SYBR Premix Ex Taq酶;
2)buffer 100μL;
3)GAS5特异性的qRT-PCR上游引物(SEQ ID NO:4),1管,10μM,100μL/管;
GAS5特异性的qRT-PCR的下游引物(SEQ ID NO:5),1管,10μM,100μL/管;
GAPDH定量PCR上游引物(SEQ ID NO:2),1管,10μM,100μL/管;
GAPDH定量PCR下游引物(SEQ ID NO:3),1管,10μM,100μL/管;
和/或,Beta-tubulin定量PCR上游引物(SEQ ID NO:6),1管,10μM,100μL/管;
Beta-tubulin定量PCR下游引物(SEQ ID NO:7),1管,10μM,100μL/管;
4)dNTP Mixture(10mM each)50μL。
实施例3LncRNA-GAS5在房水、玻璃体、血细胞和血浆内的表达检测
血液样本:清晨空腹抽取静脉血5mL,加入含2%枸橼酸钠试管内,离心获得血浆和血细胞样本,离心条件为4℃,12,000rpm,10min。
房水标本:在术中打开前房或作眼球切开前,用1.0mL无菌一次性塑料注射器直接抽取前房水0.1mL,移入已经消毒1.0mL effendorf试管中低温保存。
玻璃体样本:在行标准三通道玻璃体切割时,不打开进水开关的情况下,于切割头开口处,直接抽取玻璃体0.3mL,移入已经消毒1.0mL effendorf试管中低温保存。
房水、玻璃体、血清及血浆样本的RNA提取
分别在分离的房水、玻璃体、血细胞和血浆样本中,加入TRIzol后室温放置10min,使样品充分裂解(注:如不进行下一步操作,样品可放入-70℃长期保存)。每1ml TRIzol加入200μl氯仿,剧烈振荡混匀后室温放置3-5min使其自然分相。4℃12,000rpm离心15min。样品会分成三层:黄色的有机相,中间层和无色的水相,RNA主要在水相中,把水相转移到新管中。在上清中加入等体积冰冷的异丙醇,室温放置15min。4℃12,000rpm离心10min,弃上清,RNA沉淀于管底。RNA沉淀中加入1ml 75%乙醇(用RNase-free水配制),温和振荡离心管,悬浮沉淀。每1ml TRIzol加入1ml 75%乙醇。4℃8,000rpm离心5min,弃上清。室温放置晾干后,在沉淀内加入50μl RNase-free水,以充分溶解RNA,-70℃保存。
RNA质量检测
在260nm和280nm吸光度处,采用紫外分光光度计测定RNA的浓度;RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度,比值范围1.8到2.1。同时,结合琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量,紫外透射光下观察并拍照。
RNA逆转录获得cDNA样本
逆转录采用用TaKaRa公司PrimeScriptTM RT reagent Kit,按照试剂盒提供的体系(20μl)分别加入:
将以上体系置于无Rnase的0.2μl EP管中,按下面程序反转为cDNA:37℃15min,85℃5sec,得到的cDNA放于-20℃中保存。
实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR反应体系(50μl),配置如下:SYBR Green Mix 25μl,GAS5特异性的qRT-PCR的上游引物、GAS5特异性的qRT-PCR下游引物、GAPDH定量PCR上游引物、GAPDH定量PCR下游引物各1μl,和/或Beta-tubulin定量PCR上游引物、Beta-tubulin定量PCR下游引物各1μl,dNTP 2μl,待测样品cDNA 2μl,ddH2O 19μl。
PCR条件:
92℃5min,(92℃30s;58℃30s;72℃30s 40个循环),72℃5min。
数据分析
基因表达值用Delta Ct的方法计算,假设目的和参照基因扩增效率都接近100%且相对偏差不超过1Ct;ΔCt=目的基因Ct均数-参照基因Ct均数;其中参照基因选择GAPDH和/或Beta-tubulin;分别确定健康人和青光眼病人的ΔCt范围。
结果判断
计算出待测样本的ΔCt,分析其是否在健康人的正常范围内,若待测样本的ΔCt在健康人的ΔCt范围内,或者小于该ΔCt范围,认为待测样本为青光眼阴性;若待测样本ΔCt大于健康人ΔCt的范围,认为其为青光眼阳性。健康人的ΔCt范围如表1所示。
表1:健康人的ΔCt范围
GAS5Ct均数-GAPDH Ct均数 | GAS5Ct均数-Beta-tubulin Ct均数 | |
房水样本 | 10.5-13.3 | 11.6-12.9 |
玻璃体样本 | 7.4-8.8 | 6.5-8.2 |
血细胞样本 | 4.8-7.2 | 6.9-9.1 |
根据上述结果,同时对照实际临床病理分析诊断的结果,分别选取30例未知的临床样本,评价基于GAS5的方法检测的准确率,结果如表2所示。结果表明LncRNA-GAS5可作为青光眼诊断的生物学标记物用于青光眼病变的诊断。
表2:基于GAS5的方法检测的准确率
GAS5Ct均数-GAPDH Ct均数 | GAS5Ct均数-Beta-tubulin Ct均数 | |
房水样本 | 81.40% | 78.20% |
玻璃体样本 | 76.30% | 68.40% |
血细胞样本 | 76.20% | 77.15% |
Claims (6)
1.核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的LncRNA-GAS5在制备青光眼诊断试剂中的应用。
2.一种青光眼LncRNA-GAS5诊断试剂盒,其特征在于试剂盒包括RNA抽提体系、RNA反转录反应体系和PCR反应体系,其中PCR反应体系含有特异性扩增如权利要求1所述SEQ ID NO:1基因序列的引物序列。
3.如权利要求2所述的诊断试剂盒,其特征在于所述引物序列为GAS5特异性的qRT-PCR的上下游引物。
4.如权利要求2所述的检测试剂盒,其特征在于所述RNA抽提体系,包括RNA抽提试剂;RNA逆转录反应体系包括反转录酶、反转录体系缓冲液和RNA酶抑制剂;PCR反应体系包括扩增系统和引物系统,所述扩增系统为SYBR Premix Ex TaqTM试剂;所述引物系统包括RNA反转录随机引物和GAS5特异性的qRT-PCR的引物,其中,
RNA反转录随机引物为GAPDH和/或Beta-tubulin的定量PCR引物序列,
GAPDH定量PCR引物序列,上游引物序列如SEQ ID NO:2所示,下游引物序列如SEQ IDNO:3所示;
GAS5特异性的qRT-PCR的上游引物如SEQ ID NO:4所示,下游引物如SEQ ID NO:5所示;
Beta-tubulin定量PCR引物序列,上游引物序列如SEQ ID NO:6所示,下游引物序列如SEQID NO:7所示。
5.如权利要求4所述的检测试剂盒,其特征在于,该试剂盒包括:
(a)抽提体系
1)Trizol reagent,1管,2000μL/管;
2)氯仿,1管,500μL/管;
3)无水乙醇,1管,8000μL/管;
4)DEPC ddH2O,1管,1000μL/管;
5)ddH2O,1管,2000μL/管;
6)异丙醇,8000μL/管;
(b)反转录体系
1)总RNA反转录引物(包括Oligo dT和Random 6 mers),1管,浓度:50μM,50μL/管;
2)反转录酶(200U/μL)50μL;
3)dNTP Mixture(10mM each)50μL;
4)反转录buffer 50μL;
(c)PCR体系
1)SYBR Premix Ex Taq酶;
2)buffer 100μL;
3)GAS5特异性qRT-PCR的上游引物,1管,10μM,100μL/管;
GAS5特异性qRT-PCR的下游引物,1管,10μM,100μL/管;
GAPDH定量PCR上游引物,1管,10μM,100μL/管;
GAPDH定量PCR下游引物,1管,10μM,100μL/管;
和/或,Beta-tubulin定量PCR上游引物,1管,10μM,100μL/管;
Beta-tubulin定量PCR下游引物,1管,10μM,100μL/管;
4)dNTP Mixture(10mM each)50μL。
6.如权利要求1所述的LncRNA-GAS5反义核苷酸在制备治疗青光眼药物中的应用,其反义核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
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