CN108396061A - 一种诊断／治疗早产的试剂 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种诊断早产的试剂，以及治疗早产的药物。本申请涉及GAS5在早产及正常子宫组织中的差异表达。

Description

一种诊断/治疗早产的试剂
技术领域
本发明属于生物检测领域，特别涉及长非编码GAS5在诊断及制备治疗早产药物的应用。
背景技术
人类妊娠是一个精密调节的程序，妊娠期子宫保持静息状态以确保胎儿宫内生长发育，在某一时间点出现分娩发动，主要表现为子宫规律收缩，即临产。临产时间点的调控机制正是研究分娩发动的关键问题[1]，子宫肌收缩是研究分娩发动机制的重要研究对象。子宫肌收缩调控机制异常导致临产时间点提前或滞后出现，导致分娩时限异常，即临床上称早产或过期产,尤其是早产危害最大，约占总妊娠10-12％，新生儿易罹患神经系统、代谢系统、呼吸系统疾病，对家庭及社会产生极大精神及经济负担[2]。
分娩发动机制研究有助于揭示早产分娩提前发动的原因，对预防及治疗早产有非常重要的指导意义。子宫收缩是影响阴道分娩的主要因素，亦是分娩发动机制的重要研究对象。影响子宫收缩力的机制主要包括内分泌机制[3]、炎症机制[4]、免疫机制[5]等，其中内分泌机制中的“功能性孕激素撤退机制”广受研究者们关注[6]，即分娩发动时子宫肌细胞内孕激素受体(PR)表达类型改变，由PR-B表达为主转变为以PR-A表达为主，影响收缩相关基因[7](包括前列腺素合成酶COX-2、缩宫素受体OTR、连接蛋白Connexin43等)及炎症因子基因[8](白介素-1、肿瘤坏死因子-a等)的表达调控，也可参与免疫机制调控[9]，将分娩发动诸多机制有机结合。因此，PR-A表达调控是研究分娩发动中子宫肌收缩机制的关键。
1956年Csapo首次提出“孕激素撤退”参与羊分娩发动机制，1996年Karalis提出“功能性孕激素撤退”参与人分娩发动机制[3]，且在诸多妊娠组织，包括胎盘、蜕膜、子宫肌等中均存在此机制[4,5]，即分娩发动时妊娠组织中孕激素受体(PR)表达类型改变，由PR-B表达转变为以PR-A表达为主，启动分娩信号。研究发现，与PR-B的功能不同，PR-A表达影响收缩相关基因(包括前列腺素合成酶COX-2、缩宫素受体OTR、连接蛋白Connexin43等)及炎症因子(肿瘤坏死因子TNF-a，白介素等)表达[6,7]，直接或间接参与子宫肌收缩调控，启动分娩信号。本研究组一直致力于PR-A调控机制研究，前期报道分娩发动时核转录因子NF-KB在转录水平影响PR-A表达，影响下游收缩相关基因表达，PR-A对收缩基因的表达调控发生在细胞核内[8]，然而关于PR-A如何进入细胞核的调控机制目前仍知之甚少。
近年来，文献报道长链非编码RNA s(LncRNAs)参与妊娠过程、肌细胞发育、肿瘤等众多生理病理过程[9-12]，2013年本研究组也报道LncRNAs参与人类子痫前期疾病发生发展过程[13]。LncRNA指长度在200-100000nt之间，无或很少有编码蛋白功能的RNA分子，在多层面上(表观遗传学、转录以及转录后水平等)调控基因表达，调控细胞生物学功能[14]。
鉴于LncRNA在平滑肌发育过程中的作用报道及本研究组以往研究基础，我们推测LncRNAs在子宫平滑肌细胞收缩机制中可能也存在不容小觑的调控作用。为此，在南京医科大学博士创新工程基金(项目号：JX22013291)资助下进行了以下研究：1.对未临产/临产子宫下段肌组织(各3例)行LncRNA芯片检测，结果发现临产组子宫肌组织中有160个LncRNAs出现5倍以上上调，505个LncRNAs出现5倍以上下调；2.继续筛选具有生物学功能的LncRNA，通过阅读有关文献，最终筛选出7个表达显著差异且文献已知的LncRNAs,包括表达上调的CUDR[15](urothelial cancer associated 1,Gene ID:652995)、PANDAR[16](promoter ofCDKN1A antisense DNA damage activated RNA,Gene ID:101154753)等，表达下调的GAS5[17](growth arrest-specific 5,Gene ID:60674)、NAG7[18](long intergenic non-protein coding RNA312,Gene ID:29931)等；3.在未临产/临产子宫下段肌组织(各20例)中，对以上7个LncRNAs行real-time PCR检测，发现GAS5在临产子宫肌中表达约6.67倍下调，表达差异最显著，与芯片结果基本一致。4.GAS5在临产的18例子宫下段肌组织中稳定6.67倍低表达，仅在两例中表达稍高。因此GAS5在子宫收缩中的机制研究引起了本研究组的极大关注。
Tomoshige等人报道GAS5通过竞争性结合糖皮质激素受体(glucocorticoidreceptor，GR)的DNA结合区，参与结肠腺癌细胞凋亡、侵袭调控机制[15]。而PR蛋白的一级结构与GR类似，因此长链非编码RNAGAS5是否也能通过竞争性结合PR-A，参与调控细胞核内再定位而发挥转录调控作用，影响下游子宫收缩基因表达？
GAS5在分娩发动中的作用机制目前尚未见报道，前期根据预实验结果及文献报道，本研究组提出假设：分娩发动时子宫肌细胞中GAS5低表达，其与PR-A的竞争性结合能力降低，致更多PR-A进入细胞核，促进下游收缩相关基因表达，参与分娩发动(见图1)。
发明内容
技术目的
本发明的目的是提供GAS5在诊断早产及在制备治疗早产中的应用。
本发明涉及一种长链非编码RNA GAS5，及其检测试剂，抑制试剂等。
还涉及诊断GAS5的试剂在制备诊断早产的试剂中的应用。
还涉及抑制GAS5的试剂在制备治疗早产药物中的应用。
还涉及一组引物，其具体序列如序列1,2所示。
还涉及一组干扰GAS5的siRNA,如序列3、4或5、6或7、8所示。
还涉及一种试剂盒，包括权利要求3所述引物。
还涉及所述的siRNA在制备治疗早产药物中的应用。
还包括GAS5的药物组合组在制备分娩发动药物中的应用。
所述包括GAS5的组合物在制备治疗早产药物中的应用。
所述药物组合物，其中还包括辅料。辅料包括：(lip2000,Opti-mem培养液,PBS磷酸缓冲盐溶液)
所述试剂盒，所述引物中的浓度分别为10mol/L。
技术方案
1.子宫下段肌组织标本(临产组及未临产组各20例)，验证GAS5RNA、PR-A蛋白及下游收缩基因表达差异；2.GAS5对子宫肌细胞收缩功能的影响:分离培养人原代子宫肌细胞，过表达及干扰GAS5，检测肌细胞收缩功能(包括：基质胶试验观察细胞收缩情况、激光共聚焦检测游离Ca2+强度及24小时实时观测子宫肌细胞收缩)。3.GAS5通过对PR-A的竞争性结合参与影响PR-A核内再定位，参与分娩发动：通过RNA免疫共沉淀法(RIP)检测子宫肌细胞中GAS5是否与PR-A结合；在人原代子宫肌细胞水平实现GAS5过表达及封闭，检测核内PR-A蛋白表达差异，验证GAS5是否能影响PR-A蛋白入核，同时检测下游收缩相关基因表达差异，包括：COX-2、ZEB1、ZEB2及Connexin43等。
转染过程所需的各种试剂，
(1)lip2000，一种多用途的脂质体转染试剂，适用于DNA、RNA和寡核苷酸的转染，对大多数真核细胞具有很高的转染效率。其独特的配方使其可直接加入培养基中，血清的存在不会影响转染效率，进而将PVT1干扰序列转进到细胞内。
(2)Opti-mem培养液，含HEPES，2400mg/l碳酸氢钠，次黄嘌呤，胸腺嘧啶，丙酮酸钠，L-谷氨酰胺，微量元素，生长因子，以及减量至1.1mg/l的酚红，作为转染试剂的辅料，其本身对细胞无任何害处，而更好更有效的转进细胞中，以获得预期目的。
(3)PBS磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline)一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用。它是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液，主要成分为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl，由于Na2HPO4和KH2PO4它们有二级解离，缓冲的pH值范围很广；而NaCl和KCl主要作用为增加盐离子浓度。排除其本身对实验对象的影响。
组织收集
我们收集了20对2010年至2015年在江苏省人民医院，江苏省妇幼保健院接受剖宫产手术，诊断患有子痫前期的孕妇胎盘组织和不含有任何基础疾病的正常孕妇胎盘组织。并记录临床的特点：包括孕妇年龄，有无吸烟史，孕周数，收缩压，舒张压以，蛋白尿以及胎儿体重。组织样本收集的均为第一时间液氮或储存在-80℃,直至RNA提取。该研究经过南京医科大学伦理委员会批准。获得所有病人的书面知情同意。
子宫平滑肌原代细胞的培养
手术台上取下的新鲜子宫下段肌组织，速置入含200u/ml青霉素、250u/ml链霉素的生理盐水中。于超净工作台内将子宫肌用已过滤的D-Hanks液冲洗干净。剔除外层浆膜层，纵向剪开，刀片轻轻括去内膜，将中间平滑肌层冲洗数次，放入一无菌小烧杯中，滴少许DMEM/F12培养液。用眼科剪将平滑肌剪成约2-3mm3大小的小块，采用酶消化后组织贴块法：将组织块移入离心管，加入0.2％胰酶0.02％EDTA混合消化液，37℃作用20min，1000r/min，离心5min，弃上清，重复3次。加入完全培养液(刚浸润组织块即可)，吹散，用巴氏吸管将组织小块均匀铺入培养瓶内，并直立培养瓶,加入4ml上述培养液,放入37℃恒温培养箱内(5％CO2，37℃恒温，湿度在95-100％)，干涸4-6h后，将培养瓶轻轻放平，静置培养，3天后换新鲜培养液，待细胞融合成片时即可传代。
传代培养
倒弃旧培养液，加入0.2％胰蛋白酶及0.02％EDTA混合液约1ml，轻轻摇晃，使其流遍瓶底，中和残余培养液中的血清。倒掉再加入2ml混合消化液，消化50-90s。镜下观察可见细胞稍收缩变圆，细胞间隙增宽，甚至脱落下来，即加入2倍消化液体积的完全培养液终止消化。用巴氏吸管将细胞从瓶壁轻轻吹打下来，移入离心管，离心，重悬，细胞计数，将细胞密度调整成2-3×105/m1，接种于新的培养瓶中。每3d换液1次，待细胞长至融合状态后又可传代。
免疫细胞化学鉴定
A.制备细胞爬片：将细胞制成细胞悬液，接种到放置多聚赖氨酸包被过的盖玻片的培养板中，密度为5×105个/ml，48小时后换液继续培养，待细胞长成单层后丙酮固定30min，室温保存备用。B：a-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体(a-SMActin)的表达观察：将细胞爬片用鼠抗人a-SMActin 4℃孵育过夜，并设空白对照组，次日二抗孵育。C.荧光显微镜下观察染色。
RNA提取和定量PCR分析
根据试剂的使用说明，用Trizol试剂分离总RNA。逆转录反应应用TaKaRa PrimeScript试剂盒(TaKaRa,大连,中国)。逆转录试剂盒对1μg总RNA进行逆转录，最终体积为20μl。结果分析：分析引物的特异性及扩增效率，根据溶解曲线判断引物的反应特异性。根据扩增曲线得到Ct值，采用相对量法与内参GAPDH进行目的基因相对表达量的分析。GAS5的引物如下(序列1和2)：GAS5Sense AGTTGTGTCCCCAAGGAAGG
Anti-sense CGTTACCAGGAGCAGAACCAT
RNA免疫共沉淀法(RIP)检测
通过RNA免疫共沉淀法(RIP)检测GAS5与PR-A蛋白是否相结合；通过RNA免疫共沉淀法(RIP)检测GAS5与PR-A的结合：由组织裂解液免疫沉淀RNP复合物；提取裂解液中的小分子RNA；用γ-32PATP标记RNA5'端，然后使用15％聚丙烯酰胺尿素变性胶进行电泳分离检测；将得到RNA进行Solexa高通量测序。
质粒构建
合成人全长PVT1cDNA，并将其插入真核表达载体pCDNA 3.1中，构建GAS5过表达载体质粒，随后将上述质粒转化大肠杆菌，摇菌、培养、挑选单克隆菌培养扩增。
蛋白质免疫印迹(Westblotting)
将变性好的细胞蛋白裂解产物加入至预先制好的10％变性聚丙烯酰氨凝胶(SDS-PAGE)的加样孔中，分离样本中蛋白。随后转至NC膜，并以特异性抗体孵育。最后用ECL发光液压片曝光。GAPDH抗体为对照，TP53INP1抗体购自CST公司，ANGPTL4抗体购自Proteintech公司。
数据处理
实验数据皆用SPSS17.0软件分析，以三次实验的平均值±标准误表示，组间差异用双尾Student’s T检验、秩和检验和卡方检验。单因素分析中p<0.05的随后再使用多因素分析。
附图说明
图1长链非编码RNA GAS5竞争性结合PR-A影响下游收缩基因表达示意图；
图2子宫下段肌组织标本(临产组及未临产组)差异表达验证图；
图3.原代子宫肌细胞a-SMActin免疫荧光染色表达鉴定。左图40倍视野下，绿色是a-SMActin染色，蓝色是DAPI核染。右图为放大100倍下的单个肌细胞的a-SMActin免疫荧光染色；
图4.24小时活细胞工作站检测显微镜实时观测发现干扰GAS5的肌细胞收缩功能明显加强；
图5孔板基质胶收缩实验中发现干扰GAS5组肌细胞组，基质胶面积明显缩小，提示干扰GAS5的肌细胞收缩功能明显加强；
图6激光共聚焦实验结果提示：干扰GAS5组肌细胞组的Ca 2+荧光明显增强；
图7.RNA免疫共沉淀法(RIP)检测：GAS5可以与PR-A蛋白相结合；
图8.GAS5干扰后，细胞核内PR-A蛋白表达量明显高于过表达组，同时细胞内cox-2、Connexin43及ZEB1、2mRNA均降低，明显低于过表达组。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述，但不限制本发明。
实施例中末注明具体条件的的实验方法，基本上都按照Sambrook，J等人编著的《分子克隆实验指南(第3版)》(MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded.黄培堂等译，科学出版社.2002.8)中所述的条件及方法或按照材料提供商所建议的条件及方法进行，其它没有详细描述的技术相应于本领域人员来说是熟知的标准方法。
本发明的材料：本申请中提及的细胞株以及培养基均有商品供应或以别的途径能为公众所得，它们仅作举例，对本发明不是唯一的，可分别用其它适合的工具和生物材料来代替。
本技术方案将通过以下一系列实验验证以上调控机制：1.子宫下段肌组织标本(临产组及未临产组各20例)，验证GAS5RNA、PR-A蛋白及下游收缩基因表达差异；2.GAS5对子宫肌细胞收缩功能的影响:分离培养人原代子宫肌细胞，过表达及干扰GAS5，检测肌细胞收缩功能(包括：基质胶试验观察细胞收缩情况、激光共聚焦检测游离Ca2+强度及24小时实时观测子宫肌细胞收缩)。3.GAS5通过对PR-A的竞争性结合参与影响PR-A核内再定位，参与分娩发动：通过RNA免疫共沉淀法(RIP)检测子宫肌细胞中GAS5是否与PR-A结合；在人原代子宫肌细胞水平实现GAS5过表达及封闭，检测核内PR-A蛋白表达差异，验证GAS5是否能影响PR-A蛋白入核，同时检测下游收缩相关基因表达差异，包括：COX-2、ZEB1、ZEB2及Connexin43等。
实施例1
子宫下段肌组织标本(临产组及未临产组)差异表达验证
1.1研究方案：选取20对子宫下段肌组织，检测GAS5、核内PR-A蛋白表达量、及下游收缩基因表达差异(包括Cox-2、Connexin43、ZEB1、ZEB2等)。
1.2研究方法:qRT-PCR检测GAS5表达量及cox-2、Connexin43及ZEB1及ZEB2mRNA表达量，western blot检测组织胞核内PR-A蛋白表达量。
1.3研究过程：
1.3.1子宫组织组织标本库的建立：2010年10月始，选取在江苏省人民医院住院剖宫产分娩的单胎足月常规产检无并发症孕妇，并签署知情同意书。实验分为两组：临产组：宫口扩张>3cm,有规律宫缩，但因胎儿窘迫试产失败行剖宫产术分娩者；未临产组：为未临产组选择无宫缩孕妇，因头盆不称、巨大儿等因素行剖宫产者。两组均在胎盘娩出后，剪取子宫切口下缘的子宫下段肌组织，大小约2cm*1cm，置于生理盐水中冲洗至发白以去除血液干扰，立即放置液氮中保存。
1.3.2 LncRNA芯片检测：从标本库中取出3对未临产/临产子宫下段肌组织，行LncRNA芯片检测，(博奥生物有限公司，生物芯片北京国家工程研究中心)，找出差异表达的LncRNAs。
1.3.3 GAS5表达量与核内PR-A表达量相关性：从标本库中取出40个临产子宫下段肌组织标本，扩大样本检测行qRT-PCR定量检测GAS5RNA相对表达量(引物序列如序列1-2所示)，Western blot检测PR-A蛋白表达量，通过相关性分析研究二者的相关关系。
1.3.4 cox-2、Connexin43及ZEB1、2基因表达检测：在以上组织中检测real-timePCR检测下游收缩基因表达差异(包括cox-2、Connexin43及ZEB1、2)。
1.4研究结果：结果提示GAS5在临产组中表达是未临产组的0.35倍，临产组的细胞核内PR-A表达量是对照组的8.57倍，GAS5与核内PR-A的表达呈负相关。临产组cox-2、Connexin43、ZEB1及ZEB2mRNA表达量分别未临产组的3.12、2.86、3.53及2.91倍(见图2)。
实施例2
GAS5对子宫肌细胞收缩功能的影响:
2.1研究方案：分离、鉴定及培养人原代子宫肌细胞；在人原代子宫肌细胞水平实现GAS5过表达及干扰，检测子宫肌细胞收缩功能(包括：24小时活细胞工作站实时观测细胞收缩功能，基质胶试验观察细胞收缩情况，游离Ca2+浓度等)；
2.2研究方法:分离培养原代子宫肌细胞，免疫荧光法使用a-SMActin对分离细胞进行鉴定；设计GAS5过表达及干扰序列，在原代子宫肌细胞水平，实现GAS5干扰及过表达,测定转染效率；检测肌细胞收缩功能：24小时活细胞工作站显微镜观察肌细胞收缩功能；96孔板基质胶收缩实验观测肌细胞收缩功能；激光共聚焦实验检测钙离子荧光强度。
2.3研究过程：
2.3.1原代细胞分离培养；
2.3.1.1子宫平滑肌原代细胞的培养：手术台上取下的新鲜子宫下段肌组织，速置入含200u/ml青霉素、250u/ml链霉素的生理盐水中。于超净工作台内将子宫肌用已过滤的D-Hanks液冲洗干净。剔除外层浆膜层，纵向剪开，刀片轻轻括去内膜，将中间平滑肌层冲洗数次，放入一无菌小烧杯中，滴少许DMEM/F12培养液。用眼科剪将平滑肌剪成约2-3mm3大小的小块，采用酶消化后组织贴块法：将组织块移入离心管，加入0.2％胰酶0.02％EDTA混合消化液，37℃作用20min，1000r/min，离心5min，弃上清，重复3次。加入完全培养液(刚浸润组织块即可)，吹散，用巴氏吸管将组织小块均匀铺入培养瓶内，并直立培养瓶,加入4ml上述培养液,放入37℃恒温培养箱内(5％CO2，37℃恒温，湿度在95-100％)，干涸4-6h后，将培养瓶轻轻放平，静置培养，3天后换新鲜培养液，待细胞融合成片时即可传代。
2.3.1.2传代培养：倒弃旧培养液，加入0.2％胰蛋白酶及0.02％EDTA混合液约1ml，轻轻摇晃，使其流遍瓶底，中和残余培养液中的血清。倒掉再加入2ml混合消化液，消化50-90s。镜下观察可见细胞稍收缩变圆，细胞间隙增宽，甚至脱落下来，即加入2倍消化液体积的完全培养液终止消化。用巴氏吸管将细胞从瓶壁轻轻吹打下来，移入离心管，离心，重悬，细胞计数，将细胞密度调整成2-3×105/m1，接种于新的培养瓶中。每3d换液1次，待细胞长至融合状态后又可传代。
2.3.1.3免疫细胞化学鉴定：A.制备细胞爬片：将细胞制成细胞悬液，接种到放置多聚赖氨酸包被过的盖玻片的培养板中，密度为5×105个/ml，48小时后换液继续培养，待细胞长成单层后丙酮固定30min，室温保存备用。B：a-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体(a-SMActin)的表达观察：将细胞爬片用鼠抗人a-SMActin 4℃孵育过夜，并设空白对照组，次日二抗孵育。C.荧光显微镜下观察染色。
2.3.2干扰及过表达GAS5：分别合成针对GAS5的siRNA及过表达质粒p-GAS5-EGFP，转染原代子宫肌细胞，验证转染效率。
合成GAS5siRNA序列如下:
第一组：CAGAAAGCUGGAAGUUGAAAUGGUG(序列3)
Anti sense:CACCAUUUCAACUUCCAGCUUUCUG(序列4)
第二组：UAUCCAUGGAUGACUUGCUUGGGUA(序列5)
Anti sense:UACCCAAGCAAGUCAUCCAUGGAUA(序列6)
第三组：GCAAAGGACUCAGAAUUCAUGAUUG(序列7)
Anti sense:CAAUCAUGAAUUCUGAGUCCUUUGC(序列8)
将人全长GAS5cDNA全长序列正向插入真核表达载体pEGFP-N3(购自美国Clontech公司)，重组表达载体称为pEGFP-GAS5，将三组干扰序列分别克隆到pSilencer4.1-CMVneo干扰表达载体中(购自美国Invitrogen公司)，实现SPRY4-IT1过表达和封闭，分别转染HTR-8/SVneo细胞，qRT-PCR检测转染前后子宫原代平滑肌细胞GAS5表达量。干扰序列干扰效果数据结果相差不多，平均化数据后得到图中结果。
2.3.3检测肌细胞收缩功能：子宫平滑肌原代细胞实现GAS5过表达和封闭后，检测子宫肌细胞收缩功能，包括：胶孔试验观察细胞收缩情况；特异性Ca2+荧光批示剂Fluo-3/AM负载细胞，激光共聚焦显微镜检测游离Ca2+浓度和细胞收缩率；检测细胞COX-2、CX43及ZEB1、2基因及蛋白表达。
2.4研究结果：在24小时活细胞工作站检测显微镜实时观测发现干扰GAS5的肌细胞收缩功能明显加强；96孔板基质胶收缩实验中发现干扰GAS5组肌细胞组，基质胶面积明显缩小，提示干扰GAS5的肌细胞收缩功能明显加强；激光共聚焦实验结果提示：干扰GAS5组肌细胞组的Ca 2+荧光明显增强，提示干扰GAS5促进肌细胞收缩。收缩实验结果：干扰原代肌细胞GAS5后，子宫肌细胞收缩能力明显加强，GAS5低表达与子宫肌细胞收缩密切相关。(图3、图4、图5、图6)
实施例3
3 GAS5通过对PR‐A的竞争性结合，影响PR‐A核内定位：
3.1研究方案：及培养人原代子宫肌细胞；检测GAS5与PR-A蛋白是否结合；过表达及干扰GAS5后检测细胞核内PR-A蛋白表达；
3.2研究方法:培养原代子宫肌细胞；原代肌细胞水平GAS5过表达及干扰后，western blot检测细胞核内PR-A蛋白表达以及qRT-PCR检测收缩基因表达差异(包括cox-2、Connexin43、ZEB1及ZEB2)。
3.3研究过程：
3.3.1原代细胞培养；步骤同前。
3.3.2 RNA免疫共沉淀法(RIP)检测：通过RNA免疫共沉淀法(RIP)检测GAS5与PR-A蛋白是否相结合；通过RNA免疫共沉淀法(RIP)检测GAS5与PR-A的结合：由组织裂解液免疫沉淀RNP复合物；提取裂解液中的小分子RNA；用γ-32PATP标记RNA5'端，然后使用15％聚丙烯酰胺尿素变性胶进行电泳分离检测；将得到RNA进行Solexa高通量测序。
3.3.3检测PR-A蛋白、GAS5RNA表达及下游相关收缩基因表达。Western blot及PCR方案略过。
3.4研究结果：RIP检测结果提示GAS5与PR-A蛋白相结合；GAS5干扰后，细胞核内PR-A蛋白表达量明显高于过表达组，提示GAS5可能影响PR-A蛋白进入细胞核；同时细胞内cox-2、Connexin43及OTR mRNA均降低，明显低于过表达组(图7、图8)。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省人民医院
<120> 一种诊断／治疗早产的试剂
<130> CP11704118C
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agttgtgtcc ccaaggaagg 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgttaccagg agcagaacca t 21
<210> 3
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 3
cagaaagcug gaaguugaaa uggug 25
<210> 4
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 4
caccauuuca acuuccagcu uucug 25
<210> 5
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 5
uauccaugga ugacuugcuu gggua 25
<210> 6
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 6
uacccaagca agucauccau ggaua 25
<210> 7
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 7
gcaaaggacu cagaauucau gauug 25
<210> 8
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 8
caaucaugaa uucugagucc uuugc 25

Claims (9)

1.诊断GAS5的试剂在制备诊断早产的试剂中的应用。
2.抑制GAS5的试剂在制备治疗早产药物中的应用。
3.如权利要求1中的试剂，其特征在于是一组引物，其具体序列如序列1,2所示。
4.一组干扰GAS5的siRNA,如序列3、4或5、6或7、8所示。
5.一种试剂盒，包括权利要求3所述引物。
6.权利要求4所述的siRNA在制备治疗早产药物中的应用。
7.包括GAS5的药物组合组在制备分娩发动药物中的应用。
8.如权利要求7所述组合物在制备治疗早产药物中的应用。
9.根据权利要求7所述药物组合物，其中还包括辅料。
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