CN103695423B - 调控yap和/或tead和/或rhamm表达水平物质的新用途 - Google Patents

调控yap和/或tead和/或rhamm表达水平物质的新用途 Download PDF

Info

Publication number
CN103695423B
CN103695423B CN201310704082.3A CN201310704082A CN103695423B CN 103695423 B CN103695423 B CN 103695423B CN 201310704082 A CN201310704082 A CN 201310704082A CN 103695423 B CN103695423 B CN 103695423B
Authority
CN
China
Prior art keywords
rhamm
expression
yap
shrna
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201310704082.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103695423A (zh
Inventor
黄来强
王中原
吴彦萍
王海峰
张扬清
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Graduate School Tsinghua University
Original Assignee
Shenzhen Graduate School Tsinghua University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Graduate School Tsinghua University filed Critical Shenzhen Graduate School Tsinghua University
Priority to CN201310704082.3A priority Critical patent/CN103695423B/zh
Publication of CN103695423A publication Critical patent/CN103695423A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103695423B publication Critical patent/CN103695423B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明公开了调控YAP和/或TEAD和/或RHAMM表达水平物质的新用途。本发明所提供的一种新用途是调控YAP表达水平的物质在制备调控动物细胞中RHAMM表达水平的产品中的应用。本申请的实验证明YAP和TEAD均为干预RHAMM表达的新靶点,通过降低YAP或TEAD的表达可以降低RHAMM表达,降低YAP、TEAD或RHAMM表达可以抑制人三阴性乳腺癌细胞系MDA‑MB‑231的迁移能力和浸润能力,可采用不同方法手段干预调控RHAMM、或YAP/TEAD、或Mevalonate途径中Meva至YAP之间的任一点,从而实现对细胞迁移的干预和肿瘤转移的治疗。

Description

调控YAP和/或TEAD和/或RHAMM表达水平物质的新用途
技术领域
本发明涉及调控YAP和/或TEAD和/或RHAMM表达水平物质的新用途。
背景技术
乳腺癌(breast cancer)是发达国家和发展中国家女性最常见的肿瘤。全球每年有120万妇女患乳腺癌,50万妇女死于乳腺癌。欧美发达国家,每8-9人中就有1人患有乳腺癌。在发展中国家,由于寿命延长、城镇化以及采取西方生活方式,乳腺癌的发病率急剧升高。在我国,北京、上海、天津、广州、深圳等大城市的统计显示乳腺癌同样是我国女性最常见的恶性肿瘤,且发病率呈逐年上升趋势。数据表明:我国女性乳腺癌发病率逐年上升,目前已经从五年前的十万分之十七增加到去年的十万分之五十二,上升超过三倍;死亡率增长了38.91%。其中发病率最高的是北京、上海、广州、深圳等经济发达的大城市,生活水平的高低与发病率的高低成正比。目前治疗乳腺癌尤其是晚期乳腺癌采用的传统的手术、放疗和化疗疗效有限,乳腺癌仍高居女性癌症杀手的榜首。其预后同疾病范围是否已有转移密切相关,尤其局部晚期病变的患者大多已出现远处器官的转移,5年生存率仅为10~30%。因此,揭示乳腺癌进展及癌转移的分子机制,可为研发更有效的临床预后、疗效等的生物标志物(biomarkers)及分子靶向药物奠定理论基础,具有极重要的临床意义。
针对乳腺癌进展及癌转移(progression and metastasis)的分子机制的研究愈来愈成为国内外研究的热点。乳腺癌进展及癌转移涉及癌细胞的能动性(motile)表征,而癌细胞的积极的迁移(migration)运动是其进一步侵袭(invasion)周围组织及转移(metastasis)至淋巴组织及远处其他器官的前提,这一系列复杂过程受多种因子影响,包括多种生长因子(growth factors)、细胞因子(cytokines)、趋化因子(chemokines)以及肿瘤微环境的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)等。细胞外基质成分之一的透明质酸(Hyaluronan,HA)是含有葡萄糖醛酸及N-乙酰氨基葡萄糖的阴离子聚合体,与肿瘤侵袭与转移密切相关。而结合透明质酸并介导细胞运动的透明质酸介导的运动受体(Receptorfor hyaluronan-mediated motility,RHAMM)可结合有丝分裂纺锤体而促进细胞分裂间期微管的不稳定性及纺锤体的完整性。独特的是,RHAMM有可通过非经典的途径被输出到细胞膜表面与CD44相互作用,从而促进CD44-介导的通过结合并激活ERK1,2,进而激活细胞能动性相关基因的表达。
Hippo信号通路及其下游的效应器Yes相关蛋白(Yes-associated protein,YAP)从果蝇至哺乳动物高度保守,在调控器官大小、组织再生及干细胞自我更新等方面发挥决定作用。YAP能够进入细胞核,与核内的转录因子相互结合,启动下游靶基因的转录。Hippo信号通路一旦被激活,上游激酶磷酸化YAP,被磷酸化的YAP能够与细胞骨架蛋白14-3-3相互作用,停留在胞质内,不能进入细胞核激活基因转录。TEAD(转录增强因子TEF)是细胞核内与YAP结合最主要的转录因子,YAP与TEAD结合后,依赖TEAD中DNA结合功能域,启动下游基因转录。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供调控YAP和/或TEAD和/或RHAMM表达水平物质的新用途以及调控YAP表达水平的物质、调控TEAD表达水平的物质和调控RHAMM表达水平的物质。具体如下:
1、调控YAP表达水平的物质在制备调控动物细胞中RHAMM表达水平的产品(如试剂)中的应用。
2、降低YAP表达水平的shRNA,是形成茎环结构的短发夹RNA,所述茎环结构中茎的一条链序列是SEQ ID No.3的第1-20位,所述茎环结构中茎的另一条链序列与SEQ ID No.3的第1-20位反向互补。
3、2中所述降低YAP表达水平的shRNA的相关生物材料,为下述A1)-A9)中的任一种:
A1)2中所述降低YAP表达水平的shRNA产生的siRNA;
A2)表达A1)所述siRNA的表达载体;
A3)表达A1)所述siRNA的重组微生物细胞;
A4)表达A1)所述siRNA的重组动物细胞;
A5)表达A1)所述siRNA的重组植物细胞;
A6)表达2中所述shRNA的表达载体;
A7)表达2中所述shRNA的重组微生物细胞;
A8)表达2中所述shRNA的重组动物细胞;
A9)表达2中所述shRNA的重组植物细胞。
4、降低YAP表达水平的物质在制备抑制动物细胞迁移和/或浸润(侵袭)产品(如试剂)中的应用。
5、调控TEAD表达水平的物质在制备调控动物细胞中RHAMM表达水平的产品(如试剂)中的应用。
6、降低TEAD表达水平的shRNA,是形成茎环结构的短发夹RNA,所述茎环结构中茎的一条链序列是SEQ ID No.4的第1-22位,所述茎环结构中茎的另一条链序列与SEQ IDNo.4的第1-22位反向互补。
7、6中所述的shRNA的相关生物材料,为下述B1)-B9)中的任一种:
B1)6中所述的shRNA产生的siRNA;
B2)表达B1)所述siRNA的表达载体;
B3)表达B1)所述siRNA的重组微生物细胞;
B4)表达B1)所述siRNA的重组动物细胞;
B5)表达B1)所述siRNA的重组植物细胞;
B6)表达6中所述的shRNA的表达载体;
B7)表达6中所述的shRNA的重组微生物细胞;
B8)表达6中所述的shRNA的重组动物细胞;
B9)表达6中所述的shRNA的重组植物细胞。
8、降低TEAD表达水平的物质或降低RHAMM表达水平的物质在制备抑制动物细胞迁移和/或抑制动物细胞浸润(侵袭)产品(如试剂)中的应用。
9、1)降低RHAMM表达水平的shRNA,是形成茎环结构的短发夹RNA,所述茎环结构中茎的一条链序列是SEQ ID No.1的第1-20位,所述茎环结构中茎的另一条链序列与SEQ IDNo.1的第1-20位反向互补;具体地所述shRNA的核苷酸序列是SEQ ID No.1;
2)1)所述shRNA的相关生物材料,为C1-C9中的任一种:
C1)1)所述shRNA产生的siRNA;
C2)表达C1)所述siRNA的表达载体;
C3)表达C1)所述siRNA的重组微生物细胞;
C4)表达C1)所述siRNA的重组动物细胞;
C5)表达C1)所述siRNA的重组植物细胞;
C6)表达1)所述的shRNA的表达载体;
C7)表达1)所述的shRNA的重组微生物细胞;
C8)表达1)所述的shRNA的重组动物细胞;
C9)表达1)所述的shRNA的重组植物细胞;
3)降低RHAMM表达水平的shRNA,是形成茎环结构的短发夹RNA,所述茎环结构中茎的一条链序列是SEQ ID No.2的第1-20位,所述茎环结构中茎的另一条链序列与SEQ IDNo.2的第1-20位反向互补;具体地所述shRNA的核苷酸序列是SEQ ID No.2;
4)3)所述shRNA的相关生物材料,为D1-D9中的任一种:
D1)3)所述shRNA产生的siRNA;
D2)表达D1)所述siRNA的表达载体;
D3)表达D1)所述siRNA的重组微生物细胞;
D4)表达D1)所述siRNA的重组动物细胞;
D5)表达D1)所述siRNA的重组植物细胞;
D6)表达3)所述的shRNA的表达载体;
D7)表达3)所述的shRNA的重组微生物细胞;
D8)表达3)所述的shRNA的重组动物细胞;
D9)表达3)所述的shRNA的重组植物细胞。
其中,所述调控YAP表达水平的物质具体可为降低YAP表达水平的物质或提高YAP表达水平的物质。所述降低YAP表达水平的物质可为任何可以降低细胞中YAP表达水平的物质,如降低YAP表达水平的siRNA、编码所述降低YAP表达水平的siRNA的DNA分子、表达所述降低YAP表达水平的siRNA的表达载体、表达所述降低YAP表达水平的siRNA的重组微生物、表达所述降低YAP表达水平的siRNA的重组植物细胞、表达所述降低YAP表达水平的siRNA的重组动物细胞;所述降低YAP表达水平的物质还可为任何降低YAP表达水平的shRNA、编码所述降低YAP表达水平的shRNA的DNA分子、表达所述降低YAP表达水平的shRNA的表达载体、表达所述降低YAP表达水平的shRNA的重组微生物、表达所述降低YAP表达水平的shRNA的重组植物细胞和表达所述降低YAP表达水平的shRNA的重组动物细胞。
所述降低YAP表达水平的siRNA具体可为如下siRNA:一条链序列为SEQ ID No.3的第1-20位,另一条链的序列与SEQ ID No.3的第1-20位反向互补。
所述降低YAP表达水平的shRNA是形成茎环结构的短发夹RNA,所述茎环结构中茎的一条链序列是SEQ ID No.3的第1-20位,所述茎环结构中茎的另一条链序列与SEQ IDNo.3的第1-20位反向互补。在本发明的一个实施方式中,所述降低YAP表达水平的shRNA的核苷酸序列是SEQ ID No.3。
所述提高YAP表达水平的物质可为编码YAP的DNA分子,或含有编码YAP的DNA分子的重组载体、重组微生物、重组植物细胞或重组动物细胞。
所述调控TEAD表达水平的物质具体可为降低TEAD表达水平的物质或提高TEAD表达水平的物质。所述降低TEAD表达水平的物质可为任何可以降低细胞中TEAD表达水平的物质,如降低TEAD表达水平的siRNA、编码所述降低TEAD表达水平的siRNA的DNA分子、表达所述降低TEAD表达水平的siRNA的表达载体、表达所述降低TEAD表达水平的siRNA的重组微生物、表达所述降低TEAD表达水平的siRNA的重组植物细胞和表达所述降低TEAD表达水平的siRNA的重组动物细胞;所述降低TEAD表达水平的物质还可为任何可以降低TEAD表达水平的shRNA、编码所述降低TEAD表达水平的shRNA的DNA分子、表达所述降低TEAD表达水平的shRNA的表达载体、表达所述降低TEAD表达水平的shRNA的重组微生物、表达所述降低TEAD表达水平的shRNA的重组植物细胞和表达所述降低TEAD表达水平的shRNA的重组动物细胞。
所述降低TEAD表达水平的siRNA具体可为如下siRNA:一条链序列为SEQ ID No.4的第1-22位,另一条链的序列与SEQ ID No.4的第1-22位反向互补。
所述降低TEAD表达水平的shRNA是形成茎环结构的短发夹RNA,所述茎环结构中茎的一条链序列是SEQ ID No.4的第1-22位,所述茎环结构中茎的另一条链序列与SEQ IDNo.4的第1-22位反向互补。在本发明的一个实施方式中,所述降低YAP表达水平的shRNA的核苷酸序列是SEQ ID No.4。
所述提高TEAD表达水平的物质可为编码TEAD的DNA分子,或含有编码TEAD的DNA分子的重组载体、重组微生物、重组植物细胞或重组动物细胞。
上述重组微生物具体可为细菌、酵母、藻、真菌或病毒,上述重组植物细胞不包括植物的繁殖材料,上述重组动物细胞不包括动物的繁殖材料。
所述调控RHAMM表达水平可为调控RHAMM的转录水平和/或调控RHAMM的蛋白翻译水平。
所述降低RHAMM表达水平的物质可为上述降低YAP表达水平的物质或上述降低TEAD表达水平的物质,也可为降低RHAMM表达水平的siRNA、编码所述降低RHAMM表达水平的siRNA的DNA分子、表达所述降低RHAMM表达水平的siRNA的表达载体、表达所述降低RHAMM表达水平的siRNA的重组微生物、表达所述降低RHAMM表达水平的siRNA的重组植物细胞、表达所述降低RHAMM表达水平的siRNA的重组动物细胞;所述降低RHAMM表达水平的物质还可为任何降低RHAMM表达水平的shRNA、编码所述降低RHAMM表达水平的shRNA的DNA分子、表达所述降低RHAMM表达水平的shRNA的表达载体、表达所述降低RHAMM表达水平的shRNA的重组微生物、表达所述降低RHAMM表达水平的shRNA的重组植物细胞和表达所述降低RHAMM表达水平的shRNA的重组动物细胞。
所述降低RHAMM表达水平的siRNA具体可为如下siRNA:一条链序列为SEQ ID No.1的第1-20位,另一条链的序列与SEQ ID No.1的第1-20位反向互补。所述降低RHAMM表达水平的shRNA是形成茎环结构的短发夹RNA,所述茎环结构中茎的一条链序列是SEQ ID No.1的第1-20位,所述茎环结构中茎的另一条链序列与SEQ ID No.1的第1-20位反向互补。在本发明的一个实施方式中,所述降低RHAMM表达水平的shRNA的核苷酸序列是SEQ ID No.1。
所述降低RHAMM表达水平的siRNA具体可为如下siRNA:一条链序列为SEQ ID No.2的第1-20位,另一条链的序列与SEQ ID No.2的第1-20位反向互补。所述降低RHAMM表达水平的shRNA是形成茎环结构的短发夹RNA,所述茎环结构中茎的一条链序列是SEQ ID No.2的第1-20位,所述茎环结构中茎的另一条链序列与SEQ ID No.2的第1-20位反向互补。在本发明的一个实施方式中,所述降低RHAMM表达水平的shRNA的核苷酸序列是SEQ ID No.2。
所述动物细胞可为肿瘤细胞。所述肿瘤细胞可为乳腺癌细胞。所述乳腺癌细胞可为三阴性乳腺癌细胞。所述三阴性乳腺癌细胞可为人乳腺癌细胞系MDA-MB-231。
本申请中,所述YAP是氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的蛋白质,所述RHAMM是氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的蛋白质,所述TEAD是氨基酸序列如SEQ ID No.7、或SEQ IDNo.8或SEQ ID No.9所示的蛋白质。
本申请的实验证明YAP和TEAD均为干预RHAMM表达的新靶点,通过降低YAP或TEAD的表达可以降低RHAMM表达,降低YAP、TEAD或RHAMM表达可以抑制人三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231的迁移能力和浸润能力,可采用不同方法手段干预调控RHAMM、或YAP/TEAD、或Mevalonate途径中Meva至YAP之间的任一点,从而实现对细胞迁移的干预和肿瘤转移的治疗。
附图说明
图1是RHAMM在乳腺癌细胞的迁移和浸润中起到的重要作用。
图1中A为检测RHAMM的Western blot免疫印迹实验结果,其中,左起第1列为NT慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系,左起第2列为shRHAMM1慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系,左起第3列为shRHAMM2慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系。
图1中B和D为靶向RHAMM的shRNA介导的RHAMM表达水平的下降抑制MDA-MB-231细胞的迁移能力,NT为NT慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系,shRHAMM1为shRHAMM1慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系,shRHAMM2为shRHAMM2慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系。
图1中C和E为靶向RHAMM的shRNA介导的RHAMM表达水平的下降抑制MDA-MB-231细胞的浸润能力,NT为NT慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系,shRHAMM1为shRHAMM1慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系,shRHAMM2为shRHAMM2慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系。
图2是YAP和TEAD对于RHAMM表达起到的重要作用。图中,RNAi介导的YAP或者TEAD表达水平的下降通过抑制RHAMM的蛋白表达从而抑制了人乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移和浸润。
图2中A为荧光定量PCR检测RHAMM的mRNA水平的变化结果。
图2中B为检测RHAMM、YAP、TEAD4的Western blot免疫印迹实验结果。
图2中C和E为shRNA介导的YAP或TEAD蛋白表达水平的降低显著性的抑制MDA-MB-231细胞的迁移能力,外源性的转入RHAMM能够拯救这种抑制效果。
图2中D和F为shRNA介导的YAP或TEAD蛋白表达水平的降低显著性的抑制MDA-MB-231细胞的浸润能力,外源性的转入RHAMM能够拯救这种抑制效果。
图2中,NT为NT慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系,shYAP为shYAP慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系,shTEAD为shTEAD慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系,shYAP+RHAMM为shYAP+RHAMM细胞系,shTEAD+RHAMM为shTEAD+RHAMM细胞系,NT+RHAMM为NT+RHAMM细胞系。
图3是YAP的高表达对RHAMM转录和翻译的促进作用。
图3中A是YAP的高表达对RHAMM转录的促进作用。
图3中B是YAP的高表达对RHAMM翻译的促进作用。
图3中C是用柱状图的形式来说明图3中B中YAP的高表达促进RHAMM蛋白水平的显著性增加。
图3中A、B和C中,左列均为293T细胞,右列均为293T-YAP细胞。
图3中A和C中,用t-Test进行差异显著性分析,*表示有显著差异(p<0.05)。
图4是检测乳腺癌患者组织切片中YAP和RHAMM的表达情况。
图4中,上排两张照片为正常组织,下排两张照片为肿瘤组织。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。以下实施例中的定量试验,如无特别说明,均设置三次重复。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
下述实施例中的人三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231购买自ATCC。MDA-MB-231的雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体(HER2)均阴性。
下述实施例中的含10%胎牛血清的L-15培养基是向L-15培养基(Gibco)中加入胎牛血清(Hyclone)至胎牛血清的体积浓度为10%得到的培养基。
下述实施例中的含20%胎牛血清的L-15培养基是向L-15培养基(Gibco)中加入胎牛血清(Hyclone)至胎牛血清的体积浓度为20%得到的培养基。
本申请中,YAP是氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的蛋白质;RHAMM是氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的蛋白质;TEAD1是氨基酸序列如SEQ ID No.7所示的蛋白质;TEAD3是氨基酸序列如SEQ ID No.8所示的蛋白质;TEAD4是氨基酸序列如SEQ ID No.9所示的蛋白质。
实施例1、RHAMM在乳腺癌细胞的迁移和浸润中起到的重要作用,RNAi介导的RHAMM的敲低会抑制乳腺癌细胞的迁移和浸润
1、靶向RHAMM的shRNA能够显著性地降低MDA-MB-231细胞的RHAMM蛋白表达
首先包装一个表达靶向RHAMM的shRNA(名称为shRHAMM1)的慢病毒(名称为shRHAMM1慢病毒)、包装另一个表达靶向RHAMM的shRNA(名称为shRHAMM2)的慢病毒(名称为shRHAMM2慢病毒)、包装一个表达无规序列的shRNA(名称为shC)的慢病毒(名称为NT慢病毒)作为阴性对照。然后分别用shRHAMM1慢病毒、shRHAMM2慢病毒和NT慢病毒这三种慢病毒分别单独感染三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231。12小时后,移除病毒,正常培养病毒感染过的MDA-MB-231细胞。结果表明,shRHAMM1慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系中的RHAMM含量是NT慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系中的RHAMM含量的0.1倍,shRHAMM2慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系中的RHAMM含量是NT慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系中的RHAMM含量的0.25倍,说明两条RHAMM干扰序列shRHAMM1和shRHAMM2都能够显著性地降低MDA-MB-231细胞的RHAMM蛋白表达(图1中A)。
其中,实验方法如下:
1.1、慢病毒的包装
shRHAMM1、shRHAMM2和shC这三种shRNA的序列如下:
shRHAMM1:GCUAGAUAUUGCCCAGUUAUUCAAGAGAUAACUGGGCAAUAUCUAGCUU(SEQ IDNo.1);
shRHAMM2:GGACCAGUAUCCUUUCAGAUUCAAGAGAUCUGAAAGGAUACUGGUCCUU(SEQ IDNo.2);
shC:UUCUCCGAACGUGUCACGUUUCAAGAGAACGUGACACGUUCGGAGAAUU。
将shRHAMM1的编码DNA(将SEQ ID No.1的核苷酸U替换为T的双链DNA)插入pGPH1/GFP/Neo(上海吉玛制药技术有限公司)得到shRHAMM1的表达载体,将shRHAMM2的编码DNA(将SEQ ID No.2的核苷酸U替换为T的双链DNA)插入pGPH1/GFP/Neo得到shRHAMM2的表达载体,将shC的编码DNA(将shC的核苷酸U替换为T的双链DNA)插入pGPH1/GFP/Neo得到shC的表达载体,将该shRHAMM1的表达载体包装成表达shRHAMM1的慢病毒(名称为shRHAMM1慢病毒),将该shRHAMM2的表达载体包装成表达shRHAMM2的慢病毒(名称为shRHAMM2慢病毒),将shC的表达载体包装成表达shC的慢病毒(名称为NT慢病毒)。shRHAMM1慢病毒、shRHAMM2慢病毒和NT慢病毒由上海吉玛制药技术有限公司利用商品目录号为D01001的慢病毒包装系统制备。shRHAMM1慢病毒、shRHAMM2慢病毒和NT慢病毒中除表达的shRNA序列不同外,其它均相同。
1.2分别用1.1的三种慢病毒感染三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231。感染方法如下:MDA-MB-231细胞接种于六孔板,在含10%胎牛血清的L-15培养基中于37℃培养24小时后先加入5μg/ml Polybrene(Sigma),然后分别加入1×108TU/ml shRHAMM1慢病毒毒液、shRHAMM2慢病毒毒液和NT慢病毒毒液。12小时后,去除含病毒培养液,换新鲜含10%胎牛血清的L-15培养基在37℃继续培养病毒感染过的MDA-MB-231细胞,培养36小时后分别得到三种慢病毒感染成功的三阴性乳腺癌细胞系,即shRHAMM1慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系、shRHAMM2慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系、NT慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系。将shRHAMM1慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系、shRHAMM2慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系和NT慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系分别接种于装有含10%胎牛血清的L-15培养基的六孔板中37℃培养24小时,分别收集细胞裂解细胞提取蛋白质,然后用抗RHAMM的抗体(从epitomics公司购买)进行Western blot免疫印迹实验检测RHAMM的蛋白水平变化。该Western blot免疫印迹实验中,以GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)为内参。
2、靶向RHAMM的shRNA介导的RHAMM蛋白表达水平的降低抑制MDA-MB-231细胞的迁移能力
步骤1中的shRHAMM1慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系、shRHAMM2慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系、NT慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系各取5×104个细胞(100μl,无血清)接种于24孔Transwell的嵌套中,Transwell下层加入600μl含20%胎牛血清的L-15培养基,置于37℃培养箱6小时后,固定,结晶紫染色,显微镜下拍照,检测细胞迁移情况,结果表明,与NT慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系相比,shRHAMM1慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系中迁移的细胞数是NT慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系的0.16倍,shRHAMM2慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系中迁移的细胞数是NT慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系的0.21倍。说明shRNA介导的RHAMM蛋白表达水平的降低显著性的抑制MDA-MB-231细胞的迁移能力(图1中B和D)。
3、靶向RHAMM的shRNA介导的RHAMM蛋白表达水平的降低抑制MDA-MB-231细胞的浸润能力
步骤1中的shRHAMM1慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系、shRHAMM2慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系、NT慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系各取5×104个细胞(100μl,无血清)接种于24孔Transwell的嵌套中,Transwell下层加入600μl含20%胎牛血清的L-15培养基,置于37℃培养箱24小时后,固定,结晶紫染色,显微镜下拍照,检测细胞浸润情况,结果表明,与NT慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系相比,shRHAMM1慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系中浸润的细胞数是NT慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系的0.12倍,shRHAMM2慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系中浸润的细胞数是NT慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系的0.17倍。说明shRNA介导的RHAMM蛋白表达水平的降低显著性的抑制MDA-MB-231细胞的浸润能力(图1中C和E)。
总之,shRNA介导的RHAMM蛋白水平下降能够显著性的抑制人乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞的迁移和浸润。
实施例2、YAP和TEAD对于RHAMM表达起到的重要作用,RNAi介导的YAP或TEAD的敲低通过降低RHAMM的蛋白水平来抑制乳腺癌细胞的迁移和浸润
1、靶向YAP的shRNA和靶向TEAD的shRNA能够显著性地降低MDA-MB-231细胞的RHAMM蛋白表达
首先包装一个表达靶向YAP的shRNA(名称为shYAP)的慢病毒(名称为shYAP慢病毒)、包装一个表达靶向TEAD1/3/4的shRNA(名称为shTEAD)的慢病毒(名称为shTEAD慢病毒)、包装一个表达无规序列的shRNA(名称为shC)的慢病毒(名称为NT慢病毒)作为阴性对照。然后分别用shYAP慢病毒、shTEAD慢病毒和NT慢病毒这三种慢病毒分别单独感染三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231。12小时后,移除病毒,正常培养病毒感染过的MDA-MB-231细胞。结果表明,shYAP慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系中的RHAMM蛋白含量是NT慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系中的RHAMM蛋白含量的0.4倍,shYAP慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系中的RHAMM的mRNA含量是NT慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系中RHAMM的mRNA含量的0.35倍;shTEAD慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系中的RHAMM蛋白含量是NT慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系中的RHAMM蛋白含量的0.75倍,shTEAD慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系中的RHAMM的mRNA含量是NT慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系中RHAMM的mRNA含量的0.58倍(图2中A和B)。说明YAP的干扰序列shYAP能够显著性地降低MDA-MB-231细胞的YAP蛋白的表达;TEAD的干扰序列shTEAD能够显著性地降低MDA-MB-231细胞的TEAD蛋白的表达。同时,敲除YAP或者TEAD都能显著地降低RHAMM的mRNA和蛋白水平。
其中,实验方法如下:
1.1、慢病毒的包装
NT慢病毒的包装同实施例1的1.1中NT慢病毒的包装,shYAP慢病毒的包装,除将NT慢病毒的包装中的shC替换为shYAP外,其它实验方法与NT慢病毒的完全相同;shTEAD慢病毒的包装,除将NT慢病毒的包装中的shC替换为shTEAD外,其它实验方法与NT慢病毒的完全相同。shYAP慢病毒的包装和shTEAD慢病毒的包装具体如下:
shYAP:GACAUCUUCUGGUCAGAGAUUCAAGAGAUCUCUGACCAGAAGAUGUCUU(SEQ ID No.3);
shTEAD:AUGAUCAACUUCAUCCACAAGUUCAAGAGACUUGUGGAUGAAGUUGAUCAUUU(SEQ IDNo.4)。
将shYAP的编码DNA(将SEQ ID No.3的核苷酸U替换为T的双链DNA)插入pGPH1/GFP/Neo(上海吉玛制药技术有限公司)得到shYAP的表达载体,将shTEAD的编码DNA(将SEQID No.4的核苷酸U替换为T的双链DNA)插入pGPH1/GFP/Neo得到shTEAD的表达载体,将该shYAP的表达载体包装成表达shYAP的慢病毒(名称为shYAP慢病毒),将该shTEAD的表达载体包装成表达shTEAD的慢病毒(名称为shTEAD慢病毒)。shYAP慢病毒和shTEAD慢病毒由上海吉玛制药技术有限公司利用商品目录号为D01001的慢病毒包装系统制备。shYAP慢病毒、shTEAD慢病毒和NT慢病毒中除表达的shRNA序列不同外,其它均相同。
1.2分别用1.1的三种慢病毒感染三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231。感染方法如下:MDA-MB-231细胞接种于六孔板,在含10%胎牛血清的L-15培养基中于37℃培养24小时后先加入5μg/ml Polybrene(Sigma),然后分别加入1×108TU/ml shYAP慢病毒毒液、shTEAD慢病毒毒液和NT慢病毒毒液。12小时后,去除含病毒培养液,换新鲜含10%胎牛血清的L-15培养基在37℃继续培养病毒感染过的MDA-MB-231细胞,培养36小时后分别得到三种慢病毒感染成功的三阴性乳腺癌细胞系,即shYAP慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系、shTEAD慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系、NT慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系。将shYAP慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系、shTEAD慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系和NT慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系分别接种于装有含10%胎牛血清的L-15培养基的六孔板中37℃培养24小时,分别收集细胞裂解细胞提取蛋白质,然后分别用抗YAP抗体(Abnova)、抗TEAD4(Abonva)抗体和抗RHAMM的抗体(从epitomics公司购买)进行Western blot免疫印迹实验检测YAP、TEAD4和RHAMM的蛋白水平变化。
1.3同时提取shYAP慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系、shTEAD慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系、NT慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系细胞的总RNA,用PrimeScript RT-PCRKit(TaKaRa)进行反转录实验得到cDNA。用荧光定量的方法检测RHAMM的转录水平,即RHAMM的mRNA水平的变化。其中,荧光定量PCR检测以GAPDH为内参基因,荧光定量PCR检测内参基因的PCR引物序列为:GAPDH:sense,5’-CCAGAACATCATCCCTGCCTCTACT-3’;anti-sense,5’-GGTTTTTCTAGACGGCAGGTCAGGT-3’;荧光定量PCR检测RHAMM的转录水平的引物为:RHAMM:sense,
5’-AGAACCAACTCAAGCAACAGG-3’;anti-sense:
5’-AGGAGACGCCACTTGTTAATTTC-3’。
2、靶向YAP的shRNA和靶向TEAD的shRNA抑制MDA-MB-231细胞的迁移能力和浸润能力,外源转入RHAMM能拯救这种抑制效果。
用Lipofectamine2000transfection reagent(Invitrogen)将RHAMM表达质粒Flag-RHAMM(将SEQ ID No.11所示的RHAMM的编码基因插入到pFLAG-CMV-2(Sigma)的NotI和KpnI位点间得到RHAMM表达质粒Flag-RHAMM)导入shYAP慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系得到shYAP+RHAMM细胞系,将RHAMM表达质粒Flag-RHAMM导入shTEAD慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系得到shTEAD+RHAMM细胞系,将RHAMM表达质粒Flag-RHAMM导入NT慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系得到NT+RHAMM细胞系。
按照实施例1中步骤2和步骤3的方法测定NT慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系、shYAP慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系、shTEAD慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系、shYAP+RHAMM细胞系、shTEAD+RHAMM细胞系和NT+RHAMM细胞系这6个细胞系的迁移能力和浸润能力。结果表明,与NT慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系相比,shYAP慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系中迁移的细胞数是NT慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系的0.25倍,shTEAD慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系中迁移的细胞数是NT慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系的0.25倍,NT+RHAMM细胞系中迁移的细胞数是NT慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系的1.13倍,shYAP+RHAMM细胞系中迁移的细胞数是NT慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系的0.8倍,shTEAD+RHAMM细胞系中迁移的细胞数是NT慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系的0.8倍。与NT慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系相比,shYAP慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系中浸润的细胞数是NT慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系的0.15倍,shTEAD慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系中浸润的细胞数是NT慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系的0.25倍,NT+RHAMM细胞系中浸润的细胞数是NT慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系的1.1倍,shYAP+RHAMM细胞系中浸润的细胞数是NT慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系的0.7倍,shTEAD+RHAMM细胞系中浸润的细胞数是NT慢病毒感染的MDA-MB-231细胞系的0.8倍。说明shRNA介导的YAP或TEAD蛋白表达水平的降低显著性的抑制MDA-MB-231细胞的迁移能力和浸润能力,外源性的转入RHAMM能够拯救这种抑制效果(图2中C和E,图2中D和F)。
总之,shRNA介导的YAP或TEAD蛋白水平下降能够通过抑制RHAMM的表达显著性的抑制人乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞的迁移和浸润。
实施例3、YAP的高表达对RHAMM转录和翻译的促进作用。
用Lipofectamine2000transfection reagent(Invitrogen)将YAP表达质粒V5-YAP质粒(将YAP的编码基因插入到pcDNA3.1V5/His(Invitrogen)的EcoRI和NotI位点间得到V5-YAP表达质粒)导入293T细胞后得到YAP蛋白过量表达的重组细胞,将该重组细胞命名为293T-YAP细胞。提取293T细胞和293T-YAP细胞的总RNA,按照1.3的方法用荧光定量的方法检测RHAMM的转录水平,即RHAMM的mRNA水平的变化;按照1.2的方法进行Western blot免疫印迹实验检测293T细胞和293T-YAP细胞中RHAMM的蛋白水平变化。V5抗体购于GeneTeX公司。
结果表明293T-YAP细胞中的RHAMM的mRNA水平是293T细胞中RHAMM的mRNA水平3.3倍,293T-YAP细胞中的RHAMM的蛋白水平是293T细胞中的RHAMM的蛋白水平1.55倍(图3中A、B和C)。
总之,YAP能够显著促进RHAMM的转录和翻译,从而促进RHAMM在乳腺癌细胞的迁移和浸润。
实施例4、检测乳腺癌患者组织切片中YAP和RHAMM的表达情况。
使用凯基兔抗体免疫组化试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司),分别用抗YAP的一抗(购于Santa Cruz)和抗RHAMM的一抗(epitomics公司)进行免疫组化检测靠近肿瘤部位的正常组织(距离肿瘤部位约4-5cm的正常组织)切片和肿瘤部位切片的YAP和RHAMM的表达情况。结果表明(1)在组织切片中靠近肿瘤部位的正常组织中YAP和RHAMM的表达量都很少;(2)在组织切片中肿瘤部位的组织中YAP和RHAMM的表达量都很高(图4)。总之,在乳腺癌患者组织切片中YAP和RHAMM表达呈现正相关的结果和在体外的细胞结果是非常一致的,YAP的高表达能够显著促进RHAMM的表达。
具体方法如下:
1)将切片放入3%H2O2-甲醇液中浸泡10分钟,以消除内源性过氧化氢酶的作用。
2)用PBS洗2分钟/次×3次。
3)加一滴封闭液10%山羊血清于组织切片上(需完全覆盖待检组织)孵育10分钟。
4)倒掉或吸干液体(不要冲洗)。
5)一张切片加二滴(100μL)抗YAP的一抗,另一张加二滴(100μL)抗RHAMM的一抗,抗体需完全覆盖待检组织,湿盒内孵育30~60分钟。
6)用PBS洗2分钟/次×3次。
7)每张切片加一滴抗兔生物素化二抗(需完全覆盖待检组织),孵育10分钟。
8)用PBS洗2分钟/次×3次。
9)每张切片加一滴链亲和素标记HRP(需完全覆盖待检组织),孵育10分钟。
10)用PBS洗2分钟/次×3次。
11)制备DAB显色液(需现用现配)
①取2.5μL20倍浓缩DAB底物缓冲液加入到50μL蒸馏水中,混匀。
②取2.5μL20倍浓缩DAB显色液、2.5μL20倍浓缩DAB底物溶液加入①中,混匀。
12)每张切片加一滴上述DAB显色液,室温显色2~5分钟(可在镜下掌握显色程度)。
13)自来水充分冲洗。
14)复染,盐酸酒精分化。
15)脱水、透明、封片、镜检。

Claims (1)

1.下述1)-4)中任一种:
1)shRNA,是形成茎环结构的短发夹RNA,所述茎环结构中茎的一条链序列是SEQ IDNo.1的第1-20位,所述茎环结构中茎的另一条链序列与SEQ ID No.1的第1-20位反向互补;所述shRNA的核苷酸序列是SEQ ID No.1;
2)1)所述shRNA的相关生物材料,为C1-C9中的任一种:
C1)1)所述shRNA产生的siRNA;
C2)表达C1)所述siRNA的表达载体;
C3)表达C1)所述siRNA的重组微生物细胞;
C4)表达C1)所述siRNA的重组动物细胞;
C5)表达C1)所述siRNA的重组植物细胞;
C6)表达1)所述的shRNA的表达载体;
C7)表达1)所述的shRNA的重组微生物细胞;
C8)表达1)所述的shRNA的重组动物细胞;
C9)表达1)所述的shRNA的重组植物细胞;
3)shRNA,是形成茎环结构的短发夹RNA,所述茎环结构中茎的一条链序列是SEQ IDNo.2的第1-20位,所述茎环结构中茎的另一条链序列与SEQ ID No.2的第1-20位反向互补;所述shRNA的核苷酸序列是SEQ ID No.2;
4)3)所述shRNA的相关生物材料,为D1-D9中的任一种:
D1)3)所述shRNA产生的siRNA;
D2)表达D1)所述siRNA的表达载体;
D3)表达D1)所述siRNA的重组微生物细胞;
D4)表达D1)所述siRNA的重组动物细胞;
D5)表达D1)所述siRNA的重组植物细胞;
D6)表达3)所述的shRNA的表达载体;
D7)表达3)所述的shRNA的重组微生物细胞;
D8)表达3)所述的shRNA的重组动物细胞;
D9)表达3)所述的shRNA的重组植物细胞。
CN201310704082.3A 2013-12-19 2013-12-19 调控yap和/或tead和/或rhamm表达水平物质的新用途 Active CN103695423B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310704082.3A CN103695423B (zh) 2013-12-19 2013-12-19 调控yap和/或tead和/或rhamm表达水平物质的新用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310704082.3A CN103695423B (zh) 2013-12-19 2013-12-19 调控yap和/或tead和/或rhamm表达水平物质的新用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103695423A CN103695423A (zh) 2014-04-02
CN103695423B true CN103695423B (zh) 2016-09-21

Family

ID=50357087

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310704082.3A Active CN103695423B (zh) 2013-12-19 2013-12-19 调控yap和/或tead和/或rhamm表达水平物质的新用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103695423B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104450709B (zh) * 2014-11-28 2018-06-05 广州市锐博生物科技有限公司 抑制hmmr基因的寡聚核酸及其应用
CN104721838B (zh) * 2015-03-09 2019-05-14 黄智慧 Yap抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用
CN114085873A (zh) * 2021-11-16 2022-02-25 珠海中科先进技术研究院有限公司 一种癌细胞状态辨识基因电路组及其制备方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102136042B (zh) * 2010-01-26 2015-07-29 徐彦辉 Yap-tead蛋白复合物的三维结构及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN103695423A (zh) 2014-04-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Yang et al. RETRACTED: Exosome-derived miR-130a activates angiogenesis in gastric cancer by targeting C-MYB in vascular endothelial cells
Chen et al. Exosomal miR-222 from adriamycin-resistant MCF-7 breast cancer cells promote macrophages M2 polarization via PTEN/Akt to induce tumor progression
US20140323551A1 (en) Targeting micrornas mir-409-5p, mir-379 and mir-154* to treat prostate cancer bone metastasis and drug resistant lung cancer
TW201615202A (zh) 甲病毒在製備抗腫瘤藥物方面的應用
Yang et al. MicroRNA‐145 induces the senescence of activated hepatic stellate cells through the activation of p53 pathway by ZEB2
Zhang et al. Hypoxia preconditioned renal tubular epithelial cell-derived extracellular vesicles alleviate renal ischaemia-reperfusion injury mediated by the HIF-1α/Rab22 pathway and potentially affected by microRNAs
Bausero et al. Silencing the hsp25 gene eliminates migration capability of the highly metastatic murine 4T1 breast adenocarcinoma cell
CN111718995B (zh) 一种鼻咽癌转移诊断和/或预后评估的生物标记
CN107287174A (zh) 肝癌标志物oxct1及其在肝癌诊断、治疗以及预后中的应用
CN103695423B (zh) 调控yap和/或tead和/或rhamm表达水平物质的新用途
Wang et al. Combined knockdown of D-dopachrome tautomerase and migration inhibitory factor inhibits the proliferation, migration, and invasion in human cervical cancer
CN104031884B (zh) 蛋白质精氨酸甲基转移酶7在癌细胞转移中的应用
CN110251529A (zh) miR-124-3p与其类似物在制备抗乳腺癌疾病药物中的应用
CN109223818A (zh) miR-3158-3p在制备诊断、预防和/或治疗特应性皮炎产品中的应用
CN103705505A (zh) 辛伐他汀的新用途
CN110317872A (zh) 用于制备检测、预后和诊断乳腺癌产品的分子标记物及试剂盒
CN116270710A (zh) circRBM33作为靶点在前列腺癌诊断和治疗中的应用
CN106701762B (zh) 一种p4hb基因表达的抑制剂及其应用
CN109010831A (zh) LncRNA RET调控肿瘤细胞放射敏感性的应用
CN106729756A (zh) 生物标志物作为靶标在肺腺癌诊治中的应用
CN105126098B (zh) 单克隆抗体nj001‑1在制备抑制nsclc侵袭及转移的药物中的应用
CN106540259A (zh) 细胞骨架通过yap调控癌细胞中s100a7、s100a8和s100a9的表达中的应用
CN112656805A (zh) 抑制ythdf1活性的物质在制备预防或治疗胃癌产品中的应用
CN105582536B (zh) Agpat9基因在制备治疗肝癌药物、诊断及预后评估试剂中的应用
CN103614379B (zh) 一种靶向FoxQ1基因的干扰siRNA及其抗非小细胞肺癌的用途

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant